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Altklausur Rekombinante Wirkstoffe 1.a) In welchen Wirtssystemen werden heutzutage rekombinante Arzneistoffe produziert? (wissenschaftl. Artname / Zelllinie) Prokaryotisch Escherichia coli: allgemein für rekombinante Proteine Bacillus subtilis: hauptsächlich für Proteasen Eukaryotisch Hefen (Saccharomyces cerevisiae, Pischia pastoris) Säugetierzellen (Chinese Hamster Ovary Cells, Baby Hamster Kidney Cells, Myelomzelle) Insektenzellen (Sf9-Zellen, Sf21) Pflanzenzellen (Karottenzelllinie) Hybridoma-Zelllinien (transformierte Zelle eines B-Zell-Tumors mit Maus-B-Zelle fusioniert) Transgene Tiere (Ziege) 1.b) Vergleiche die Wirtssysteme bezüglich Geschwindigkeit, Kosten, Glykosylierung Vergleich der Expressionssysteme Geschwindigkeit Kosten Glykosylierung Faltung Gesetzliche Bestimmungen Am schlechtesten Transgene Tiere Tiere Bakterien Bakterien Tiere Am besten Transgene Pflanzen Säugetierzellen Hefezellen Hefezellen Pflanzen Säugetierzellen Insektenzellen Hefezellen Bakterien Pflanzen Pflanzen Pflanzen Insektenzellen Insektenzellen Insektenzellen Insektenzellen Hefezellen Hefezellen Tiere Tiere Bakterien Bakterien Säugetierzelle Säugetierzelle Säugetierzelle 2a) Erkläre die Funktion folgender Vektorelemente: Vektorelement: Funktion: Beispiel: Promotor Lac-Operon = DNA-Abschnitt an dem Transkriptionsfaktoren und die RNAPolymerase binden und die Transkription initiieren Ein Promotor ist eine Nukleotid-Sequenz auf der DNA, die die regulierte Expression eines Gens ermöglicht. Der Protomor ist ein essenzieller Bestandteil eines Gens. Er liegt am 5‘-Ende des Gens. Die wichtigste Eigenschaft des Promotors ist eine spezifische Wechselwirkung mit bestimmten DNA-bindenen Proteinen, welche den Start der Transkription des Gens durch RNA-Polymerase vermitteln und als Transkriptionsfaktoren bezeichnet werden. Sekretionssignal = Reiz oder DNA-Sequenz (Protein) --> ermöglichst das Ausschleusen zellulärer Produkte in den Extrazellularraum Ist eine Peptidsequenz, die mit dem gewünschten Peptid fusioniert ist und es zu speziellen Kompartimenten dirigiert bzw. es schließlich ins Medium sezernieren (ER Golgi sekretorischer Weg) lässt. PHO5 (Saure Phosphatase, Transkription bei Phosphatmangel) phoA-Gen (Alkalische Phosphatase) Tags Ein Tag ist ein Gen Abschnitt, der an den Gen-Abschnitt für das eigentlich gewünschte Protein angehängt wird (z.B. His-tag, der für kurze Histidin-Kette kodiert). Der entsprechende Rest hängt nach der Expression am gewünschten Protein und kann aufgrund seiner Eigenschaften zur Reinigung des Proteins genutzt werden: z.B. His-tag haftet an Ni2+Säule Protein wird eluiert Tag wird mit Protease abgeschnitten gereinigtes Protein His-tag Reportergen Ein Reportergen ist ein Gen, mit Hilfe dessen bestimmte Qualitäten und Effekte anderer Gene gezeigt werden können. Dabei wird ein Reporterenzym, ein fluoreszentes Reporterprotein oder ein detektierbares Antigen gelegentlich auch als Fusionsprotein exprimiert. Chloramphenicol-Acetyltransferase, bakterielle beta-Galactosidase Auxotrophiemarker Befindet sich auf Plasmid Isoliert Integrationsergeignis TRP1 Korrigieren Mutationen in Genen des Wirtsgenoms, die für essentielle Stoffwechselprozesse wichtig sind. Ist ein rezessiver Selektionsmarker (= Gene, deren Produkte genetische Defekte in Mutanten komplementieren). 2b) Erkläre Shuttle-Vektor = Vektoren, die wir außer in Bakterien auch in einem anderen Organismus benutzen können - Neukombination von DNA-Fragmenten findet fast ausschließlich in E. coli statt -> fast alle Vektoren tragen Kontrollelemente für die Amplifikation und Selektion von Plasmiden in Bakterien (z.B. bakterieller Replikationsursprung und Resistenzgen gegen ein Antibiotikum) - wenn wir Plasmide zusätzlich in anderen Organismen, z.B. Hefe einsetzen wollen, brauchen wir auch Kontrollund Selektionselemente, die in Hefen funktionieren - ein einfacher Hefe-Shuttle-Vektor kann z.B. einen Promotor und einen Transkriptionsterminator enthalten, die die Expression eines Auxotrophie-Markers zur Selektion des Plasmides in Hefen steuern - zusätzlich können die Vektoren auch Kontrollelemente zur Expression eines Transgens enthalten, dann bezeichnet man sie als "Expressionsvektor" Bestandteile: Origin of replication für E. coli Selektionsmarker für E. coli Promotor und Terminator für Selektionsmarker/Auxotrophiemarker für anderen Wirt 2c) Warum verwendet man zur heterologen Genexpression oft "regulierbare Promotoren"? Erklären Sie die Regulation an Hand eines konkreten Beispiels! Heterologe Genexpression = Expression von fremdem genetischem Material in einem Organismus, egal ob Bakterium oder höherem Organismus Wenn man ein Fremd-Gen in einen Organismus einführt, und dieses sofort exprimiert wird, wird es häufig vom Organismus erkannt, woraufhin er sein Wachstum einstellt. Um dies zu verhindert, lässt man den Wirtsorganismus zunächst Wachsen und schaltet erst ab einer bestimmten Dichte das Fremd-Gen ein. Hierzu ist ein regulierbarer Promotor notwendig, also ein Protomor, der sich gezielt erst nach einer bestimmten Zeit anschalten lässt. Durch regulierbare Promotoren lässt sich eine Genexpression zum unerwünschten Zeitpunkt verhindern. Toxische oder nichttoxische Genprodukte von wirtsfremden Genen können Wachstum der Zellen hemmen, da diese vom Wirt erkannt werden. Deshalb induziert man die Genexpression erst am Ende der log-Phase, sodass kein starkes Wachsen der Zellpopulation zu erwarten ist und eine Wachstumshemmung nicht ins Gewicht fällt. Beispiel: Durch das Lac-Operon lässt sich die Expression eines darin eingebauten Gens steuern. An den Operator kann ein Repressor, der in Gegenwart von Glucose gebildet wird, binden, die Transkription inhibieren und somit negativ regulieren. Durch Zugabe eines Induktors (IPTG) verändert Repressor seine Konformation, kann nicht mehr binden und der lac-Promotor wird frei, wodurch die Transkription ablaufen kann. Bei Abwesenheit von Glucose steigt intrazell. cAMP-Konz. an. cAMP bindet an CRP (cAMP-Rezeptor-Protein), wodurch 2 CRP-Moleküle oberhalb des lac-Promotors binden. Dies erhöht die Affinität der RNA-Polymerase zum lac-Promotor, was die Transkriptionseffizienz steigert. Dies ist eine positive Regulation. Man gibt so viel Glucose dazu, dass sie kurz vor dem Ende der log-Phase verbraucht ist. Dann wird auch IPTG zugegeben. 3) Nenne 8 rekombinante Wirkstoffe und erkläre knapp (stichwortartig) deren biologische Funktion und pharmazeutische Anwendung DNase I: - In CHO-Zellen - Schneidet die DNA in kürzere Fragmente - Wird bei Mukoviszidose eingesetzt - Durch gestörte mucoziliäre Clearance (aufgrund hochviskösen Schleims) entstehen häufig Infektion. Dadurch wandern Leukozyten (vorwiegend Neutrophile) ein, die mit der Zeit zerfallen. Dabei wird DNA freigesetzt, die den Schleim visköser macht - DNase I führt zu kürzerer DNA und geringerer Viskosität - Wird als Aerosol appliziert Omalizumab - In CHO-Zellen - Humanisierter monoklonaler Antikörper - Bindet Effektordomäne von IgE-Antikörpern - Wird bei schwerem, persistierendem Asthma eingesetzt, wenn die Standardtherapie versagt - Bindet die Effektordomäne von IgE-Antikörpern, sodass die Antikörper nicht mehr am IgE-Rezeptor auf Mastzellen binden können. Dadurch wird die Degranulation vermindert und Rezeptordichte herabreguliert Muromomab - Monoklonaler Antikörper - Murin; auch in Mauszellen produziert - Wird zur Behandlung einer steroidresistenten akuten Abstoßung von allogenen Organtransplantationen eingesetzt - Bindet CD3-Komplexe auf T-Zellen, wodurch die Signaltransduktion von über den T-Zellrezeptor inhibiert wird. Der Komplex wird vom Immunsystem als fremd erkannt und T-Zellen dadurch eliminiert. Abciximab - In Säugetier-Zellkulturen - Ist das Fab-Fragment eines chimären murin-humanen AK des IgG-Typs gegen den GlycoproteinRezeptor GPIIb/IIIa - Anwendung bei Koronarintervention (Stent-Implantation, Ballondilatation) und instabiler Angina pectoris - enthaltener Teil der konstanten Domäne ist human, variable AK-Region ist murin - Bindung an GPIIb/IIIa verhindert, dass aktivierte Thrombozyten sich miteinander verbinden, wodurch keine Thrombozytenaggregation stattfindet. Es wird eine Thrombosebildung verhindert Somatotropin (= hGH = Somatropin) - In E. coli - Ist das menschliche Wachstumshormon - Wird bei Mangel an GH im Kindesalter eingesetzt, die durch Gendefekte hervorgerufen werden - Induziert in Leber über GHR die Bildung von IGF (Insulin-like growth Faktoren), die das Wachstum von Muskeln, Organen und Knochen stimulieren. Es wirkt auch direkt auf den Fett, Eiweiß- und Zuckerstoffwechsel, wobei freie Fettsäuren gebildet werden, die die Ausschüttung von GH aus der Hypophyse hemmen. IGFs und GH inhibieren die Ausschüttung des WachstumshormonReleasingfaktors im Hypothalamus. Erythropoetin - In CHO-Zellen (Glycosylierung für HWZ entscheidend) - Ist ein Glycoprotein, das die Proliferation von Vorläuferzellen und die Differenzierung zu Erythrozyten stimuliert - Wird bei renaler Anämie (durch chronische Niereninsuffizienz eingesetzt) oder bei Tumoren, Lymphomen und Infektionen eingesetzt, bei denen BFU-E und CFU-E durch hohe Konz. von Zytokinen gehemmt werden o Wird nicht bei Anämien eingesetzt, die aufgrund von VitB12-, Folsäure-, Eisenmangel entstehen - Gelangt ins Knochenmark und wirkt dort auf burst forming units der Erythropoese (BFU-E) und CFU-E (colony) sowie erythroide Vorläuferzellen und stimuliert die Erythropoese, wodurch die Erythrozytenzahl steigt und die O2-Versorgung verbessert wird. EPO bindet an seinen Rezeptor (ist eine RTK), bevor der JAK/STAT-Signalweg und die MAPK-Kaskade angestoßen wird. Dies führt zu Zellproliferation und Genexpression. Interferon alpha - In E. coli (Glycosylierung trägt nicht zu Wirkung bei) - Ist ein Interferon des Typs I; Glycosyliertes Protein, dessen Glycosylierung nicht zur Wirkung beiträgt - Wird bei chronischer Hepatitis B, Hepatitis C, Haarzell-Leukämie, Karposi-Sarkom eingesetzt - Wirkt antiproliferativ, antiviral, immunmodulatorisch. Aktiviert INF Typ 1-Rezeptor, der über JAK/STAT-Signalweg Translation von mRNA hemmt, die Degradation von mRNA fördert und Virusreplikation verhindert. Gewebe-Plasminogenaktivator (t-PA) - In CHO (andere Produkte auch in E. coli) - Ist eine Protease, die Plasminogen in Plasmin umwandelt - Wird zur Fibrinolyse beim akuten Herzinfarkt, bei akuter massiver Lungenembolie und bei akutem ischämischen Schlaganfall eingesetzt - Ist als ternärer Komplex aus Fibrin und Plasminogen aktiv und wandelt Plasminogen zu Plasmin um, das wiederum das Fibrin im Fibrinnetz zu Fibrinpeptiden spaltet und somit die Auflösung von Blutgerinnseln (Fibrinolyse) bewerkstelligt. Bevacizumab Zur Behandlung der altersabhängigen Maculadegeneration Vollständiger humanisierter Antikörper (aus Maus) Optimierung im Phage-display Altersabhängige Maculadegeneration: - - entsteht durch Überlastung des Pigmentepithels im Bereich der Macula lutea und/oder durch überaktive Immunzellen jede Pigmentzelle muss täglich tausende von abgestoßenen Membranscheibchen der Sensoraußenglieder abbauen kann das Epithel die Abbauprodukte nicht mehr verarbeiten Ablagerungen / Drusen (= extrazelluläre Protein und Lipidablagerungen) Macrophagen wandern ein abdichtende Membran wieder permeabel, sodass hyalines Material und Flüssigkeit in den subepithelialen Raum eindringen können später wachsen Gefäßschlingen über diesen Spaltraum bis zur Sensorschicht heben Sensoren aus der eigentlichen optischen Ebene Verschlechterung des Sehvermögens Blutungen --> Zerstörung des zentralen Abschnitts der Retina Behandlung der Altersabhängigen Maculadegeneration: - VEGF (vaskular endothelial growth factor) = Faktor, der die Blutgefäßbildung fördert VEGF binden an VEGF-2-Rezeptor Kaskade Genexpression, Zellproliferation, Migration, Gefäßpermeabilität, Apoptose-Resistenz man kann den Faktor VEGF mit einem Antikörper (= Bevacizumab) ausschalten Gefäßbildung wird verhindert es wird der Maculadegeneration entgegengewirkt Cerezym 400 U Zur Behandlung von Morbus Gaucher In CHO-Zellen hergestellt Ein Enzym Morbus Gaucher: - Enzym β-Glucocerebrosidase fehlt β-Glucocerebrosidase: in den Lysosomen der Makrophagen und anderen phagozytierenden Zellen lokalisiert sorgt dort für den Abbau des im Stoffwechsel anfallenden Glukocerebrosid bei Fehlen des Enzyms: intrazelluläre Akkumulation von Glukocerebrosid führt letztendlich zu Gebwebsschädigung Behandlung von Morbus Gaucher: - Problem: intrazelluläres Target!! Glukocerebrosidase wurde vorwiegend von Leberzellen und nicht den eigentlichen Zielzellen (phagozytierende Zellen) aufgenommen Lösung: Makrophagen haben auf ihrer Oberfläche Mannosespezifische (Mannose-6-Phosphat) Rezeptoren Glukocerebrosidase enthielt Mannose; aber nicht entständig Modifizierung notwendig: Enzym muss mit 3 verschiedenen Zuckerspaltenden Enzymen behandelt werden Deglykosylierung Produkt: Cerezym 400 U Insulindetemir - Zur Behandlung von Diabetes In s. cerevisiae hergestellt Insulin in B-Kette um eine Aminosäure verkürzt Insulin ist hoch affin zu Albumin Komplex entlässt Insulin nur langsam lang-wirksames Insulin Außerdem assoziieren Insulindetemir-Monomere zu Hexameren und Dihexameren verzögerte Freisetzung Diabetes: - Diabetes entsteht durch Insulinmangel oder durch zu wenige und/oder beschädigte Insulinrezeptoren Insulin bewirkt durch Signal-Kaskade Glucoseaufnahme in die Zellen Kein Insulin keine Glucoseaufnahme in Zellen Blutzuckerspiegel steigt Behandlung von Diabetes: Insulinsubstitution z.B. in Form
