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Klausur Biotechnologie 2013 1) a) In welchen Wirtssystemen werden heutzutage rekombinante Arzneistoffe produziert? geben Sie auch wissenschaftliche Artnamen oder Zelllinien an (wenn möglich)! Definieren Sie folgende Begriffe und geben Sie jeweils ein Beispiel dafür an. b) Vergleichen Sie die verschiedenen Wirtssysteme hinsichtlich Geschwindigkeit, Kosten und Glykosylierung. 2) a) Erklären Sie die Funktion folgender Vektorelemente und geben Sie jeweils ein konkretes Beispiel an: Auxotrophiemarker Sekretionssignal Promotor Tags Reportergen b) Was versteht man unter dem Begriff "shuttle vector"? c) Warum verwendet man zur heterologen Genexpression oft "regulierbare Promotoren"? Erklären Sie die Regulation an Hand eines konkreten Beispiels! 3) Nennen Sie 8 auf dem Markt eingeführte rekombinante Wirkstoffe und erklären Sie knapp (stichwortartig) deren biologische Funktion und pharmazeutische Anwendung! Lösung: 1) A) Prokaryontisch: Escherichia coli ( E. coli BL21) Bacillus subtilis (für Proteasen) Eukaryontisch Hefen (Saccharomyces cerevisiae, Pischia pastoris) Säugetierzellen (Chinese Hamster Ovary Cells, Baby Hamster Kidney Cells, Myelomzelle) Insektenzellen (Sf9-Zellen, Sf21) Pflanzenzellen (Karottenzelllinie) Hybridoma-Zelllinien (transformierte Zelle eines B-Zell-Tumors mit Maus-B-Zelle fusioniert) Transgene Tiere (Ziege) Transgene Pflanzen (Mais, Tabak) B) Vergleich der Expressionssysteme Geschwindigk eit Kosten Glykosylierung Faltung Gesetzliche Bestimmunge n Am schlechtesten Transgene Tiere Tiere Bakterien Bakterien Tiere Am besten Transgene Pflanzen Säugetierzelle n Hefezellen Hefezellen Pflanzen Säugetierzelle n Pflanzen Insektenzellen Hefezellen Bakterien Insektenzellen Hefezellen Bakterien Pflanzen Pflanzen Insektenzellen Insektenzellen Insektenzellen Hefezellen Tiere Tiere Bakterien Säugetierzelle Säugetierzelle Säugetierzelle 2) A) Auxotrophiemarker: Korrigieren Mutationen in Genen des Wirtsgenoms, die für essentielle Stoffwechselprozesse wichtig sind. Ist ein rezessiver Selektionsmarker (= Gene, deren Produkte genetische Defekte in Mutanten komplementieren). Bspw. Trp1: Sekretionssignal: Ist eine Peptidsequenz, die mit dem gewünschten Peptid fusioniert ist und es zu speziellen Kompartimenten dirigiert bzw. es schließlich ins Medium sezernieren (ER Golgi sekretorischer Weg) lässt. Bspw. phoA-Gen (Alkalische Phosphatase) Promotor: DNA-Abschnitt eines Gens, an dem RNA-Polymerase und Transkriptionsfaktoren binden und die Transkription initiieren Bspw. PHO5 (Saure Phosphatase, Transkription bei Phosphatmangel) Tags: Ist eine Aminosäuresequenz, die als molekulares Etikett dient und Aufreinigungsvorgänge vereinfacht. Bspw. His-Tag Reportergen: Ein Gen, dessen Produkt leicht detektierbar und quantifizierbar ist. Bspw. Chloramphenicol-Acetyltransferase, bakterielle beta-Galactosidase B) Shuttle Vektor: Vektor, der außer in Bakterien auch in einem anderen Organismus benutzt werden kann. Neukombination, Amplifikation und Selektion von Genen in E. coli Expression des Gens in einem anderen Wirtssystem. Bestandteile: Origin of replication für E. coli Selektionsmarker für E. coli Promotor und Terminator für Selektionsmarker/Auxotrophiemarker für anderen Wirt C) Durch regulierbare Promotoren lässt sich eine Genexpression zum unerwünschten Zeitpunkt verhindern. Toxische oder nichttoxische Genprodukte von wirtsfremden Genen können Wachstum der Zellen hemmen, da diese vom Wirt erkannt werden. Deshalb induziert man die Genexpression erst am Ende der log-Phase, sodass kein starkes Wachsen der Zellpopulation zu erwarten ist und eine Wachstumshemmung nicht ins Gewicht fällt. Beispiel: Durch das Lac-Operon lässt sich die Expression eines darin eingebauten Gens steuern. An den Operator kann ein Repressor, der in Gegenwart von Glucose gebildet wird, binden, die Transkription inhibieren und somit negativ regulieren. Durch Zugabe eines Induktors (IPTG) verändert Repressor seine Konformation, kann nicht mehr binden und der lac-Promotor wird frei, wodurch die Transkription ablaufen kann. Bei Abwesenheit von Glucose steigt intrazell. cAMP-Konz. an. cAMP bindet an CRP (cAMP-Rezeptor-Protein), wodurch 2 CRP-Moleküle oberhalb des lac-Promotors binden. Dies erhöht die Affinität der RNA-Polymerase zum lac-Promotor, was die Transkriptionseffizienz steigert. Dies ist eine positive Regulation. Man gibt so viel Glucose dazu, dass sie kurz vor dem Ende der log-Phase verbraucht ist. Dann wird auch IPTG zugegeben. 3) DNase I: - In CHO-Zellen - Schneidet die DNA in kürzere Fragmente - Wird bei Mukoviszidose eingesetzt - - Durch gestörte mucoziliäre Clearance (aufgrund hochviskösen Schleims) entstehen häufig Infektion. Dadurch wandern Leukozyten (vorwiegend Neutrophile) ein, die mit der Zeit zerfallen. Dabei wird DNA freigesetzt, die den Schleim visköser macht DNaseI führt zu kürzerer DNA und geringerer Viskosität Wird als Aerosol appliziert Omalizumab - In CHO-Zellen - Humanisierter monoklonaler Antikörper - Bindet Effektordomäne von IgE-Antikörpern - Wird bei schwerem, persistierendem Asthma eingesetzt, wenn die Standardtherapie versagt - Bindet die Effektordomäne von IgE-Antikörpern, sodass die Antikörper nicht mehr am IgE-Rezeptor auf Mastzellen binden können. Dadurch wird die Degranulation vermindert und Rezeptordichte herabreguliert Muromomab - Monoklonaler Antikörper - Murin; auch in Mauszellen produziert - Wird zur Behandlung einer steroidresistenten akuten Abstoßung von allogenen Organtransplantationen eingesetzt - Bindet CD3-Komplexe auf T-Zellen, wodurch die Signaltransduktion von über den T-Zellrezeptor inhibiert wird. Der Komplex wird vom Immunsystem als fremd erkannt und T-Zellen dadurch eliminiert. Abciximab - In Säugetier-Zellkulturen - Ist das Fab-Fragment eines chimären murin-humanen AK des IgG-Typs gegen den Glycoprotein-Rezeptor GPIIb/IIIa - Anwendung bei Koronarintervention (Stent-Implantation, Ballondilatation) und instabiler Angina pectoris - enthaltener Teil der konstanten Domäne ist human, variable AK-Region ist murin - Bindung an GPIIb/IIIa verhindert, dass aktivierte Thrombozyten sich miteinander verbinden, wodurch keine Thrombozytenaggregation stattfindet. Es wird eine Thrombosebildung verhindert Somatotropin (= hGH = Somatropin) - In E. coli - Ist das menschliche Wachstumshormon - Wird bei Mangel an GH im Kindesalter eingesetzt, die durch Gendefekte hervorgerufen werden - Induziert in Leber über GHR die Bildung von IGF (Insulin-like growth Faktoren), die das Wachstum von Muskeln, Organen und Knochen stimulieren. Es wirkt auch direkt auf den Fett, Eiweiß- und Zuckerstoffwechsel, wobei freie Fettsäuren gebildet werden, die die Ausschüttung von GH aus der Hypophyse hemmen. IGFs und GH inhibieren die Ausschüttung des Wachstumshormon-Releasingfaktors im Hypothalamus. Erythropoetin - - In CHO-Zellen (Glycosylierung für HWZ entscheidend) Ist ein Glycoprotein, das die Proliferation von Vorläuferzellen und die Differenzierung zu Erythrozyten stimuliert Wird bei renaler Anämie (durch chronische Niereninsuffizienz eingesetzt) oder bei Tumoren, Lymphomen und Infektionen eingesetzt, bei denen BFU-E und CFUE durch hohe Konz. von Zytokinen gehemmt werden o Wird nicht bei Anämien eingesetzt, die aufgrund von VitB12-, Folsäure-, Eisenmangel entstehen Gelangt ins Knochenmark und wirkt dort auf burst forming units der Erythropoese (BFU-E) und CFU-E (colony) sowie erythroide Vorläuferzellen und stimuliert die Erythropoese, wodurch die Erythrozytenzahl steigt und die O2Versorgung verbessert wird. EPO bindet an seinen Rezeptor (ist eine RTK), bevor der JAK/STAT-Signalweg und die MAPK-Kaskade angestoßen wird. Dies führt zu Zellproliferation und Genexpression. Interferon alpha - In E. coli (Glycosylierung trägt nicht zu Wirkung bei) - Ist ein Interferon des Typs I; Glycosyliertes Protein, dessen Glycosylierung nicht zur Wirkung beiträgt - Wird bei chronischer Hepatitis B, Hepatitis C, Haarzell-Leukämie, KarposiSarkom eingesetzt - Wirkt antiproliferativ, antiviral, immunmodulatorisch. Aktiviert INF Typ 1Rezeptor, der über JAK/STAT-Signalweg Translation von mRNA hemmt, die Degradation von mRNA fördert und Virusreplikation verhindert. Gewebe-Plasminogenaktivator (t-PA) - In CHO (andere Produkte auch in E. coli) - Ist eine Protease, die Plasminogen in Plasmin umwandelt - Wird zur Fibrinolyse beim akuten Herzinfarkt, bei akuter massiver Lungenembolie und bei akutem ischämischen Schlaganfall eingesetzt - Ist als ternärer Komplex aus Fibrin und Plasminogen aktiv und wandelt Plasminogen zu Plasmin um, das wiederum das Fibrin im Fibrinnetz zu Fibrinpeptiden spaltet und somit die Auflösung von Blutgerinnseln (Fibrinolyse) bewerkstelligt. Zusatz: Klonierungsvektor Bestandteile: Ori für E. coli Selektionsmarker für E. coli MCS Häufig Reportergen (beta-Galactosidase) Expressionsvektor Bestandteile: Starker Promotor MCS hinter Promotor Terminatorsequenz Repressor/Induktor-System zur Regulation der Transkription/des Promotors Translationskontrolleinheiten (prokar. Shine-Dalgarno-Sequenz, Startcodon, Stoppcodon) Auxotrophiemarker mit Promotor und Terminator für Wirt Evtl. ori für Wirt Evtl Selektionsmarker für E. coli Evtl. ori für E. coli
