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Altklausur Rekombinante Wirkstoffe
1.a) In welchen Wirtssystemen werden heutzutage rekombinante Arzneistoffe produziert? (wissenschaftl.
Artname / Zelllinie)
Prokaryotisch

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Escherichia coli: allgemein für rekombinante Proteine
Bacillus subtilis: hauptsächlich für Proteasen
Eukaryotisch
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
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Hefen (Saccharomyces cerevisiae, Pischia pastoris)
Säugetierzellen (Chinese Hamster Ovary Cells, Baby Hamster Kidney Cells, Myelomzelle)
Insektenzellen (Sf9-Zellen, Sf21)
Pflanzenzellen (Karottenzelllinie)
Hybridoma-Zelllinien (transformierte Zelle eines B-Zell-Tumors mit Maus-B-Zelle fusioniert)
Transgene Tiere (Ziege)
1.b) Vergleiche die Wirtssysteme bezüglich Geschwindigkeit, Kosten, Glykosylierung
Vergleich der Expressionssysteme
Geschwindigkeit
Kosten
Glykosylierung
Faltung
Gesetzliche
Bestimmungen
Am
schlechtesten
Transgene Tiere
Tiere
Bakterien
Bakterien
Tiere
Am besten
Transgene
Pflanzen
Säugetierzellen
Hefezellen
Hefezellen
Pflanzen
Säugetierzellen
Insektenzellen
Hefezellen
Bakterien
Pflanzen
Pflanzen
Pflanzen
Insektenzellen
Insektenzellen
Insektenzellen
Insektenzellen
Hefezellen
Hefezellen
Tiere
Tiere
Bakterien
Bakterien
Säugetierzelle
Säugetierzelle
Säugetierzelle
2a) Erkläre die Funktion folgender Vektorelemente:
Vektorelement:
Funktion:
Beispiel:
Promotor
Lac-Operon
= DNA-Abschnitt an dem Transkriptionsfaktoren und die RNAPolymerase binden und die Transkription initiieren
Ein Promotor ist eine Nukleotid-Sequenz auf der DNA, die die
regulierte Expression eines Gens ermöglicht. Der Protomor ist ein
essenzieller Bestandteil eines Gens. Er liegt am 5‘-Ende des Gens.
Die wichtigste Eigenschaft des Promotors ist eine spezifische
Wechselwirkung mit bestimmten DNA-bindenen Proteinen, welche
den Start der Transkription des Gens durch RNA-Polymerase
vermitteln und als Transkriptionsfaktoren bezeichnet werden.
Sekretionssignal
= Reiz oder DNA-Sequenz (Protein)
--> ermöglichst das Ausschleusen zellulärer Produkte in den
Extrazellularraum
Ist eine Peptidsequenz, die mit dem gewünschten Peptid fusioniert
ist und es zu speziellen Kompartimenten dirigiert bzw. es
schließlich ins Medium sezernieren (ER  Golgi  sekretorischer
Weg) lässt.
PHO5 (Saure Phosphatase, Transkription
bei Phosphatmangel)
phoA-Gen (Alkalische Phosphatase)
Tags
Ein Tag ist ein Gen Abschnitt, der an den Gen-Abschnitt für das
eigentlich gewünschte Protein angehängt wird (z.B. His-tag, der für
kurze Histidin-Kette kodiert). Der entsprechende Rest hängt nach
der Expression am gewünschten Protein und kann aufgrund seiner
Eigenschaften zur Reinigung des Proteins genutzt werden:
 z.B. His-tag haftet an Ni2+Säule  Protein wird eluiert  Tag
wird mit Protease abgeschnitten  gereinigtes Protein
His-tag
Reportergen
Ein Reportergen ist ein Gen, mit Hilfe dessen bestimmte
Qualitäten und Effekte anderer Gene gezeigt werden können.
Dabei wird ein Reporterenzym, ein fluoreszentes Reporterprotein
oder ein detektierbares Antigen gelegentlich auch als
Fusionsprotein exprimiert.
Chloramphenicol-Acetyltransferase,
bakterielle beta-Galactosidase
Auxotrophiemarker
Befindet sich auf Plasmid
Isoliert Integrationsergeignis
TRP1
Korrigieren Mutationen in Genen des Wirtsgenoms, die für
essentielle Stoffwechselprozesse wichtig sind.
Ist ein rezessiver Selektionsmarker (= Gene, deren Produkte
genetische Defekte in Mutanten komplementieren).
2b) Erkläre Shuttle-Vektor
= Vektoren, die wir außer in Bakterien auch in einem anderen Organismus benutzen können
- Neukombination von DNA-Fragmenten findet fast ausschließlich in E. coli statt -> fast alle Vektoren tragen
Kontrollelemente für die Amplifikation und Selektion von Plasmiden in Bakterien (z.B. bakterieller
Replikationsursprung und Resistenzgen gegen ein Antibiotikum)
- wenn wir Plasmide zusätzlich in anderen Organismen, z.B. Hefe einsetzen wollen, brauchen wir auch Kontrollund Selektionselemente, die in Hefen funktionieren
- ein einfacher Hefe-Shuttle-Vektor kann z.B. einen Promotor und einen Transkriptionsterminator enthalten,
die die Expression eines Auxotrophie-Markers zur Selektion des Plasmides in Hefen steuern
- zusätzlich können die Vektoren auch Kontrollelemente zur Expression eines Transgens enthalten, dann
bezeichnet man sie als "Expressionsvektor"
Bestandteile:
 Origin of replication für E. coli
 Selektionsmarker für E. coli
 Promotor und Terminator für Selektionsmarker/Auxotrophiemarker für anderen Wirt
2c) Warum verwendet man zur heterologen Genexpression oft "regulierbare Promotoren"? Erklären Sie die
Regulation an Hand eines konkreten Beispiels!
Heterologe Genexpression = Expression von fremdem genetischem Material in einem Organismus, egal ob
Bakterium oder höherem Organismus
Wenn man ein Fremd-Gen in einen Organismus einführt, und dieses sofort exprimiert wird, wird es häufig vom
Organismus erkannt, woraufhin er sein Wachstum einstellt. Um dies zu verhindert, lässt man den
Wirtsorganismus zunächst Wachsen und schaltet erst ab einer bestimmten Dichte das Fremd-Gen ein. Hierzu
ist ein regulierbarer Promotor notwendig, also ein Protomor, der sich gezielt erst nach einer bestimmten Zeit
anschalten lässt.
Durch regulierbare Promotoren lässt sich eine Genexpression zum unerwünschten Zeitpunkt verhindern.
Toxische oder nichttoxische Genprodukte von wirtsfremden Genen können Wachstum der Zellen hemmen, da
diese vom Wirt erkannt werden. Deshalb induziert man die Genexpression erst am Ende der log-Phase, sodass
kein starkes Wachsen der Zellpopulation zu erwarten ist und eine Wachstumshemmung nicht ins Gewicht fällt.
Beispiel:
Durch das Lac-Operon lässt sich die Expression eines darin eingebauten Gens steuern. An den Operator kann
ein Repressor, der in Gegenwart von Glucose gebildet wird, binden, die Transkription inhibieren und somit
negativ regulieren. Durch Zugabe eines Induktors (IPTG) verändert Repressor seine Konformation, kann nicht
mehr binden und der lac-Promotor wird frei, wodurch die Transkription ablaufen kann.
Bei Abwesenheit von Glucose steigt intrazell. cAMP-Konz. an. cAMP bindet an CRP (cAMP-Rezeptor-Protein),
wodurch 2 CRP-Moleküle oberhalb des lac-Promotors binden. Dies erhöht die Affinität der RNA-Polymerase
zum lac-Promotor, was die Transkriptionseffizienz steigert. Dies ist eine positive Regulation.
Man gibt so viel Glucose dazu, dass sie kurz vor dem Ende der log-Phase verbraucht ist. Dann wird auch IPTG
zugegeben.
3) Nenne 8 rekombinante Wirkstoffe und erkläre knapp (stichwortartig) deren biologische Funktion und
pharmazeutische Anwendung
DNase I:
- In CHO-Zellen
- Schneidet die DNA in kürzere Fragmente
- Wird bei Mukoviszidose eingesetzt
- Durch gestörte mucoziliäre Clearance (aufgrund hochviskösen Schleims) entstehen häufig Infektion.
Dadurch wandern Leukozyten (vorwiegend Neutrophile) ein, die mit der Zeit zerfallen. Dabei wird DNA
freigesetzt, die den Schleim visköser macht
- DNase I führt zu kürzerer DNA und geringerer Viskosität
- Wird als Aerosol appliziert
Omalizumab
- In CHO-Zellen
- Humanisierter monoklonaler Antikörper
- Bindet Effektordomäne von IgE-Antikörpern
- Wird bei schwerem, persistierendem Asthma eingesetzt, wenn die Standardtherapie versagt
- Bindet die Effektordomäne von IgE-Antikörpern, sodass die Antikörper nicht mehr am IgE-Rezeptor auf
Mastzellen binden können. Dadurch wird die Degranulation vermindert und Rezeptordichte
herabreguliert
Muromomab
- Monoklonaler Antikörper
- Murin; auch in Mauszellen produziert
- Wird zur Behandlung einer steroidresistenten akuten Abstoßung von allogenen
Organtransplantationen eingesetzt
- Bindet CD3-Komplexe auf T-Zellen, wodurch die Signaltransduktion von über den T-Zellrezeptor
inhibiert wird. Der Komplex wird vom Immunsystem als fremd erkannt und T-Zellen dadurch
eliminiert.
Abciximab
- In Säugetier-Zellkulturen
- Ist das Fab-Fragment eines chimären murin-humanen AK des IgG-Typs gegen den GlycoproteinRezeptor GPIIb/IIIa
- Anwendung bei Koronarintervention (Stent-Implantation, Ballondilatation) und instabiler Angina
pectoris
- enthaltener Teil der konstanten Domäne ist human, variable AK-Region ist murin
- Bindung an GPIIb/IIIa verhindert, dass aktivierte Thrombozyten sich miteinander verbinden, wodurch
keine Thrombozytenaggregation stattfindet. Es wird eine Thrombosebildung verhindert
Somatotropin (= hGH = Somatropin)
- In E. coli
- Ist das menschliche Wachstumshormon
- Wird bei Mangel an GH im Kindesalter eingesetzt, die durch Gendefekte hervorgerufen werden
- Induziert in Leber über GHR die Bildung von IGF (Insulin-like growth Faktoren), die das Wachstum von
Muskeln, Organen und Knochen stimulieren. Es wirkt auch direkt auf den Fett, Eiweiß- und
Zuckerstoffwechsel, wobei freie Fettsäuren gebildet werden, die die Ausschüttung von GH aus der
Hypophyse hemmen. IGFs und GH inhibieren die Ausschüttung des WachstumshormonReleasingfaktors im Hypothalamus.
Erythropoetin
- In CHO-Zellen (Glycosylierung für HWZ entscheidend)
- Ist ein Glycoprotein, das die Proliferation von Vorläuferzellen und die Differenzierung zu Erythrozyten
stimuliert
- Wird bei renaler Anämie (durch chronische Niereninsuffizienz eingesetzt) oder bei Tumoren,
Lymphomen und Infektionen eingesetzt, bei denen BFU-E und CFU-E durch hohe Konz. von Zytokinen
gehemmt werden
o Wird nicht bei Anämien eingesetzt, die aufgrund von VitB12-, Folsäure-, Eisenmangel
entstehen
- Gelangt ins Knochenmark und wirkt dort auf burst forming units der Erythropoese (BFU-E) und CFU-E
(colony) sowie erythroide Vorläuferzellen und stimuliert die Erythropoese, wodurch die
Erythrozytenzahl steigt und die O2-Versorgung verbessert wird. EPO bindet an seinen Rezeptor (ist
eine RTK), bevor der JAK/STAT-Signalweg und die MAPK-Kaskade angestoßen wird. Dies führt zu
Zellproliferation und Genexpression.
Interferon alpha
- In E. coli (Glycosylierung trägt nicht zu Wirkung bei)
- Ist ein Interferon des Typs I; Glycosyliertes Protein, dessen Glycosylierung nicht zur Wirkung beiträgt
- Wird bei chronischer Hepatitis B, Hepatitis C, Haarzell-Leukämie, Karposi-Sarkom eingesetzt
- Wirkt antiproliferativ, antiviral, immunmodulatorisch. Aktiviert INF Typ 1-Rezeptor, der über
JAK/STAT-Signalweg Translation von mRNA hemmt, die Degradation von mRNA fördert und
Virusreplikation verhindert.
Gewebe-Plasminogenaktivator (t-PA)
- In CHO (andere Produkte auch in E. coli)
- Ist eine Protease, die Plasminogen in Plasmin umwandelt
- Wird zur Fibrinolyse beim akuten Herzinfarkt, bei akuter massiver Lungenembolie und bei akutem
ischämischen Schlaganfall eingesetzt
-
Ist als ternärer Komplex aus Fibrin und Plasminogen aktiv und wandelt Plasminogen zu Plasmin um,
das wiederum das Fibrin im Fibrinnetz zu Fibrinpeptiden spaltet und somit die Auflösung von
Blutgerinnseln (Fibrinolyse) bewerkstelligt.
Bevacizumab
Zur Behandlung der altersabhängigen Maculadegeneration
Vollständiger humanisierter Antikörper (aus Maus)
Optimierung im Phage-display
Altersabhängige Maculadegeneration:
-
-
entsteht durch Überlastung des Pigmentepithels im Bereich der Macula lutea und/oder
durch überaktive Immunzellen
jede Pigmentzelle muss täglich tausende von abgestoßenen Membranscheibchen der
Sensoraußenglieder abbauen
kann das Epithel die Abbauprodukte nicht mehr verarbeiten Ablagerungen / Drusen (=
extrazelluläre Protein und Lipidablagerungen)
Macrophagen wandern ein
abdichtende Membran wieder permeabel, sodass hyalines Material und Flüssigkeit in den
subepithelialen Raum eindringen können
später wachsen Gefäßschlingen über diesen Spaltraum bis zur Sensorschicht  heben Sensoren aus
der eigentlichen optischen Ebene  Verschlechterung des Sehvermögens
Blutungen --> Zerstörung des zentralen Abschnitts der Retina
Behandlung der Altersabhängigen Maculadegeneration:
-
VEGF (vaskular endothelial growth factor) = Faktor, der die Blutgefäßbildung fördert
VEGF binden an VEGF-2-Rezeptor  Kaskade  Genexpression, Zellproliferation, Migration,
Gefäßpermeabilität, Apoptose-Resistenz
 man kann den Faktor VEGF mit einem Antikörper (= Bevacizumab) ausschalten  Gefäßbildung
wird verhindert  es wird der Maculadegeneration entgegengewirkt
Cerezym 400 U
Zur Behandlung von Morbus Gaucher
In CHO-Zellen hergestellt
Ein Enzym
Morbus Gaucher:
-
Enzym β-Glucocerebrosidase fehlt
β-Glucocerebrosidase: in den Lysosomen der Makrophagen und anderen phagozytierenden Zellen
lokalisiert
 sorgt dort für den Abbau des im Stoffwechsel anfallenden Glukocerebrosid
 bei Fehlen des Enzyms: intrazelluläre Akkumulation von Glukocerebrosid  führt letztendlich zu
Gebwebsschädigung
Behandlung von Morbus Gaucher:
-
Problem: intrazelluläres Target!!  Glukocerebrosidase wurde vorwiegend von Leberzellen und nicht
den eigentlichen Zielzellen (phagozytierende Zellen) aufgenommen
Lösung: Makrophagen haben auf ihrer Oberfläche Mannosespezifische (Mannose-6-Phosphat)
Rezeptoren  Glukocerebrosidase enthielt Mannose; aber nicht entständig  Modifizierung
notwendig: Enzym muss mit 3 verschiedenen Zuckerspaltenden Enzymen behandelt werden 
Deglykosylierung  Produkt: Cerezym 400 U
Insulindetemir
-
Zur Behandlung von Diabetes
In s. cerevisiae hergestellt
Insulin in B-Kette um eine Aminosäure verkürzt  Insulin ist hoch affin zu Albumin  Komplex
entlässt Insulin nur langsam  lang-wirksames Insulin
Außerdem assoziieren Insulindetemir-Monomere zu Hexameren und Dihexameren  verzögerte
Freisetzung
Diabetes:
-
Diabetes entsteht durch Insulinmangel oder durch zu wenige und/oder beschädigte Insulinrezeptoren
Insulin bewirkt durch Signal-Kaskade Glucoseaufnahme in die Zellen
Kein Insulin  keine Glucoseaufnahme in Zellen  Blutzuckerspiegel steigt
Behandlung von Diabetes:
Insulinsubstitution z.B. in Form