Molekulare Mechanismen der antikörpervermittelten Hepatitis C
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Aus der Abteilung Innere Medizin II der Medizinischen Universitätsklinik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Molekulare Mechanismen der antikörpervermittelten Hepatitis C Virus Neutralisation Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Vorgelegt 2009 von Anita Silvia Haberstroh geboren in Herbolzheim Dekan: Prof. Dr. Ch. Peters Erstgutachter: Prof. Dr. Dr. h.c. mult. H. E. Blum Zweitgutachter: Prof. Dr. C. Waller Jahr der Promotion: 2008 Akkürzungsverzeichnis Abkürzungen AII aa Abb. AK ALT aP ApoC-I bp BSA BV CD cDNA CMV C1qR C-terminal DC dH2O DNA DMSO E1/E2 EDTA ER FACS FCS FSME GFP GOT GPT γ – GT HAV HBV HCC HCV HCVcc HCV-LPs HCVpp HDL HIV HVR-1 IFN-α/IFN-γ IgG IL-2 IRF3 IRES ISDR Jak-STAT JFH-1 kDa Apolipoprotein II amino acid Abbildung Antikörper Alanin-Amino-Transferase Alkalische Phosphatase Apolipoprotein C-I Basenpaar Rinderserumalbumin Baculovirus cluster of differentiation complementary deoxyribonucleic acid Cytomegalievirus complement receptor carboxyterminal dendritic cell zweifach destilliertes Wasser Desoxyribonukleinsäure Dimethylsulfoxid envelope glycoproteins 1 and 2 Ethylendiamintetraacetat endoplasmatisches Retikulum fluorescence activated cell sorter fetal calf serum Frühsommer-Meningoenzephalitis green fluorescent protein Glutamat-Oxalacetat-Transaminase Glutamat-Pyruvat-Transaminase γ - Glutamyltransferase Hepatitis A Virus Hepatitis B Virus Hepatozelluläres Karzinom Hepatitis C Virus cell culture-derived HCV HCV-like particles HCV pseudotyped particles high density lipoprotein human immunodeficiency virus hypervariable Region 1 Interferon-α/Interferon-γ Immunglobulin G Interleukin-2 interferon regulatory factor Internal ribosomal enrty site IFN-α Sensitivität-determinierende Region Janus kinase, signal transducers and activators of transcription Japanese fulminant Hepatitis kilo Dalton I Akkürzungsverzeichnis LDL Lsg. mAb MFI MHC min MLV MOI MW NANB NC NK nm NOB NS2A-5B N-terminal OD ORF PAGE PBS PCR PE PFA pfu pH PKR PVDF RNA rpm RT RT-PCR SDS SR-BI Tab. Th Tn 7 Tris TEMED TNF-α UTR v w low density lipoprotein Lösung monoklonaler Antikörper mean fluorescence intensity major histocompatibility complex Minute murine leukemia virus multiplicity of infection molecular weight Non A Non B negative control natürliche Killerzelle Nanometer neutralization of binding nonstructural protein 2A-5B aminoterminal optische Dichte offener Leserahmen Polyacrylamidgelelektrophorese phosphat buffered saline polymerase chain reaction Phycoerythrin Paraformaldehyd plaque forming unit potentia hydrogenii double-stranded RNA-dependent protein kinase Polyvinyliden-Difluorid Ribonukleinsäure rounds per minute Raumtemperatur Reverse-Transcriptions-PCR Natriumdodecylsulfat Scavenger Rezeptor Typ B Klasse I Tabelle T-Helferzelle Transposon 7 Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin Tumor-Nekrose-Faktor-α untranslatierte Region volume weight II Inhaltsverzeichnis III Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...................................................................................................................... 1 1.1 Klinische Bedeutung des Hepatitis C Virus ................................................................... 1 1.2 Molekularbiologie des HCV........................................................................................... 3 1.3 Virale Bindung und zelluläre Aufnahme........................................................................ 8 1.4 Pathogenese, humorale und zelluläre Immunantwort .................................................. 10 1.5 Bedeutung neutralisierender Antikörper ...................................................................... 12 1.6 Modellsysteme zur Untersuchung der Virus-Wirtszellinteraktion............................... 13 1.6.1 Hepatitis C Virus-ähnliche Partikel (HCV-LP)............................................................ 13 1.6.2 HCV Pseudopartikel (HCVpp)..................................................................................... 15 1.6.3 Rekombinante infektiöse HCV Virionen (HCVcc)...................................................... 16 1.7 Ziele der Arbeit............................................................................................................. 17 2 Material und Methoden ............................................................................................. 18 2.1 Materialien und biologische Proben............................................................................. 18 2.1.1 Antibiotika.................................................................................................................... 18 2.1.2 Antikörper..................................................................................................................... 18 2.1.3 Chemikalien.................................................................................................................. 19 2.1.4 Geräte und Verbrauchsmaterialien ............................................................................... 20 2.1.5 Software........................................................................................................................ 21 2.1.6 Zellkulturmedien und Zellinien.................................................................................... 21 2.1.7 Serumproben von HCV positiven Patienten................................................................. 22 2.1.8 Aufreinigung von Anti-HCV-IgG aus humanem Serum.............................................. 22 2.1.9 Proteinkonzentrationsbestimmung mit Hilfe des Bradford-Tests ................................ 23 2.2 Zellkultur ...................................................................................................................... 23 2.3 Synthese von HCV-LPs im Baculovirus-Insektenzellsystem und Bindung an Huh-7-Zellen ................................................................................................................ 24 2.4 Synthese von HCV Pseudopartikeln (HCVpp) und Infektion von Huh-7 Zellen ........ 25 2.5 Prinzip der Durchflußzytometrie (FACS) .................................................................... 26 2.6 Analyse der zellulären HCVpp Aufnahme mittels FACS............................................ 27 2.7 Hemmung zellulärer HCVpp Infektionen mittels HCV positiver Seren auf Bindungs- und Postbindungsebene .............................................................................. 28 2.8 Synthese von rekombinanten Virionen (HCVcc) und Infektion von Huh-7 Zellen..... 28 2.8.1 Prinzip der HCVcc-Infektionsdetektion (Luciferase assay)......................................... 29 Inhaltsverzeichnis IV 3 Ergebnisse ................................................................................................................... 30 3.1 Humane anti-HCV IgGs neutralisieren die HCVpp Infektion auf einem späteren Schritt nach der viralen Bindung an die Zielzelle ........................................................ 30 3.2 Monoklonale anti-E2 und anti-E1 Antikörper beeinflussen die HCV Infektion sowohl auf Bindungs- sowie auf Postbindungsebene .................................................. 34 3.3 Untersuchung der viralen Aufnahmeschritte, welche das Ziel neutralisierender Antikörper darstellen, mittels eines Kinetik-Assays .................................................... 37 3.4 Analyse der Antikörper-vermittelten Neutralisation unter Verwendung des HCVcc-Modellsystems ................................................................................................ 39 4 Diskussion ................................................................................................................... 42 4.1 Das Angriffsziel neutralisierender Antikörper in HCV-positiven Patientenseren besteht in Schritten nach der Bindung an die Wirtszelle ............................................. 42 4.2 Charakterisierung der Virushüllglykoproteine E1 und E2 als Ziel neutralisierender Antikörper .................................................................................................................... 43 4.3 Validierung der Ergebnisse unter Verwendung des HCVcc-Systems ......................... 44 4.4 Bedeutung neutralisierender Antikörper für die Pathogenese der HCV-Infektion ...... 44 5 Zusammenfassung...................................................................................................... 46 6 Literaturverzeichnis................................................................................................... 47 7 Danksagung................................................................................................................. 57 8 Lebenslauf ................................................................................................................... 58 9 Eigene Veröffentlichungen ........................................................................................ 59 Einleitung 1 1 Einleitung 1.1 Klinische Bedeutung des Hepatitis C Virus Das Hepatitis C Virus gehört zu den weltweit wichtigsten Erregern der chronischen Hepatitis. Man schätzt das 3 % der Weltbevölkerung mit HCV infiziert sind. Der Mensch stellt den einzigen natürlichen Wirt für das Hepatitis C Virus dar. Die Übertragung erfolgt parenteral durch Blut und Blutprodukte. In den entwickelten Ländern stellt der intravenöse Drogenmissbrauch den wichtigsten HCV-Transmissionsweg dar. Die Mehrzahl der HCVinfizierten Patienten erkrankt an einer chronischen Hepatitis, die in ihrem weiteren Verlauf zur Leberzirrhose (20-30% der chronisch infizierten Patienten) und zum HCC (1-5% der chronisch infizierten Patienten) fortschreiten kann (19). Die akute HCV-Infektion verläuft bei den meisten Patienten asymptomatisch und anikterisch. Nur bei einem Drittel der Betroffenen kommt es zu klinischen Symptomen. Die Inkubationszeit beträgt zwischen 2 und 26 Wochen, im Durchschnitt etwa 7-8 Wochen (47). Eine fulminant ablaufende Hepatitis in dieser Phase der Infektion ist extrem selten (26). Folgende Faktoren scheinen mit einer spontanen Ausheilung assoziiert zu sein: Jugendliches Alter, weibliches Geschlecht und bestimmte MHC-Gene (69). Ein chronischer Verlauf ist anzunehmen wenn die Virus-RNA länger als 6 Monate nachweisbar ist; dies ist bei 60-65% der Infizierten der Fall (69). Die meisten Patienten sind lange beschwerdefrei oder haben unspezifische Krankheitszeichen. Die wichtigsten Langzeitkomplikationen der chronischen Hepatitis C stellen die Leberzirrhose und das Hepatozelluläre Karzinom dar (86). Zu den extrahepatischen Manifestationen der HCV-Infektion gehören: Kryoglobulinämie, Non-Hodgkin B-Zell-Lymphom, Glomerulonephritis, seronegative Arthritis, Keratokonjunktivitis sicca, Sialadenitis, Lichen ruber planus, Neuropathie sowie die Induktion einer Porphyria cutanea tarda (40, 41). Ein Impfstoff ist derzeit nicht verfügbar. Die Standardtherapie der chronischen Hepatitis besteht derzeit aus einer Kombination aus pegyliertem Interferon mit Ribavirin. Grenzen der derzeitigen Therapie sind gekennzeichnet durch die fehlende Viruslimination in einem Großteil der behandelten Patienten, das ausgeprägte Nebenwirkungsprofil der Medikamente sowie die hohen Therapiekosten (30). Die Infektion mit HCV stellt zunehmend ein epidemiologisches, ein klinisches und auch ein kostenträchtiges Problem dar. Einleitung 2 Mittels ultrasensitiver Nachweismethoden wie der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) kann das HCV auch in weiteren Körperflüssigkeiten wie Speichel, Schweiß, Tränen, Sperma und Muttermilch identifiziert werden. Durch die Einführung einer systematischen Testung von Blutprodukten auf HCV-Antikörper und Verwendung der Nukleinsäure- Amplifikationstechnik (NAT) konnte das Risiko einer HCV-Infektion bis etwa 1997 auf 1:103.000 Bluttransfusionen heute auf etwa 1:2.000.000 gesenkt werden (54). Die Diagnostik einer HCV-Infektion stützt sich neben der Bestimmung der laborchemischen Parameter der Leberschädigung, wie Serumtransaminasen (GOT, GPT), γ-GT, alkalische Phosphatase (aP), Bilirubin und Albumin, auf den Nachweis antiviraler Antikörper und der HCV-RNA (86). Die Serokonversion tritt im Durchschnitt sieben bis acht Wochen nach Beginn der Infektion auf (Abb. 1.1) (77). A: HCV Infektion mit effektiver Immunantwort (limitierter Verlauf) HCV-RNA 108 ALT (U/L) 800 106 600 Symptome 400 104 CD4+/CD8+ T-Zell Antwort ALT 102 200 HCV-RNA (U/ml) 1000 Normbereich 0 Wochen Wochen bis Monate Jahre B: HCV Infektion mit ineffektiver Immunantwort (chronischer Verlauf) HCV-RNA 108 ALT (U/L) 800 106 600 Symptome 104 400 ALT 200 CD4+/CD8+ T-Zell Antwort 102 HCV-RNA (U/ml) 1000 Normbereich 0 Wochen Wochen bis Monate Jahre Abb. 1.1: Zeitverlauf von HCV-RNA, ALT (GPT) und CD4/CD8 T-Zell-Antwort bei Patienten mit akuter, spontan ausheilender Hepatitis C (A) oder akuter Hepatitis C und chronischem Verlauf (B) (40). Einleitung 3 Anti-HCV-Antikörper sind bei 50-70% der Patienten zu Beginn der klinischen Symptome nachweisbar; im weiteren Verlauf der Erkrankung sind sie auch bei chronisch infizierten Patienten zu detektieren (77). In der Regel nimmt der Antikörpertiter im Verlauf der Erkrankung ab, Antikörper können aber selbst bei spontan ausheilender Infektion ein Leben lang nachweisbar sein (53). Bei einer chronischen Infektion persistieren anti-HCV-Antikörper unbegrenzt. Der PCR-Nachweis im Serum ist heute von entscheidender Bedeutung. Die HCV-RNA ist im Serum ein bis zwei Wochen nach Infektion nachweisbar (77, 98). Die Bestimmung des Genotyps erfolgt durch direkte Sequenzierung von NS5B oder der E1Region mit anschließendem Sequenzabgleich mit Referenzsequenzen und phylogenetischen Analysen (95). 1.2 Molekularbiologie des HCV Das Hepatitis C Virus (Genus: Hepacivirus) gehört zur Familie der Flaviviridae. In dieser Familie, zu der z. B. auch die Erreger von Gelbfieber und die Pestiviren gehören, bilden die Hepaciviren mit dem HCV eine eigenständige Gattung. Das Virion enthält ein positivsträngiges RNA-Genom mit einer Länge von 9600 Nucleotiden. Das Genom beginnt mit einer hochkonservierten nicht-kodierenden Region von 341 Nukleotiden, die eine interne Ribosomenbindungsstelle enthält und die Expression des HCV-Polyproteins steuert. Dem nicht kodierenden 5´-Ende schließt sich ein offener Leserahmen mit 9030-9099 Nukleotiden an. Am 3´-Ende findet sich eine weitere nicht-kodierende Region, die von einem poly(U)Strang gefolgt von einer hochkonservierten Region von 98 Nukleotiden beendet wird. Die Translation des Leserahmens führt zu einem einzigen Polyprotein, das sich aus 3010-3030 Aminosäuren zusammensetzt. Die weitere Prozessierung erfolgt mittels zellulärer und viraler Proteasen in die Strukturproteine Capsidprotein C (Core), die Hüllglykoproteine E1 und E2, das Protein p7 und die Nicht-Strukturproteine NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B (2, 57). Einleitung 4 Offener Leserahmen ~ 3011 Kodons Strukturproteine NichtStrukturproteine 5´UTR 3´UTR HVR 1 HVR 2 Core E1 Nukleokapsid E2 p7 NS2 Ionenkanal Hüllproteine NS3 NS4A Serinprotease RNA Helikase Zysteinprotease NS4B NS5A RNA - abhängige RNA - Polymerase Membran alterationen Serinprotease Kofaktor NS5B Phospho protein Abb. 1.2: Organisation des HCV-Genoms (47). HCV, ein Einzelstrang RNA-Virus von 9.5 kb, besteht aus einem einzelnen offenen Leserahmen mit zwei untranslatierten Regionen (UTRs). Es codiert ein Polyprotein, welches in einzelne Proteine gespalten wird. Dies geschieht in der Strukturregion und am Übergang zur NichtStrukturregion durch eine zelluläre Signalpeptidase (●), am Übergang zwischen NS2 und NS3 durch eine Autoprotease (offener Pfeil) und in der Nichtstrukturregion durch die HCV-codierten Proteasen (schwarze geschlossene Pfeile). Die Strukturproteine beinhalten das Core-Protein und zwei Hüllproteine (E1 und E2). Zwei Regionen im E2-Protein, genannt hypervariable Regionen 1 und 2 (HVR-1 und HVR-2), zeigen starke SequenzVeränderungen. Für diese wird angenommen, dass sie das Ergebnis des Selektionsdrucks durch Virusspezifische Antikörper sind. Den Nichtstrukturproteinen wurden Funktionen als Ionenkanal (P7), Proteasen (NS2, NS3 und NS4A), Helicase (NS3) und RNA-abhängiger RNA-Polymerase (NS5B) zugewiesen. Die beiden Hüllproteine E1 und E2 bilden ein Heterodimer (74), welches als Strukturuntereinheit der viralen Hülle des HCV-Virions beschrieben wird. Die korrekte Faltung der E1- und E2-Hüllproteine im E1/E2-Heterodimer kann durch die Interaktion mit definierten monoklonalen Anti-E2-Antikörpern charakterisiert werden. Diese Antikörper sind gegen konformationsabhängige Epitope des E2-Proteins gerichtet (23). Die Hüllproteine sind hochglykosylierte Typ-I-Membranproteine (60). Das Molekulargewicht des glykosylierten E1- bzw. E2-Proteins beträgt nach Expression in Säugetierzellen etwa 31 kDa bzw. 70 kDa (60). In Abwesenheit von E2 entstehen missgefaltete E1-Proteine, so dass E2 möglicherweise als Chaperon fungiert (65). Die E1- und E2-Proteine verfügen über Signalsequenzen am Cterminalen Ende der Transmembran-Domänen, welche für die Membranverankerung, E1/E2Heterodimerisation und Retention im ER wichtig sind (21). An den Carboxyterminus des E2Proteins schließt sich das p7-Protein an, dessen Funktion noch nicht abschließend geklärt ist. Bisherige Untersuchungen zu diesem Molekül beschreiben es als wichtigen Bestandteil in der Vermittlung des intrazellulären Zusammenbaus und anschließendem Freisetzens des infektiösen Virions. Weiterhin scheint p7 die genotypspezifische Virusproduktion zu Einleitung 5 verstärken und führt damit auch zur Persistenz des Virus in der Zielzelle. Die zelluläre Aufnahme des Virus scheint p7-unabhängig zu sein (96). Im aminoterminalen Bereich des E2-Proteins (aa 384-410 / 474-480) liegen die sog. „hypervariablen Regionen“ HVR-1 und HVR-2. Sie unterscheiden sich bei den meisten Virusisolaten und für diese Regionen konnte ein extrem hoher Nukleotidaustausch nachgewiesen werden (60). Die HVR-1 wird an der Virusoberfläche exprimiert und dient als B-Zell-Epitop (92). Die Antikörper des Wirts sind vor allem gegen Strukturen an der Oberfläche des Virus, insbesondere gegen die Epitope der HVR-1 gerichtet (42). Das E2-Protein scheint auch bei der Virus-Wirtszell-Interaktion eine wichtige Rolle zu spielen indem es die Bindung des Virus an die Zielzelle vermittelt. Die Virushüllglykoproteine E1 und E2 scheinen eine wichtige Bedeutung für die Vermittlung der Membranfusion darzustellen. Lavillette et al. konnten mindestens drei Regionen (aa 270-284, 416-430 und 600-620) charakterisieren, welche den Membranfusionprozess beeinflussen können. Dies scheint wohl einerseits über direkte Interaktion mit der Lipidmembran und andererseits durch Unterstützung des Fusionsprozesses durch Konformationsänderungen des E1/E2-Komplexes vermittelt zu werden (49). Einleitung Genetisches Element 6 Funktion Regulatorische Sequenzen 5’UTR IRES (internal ribosomal entry site) für die Translation, Replikation 3’UTR Translation (Verpackung des viralen Genoms) und Replikation Virale Proteine Core Nukleokapsid, Assembly E1 und E2 Hüllproteine, Assembly, Rezeptorbindung und Zelleintritt, Membranfusion p7 Ionenkanal, Assembly, Release NS2 NS2-3-Protease NS3 NS2-3-Protease, Serinprotease, NTPase und RNAHelicase, Assembly NS4A Kofaktor für die NS3-Proteaseaktivität, Replikation NS4B Replikation NS5A Phosphoprotein, Replikation, ISDR, Assembly, Release NS5B RNA-abhängige RNA-Polymerase Tab. 1.1: Funktion der einzelnen genetischen Elemente des HCV (55, 61). Einleitung 7 Bislang sind sechs Hauptgenotypen und mehr als 50 Subtypen des HCV mit erheblicher Nukleotidsequenzvariation beschrieben worden (Tab. 1.2) (35). Während der Genotyp 1a vor allem in den USA und Nordeuropa verbreitet ist, zeichnet sich der Genotyp 1b mit weltweiter Verbreitung aus und ist der in Mitteleuropa am häufigsten gefundene Genotyp. Die Genotypen 2a und 2b sind ebenfalls weltweit verbreitet und repräsentieren 10% bis 20% der HCV-Genotypen. Der Genotyp 3 ist am häufigsten auf dem indischen Subkontinent anzutreffen. Der Genotyp 4 ist der häufigste Genotyp in Afrika und im mittleren Osten. Die Genotypen 5 und 6 sind selten und wurden in Südafrika (Genotyp 5) und Südostasien (Genotyp 6) isoliert. Die HCV-Genotypen unterscheiden sich nur wenig in ihrem klinischen Erscheinungsbild (40). Das Ansprechen auf eine Interferon-α Therapie ist unterschiedlich zwischen den Genotypen. Die Ansprechraten bei Patienten mit Genotyp 2 und 3 sind ca. doppelt so hoch wie bei Patienten mit Genotyp 1 (55). Die Rate der Virusproduktion bei der HCV-Infektion ist hoch. Jede Leberzelle bildet ungefähr 50 HCV-Partikel pro Tag (71); dies entspricht 1010 bis 1012 Virionen (3, 83). Die hohe Virusreplikation und das Fehlen einer Fehlerkorrektur durch die HCV-Polymerase begründen möglicherweise die hohe Mutationsrate und damit einhergehende hohe Heterogenität des HCV-RNA-Genoms (60). Als Folge davon, zirkuliert das HCV im Serum nicht als eine einzige homogene Population von Isolaten, sondern als eine Population der sog. Quasispezies mit individuellen viralen Genomen, welche sich zwischen 1% bis 5% in der Nukleotidsequenz unterscheiden (Tab. 1.2) (16, 35, 63). Durch eine hohe Mutationsrate in Epitopen der Hüllmembranproteine, trägt die Vielfalt der viralen Genome des HCV möglicherweise zur Entwicklung einer chronischen Infektion bei (28, 44). Heterogenität des Hepatitis C Virus Bezeichnung Nomenklatur Grad der Variation der Nukleotidsequenz Quasispezies - 1% bis 5% Isolate - 5% bis 15% Subtyp a, b, c, … 15% bis 30% Genotyp 1 bis 6 30% bis 50% Tab. 1.2: Heterogenität des Hepatitis-C-Virus und Genotypen (40). Anmerkung: Bei der Angabe des Genotyps werden normalerweise Gentoyp und Subtyp beschrieben, z.B. 1a oder 1b. Einleitung 8 1.3 Virale Bindung und zelluläre Aufnahme Ort der Virusvermehrung ist der Hepatozyt (3). Erster Schritt der viralen Aufnahme ist die Adsorption des Virus an die Wirtszelle (Abb. 1.3). Die Rezeptor-vermittelte Bindung und die Clathrin-abhängige Endozytose des HCV in die Zielzelle wurden bis vor kurzem aufgrund begrenzter Modelle der HCV-Infektion wenig untersucht. Untersuchungen in Modellsystemen zur Virus-Zellmembran-Interaktion gaben Hinweise darauf, dass die Bindung der Virushülle – ähnlich wie für andere Mitglieder der Flaviviridae-Familie gezeigt – durch das Virushüllglykoprotein E2 vermittelt wird (33, 32, 57, 61). Das Hüllprotein E2 scheint weiterhin Ziel Virus-neutralisierender Antikörper zu sein (42), was die Hypothese einer E2vermittelten Virus-Rezeptor-Interaktion unterstützt. Aufgrund einer hydrophoben Aminosäuresequenz wird angenommen, dass das E1-Protein ähnlich wie beim Paramyxovirus und Gelbfiebervirus bei der Membranfusion wichtig ist (33). Dies bestätigen auch kürzlich beschriebene Untersuchungen, welche drei Aminosäuresequenzbereiche der E1/E2-Proteine als Vermittler der Membranfusion charakterisieren konnten (49). Die zelluläre Aufnahme des Hepatitis C Virus ist ein komplexer Vorgang, der aus zahlreichen Schritten besteht, die in örtlichem und zeitlichem Zusammenhang zueinander stehen. Wie auch für andere behüllte Viren beinhaltet dies die Bindung an zelluläre Oberflächenfaktoren und Rezeptoren sowie die Fusion der Lipidhülle mit der Zellmembran und der Freisetzung des viralen Genoms in das Zytoplasma. Die Rolle verschiedener Moleküle und Rezeptorkandidaten für die viralen Aufnahmemechanismen ist derzeit Gegenstand der Diskussion. Diese beinhalten unter anderem das Glykosaminoglykan Heparansulfat (5), den Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor (66, 1, 108), das Tetraspanin CD81 (79), den Scavenger Rezeptor Klasse B Typ I (7, 90) und die erst kürzlich beschriebenen Tetraspanine Claudin-1, 6 und 9 (24, 112). Es wird angenommen, dass die Glykosaminoglykane und der LDL-Rezeptor einen sehr frühen Schritt der viralen Interaktion an die Zielzelle vermitteln (111, 45). Dieser Kontakt wird möglicherweise durch Lipoproteine vermittelt, die mit dem HCV-Virion assoziiert sind. Ein direkter Kontakt zwischen HCV-Hüllglykoproteinen und diesen Faktoren kann nicht ausgeschlossen werden. An darauf folgenden Mechanismen beteiligt ist der SR-BI-Rezeptor. Diese Interaktion läuft entweder direkt (90) oder indirekt durch HCV-assoziierte Lipoproteine (59) ab. Diese frühen Schritte der HCV-Infektion sind auch abhängig von verschiedenen Komponenten, welche im Serum enthalten sind. Diese beinhalten Stoffe, die die HCVInfektion verstärken (HDL) oder abschwächen (oxidiertes LDL, Lipoproteinlipase und Serumamyloid A) können. Der frühe Kontakt mit dem SR-BI-Rezeptor scheint auch maßgeblich mit der folgenden Interaktion mit CD81 vergesellschaftet zu sein, welcher an Einleitung 9 späteren Schritten der viralen Aufnahme beteiligt zu sein scheint (24, 111). Zeisel et al. konnten diese Erkenntnisse mithilfe eines Kinetikassays genauer analysieren und zeigten, dass CD81 und SR-BI die HCV Infektion auf einem zeitgleichen Schritt vermitteln können (111). Als sehr später infektionsvermittelnder Faktor wird das in die Familie der tight junctions gehörende Claudin-1 Molekül diskutiert (24). In Folge dessen wird das Virus mittels Clathrinabhängiger Endozytose in die Zelle aufgenommen; nach Fusion des Virus mit der endosomalen Membran wird das virale Genom in das Zytoplasma abgegeben (39). Diese Aufnahmeschritte stellen möglicherweise elementare Angriffspunkte für neutralisierende Antikörper dar. Abb. 1.3: Vermuteter HCV Lebenszyklus und HCV Modellsysteme. HCV Bindung an einen Rezeptorkomplex der Zelloberfläche bewirkt die Virusaufnahme in die Zielzelle. Im Zytoplasma wirkt die genomische HCV RNA als Vorlage zur HCV Polyproteintranslation. Das entstandene Polyprotein wird dann in strukturelle (Kern (C) und E1, E2 Glykoproteine) und nicht-strukturelle Proteine (NS2 bis NS5B) prozessiert. Eine RNA-abhängige RNA Polymerase (NS5B) ermöglicht die HCV Genomreplikation. Die Replikation findet in zytoplasmatischen, membranassoziierten Replikationskomplexen in einem perinukleären membranösen Netz statt (nicht abgebildet). Das Genom fügt sich mit Strukturproteinen zu HCV Partikeln zusammen, die anschließend von der Zelle freigegeben werden. HCV-ähnliche Partikel (HCV-Lps) und retrovirale Pseudopartikel (HCVpp) sind Modellsysteme zur Analyse von Virusbindung und –aufnahme. Auf dem Replicon basierende Systeme haben zur Aufklärung und Verständnis des viralen Replikationskomplexes geführt. Mit Hilfe des Repliconsystems, das die Produktion infektiöser Virionen (HCVcc) ermöglicht, ist es nun möglich zahlreiche Aspekte des HCV Lebenszyklus zu studieren. Diese beinhalten Virusanheftung, -aufnahme, -prozessierung, -replikation, zusammensetzung und –abgabe. Einleitung 10 1.4 Pathogenese, humorale und zelluläre Immunantwort Als natürlicher Wirt des HCV gilt der Mensch. Eine Schädigung der Hepatozyten nach Infektion ist möglicherweise nicht durch das Virus selbst, sondern vielmehr durch die Immunantwort des Wirtszellorganismus bedingt (55) (Abb. 1.4). Obwohl die humorale und zelluläre Immunantwort, welche durch das HCV induziert werden, detailliert untersucht wurden, ist der Mechanismus der viralen Elimination und Persistenz immer noch unzureichend verstanden (106). Obwohl eine humorale und zelluläre Immunantwort induziert wird, welche gegen Epitope aller viralen Proteine gerichtet ist, kann das HCV eine persistierende Infektion verursachen (42, 55, 84, 106). Eine starke zelluläre Immunantwort scheint für die Viruselimination von Bedeutung zu sein (47, 106). Es gibt deutliche Hinweise dafür, dass die zelluläre Immunantwort, welche Virus-spezifische CD4+- und CD8+-T-Zellen sowie natürliche Killerzellen umfasst, für den Ausgang der HCV-Infektion entscheidend ist (97, 106). HCV-Antikörper Aktivierung, Differenzierung B-Zelle TH2-Zytokine (IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13) CD4+Th2-Zelle HCV Virus-Eintritt IL-2 antivirale Zytokine IFN-γ + Lyse Leberzelle TCR MHC Klasse II MHC Klasse II CD4+Th1-Zelle CD4+Th1-Zelle TH1-Zytokine (IL-2, IFN-γ, TNF-α) MHC Klasse I Ausreifung und Migration TCR CD8+CTL MHC Klasse I DC NK Lyse + antivirale Zytokine CD8+CTL CD4+Zelle mature, T-Zellstimulierende dendritische Zelle in TZell-Arealen der lymphatischen Organe Virusinfektion DC virale Proteine Phagozytose Makropinozytose immature, Antigen-aufnehmende dendritische Zelle Abb. 1.4: Bestandteile der antiviralen Immunantwort (55, 94). Obwohl die Leberzelle hier als die Zielzelle der HCV-spezifischen Immunantwort dargestellt ist, sind andere Zellen (dendritische Zellen, Makrophagen) ebenfalls wichtig für die Antigenpräsentation. Einleitung 11 Die Viruselimination ist mit dem Vorhandensein einer starken, Virus-spezifischen Immunantwort durch zytotoxische T-Lymphozyten (22, 52, 97) und T-Helferzellen (52) assoziiert. Die Antwort der T-Helferzellen scheint kritisch zu sein, da sowohl der Verlust der CD4+-T-Zellantwort (34) als auch der Verlust von Memory-T-Helferzellen (36) mit einem Wiederauftreten bzw. Persistieren der Virämie verbunden ist. Die Tatsache, dass die virale Heterogenität bei Patienten mit erfolgreicher Viruselimination reduziert ist, stimmt mit dem Vorkommen einer größeren Kontrolle des Virus durch das Immunsystem überein (28). Zudem konnte durch Thimme et al. gezeigt werden, dass für die Viruselimination während der akuten Phase der HCV-Infektion eine suffiziente CD4+- und CD8+-T-Zellantwort von Bedeutung ist (98, 99). Über die Rolle der humoralen Antwort hingegen war bis vor kurzem deutlich weniger bekannt (15, 4); eine kürzlich durchgeführte Studie beobachtete den Verlauf der Immunantwort bei einer HCV-positiven Kohorte, welche sich im Rahmen einer nosokomialen Verbreitung in einem Hämodialyse-Zentrum zugetragen hatte. Alle Patienten waren mit dem gleichen Subtyp infiziert und befanden sich in der akuten Phase der HCV-Infektion. Interessanterweise wies der Anteil Patienten welcher sich durch eine starke Immunantwort auszeichnete gleichzeitig einen starken Abfall der Viruslast auf; im Gegensatz dazu entwickelten Patienten mit einer schwächeren Immunantwort eine verstärkte Virusreplikation (48). Eine weitere Arbeit konnte zeigen, dass eine starke humorale Immunantwort in der Frühphase der Infektion maßgeblich an der Ausheilung oder der Kontrolle über das Virus beteiligt ist (78). Sowohl eine chronische als auch eine akute HCV-Infektion können die Induktion einer humoralen Immunantwort zur Folge haben (55). Im menschlichen Organismus sowie im Tiermodell konnte beobachtet werden, dass diese Induktion mit einer Verzögerung von einigen Wochen einhergeht, was bedeutet, dass Anti-HCV spezifische Antikörper frühestens 7-8 Wochen nach Infektion nachweisbar sind (70, 11, 93, 77, 105). Einleitung 12 1.5 Bedeutung neutralisierender Antikörper Im Rahmen experimenteller HCV Infektionen von Schimpansen wurden erstmalig HCV neutralisierende Antikörper beschrieben (27, 29). Diese Antikörper waren gegen Epitope der Hypervariablen Region-1 (HVR-1) des HCV Hüllglykoproteins E2 gerichtet und schienen isolatspezifisch zu sein. Hinweise auf eine vor HCV schützende Funktion dieser Antikörper liefern experimentelle Untersuchungen, in denen die Infektiösität des HCV für Schimpansen durch Behandlung mit Antikörpern neutralisiert werden konnte (29). Auf der anderen Seite wurde der Verlauf der HCV Infektion durch Veränderungen der HVR-1 im Bereich der für das Hüllglykoprotein E2 codierenden Sequenz negativ beeinflusst. Diese Sequenzänderung fand simultan zur Antikörperserokonversion statt (28) und legt den Verdacht nahe, dass E2 ein Hauptziel der humoralen Immunantwort darstellen könnte. Bei den beschriebenen Veränderungen handelt es sich wahrscheinlich um sog. ,,escape“ Mutationen, was auf eine Anpassung des HCV an den durch Antikörper ausgeübten Immunselektionsdruck hindeuten könnte und mit der Eigenschaft des HCV als sogenannte Quasispecies in Verbindung gebracht wird (103). Das Vorhandensein von gegen HVR-1 gerichtete Antikörper wurde auch beim Menschen mit einer Viruselimination in Zusammenhang gebracht (114). Allerdings schützen HCV spezifische Antikörper weder beim Menschen noch im Schimpansenmodell vor Reinfektionen (25, 46). Überraschend ist, dass es im Schimpansenmodell zu einer Ausheilung der Infektion ohne vorherige Induktion Virus-neutralisierender Antikörper kommen kann (22). Beim Menschen wurde bereits eine Ausheilung ohne Serokonversion beobachtet (80, 81). Eine Opsonierung des Virions durch Antikörper kann zur Elimination durch Makrophagen, zum Transport zu sekundären lymphatischen Organen und zur effizienten Induktion der zellulären Immunantwort führen (84, 17). Zu diesen Effekten könnten auch unspezifische natürliche Antikörper beitragen (73). Die gebildeten Antikörper können jedoch das Virus nicht in jedem Fall neutralisieren und somit eine Viruselimination herbeiführen (17, 27, 85). Ferner wurde eine antikörpervermittelte Viruselimination bei Untersuchungen von Patienten mit HCV und HBV bedingter Leberzirrhose nach Lebertransplantation vermutet. Hier schienen mittels Infusion verabreichter anti-HBs und anti-HCV Hyperimmunglobuline einen Virus-reduzierenden Effekt in der transplantierten Leber zu haben (31). Zudem wurde beschrieben, dass primärer Antikörpermagel ein rasches Fortschreiten und einen fulminanten Verlauf der Erkrankung bedingt (20, 13). Antikörper, die gegen Epitope gerichtet sind, die für den Internalisationsprozeß von Bedeutung sind, können die virale Infektion kontrollieren oder sogar verhindern. Diese Antikörper entfalten antivirale Aktivität in Kompetitionsversuchen in vitro und werden daher als neutralisierende Antikörper Einleitung 13 bezeichnet. Die antikörperinduzierte Neutralisation wird durch verschiedene Mechanismen induziert (76). Neutralisierende Antikörper können direkt die Bindung des Virus an seine Zielzelle und im weiteren auch Schritte nach der Bindung sowie die Transkription des viralen Genoms verhindern. Ferner können neutralisierende Antikörper als Opsonine agieren und somit die Phagozytose infizierter Zellen vorantreiben (110). Die Bedeutung neutralisierender Antikörper in vivo wurde durch zwei vor kurzem erschienene Studien charakterisiert. Diese konnten zeigen, dass neutralisierende Antikörper in der Frühphase der Infektion produziert werden und dass diese maßgeblich an der Ausheilung oder der Kontrolle der Infektion beteiligt sind (78, 48). Eine weitere Studie, welche Dialysepatienten mit nosokomial erworbener HCV-Infektion über 6 Monate beobachtet hat, konnte eine Korrelation von neutralisierenden Antikörpern mit der Kontrolle der Infektion feststellen (48). Dies zeigt, dass das tiefere Verständnis der Mechanismen der antikörpervermittelten Neutralisation von Bedeutung für die Entwicklung neuer Therapien und Präventionsmöglichkeiten sein könnte. 1.6 Modellsysteme zur Untersuchung der Virus-Wirtszellinteraktion Der Virus-Replikationszyklus beginnt mit dem Kontakt des Virus auf der Zielzelle und endet mit der Ausschleusung („Release“) der kompletten Viruspartikel. Die frühreplikative Phase beinhaltet das Anheften („Attachment“), die Penetration der Zellmemembran und das Freilegen („Uncoating“) der viralen Erbsubstanz. Darauf folgt die Replikation der viralen Proteine und Nucleinsäuren; im Anschluß schließt sich der Zyklus mit dem Zusammenbau („Assembly“) und „Release“ der fertigen Viruspartikel (62). Um die frühen Schritte der HCV Bindung und Aufnahme zu untersuchen, wurden verschiedene Modellsysteme etabliert, die im folgenden Abschnitt beschrieben sind. 1.6.1 Hepatitis C Virus-ähnliche Partikel (HCV-LP) Die Expression der HCV-Strukturproteine (core, E1 und E2) im Bakulovirus- Insektenzellsystem führt zu Bildung von Hepatitis C Virus-ähnlichen Partikeln (HCV-LPs) (8). HCV-LPs haben ähnliche morphologische, antigene und biophysikalische Eigenschaften wie HCV-Partikel aus menschlichem Plasma oder der Leber (8, 9, 10, 100, 107) bzw. rekombinante Virionen aus Huh-7 Zellen (56, 104, 113). HCV-LPs enthalten jedoch keinen oder nur einen Teil des Genoms (cDNA bzw. cRNA der Strukturproteine), so dass sie nicht Einleitung 14 infektiös sind. Ähnlich wie HCV Virionen werden HCV-LPs von humanen Hepatom- und Lymphomzellinien gebunden und internalisiert (100, 107). Im Maus- und Schimpansenmodell konnte gezeigt werden, dass HCV-LPs potente Induktoren einer anti-HCV-spezifischen humoralen und zellulären Immunantwort sind, was auf eine Interaktion mit Antigenpräsentierenden Zellen schliessen lässt (9, 51, 68, 82). Abb. 1.5: Elektronenmikroskopie von HCV-LPs in Insektenzellen (8). (A) In Insektenzellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus (BVHCV.S) infiziert wurden, das die cDNA der HCV-Strukturproteine enthält, lassen sich zahlreiche, umhüllte Virus-ähnliche Partikel in großen Vakuolen des Zytoplasmas nachweisen (schwarze, geschlossene Pfeile). Zusätzlich ist die Synthese von Baculoviren sichtbar (offene, breite Pfeile). Die Balkenlänge entspricht 120 nm. (B) Vergrößerte Darstellung der HCV-LPs in BVHCV.S-infizierten Zellen. Die Balkenlänge entspricht 40 nm (C) Markierung der HCV-LPs mittels humanen HCV-Antikörpern (großes Bild) bzw. einem hochspezifischen E2-Antikörper (kleines Bild) und Gold-konjugierten Sekundärantikörpern. Nur Strukturen im Zytoplasma oder endoplasmatischen Retikulum zeigen Antikörper-Bindung, der Zellkern bleibt unmarkiert. Balkenlänge 120 (großes Bild) bzw. 50 nm (kleines Bild). (D) Elektronenmikroskopie von Partikeln, die durch präparative Ultrazentrifugation angereichert wurden. Rechts unten ist eine Markierung der angereicherten Partikel mittels einem E2-spezifischen Primärantikörper und Gold-konjugiertem Sekundärantikörper dargestellt. Die Balkenlänge entspricht jeweils 50 nm. Einleitung 1.6.2 15 HCV Pseudopartikel (HCVpp) Ein elementares Modellsystem der Untersuchung von HCV-Bindung und -Aufnahme besteht in der Aufnahme von retroviralen HCV-Pseudotypen (HCVpp) durch humane Hepatomzellen (7, 41). Retrovirale HCV-Pseudotypen sind chimere Retroviren, welche HCV-Glykoproteine inkorporiert haben (18). Die retroviralen HCV-Pseudotypen sind wie folgt aufgebaut (18): Sie bestehen aus einem retroviralen Core-Partikel, abgeleitet aus dem Murine Leukämie Virus (MLV) oder HIV-1, und tragen native HCV-Glykoproteine auf ihrer Oberfläche (Abb. 1.6) (7). HCVpp werden mittels einer Ko-Transfektion von 293T-Zellen mit Expressionsvektoren, welche für (a) HCV-Hüllglykoproteine mit deren transmembranären Domänen, (b) ein für das retrovirale Core-Protein kodierendes und gag-pol-Verpackungskonstrukt (c) eine Verpackungskomponente des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) oder lacZ (für die βGalaktosidase kodierendes Gen) retroviralen Transfervektor kodieren (Abb. 1.6). Die Pseudotypen werden in den Überstand sezerniert und können mittels Zentrifugation über einen Saccharosegradienten aufgereinigt werden. HCVpp-Partikel sind in der Lage verschiedene Hepatomzellinien zu infizieren (7, 41) und eignen sich hervorragend für Kompetitionsexperimente zur Analyse der Rolle neutralisierender Antikörper. Zusammenfassend stellt das System retroviraler Pseudopartikel ein effizientes und verlässliches System zur Untersuchung Virus-neutralisierender Antikörper dar und eignet sich somit sehr zur Untersuchung von Serumproben großer Patientenkollektive. CMV MLV Gag-Pol Pla smid 1 (retrovirale Core-Proteine) ψ CMV GFP Plasmid 2 ( GFP-Tra nsf erv ektor) • • • • 293TZellen • • • • ψ CMV GF P • E1 E2 CMV E1 E2 Plasm id 3 (Hüllmem bran-Glykoproteine) Abb. 1.6: Herstellung von infektiösen HCV-Pseudotypen (18). Die Ko-Transfektion von 293T-Zellen mit Plasmiden, welche die Expression von (a) HCV-E1/E2-Glykoproteinen, (b) retroviralen Core-Proteinen und (c) einem GFP-Expressionskonstrukt erlauben, führt zur Sekretion von HCV-Pseudotypen in den Überstand, welche die HCV-Hüllglykoproteine auf ihrer Oberfläche tragen. CMV, Zytomegalievirus-Promotor; ψ, retrovirale Verpackungssequenz. Einleitung 1.6.3 16 Rekombinante infektiöse HCV Virionen (HCVcc) Erst kürzlich gelang es Wakita et al. ein Zellkultursystem zu etablieren, dass die in vitro Synthese infektiöser Virionen (cell-culture-derived HCV, HCVcc) erlaubt. Die Replikation eines kompletten HCV Genoms (JFH-1 Klon, Genotyp 2a) in Huh-7 Zellen führt zur Bildung von viralen Partikeln, die wiederum befähigt sind naive Huh-7 Zellen zu infizieren. HCVcc lassen sich nach Transfektion von Huh-7 Zellen mit RNA, die die komplette Sequenz des HCV JFH-1 Genoms enthält aus dem Zellkulturüberstand gewinnen (56, 104, 113). Die Infektion von naiven Huh-7 Zellen erfolgt durch Zugabe des konzentrierten Zellkulturüberstands. Die Infektion der rekombinanten Virionen wird mittels spezifischer anti-HCV Antikörper und Immunfloreszenz bzw. über die Quantifizierung der HCV-RNA in der infizierten Zelle nachgewiesen. Mit Hilfe dieses Modellsystems kann erstmals der gesamte virale Lebenszyklus untersucht werden. Kürzlich veröffentlichte Ergebnisse konnten zeigen, dass HCVcc über eine Clathrin-vermittelte Endocytose pH-abhängig in Huh-7 Zellen aufgenommen werden (14). Ausbreitung Tiermodelle 5‘NCR JFH-1 5‘NCR J6 JFH-1 3‘NCR Huh-7.5 Huh-7.5 3‘NCR Volllänge-JFH-1 RNA Volllänge-J6/JFH-1 RNA NS5A, VirusRNA und Reportergen Expression HCV Virionen Abb. 1.7: Synthese infektiöser Virionen (HCVcc). Das System der infektiösen Virionen (HCVcc) bedient sich genomischer JFH-1 HCV RNA oder Chimeren dieses Genoms mit heterologen Gensequenzen (wie hier gezeigt z.B. J6). Diese RNA wird in permissive Zelllininien elektrokorporiert und so gewonnene HCV Virionen können zur Infektion von nativen Zelllinien oder Tiermodellen verwendet werden. Die Quantität der HCVcc Produktion kann durch Messung der NS5A Expression, der Expression verschiedener Reportergene, Core oder E1/E2Detektion oder durch Messung der Virus-RNA bestimmt werden. Einleitung 17 1.7 Ziele der Arbeit Ziele dieser Dissertationsarbeit waren: • Etablierung einer Versuchsanordnung zur Untersuchung verschiedener Schritte der antikörpervermittelten Virus-Neutralisation bei der HCV-Infektion. • Anwendung dieser zur spezifischen Charakterisierung von frühen Bindungsschritten und später einsetzenden Postbindungsschritten. • Untersuchung der viralen Aufnahmeschritte, welche das Ziel Virus-neutralisierender Antikörper darstellen. • Untersuchung der Bedeutung neutralisierender Antikörper für spätere Schritte der viralen Aufnahme. Material und Methoden 2 18 Material und Methoden 2.1 Materialien und biologische Proben 2.1.1 Antibiotika Penicillin/Streptomycin 2.1.2 Roche Diagnostics, Rotkreuz, Schweiz Antikörper Anti-E1 (IGH433, IGH520, IGH526,IGH481,IGH534, 11B7) E. Depla, A. Union, Innogenetics/GenImmune, Ghent, Belgien Anti-E2 (3E5-1) M. Houghton, Chiron Corporation, Emeryville, CA, USA Anti-E2 (IGH466, IGH461) E. Depla, A. Union, Innogenetics/GenImmune, Ghent, Belgien Anti-E2 (AP33) A. H. Patel, University of Glasgow, Glasgow, UK Anti-E2 (E2G) H. B. Greenberg (Division of Gastroenterology, Department of Medicine, Plaao Alto, Calif.) 917 J. Y. N. Lau, Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ Anti-CD81 (JS81) Biosciences Pharmingen Anti-SR-BI (CLA-1) Genovac GmbH, Freiburg PE Anti-Maus-IgG ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH, USA Chondroitinsulfat Merck, Biosciences, Darmstadt Heparin Merck, Biosciences, Darmstadt Rekombinantes E1 und E2 E. Depla, A. Union, Innogenetics/GenImmune, Ghent, Belgien Material und Methoden 2.1.3 19 Chemikalien 2-Propanol Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe Acrylamid 30% / Bisacrylamid 37, 5:1 Bio-Rad, München Ambion MEGAscript T7 kit Ammoniumperoxodisulfat (APS) Applied Biosystems/Ambion, USA Bio-Rad, München Amplicor Roche Diagnostics, Branchburg, NJ Bacto-Agar Difco Laboratories, Detroit, USA Bradford Reagenz (DYE REAGENT) Bio-Rad, München CalPhosTM Mammalian Transfection Kit Becton Dickinson, Heidelberg Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma, Deisenhofen Ethanol, Methanol Merck, Darmstadt Glycerol Sigma, Deisenhofen Natriumchlorid Merck, Darmstadt Promega Bright Glo Luciferase assay system Promega, Madison, Wi, USA Promega Commercial Lysis Buffer Promega, Madison, Wi, USA Proteaseinhibitoren Roche Diagnostics, Rotkreuz, Schweiz Paraformaldehyd (PFA) Polysciences, Inc. Warrington, USA QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) Qiagen GmbH, Deutschland Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen) Qiagen GmbH, Deutschland Qiagen Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen) Qiagen GmbH, Deutschland Qiagen RNeasy Kit (Qiagen) Qiagem GnbH, Deutschland Rinderserumalbumin (BSA), pH 5,2 Sigma, Deisenhofen N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Bio-Rad, München Tris(hydroxymethyl)aminomethan Sigma, Deisenhofen Trypanblau Biowhittaker, Walkersville, MD, USA Material und Methoden MapTrap Kit 2.1.4 20 Sigma, Deisenhofen Geräte und Verbrauchsmaterialien ARCHITECT Anti-HCV Abbott laboratories, IL Elektroporator ECM 830, BTX Genetronics Inc., San Diego, USA Eppendorf-Röhrchen Eppendorf, Hamburg Erlenmeyerkolben Corning Incorporated, Corning, USA FACS-Gerät: FACScalibur flow cytometer Becton Dickinson, Heidelberg FACS-Röhrchen Becton Dickinson, Heidelberg Falcon-Röhrchen Greiner, Solingen Gefrierschrank -80°C (New Brunswick Scientific) Innova, Nürtingen Gewebekulturflaschen/platten: Cellstar Greiner, Solingen Heizblock Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg Inkubatoren: Heraeus Instruments Heraeus, Hanau Kryoröhrchen Becton Dickinson, Heidelberg Küvetten Halb-Mikro Greiner, Solingen Mithras LP 940 Berthold, Freiburg Laminar Flow (Hera safe) Heraeus, Hanau Magnetrührer Janke & Kunkel, Staufen Netzgeräte (Power Supply) Bio-Rad, München Neubauer-Zählkammer Heinz Herenz, Hamburg Parafilm Pechiney, Menasha, USA Petrischalen Greiner Bio one, Österreich pH-Meter: 761 Colimatic Knick, Berlin Photometer: UV/VIS Spectrometer Lambda Bio Perkin Elmer, Darmstadt Material und Methoden 21 Pipetten, Pipettenspitzen Greiner, Solingen Pipetboy Integra Biosciences, Wallisellen, Schweiz PVDF-Immobilon-P Millipore, Bedford, MA, USA SS34- /SLA 1500-Rotor Beckmann Coulter, München Schüttelinkubator (New Brunswick Scientific) Innova, Nürtingen Sterilfilter: Stericup Vakuum-Filter 45µm Millipore, Mannheim Tischzentrifuge (Eppendorf) Eppendorf, Hamburg Zentrifugen: Universal Zentrifuge; Megafuge 1.0 Hettich, Tuttlingen; Heraeus, Hanau Waage Sartorius, Göttingen Wasserbad Memmert, Schwabach Zentrifugenröhrchen 13x51/25x89 mm Beckmann Coulter, München 2.1.5 Software Adobe Acrobat 7.0 Adobe Systems Incorporated, USA CellquestPro (FACS) Becton Dickinson, Heidelberg EndNote 8.0 (Literaturverzeichnis) ISI Researchsoft, Philadelphia, USA Microsoft Office XP Microsoft Corporation, Redmond, USA SAS Analyst statistical software package, Version 6.12 SAS Institute, Cary, NC, USA 2.1.6 Zellkulturmedien und Zellinien Dulbeccos Glutamax Medium (DMEM) (+ 10% fötales Kälberserum (FCS), 5% nicht-essentielle Aminosäuren, 100 U/ml Penicillin, 0,1 g/l Streptomycin) Life Technologies, Karlsruhe SF900 II SFM Medium (+ 1% Penicillin/Streptomycin/Neomycin) Life Technologies, Karlsruhe DH5ά Kompetente Zellen Invitrogen BV, Niederlande Fötales Kälberserum (FCS) PAA, Linz, Österreich Material und Methoden 22 Nonessential-Aminoacids-Lösung Life Technologies, Karlsruhe Trypsin/EDTA (0,5 g / 0,2 g) PAN, Aidenbach Huh-7 Zellen F. von Weizsäcker, Abt. Innere Med. II, Universitätsklinik Freiburg Huh-7.5.1. Zellen C. M. Rice, The Rockefeller University, New York, USA 293T Zellen F.-L. Cosset, INSERM U412, Lyon, Frankreich Sf9-Insektenzellen Life Technologies, Karlsruhe 2.1.7 Serumproben von HCV positiven Patienten Die HCV positiven Serumproben wurden von 22 zufällig ausgewählten Patienten mit einer chronischen HCV Infektion entnommen; 9 dieser Proben stammen aus der Abteilung für Innere Medizin II des Universitätsklinikums Freiburg, 13 der Proben wurden uns von der Universitätsklinik in Strasbourg zur Verfügung gestellt. Die Diagnose der chronischen HCVInfektion basiert auf folgenden Kriterien: 1. positive PCR für HCV RNA (Amplicor; Roche Diagnostics, Branchburg, NJ) sowie 2. Detektion von anti-HCV Antikörpern mittels ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) (ARCHITECT Anti-HCV, Abbott laboratories, Abott Park, IL). Als Kontrollserum diente Serum von HCV negativen Probanden. Um unspezifische Reaktionen aufgrund anderer im Serum enthaltener Faktoren (wie z. B. high density lipoproteins oder oxidized lipoproteins) auszuschließen wurde das anti-HCV IgG aus den Serumproben mittels Protein G Antikörperaffinitätschromatographie aufgereinigt. 2.1.8 Aufreinigung von Anti-HCV-IgG aus humanem Serum Um nachzuweisen, dass die Hemmung der zellulären HCVpp und HCVcc-Infektion durch Anti-HCV-Antikörper erfolgte, wurde IgG aus HCV-positivem Serum und HCV-negativem Kontrollserum unter Verwendung des MabTrapTM Kit (12) aufgereinigt. Eine MabTrapTM Protein-G-Säule wurde mit 3 ml Bindungspuffer äquilibriert. Die Serumproben wurden 1:1 mit Bindungspuffer verdünnt und auf die Säule aufgetragen (1 ml Gesamtvolumen). Nach Waschen mit 7 ml Bindungspuffer wurde das gebundene IgG mit 5 ml Elutionspuffer eluiert und mit 75 ml Neutralisierungspuffer neutralisiert. Anschließend wurde mit Hilfe einer Bradford-Proteinbestimmung die Proteinkonzentration bestimmt. Anschließend wurden die Material und Methoden 23 IgG enthaltenden Fraktionen vereinigt und unter Verwendung einer MabTrapTM Säule entsalzt. 2.1.9 Proteinkonzentrationsbestimmung mit Hilfe des Bradford-Tests Die Konzentrationsbestimmung von Proteinen wurde in einem „Mikroassay“ (1 ml) mit Hilfe des Bradford-Reagenz durchgeführt. Dazu wurden 4 µl des Lysats mit 800 µl dH20 verdünnt. Als Leerwert dienten 800 µl dH20. Für die Standardkurve wurden folgende BSA Proteinstandards verwendet und ebenfalls mit 800 µl dH20 verdünnt: 1,4 µg, 2,8 µg, 4,2 µg, 7 µg, 9,8 µg, 12,6 µg und 14 µg. Anschließend erfolgte die Zugabe von 200 µl BradfordReagenz. Nach 20 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Proben in Küvetten überführt und die optische Dichte bei 590 nm im Photometer gemessen. Zur Bestimmung der Proteinkonzentration einer unbekannten Lösung wurde die lineare Regression der BSAEichgeraden verwendet. 2.2 Zellkultur Für die Experimente wurden die humane Leberzellinie Huh-7, Huh-7.5.1 und embryonale 293T Nierenzellen (HEK Zellen: human embryonal kidney cells) verwendet. Die Zellen wurden in Gewebekulturflaschen (250 ml/75 cm2) im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 in 20 ml DMEM Medium kultiviert. Die Passagierung erfolgte im Rhythmus von 3-4 Tagen bei einer Konfluenz von 70-90%, wobei die Zellen durch eine Behandlung mit Trypsin-EDTA von der Oberfläche abgelöst wurden. Um zu verschiedenen Zeitpunkten über die benötigten Zellen verfügen zu können, wurden diese bei Bedarf eingefroren. Dazu wurden Zellen einer Gewebekulturflasche (Huh-7 Zellen 90% konfluent, 293T-Zellen 70% konfluent) abgelöst, in 3,6 ml DMEM Medium resuspendiert und auf 4 Kryoröhrchen verteilt. Nach der Zugabe von jeweils 100 µl DMSO erfolgte zunächst für einen Tag die Einlagerung im -80°C Gefrierschrank und anschließend in flüssigem Stickstoff bei -196ºC. Aufgetaut wurden die Zellen mit 10 ml 37°C warmen FCS und wurden nach Zentrifugation (3 min, 1000 rpm) in 5 ml DMEM oder RPMI Medium in 50 ml/25 cm2 Gewebekulturflaschen kultiviert. Material und Methoden 24 2.3 Synthese von HCV-LPs im Baculovirus-Insektenzellsystem und Bindung an Huh-7-Zellen Um in Insektenzellen HCV-LPs mittels rekombinanter Baculoviren herzustellen, wurde das Bac-to-Bac-System (Life Technologies, Karlsruhe) verwendet. Es beruht auf einer gerichteten Transposition (site-specific transposition) einer Expressionskassette in einen Shuttle-Vektor (Bacmid), der in E. coli-Zellen vermehrt wird. Das Bacmid enthält ein Mini-F-Replikon, mehrere Resistenzmarker sowie ein lacZα-kodierendes Gen mit Bindungsstelle für ein bakterielles Transposon (Tn7). Der Transfervektor pFASTBAC enthält den PolyhedrinPromotor des AcNPV, eine multiple Klonierungsstelle (multiple cloning site) und ein SV40 Poly(A)-Signal. In einem 500 ml Erlenmeyerkolben wurden Sf9 Zellen in 200 ml Sf-900 Medium (2x106 Zellen/ml) mit 2 ml rekombinantem Baculovirus (Bac-to-Bac, Gibco, Eggenstein) infiziert (2.107 pfu/ml; MOI von 0,5) und im Schüttelinkubator kultiviert (140 rpm, 28°C). Der Baculovirus enthielt die cDNA des HCV-J Stamms (Genotyp 1b) (43) bzw. die cDNA des infektiösen Klons H77C (Genotyp 1a) (109). Die Herstellung der rekombinanten Viren wurde durch unsere Arbeitsgruppe kürzlich beschrieben (8, 9, 107). Nach 1,5 Stunden bei 28°C und 140 rpm im Brutschrank wurden die Zellen zu gleichen Teilen auf drei 500 ml Erlenmeyerkolben verteilt, mit Sf-900 Medium auf je 250 ml aufgefüllt und für weitere 4 Tage bei 28°C und 140 rpm inkubiert. Anschließend wurde die Zellmorphologie mikroskopisch untersucht, wobei die infizierten Zellen sowohl ein kondensiertes Zytoplasma als auch einen kondensierten Kern aufwiesen und eine beginnende Lyse zeigten. Die Lösungen und Reagenzgefäße für alle weiteren Schritte wurden bei 4°C vorgekühlt, ebenso waren alle Zentrifugen auf 4°C vorgekühlt. Die Sf9-Suspensionskultur wurde 5 min bei 2.500 rpm pelletiert und in 60 ml Lysepuffer resuspendiert. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurde die Suspension in einem Teflon-Homogenisator mehrmals homogenisiert. Um die Zellen vollständig aufzubrechen, wurde das Homogenisat viermal mit Ultraschallimpulsen (15 sec) behandelt. Um Kern und Zelldebris abzutrennen, wurde das Homogenisat abzentrifugiert (20 min, 10000 rpm). Je 9,5 ml des Überstands wurden auf 28 ml einer 30%igen Saccharoselösung aufgetragen und 6 h bei 26.000 rpm pelletiert und somit eine Vorreinigung erzielt. Die Pellets wurden in 3 ml TN-Puffer (mit 1% Protease-Inhibitor) resuspendiert, homogenisiert und zentrifugiert (3 min, 12.000 rpm). Je 0,5 ml des Überstandes wurden auf einen 20 bis 60%igen Saccharosegradienten (1,5 ml 60% Saccharose/TN-Puffer (w/v); 0,75 ml 50% Saccharose/TN-Puffer (w/v); 0,75 ml 40% Saccharose/TN-Puffer (w/v); 0,75 ml 30% Saccharose/TN-Puffer (w/v); 0,75 ml 20% Saccharose/TN-Puffer (w/v)) aufgetragen und in einer Ultrazentrifuge zentrifugiert (22 h, 33000 rpm). Die Fraktionierung Material und Methoden 25 des Saccharose-Dichtegradienten erfolgte durch Abpipettieren von 10 x 0,5 ml Fraktionen. Von jeder Fraktion wurde die Gesamtproteinmenge bestimmt und das Vorhandensein von HCV-LPs durch Western-Blot-Assay der Gradientenfraktionen bestimmt. Die Fraktionen wurden mit Glyzerol (1:10) versetzt und zur weiteren Verwendung bei -80°C aufbewahrt. Als Kontrollpräparation dienten Insektenzellen, welche mit dem Kontrollbaculovirus BVGUS infiziert wurden, der die cDNA der β-Glucuronidase (GUS) enthielt. Die Kontrollpräparation diente später als Kontrolle für alle Bindungs- und Hemmungsexperimente. Die Bindung der HCV-LPs an Zellinien wurde bereits beschrieben und analog durchgeführt (107). Die Zellen (1.5 x 105 Zellen pro Ansatz) wurden mit HCV-LPs oder InsektenzellKontrollpräparationen (GUS) in PBS (Endvolumen 100 µl) für 1 h bei 4°C inkubiert. Nach Entfernung nicht gebundener HCV-LPs durch dreimaliges Waschen mit PBS wurden die Zellen für 40 min bei 4 °C mit dem monoklonalen Maus-Anti-E1-Antikörper 11B7 in 50 µl PBS inkubiert. Nach anschließendem dreimaligem Waschen mit PBS folgte die Detektion mit Phycoerythrin(PE)-konjugierten Anti-Maus-IgG-Antikörper (1:100) für 30 min bei 4°C. Danach wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Die zellgebundene Fluoreszenz wurde mit einem FACScalibur flow cytometer ermittelt. Mit Hilfe der Computerprogramme Cellquest 3.11 und Cellquest Pro erfogte die Auswertung. Dieses Programm erstellt Histogramme von jeder Probe und kalkuliert die „mean fluorescence intensity“ (MFI) von jeder Zellpopulation, welche direkt mit der Oberflächendichte der an die Hepatozyten gebundenen PE- bzw. FITC-markierten HCV-LPs korreliert (88). 2.4 Synthese von HCV Pseudopartikeln (HCVpp) und Infektion von Huh-7 Zellen Die Herstellung von HCV-Pseudotypen wurde wie kürzlich beschrieben durchgeführt (7). 293T-Zellen wurden mit Expressionsvektoren transfiziert, welche folgende virale Komponenten exprimieren: HCV-E1/E2 (HCV-Stamm H77, Genotyp 1a; HCV-Stamm HCVJ, Genotyp 1b; HCV-Stamm J6, Genotyp 2a), retrovirale Core/Verpackungs-Komponente und GFP/Integrationssignal (Abb. 1.6). Die Expressionsplasmide wurden freundlicherweise von F.-L. Cosset, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U412, Lyon, Frankreich zur Verfügung gestellt. Das Medium wurde 16 h nach der Transfektion ersetzt. Nach 24 h wurden die Überstände, welche die HCV-Pseudotypen enthielten, abgenommen. Diese wurden filtriert (Porengröße 0,45-µm) und anschließend für die Aufnahme in Huh-7Zellen, angesetzt am Vortag mit einer Dichte von 0,5 x 104 Zellen pro well in einer 48-well- Material und Methoden 26 Platte, verwendet. Die Aufnahme der HCVpp wurde mittels FACS-Analyse der GFPExpression in den Huh-7-Zellen untersucht (7),(6).Zur Infektion von Huh-7-Zellen mit HCVpp wurden die Zellen einen Tag vor Infektion durch HCVpp verschiedener Stämme (HCV-H77C, HCV-J, J6) in 48-well Platten mit einer Dichte von 0,5x104 Zellen pro Well ausplattiert. 50µl des HCVpp enthaltenden Überstandes transfizierter 293T-Zellen wurden pro Ansatz mit 45µl DMEM Medium und 5µl HBS Puffer gemischt und jeweils in ein Well pipettiert. Alle Infektionsexperimente wurden als Triplikate in mindestens zwei unabhängig voneinander durchgeführten Messungen durchgeführt. Die infizierten Zellen wurden für 72h bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Anschließend konnte die GFP-Expression aller mit HCVpp infizierter Zellen durchflußzytometrisch (Kapitel 2.5) gemessen werden. 2.5 Prinzip der Durchflußzytometrie (FACS) Die Durchflußzytometrie FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter, Abb. 2.1) erlaubt es, Eigenschaften von Zellen bzw. von an die Zellmembran gebundenen Molekülen (z.B. Proteine, Viren, HCV-LPs) zu untersuchen. Für das System der HCV-Pseudopartikel wird die zytoplasmatische Intensität des Green Fluorescent Protein Markers (GFP) in Huh-7 Zellen gemessen (89, 101). GFP ist ein Fluorochrom, dass, durch Laserlicht angeregt, grünes Licht bei 530 nm emittiert (67). Mit Hilfe des CMV Plasmids wird GFP in den Nukleus integriert und mit dem normalen Zellzyklus repliziert. Es ist somit ein Aktivitätsmarker, da es nur von lebenden Zellen produziert wird. Diese GFP Expression kann durchflußzytometrisch gemessen werden und unterscheidet sich deutlich von der natürlichen Eigenfluoreszenz der Huh-7 Zellen. Das Prinzip der Durchflußzytometrie basiert auf dem laminaren Durchfluß einzelner Zellen bzw. Zellen mit daran gebundenen Molekülen durch einen fokussierten Laserstrahl, welcher fluoreszierende Farbstoffe (z.B. GFP) bei deren Absorptionswellenlänge anregt. Die daraus resultierende Emission bei einer längeren Wellenlänge kann daher mittels spezieller Filterkombinationen detektiert werden. Die Fluoreszenz wird in elektrische Signale umgewandelt und mit Hilfe des Computers in Dot-Blots (Einzelpunktbilder) bzw. Histogramme umgesetzt. Aus der Art der Lichtstreuung kann die Zellgröße bestimmt, sowie Aussagen über die Zellkomplexibilität getroffen werden (Abb. 2.1). Material und Methoden 27 Probe • • • • • • • • • • • • • • • • Pufferlösung Laser Ablenkungs platten − Sammelgefäße • • • • vibrierende Fließkammer rote Fluoreszenz grüne Fluoreszenz Prisma 90° Lichtablenkung (Granularität) elektrische Aufladung + • Durchlicht (Größe) • Überschuß Abb. 2.1: Fluoreszenzaktivierter Zellsorter (FACS) (87). Die zu untersuchenden GFP exprimierenden Zellen werden in eine vibrierende Flusskammer gebracht. Der Zellstrom wird in einer Pufferflüssigkeit an einem Laserstrahl vorbeigeleitet, wobei im Durchlicht die Größe jeder einzelnen Zelle, der Gehalt an Granula (Granularität) in einer 90°-Ablenkung des Lichtstrahls, ferner grüne Fluoreszenz und damit die GFP Expression gemessen werden. Durch die Vibration wird der Zellstrom in feine Tröpfchen verteilt, die aufgeladen und unter Computerkontrolle durch Ablenkungsplatten nach den zu messenden Parametern sortiert werden. 2.6 Analyse der zellulären HCVpp Aufnahme mittels FACS Die Infektion der Zelllinien mit HCVpp ist unter Kapitel 2.4 beschrieben und wurde analog durchgeführt. Huh-7 Zellen (0.5 x 104 Zellen pro Ansatz) wurden nach 72-stündiger Inkubation bei 37°C mit PBS gewaschen und dann unter Einwirkung von Trypsin/EDTA von ihrer Unterfläche abgelöst. Die Trypsin/EDTA Wirkung wurde nach ca. 2-minütiger Einwirkungszeit durch Hinzugabe von DMEM Medium gestoppt. Daraufhin wurden die abgelösten Zellen inklusive des Mediums in Eppendorf Röhrchen überführt und für 10 Minuten zentrifugiert (2500 rpm bei 4°C). Anschließend konnte der Überstand abgenommen werden und das nun sichtbare Zellpellet mit 2%-iger Paraformaldehyd-Lösung (PFA-Lösung) fixiert werden. Die fixierten Zellen wurden in FACS Röhrchen überführt und ihre GFP Expression konnte anschließend durchflußzytometrisch bestimmt werden. Die GFPvermittelte Fluoreszenz wurde mit einem FACScalibur Flow Cytometer ermittelt. Mit Hilfe des Computerprogramms CellquestPro erfolgte die Auswertung. Dieses Programm erstellt Dot-Blots von jeder Probe und kalkuliert die „mean fluorescence intensity“ (MFI) von jeder Zellpopulation. Material und Methoden 28 2.7 Hemmung zellulärer HCVpp Infektionen mittels HCV positiver Seren auf Bindungs- und Postbindungsebene Die virale Bindung an die Zielzelle wurde mit Hilfe zweier Protokolle untersucht mittels derer frühe Bindungsschritte von später ablaufenden sogenannten Postbindungsschritten separiert betrachtet werden können. Diese werden als Protokoll I und II bezeichnet. In Protokoll I werden Huh-7 Zellen, welche am Vortag in einer Konzentration von 0,5 x 104 Zellen/well einer 48 well Platte ausplattiert wurden, mit einem Mix aus HCVpp und Antikörpern (100 µg/ml) für eine Stunde bei 2000 rpm bei 4 °C zentrifugiert. Bei 4°C sind die HCVpp lediglich in der Lage, an die Zelloberfläche zu binden, eine Endozytose ist aufgrund des noch geringen Energiezustandes nicht möglich. Danach werden die nicht gebundenen viralen Proteine mittels zweimaligem Waschen mit eiskaltem PBS entfernt und die Antikörper, welche in Medium verdünnt sind (100 µg/ml), nochmals für 4 h hinzugegeben und die Temperatur auf 37°C angehoben um die virale Aufnahme in die Zelle zu ermöglichen. Nach 4 h werden die Antikörper entfernt, die Zellen mit Medium bedeckt und 72 h später nach einer Inkubation bei 37 °C wird die GFP Reportergen-Expression mittels FACS gemessen. Um spätere Schritte, welche nach der viralen Bindung an die Zielzelle ablaufen, untersuchen zu können werden die Experimente entsprechend folgendem Protokoll II durchgeführt: Huh-7 Zellen werden mit HCVpp für 1 h bei 4 °C bei 2000 rpm zentrifugiert, die ungebundenen viralen Proteine mit eiskaltem PBS entfernt und erst jetzt erfolgt die Zugabe von Antikörpern, welche nun nur noch an einem späteren Schritt nach der Bindung angreifen können. Die weiteren Schritte sind analog zu Protokoll I. Um diese soganannten Postbindungsschritte zeitlich noch genauer eingrenzen zu können haben wir einen Versuchsansatz entwickelt, bei dem die Antikörper zeitlich versetzt um 20 Minuten nach der Bindung hinzugegeben werden. Dieser Ansatz wird in Abb. 3.3A Zum besseren Verständnis bildlich dargestellt. 2.8 Synthese von rekombinanten Virionen (HCVcc) und Infektion von Huh-7 Zellen Die Synthese rekombinanter Virionen wurde wie kürzlich beschrieben durchgeführt (104, 45). Die Luc-Jc1 Plasmid DNA kodiert die Strukturproteine von HCV-Strang J6, die NichtStrukturproteine von HCV Klon JFH1 sowie ein Luziferase Reporter Element. Aus 1 µg aufgereinigter DNA konnten ca. 100 µg RNA mithilfe eines RNA-Synthese Kits (Ambion MEGAscript T7 kit) transkribiert werden. Hierzu wurden 2 µl der Nucleosidtriphosphate Material und Methoden 29 ATP, CTP, GTP und UTP mit 1 µg DNA, Reaktionspuffer und den RNA-Polymerasen für 6 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die RNA mithilfe eines Formaldehyd-Agarose-Gels bestimmt. Nach anschließender Behandlung mit DNase wurde die RNA durch LiCL2 Präzipitation aufgereinigt und die Konzentration durch Messung der OD bei 260/280 nm bestimmt. Anschließend erfolgte die Elektroporation von 10 µg der erhaltenen RNA in 6x106 Huh-7.5.1 Zellen (Elektroporator ECM 830 BTX, Genetronics). Die elektroporierten Zellen wurden in 24 mL 37°C warmem Medium aufgenommen und bei einer Konzentration von 2 ml Zellsuspension per well auf zwei six-well-Platten gebracht. Infektiöse rekombinante HCV (HCVcc) wurden nach 48 und 72 h geerntet, titriert und bei 4°C bzw -80°C gelagert. Für Bindungs- bzw Infektionsversuche wurden Huh-7.5.1 Zellen bei 4°C bzw 37°C mit HCVcc inkubiert. Um die Luziferase-Aktivität als Infektionsmarker zu detektieren, wurden die Zellen nach 48 h lysiert (Promega Commercial Lysis Buffer). Die Luziferase-Aktivität wurde nach Zugabe einer Luziferin-Lösung mit Hilfe eines Luminometers gemessen (Mithras LP940, Berthold, Freiburg). 2.8.1 Prinzip der HCVcc-Infektionsdetektion (Luciferase assay) Die luminometrische Messung der infizierten Zellen beruht auf dem Prinzip der ATPBiolumineszenztechnik. Biolumineszenz tritt natürlicherweise auf, wenn das Pigment Luciferin mit Sauerstoff oder ATP reagiert. Diese Reaktion wird von Luciferase, einem von Leuchtkäfern stammendem Enzym, katalysiert. Das entstehende Licht ist mit Hilfe eines Luminometers, welcher die Photonenemission misst, detektierbar und direkt proportional zur vorhandenen ATP-Menge. Dieses Prinzip macht sich die moderne Wissenschaft in der Detektion von z. B. DNA und RNA zu nutze (37). Im Rahmen der Analyse der HCVcc Infektion in Huh-7.5.1. Zellen gelang es im Jahre 2005 Koutsoudakis et al. ein Luziferase Reporter Element direkt an die Plasmid-DNA eines HCV Klons zu koppeln um mit Hilfe der späteren, durch Zugabe von Luciferin ermöglichten Lichtemission direkte Auskunft über die Infektionskapazität zu erhalten. Hierbei steht Zusammenhang mit der Lichtemissionsstärke (45). die HCVcc-Infektion in direktem Ergebnisse 3 30 Ergebnisse 3.1 Humane anti-HCV IgGs neutralisieren die HCVpp Infektion auf einem späteren Schritt nach der viralen Bindung an die Zielzelle Zur genauen Identifizierung der Schritte, die das Ziel neutralisierender Antikörper darstellen, wurde ein auf dem Modellsystem der HCVpps basierender Versuchsansatz etabliert, welcher bereits in Kapitel 2.7 beschrieben wurde. Die temperaturabhängige HCVpp Bindung bei 4°C und der energieabhängige Internalisierungsprozeß, welcher physiologische Temperaturen von 37°C benötigt, sind für diese Experimente von essentieller Bedeutung. Zur Validierung dieses Systems wurde die HCVpp Infektion in Huh-7 Zellen in Anwesenheit von polyklonalem antiSR-BI Serum, monoklonalem anti-CD81 Antikörper sowie Heparin untersucht. Allen diesen Molekülen wird in der Literatur eine Rolle im Bindungs- und Internalisationsmechanismus des HCV zugeschrieben. Die Experimente im Sinne von Protokoll I und II wurden in Anwesenheit von polyklonalem anti-SR-BI Serum, monoklonalem anti-CD81 Antikörper und Heparin als Ligand des Heparansulfat-Rezeptors durchgeführt. Unsere Ergebnisse zeigen, das polyklonales anti-SR-BI Serum und der monoklonale anti-CD81 Antikörper die HCVppInfektion auf einem späteren Schritt hemmen während Heparin eine stärkere Hemmung in Protokoll I zeigt, woraus eine stärkere Beteiligung auf der Bindungsebene abzuleiten ist (Abb. 3.1B). Zur weiteren Überprüfung der Richtigkeit der Ergebnisse wurden die Experimente auch im HCVcc System durchgeführt, wobei sich nahezu identische Ergebnisse darstellten (Abb. 3.4A).Diese Daten bestätigen den neu etablierten Versuchsansatz als ein System, welches in der Tat zwischen frühen Bindungsschritten und später ablaufender Internalisation zu differenzieren vermag. Dies ermöglicht das Heranziehen dieses zur separierten Betrachtung dieser Schritte fähigen Systems zur weiteren Untersuchung der Ziele neutralisierender Antikörper im zeitlichen Verlauf der HCV-Infektion. Um die Angriffsziele humaner neutralisierender Antikörper im zeitlichen Ablauf der HCVInfektion genauer analysieren zu können, wurde das oben dargestellte und validierte System herangezogen. Hierzu wurden Serumproben von 22 zufällig ausgewählten HCV-positiven Patienten gesammelt, die genauen Angaben über die Patienten sind in Tab. 3.1 zusammengestellt. Alle Patienten weisen eine chronische Hepatitis C Infektion mit unterschiedlichen HCV Genotypen im Sinne von 1, 2, 3 und 4 mit einer Viruslast auf, die zwischen 1,6 x 104/ ml und 1 x 108/ ml variiert. Als negatives Kontrollserum diente Serum von HCV negativen Probanden. Um unspezifische Reaktionen auszuschließen wurden die Ergebnisse 31 Seren mittels einer Protein G Antikörper Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die antiHCV IgGs wurden im Hinblick auf ihre HCVpp neutralisierenden Eigenschaften in Protokoll I und II getestet. Wie Tab. 3.1 zeigt wurde die HCVpp Infektion durch 18 von 22 PatientenIgGs um mehr als 25 % inhibiert. Interessanterweise zeigten 18 von 22 Patienten mit detektierbaren neutralisierenden Antikörpern (alle Patienten außer Nr. 2 und 5) eine deutliche Hemmung in Protokoll II. Diese Daten lassen darauf schließen, dass der größte Anteil der neutralisierenden Wirtszellantwort in HCV infizierten Patienten Antikörper beinhalten, die die HCV Infektion nach Bindung des Virus an die Wirtszelle hemmen können. Dies ist nochmals in Abb. 3.1C verdeutlicht, welche eine Auswahl der Patienten aus obiger Tabelle darstellt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass es sich bei der Hemmung der HCVpp Infektion durch neutralisierende Antikörper aus Patientenseren um einen konzentrationsabhängigen Prozeß handelt. Abb. 3.1D zeigt die konzentrationsabhängige Neutralisierung von Patient Nr. 7 (schwarze Rauten) und Kontroll IgG (weiße Dreiecke) in aufsteigender Konzentration der anti-HCV IgGs (0,05; 0,5; 5; 50 und 100 µg/ml) und als Prozent Neutralisation im Dreifachansatz dargestellt. Ergebnisse 32 Abb. 3.1: Humane anti-HCV IgGs neutralisieren die HCVpp Infektion auf einem späteren Schritt nach der viralen Bindung an die Zielzelle. (A) Schematische Darstellung des Versuchsaufbau (Protokoll I und II) zur Unterscheidung von Bindungschritten und einer Ebene nach der HCVpp-Bindung. Zur Generierung der HCVppBindung wurden HCVpp und Huh-7 Zellen für 1h bei 4°C inkubiert. Unter diesen Bedingungen ist ein HCVpp lediglich in der Lage an die Oberfläche zu binden, kann aber nicht die Zellmembran passieren, da dies ein energieabhängiger Prozeß ist, der erst mit dem anschließenden Anheben der Temperatur auf 37°ablaufen kann. In Protokoll I werden die inhibierenden Antikörper vor der Bindung an die Huh-7-Zelle angefügt; in Protokoll II werden die Antikörper zusätzlich nach der Bindung an die Huh-7-Zelle zugegeben. Die gestrichelten Linien symbolisieren die Zeitpunkte der Anwesenheit von Antikörpern. Nach 72 Stunden wurde die HCVpp Infektion mittels GFP-Detektion im Rahmen der FACS-Analyse gemessen. (B) Hemmung der HCVpp (1a; H77c strain) Infektion von Huh-7 Zellen durch anti-SR-BI, anti-CD81-Antikörper oder Kontrollantikörper und Heparin (als Negativkontrolle diente Chondroitinsulfat (CSA)). Es sind die Mittelwerte von sechs unabhängig durchgeführten Experimenten gezeigt. (C) Hemmung der HCVpp (1a; H77c strain) Infektion durch aufgereinigtes anti-HCV IgG (100µg/ml) aus Patientenseren mit chronischer HCV Infektion in Protokoll I und II. Als Negativkontrolle dienten aufgereinigte IgG aus Seren von HCV negativen Probanden. Es sind die Mittelwerte von vier unabhängig durchgeführten Experimenten dargestellt. (D) Konzentrationsabhängige Hemmung der HCVpp (1a; H77c strain) Infektion durch anti-HCV IgG von Patient Nr. 7 (schwarze Rauten) und Kontroll IgG (offene Dreiecke) in Protokoll II. Die Mittelwerte ± SD eines Experimentes in Dreifachansatz sind gezeigt. Ergebnisse 33 Neutralisation der HCVpp (H77C - 1a) Infektion (%) Protokoll Protokoll I II 74 ± 1 77 ± 2 Pat.-Nr. Alter Genotyp Viruslast (IU/ml) 1 55 1b 1.6 x 104 2 45 1a 1.8 x 106 72 ± 1 47 ± 6 3 65 1 1.3 x 106 60 ± 4 63 ± 1 4 53 1b 9.8 x 105 61 ± 3 53 ± 8 5 54 1b 1.4 x 107 71 ± 3 46 ± 8 6 53 1b 1.0 x 108 76 ± 5 65 ± 5 7 50 1a 6.0 x 106 75 ± 3 70 ± 1 8 50 4d 5.4 x 105 75 ± 5 69 ± 2 9 70 1b 3.2 x 105 70 ± 8 68 ± 4 10 64 1b 1.9 x 106 25 ± 8 10 ± 4 11 35 1b 2.6 x 105 15 ± 5 19 ± 4 12 48 1b 1.0 x 105 51 ± 5 48 ± 1 13 61 1b 1.7 x 106 7±2 3±1 14 61 1 3.6 x 105 31 ± 6 24 ± 5 15 41 1b 1.8 x 106 28 ± 3 20 ± 9 16 39 3a 1.6 x 105 8±4 1±1 17 47 1a 4.2 x 106 53 ± 1 52 ± 6 18 60 1b 4.9 x 106 41 ± 8 46 ± 7 19 58 1a 1.2 x 105 58 ± 10 52 ± 10 20 42 --- 2±1 3±4 21 25 --- 0 0 22 35 2a 1.0 x 105 61 ± 4 60 ± 7 23 35 2a 7.8 x 105 87 ± 3 85 ± 4 2a 5 94 ± 2 91 ± 4 24 64 no infection no infection 5.8 x 10 Tab. 3.1: Eigenschaften der HCV positiven Patienten sowie Ergebnisse der HCVpp Neutralisierung in Protokoll I und II. Diese Tabelle zeigt Angaben über die Patienten im Sinne von Alter, HCV-Genotyp, Viruslast sowie deren neutralisierende Eigenschaften in Protokoll I und II. Ergebnisse 34 3.2 Monoklonale anti-E2 und anti-E1 Antikörper beeinflussen die HCV Infektion sowohl auf Bindungs- sowie auf Postbindungsebene Die HCV- Infektion der Zielzelle wird von viraler Seite durch die Virushüllglykoproteine E1 und E2 vermittelt. Eine weitere Aufgabe dieser Arbeit bestand darin, die Frage zu klären welches Epitop, bzw. welche Aminosäuresequenz für Bindungsschritte wichtig ist und ob es Epitope gibt, die die Infektion auf einem späteren Schritt nach der HCV Bindung an die Zielzelle vermitteln. Hierzu wurde ein Panel bereits gut charakterisierter, monoklonaler antiE1 und anti-E2-Antikörper verwandt. Die Experimente wurden im Sinne von Protokoll I und Protokoll II durchgeführt. Wie Abb. 3.2 zeigt sind verschiedene monoklonale anti-E1 und anti-E2 Antikörper in der Lage die HCVpp Infektion in Protokoll II zu hemmen, was darauf schließen lässt, dass beide Virushüllglykoproteine an Interaktionen des Virus mit der Zielzelle beteiligt sind. Tab. 3.2 gibt eine Übersicht über die mit Hilfe von mAbs gewonnenen Ergebnisse. Abb. 3.2 A-C zeigt eine Auswahl der in der Tabelle dargestellten Daten. Zusammenfassend lässt sich die Schlussfolgerung ziehen, dass beide Virushüllglykoproteine E1 und E2 - unter anderem an späteren Schritten der HCV Infektion beteiligt sind. Abb. 3.2 D demonstriert die Konzentrationsabhängige Neutralisation von anti-E1 IGH526 und anti-E2 AP33 sowie Kontroll-IgG. Um die Bedeutung des E1-Epitopes im Bezug auf die späten Schritte der viralen Bindung näher zu charakterisieren, wurde die Interferenz von viralem Virushüllglykoprotein E1 mit anti-E1 Antikörpern bei der Bindung an die Zielzelle untersucht. Hierzu dienten Experimente bei denen die Bindung von rekombinantem E1, HCV-LPs und HCVpps an Huh-7 Zellen durch anti-E1 Antikörper inhibiert wurden. Hierzu wurde rekombinantes E1, HCV-LPs oder HCVpps mit einem monoklonalen anti-E1 Antikörper vorinkubiert (1h bei 4°C) und anschließend für eine Stunde bei 4°C an Huh-7 Zellen gebunden. Die Detektion der gebundenen Partikel erfolgte mittels FACS-Analyse (siehe Material und Methoden). Es konnte gezeigt werden, dass anti-E1 Antikörper, welche gegen die Sequenz 313-326 gerichtet sind, keine detektierbare Bindungshemmung zeigten. Als Positivkontrolle diente Heparin, welches für eine Interaktion auf früher Ebene bekannt ist. Dies lässt darauf schließen, dass das E1 Epitop mit der Sequenz 313-326 das Ziel neutralisierender Antikörper eines späteren Schrittes darstellt. Ergebnisse 35 Antikörper Epitop (aa) Neutralisation der HCVpp Infektion (%) Genotyp Genotyp 1a 1b Protokoll Protokoll I II I II Anti-E1 IGH433* 235-247 (1b) 0 0 8±3 0 IGH520* 313-326 (1b) 81 ± 7 64 ± 12 60 ± 7 52 ± 9 IGH526* 313-326 (1b) 76 ± 8 75 ± 9 59 ± 7 51 ± 11 IGH481* 230-263 (1b) 0 0 ND ND IGH534* 313-326 (1b) 60 ± 15 30 ± 2 61 ± 6 48 ± 9 11B7(107) 212-224 (1b) 12 ± 2 24 ± 3 17 ± 5 0 412-423 (1a) 77 ± 5 78 ± 2 ND ND 3E5-1(107) 522-529 (1a) 28 ± 1 31 ± 2 55 ± 6 31 ± 6 E2G(107) ND (1a) 53 ± 2 61 ± 5 16 ± 1 2±1 917(107) 460-479 (1b) 66 ± 8 50 ± 5 ND ND IGH466* 516-535 (1b) 73 ± 3 53 ± 5 3 ± 0.1 0 IGH461* 436-448 (1b) 0 0 47 ± 5 65 ± 10 Anti-E2 AP33(75, 78) Tab. 3.2: Tabelle der monoklonalen anti-E1 und anti-E2 Antikörper. Die Tabelle zeigt die Antikörpernamen, Epitope, Herkunft sowie die Ergebnisse für jeweils Protokoll I und II sowohl für HCVpp Genotyp 1a und 1b als % Neutralisation im Dreifachansatz. *Eric Depla/Ann Union/Geert Martens; Innogenetics/GenImmune, Ghent, Belgium Ergebnisse 36 Abb. 3.2: Neutralisierung der HCVpp Infektion durch monoklonale anti-E2 und anti-E1 Antikörper auf Bindungs- und Post-Bindungsebene. (A,B) Hemmung der HCVpp (1a; H77 strain) Infektion in Huh-7 Zellen durch monoklonale anti-E1 (A) und anti-E2 (B) in Protokoll I und II. (C) Hemmung der HCVpp (1b; HCV J strain) Infektion durch monoklonale anti-E1 Antikörper in Protokoll I und II. (D) Konzentrationsabhängige Hemmung der HCVpp (1a; H77c strain) Infektion durch anti-E2 mAb AP33 (schwarze Kreise), anti-E1 mAb IGH 520 (schwarze Quadrate) und Kontroll IgG (offene Dreiecke) in Protokoll II. (E) Neutralisierung der Bindung von rekombinantem Hüllglykoprotein E1 an Huh-7 Zellen durch anti-E1 Antikörper oder Heparin als Positivkontrolle. Als Negativkontrolle dienten nur mit Detektionsantikörpern detektierte Zellen (NC=- light shaded histograms). (F) Hemmung der Bindung von rekombinantem E1 (Subtyp 1b), HCV-LP (1a) und HCVpp (1b) an Huh-7 Zellen durch anti-E1 Antikörper, Kontrollantikörper und Heparin. Die Mittelwerte ± SD von drei unabhängigen Experimenten in Dreifachansatz sind gezeigt. * statistische Signifikanz Ergebnisse 37 3.3 Untersuchung der viralen Aufnahmeschritte, welche das Ziel neutralisierender Antikörper darstellen, mittels eines Kinetik-Assays Um das Ziel neutralisierender anti-HCV Antikörper im Verlauf der HCV Infektion näher untersuchen zu können, wurde ein sogenannter Kinetik-Assay etabliert, welcher ein zeitlich genaueres Betrachten der Schritte nach der viralen Bindung ermöglicht. Diese Versuchsanordnung wurde bereits in Kapitel 2.7 beschrieben und durch Abb. 3.3A verdeutlicht. Zunächst wurde die Inhibitionskapazität von anti-CD81, anti-SR-BI und Heparin untersucht. Wie Abb. 3.3 verdeutlicht, beträgt die Hemmung der HCVpp Infektion durch Heparin als physiologischen Liganden des Heparansulfatrezeptors in Protokoll I 50 %, in Protokoll II ist hingegen schon zum Zeitpunkt 0 keine signifikante Hemmung zu detektieren. Diese Daten bestätigen, dass der Heparansulfatrezeptor an der Vermittlung eines frühen Schrittes der HCV Infektion beteiligt ist. Wenn man hingegen die Ergebnisse für anti-CD81 und anti-SR-BI betrachtet, sieht man eine Hemmung von über 80 % in Protokoll I welche sich auch in Protokoll II fortsetzt und bis zu einem Zeitpunkt zwischen 60 und 80 Minuten nach der HCVpp-Bindung an die Zielzelle detektierbar bleibt. Dies bestätigt die Annahme, dass das Tetraspanin CD81 und der Scavenger Receptor BI maßgeblich an einem späteren Schritt weit nach der viralen Bindung an die Zielzelle beteiligt sind. Zum weiteren Verständnis der Angriffsmomente neutralisierender Antikörper in Patientenseren wurden auch verschiedene humane anti-HCV Antikörper, welche eine hemmende Reaktion in Protokoll II gezeigt hatten, durch den Kinetikassay näher untersucht. Abb. 3.3C zeigt die Ergebnisse für 7 Patientenseren (1, 7, 8, 9, 12, 17 und 19) im Vergleich zu Kontroll-IgG eines HCV negativen Probanden sowie anti-CD81 Antikörper. Die Daten verdeutlichen, dass alle Patientenseren in der Lage sind, die HCVpp Infektion bis über die HCVpp Bindung hinaus zu neutralisieren, die hemmenden Eigenschaften können bis zu 60 Minuten nach der viralen Bindung detektiert werden; für Pat. 8, 9, 17 stellt sich sogar eine Hemmung bis 120 min nach der Bindung dar. Dies zeigt, das auch Schritte nach der viralen Bindung an die Zielzelle, wie die Clathrin-abhängige Endozytose, das Ziel neutralisierender Antikörper darstellen. Ergebnisse 38 Abb. 3.3: Kinetik der Neutralisierung der HCVpp-Infektion durch anti-HCV IgG. (A) Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. Die Hemmung der HCVpp Infektion in Huh-7 Zellen wird analog zu der Darstellung in Abb. 3.1A durchgeführt; wird aber dahingehend verfeinert, dass die Antikörper in Protokoll II alle 20 Minuten bis zum Ablaufen von 120 Minuten zugegeben werden. Die gestrichelten Linien symbolisieren die Zeitpunkte der Anwesenheit von Antikörpern. (B) Kinetik der antikörpervermittelten Neutralisierung der HCVpp (1a; H77c strain) Infektion durch anti-CD81, anti-SR-BI, Heparin und Kontrollantikörpern. (C) Kinetik der antikörpervermittelten Neutralisation der HCVpp (1a, H77c) Infektion durch anti-HCV IgG aus Patientenseren oder HCV negativen Kontrollseren. . Die Mittelwerte ± SD von drei unabhängigen Experimenten in Dreifachansatz sind gezeigt. Ergebnisse 3.4 Analyse 39 der Antikörper-vermittelten Neutralisation unter Verwendung des HCVcc-Modellsystems Um die im HCVpp-System gewonnenen Ergebnisse zu bestätigen wurde die durch anti-HCV IgG vermittelte Neutralisation im HCVcc-System untersucht. Die HCVcc-Infektion von Huh7.5.1-Zellen wurde analog zu Protokoll I und II durchgeführt. Wie in Abb. 3.4 dargestellt, zeigte sich unter Verwendung der anti-HCV IgGs eine deutliche Hemmung in Protokoll II; diese ist nahezu identisch zu den im HCVpp-System gezeigten Ergebnissen. Um die Schritte nach der viralen Bindung an die Zielzelle näher untersuchen zu können, wurde auch der im HCVpp-System verwendete Kinetik-Assay auf das HCVcc-System übertragen und analog durchgeführt. Wie bereits im HCVpp-System gezeigt, konnte eine nahezu identische Neutralisierungskinetik für anti-CD81, anti-SR-BI und verschiedene anti-HCV-IgG analysiert werden (Abb. 3.5). Diese Ergebnisse bestätigen die bereits im HCVpp-System gewonnene Annahme, dass HCV positive Patientenseren Antikörper enthalten, welche auf einen späten Schritt der viralen Infektion gerichtet sind. Ergebnisse 40 Abb. 3.4: Neutralisierung der HCVcc Infektion durch humane anti-HCV-Antikörper. (A) Hemmung der HCVcc (Luc-Jc1) Infektion von Huh-7.5.1-Zellen durch Heparin, anti-CD81 und anti-SR-BI bzw. Kontroll-Antikörper in Protokoll I und II. (B) Hemmung der HCVcc (Luc-Jc1) Infektion von Huh-7.5.1-Zellen durch humane antiHCV-Antikörper und Kontroll-Antikörper (100µg/ml) in Protokoll I und II. Die Mittelwerte ± SD von vier unabhängigen Experimenten in Dreifachansatz sind gezeigt. Ergebnisse 41 Abb. 3.5: Kinetik der Neutralisierung der HCVcc-Infektion durch anti-HCV IgG. (A) Kinetik der antikörpervermittelten Neutralisierung der HCVpp (1a; H77c strain) Infektion durch anti-CD81, anti-SR-BI und Heparin. (B, C) Kinetik der antikörpervermittelten Neutralisation der HCVpp (1a, H77c) Infektion durch antiHCV IgG aus Patientenseren oder HCV negativen Kontrollseren sowie anti-CD81 Antikörpern. Die Mittelwerte ± SD von drei unabhängigen Experimenten in Dreifachansatz sind gezeigt. Diskussion 4 42 Diskussion 4.1 Das Angriffsziel neutralisierender Antikörper in HCV-positiven Patientenseren besteht in Schritten nach der Bindung an die Wirtszelle In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Mehrzahl HCV infizierter Patienten antivirale Antikörper produziert, deren Ziel vornehmlich Schritte nach der Bindung an die Wirtszelle darstellen. Dies beinhaltet möglicherweise Schritte nach der viralen Bindung an die Zielzelle, wie die Clathrin-abhängige Endozytose und letztendlich auch einen sehr späten Schritt – die Membranfusion. Darüber hinaus konnte diese Arbeit erstmals virale Epitope der Virushüllglykoproteine charakterisieren, welche elementare Angriffsziele im Rahmen der antikörpervermittelten Neutralisation der viralen Aufnahme darstellen. Mit Hilfe von Experimenten, welche es erlauben den zeitlichen Ablauf der viralen Aufnahme genauer zu untersuchen, konnte gezeigt werden, dass die Wirtszellantwort in Patientenseren gegen Schritte der viralen Aufnahme gerichtet ist, deren Zeitpunkt nahe dem der bekannten Rezeptorkandidaten CD81 und SR-BI einzuordnen ist. Diese Erkenntnisse haben große Bedeutung für das Verständnis der Pathogenese der HCV-Infektion und darüber hinaus könnten sie zur Entwicklung neuer antiviraler und immunmodulatorischer Strategien beitragen. Analog zu anderen viralen Infektionen sind anti-HCV Antikörper in der Lage mit verschiedenen Schritten des viralen Zyklus zu interagieren und eine virale Aufnahme zu verhindern (4). Die Bindung neutralisierender Antikörper an das Virus vermag eine direkte Blockade der Bindung an die Zielzelle zu vermitteln und führt somit zu einem Verhindern der Infektion. Darüber hinaus können auch spätere Schritte nach der viralen Bindung zum Ziel neutralisierender Antikörper werden; diese stehen in naher Verbindung zu späten Aufnahmerezeptorkandidaten wie CD81, SR-BI und Claudin-1 (4, 111). Auch die Clathrinabhängige Endozytose stellt ein wichtiges Ziel der Inhibierung einer viralen Infektion dar und ist damit möglicherweise Ziel neutralisierender Antikörper. Auch die Fusion mit der Zelloberfläche sowie mit dem Endosom kann Angriffspunkt neutralisierender Antikörper sein: diese können direkt mit dem Fusionsprotein interagieren und durch Änderung der Konformation, welche für den Fusionsprozess elementar erscheint, oder durch einfache Blockade des Kontakts zwischen Virus und Membran eine virale Infektion der Zelle verhindern. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden dass neutralisierende Antikörper in Diskussion 43 Patientenseren mit den Modellsystemen HCVpp und HCVcc auf einer Ebene nach der Bindung an die Zielzelle interagieren; diese Neutralisation findet auf einer Ebene nahe der CD81 und SR-BI Interaktion statt. Diese späte Interaktion mit der viralen Aufnahme kann möglicherweise auch sehr späte Schritte – wie die Interaktion mit Claudin-1 sowie die Membranfusion – betreffen. Im Rahmen einer Kollaboration mit der Arbeitsgruppe von F.-L. Cosset, Lyon konnte gezeigt werden, dass der sehr späte Schritt der Membranfusion ein mögliches Ziel neutralisierender Antikörper darstellt (38). Darüber hinaus können unsere Ergebnisse die virale Bindung als Angriffspunkt neutralisierender Antikörper nicht ausschließen. Die Antikörpervermittelte Interaktion auf der Ebene von späten Schritten der viralen Aufnahme und der Membranfusion konnte bereits für andere Viren der Familie der Flaviviridae, wie das West-Nil-Virus (72) und das Dengue-Virus (91), gezeigt werden. Zusammenfassend lässt sich die Aussage treffen, dass unsere Ergebnisse darauf hindeuten, dass späte Schritte nach der viralen Bindung sowie auch die Membranfusion eine Schlüsselrolle für eine effiziente Neutralisation des Hepatitis C Virus darstellen. 4.2 Charakterisierung der Virushüllglykoproteine E1 und E2 als Ziel neutralisierender Antikörper Wie schon in verschiedenen Modellsystemen bereits gezeigt stellen die Virushüllglykoproteine E1 und E2 eine wichtige Rolle im Rahmen der zellulären Aufnahme dar. Somit repräsentieren sie auch ein wichtiges Ziel für neutralisierende Antikörper. Bisher konnten neutralisierende Antikörper charakterisiert werden, welche sowohl die lineare Struktur als auch die in kompletter Konformation vorliegende Struktur des Epitopes erkennen (4, 78, 64, 7, 104, 56). Der genaue Aufnahmeschritt, welcher durch neutralisierende Antikörper erkannt wird, konnte bisher nicht genau definiert werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Epitope der Virushüllglykoproteine E1 und E2 das Ziel neutralisierender Antikörper eines späten Aufnahmeschrittes darstellen. Weiter konnte das Epitop E1 mit der Aminosäuresequenz 313-326 als wichtiger Faktor für die Vermittlung eines späten Aufnahmeschrittes, und im Zuge dessen auch als wichtiger Part für die antikörpervermittelte Neutralisierung, charakterisiert werden. Diese Erkenntnis unterstreicht die elementare Bedeutung des E1-Epitopes für einen späten Schritt in der viralen Aufnahme. Diskussion 44 4.3 Validierung der Ergebnisse unter Verwendung des HCVcc-Systems Das HCVcc-System stellt das derzeit am meisten verwendete Modellsystem dar. Es erlaubt, im Gegensatz zum HCVpp und HCV-LP System, die Untersuchung des kompletten Infektions - und Vermehrungszyklus eines Hepatitis C Virus. Die rekombinant hergestellten Virionen enthalten, im Gegensatz zu HCVpp und HCV-LP, nicht nur die Virushüllglykoproteine als Bestandteil des HCV sondern auch die für die Replikation wesentlichen Faktoren (45, 4). Deshalb stellt das HCVcc-System das System dar, welches dem Hepatitis C Virus in natura am nächsten kommt und ist somit der derzeitige Goldstandard bei in vitro Experimenten zur Untersuchung des Lebenszyklus des HCV (4). Das HCVpp-System diente bei dieser Arbeit als primäres System, da es eine sehr robuste und labortechnisch relativ einfach zu handhabende Methode darstellt. Weiter lässt es sich in großen Mengen relativ leicht produzieren, was eine Eignung zu relativ großen Versuchsanordnungen zur Folge hat. Nun war es ein weiteres Ziel dieser Arbeit, die bereits im HCVpp-System beobachteten Erkenntnisse mit dem derzeit gängigsten System, dem HCVcc-System, zu untersuchen um die Ergebnisse zu bestätigen. Die bereits im Ergebnisteil dokumentierten Erkenntnisse unter Verwendung rekombinanter Virionen sind nahezu identisch mit den Ergebnissen für das HCVpp-System. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, das die Mechanismen der Neutralisation beider Systeme in vitro sehr ähnlich zu sein scheinen. Dies bestätigen auch erst kürzlich durchgeführte Studien, welche gezeigt haben, dass die in vitro Neutralisation im HCVppModell mit der in vitro Neutralisation im HCVcc-System als auch mit der in vivo Neutralisation in einer chimären uPA-SCID Maus (50, 102) identisch ist. Dennoch lassen sich kleinere Unterschiede zwischen den verschiedenen Systemen nicht vollständig ausschließen. 4.4 Bedeutung neutralisierender Antikörper für die Pathogenese der HCV-Infektion Unter Verwendung des HCVpp-System konnten bereits zwei Studien zeigen, dass neutralisierende Antikörper im Rahmen der HCV-Infektion von Patienten in der frühen Phase der Infektion produziert werden. Darüber hinaus ergab sich auch die Erkenntnis, das neutralisierende Antikörper primär von Patienten produziert werden, welche in der Lage waren die Infektion spontan auszuheilen bzw. die Infektion unter Kontrolle zu halten (78, Diskussion 45 103). Patienten die nicht in der Lage waren die Infektion spontan auszuheilen oder unter Kontrolle zu bringen entwickelten hoch-titrige und kreuzneutralisierende Antikörper während der Chronifizierungsphase der HCV-Infektion (78, 103, 58, 48). Paradoxerweise waren diese Antikörper nicht in der Lage die HCV-Infektion zu beherrschen (78, 103, 58). Untersuchungen bei einem mit chronischer Hepatitis C infiziertem Patienten, welcher im Rahmen einer Langzeitstudie über 30 Jahre im Hinblick auf seine Immunantwort untersucht wurde, hat ergeben, dass das HCV kontinuierlich der Wirtszellantwort mit Hilfe ständig ablaufender Mutationen entflieht („escape“-Phänomen) (103). Dies führt zu einem Verlust der Fähigkeit von Antikörpern, die HCV Virushüllglykoproteine zu erkennen; dies lässt die Vermutung zu, dass die Wirtszellantwort und die im Rahmen dieser produzierten Antikörper hinter der sich schnell entwickelnden HCV Virushüllglykoproteinsequenz der QuasispeziesPopulation zurückliegt (103). Dies bedeutet, das die Neutralisierung heterologer HCV-Stränge nicht gleichbedeutend ist mit der Neutralisierung sich derzeit im Serum befindlicher viraler Varianten (103). Diese Erkennnisse könnte die Erklärung dafür liefern, weshalb die in dieser Arbeit gefundenen neutralisierenden Antikörper in Patientenseren nicht in der Lage sind, die chronische HCV-Infektion zu kontrollieren. Zusammenfassend lassen die Erkenntnisse dieser Arbeit die Schlussfolgerung zu, dass sowohl die effiziente antikörpervermittelte Neutralisation als auch die „virale Flucht“ vor Beherrschung der Infektion auf späten Schritten nach der viralen Bindung an die Zielzelle ablaufen. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die These, dass HCV- Wirtszellinteraktionen während späteren Schritten der viralen Aufnahme nach der Bindung als auch sehr späte Schritte wie die Membranfusion eine elementare Rolle für die Kontrolle der viralen Infektion als auch für den sogenannten „escape“-Mechanismus darstellt. Die weitere Identifikation und Charakterisierung der Mechanismen der antikörpervermittelten Einflussnahme auf den viralen Aufnahmemechanismus des HCV hat große Bedeutung sowohl für das Verständnis der Pathogenese der HCV-Infektion neuartiger Therapien und Optionen der Vorsorge. als auch für die Entwicklung Zusammenfassung 5 46 Zusammenfassung Das Hepatitis C Virus gehört zu den weltweit wichtigsten Erregern der chronischen Hepatitis. Virale Bindung und Aufnahme repräsentieren die ersten Schritte der Interaktion zwischen Virus und Zelle und stellen damit ein wichtiges Angriffsziel für die adaptive Immunantwort dar. Die Mechanismen der antikörpervermittelten Neutralisation im Rahmen der Wirtszellantwort sind derzeit nicht vollständig verstanden. Retrovirale HCV Pseudopartikel (HCVpp) und rekombinante infektiöse Virionen (HCVcc) stehen als wichtige Modellsysteme zur Verfügung und erlauben eine Beobachtung des viralen Aufnahmemechanismus sowie der antikörpervermittelten Neutralisation. In dieser Arbeit wurden diese Modellsysteme eingesetzt, um den Mechanismus der antikörpervermittelten Neutralisation zu analysieren. Zu diesem Zweck wurden monoklonale Anti-Hüllglykoprotein-Antikörper und polyklonale Anti-HCV Immunglobuline aus aufgereinigten Seren von HCV-infizierten Patienten verwendet. Mit Hilfe einer Reihe von monoklonalen Anti-Hüllglykoprotein-Antikörpern konnte diese Arbeit ein Epitop (aa 313326) innerhalb des E1-Glykoproteins als Angriffsziel neutralisierender Antikörper identifizieren. Dieses scheint einen späten Schritt der viralen Aufnahme zu vermitteln. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Mehrheit der mit chronischer Hepatitis C infizierten Patienten in der Lage war, die HCVpp und HCVcc-Infektion auf einem späteren Schritt der Aufnahme nach der viralen Bindung zu hemmen. Diese Erkenntnisse lassen darauf schliessen, dass ein Grossteil der Wirtszellantwort in HCV-positiven Patienten Antikörper beinhaltet, die auf einen Infektionsschritt nach der viralen Bindung an die Zielzelle gerichtet sind. Um den Zeitpunkt dieser späten Inhibierung durch neutralisierende Antikörper genauer charakterisieren zu können, wurde die kinetische Abfolge der Neutralisation durch Antikörper mit Hilfe eines in dieser Arbeit etablierten Versuchsansatzes untersucht. Es zeigte sich bei einigen der verwandten Patientenseren ein zeitlich ähnliches Neutralisationsmuster zu dem der Rezeptorkandidaten der späten Virusaufnahme – SR-BI und CD81. Unsere Untersuchungen weisen darauf hin, dass im Verlauf der Hepatitis C Virus Infektion neutralisierende Antikörper induziert werden, die auf einen späteren Schritt nach der viralen Bindung gerichtet sind welche eine Ebene nahe der CD81 und SR-BI Interaktion beinhaltet. Die weitere Identifikation und Charakterisierung der Mechanismen der antikörpervermittelten Einflussnahme auf den viralen Aufnahmemechanismus des HCV hat große Bedeutung sowohl für das Verständnis der Pathogenese der HCV-Infektion als auch für die Entwicklung neuartiger Therapien und Optionen der Vorsorge. Literaturverzeichnis 6 47 Literaturverzeichnis 1. Agnello, V., G. Abel, M. Elfahal, G. B. Knight, and Q. X. Zhang. 1999. Hepatitis C virus and other flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 96:12766-71. 2. Appel, N., M. Zayas, S. Miller, J. Krijnse-Locker, T. Schaller, P. Friebe, S. Kallis, U. Engel, and R. Bartenschlager. 2008. Essential role of domain III of nonstructural protein 5A for hepatitis C virus infectious particle assembly. PLoS Pathog 4:e1000035. 3. Bartenschlager, R., and V. Lohmann. 2000. Replication of hepatitis C virus. J. Gen. Virol. 81:1631-48. 4. Barth, H., T. J. Liang, and T. F. Baumert. 2006. 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Blum danke ich für seine Unterstützung und die Möglichkeit, die Dissertation in seiner Abteilung durchzuführen. Herrn Prof. Dr. C. Waller danke ich für sein Engagement als Zweitgutachter. Frau E. K. Schnober gilt mein ganz besonderer Dank für die hervorragende Unterstützung bei der Durchführung der Experimente und der Diskussion der Ergebnisse. Frau Dr. M. B. Zeisel danke ich für die Unterstützung bei den HCVcc-Experimenten sowie für die kritische Durchsicht dieser Arbeit. Frau Dr. A. Union, Herrn Dr. E. Depla und Herrn Dr. A. Patel danke ich für die Bereitstellung der monoklonalen Anti-HCV Antikörper. Frau Dr. H. Barth, Herrn P. Carolla, Frau B. Gißler, Frau Prof. F. Stoll-Keller, Frau Dr. C. Schuster, Frau Dr. M. Dimitrova sowie allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der B-Labore der Abt. Innere Medizin II und INSERM Strasbourg danke ich herzlich für Ihre wertvolle Unterstützung. Von ganzem Herzen danken möchte ich meiner Familie und meinem Freund Dr. Rouven Streller für ihre allgegenwärtige Hilfsbereitschaft, ihre Unterstützung und ihr Vertrauen. Lebenslauf 8 58 Lebenslauf 10.09.1979 geboren in Herbolzheim 1986-1990 Grundschule Köndringen 1990-1996 Gymnasium Kenzingen 1996-1999 Sozialpädagogisches Gymnasium St. Ursula, Freiburg 1999 Abitur 1999-2002 Ausbildung zur Medizinisch-Technischen Laboratoriumsassistentin, Universitätsklinikum Freiburg seit 2002 Studium der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg 2004 1. Abschnitt der ärztlichen Prüfung 2004-2007 Famulaturen in den Fachbereichen - Chirurgie (Kreiskrankenhaus Emmendingen) - Allgemeinmedizin (Praxis Dr. Räpple, Teningen) - Psychiatrie (Universitätsklinikum Freiburg) - Gynäkologie (Praxis Dr. Bauer, Freiburg) 2005-2008 Experimentelle Dissertation in der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Baumert, Abt. Innere Medizin II, Medizinische Universitätsklinik Freiburg (Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. Dr. h. c. H. E. Blum) 2007-2008 Praktisches Jahr am Universitätsklinikum Freiburg, Wahlfach Dermatologie 2009 2. Abschnitt der ärztlichen Prüfung Eigene Veröffentlichungen 9 59 Eigene Veröffentlichungen 1. Originalartikel: Haberstroh, A., E. K. Schnober, M. B. Zeisel, P. Carolla, H. Barth, H. E. Blum, F.-L. Cosset, G. Koutsoudakis, R. Bartenschlager, A. Union, E. Depla, A. Owsianka, A. H. Patel, C. Schuster, F. Stoll-Keller, M. Doffoel, M. Dreux, and T. F. Baumert. 2008. Neutralizing host responses in hepatitis C virus infection target viral entry at post-binding steps and membrane fusion. Gastroenterology.2008 Nov;135(5):1719-1728. Zeisel, M. B., G. Koutsoudakis, E. K. Schnober, A. Haberstroh, H. E. Blum, F.-L. Cosset, T. Wakita, D. Jaeck, M. Doffoel, C. Royer, E. Soulier, E. Schvoerer, C. Schuster, F. Stoll-Keller, R. Bartenschlager, T. Pietschmann, H. Barth, T. F. Baumert. 2007. Scavenger receptor class B type I is a key host factor for hepatitis C virus required for an entry step closely linked to CD81. Hepatology; 46: 1722-31. Lucas M., A. Ulsenheimer, K. Pfafferot, M. H. J. Heeg, S. Gaudieri, N. Grüner, A. Rauch, J. T. Gerlach, M. C. Jung, R. Zachoval, G. R. Pape, W. Schraut, T. Sanantonio, H. Nitschko, M. Obermeier, R. Phillips, T. J. Scriba, N. Semmo, C. Day, J. N. Weber, S. Fidler, R. Thimme, A. Haberstroh, T. F. Baumert, P. Klenerman, H. M. Diepolder. 2007. Tracking virus-specific CD4+ T cells during and after acute hepatitis C virus infection. Plos One; e649 17653276. Weseslindtner L., C. Neumann-Haefelin, S. Viazov, A. Haberstroh, J. Kletzmayr, J. H. Aberle, J. Timm, S. R. Ross, R. Klauser-Braun, T. F. Baumert, M. Roggendorf, R. Thimme, H. Holzmann. 2008. Acute infection with a single hepatitis C virus strain in dialysis patients: analysis of adaptive immune response and viral variability. J Hepatol.2009 Apr;50(4):693-704. Vieyres G., A. G. N. Angus, A. Haberstroh, T. F. Baumert, J. Dubuisson, A. H. Patel. 2008. Rapid synchronization of hepatitis C virus infection by magnetic adsorption. J Virol Methods.2009 Apr;157(1):69-79. Buchkapitel: Lupberger J., M. B. Zeisel, A. Haberstroh, E. K. Schnober, S. Krieger, E. Soulier, C. Thumann, C. Royer, S. Fafi-Kremer, C. Schuster, F. Stoll-Keller, H. E. Blum, T. F. Baumert. 2008. Virus-host interactions during hepatitis C virus entry – Implications for pathogenesis and novel treatment approaches. Virologica Sinica. 23 (2):124-131 Eigene Veröffentlichungen 60 2. Tagungsbeiträge Vorträge: Haberstroh, A., E. K. Schnober, M. B. Zeisel, P. Carolla, H. Barth, H. E. Blum, F.-L. Cosset, G. Koutsoudakis, R. Bartenschlager, A. Union, E. Depla, A. Owsianka, A. H. Patel, C. Schuster, F. Stoll-Keller, M. Doffoel, M. Dreux, and T. F. Baumert. 2008. La reponse humorale neutralisante dans l’infection par le virus de l’entree du virus qui suit l’attachement. 8eme Reunion RNH de l’Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les Hepatites Virales B et C (ANRS), 24.-25.01.2008, Paris, France. Haberstroh, A., E. K. Schnober, M. B. Zeisel, P. Carolla, H. Barth, H. E. Blum, F.-L. Cosset, G. Koutsoudakis, R. Bartenschlager, A. Union, E. Depla, A. Owsianka, A. H. Patel, C. Schuster, F. Stoll-Keller, M. Doffoel, M. Dreux, and T. F. Baumert. 2007. La reponse humorale neutralisante dans l’infection par le virus de l’entree du virus qui suit l’attachement. 61emes Journees Scientifiques de l’AFEF, 28.09.2007,Grenoble, France. Zeisel, M. B., G. Koutsoudakis, E. K. Schnober, A. Haberstroh, H. E. Blum, F.-L. Cosset, T. Wakita, D. Jaeck, M. Doffoel, C. Royer, E. Soulier, E. Schvoerer, C. Schuster, F. Stoll-Keller, R. Bartenschlager, T. Pietschmann, H. Barth, T. F. Baumert. 2007. Le scavenger receptor B I est necessaire a une etape de l’entree du virus de l’hepatite C etroitement associee au CD81. 61emes Journees Scientifiques de l’AFEF, 28.09.2007, Grenoble, France. Haberstroh, A., E. K. Schnober, M. B. Zeisel, P. Carolla, H. Barth, H. E. Blum, F.-L. Cosset, G. Koutsoudakis, R. Bartenschlager, A. Union, E. Depla, A. Owsianka, A. H. Patel, C. Schuster, F. Stoll-Keller, M. Doffoel, M. Dreux, and T. F. Baumert. 2007. Neutralizing host responses in hepatitis C virus infection target viral entry at post-binding steps and membrane fusion. 14th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses, 09.-13.09.2007, Glasgow, United Kingdom. Zeisel, M. B., G. Koutsoudakis, E. K. Schnober, A. Haberstroh, H. E. Blum, F.-L. Cosset, T. Wakita, D. Jaeck, M. Doffoel, C. Royer, E. Soulier, E. Schvoerer, C. Schuster, F. Stoll-Keller, R. Bartenschlager, T. Pietschmann, H. Barth, T. F. Baumert. 2007. Scavenger receptor class B type I is a host entry factor required for the early steps of hepatitis C virus infection. Reunion AC29 de l’Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les Hepatites Virales B et C (ANRS), 14.02.07, Paris, France. Zeisel M. B., E. K. Schnober, A. Haberstroh, D. Lavillette, F.-L. Cosset, T. Wakita, D. Jaeck, C. Royer, C. Schuster, F. Stoll-Keller, H. E. Blum, H. Barth, T. F. Baumert. 2006. Scavenger receptor class B type I is a co-receptor for infection with cell culture-derived hepatitis C virus. 7eme Reunion RNH de l’Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les Hepatites Virales B et C (ANRS), 03.-04.10.06, Paris, France. Eigene Veröffentlichungen 61 Zeisel M. B., E. K. Schnober, A. Haberstroh, D. Lavillette, F.-L. Cosset, T. Wakita, D. Jaeck, C. Royer, C. Schuster, F. Stoll-Keller, H. E. Blum, H. Barth, T. F. Baumert. 2006. Scavenger receptor class B type I is a co-receptor for infection with cell culture-derived hepatitis C virus.13th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses, 27.31.08.2007, Cairns, Australia. Zeisel M. B., E. K. Schnober, A. Haberstroh, D. Lavillette, F.-L. Cosset, T. Wakita, D. Jaeck, C. Royer, C. Schuster, F. Stoll-Keller, H. E. Blum, H. Barth, T. F. Baumert. 2006. Scavenger receptor class B type I is a co-receptor for infection with cell culture-derived hepatitis C virus. International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease (ISVHLD), 01.-05.07.2006, Paris, France. Haberstroh A., H. Barth, E. K. Schnober, J. M. Pestka, H. M. Diepolder, J. T. Gerlach, G. R. Pape, A. H. Patel, H. E. Blum, F. L. Cosset, T. F. Baumert. 2006. Cellular binding and entry of hepatitis C virus pseudotypes and virus-like particles requires a different set of cellular co-receptors. 41st Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver (EASL), 26.-30.04.2006, Vienna, Austria. Posterpräsentationen: Schnober E. K., A. Haberstroh, M. B. Zeisel, A. Union, G. Maartens, M. Dreux, F.-L. Cosset, T. F. Baumert. Identification of envelope glycoprotein E1 epitope 313-326 as a viral factor mediating a post-binding step of hepatitis C virus entry. 2008. 15th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses, 05.-09.10.2008, San Antonio, USA. Zeisel M. B., A. Haberstroh, E. K. Schnober, P. Carolla, H. E. Blum, F.-L. Cosset, G. Koutsoudakis, R. Bartenschlager, C. Schuster, M. Doffoel, F. Stoll-Keller, T. F. Baumert. 2008. Neutralizing antibodies in HCV infected patients target viral entry steps related to HCV-CD81, scavenger receptor B I and claudin-1 interactions. 15th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses, 05.-09.10.2008, San Antonio, USA. Haberstroh, A., E. K. Schnober, P. Carolla, M. B. Zeisel, H. Barth, H. E. Blum, M. Dreux, F.-L. Cosset, G. Koutsoudakis, R. Bartenschlager, E. Depla, A. Owsianka, A. H. Patel, C. Schuster, F. Stoll-Keller, M. Doffoel, F.-L. Cosset and T. F. Baumert. 2008. Neutralizing host responses in hepatitis C virus infection target viral entry at post-binding steps and viral fusion. 43th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver (EASL), 23.-27.04.2008, Milan, Italy. Haberstroh, A., E. K. Schnober, P. Carolla, M. B. Zeisel, H. Barth, H. E. Blum, M. Dreux, F.-L. Cosset, G. Koutsoudakis, R. Bartenschlager, E. Depla, A. Owsianka, A. H. Patel, C. Schuster, F. Stoll-Keller, M. Doffoel, F.-L. Cosset and T. F. Baumert. 2008. Neutralizing host responses in hepatitis C virus infection target viral entry at post-binding Eigene Veröffentlichungen 62 steps and viral fusion. Annual Meeting of the German Society for the Study of the Liver (GASL), 25.-26.01.2008, Frankfurt, Germany. Haberstroh, A., E. K. Schnober, M. B. Zeisel, P. Carolla, H. Barth, H. E. Blum, F.-L. Cosset, G. Koutsoudakis, R. Bartenschlager, A. Union, E. Depla, A. Owsianka, A. H. Patel, C. Schuster, F. Stoll-Keller, M. Doffoel, M. Dreux, and T. F. Baumert. 2007. Neutralizing host responses in hepatitis C virus infection target viral entry at post-binding steps and membrane fusion. 58th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD), 02.-06.11.2007, Boston, USA. Zeisel, M. B., G. Koutsoudakis, E. K. Schnober, A. Haberstroh, H. E. Blum, F.-L. Cosset, T. Wakita, D. Jaeck, M. Doffoel, C. Royer, E. Soulier, E. Schvoerer, C. Schuster, F. Stoll-Keller, R. Bartenschlager, T. Pietschmann, H. Barth, T. F. Baumert. 2007. Scavenger receptor class B type I is a key host factor for hepatitis C virus required for an entry step closely linked to CD81. 58th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD), 02.-06.11.2007, Boston, USA. Zeisel, M. B., G. Koutsoudakis, E. K. Schnober, A. Haberstroh, H. E. Blum, F.-L. Cosset, T. Wakita, D. Jaeck, M. Doffoel, C. Royer, E. Soulier, E. Schvoerer, C. Schuster, F. Stoll-Keller, R. Bartenschlager, T. Pietschmann, H. Barth, T. F. Baumert. 2007. Scavenger receptor class B type I is a key host factor for hepatitis C virus required for an entry step closely linked to CD81. 14th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses, 09.-13.09.2007, Glasgow, United Kingdom. Zeisel M. B., E. K. Schnober, A. Haberstroh, D. Lavillette, F.-L. Cosset, T. Wakita, D. Jaeck, C. Royer, C. Schuster, F. Stoll-Keller, H. E. Blum, H. Barth, T. F. Baumert. 2006. Scavenger receptor class B type I is a co-receptor for infection with cell culture-derived hepatitis C virus. 57th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD), 27.-31.10.2006, Boston, USA. Haberstroh A., H. Barth, E. K. Schnober, J. M. Pestka, H. M. Diepolder, J. T. Gerlach, G. R. Pape, A. H. Patel, H. E. Blum, F. L. Cosset, T. F. Baumert. 2006. Cellular binding and entry of hepatitis C virus pseudotypes and virus-like particles requires a different set of cellular co-receptors. 22th Annual Meeting of the German Association for the Study of the Liver (GASL), 20.-21.01.2006, Leipzig, Germany.
