Intrazelluläre Bestimmung von Interleukin-2, -5 und
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Aus der Abteilung für Gastroenterologie und Hepatologie der Medizinischen Klinik der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil - Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Leitender Arzt: Prof. Dr. med. B. May Intrazelluläre Bestimmung von Interleukin-2, -5 und -10 bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen unter systemischer Glukokortikoidmedikation Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Anja Engel aus Ingolstadt 2001 Abstract von: Engel, Anja Intrazelluläre Bestimmung von Interleukin - 2, - 5 und - 10 bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen unter systemischer Glukokortikoidmedikation Bei Morbus Crohn und Colitis ulcerosa handelt es sich um chronisch entzündliche Darmerkrankungen, an deren Pathogenese Interleukine als Entzündungsmediatoren zweifelsohne eine bedeutende Rolle spielen. Dennoch ist das Verhalten dieser Interleukine bezüglich des Krankheitsbildes, der Entzündungsaktivität und ihre Beeinflußbarkeit durch Glukokortikoide nicht widerspruchsfrei geklärt. Intention der vorliegenden Arbeit war es, die Interleukine IL-2, IL-5 und IL-10 in peripheren Lymphozyten bei Patienten mit Morbus Crohn und Colitis ulcerosa unter systemischer Steroidmedikation auf Einzelzellniveau zu untersuchen. Dazu wurden die Lymphozyten isoliert, zur Interleukinproduktion angeregt, auf einem Objektträger fixiert, die Interleukine mit Hilfe der Peroxidasetechnik angefärbt und die Interleukinmenge mittels Computerbildanalyse bestimmt. Es lagen folgende Patientenkollektive vor: 1.) Neun Patienten mit inaktivem Morbus Crohn ohne Steroidmedikation, 2.) acht Patienten mit inaktivem Morbus Crohn unter systemischer Steroidmedikation, 3.) neun Patienten mit aktivem Morbus Crohn und Steroiden, 4.) fünf Patienten mit aktiver Colitis ulcerosa und Steroiden sowie 5.) vier Patienten mit inaktiver Colitis ulcerosa und Steroiden (mittlere Steroiddosis 72 mg). Im Vergleich der 1. und 2. Gruppe zeigte sich in dem Kollektiv mit der Steroidmedikation eine signifikante Zunahme von IL-2 pro Lymphozyt, wohingegen sich der relative Anteil IL-2-bildender Zellen in den beiden Kollektiven nicht unterschied. Weiterhin fand sich im Vergleich der Gruppen 2 und 3 mit Erreichen des Remissionsstadiums bei Morbus Crohn unter Glukokortikoidmedikation eine signifikante Zunahme des relativen Anteils an IL-10produzierenden Lymphozyten. Der Vergleich der Kollektive 3 und 4 zeigte auch unter Steroidmedikation einen signifikant höheren Anteil an IL-5-bildenden Zellen bei Colitis ulcerosa gegenüber Morbus Crohn. Der Konzentrationsanstieg von IL-2 pro Lymphozyt bei inaktivem Morbus Crohn unter systemischer Steroidmedikation gegenüber dem Kollektiv ohne Steroide kann darin begründet sein, daß ein Wirkungsmechanismus der Glukokortikoide ist, die Ausschleusung proinflammatorischer Zytokine aus der Zelle zu blockieren. Der Anstieg von IL-10 nach Erreichen der Remission bei Morbus Crohn unterstützt die Hypothese der antiinflammatorischen Wirkung dieses Interleukins. Die Hypothese der TH2-gewichteten Immunitätslage bei der Colitis ulcerosa wird durch den auch unter Steroidmedikation fortbestehenden gegenüber Morbus Crohn erhöhten Anteil an IL-5-produzierenden Lymphozyten unterstützt. Dekan Prof. Dr. med. G. Muhr Referent Prof. Dr. med. B. May Koreferent Prof. Dr. med. R.J. Adamek Tag der mündlichen Prüfung 18.12.2001 Inhaltsverzeichnis Seite 1. Einleitung ..................................................................................................... 1 1.1 Problemstellung ........................................................................................... 1 1.2 Grundlagen chronisch entzündlicher Darmerkrankungen ............................. 2 1.3 Das Immunsystem ....................................................................................... 4 1.3.1 Interaktionen der Zellen des Immunsystems ................................................ 4 1.3.2 Zytokine, unter besonderer Berücksichtigung von IL-2, IL-5 und IL-10......... 5 1.3.3 Das Immunsystem des Gastrointestinaltraktes .......................................... 12 1.3.4 Das Immunsystem bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen ......... 14 1.4 Glukokortikoide........................................................................................... 18 1.4.1 Geschichtliche Entwicklung der Glukokortikoide......................................... 18 1.4.2 Allgemeine Charakterisierung der Kortikosteroide...................................... 18 1.4.3 Molekularer Angriffspunkt der Glukokortikoide ........................................... 19 1.4.4 Einfluß der Glukokortikoide auf zirkulierende Zellen................................... 21 1.4.5 Einfluß der Glukokortikoide auf den Arachidonsäuremetabolismus............ 22 1.4.6 Einfluß der Glukokortikoide auf die Zytokinbildung ..................................... 24 1.4.7 Einfluß der Glukokortikoide auf Rezeptoren ............................................... 27 1.4.8 Einfluß der Glukokortikoide auf die Antikörperproduktion ........................... 27 1.4.9 Einfluß der Glukokortikoide auf die Darmpermeabilität............................... 27 1.4.10 Pharmakotherapie mit Glukokortikoiden..................................................... 28 1.4.11 Glukokortikoide bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen............... 30 2. Patientenkollektiv, Material und Methoden ................................................. 32 2.1 Aktivitätsindizes bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen.............. 32 2.1.1 Aktivitätsindizes bei Morbus Crohn............................................................. 32 2.1.2 Aktivitätsindizes bei Colitis ulcerosa ........................................................... 34 2.2 Probanden.................................................................................................. 35 2.3 Material und Methoden............................................................................... 36 2.3.1 Allgemeines zur Zytokindetektion ............................................................... 36 2.3.2 Verwendete Medien und Lösungen ............................................................ 37 2.3.3 Versuchsbeschreibung zur Interleukindarstellung ...................................... 39 2.3.4 Computergestützte Bildanalyse zur Interleukinbestimmung ....................... 44 2.3.5 Statistische Methoden ................................................................................ 47 3. Ergebnisse ................................................................................................. 49 3.1 IL-2, IL-5 und IL-10 bei Morbus Crohn in Remission; Vergleich mit und ohne Glukokortikoide ..................................................... 50 3.2 IL-2, IL-5 und IL-10 bei Morbus Crohn unter Glukokortikoiden; Vergleich akuter Schub und Remission...................................................... 54 3.3 IL-2, IL-5 und IL-10 bei Colitis ulcerosa unter Glukokortikoiden; Vergleich akuter Schub und Remission...................................................... 58 3.4 IL-2, IL-5 und IL-10 bei aktiven chronisch entzündlichen Darmerkrankungen unter Glukokortikoiden; Vergleich Crohn und Colitis ........... 62 3.5 IL-2, IL-5 und IL-10 bei inaktiven chronisch entzündlichen Darmerkrankungen unter Glukokortikoiden; Vergleich Crohn und Colitis ............ 66 3.6 Zusammenfassung der Meßergebnisse ..................................................... 70 4. Diskussion.................................................................................................. 71 4.1 Einfluß einer Steroidmedikation auf das Zytokinprofil bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen.............................................................. 71 4.2 Ursachen der Differenzen in den Meßergebnissen..................................... 77 4.3 Beurteilung der Methode der intrazellulären Zytokindetektion .................... 80 5. Zusammenfassung und Ausblick................................................................ 82 6. Literaturverzeichnis .................................................................................... 83 Abkürzungsverzeichnis AK Antikörper CCD Charge coupled device CD Cluster of differentiation CDAI Crohn´s disease activity index CU Colitis ulcerosa DAB 3,3-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay g Erdbeschleunigung (9,81 m/s2) GALT Gut-associated lymphoid tissue GC Glukokortikoide IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin MC Morbus Crohn MHC Major histocompatibiltiy complex mRNA messanger-Ribonukleinsäure PCR Polymerase chain reaction RIA Radioimmunoassay TH T-Helferzell-Klasse TNF Tumor necrosis factor 1 1. Einleitung 1.1 Problemstellung Bei den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen kommt immunologischen Mechanismen pathogenetisch eine besondere Bedeutung zu [ZEITZ 90]. Dafür spricht auch der Erfolg immunsuppressiver Therapieansätze [CHOI 94, COHEN 95, LICHTENSTEIN 94], die seit der Einführung der Glukokortikoide in die Therapie dieser Erkrankungen [TRUELOVE 55] die wirksamste Möglichkeit zur Überführung eines akuten Schubs in die Remission darstellen [MALCHOV 84, SUMMERS 79]. Die Lymphozyten des darmassoziierten Immunsystems besitzen bereits im gesunden Zustand eine hohe Aktivität zur Produktion von Zytokinen, die eine wichtige Rolle bei der Initiierung und Unterhaltung sowie Eindämmung entzündlicher Prozesse spielen [MULLIN 92]. Dabei ist der balancierte Gleichgewichtszustand dieser Entzündungszellen und ihrer Mediatoren bei den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen mit der Folge einer perpetuierten Immunreaktion gestört. Durch zirkulierende Lymphozyten bleibt die chronische Entzündung nicht auf den Darm beschränkt, sondern es sind sowohl intestinal, als auch peripher, aktivierte Lymphozyten nachweisbar [MAZLAM 92, RAEDLER 92, SCHREIBER 95]. Aufgrund dieser Interaktionen zwischen organbezogenem und systemischem Immunsystem ist es möglich, über Zytokinmessungen in Blutproben sowohl Einblick in den Zustand des peripheren als auch des intestinalen Immunsystems zu erhalten [SANDER 93, SHER 95]. Durch direkte Untersuchung der zytokinproduzierenden Zellen kann man darüber hinaus neben dem Anteil an zytokinbildenden Lymphozyten auch eine Aussage über die Zytokinproduktion der Einzelzelle erhalten [ANDERSSON 92/94a/94b, SANDER 91/93]. Glukokortikoide interferieren mit der Zytokinproduktion der Entzündungszellen, was anhand eines veränderten Zytokinprofils nachzuweisen ist [BRINKMANN 95]. In dieser Arbeit soll die Beeinflussung der Zyokinsynthese durch eine systemische Steroidmedikation bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen auf der Ebene peripherer Lymphozyten untersucht werden. 2 Mit Hilfe von Antikörpern und der Peroxidasetechnik [DOLHAIN 93] werden die Zytokine Interleukin (IL) -2, -5 und -10 intrazellulär markiert und unter Verwendung einer Computerbildanalyse [BJÖRK 94/96, HERR 97] ausgewertet. Durch weitere Erforschung der Zytokinmuster und ihrer Beeinflußbarkeit durch eine immunsuppressive Therapie kann man sich genauere Einblicke in die Pathogenese und Therapie der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen erhoffen. 1.2 Grundlagen chronisch entzündlicher Darmerkrankungen Die chronisch entzündlichen Darmerkrankungen lassen sich in den Morbus Crohn und die Colitis ulcerosa einteilen [ADLER 96, GOEBELL 92]. Es handelt sich hierbei um Entzündungen des Darms, deren Ätiologie im Gegensatz zu den Darmentzündungen mikrobieller, chemischer oder aktinischer Genese bislang nicht geklärt ist. Im Intestinaltrakt laufen permanent Immunreaktionen ab, die physiologisch und als Schutzfunktion gegenüber Noxen wie Mikroorganismen oder Nahrungsmittelantigene zu verstehen sind. Überschießende Reaktionen führen zu Störungen, beispielsweise bei der einheimischen Sprue, einer Heterosensibilisierung gegen Gluten. Demgegenüber ist bei den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen ein auslösendes Agens nicht bekannt. Neben genetischen und umweltbedingten Faktoren spielen pathogenetisch immunologische Mechanismen eine zentrale Rolle, wobei unklar ist, ob es sich bei letzteren um ein primäres oder sekundäres Geschehen infolge der Krankheit handelt [GIBSON 94]. So könnte die chronische Aktivierung des Immunsystems eine Reaktion auf eine unerkannte Infektion, eine erhöhte Permeabilität der Darmmukosa oder eine gesteigerte Präsentation luminaler Antigene durch antigenpräsentierende Zellen gegenüber T-Zellen sein [HAWTHORNE 89]. Infektiös bedingte Enteritiden oder nutritive Störungen könnten einen Defekt in der Schleimhautbarriere des Gastrointestinaltraktes bedingen und zu einer vermehrten Aufnahme verschiedener luminaler Antigene führen. Da die hochsensitive Regulation potentiell autoaggressiver Lymphozyten störanfällig ist, könnte die Absorption kreuzreagierender Antigene zu einem Zusammenbruch der Immuntoleranz gegenüber darmeigenem Gewebe und so zur Etablierung einer Autoimmunerkrankung führen. Dabei sind die Grenzen zwischen Autoimmunerkrankungen und chronischen infektiös-allergischen Krankheiten nicht immer eindeutig zu ziehen [RAEDLER 92]. 3 Pathogene Immunreaktionen perpetuieren die einmal angelaufene Entzündung der Darmwand, was zu einer weiteren Schädigung der Schleimhautbarriere mit konsekutiv vermehrter Aufnahme luminaler Antigenen und somit zum Schluß des Circulus vitiosus führt [SNOOK 90, VORLAENDER 83]. Von einigen Autoren wird beim Morbus Crohn primär eine T-Zellaktivierung auf ein spezifisches intestinales Antigen diskutiert, wohingegen bei der Colitis ulcerosa ein vorbestehender Epitheldefekt im Dickdarm mit unspezifischer Einwirkung einer großen Anzahl an Makromolekülen vermutet wird [GIBSON 94, ZEITZ 90]. Mit fortschreitender Krankheitsdauer sind diese Ereignisse aber nicht mehr voneinander abzugrenzen, da sie sich gegenseitig bedingen, indem eine überschießende T-Zellantwort zu einer Entzündung mit Schädigung des Darmepithels und letztere wiederum zu T-Zellaktivierung durch vermehrt aufgenommene Antigene führen kann [MAC DONALD 88]. Einen interessanten Hinweis dafür, daß in der Pathogenese des Morbus Crohn aktivierten T-Zellen eine wichtige Bedeutung zukommt, haben Berichte über eine Remission infolge Aufhebung der T-Zellaktivität bei Infektion mit dem Human immuno-deficiency virus geliefert [JAMES 88]. Symptome sind bei beiden Erkrankungen u.a. Diarrhöen, zum Teil mit Schleim- und Blutbeimengungen, Abdominalschmerzen, Tenesmen sowie zahlreiche extra- intestinale Manifestationen. Die blutig-schleimigen Diarrhöen und Tenesmen sind bei der Colitis ulcerosa Leitsymptom, während beim Morbus Crohn Diarrhöen ohne Blut und - vor allem bei Erkrankung des terminalen Ileums - rezidivierende Schmerzen im rechten Unterbauch dominieren. Extraintestinale Symptome wie Arthritis, Erythema nodosum, Pyoderma gangraenosum, aphthöse Stomatitis, Iritis, Konjunktivitis, subfebrile Temperaturen usw., die meist mit der Entzündungsaktivität im Darm korrelieren, finden sich bei 10-20 % der Morbus-Crohn-Patienten, während sie bei Colitis-ulcerosa-Patienten seltener auftreten. Bei letzterer tritt allerdings in 5 % der Fälle eine primär sklerosierende Cholangitis auf. Das gleichzeitige Auftreten solcher extraintestinalen Manifestationen unterstreicht dabei die systemische Natur der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen [RAEDLER 92]. Die bei der Colitis ulcerosa vorhandene Vulnerabilität der Darmschleimhaut erklärt die häufige Komplikation einer Blutung. Als weitere Komplikationen sind das toxische Megakolon bei fulminantem Krankheitsverlauf und das Kolonkarzinom nach langer Krankheitsdauer zu nennen. Beim Morbus Crohn komplizieren neben Konglomerattumoren und Stenosen vor allem Fisteln und Abszesse das Krankheitsgeschehen. 4 Der intestinale Befall der Colitis ulcerosa beginnt stets im Rektum und breitet sich kontinuierlich nach proximal aus; allerdings wird nur selten das terminale Ileum im Rahmen einer sogenannten Backwash-Ileitis erreicht. Dagegen betrifft der Morbus Crohn in unterschiedlichem Ausmaß diskontinuierlich sämtliche Abschnitte des Gastrointestinaltraktes, wobei das terminale Ileum und das Kolon von der auch als Ileitis terminalis oder Ileocolitis regionalis bezeichneten Erkrankung bevorzugt befallen werden. Endoskopisch findet man bei der Colitis ulcerosa unscharf begrenzte Ulzerationen und Pseudopolypen der Restschleimhaut sowie eine diffuse Rötung mit Kontaktblutungen. Das endoskopische Bild des Morbus Crohn besteht aus scharf begrenzten landkartenartigen Ulzerationen, längs- und querverlaufenden Fissuren und einem dadurch bedingten Pflastersteinrelief. Eine weitere Unterscheidung ergibt das histologische Bild, das bei der Colitis ulcerosa durch auf Mukosa und Submukosa beschränkte Ulzerationen und Kryptenabszesse geprägt ist, während beim Morbus Crohn eine transmurale epitheloidzellig-granulomatöse Entzündung vorliegt. Der Krankheitsverlauf chronisch entzündlicher Darmerkrankungen ist durch akute entzündliche Schübe geprägt, welche Remissionsphasen ohne ausgeprägte entzündliche Aktivität unterbrechen. Im Gegensatz zu der häufigen chronischrezidivierenden Form ist der seltenere chronisch-kontinuierliche Verlauf durch ständig vorhandene Entzündungszeichen charakterisiert. 1.3 Das Immunsystem 1.3.1 Interaktionen der Zellen des Immunsystems Ein wirksames Immunsystem hängt von den Interaktionen der an der Immunantwort beteiligten Zellen und humoralen Faktoren ab. Das humorale Immunsystem setzt sich vor allem aus den Antikörpern und dem Komplementsystem zusammen. Wichtige zelluläre Bestandteile des Immunsystems sind unter anderem B- und T-Lymhozyten sowie Makrophagen, Granulozyten und Mastzellen [GEMSA 97]. Dabei sind B-Lymphozyten für die humoralen Immunreaktionen entscheidend, indem sie nach Antigenkontakt zu antikörpersezernierenden Plasmazellen heranreifen. Die T-Lymphozyten sind dagegen die Träger der zellulären Immunität und üben unterschiedliche Effektor- und Regulatorfunktionen aus, wie zum einen die direkte 5 Zytolyse und zum anderen die Sekretion von Zytokinen, die wiederum andere Zellen beeinflussen. Dabei werden die verschiedenen Funktionen von T-Zell-Sub- populationen erfüllt, die sich anhand von Oberflächeneigenschaften unterscheiden. Diese Oberflächenmarker sind die Cluster-of-Differentiation (CD). Zytotoxische T-Lymphozyten als zytolytische Effektorzellen tragen den Marker CD8, der als Korezeptor an der spezifischen Kopplung an MHC-Moleküle der Klasse I (Genprodukt des Major Histocompatibiliy Complex = MHC) auf kernhaltigen Körperzellen beteiligt ist. Eine Immunantwort wird immer dann ausgelöst, wenn spezifische T-Zell-Rezeptoren und CD8-Korezeptoren auf Wirtszellen körpereigene MHC-Proteine zusammen mit körperfremden Aminosäuresequenzen erkennen. Dies bezeichnet man als MHC-Restriktion der Immunantwort. Neben den zytotoxischen Zellen mit dem Marker CD8 gibt es T-Lymphozyten mit dem Marker CD4. Diese besitzen keine unmittelbare Effektorfunktion, sondern beeinflussen vielmehr die Aktivität anderer Zellen durch die Sekretion von Zytokinen als Mediatoren. Dazu interagieren sie mit ihrem spezifischen Rezeptor und CD4Rezeptor mit Peptiden, die ihnen von MHC-Molekülen der Klasse II vor allem auf Bund T-Lymphozyten sowie Makrophagen präsentiert werden. Die CD4+ T-Zellen werden entsprechend ihrer Funktion auch als T-Helfer-Lymphozyten bezeichnet. Sie ermöglichen die Differenzierung inaktiver T-Lymphozyten in zytotoxische TLymphozyten oder von inaktiven B-Lymphozyten in antikörperproduzierende Plasmazellen. Für die damit sehr vielfältigen Aufgaben sind wiederum zwei Subpopulationen verantwortlich, die sich aufgrund ihres unterschiedlichen Zytokinsekretionsmusters unterscheiden: TH1-Zellen fördern v.a. die Proliferation und Funktion aller T-Lymphozyten und damit die Ausbildung zellvermittelter Immunreaktionen, wohingegen TH2-Zellen u.a. die Differenzierung von B-Lymphozyten bis zur Plasmazelle und damit die humorale Immunität steuern. Hierdurch wird deutlich, daß eine klare Trennung zwischen zellulärer und humoraler Immunität nicht möglich ist, wobei gerade die T-Helfer-Zellen mit den von ihnen produzierten Zytokinen eine wichtige Brücke bilden. 1.3.2 Zytokine, unter besonderer Berücksichtigung von IL-2, IL-5 und IL-10 Zytokine sind lösliche Proteine bzw. Glykoproteine, die von Lymphozyten, Granulozyten und Makrophagen, aber auch von Zellen außerhalb des Immunsystems, wie z.B. Endothelzellen und Fibroblasten, produziert werden. Sie wirken als Regulatoren sowie Wachstumsfaktoren des Immunsystems und entfalten diese 6 Wirkung bereits in Konzentrationen von 10-14 bis 10-9 mol/l über Rezeptoren der Zielzellen [BRYNSKOV 93]. Dabei hängen die vielfältigen biologischen Funktionen eines Zytokins unter anderem von den Zellen ab, auf die das Zytokin einwirkt. Außerdem reagiert ein Zytokin selten als individuelles Molekül, sondern die Wirkung ist ein Resultat eines Netzwerkes und einer Hierarchie von verschiedenen Zytokinen und deren synergistischen und antagonistischen Wirkungen. Zytokine besitzen keine Enzymaktivität, sondern ähneln eher Peptidhormonen, indem sie als Botenstoffe interzellulärer Kommunikation dienen. Dabei wirken sie sowohl autokrin, d.h. auf die Produzentenzellen, als auch parakrin, also auf Zellen in ihrer Umgebung. Dagegen entfalten sie keine oder nur geringe endokrine Wirkungen über den Blutkreislauf, denn aufgrund ihrer großen Funktionsvielfalt und Wirkungsstärke würden hohe Konzentrationen im Blutkreislauf zu nicht kontrollierbaren Immunreaktionen führen [KELSO 89]. Auch eine Überproduktion von Zytokinen, z.B. im Rahmen einer Infektion oder Verletzung, kann zu Schäden führen [CERAMI 92]. Zum Teil werden Zytokine, die von Lymphozyten produziert werden, als Lymphokine bezeichnet, allerdings werden einige Lymphokine auch von nichtlymphatischen Zellen sezerniert. Viele von T-Lymphozyten gebildeten Lymphokine wiederum werden Interleukine genannt, wobei in der Regel ein Faktor erst dann als Interleukin klassifiziert wird, wenn er biochemisch genauer untersucht und seine Primärstruktur bekannt ist. Die erste Beobachtung, daß Lymphozyten andere Zellen beeinflussen können, wurde Anfang der 30er Jahre von RICH und LEWIS gemacht, die zeigten, daß sensibilisierte Lymphozyten Zellwanderungen von Makrophagen durch Gewebsexplantate hemmen können. Mitte der 60er Jahre vermutete man, daß die Reifung von B-Zellen zu antikörpersezernierenden Plasmazellen weder allein durch die Interaktion von Antigenen mit Rezeptoren der B-Zellen, noch durch zusätzliche Zell-Zell-Interaktionen erklärt werden kann [IBELGAUFTS 92]. Als Anfang der 70er Jahre entdeckt wurde, daß der Kulturüberstand adhärenter Leukozyten die Proliferation von T- und B-Zellen steigern kann, wurde dieser immunstimulierende Faktor isoliert, biochemisch aufgeklärt und Interleukin-1 genannt. Inzwischen kennt man über 30 verschiedene Zytokine, von denen ein Teil in Tab. 1 aufgelistet ist. Bei den zytokinproduzierenden T-Zellen handelt es sich v.a. um die oben erwähnten T-Helfer-Lymphozyten mit ihren Subpopulationen, welche wiederum auch zwei Subtypen von Zytokinprofilen bilden können. Allerdings sehen DAYNES et al. hierin 7 weniger starre Untergruppen von T-Helferzellen, als vielmehr Zellen, die flexibel ihre Zytokinprofile entsprechend der Immunlage ändern können [DAYNES 89]. Die TH1-Zellen bilden nach Aktivierung Interferon (IFN)-γ, Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-β und IL-2. Dabei ist IFN-γ das wichtigste makrophagenaktivierende Zytokin, durch das diese Zellen befähigt werden, auf antigene Stimuli als antigenpräsentierende Zellen zu reagieren. TNF-β, das auch als Lymphotoxin bezeichnet wird, kann auf einige Zellen direkt zytotoxisch wirken und somit eine Zytostase oder Zytolyse verursachen. IL-2, auf das weiter unten noch näher eingegangen wird, ist der wichtigste Wachstums- und Proliferationsfaktor für B- und T-Lymphozyten. Durch diese von den sezernierten Zytokinen hervorgerufenen Reaktionen sind die TH1Zellen also vor allem inflammatorisch wirksam. Dagegen produzieren die TH2-Zellen IL-4, IL-5 und IL-10, welche einerseits die Antikörperproduktion durch B-Zellen stimulieren und andererseits viele Reaktionen der inflammatorisch wirksamen TH1Zellen antagonisieren. Die Differenzierung in TH1- bzw. TH2-Lymphozyten selbst wird auch wieder durch Zytokine reguliert, wodurch sich die TH1- und TH2-Populationen wechselseitig beeinflussen können. So kann das von TH1-Zellen gebildete IFN-γ die Entwicklung von weiteren TH1-Lymphozyten fördern und von TH2-Zellen hemmen. Letztere werden durch von TH2-Zellen selbst gebildetes IL-4 und IL-10 positiv gesteuert, wohingegen diese Zytokine auf die TH1-Zellen hemmend wirken. Das von TH1-Zellen gebildete IL-2 fördert dagegen sowohl die Differenzierung und Proliferation von TH1-Zellen als auch von TH2-Zellen. Dieses proinflammatorische Interleukin unterliegt aber ebenso wie das antiinflammaroische IL-10 der inhibierenden Kontrolle des IL-4 (Abb. 1). naive TH-Zelle TH1Zelle IFN-γ IL-4 TNF-β IL-2 Abb. 1: TH2Zelle IL-5 IL-10 Wechselwirkungen der T-Helferzellsubpopulationen TH1 und TH2 8 Darüber hinaus wird die TH1-Antwort durch das von Makrophagen sezernierte IL-12 induziert. Auch IL-1, das wichtigste von Makrophagen sezernierte Zytokin, ist ein vielfältiger Induktor von Entzündungsmediatoren. Die Genexpression der Zytokine ist eine komplexe Kaskade von Tanskription und posttranskriptionellen Prozessen, welche durch Veränderung von Transkriptionsfaktoren und Stabilisations- bzw. Degradationsfaktoren der mRNA beeinflußbar sind. Bei diesen die Zytokinexpression beeinflussenden Faktoren handelt es sich um spezifische DNA- bzw. RNA-bindende Proteine, die von Zytokinen, Eikosanoiden oder auch Steroiden stimuliert oder inhibiert werden können [SCHREIBER 95]. Verschiebungen in dem Gleichgewicht zwischen TH1- und TH2-Zellen und somit der jeweiligen Zytokine sind an der Entwicklung und auch Persistenz verschiedener entzündlicher Erkrankungen wesentlich beteiligt [GEMSA 97, IBELGAUFTS 92]. In den folgenden Abschnitten wird auf die Interleukine IL-2, IL-5 und IL-10 näher eingegangen. Dabei ist zu beachten, daß eine isolierte Darstellung von Zytokinen künstlich ist und dem komplexen Zytokinnetzwerk nicht immer gerecht wird. IL-1 und seine Funktionen werden im folgenden ebenfalls berücksichtigt werden, denn zum einen steht dieses Zytokin häufig am Anfang der T-Zell-abhängigen Immunantwort [HODGSON 95], und zum anderen interferieren die Glukokortikoide, deren Wirkung hier untersucht wird, mit der IL-1-Produktion. Interleukin-2: Mitte der 70er Jahre wurde entdeckt, daß T-Lymphozyten unbegrenzt lange in Kultur gehalten werden können, wenn man ihr Wachstumsmedium mit dem Medium supplementiert, in welchem zuvor stimulierte T-Zellen gewachsen waren. Der wachstumsfördernde Effekt dieses Mediums wurde auf einen von den aktivierten TZellen sezernierten Wachstumsfaktor („T-cell-growth-factor“) zurückgeführt. Dieser konnte isoliert und charakterisiert werden und wurde Interleukin-2 genannt. Das IL-2-Gen liegt auf Chromosom 4 und kodiert für ein Protein, das nach Abspaltung einer Signalsequenz aus 133 Aminosäuren besteht und in unterschiedlichem Ausmaß glykosyliert wird. Die Synthese von IL-2 wird auf der Ebene der Transkription und posttranskriptioneller Prozesse reguliert. So gibt es zum einen in T-Zellen einen Repressor, der die posttranskriptionelle Prozessierung der IL-2-mRNA-Vorläufer beeinflußt und dazu führt, daß bis zu 98 % der IL-2-mRNA nicht prozessiert werden [IBELGAUFTS 92]. 9 Und zum anderen enthält die Promotorregion des IL-2-Gens mehrere Bindungsstellen für spezifische Transkriptionsfaktoren, welche die Aktivierung oder Repression der Genaktivität regulieren. IL-2 wird hauptsächlich von der TH1-Subpopulation der CD4+ T-Helferzellen produziert und ist ein essentieller Wachstums- und Aktivierungsfaktor für T-Lymphozyten. Dabei nimmt es eine Schlüsselstellung bei der Aktivierung zytotoxischer CD8+ TLymphozyten ein. Die Bildung dieser CD8+ T-Zellen läuft in folgenden Schritten ab (Abb. 2): Zuerst werden TH1-Zellen durch antigenpräsentierende Zellen aktiviert, indem diese Antigene zusammen mit MHC-Klasse-II-Molekülen anbieten und außerdem IL-1 sezernieren. Die dadurch aktivierten TH1-Zellen differenzieren sich und sezernieren IL-2. Dieses Zytokin bindet zum einen autokrin, was zu einer klonalen Proliferation der TH1-Zellen führt, und zum anderen parakrin an zytotoxische CD8+ T-Zellen. Letztere wurden ihrerseits bereits durch Antigenpräsentation, hier zusammen mit MHC-KlasseI-Molekülen, in Gegenwart von IL-1 voraktiviert. Diese Voraktivierung führt zur Expression von IL-2-Rezeptoren. Nach Bindung von IL-2 an den zellulären IL-2Rezeptor wird der gesamte Komplex internalisiert, woraufhin intrazelluläre Signalwege initiiert werden, die zur Zellteilung und Generierung der Zellzytotoxizität führen. IL-1 TH1 TH1 APC Differenzierung TH1 IL-2 TH1 IL-2 IL-1 klonale Proliferation CTL APC CTL Voraktivierung INF- γ TNF- β Zytotoxizität CTL CTL AG IL-2-R Abb. 2: MHC II MHC I CD4-TCR CD8-TCR Schema zur Aktivierung zytotoxischer T-Lymphozyten; APC: Antigenpräsentierende Zellen, TH1: TH1-Lymphozyten, CTL: zytotoxische T-Lymphozyten, AG: Antigen, MHC I bzw. II: Major Histocompatibility Complex I bzw. II, CD4- bzw. CD8-TCR: CD4- bzw. CD8-T-Zellrezeptor, IL-2-R: Interleukin-2-Rezeptor 10 Interleukin-5: Bei IL-5 handelt es sich um ein Polypeptid bestehend aus 115 Aminosäuren, dessen Erbinformation auf Chromosom 5 kodiert ist. Dieses Interleukin wird vor allem von der TH2-Subpopulation der CD4+ T-Helferzellen, aber auch von eosinophilen Granulozyten und Mastzellen [MORI 95] gebildet. Die Synonyme für IL-5 wie z.B. „B-cell-differentiation/growth-factor“, „IgA-enhancingfactor“ und „eosinophil-differentiation-factor“ deuten schon auf folgende Funktionen hin: IL-5 induziert Proliferation, Differenzierung und Immunglobulinsekretion von BZellen, wobei es möglicherweise eine besondere Rolle bei der Mukosaimmunität spielt, denn es steigert die IgA-Produktion der B-Zellen in den Peyerschen Plaques. Außerdem verstärkt es die IL-4-induzierte IgE-Produktion von B-Lymphozyten, was seine Bedeutung bei Allergien unterstreicht. Dazu trägt auch die Tatsache bei, daß es sich um einen hämopoetischen Wachstumsfaktor handelt, der Differenzierung und Proliferation eosinophiler Granulozyten aus Knochenmarkvorläuferzellen stimuliert. Zusammen mit IL-2 wirkt IL-5 synergistisch bei der Ausdifferenzierung unspezifischer T-Lymphozyten zu zytotoxischen T-Zellen, unter anderem, indem es die Expression von IL-2-Rezeptoren fördert [IBELGAUFTS 92]. Interleukin-10: IL-10 ist ein Protein mit einer Länge von 160 Aminosäuren, dessen Erbinformation auf Chromosom 1 kodiert ist. Es wurde 1990 entdeckt und als wichtiger Regulator lymphatischer und myeloischer Zellen erkannt [GEMSA 97, IBELGAUFTS 92]. Hauptsächlich wird IL-10 von TH2-Zellen und Monozyten, aber auch B-Zellen, produziert. FUSHIMI et al. beschreiben eine zehnfach stärkere IL-10-Produktion in Monozyten als in Lymphozyten nach Stimulation, so daß sie als Hauptquelle des IL-10 nicht die TH2-Zellen, sondern die Monozyten in Betracht ziehen [FUSHIMI 97]. Wichtige Funktionen von IL-10 kommen in dem Synonym „Cytokine-synthesisinhibitory-factor“ zum Ausdruck, denn IL-10 inhibiert in TH1-Zellen und in Makrophagen die Produktion inflammatorischer Zytokine. Weiterhin wird auf Monozyten die Expression der MHC II-Moleküle reduziert und somit auch die Antigenpräsentation eingeschränkt [NIELSEN 96]. Das hat eine Hemmung der makrophagenabhängigen T-Zellproliferation und T-Zellzytotoxizität zur Folge. Dazu 11 trägt auch bei, daß IL-10 die Produktion des IL-1-Rezeptorantagonisten hochreguliert [SCHREIBER 95]. IL-10 hat weiterhin autoregulative Aktivitäten, indem es seine eigene Produktion reduziert. Nach ELENKOV et al. trägt das Verhältnis des TH1-induzierenden IL-12 und des TH1inhibierenden IL-10 entscheidend zum TH1-TH2-Gleichgewicht und somit zu einer ausgewogenen Immunitätslage bei [ELENKOV 96]. Neben seiner hemmenden Funktion wirkt IL-10 als Koaktivator für die Proliferation von B-Lymphozyten mit resultierender polyklonaler IgG- und IgE-Synthese. Zu dieser BZellstimulation trägt IL-10 bei, indem es auf B-Lymphozyten im Gegensatz zu den Monozyten die Expression von MHC II-Molekülen verstärkt [KUCHARZIK 95] und so die Interaktion zwischen B-Zellen und T-Helferzellen fördert. Verschiedene Autoren betonen die Bedeutung des IL-10 für Krankheiten allergischer Genese [FUSHIMI 97]. So fördert IL-10 zusammen mit IL-4 die Proliferation und somit auch die Histamingenese von Mastzellen [IBELGAUFTS 92]. Die Freisetzung der gewebezerstörenden Sauerstoffradikale wird wiederum durch IL-10 gehemmt [NIELSEN 96]. Weiterhin scheint IL-10 auf intestinale T-Lymphozyten einen antiproliferativen Effekt zu haben [PALLONE 96]. Die besondere Rolle von IL-10 als Suppressor von Makrophagen und T-Zellen wird vor allem in dem von KÜHN et al. durchgeführten Versuch deutlich, in welchem gezeigt wurde, daß Knockout-Mäuse mit genetisch bedingtem Mangel an IL-10 eine chronische Enterokolitis entwickeln. Die fehlerhafte Immunkontrolle mit einer übermäßigen Antigenpräsentation einer Vielzahl intestinaler Antigene durch MHC II-Moleküle führte bei diesen Mäusen zu einer Überproduktion von Zytokinen wie IL-1, TNF-α und IFN-γ [KÜHN 93]. Dies weist auf die wichtige immunregulatorische Funktion von IL-10 im Intestinaltrakt hin, die bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen gestört ist. 12 Tab. 1: Zytokin Übersicht wichtiger Zytokine; ausgewählt nach GEMSA 97 und IBELGAUFTS 92. Hauptproduzenten Hauptwirkung IL-1 Makrophagen Aktivierung von T- und B-Zellen IL-2 TH1-Zellen Wachstumsfaktor für T- und B-Zellen IL-3 T-Zellen hämopoetischer Wachstumsfaktor IL-4 TH2-Zellen B-Zellaktivierung, Makrophageninhibierung IL-5 TH2-Zellen B-Zellaktivierung, Eosinophilenaktivierung IL-6 Makrophagen, TH2-Zellen Kostimulator für T- und B-Zellen IL-7 Knochenmarkstromazellen Proliferation von B-Zellen IL-8 Makrophagen Chemotaxis und Aktivierung von Neutrophilen IL-9 T-Helferzellen Proliferation von T-Helfer- und Mastzellen IL-10 TH2-Zellen, Makrophagen B-Zellaktivierung, TH1-Zellinhibierung IL-11 Knochenmarkstromazellen Proliferation von B-Zellen IL-12 Makrophagen TH1-Zellaktivierung IL-13 T-Zellen B-Zellaktivierung, Makrophageninhibierung IL-14 T-Zellen B-Zellproliferation, Blockade der Ig-Produktion IL-15 Makrophagen Stimulation der Zytotoxizität IL-16 zytotoxische T-Zellen Chemotaxis von T-Helferzellen IL-17 T-Helferzellen T-Zellstimulation IFN-γ TH1-Zellen Makrophagenaktivierung TNF-α Makrophagen, T-Zellen Stimulation der Zytotoxizität TNF-β TH1-Zellen Stimulation der Zytotoxizität 1.3.3 Das Immunsystem des Gastrointestinaltraktes Der Gastrointestinaltrakt stellt mit seiner bis zu 400 m2 großen Oberfläche die größte Grenzfläche zwischen Organismus und Umwelt dar und ist dadurch einer Vielzahl potentiell pathogener Noxen ausgesetzt. Um aber seiner Funktion als Resorptionsund Sekretionsorgan nachkommen zu können, ist er im Gegensatz zur Haut mit einschichtigem Epithel ausgekleidet. Auf diese Weise sind nicht so sehr mechanische, sondern funktionelle Prinzipien an der als Mukosablock bezeichneten Schrankenfunktion des Gastrointestinaltraktes beteiligt [SCHÖLMERICH 95]. Der Mukosablock wird durch das darmassoziierte lymphatische Gewebe (gut associatied lymphoid tissue = GALT) aufgebaut. Das GALT muß zum einen überschießende Immunantworten auf exogene Faktoren verhindern, und zum anderen 13 müssen gleichzeitig bestimmte Krankheitserreger hochselektiv erkannt und attackiert werden. Um dieser schwierigen Aufgabe nachkommen zu können, ist eine gute Koordination der einzelnen Immunzellen notwendig, die unter anderem durch die Zytokine geregelt wird. So zeigt sich auch bei fehlender Entzündung eine stärkere IL-2-Bildung im Darmgewebe als im peripheren Blut, was auf den gesteigerten Aktivitätszustand des intestinalen Immunsystems hinweist [MULLIN 92]. Mit der höheren IL-2-Produktion kongruent, exprimieren sowohl die B- als auch die T-Lymphozyten im Darm stärker als im peripheren Blut den IL-2-Rezeptor. Bei den intraepithelialen Lymphozyten des GALT handelt es sich vor allem um zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten, wohingegen in der Lamina propria die CD4+ THelfer-Lymphozyten dominieren [SELBY 84]. In der Lamina propria finden sich außerdem Plasmazellen, die hauptsächlich das Immunglobulin IgA produzieren [MAC DERMOTT 81]. Neben diesen diffusen Ansammlungen von Lymphozyten lassen sich Anhäufungen von organisiertem Lymphgewebe in Form der Peyerschen Plaques und der solitären Lymphfollikel in der Darmwand abgrenzen, in denen rezirkulierende Lymphozyten aus dem Blut akkumulieren. Dieses in Kompartimenten organisierte lymphatische Gewebe stellt vor allem den afferenten Schenkel der Immunantwort des GALT dar, in dem die Immunantwort initiiert wird. Dagegen entsprechen die diffus in der Mukosa verteilten Immunzellen dem efferenten Schenkel des GALT, der die Immunantwort an der Mukosaoberfläche ausführt. Ein oral aufgenommenes Antigen wird über spezialisierte Zellen zu den Lymphfollikeln der Darmwand transferiert, woraufhin undifferenzierte B- und T-Lymphozyten über die mesenterialen Lymphknoten und den Ductus thoracicus in die Blutbahn gelangen, zu Immunoblasten heranreifen, um dann zurück in der Darmschleimhaut sich zu immunkompetenten Zellen zu spezialisieren. Dabei wandern die aktivierten Lymphozyten bevorzugt in die Region zurück, wo sie aktiviert wurden. Diese Rezirkulation wird als „lymphocyt homing“ bezeichnet (Abb. 3). 14 Abb. 3: Schematische Darstellung des lymphocyt homing; entnommen aus VORLAENDER 83 Im Gegensatz zum systemischen T-Lymphozytensystem entwickelt sich ein Großteil der T-Zellen des GALT thymusunabhängig und unterliegt somit keiner Negativselektion. Daher umfaßt diese T-Zellpopulation auch potentiell autoaggressive Lymphozyten, die zur Verhinderung autoreaktiver Prozesse einer regionalen Suppression unterliegen müssen [ADLER 96]. Die T-Zellen in der Lamina propria zeigen phänotypische Charakteristika von Gedächtniszellen, so daß nach Einwirken eines spezifischen Antigens das Immunsystem sofort reagieren kann. Dabei proliferieren die T-Zellen nach Stimulation durch Antigene weniger, als daß sie mit Helferfunktionen antworten, und somit die lokale Immunantwort durch Sekretion unterschiedlicher Zytokine regulieren [ZEITZ 90]. Durch die Rezirkulation von Lymphozyten führen die von ihnen sezernierten inflammatorischen Zytokine, je nach Entzündungsstärke, neben intestinalen auch zu systemischen Reaktionen [ANDUS 91, NIEDERAU 97, SARTOR 94]. 1.3.4 Das Immunsystem bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen Der chronische Entzündungszustand bei Morbus Crohn und Colitis ulcerosa führt zu vielfältigen Veränderungen des Immunsystems, bzw. möglicherweise polygenetisch bedingte Besonderheiten des Immunsystems bedingen wiederum das chronische Entzündungsgeschehen. Auf letzteres weisen Untersuchungen an transgenen 15 Mäusen mit genetisch bedingtem Mangel an IL-2, IL-10 oder des T-Zellrezeptors hin [KOMANO 95, KÜHN 93]. Bei diesen Knockout-Mäusen kam es zu Darmschleimhautalterationen mit Kryptenabszessen und Ulzerationen, ohne daß zuvor ein Epithelschaden vorgelegen hat. MAC DONALD et al. beobachteten, daß aktivierte T-Zellen eine Kryptenhyperplasie und villöse Atrophie verursachen. Die aktivierten T-Zellen sezernieren vermehrt die TH-1-Zytokine IL-2 und INF-γ [MAC DONALD 88], wobei erhöhte Konzentrationen von IFN-γ zu einer gesteigerten Darmpermeabilität und Rekrutierung antigen- präsentierender Monozyten in der Darmmukosa beitragen [PALLONE 96]. Die TH1Dominanz in den entzündlichen Schleimhautläsionen ließ sich mit Antikörpern gegen IFN-γ bzw. gegen das TH1-induzierende IL-12, aber auch durch Applikation des TH2Zytokins IL-10, reduzieren [FUSS 96]. Die Relation der CD4+- zur CD8+-Subpopulation weicht bei den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im peripheren Blut und in der intestinalen Lamina propria nicht signifikant gegenüber den Kontrollen ab. Allerdings finden sich, bedingt durch die Rekrutierung der T-Lymphozyten im darmassoziierten Immunsystem, besonders bei aktiver Krankheit leicht erniedrigte T-Zellkonzentrationen im peripheren Blut [SELBY 84]. Weiterhin werden in der intestinalen Mukosa die Oberflächenmarker CD45RO, die für CD4+ T-Gedächtniszellen charakteristisch sind, sowie die MHC II-Moleküle, die durch Antigenpräsentation T-Helferzellen aktivieren, verstärkt exprimiert. ZEITZ et al. gehen bei den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen von einem Ungleichgewicht zwischen Aktivator- und Suppressorfunktionen infolge eines T-Zelldefektes aus. Daraus resultiere nach Antigenstimulation eine überschießende Proliferation immunkompetenter Zellen. Ein solcher T-Zelldefekt könnte sich in einem veränderten Zytokinmuster zeigen [ZEITZ 90]. Sowohl beim Morbus Crohn als auch bei der Colitis ulcerosa zeigen sich die Serumspiegel von IL-1 [HODGSON 95, SHER 95] und vor allem beim Morbus Crohn, aber weniger bei der Colitis ulcerosa, die Konzentrationen von IL-6 [ANDUS 91, GROSS 92, SHER 95] erhöht. Bei diesen Interleukinen handelt es sich um Induktoren von Akute-Phase-Proteinen in der Leber und verschiedener Zytokine in Entzündungszellen. Ebenso findet sich IL-8, ein chemotaktischer Faktor für neutrophile Granulozyten, bei beiden Krankheitsbildern vermehrt [ISAACS 92, SHER 95]. 16 Einen interessanten Unterschied zwischen chronisch entzündlichen Darmer- krankungen und einer infektiösen Kolitis lieferte eine Untersuchung, nach der bei beiden Erkrankungen die IL-1-Level in der entzündeten Mukosa erhöht waren, aber nur bei der infektiösen Kolitis auch in gleichem Maße die IL-1-Rezeptorantagonisten anstiegen. Dagegen herrschte bei den chronischen Darmerkrankungen ein relativer Mangel an diesem Antagonisten [ISAACS 92, HODGSON 95, SCHREIBER 95]. Bei der Colitis ulcerosa lassen sich für IL-2 und auch IFN-γ normale bis erniedrigte Konzentrationen nachweisen, während diese TH1-Zytokine beim Morbus Crohn - wie auch bei anderen chronischen granulomatösen Entzündungen - erhöht sind [BREESE 93, MULLIN 92, SHER 95]. In Übereinstimmung hiermit zeigt sich bei Morbus Crohn eine erhöhte Freisetzung löslicher IL-2-Rezeptoren [BREESE 93, MUELLER 90, ZEITZ 90]. Demgegenüber sind die TH2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-10 bei der Colitis ulcerosa besonders stimuliert, normal oder sogar erniedrigt beim Morbus Crohn [FUSS 96]. Aus diesen Ergebnissen hat man die Hypothese abgeleitet, daß es sich bei der Colitis ulcerosa um eine TH2-gewichtete und beim Morbus Crohn um eine TH1-gewichtete Erkrankung handelt. Hierfür argumentiert auch die Entdeckung, daß IL-12 als Induktor einer TH1-Zytokinantwort beim Morbus Crohn im Unterschied zur Colitis ulcerosa erhöht ist [MONTELEONE 97, PARRONCHI 97]. Verschiedene Autoren wiesen bei beiden Erkrankungen erhöhte Werte des antiinflammatorisch wirksamen IL-10 sowohl in Darmresektaten [AUTSCHBACH 96], als auch im Serum [KUCHARZIK 95, NIEDERAU 97] nach. Andere Autoren betonen mehr einen Defekt dieser antiinflammatorischen Zytokine, der sich bei der Colitis ulcerosa in intestinal verminderten IL-10-Werten und beim Morbus Crohn in reduzierten IL-4-Werten ausdrücke [NIELSEN 96, PARRONCHI 97]. Dagegen liegen auch Untersuchungen vor, die keine Unterschiede bezüglich des IL-10 im chronisch entzündeten Darmgewebe und normalem Darmgewebe aufzeigen [SCHREIBER 95]. BRYNSKOV et al. geben sowohl für den Morbus Crohn als auch für die Colitis ulcerosa im entzündeten Darmgewebe erhöhte IL-2-Werte an [BRYNSKOV 92]. Auch im Hinblick auf weitere Zytokine fanden verschiedene Autoren keine signifikanten Unterschiede zwischen Morbus Crohn und Colitis ulcerosa [ISAACS 92, NIEDERAU 97]. Daß sich die Immunreaktionen bei den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen nicht nur im entzündeten Darmgewebe abspielen, wird dadurch unterstrichen, daß sich die Interleukine IL-1, IL-2, IL-6 und IL-8 bei dem segmentalen Morbus Crohn in 17 entzündeten und nicht entzündeten Darmsegementen gleichermaßen erhöht finden [SHER 95]. Neben der veränderten T-Zellantwort ist bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen auch die intestinale B-Zellantwort verändert. Allerdings beruht die Aktivierung und Steuerung von B-Lymphozyten wiederum auf Interaktionen mit TZellen und der Freisetzung bestimmter Zytokine. Das humorale Immunsystem des Darmtraktes wird zum großen Teil vom sekretorischen IgA gebildet, das einen wichtigen Beitrag zur Oberflächenabwehr liefert, indem es nicht komplementfixiert ist und so Antigene abfangen kann, ohne eine Entzündung zu induzieren. Bei Colitis ulcerosa und beim Morbus Crohn findet man intestinal eine ehöhte Anzahl an Plasmazellen, und auch wenn weiterhin die IgAsezernierenden Plasmazellen dominieren, so verschiebt sich das Verhältnis der Sekretionsraten doch zugunsten einer vermehrten IgG- und IgM-Produktion [HAWTHORNE 89]. Das bedeutet ein vermehrtes Anfallen von Antikörpern, die über Fixierung von Komplement zytotoxisch und damit gewebsschädigend wirken. Weiterhin zeigen die Plasmazellen eine erhöhte Spontansekretion von monomeren IgA-Molekülen im Unterschied zum regulär sezernierten dimeren IgA [ZEITZ 90]. Die teilsweise gemessenen erniedrigten IgA-Syntheseraten in der chronisch entzündeten intestinalen Mukosa bei gesteigerter IgA-Sekretion von peripheren Plasmazellen wurde auf eine defekte Rezirkulation der Plasmazellen zurückgeführt [MAC DERMOTT 81]. Bezüglich der Eikosanoide zeigten LAURITSEN et al., daß die rektalen Konzentrationen von Prostaglandin E2 und Leukotrien B4 mit dem Aktivitätsindex der Colitis ulcerosa positiv korrelieren und daß sich die Konzentrationen unter Prednisoloneinläufen sowie unter systemischer Medikation signifikant verringern [LAURITSEN 86]. Auf diese Glukokortikoidinteraktionen wird im nächsten Abschnitt näher eingegangen. Die erhöhte Konzentration des schleimhautprotektiven Prostaglandin E2 wird von diesen Autoren - ähnlich wie für IL-10 [KUCHARZIK 95] als sekundäres Phänomen auf die gesteigerte Entzündungsaktivität gedeutet, zumal selektive Inhibitoren der Cyclooxygenase keine positiven klinischen Effekte bewirken. Demgegenüber lieferten kontrollierte Studien mit selektiven Lipoxygenase vielversprechende Ergebnisse [LAURSEN 94]. Inhibioren der 18 1.4 Glukokortikoide 1.4.1 Geschichtliche Entwicklung der Glukokortikoide Das physiologisch wichtigste Glukokortikoid ist Cortisol (= Hydrocortison). Es wurde 1937 unabhängig voneinander von KENDALL und WINTERSTEINER entdeckt. Zur gleichen Zeit machte HENCH die Beobachtung, daß Patienten mit chronischer Polyarthritis während einer Schwangerschaft oder bei Gelbsuchterkrankung eine vorübergehende Remission ihrer Krankheit bekamen. HENCH vermutete, daß die von KENDALL erforschten Nebennierenrindenhormone die Ursache für die Besserung sein könnten [KAISER 92]. Nachdem 1948 ein Syntheseweg gefunden und so weit verbessert war, daß eine Produktion möglich war, lieferte der Pharmakonzern Merck die erste pharmazeutische Zubereitung von Cortison. Hiermit behandelte man eine Patientin, die an einer immobilisierenden chronischen Polyarthritis litt. Schon nach drei Tagen Behandlung mit einer zweimal täglichen Injektion von 50 mg Cortison konnte die Patientin ohne Schmerzen aufstehen, was als das „Cortison-Wunder“ bezeichnet wurde [KAISER 92, KLINKENBERG 87]. In einer ersten Publikation aus dem Jahr 1949 wurden bereits die entscheidenden Merkmale dieser neuen Therapie beschrieben: - Klinischer Effekt nach wenigen Tagen, - Dosisabhängigkeit der Wirkung, - Blutsenkung fällt parallel zur klinischen Besserung, - Rückfall nach Absetzen der Behandlung, - unerwünschte Wirkungen bei langfristiger Anwendung. 1.4.2 Allgemeine Charakterisierung der Kortikosteroide Unter Kortikosteroiden versteht man alle Steroide der Nebennierenrinde, die aus der Ausgangssubstanz Cholesterol in den verschiedenen Rindenzonen produziert werden. In der Zona fasciculata werden die Glukokortikoide gebildet, die insbesondere den Kohlenhydrat-, Eiweiß- und Fettstoffwechsel beeinflussen. In der Zona glomerulosa werden die in den Mineralstoffwechsel eingreifenden Mineralkortikoide produziert, während in der Zona reticularis in geringen Mengen Androgene gebildet werden. Glukokortikoide verstärken vorwiegend in der Leber die Bildung von Enzymen, die für die physiologischen Wirkungen der Glukokortikoide verantwortlich sind. Dabei handelt 19 es sich um Enzyme der Glukoneogenese, die folglich zu einer Erhöhung des Blutzuckers führen, woher auch der Name der Glukokortikoide stammt. Dieser Effekt ist wesentlich für die Eigenschaft der Glukokortikoide als Streßhormone, aber auch für die pharmakologische Nebenwirkung eines Steroiddiabetes. Durch ihre Beeinflussung des Kohlenhydrat-, Eiweiß- und Fettstoffwechsels sowie des Elektrolyt- und Wasserhaushaltes ermöglichen die Nebennierenrindenhormone die Aufrechterhaltung der Homöostase. Die physiologische Bedeutung dieser Hormone besteht darin, den Organismus auf äußere und innere Beanspruchungen, also auf Streß, reagieren zu lassen. Dabei schützen vor allem die Glukokortikoide den Organismus jedoch auch vor überschießenden streßinduzierten Verteidigungsmechanismen [GRAUPE 84]. Durch Akzentuierung dieser physiologischen Wirkungen haben die Glukokortikoide in pharmazeutischen Dosierungen antiphlogistische und immunsuppressive Effekte, auf die in den nächsten Abschnitten näher eingegangen werden soll. 1.4.3 Molekularer Angriffspunkt der Glukokortikoide (Abb. 4) Der Rezeptor für Glukokortikoide liegt im Zytosol und ist ubiquitär vorhanden, wobei die Resultate der Interaktion gewebe- bzw. zellspezifisch sind. Nachdem die Steroide passiv die Zellmembran passiert haben, gehen sie eine Verbindung mit dem zytosolischen Rezeptor ein und bewirken durch Abspaltung eines Hitzeschockproteins eine Änderung der Rezeptorkonformation. Dadurch kann der Kortikoid-Rezeptor-Komplex in den Zellkern transloziert werden, wo er an die positiv oder negativ glukokortikoidresponsiven Elemente der DNA bindet [BUTTGEREIT 96] und eine allosterische Änderung der RNA-Polymerase mit der Folge einer gesteigerten oder verminderten Aktivität bewirkt [SAJDEL 71]. Alternativ kann der Komplex mit Transkriptionsfaktoren reagieren und dadurch deren Bindung an die DNA und somit die Transkription alterieren [ADCOCK 95, NEURATH 96]. BARNES et al. gehen davon aus, daß vor allem die Interaktionen mit den Transkriptionsfaktoren für die vielfältigen antiinflammatorischen Wirkungen der Glukokortikoide verantwortlich sind, da nur so die Expression multipler inflammatorischer Gene gehemmt werden könne [BARNES 98]. Neben der Transkription können Glukokortikoide auch posttranskriptionelle und posttranslationelle Prozesse modulieren [ELENKOV 96, FUSHIMI 97]. Außerdem kann sich der Glukokortikoid-Rezeptor-Komplex mit zytoplasmatischen Proteinen verbinden und deren Funktion beeinflussen. 20 Glukokortikoid Zellmembran Protein GC-R mit HSP HSP Zellkern TF DNA TF + GRE + mRNA - GRE - - inflammatorische Zytokine Expression von Rezeptoren Lipokortin protektive Zytokine Abb. 4: Wirkmechanismen der Glukokortikoide; GC-R: Glukokortikoidrezeptor, HSP: Hitzeschockprotein, TF: Transkriptionsfaktor, +GRE: glukokortikoidresponsive Elemente, -GRE: negativ glukokortikoidresponsive Elemente Die Genom-Interaktionen führen im Zeitraum einiger Stunden zu einem Effekt [ZABEL 90]. In hohen Konzentrationen rufen Glukokortikoide auch von Transkription und Translation unabhängige Sofortwirkungen im Sekundenbereich hervor. Als ein möglicher Wirkmechanismus hierfür wird der Einbau von Glukokortikoiden in die Zellmembranen mit der Folge einer Membranstabilisierung diskutiert [BUTTGEREIT 96, SCHLEIMER 84]. Diese Sofortwirkung der Steroide wird auch für den therapeutischen Nutzen einer hochdosierten, über die Besetzung aller Steroidrezeptoren hinausgehenden, Akuttherapie verantwortlich gemacht. Die Angaben über die Dosis, bei der 21 nahezu alle Glukokortikoidrezeptoren besetzt sind, liegen zwischen 60 mg [SHIMADA 97] und 300 mg Prednisolonäquivalent intravenös [BUTTGEREIT 96]. Die bei etwa 15 % der Bevölkerung [WALKER 87] zu beobachtende Steroidresistenz kann auf einer reduzierten Rezeptoranzahl, einer verminderten GlukokortikoidRezeptoraffinität oder auch einer Abschwächung der Bindung des Hormon-RezeptorKomplexes an die DNA beruhen. Die positive Korrelation zwischen dem Auftreten einer Steroidresistenz und der Anzahl an Glukokortikoidrezeptoren [SHIMADA 97, WALKER 87] ist als Kompensationsversuch bei verminderter Rezeptoraffinität gegenüber Glukokortikoiden zu werten. 1.4.4 Einfluß der Glukokortikoide auf zirkulierende Zellen Ca. vier Stunden nach Kortikoidgabe (FAUCI bzw. RINEHART et al. untersuchten die Wirkung von 100 - 400 mg Hydrocortison i.v., bzw. 50 mg Prednison p.o.) kommt es zu einer transienten Lymphopenie und Monozytopenie durch Umverteilung vom intravaskulären Pool in das Knochenmark und das lymphatische Gewebe [FAUCI 74, RINEHARD 75 PARILLO 78]. Dabei werden die T-Lymphozyten stärker als die BLymphozyten reduziert. Eine zur Lymphopenie führende Zerstörung von Lymphozyten findet nicht statt, doch es wurde eine Lysis bzw. Induktion der Apoptose von Untergruppen aktivierter Lymphozyten beschrieben [CUPPS 82, KIRSCH 99]. Lymphozyten und Monozyten erreichen 24 Stunden nach Medikation wieder ihre Ausgangswerte, wobei auch bei fortgesetzter Therapie die Anzahl der Monozyten nach dieser Zeit wieder ansteigt [RINEHART 75] im Gegensatz zu der unter Medikation persistierenden Lymphopenie [FAUCI 75]. Eine Steroidtherapie führt zu einer Abnahme des Verhältnisses von CD4+- zu CD8+ THelferzellen [OEHLING 97] und des Verhältnisses von Gedächtnis- zu naiven T-Zellen [CORRIGAN 93]. Außerdem wird die Zahl der eosinophilen [SCHLEIMER 94] und basophilen Granulozyten reduziert. Die Eosinopenie ist Folge einer verkürzten Überlebensdauer eosinophiler Granulozyten durch verminderte IL-5-Bildung, so daß es zu einer Eindämmung allergischer Reaktionen kommt - ein wichtiges Einsatzgebiet der Glukokortikoide [CORRIGAN 93, DOI 94]. Im Gegensatz zur Abnahme der eosinophilen und basophilen steigen die neutrophilen Granulozyten in der Peripherie durch Mobilisierung aus dem Knochenmark an. Allerdings wird zum einen die Anhaftung der Granulozyten an das Gefäßendothel durch eine Hemmung der Adhäsionsmoleküle und zum anderen die Chemotaxis verhindert [BUTTGEREIT 96]. 22 Beide Tatsachen führen zu einer verminderten Rekrutierung der Neutrophilen im Entzündungsherd und können so die charakteristische Neutrophilie ohne eine resultierende gesteigerte Abwehr erklären. Auch Monozyten reagieren neben der Umverteilung mit einer Hemmung ihrer Chemotaxis und Phagozytosefähigkeit sowie Freisetzung von lysosomalen Enzymen und Sauerstoffradikalen. Dazu trägt die verminderte Freisetzung des makrophagenaktivierenden chemotaktischen Faktors (MCAF) bei, indem Steroide die Transkription der MCAF-Gene hemmen und die MCAF-mRNA destabilisieren [MUKAIDA 91]. Hier zeigt sich bereits, daß Steroide zum einen indirekt die Funktionsfähigkeit der Immunzellen durch Umverteilung reduzieren und daß sie aber auch direkt auf die Funktionalität Einfluß nehmen können. 1.4.5 Einfluß der Glukokortikoide auf den Arachidonsäuremetabolismus Die pharmakologische Wirkung der Steroide als Antiphlogistika und Immunsuppressiva beruht unter anderem auf der vermehrten Bildung des Proteins Lipokortin [GOULDING 93] (Abb. 4). Dieses ist ein Antagonist der Phospholipase A2, die als Schlüsselenzym des Eikosanoidstoffwechsels die Freisetzung von Arachidonsäure aus Membranen katalysiert (Abb. 5). Aus der Arachidonsäure werden unter Einwirkung der Enzyme Cyclooxygenase und Lipoxygenase die Eikosanoide Prostaglandine und Leukotriene gebildet, welche an Entzündung, Fieber und Schmerz beteiligt sind. Leukotrien B4 wird vor allem aus Granulozyten- und Monozytenmembranen metabolisiert, wobei es auch auf diese Entzündungszellen chemotaktisch wirkt und aus ihnen lysosomale Enzyme und Sauerstoffradikale freisetzt. Da durch einen Mangel an Arachidonsäure sowohl der Cyclooxygenase als auch der Lipoxygenase ihr Substrat entzogen wird, haben die Glukokortikoide eine wesentlich stärkere antiinflammatorische Wirkung als die nichtsteroidalen Antiphlogistika, die nur über eine Hemmung der Cyclooxygenase die Prostaglandinsynthese zu hemmen vermögen. 23 OH R P O CH2O O CH C CH2 C O COOH Membranphospholipid HOOC Phospholipase A2 O Lipokortin Glukokortikoide HO H OH Arachidonsäure OH Prostacyclin Cyclooxygenase COOH Lipoxygenase HO OH OH O O COOH HO Thromboxan A2 COOH O Leukotrien B4 Prostaglandin E2 Abb. 5: Die Arachidonsäurekaskade und ihr Angriffspunkt durch Glukokortikoide Prostanglandine und Leukotriene können einen Einfluß auf Zytokine über veränderte Genexpression ausüben [BRYNSKOV 92a]. So ist Prostaglandin E2 ein endogener substantieller und funktioneller Inhibitor von IL-1, indem es die Synthese von IL-1 und die proliferative Antwort von Lymphozyten auf IL-1 hemmt [KNUDSEN 86]. Dies ist als negative Rückkopplung zu verstehen, da IL-1 ein Induktor von Prostanglandin E2 ist [ISAAKS 92, MIURA 85], welches unter anderem die pyrogene Wirkung von IL-1 im Gehirn vermittlet [BRYNSKOV 92a]. Bezüglich des IL-2 zeigt sich, daß seine Synthese von Prostaglandin E2 gehemmt und von Leukotrien B4 gefördert wird. Prostaglandinsyntheseinhibitoren führen somit zu einer vermehrten IL-2-Produktion [RAPPAPORT 82]. Ebenso beobachteten GOODWIN et al., daß Lipoxygenaseinhibitoren, nicht aber Cyclooxygenaseinhibitoren, ähnliche Hemmwirkungen auf die IL-2-Produktion und Lymphozytenproliferation wie Steroide haben [GOODWIN 86]. Insgesamt zeigen sich zwischen dem Arachidonsäuremetabolismus und den Zytokinen, wie auch im Zytokinnetzwerk selbst, zahlreiche Interaktionen, die durch Glukokortikoide in vielfältiger Weise beeinflußt werden. 24 1.4.6 Einfluß der Glukokortikoide auf die Zytokinbildung Wie oben bereits beschrieben, können Glukokortikoide auf die ZytokingenPromotoren und somit die Zytokinbildung über Bindung des Steroid-RezeptorKomplexes an die glukokortikoidresponsiven Elemente oder an Transkriptionsfaktoren Einfluß nehmen. Dabei hängt die jeweilige Wirkung der Steroide auf die Zytokinproduktion und die klonale Proliferation von CD4+ T-Zellen vom Stadium der TZell-Differenzierung ab. So bewirken Glukokortikoide eine ca. 100-fach schwächere Reduktion der klonalen Zellproliferation von Gedächtnis-CD4+ T-Zellen (CD4+45RO+) gegenüber naiven CD4+ T-Zellen (CD4+45RO-) [BRINKMANN 95, UMLAND 97]. In naiven CD4+ T-Zellen wird die Bildung inflammatorischer Zytokine wie IL-2, IL-5 und IFN-γ inhibiert und die Produktion protektiver Zytokine wie IL-4 und IL-10 induziert. Dagegen werden bei den CD4+ T-Gedächtniszellen die Zytokine IL-4, IL-5 und IL-10 gehemmt, wohingegen IFN-γ nur schwach inhibiert wird [BRINKMANN 95, NEURATH 96] (Abb. 6). CD4+ TH-Zelle CD4+45ROnaiveTH-Zelle CD4+45RO+ GedächtnisTH-Zelle Glukokortikoide IL-4 ↑ IL-10 ↑ IL-5 ↓ IL-2 ↓ IFN- γ ↓ Abb. 6: IL-4 ↓ IL-5 ↓ IL-10 ↓ IFN- γ (↓) Einfluß von Glukokortikoiden auf das Zytokinprofil von naiven T-Helferzellen und Gedächtnis-T-Helferzellen [nach NEURATH 96] Dies deutet auf eine Verstärkung der TH2-Antwort bei naiven TH-Zellen und demgegenüber auf eine Abschwächung der TH2-Antwort mit folglicher Betonung der TH1-Zytokine bei Gedächtnis-TH-Zellen durch Glukokortikoide hin. Ebenso ist der Zeitpunkt der Zytokindetektion nach Glukokortikoidapplikation wesentlich. So konnten HODGE et al. zeigen, daß Gukokortikoide nach 4 h zu einer Abnahme der Zytokinproduktion pro Zelle und nach 24 h sowohl zu einer Dezimierung 25 der Zytokinproduktion pro Zelle als auch des prozentualen Anteils der zytokinproduzierenden Zellen führen [HODGE 99]. Verschiedene Autoren haben unter Kortikoidapplikation eine deutliche Hemmung von IL-2, IL-5, IFN-γ und TNF-α sowie eine nur geringfügige Abnahme oder sogar Steigerung von DAYNES 89, IL-4 und DANDONA 99, IL-10 festgestellt DOZMOROV 98, [BISCHOF 98, CROCKER 98b, HODGE 99, RAMIREZ 96, VISSER 98]. VERHOEF et al. beschreiben hierbei im Zusammenhang mit rheumatoider Arthritis eine nur kurzfristige Abnahme von IFN-γ und eine längerfristige Zunahme von IL-10 [VERHOEF 99]. ELENKOV et al. konnten in-vitro eine nichtsignifikante Hemmung der IL-10-Produktion durch Dexamethason gegenüber einer hochsignifikanten Hemmung der Bildung von IL-12, einem Induktor der TH1Antwort, nachweisen [ELENKOV 96]. Diese für eine glukokortikoidinduzierte TH2-Präferenz sprechenden Ergebnisse werden von Untersuchungen relativiert, die neben einer Verminderung des von TH1Zellen sezernierten IL-2 und IFN-γ eine deutliche Reduktion der TH2-Interleukine IL-4 und IL-5 und auch IL-10 lieferten [CROCKER 98a, FUSHIMI 97, MORI 95, SEWELL 98, UMLAND 97]. Dabei wird insbesondere bei Allergikern IL-5 durch Steroide inhibiert. Sowohl naive als auch Gedächtnis-T-Zellen reagieren auf Steroide mit einer verminderten IL-5Synthese, so daß es einheitlich und unabhängig von Zeitpunkt und Dauer der Medikation zu einer IL-5-Reduktion kommt [NEURATH 96, OKAYAMA 94, ROLFE 92]. Der Effekt von Steroiden auf IL-10 wird als biphasisch beschrieben, indem die Produktion von IL-10 bei niedrigen Steroidkonzentrationen stimuliert [FRANCHIMONT 99b, HODGE 99] und bei höheren Konzentrationen inhibiert werde [FRANCHIMONT 99b]. Dabei wird der inhibierende Effekt von Budesonid auf IL-10 durch IL-2 reduziert [LARSSON 99], was die Balance der Zytokine demonstriert. Andere Autoren wiederum zweifeln die Hypothese an, daß Glukokortikoide überhaupt die TH1- bzw. die TH2-Zytokinproduktion differenziert beeinflussen können; sie beschreiben eine allgemeine Suppression der Interleukinproduktion [MOYNIHAN 98]. Das wichtigste von Makrophagen sezernierte Zytokin IL-1 mit seinen multiplen biologischen Wirkungen wird ebenfalls von Glukokortikoiden gehemmt. ZABEL et al. wiesen einen zirkadianen Rhythmus der IL-1-Produktion nach, der aber vom physiologischen Rhythmus der Cortisolproduktion unabhängig sei. Dagegen stellten sie bei unphysiologischen Cortisolkonzentrationen durch Hyperkortisolismus 26 oder Medikation eine Hemmung von IL-1 fest [ZABEL 90]. Hierbei scheinen Glukokortikoide nicht die IL-1-Transkription, sondern die Translation des Proteins und posttranslationelle Prozesse wie Ausschleusung aus der Zelle zu hemmen [KERN 88] oder auch als direkte Antagonisten der IL-1-Aktionen aufzutreten [RHODES 86]. Die Hemmung von IL-1 führt konsekutiv zu einer verminderten Freisetzung von IL-2, welches aber auch direkt durch Glukokortikoide inhibiert wird. Der Einfluß der Glukokortikoide auf die IL-2-Kaskade wird von einigen Autoren ausschließlich auf die Hemmung der IL-2-Produktion zurückgeführt [LILLEHOJ 85], wohingegen andere Autoren zusätzlich eine verminderte IL-2-Rezeptor-Expression [REED 86] und weiterhin eine deutlich eingeschränkte IL-2-Bindung an bereits existierende Rezeptoren [HORST 87] nachgewiesen haben. Ein Konsens hieraus stellen Messungen her, nach welchen eine Hemmung der IL-2-Rezeptorbildung erst bei höheren Steroidkonzentrationen gelingt [RANDAZZO 84]. Weiterhin zeigten GILLIS et al. neben anderen Arbeitsgruppen, daß durch 10-6 mol/l Dexamethason die IL-2-Produktion mit daraus resultierender T-Zellproliferation um bis zu 100 % und dagegen bei bereits produziertem IL-2 die T-Zellproliferation nur um ca. 25 % gehemmt wird [GILLIS 79, GRAUPE 84, RANDAZZO 84]. In der IL-2-Dezimierung sahen GILLIS et al. neben der pharmakologischen Funktion auch eine physiologische Wirkung der Glukokortikoide. So sei die nach Adrenalektomie zu beobachtende Lymphozytose u.a. Ausdruck einer verstärkten T-Zellproliferation durch verminderte Suppression des IL-2 durch adrenale Glukokortikoide. Sowohl die Förderung der protektiven Zytokine in naiven T-Zellen als auch die Hemmung des am Anfang stehenden Amplifikationssystems aus IL-1 und IL-2 und somit der klonalen T-Zellexpansion [GILLIS 79] liefert eine Erklärung für die effektive Beeinflußbarkeit der frühen Immunantwort durch Glukokortikoide. Demgegenüber verstärkt sich mit fortschreitendem Immungeschehen die Immunreaktion kaskadenartig mit der Folge einer eingeschränkten Änderung einer bereits etablierten Immunantwort. Als weitere Effekte der Glukokortikoide auf Zytokine wurde eine verminderte Expression von IL-3, IL-6, IL-8, TNF-α und GM-CSF beschrieben [BRYNSKOV 92a, BUTTGEREIT 96, GOULDING 93, MUKAIDA 91]. Auch in physiologischen Konzentrationen modulieren die Glukokortikoidhormone Entzündungs- und Immunreaktionen, indem sie als Regulatoren der Zytokinproduktion agieren. Dabei werden die immunsuppressiven Effekte der Steroide durch den von ihnen selbst induzierten proinflammatorischen Migrationsinhibitionsfaktor (MIF), durch 27 welchen chemotaktisch rekrutierte Makrophagen am Ort der Reaktion festgehalten werden, gegenreguliert und ausbalanciert. Allerdings wird MIF bei steigenden Kortikoidkonzentrationen nicht mehr induziert und somit der Körper vor überschießenden Entzündungen geschützt [CALANDRA 95]. 1.4.7 Einfluß der Glukokortikoide auf Rezeptoren Neben ihrer Hemmung von Zytokinen reduzieren die Glukokortikoide vor allem die zelluläre Immunantwort, indem sie die Expression von Rezeptoren, speziell MHCMolekülen, verändern. Hierdurch wird die Antigenpräsentation für T-Lymphozyten und dadurch wiederum die T-Zellaktivierung beeinträchtigt [GERRARD 84]. Hierbei scheinen die Steroide die Antigenpräsentation vor allem auf der Ebene der Antigenprozessierung und Assoziation mit den MHC II-Molekülen zu stören. Denn im Gegensatz zu einer verminderten MHC II-Expression unter Steroidappliklation bei Mäusen [SNYDER 82], wurde beim Menschen eine Zunahme von MHC II-Molekülen festgestellt [GERRARD 84, RHODES 86]. Weiterhin wird durch Kortikosteroide die Expression von IgG-Fc-Rezeptoren auf Makrophagen und somit die Elimination von Antigen-Antikörper-Komplexen inhibiert. 1.4.8 Einfluß der Glukokortkoide auf die Antikörperproduktion B-Lymphozyten sind relativ resistent gegenüber dem direkten Effekt von Steroiden, so daß die Antikörpersynthese nur wenig supprimiert wird [HAYNES 79]. Hauptsächlich erfolgt die Beeinflussung der B-Zellfunktion indirekt über die T-Helferzellen und die von ihnen sezernierten Interleukine, welche sowohl supprimierende als auch aktivierende Wirkungen ausüben. BUTLER et al. fanden unter hochdosierter Methylprednisolontherapie bei fast allen gesunden Probanden im Serum eine IgG-Abnahme, bei der Hälfte eine IgAVerminderung und bei wenigen einen signifikant erniedrigten IgM-Spiegel [BUTLER 73]. 1.4.9 Einfluß der Glukokortikoide auf die Darmpermeabilität Entzündungen bewirken eine Vasodilatation sowie eine gesteigerte Gefäßpermeabilität. Dies führt im akuten Schub der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen zu einer Ödembildung der Darmschleimhaut mit der Folge einer erhöhten intestinalen Permeabilität, besonders beim Morbus Crohn [HOWDEN 94]. Die 28 Konsequenzen sind einerseits eine gesteigerte Invasion von Noxen und andererseits ein vermehrter Übertritt von Proteinen in das Interstitium sowie eine ineffektive Salzund Wasserresorption, was wiederum zu Diarrhöen, Protein- und Blutverlusten führt. Die Wirkung der Kortikosteroide besteht hier in der Eindämmung der Ödembildung, zum einen durch Hemmung der Histaminfreisetzung aus Mastzellen und Basophilen und zum anderen durch eine Vasokonstriktion infolge verminderter Stickstoffmonoxidbildung [BUTTGEREIT 96], Bradikininbildung [GRAUPE 84] und Prostaglandinbildung [LAURITSEN 86]. Glukokortikoide sollen auch direkt die Endothel- und Epithelzellen in ihrer Gestalt und Kontraktilität sowie in ihren Sekretionseigenschaften verändern können [SCHLEIMER 84]. Dies kann durch eine direkte Stabilisierung der Integrität von Membranen bedingt sein [BUTTGEREIT 96]. Zu der erhöhten Darmpermeabilität tragen auch die erhöhten IL-1-Werte unter Vermittlung von Leukotrienen und Prostaglandinen [BRYNSKOV 92a] und die erhöhten IL-2-Werte bei [MULLIN 92], die durch Steroide wirkungsvoll reduziert werden können. Tab. 2: Entzündungshemmende Wirkung von Glukokortikoiden; nach ADLER 96. Angriffsort, Wirkmechanismus Effekt Hemmung der Phospholipase A2 durch Lipokortin Hemmung der Leukotrienen Lymphozyten, v.a. T-Helferzellen Lymphopenie, Hemmung der IL-2-Freisetzung Makrophagen, Monozyten Monozytopenie, Hemmung der Phagozytose, Hemmung der IL-1-Freisetzung Mastzellen, Basophile Hemmung der Histaminfreisetzung Eosinophile, Basophile Reduktion der Anzahl Granulozyten, v.a. Neutrophile Hemmung der Anhaftung am Gefäßendothel Darmschleimhaut ð Vasokonstriktion ð Stimulation des Natriumtransports Verrringerung des Durchtritts von Proteinen, Hemmung der Ödembildung, Reduktion der Diarrhöen 1.4.10 Bildung von Prostaglandinen und Pharmakotherapie mit Glukokortikoiden Die Pharmakokinetik der verschiedenen Glukokortikoide ist unterschiedlich. Da sie sich aber mit dem gleichen Glukokortikoidrezeptor verbinden, ist die Pharmakodynamik aller Glukokortikoide einheitlich. Prednison, Prednisolon und die Prednisolonabkömmlinge werden als Standardpräparate in der systemischen pharmakologischen Therapie eingesetzt, da sie gegenüber Cortison und Cortisol verminderte Mineralkortikoid- und verstärkte Glukokortikoidwirkungen haben. 29 Im Blut wird Prednisolon an das kortikosteroidbindende Globulin mit hoher Substrat-, aber geringer Bindungskapazität und an Albumin mit hoher Bindungs-, aber geringer Substrataffinität gebunden [ZABEL 90]. Der Anteil an gebundenem Prednisolon liegt bei bis zu 95 %, wobei der Anteil an dem freien und somit wirksamen, aber auch schnell inaktivierten Kortikoid, bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen infolge der hier häufig anzutreffenden Hypalbuminämie ansteigen kann. Die Plasmaeliminationshalbwertszeit von Prednisolon liegt zwischen zwei und vier Stunden. Es besteht jedoch zwischen der Plasmahalbwertszeit und der Dauer der klinischen Wirkung keine direkte Beziehung; die Kortikoide wirken grundsätzlich erheblich länger, als sie im Plasma anwesend sind, da sie ihre wesentliche Wirkung auf molekularer Ebene durch Veränderung der Synthese von Proteinen entfalten. Die physiologische Glukokortikoid-Freisetzung erfolgt nach einem zirkadianen Rhythmus mit einem maximalen Glukokortikoid-Blutspiegel morgens zwischen sechs und neun Uhr und einem Blutspiegel-Minimum gegen Mitternacht. Um die Beeinflussung des hormonellen Regelkreises mit folglicher Nebennierenrindeninsuffizienz möglichst gering zu halten, sollte die Tagesdosis immer morgens gegeben werden, weil dann die Nebennierenrinde schon mit der Eigenproduktion begonnen hat und die Hemmbarkeit der übergeordneten Zentren relativ niedrig ist. Bei kurzfristiger Anwendung bleiben Glukokortikoide auch in hoher Dosis praktisch nebenwirkungsfrei. Bei langfristiger Verabreichung kommt es zu Nebenwirkungen, die dem Cushing-Syndrom bei endogener Cortisolüberproduktion gleichen. Folgen der antiphlogistischen und antiproliferativen Wirkung sind Infektionsneigung, Wundheilungsstörungen und Hautatrophie; weiterhin kann es zu Osteoporose und zu Wachstumsstörungen beim Kind kommen. Die übersteigerte physiologische Wirkung führt durch vermehrte Glukoneogenese zur Proteinkatabolie mit Atrophie der Extremitätenmuskulatur und unter Insulineinfluß zum Fettansatz im Gesicht und Nacken und zur Stammfettsucht. Bei unzureichender Insulinausschüttung kann ein Steroiddiabetes auftreten. Folge der Mineralkortikoidwirkung sind Störungen des Salzund Wasserhaushaltes mit Hypokaliämie, Ödemneigung und Hypertonie. Weitere Nebenwirkungen sind Glaukom und Katarakt, Steroidakne, eine erhöhte Thromboseneigung sowie seltener psychische und neurologische Störungen. 30 CH2 CH2 OH CH3 C O OH O OH CH3 C O OH HO CH3 O O Cortison (Cortison Ciba) CH2 O Cortisol (Hydrocortison Hoechst) CH2 OH CH3 C O OH Prednison (Decortin) OH CH2 CH3 C O OH HO CH3 C O O HO CH3 CH3 CH3 O OH C4H8 O O O OH CH3 C O OH O CH3 CH3 HO CH2 CH3 Prednisolon (Solu-/Decortin-H) Methylprednisolon (Urbason) Budesonid (Entocort) Abb. 7: Strukturformeln der Ausgangssubstanzen und der bei den Patienten in dieser Arbeit angewendeten Glukokortikoide 1.4.11 Glukokortikoide bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen Die medikamentöse Therapie des Morbus Crohn und der Colitis ulcerosa beschränkt sich bis heute auf die Unterdrückung der Entzündungsaktivität und ist somit palliativ und nicht kurativ, da Ätiologie und exakte Pathogenese nicht bekannt sind. Dabei sind die wichtigsten Medikamente der Immunsuppression die Glukokortikoide [MALCHOW 84, SUMMERS 79, TRUELOVE 55]. Die Glukokortikoide werden seit ihrer Einführung in die Therapie der Colitis ulcerosa Mitte der 50er Jahre durch TRUELOVE und WITTS in der Behandlung der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen eingesetzt. Bereits Anfang der 50er Jahre wurde bei einer kleinen Anzahl von Patienten mit Colitis ulcerosa und Morbus Crohn die Effektivität einer Behandlung mit dem adrenokortikotropen Hormon ACTH festgestellt [GRAY 51] und in einer kontrollierten Studie Ende der 50er Jahre für die Colitis ulcerosa bestätigt [TRUELOVE 59]. TRUELOVE und WITTS zeigten Mitte der 50er Jahre in einer kontrollierten Doppelblindstudie, daß Cortison bei der Colitis ulcerosa im Erreichen des Remissionsstadium gegenüber Plazebos überlegen ist [TRUELOVE 55], wohingegen täglich 50 mg Cortison per os eine Remission nicht aufrechterhalten können [TRUELOVE 59]. Auch die Dauer einer intensiven intravenösen Behandlung in der Akutphase hat keinen Einfluß auf den Zeitpunkt des Rückfalles [JÄRNEROT 85]. 31 Zu ähnlichen Ergebnissen kam man für den Morbus Crohn in der in den 70er bzw. 80er Jahren durchgeführten National Cooperative Crohn´s Disease Study (NCCDS) und European Cooperative Crohn´s Disesase Study (ECCDS), in denen gezeigt wurde, daß die Ansprechbarkeit bei aktivem Morbus Crohn auf Prednison bzw. Methylprednisolon signifikant besser als auf Plazebos war. In diesen sowie in weiteren kontrollierten Doppelblindstudien [SMITH 78] wurde festgestellt, daß bei inaktivem Morbus Crohn eine niedrigdosierte Kortikoidmedikation Plazebos in Hinblick auf eine Prophylaxe vor einem erneuten Schub nicht überlegen ist. Allerdings zeigte die europäische Crohn-Studie, daß eine bei aktiver Krankheit erfolgreich eingesetzte Methylprednisolontherapie in niedriger Dosierung fortgeführt eine Remission erhalten kann. Dies bestätigen weitere klinische Erfahrungen [CLEMENT 86], und die Mehrheit der Zentren führt auch eine Therapie mit 5 bis 10 mg Prednisolonäquivalent bis zu einem halben Jahr nach Erreichen einer Remission durch [MAY 96]. MUNKHOLM et al. zeigten nach erstmals eingesetzter systemischer Steroidtherapie im Rahmen eines Morbus Crohn bei 44 % der Patienten einen Langzeiteffekt, eine Steroidabhängigkeit in 36 % und eine Resistenz gegenüber dieser Therapie in den übrigen 20 % [MUNKHOLM 94]. MODIGLIANI ermittelten unter einer Dosierung von 1 mg Prednisolon/kg/Tag peroral in 92 % der Fälle aktiven Morbus Crohns innerhalb von 7 Wochen eine Remission [MODIGLIANI 90]. Bei einem schweren Schub einer Colitis ulcerosa oder eines Morbus Crohn sollte 1 mg Prednisolon/kg/Tag parenteral gegeben werden. Der Einsatz einer hochdosierten Methylprednisolontherapie (1000 mg/Tag) bringt keinen weiteren Vorteil, wie ROSENBERG et al. für die Colitis ulcerosa feststellen konnten [ROSENBERG 90]. Bei Befall des distalen Kolons kann der Einsatz von Glukokortikoiden in Form von Klysmen sinnvoll sein [TRUELOVE 60]. 32 2. Patientenkollektiv, Material und Methoden 2.1. Aktivitätsindizes bei Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Um die Meßergebnisse über die Zytokinproduktion bezüglich der entzündlichen Aktivität und dem Schweregrad der Erkrankung beurteilen zu können, ist es notwendig, die Aktivität nach einem definierten Schema zu bestimmen. Solche Schemata wurden vor allem zur Evaluation von Therapieerfolgen entwickelt. Die Beurteilung der Erkrankung in einem Index ist insofern schwierig, als Krankheitsschwere und entzündliche Aktivität nicht immer übereinstimmen [ADLER 96]. Außerdem können durch Verwendung eines einheitlichen Index für alle Patienten Befunde unberücksichtigt bleiben, die für die Bewertung des Krankheitsbildes des einzelnen Patienten wichtig sind. 2.1.1 Aktivitätsindizes bei Morbus Crohn Zur Einschätzung des Morbus Crohn stehen verschiedene Indizes wie beispielsweise der von BEST et al. im Rahmen der National Cooperative Crohn´s Disease Study entwickelte Crohn´s Disease Activity Index (CDAI) [BEST 76], der Aktivitätsindex nach VAN HEES oder der Schweregrad-Aktivitäts-Index nach GOEBELL zur Verfügung [GOEBELL 92]. Im Gegensatz zu dem ausschließlich Laborparameter und objektive klinische Befunde erfassenden VAN-HEES-Index berücksichtigt der CDAI sowohl objektive als auch subjektive Aspekte der Erkrankung (Tab. 3). Dabei spiegeln subjektive Angaben mehr die Krankheitsschwere und die objektiven Merkmale gemeinsam mit Laborparametern eher die entzündliche Aktivität wider. Diese müssen vor allem beim Morbus Crohn nicht immer in enger Beziehung miteinander stehen. Mit dem von ihnen entwickelten Index trugen BEST et al. ihren eigenen Anforderungen Rechnung, Faktoren zu berücksichtigen, die als Indikatoren der Krankheitsaktiviät angesehen werden, wichtige Parameter direkt bei der Visite erfassen zu können und die einzelnen Komponenten entsprechend ihrer Bedeutung zu gewichten. Durch den erhaltenen Summenwert wird eine künstliche Grenze zwischen aktiver und inaktiver Krankheit gezogen, wobei ein numerischer Index zur Standardisierung nötig 33 ist. Als Grenze zwischen aktiver und inaktiver Krankheit haben BEST et al. einen CDAI von 150 vorgeschlagen, wobei ein Wert über 450 als sehr schwerer Krankheitszustand eingestuft wird. Tab. 3: Crohn´s Disease Activity Index nach BEST 76. Variable Faktor Diarrhöen (Summe über letzte Woche): Zahl der flüssigen oder sehr weichen Stühle x2 Bauchbeschwerden (Summe über letzte Woche): 0 = keine, 1 = mild, 2 = mäßig, 3 = stark x5 Allgemeinbefinden (Summe über letzte Woche): 0 = gut, 1 = mäßig, 2 = schlecht, 3 = sehr schlecht, 4 = unerträglich x7 Aktuelle assoziierte Symptome (jede Kategorie zählt einzeln): 1.) Arthritis, Arthralgie 2.) Iritis, Uveitis 3.) Erythema nodosum, Pyoderma gangraenosum, Stomatits aphthosa 4.) Analfissur, Analfistel, Abszeß 5.) andere Fisteln 6.) Fieber über 37,5°C in der letzten Woche x 20 Symptomatische Durchfallbehandlung: 0 = nein, 1 = ja x 30 Resistenz im Abdomen: 0 = nein, 2 = fraglich, 5 = sicher x 10 Hämatokrit (Hkt): 47 - Hkt bei Männern, 42 - Hkt bei Frauen x6 Gewicht: (1 - Gewicht / Standardgewicht) x 100 Summe 34 2.1.2 Aktivitätsindizes bei Colitis ulcerosa Auch die Colitis ulcerosa kann nach verschiedenen Indizes klassifiziert werden, wobei in unterschiedlichem Ausmaß auf subjektive Parameter und objektive Befunde eingegangen wird. So bewertet beispielsweise der klinische Index nach RACHMILEWITZ (Clinical Activity Index) neben Laborbefunden und objektiven klinischen Befunden auch das subjektive Befinden des Patienten. Der zusätzliche endoskopische Index im Scoring-System nach RACHMILEWITZ berücksichtigt die Tatsache, daß, ähnlich wie bei Morbus Crohn, die klinische Schwere der Colitis ulcerosa nicht immer mit dem endoskopischen Befund korreliert [ADLER 96]. Hauptsächlich verwendet wird die einfach zu handhabende Klassifikation von TRUELOVE und WITTS, nach welcher die Krankheit bezüglich objektiver klinischer und laborchemischer Parameter in einen milden, schweren und sehr schweren bis fulminanten Schub eingeteilt wird (Tab. 4). Tab. 4: Klassifikation der Colitis ulcerosa nach TRUELOVE und WITTS [TRUELOVE 55, GOEBELL 92, ADLER 96]. Variable milder Schub schwerer Schub sehr schwerer Schub Diarrhöen < 5 pro Tag 5 - 9 pro Tag > 9 pro Tag Blutung keine oder wenig mäßig profus Fieber afebril > 37,8 °C > 38,8 °C Hämoglobin Hb: > 10 g % Hb: 7,5 - 10 g % Hb: < 7,5 g % Blutsenkung < 30 mm/h 30 - 50 mm/h > 50 mm/h Albumin >4g% 3-4g% <3g% Maximal sind nach diesem Index 18 Punkte erreichbar, indem für fehlende oder leicht pathologische Befunde 0 bzw. 1 Punkt, für schwere Symptomatik je 2 Punkte und für sehr schwere Befunde jeweils 3 Punkte vergeben werden. Somit entspricht ein Score bis zu 6 Punkten einem leichten, zwischen 7 und 12 Punkten einem schweren und über 12 Punkten einem sehr schweren Verlauf der Colitis ulcerosa. In dieser Arbeit wurde der Morbus Crohn nach dem CDAI von BEST et al. und die Colitis ulcerosa nach dem Index von TRUELOVE und WITTS eingeteilt, wobei die erhobenen Daten und Angaben zur Klassifizierung sich jeweils auf die Woche bis zur Untersuchung der Zytokine beziehen. 35 2.2 Probanden Das Patientenkollektiv umfaßte 25 Patienten der gastroenterologischen Abteilung der Berufsgenossenschafltichen Kliniken Bergmannsheil Bochum. Im untersuchten Kollektiv waren 16 Patienten an Morbus Crohn und neun Patienten an Colitis ulcerosa erkrankt. Dabei war das Krankheitsstadium im Crohn-Kollektiv nach dem Aktivitätsindex von BEST et al. bei neun Patienten als aktiv und bei sieben Patienten als inaktiv zu klassifizieren. Im Colitis-ulcerosa-Kollektiv befanden sich nach der Einteilung von TRUELOVE und WITTS fünf Patienten im milden Stadium und vier im schweren Schub. Der Frauenanteil überwog mit 60 % gering bei Morbus Crohn, wohingegen bei der Colitis ulcerosa der Männeranteil mit 66 % vorherrschte. Das Alter der Patienten mit Morbus Crohn reichte von 25 Jahren bis 80 Jahre bei einem Median von 28 Jahren. Bei der Colitis ulceorsa variierte das Alter von 30 Jahren bis 63 Jahre bei einem im Gegensatz zum Morbus Crohn deutlich höheren Median von 54 Jahren. Die mittlere Krankheitsdauer betrug sowohl beim Morbus Crohn als auch bei der Colitis ulceorsa sieben Jahre. In die Studie wurden Patienten eingeschlossen, die seit mindestens fünf Tagen eine Glukokortikoidmedikation intravenös erhielten, bzw. nach intravenöser Therapie oral ausgeschlichen wurden, oder über einen Zeitraum von mehreren Monaten geringe Steroidmengen oral einnahmen. Die mittlere Steroiddosis betrug 72 mg täglich, wobei die Patienten mit aktivem Morbus Crohn 105,5 mg, mit inaktivem Morbus Crohn 41,3 mg, mit aktiver Colitis ulcerosa 70,8 mg und mit inaktiver Colitis ulcerosa 34,5 mg als mittlere Medikamentendosis erhielten. Dabei wurden oral vor allem Decortin-H (Prednisolon) bzw. Urbason (Methylprednisolon) und intravenös ausschließlich Solu-Decortin-H (Prednisolon) eingesetzt. Als Begleitmedikation erhielt die Mehrheit der Patienten mit Morbus Crohn Salofalk, Claversal oder Pentasa (Mesalazin) täglich 3 x 1 g, und die Patienten mit Colitis ulcerosa nahmen größtenteils zusätzlich zur Glukokortikoidmedikation Azulfidine (Sulfasalazin) täglich 3 x 1 g oder Dipentum (Olsalazin) täglich 3 x 1 g ein. Ein Patient mit Colitis ulcerosa erhielt darüber hinaus Imurek (Azathioprin) täglich 100 mg. Weiterhin setzten drei Patienten über die systemische Steroidmedikation hinaus Colifoam-Schaum (Hydrocortison) 2 x täglich und ein Patient EntocortKlysmen (Budesonid) 2 x täglich ein. 36 Erwähnt werden soll, daß sich bei einem Patienten mit Morbus Crohn ein ausschließlicher Befall des Magens und Dünndarms zeigte, und ein Patient mit Colitis ulcerosa einen gleichzeitig bestehenden Morbus Bechterew aufwies. 2.3 Material und Methoden 2.3.1 Allgemeines zur Zytokindetektion Es gibt verschiedene Methoden, die Zytokinproduktion zu messen. So kann man die biologische Aktivität der Zytokine durch Einbau radioaktiv markierten Thymidins in proliferierende Zellen messen, die mRNA mit Hilfe der PCR-Technik oder in-situHybridisierung bestimmen oder Zytokine im Serum oder Überständen von Zellkulturen bzw. Biopsien mit der ELISA- oder RIA-Technik detektieren. Allerdings ist die biologische Aktivität ein ungenauer Parameter [DOLHAIN 93], eine transkribierte mRNA muß nicht obligat translatiert werden [AUTSCHBACH 96, DOLHAIN 93] und Zytokine wirken häufig direkt von Zelle zu Zelle infolge einer direkt rezeptorgerichteten Fokussierung der Zytokinfreisetzung und sind somit nicht extrazellulär bestimmbar [POO 88]. Vielmehr stellt die extrazelluläre Detektierung das Resultat aus freigesetzten, absorbierten und degradierten Zytokinen dar [SANDER 91]. Dagegen erhält man mit der intrazellulären Zytokinmessung eine Aussage über die Zytokinproduktion der Einzelzelle und den relativen Anteil an zytokinproduzierenden Zellen. Allerdings liefert diese Methode keine Aussage über das im Endeffekt freigesetzte Zytokin. Dennoch kann insofern eine Einschätzung des auf die Zellen einwirkenden Zytokins erfolgen, als daß unter optimalen Bedingungen zytokinproduzierende von zytokinaufnehmenden Zellen unterschieden werden können. So führt eine gesteigerte Zytokinsynthese in den produzierenden Zellen zu einer Akkumulation in den Golgi-Organellen und läßt sich hier charakteristischerweise perinukleär nachweisen, wohingegen die Zielzellen eine diffuse membranöse oder zytoplasmatische Zytokinanhäufung aufweisen [ANDERSSON 92/94a/94b, SANDER 91/93]. Das Prinzip der Methode besteht darin, isolierte Lymphozyten ex-vivo zur Zytokinproduktion permeabilisieren anzuregen, und die die Zellen zu Interleukinmoleküle fixieren, im die Zellinneren Zellmembran mit Hilfe zu von monoklonalen Antikörpern zu markieren. Dazu sind die Antikörper biotinyliert, und mit 37 dem Biotin reagiert in einem weiteren Schritt das Streptavidin einer StreptavidinPeroxidase, welche als Indikatorenzym für die anschließende Färbung dient. Das Substrat der Peroxidase ist Wasserstoffperoxid, welches zu Wasser reduziert wird. Als Reduktionsmittel fungiert das Chromogen Diaminobenzidin, das dadurch aus der Lösung ausfällt und auf diese Weise dort zu einem lichtmikroskopisch braunen Präzipitat führt, wo Interleukin vorliegt (Abb. 10a). Je stärker die Braunfärbung einer Zelle ist, desto mehr Interleukin hat sie produziert, bzw. desto mehr Interleukin hat sie von einer anderen Zelle aufgenommen. Bei dieser Peroxidasetechnik handelt es sich um eine Immunzytochemietechnik. Sie besitzt gegenüber der vielfach angewandten Immunfluoreszenztechnik [SANDER 91] den Vorteil, daß die Objektträger lichtmikroskopisch untersucht und ohne Qualitätsverlust aufbewahrt werden können. Um das Ausmaß der Anfärbung objektiv zu bestimmen, bedient man sich der morphometrischen Messung mit Hilfe der Computerbildanalyse (Abb. 10b). 2.3.2 Verwendete Medien und Lösungen Die Medien und Lösungen sind in der Reihenfolge ihres Bedarfs aufgeführt. Sie werden immer erst kurz vor Gebrauch angesetzt und vor Benutzung gut geschüttelt. Zum Abmessen und Vermischen kleiner Volumina werden 2-20 µl- und 200-1000 µlMikroliterpipetten (Eppendorf) und 1,5 ml-Reaktionsgefäßen (Plastibrand) verwendet. • Medium zum Waschen und Aufbewahren der Zellen (HBSS): 995 ml Aqua dest. + 1 Glas Hanks´Balanced Salts (Sigma Chemical Company) + 4,7 ml Natriumhydrogencarbonat-Lösung 7,5 % • Nährmedium zum Kultivieren bzw. Inkubieren der Zellen: RPMI-1640-Medium (Sigma Cell CultureTM), ergänzt zu 1 % mit fetalem Kälberserum • Lösungen zur Stimulation der Interleukinproduktion (Sigma): Stimulator 1: 2 µl Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (10 µl Stammlösung zu 10 µl DMSO) + 18 µl HBSS Stimulator 2: 2 µl Ionomycin (Stammlösung zu 1 mM in DMSO) + 18 µl HBSS 38 • Lösung zum Fixieren der Zellen: Fixativ-Stammlösung (Hölzel Diagnostika, ICS-Kombikit), 1:10 mit HBSS verdünnen • Lösung zur Hemmung der endogenen Peroxidase: 7 ml HBSS + 241 µl Wasserstoffperoxid 30 % + 14 µl Natriumacid 10 % • Medium zur reversiblen Permeabilisation der Zellen: 995 ml Aqua dest. + 1 Glas Hanks´Balanced Salts + 4,7 ml Natriumhydrogenkarbonat-Lösung 7,5 % + 1 g Saponin (Sigma) • Antikörper (AK) -Lösungen zur Markierung der Interleukine (Hölzel Diagnostika, ICS-Kombikit extra): Antikörper-Stammlösungen: biotinyliertes Anti-human-IL-2, Anti-human-IL-5 und Anti-human-IL-10; jeweils im Verhältnis 1:10 mit einer Permeabilisator-Verdünnung versetzt (Permeabilisatorverdünnung: 5 µl Permeabilisator-Stammlösung + 495 µl HBSS) • Isotypenkontrolle der Interleukin-spezifischen Antikörper (Phar Mingen): Kontrolle des Antikörpers gegen IL-2: biotinyliertes Maus-IgG 2a,κ, 1:1 mit HBSS verdünnt Kontrolle des Antikörpers gegen IL-5: biotinyliertes Maus-IgG1,κ, 1:1 mit HBSS verdünnt • Streptavidin-Peroxidase-Lösung: Streptavidin-Peroxidase-Stammlösung (Immunotech), im Verhältnis 10:1 mit einer 1:10-Permeabilisator-Verdünnung (Hölzel Diagnostika) versetzt • Lösung zum Anfärben der Zelle: DAB Chromogen System (Immunotech) 5 ml Aqua dest. + 5 Tropfen Buffer concentrate for DAB (3,3-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid) + 5 Tropfen DAB Chromogen + 2 Tropfen Wasserstoffperoxid 3 % 39 2.3.3 Versuchsbeschreibung zur Interleukindarstellung Isolierung der Leukozyten durch Dichtegradientenzentrifugation: Einem Kollektiv von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen wird Blut in ein Lithium-Heparin-Röhrchen (Sarstedt Monovette) entnommen. Das Blut wird innerhalb einer halben Stunde weiterverarbeitet, damit zum einen die Zellmorphologie nicht beeinträchtigt wird und zum anderen keine Zellen mit eingeschränkter Vitalität isoliert werden. Zur Isolierung der Leukozyten bedient man sich der Dichtegradientenzentrifugation, bei der die unterschiedliche Dichte der Blutzellen ausgenutzt wird: Erythrozyten und Granulozyten haben eine Dichte größer als 1,077 g/ml, während die Dichte der Lymphozyten, Monozyten und Thrombozyten unter 1,077 g/ml liegt. Deshalb wird ein Flotationsmittel mit einer Dichte von 1,077 g/ml verwendet. In einem 15mlZentrifugenröhrchen (Falcon) werden 3 ml des Flotationsmittels Histopaque 1077 (Sigma diagnostics) vorgelegt und mit 3 ml Patientenblut überschichtet. Im nächsten Schritt erfolgt die Zentrifugation bei 1390 g für 32 min bei Raumtemperatur (Heraeus Minifuge T, Heraeus Holding GmbH), wodurch die Erythrozyten und Granulozyten durch den Dichtegradienten auf den Boden des Röhrchens wandern, während sich die gewünschten Lymphozyten zusammen mit Monozyten und Thrombozyten an der Grenzschicht zwischen Plasma und Flotationsmittel ansammeln. Diese lymphozytenreiche Zone erscheint als milchiger Zellring (Abb. 8), der nun mit einer Pasteurpipette vorsichtig abgehebert und in ein sauberes Zentrifugenröhrchen überführt wird, in dem bereits 2 ml Hanks-Lösung vorgelegt sind. Dabei soll möglichst nur die begrenzte weißliche Zellschicht erfaßt werden, da zuviel Flotationsmittel eine Verunreinigung mit Granulozyten bedingt und zuviel Plasma zu einer Kontamination mit Proteinen führt, was sich in folgenden Schritten als störende Zellaggregation bemerkbar machen kann. 40 Abb. 8: Isolierung von Lymphozyten aus heparinisiertem Vollblut mit der Dichtegradientenzentrifugation; nach VORLAENDER 83 Waschen der Leukozyten und Bestimmung der Zellkonzentration: Die Lymphozytensuspension wird mit Hanks-Lösung auf 10 ml aufgefüllt und mit einem Vortexer gut durchmischt, ohne dabei die Zellen zu lysieren. Anschließend wird für 10 min bei 1200 g zentrifugiert und der Überstand mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe bis auf 0,5 ml abgesaugt. Das zurückbleibende Pellet wird zweimal jeweils in 5 ml Nährmedium RPMI-1640 resuspendiert und bei dem gleichen Programm zentrifugiert. Zuletzt wird der Überstand bis auf 1,0 ml abgesaugt, so daß die Leukozyten gewaschen in einer Nährlösung vorliegen. Die ungefähre Zellkonzentration lag bei 2 x 106 Zellen/ml (bestimmt mit Hilfe einer NeubauerZählkammer - 0,100 mm Tiefe, 0,0025 mm2 Fläche pro kleinstem Quadrat -, entsprechend ungefähr zehn Zellen pro großem Quadrat). Stimulation der Interleukin-Produktion: Eine Stimulation der Interleukin-Produktion ist notwendig, da die Anzahl spontan interleukinproduzierender Zellen unter 1:10 000 liegt [ANDERSSON 92], bzw. periphere T-Zellen keine meßbare Produktion an Zytokin-mRNA oder Proteinen zeigen. Erst nach externer Stimulation bilden die peripheren T-Zellen Zytokine entsprechend ihrem Aktivitätszustand [KELSO 89]. Es ist bekannt, daß die physiologische Stimulation von T-Zellen über den TZellrezeptor zu einer Aktivierung der Proteinkinase C und zu einem Anstieg der zytoplasmatischen Ca2+-Konzentration führt [MORI 95]. Deshalb werden hier als 41 Stimulatoren der Proteinkinase-C-Aktivator Phorbol-Myristat-Acetat und das Ca2+Ionophor Ionomycin verwendet. Von der Zellsuspension wird 1 ml in ein Reaktionsfach (16 mm Durchmesser, flacher Boden) einer Mikrotiterplatte (Cell WellsTM) gegeben, mit jeweils 10 µl der Verdünnungen des Stimulators 1 und 2 versetzt und mit Parafilm abgedichtet. Die Mikrotiterplatte wird im Shaker-Incubator (Microtiter Dynatech) für 2 min geschüttelt, und anschließend wird für 5 h bei 37°C im Dunkeln inkubiert [BJÖRK 96, JUNG , SANDER 91]. Nach der Inkubation wird nochmals für 2 min geschüttelt, um agglutinierte Zellen voneinander und vom Boden des Reaktionsgefäßes zu lösen. Waschen der stimulierten Leukozyten: Zum Waschen der Zellen wird die inkubierte Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert und mit HBSS auf 5 ml aufgefüllt. Die Zellsuspension wird suspendiert und für 6 min bei 990 g zentrifugiert. Mit Hilfe der Wasserstrahlpumpe wird bis auf 0,5 ml abgesaugt und der Waschvorgang noch einmal wiederholt. Diese Waschvorgänge sind notwendig, um Restproteine des Nährmediums zu beseitigen, welche die Qualität der Zytokinmarkierung negativ beeinflussen würden. Nach der Zentrifugation wird bis auf 0,1 ml abgesaugt. Fixieren der Leukozyten auf einem Objektträger: Da hier der intrazelluläre Zytokingehalt morphometrisch bestimmt werden soll, müssen die Lymphozyten in ihrer möglichst ursprünglichen Struktur fixiert werden, so daß sowohl die intrazelluläre Antigenität als auch die Oberfläche erhalten bleiben und außerdem nur wenig Zellen verloren gehen. Als Fixativ eignet sich hierfür phosphatgepuffertes Paraformaldehyd, das die Tertiärstruktur von Proteinen nur wenig beeinflußt und die Stabilität der Lymphozytenmembran erhält. Als Träger für die Zellen dienen spezielle Adhäsionsobjektträger (Bio-Rad Clin. Div. München) mit zwölf Reaktionsfeldern (Abb. 9), von denen die grüne Schutzfarbe mit einem weichen Wasserstrahl abgewaschen wird und die in Hanks-Lösung feucht gehalten werden. Für die folgenden Inkubationsvorgänge empfiehlt sich das Anlegen einer feuchten Kammer für den Objektträger. Das Leukozytenzellpellet wird in den verbliebenen 0,1 ml resuspendiert, das HBSS von den Objektträgern abgeklopft und je 15 µl der Zellsuspension auf die Felder des Adhäsionsobjektträgers gegeben. Die Zellen läßt man für 10 min auf den 42 Adhäsionsfeldern elektrostatisch adhärieren, anschließend wird die Zellsuspension abgeschüttelt und auf jedes Feld werden 20 µl der Fixativ-Verdünnung, die Formaldehyd enthält, gegeben. Nach weiteren 10 min Einwirkungszeit werden das Fixativ und die überschüssigen Zellen mit HBSS abgewaschen. Der Fixiervorgang ist besonders wichtig, um die Präparate ohne Qualitätsverlust aufbewahren zu können. Bei ungenügender Fixierung wird das Präparat durch Auftreten von Vakuolen im Zyoplasma der Zellen zerstört [DOLHAIN 93]. grüne Schutzfarbe P a tie n t 1 N r. N r. IL-2 -AK IL-5 -AK IL-10 -AK P a tie n t 2 IL-2 -AK IL-5 -AK IL-10 -AK I g G 2a,κ I g G 1, κ H B S S I g G 2a, κ I g G 1, κ H B S S Abb. 9: Besetzung der Felder des Adhäsionsobjektträgers Hemmung der endogenen Peroxidase: Da die Anfärbung der Interleukine auf der Reaktion eines Farbstoffes mit einer zuvor auf den Interleukinen über Antikörper fixierten Peroxidase beruht, muß die endogene Peroxidase in den Leukozyten gehemmt werden, um keine unspezifischen Anfärbungen zu erhalten. Es werden 20 µl einer Lösung aus Wasserstoffperoxid und Natriumazid auf jedes Reaktionsfeld gegeben und für 25 min inkubiert. Anschließend wird der Objektträger im mit Saponin versetzten HBSS gewaschen, um die Zellmembranen für die folgenden Schritte durchlässig zu machen. Permeabilisierung der Membranen: Bei den Interleukinen handelt es sich um Proteine. Diese werden an den Ribosomen des endoplasmatischen Retikulums produziert und anschließend unter anderem zur Glykosylierung und zur Sekretion in den Golgi-Apparat transportiert, wo man sie dann in den Lymphozyten als typisches perinukleäres Muster mit Hilfe von Antikörpern, Enzymen und Farbstoffen nachweisen kann. Die Lymphozyten müssen also so permeabel gemacht werden, daß die Antikörper, Enzyme und Farbstoffe durch die Zytoplasmamembran, durch das Zytosol und durch die Membranen des Endoplasmatischen Retikulums und des Golgi-Apparats dringen können. Andererseits muß diese Permeabilität reversibel sein, damit die Anfärbung nicht wieder verlorengeht. Auch dürfen die Zellmorphologie und vor allem die Struktur der nachzuweisenden Zytokine nicht unter dieser Prozedur leiden. Für diese Zwecke 43 eignet sich das Detergenz Saponin, wohingegen organische Lösungsmittel wie Ethanol, Aceton oder Methanol entweder die Zytokine in ihrer Struktur verändern oder sie extrahieren. Bei Saponin handelt es sich um ein pflanzliches Glykosid, das eine hohe Affinität zu Cholesterin hat und in cholesterinreichen Plasmamembranen zirkuläre Strukturen mit einer zentralen Pore bildet. Während der gesamten Inkubation mit den Antikörpern muß Saponin anwesend sein, und anschließend muß es ausgewaschen werden, um den Markierungsvorgang dauerhaft zu machen [SANDER 91]. Markierung von IL-2, IL-5 und IL-10 mit Antikörpern: Für die Zytokinmarkierung werden monoklonale Antikörper bevorzugt, da sie zu weniger unspezifischen Markierungen als polyklonale Seren führen [SANDER 91]. Außerdem wird eine Minimierung der Hintergrundsignale dadurch erreicht, daß die zytokinspezifischen Antikörper direkt biotinyliert sind und somit kein zweiter Antikörper eingesetzt werden muß [ANDERSSON 94a]. Aus der mit Saponin versetzten Hanks-Lösung wird der gespülte Objektträger entnommen und vorsichtig um die Felder herum getrocknet, damit die Antikörperlösungen nicht wegen der Detergenzwirkung des Saponins verlaufen. Jeweils 10 µl der Verdünnung des Antikörpers gegen IL-2, IL-5 und IL-10 werden auf je ein Feld der oberen Felderreihe gegeben. Auf die jeweiligen unteren Felder werden je 10 µl der Isotypenkontrollen bzw. für IL-10 HBSS aufgetragen. Diese den monoklonalen Antikörpern gleichenden Isotypen dienen als Kontrolle für unspezifische Ablagerungen [ANDERSSON 94a]. In der feuchten Kammer inkubiert man nun für 60 min und wäscht anschließend in mit Saponin versetzter Hanks-Lösung. Färbung durch Anwendung der Peroxidasetechnik: Es wird das Enzym Streptavidin-Peroxidase verwendet, das sich an die zuvor angelagerten Antikörper bindet und den anschließend dazugegeben Farbstoff umsetzt. Die Streptavidin-Peroxidaselösung wird zu je 20 µl auf jedes Reaktionsfeld gegeben und für 45 min inkubiert. Nach der Inkubation wird in Hanks-Lösung ohne Saponin gewaschen. Anschließend gibt man durch einen Filter zwei bis drei Tropfen Färbelösung DAB auf jedes Reaktionsfeld und läßt 20 min einwirken. 44 Einbetten des Adhäsionsobjektträgers: Nach dem Färbevorgang wird die Farblösung vom Objektträger für 2 min mit Aqua dest. abgewaschen. Anschließend entzieht man durch Anwendung folgender Schritte das Wasser: 2 min Waschen in 70%-igem Alkohol, 1 min Waschen in 100%-igem Alkohol und zweimal je 1 min Waschen in Xylol. Nun läßt man das Präparat gut lufttrocknen und bettet es anschließend in Permanent Resin Mounting Medium (Immunotech) ein (Deckgläser 18 x 18 mm). Die Präparate können nun bei Raumtemperatur dauerhaft aufbewahrt werden. 2.3.4 Computergestützte Bildanalyse zur Interleukinbestimmung Präparate für die computergestützte Bildanalyse: Bei den nun vorliegenden Präparaten handelt es sich um Dauerpräparate, die somit zu einem beliebigen Zeitpunkt und auch wiederholt zur Überprüfung der Reliabilität ausgewertet werden können. Hier liegt ein entscheidender Vorteil der Immunperoxidasetechnik gegenüber der Immunofluoreszenztechnik, bei welcher die Präparate bei -20°C gelagert und innerhalb von 72 Stunden ausgewertet werden müssen [DOLHAIN 93]. Ein weiterer Vorteil der Immunperoxidasetechnik ist die Markierung der Interleukine mit dem im sichtbaren Wellenlängenbereich absorbierenden Farbstoff DAB, was die Untersuchung mit einem normalen Lichtmikroskop ermöglicht. Auch hat sich die Immunperoxidasetechnik als etwas empfindlicher gegenüber der Immunfluoreszenztechnik erwiesen [DOLHAIN 93]. Computergestützte Bildanalyse: Die Auswertung der Präparate erfolgt mit einer computerunterstützten morphometrischen Darstellung der intrazellulären Zytokine und einer angeschlossenen automatischen Bildanalyse. Die angefärbten Interleukinmarkierungen können mit einer an das Mikroskop adaptierten Charge coupled device (CCD) -Farbkamera registriert und einem Bildverarbeitungsprogramm zugeführt werden. Hiebei handelt es sich um ein halbautomatisches Routineprogramm zur Bestimmung der Anzahl zytokinproduzierender Zellen, der Intensität der Zytokinproduktion und des charakteristischen intrazellulären Verteilungsmusters der Zytokine [BJÖRK 94/96, CUI 97, HERR 97]. Demgegenüber stellt das visuelle Auswerten von Zellpräparaten unter dem Mikroskop eine nur schlecht reproduzierbare Methode dar, da die Erkennung und Zuordnung von 45 Strukturen stets subjektiv ist. So können zwar stark und schwach zytokinproduzierende Zellen vom visuellen Eindruck der Anfärbungsintensität unterschieden werden, doch reproduzierbare Daten liegen auf diese Weise nicht vor [ANDERSSON 94b]. Computergestützte Systeme zur digitalen Bildanalyse können in diesen Fällen durch objektive Analyse der Daten die Reproduzierbarkeit der Auswertung erhöhen und durch Erkennung kleinster Details, die vom menschlichen Auge nicht mehr erfaßt werden können, die Genauigkeit steigern [NICKOLAY 97]. Bildanalyseprogramm: Als Programm wird hier Optimas 5.1 für Windows 3.11 (Stemmer Imaging GmbH in Puchheim, Deutschland) verwendet, bei dem es sich um ein speziell zum Einsatz in Wissenschaft und Medizin entwickeltes Softwarepaket zur Bildverarbeitung und Bildanalyse handelt. Optimas arbeitet unter Standardbetriebssystemen wie Windows und ermöglicht so eine Einbindung der Ergebnisse in eine weitere Datenverarbeitung mit Excel oder anderen Datenkalkulationssystemen. Die zur Erfassung der Bilddaten notwendige Hardware besteht im wesentlichen aus Mikroskop (Biokular, Olympus BX40F), CCDVideokamera (3CCD-IRIS COLOR DXC-930P) mit Optik und Adapter (Sony CMAD2), Framegrabberkarte und Computer (Pentium 75 MHz, 16 MB RAM). Durchführung der Bildanalyse: Das durch ein Lichtmikroskop 400-fach vergrößerte Bild wird mit Hilfe eines Interferenzfilters in monochromatischem blauen Licht dargestellt. Diese Monochromatisierung ist notwendig, da das der Methode zugrunde liegende Prinzip der Strahlenabschwächung gemäß dem Lambert-Beerschen Absorptionsgesetz (Gl. 1) nur für monochromatisches Licht gültig ist. Die Blaueinfärbung liefert dabei einen erhöhten Kontrast der Markierungen gegenüber dem Hintergrund [BJÖRK 94], da das Absorptionsmaximum des Farbstoffs im Bereich des Interferenzfilters liegt. Das Lambert-Beersche Gesetz beschreibt den Zusammenhang zwischen der Absorption monochromatischer Strahlung in einem Medium und der vorhandenen Menge des hier als Absorbens fungierenden DAB. 46 E = log (Io/I) = ε·c·d (Gl. 1) Lambert-Beersches Absorptionsgesetz; E: Extinktion, Io bzw. I: Intensität des Lichtstrahls vor bzw. hinter dem Absorber, ε: stoffspezifischer Extinktionskoeffizient, c: Konzentration des Absorbens, d: Weglänge des Strahls im Absorber Das mikroskopische Bild, welches durch die CCD-Kamera aufgezeichnet wird, kann vor der Übertragung in den Computer auf einem separaten Monitor zur optimalen Bildeinstellung dargestellt werden. Dabei ist es Aufgabe der CCD-Videokamera, das zweidimensionale Bild aufzunehmen und in ein digitales Bild bestehend aus 512 x 512 Pixeln umzuwandeln. Die sich im Computer befindende Framegrabberkarte steuert den Datentransfer zwischen Computer und Kamera und stellt das digitalisierte Bild in 24 Bit Farbtiefe dar. Auf dem Monitor werden die Interleukinspots in der kontraststeigernden blauen Einfärbung mit Hilfe des Mikroskops optimal dargestellt und anschließend abgespeichert. Das so primär farbig vorliegende Bild wird in eine 8 Bit Graustufengraphik transformiert, welche 256 Graustufen liefert. Da die Intensität der Anfärbung in Graustufen dargestellt wird, erscheint eine stark mit dem braunen Chromogen DAB angefärbte Zelle schwarz. Das durch die Pixel morphometrisch dargestellte Interleukin läßt sich somit in seiner Ausdehung und Akkumulation erfassen, da die Pixel eine definierte Größe haben und eine von 256 Graustufen annehmen können. Für die sich anschließende Bildanalyse muß das eingelesene Rohbild noch vorbereitet werden, da sich bei der Bildaufnahme Störungen wie Rauschen und Schatten nie ganz vermeiden lassen. Zur Unterdrückung solcher Störungen wird eine Untergrundkorrektur durch Subtraktion eines Blindpräparates vorgenommen. Aufgabe der Software ist es nun, die Zellen selbständig zu erkennen und die Fläche des angefärbten Interleukins in den Zellen sowie die Intensität der Anfärbung zu quantifizieren. Das Programm Optimas kann zusammenhängende Strukturen erkennen und ausmessen. Durch diese Beschränkung auf flächenhafte Bildmerkmale erfolgt eine Fokussierung auf zytokinproduzierende Zellen, da in diesen das Interleukin in den Golgi-Organellen akkumuliert. Hierfür benötigt die Software einen vom Benutzer vorzugebenden Graustufenbereich, welcher über ein Histogramm der Graustufenverteilung der Bildgraphik abgeschätzt werden kann. Das Histogramm der Verteilung der Grauintensitäten drückt das hellste Signal durch die Zahl 0 (weiß) und das dunkelste Signal durch die Zahl 256 (schwarz) 47 aus. Es wird ein unterer Schwellenwert als hellste Graustufe eingegeben, oberhalb derer das Bildanalysesystem die Bildpunkte als Interleukin-DAB-Komplex erkennen soll. Dazu müssen sich die Objekte genügend vom Hintergrund abheben. Durch selektives Löschen von dunkel und scharf begrenzt erscheinenden Verschmutzungen wird eine Beschränkung auf die Bildmerkmale der Interleukinproduktion erreicht. Um den in dieser Auswahl der zu analysierenden Bildmerkmale implizierten subjektiven Parameter zu minimieren, sind Kriterien zur Morphologie der Interleukinspots und zur Intensität ihrer Anfärbung zu beachten [BJÖRK 96]. Dabei stellen sich die Interleukine als charakteristische rundliche Akkumulation in den Golgi-Organellen und dem endoplasmatischen Retikulum perinukleär dar. Dieses fokale intrazelluläre Signal der zytokinproduzierenden Zellen kann von den diffusen membranösen Signalen der zytokinaufnehmenden Zellen unterschieden werden. Optimas kann nach dieser Vorarbeit eine Quantifizierung der Interleukin-DABKomplexe nach Fläche und Intensität vornehmen. Die Ausgabe der Ergebnisse erfolgt in Form von Exportdateien, die durch OLE (Object Linking and Embedding) -Reports verfügbar gemacht werden. Die Ergebnisse in Form objektiver und reproduzierbarer Zahlen können auf diese Weise statistischen Analysen unterzogen werden. In dieser Arbeit wurden pro Patient und Interleukin 200 Zellen ausgezählt und anschließend die Anzahl der angefärbten Zellen zu der Anzahl der insgesamt ausgezählten Zellen ins Verhältnis gesetzt. Außerdem erfolgt die Bestimmung der mittleren Interleukinproduktion pro Einzelzelle. 2.3.5 Statistische Methoden Unterschiede in den Ergebnissen zwischen den einzelnen betrachteten Kollektiven wurden mittels des Mann-Whitney-U-Tests für unverbundene Stichproben (Systat 7.0 für Windows 95, SPSS Inc. in Chicago, USA) geprüft, wobei ein Signifikanzniveau von 5 % zugrunde gelegt wird, d.h. zwei Werte unterscheiden sich signifikant, wenn p < 0,05 ist. 48 Abb. 10a: Bildschirmdarstellung des lichtmikroskopischen Bildes der Lymphozyten, IL-2 markiert Abb. 10b: Bildschirmdarstellung der von Optimas erkannten Strukturen; eine Ausradierung der markierten Verschmutzungen ist noch notwendig. 49 3. Ergebnisse Intention der vorliegenden Arbeit war es, die Interleukine IL-2, IL-5 und IL-10 in peripheren Lymphozyten bei Morbus Crohn und Colitis ulcerosa unter laufender systemischer Steroidmedikation zu untersuchen. Insbesondere werden die Kollektive Morbus Crohn in Remission unter Glukokortikoidmedikation und Morbus Crohn in Remission ohne Glukokortikoide miteinander verglichen. Dabei dienen als Vergleichsgruppe Patienten mit Morbus Crohn in Remission unter Pentasa-Medikation aus einer Studie der Firma Ferring [SOMMERKAMP 99]. Zum weiteren Vergleich der Interleukinproduktion unter Steroideinfluß mit dem jeweiligen Kollektiv ohne Steroidmedikation wird auf die folgenden Arbeiten aus der Arbeitsgruppe verwiesen. Nachdem gezeigt wurde, inwieweit die Glukokortikoidmedikation einen meßbaren Effekt auf die Interleukinproduktion hat, sollen die einzelnen Krankheitsgruppen unter Steroidmedikation miteinander verglichen werden: 1.) Morbus Crohn im akuten Schub und in Remission, 2.) Colitis ulcerosa im akuten Schub und in Remission, 3.) aktiver Morbus Crohn und aktive Colitis ulcerosa sowie 4.) inaktiver Morbus Crohn und inaktive Colitis ulcerosa. Bei der Darstellung der Meßergebnisse wird zuerst die Menge der Einzelzellproduktion des jeweiligen Interleukins anhand der Extinktion und im Anschluß daran der relative Anteil der das entsprechende Interleukin produzierenden Zellen dargestellt. Einer einleitenden graphischen Darstellung der Meßwerte folgt eine statistische Auflistung, wobei die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Meßergebnisse als Mittelwert mit Standardabweichung angegeben werden. Unterschiede zwischen den Mittelwerten der einzelnen betrachteten Kollektive werden als signifikant bezeichnet, wenn p < 0.05 betrug (berechnet nach dem Mann-Whitney-U-Test). Die in den folgenden Diagrammen häufig imponierenden deutlichen Unterschiede der Mittelwerte verlieren aufgrund der hohen Standardabweichungen oft an statistischer Bedeutung (mit ns = nicht signifikant bzw. s = signifikant markiert). 50 3.1 IL-2, IL-5 und IL-10 bei Morbus Crohn (MC) in Remission; Vergleich mit und ohne Glukokortikoide (GC) 0,008 MC inaktiv mit GC 0,007 MC inaktiv ohne GC 0,006 Extinktion 0,005 0,004 s 0,003 ns 0,002 ns 0,001 0,000 1 2 IL5 IL2 ns: nicht signifikant; s: signifikant Abb. 11a: 3 IL10 Extinktionen von IL-2, IL-5 und IL-10 pro Lymphozyt bei Morbus Crohn in Remission; Vergleich mit und ohne Glukokortikoidmedikation 0 ,22 MC inaktiv m it GC 0 ,20 MC inaktiv ohne GC 0 ,18 Rel. Häufigkeit 0 ,16 0 ,14 0 ,12 ns 0 ,10 0 ,08 0 ,06 0 ,04 ns ns 0 ,02 0 ,00 1 2 IL2 IL5 ns: nicht signifikant; s: signifikant Abb. 11b: 3 IL10 Relative Häufigkeiten von IL-2-, IL-5- und IL-10-produzierenden Lymphozyten bei Morbus Crohn in Remission; Vergleich mit und ohne Glukokortikoidmedikation 51 Tab. 5a: Statistik der Extinktionen von IL-2 pro Lymphozyt bei Morbus Crohn in Remission; Vergleich mit und ohne Glukokortikoidmedikation Anzahl Mittelwert Standardabweichung MC inaktiv mit GC 8 0,005 0,0028 MC inaktiv ohne GC 9 0,002 0,0019 => p = 0,03 Tab. 5b: Statistik der relativen Häufigkeiten der IL-2-produzierenden Lymphozyten bei Morbus Crohn in Remission; Vergleich mit und ohne Glukokortikoidmedikation Anzahl Mittelwert Standardabweichung MC inaktiv mit GC 8 0,13 0,076 MC inaktiv ohne GC 9 0,10 0,057 => p = 0,25 Bei Morbus Crohn in Remission zeigt sich eine signifikant höhere IL-2-Konzentation pro Lymphozyt bei bestehender Glukokortikoidmedikation im Vergleich zum fehlenden Steroideinfluß. Auf mögliche Ursachen dieses Ergebnisses wird in der Diskussion näher eingegangen. Die Anzahl der IL-2-bildenden Zellen unterscheidet sich nicht mit oder ohne Glukokortikoide. 52 Tab. 6a: Statistik der Extinktionen von IL-5 pro Lymphozyt bei Morbus Crohn in Remission; Vergleich mit und ohne Glukokortikoidmedikation Anzahl Mittelwert Standardabweichung MC inaktiv mit GC 7 0,002 0,0015 MC inaktiv ohne GC 9 0,001 0,0021 => p = 0,08 Tab. 6b: Statistik der relativen Häufigkeiten der IL-5-produzierenden Lymphozyten bei Morbus Crohn in Remission; Vergleich mit und ohne Glukokortikoidmedikation Anzahl Mittelwert Standardabweichung MC inaktiv mit GC 7 0,05 0,040 MC inaktiv ohne GC 9 0,04 0,024 => p = 0,49 Bezüglich IL-5 zeigt sich zwischen dem Morbus-Crohn-Kollektiv in Remission unter systemischer Steroidmedikation und dem Kollektiv ohne Glukokortikoide im Gegensatz zu IL-2 kein statistisch signifikanter Unterschied. Dennoch läßt sich zumindest tendenziell eine höhere Konzentration von IL-5 pro Lymphozyt unter Kortisoneinfluß messen, ähnlich wie oben für IL-2 beschrieben. Der relative Anteil IL-5-bildender Zellen ist auch hier unabhängig von der Medikation. 53 Tab. 7a: Statistik der Extinktionen von IL-10 pro Lymphozyt bei Morbus Crohn in Remission; Vergleich mit und ohne Glukokortikoidmedikation Anzahl Mittelwert Standardabweichung MC inaktiv mit GC 8 0,003 0,0035 MC inaktiv ohne GC 9 0,0008 0,00054 => p = 0,11 Tab. 7b: Statistik der relativen Häufigkeiten der IL-10-produzierenden Lymphozyten bei Morbus Crohn in Remission; Vergleich mit und ohne Glukokortikoidmedikation Anzahl Mittelwert Standardabweichung MC inaktiv mit GC 8 0,07 0,056 MC inaktiv ohne GC 9 0,02 0,015 => p = 0,09 Der Anteil IL-10-produzierender Zellen bei Morbus Crohn steigt unter Glukokortikoidmedikation deutlich an, wobei allerdings keine statistische Signifikanz erreicht wird. Dennoch ist die Tendenz verglichen mit IL-2 und IL-5 deutlich. Die IL-10-Menge pro Lymphozyt ist unter Steroideinfluß im Mittel deutlich höher als ohne Steroide, wobei jedoch aufgrund stark streuender Werte das Signifikanzniveau nicht erreicht wird. 54 3.2 IL-2, IL-5 und IL-10 bei Morbus Crohn (MC) unter Glukokortikoiden (GC); Vergleich akuter Schub und Remission MC aktiv mit GC 0,010 MC inaktiv mit GC Extinktion 0,008 0,006 ns 0,004 ns 0,002 ns 0,000 1 2 IL5 IL2 ns: nicht signifikant; s: signifikant Abb. 12a: 3 IL10 Extinktionen von IL-2, IL-5 und IL-10 pro Lymphozyt bei Morbus Crohn unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich akuter Schub und Remission 0 ,22 MC aktiv m it GC 0 ,20 MC inaktiv m it GC 0 ,18 Rel. Häufigkeit 0 ,16 0 ,14 ns 0 ,12 0 ,10 0 ,08 0 ,06 0 ,04 ns s 0 ,02 0 ,00 1 2 IL5 IL2 ns: nicht signifikant; s: signifikant Abb. 12b: 3 IL10 Relative Häufigkeiten von IL-2-, IL-5- und IL-10- produzierenden Lymphozyten bei Morbus Crohn unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich akuter Schub und Remission 55 Tab. 8a: Statistik der Extinktionen von IL-2 pro Lymphozyt bei Morbus Crohn unter Glukokortikoiden; Vergleich akuter Schub und Remission Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn aktiv 9 0,007 0,0032 Morbus Crohn inaktiv 8 0,005 0,0028 => p = 0,09 Tab. 8b: Statistik der relativen Häufigkeiten der IL-2-produzierenden Lymphozyten bei Morbus Crohn unter Gkukokortikoidmedikation; Vergleich akuter Schub und Remission Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn aktiv 9 0,17 0,058 Morbus Crohn inaktiv 8 0,13 0,076 => p = 0,44 Unter Glukokortikoidmedikation unterscheiden sich aktiver und inaktiver Morbus Crohn sowohl hinsichtlich der IL-2-Produktion pro Einzelzelle als auch hinsichtlich des Anteils an IL-2-produzierenden Zellen nicht signifikant, wenn auch die IL-2-Bildung pro Lymphozyt im akuten Schub tendenziell erhöht ist. 56 Tab. 9a: Statistik der Extinktionen von IL-5 pro Lymphozyt bei Morbus Crohn unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich akuter Schub und Remission Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn aktiv 9 0,005 0,0033 Morbus Crohn inaktiv 7 0,002 0,0015 => p = 0,10 Tab. 9b: Statistik der relativen Häufigkeiten der IL-5-produzierenden Lymphozyten bei Morbus Crohn unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich akuter Schub und Remission Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn aktiv 9 0,04 0,034 Morbus Crohn inaktiv 7 0,05 0,040 => p = 0,43 Ebenso kann hinsichtlich der IL-5-Produktion unter Steroideinfluß zwischen aktivem und inaktivem Morbus Crohn kein signifikanter Unterschied gemessen werden, obwohl die für IL-2 oben beschriebene Tendenz zur Mehrproduktion der Interleukine pro Lymphozyt im akuten Schub auch bezüglich IL-5 noch zu erkennen ist. 57 Tab. 10a: Statistik der Extinktionen von IL-10 pro Lymphozyt bei Morbus Crohn unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich akuter Schub und Remission Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn aktiv 9 0,002 0,0039 Morbus Crohn inaktiv 7 0,003 0,0035 => p = 0,17 Tab. 10b: Statistik der relativen Häufigkeiten der IL-10-produzierenden Lymphozyten bei Morbus Crohn unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich akuter Schub und Remission Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn aktiv 9 0,01 0,015 Morbus Crohn inaktiv 7 0,07 0,056 => p = 0,01 Unter Steroidmedikation zeigt sich bei Morbus Crohn in Remission gegenüber einem akuten Schub eine signifikante Zunahme des relativen Anteils der IL-10produzierenden Lymphozyten. Demgegenüber ist bei Morbus Crohn in Remission und im akuten Schub die IL-10-Produktion pro Zelle unter Glukokortikoidmedikation nicht signifkant unterschiedlich. 58 3.3 IL-2, IL-5 und IL-10 bei Colitis ulcerosa (CU) unter Glukokortikoiden (GC); Vergleich akuter Schub und Remission 0,035 CU aktiv mit GC 0,030 CU inaktiv mit GC Extinktion 0,025 0,020 ns 0,015 0,010 ns ns 0,005 0,000 1 2 IL5 IL2 ns: nicht signifikant; s: signifikant Abb. 13a: 3 IL10 Extinktionen von IL-2, IL-5 und IL-10 pro Lymphozyt bei Colitis ulcerosa unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich akuter Schub und Remission CU aktiv m it GC 0,20 CU inaktiv m it GC Rel. Häufigkeit 0,15 ns 0,10 ns 0,05 ns 0,00 1 IL2 2 IL5 3 IL10 ns: nicht signifikant; s: signifikant Abb. 13b: Relative Häufigkeiten von IL-2-, IL-5- und IL-10- produzierenden Lymphozyten bei Colitis ulcerosa unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich akuter Schub und Remission 59 Tab. 11a: Statistik der Extinktionen von IL-2 pro Lymphozyt bei Colitis ulcerosa unter Glukokortikoidmedikaton; Vergleich akuter Schub und Remission Anzahl Mittelwert Standardabweichung Colitis ulcerosa aktiv 5 0,009 0,0049 Colitis ulcerosa inaktiv 4 0,008 0,0059 => p = 0,18 Tab. 11b: Statistik der relativen Häufigkeiten der IL-2-produzierenden Lymphozyten bei Colitis ulcerosa unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich akuter Schub und Remission Anzahl Mittelwert Standardabweichung Colitis ulcerosa aktiv 5 0,15 0,043 Colitis ulcerosa inaktiv 4 0,13 0,070 => p = 0,99 Hinsichtlich der IL-2-Produktion kann zwischen Colitis ulcerosa im akuten Schub und in Remission unter Steroideinfluß kein signifikanter Unterschied gemessen werden. 60 Tab. 12a: Statistik der Extinktionen von IL-5 pro Lymphozyt bei Colitis ulcerosa unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich akuter Schub und Remission Anzahl Mittelwert Standardabweichung Colitis ulcerosa aktiv 5 0,016 0,0190 Colitis ulcerosa inaktiv 4 0,007 0,0058 => p = 0,99 Tab. 12b: Statistik der relativen Häufigkeiten der IL-5-produzierenden Lymphozyten bei Colitis ulcerosa unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich akuter Schub und Remission Anzahl Mittelwert Standardabweichung Colitis ulcerosa aktiv 5 0,10 0,040 Colitis ulcerosa inaktiv 4 0,08 0,084 => p = 0,22 Auch bezüglich der IL-5-Produktion kann unter Steroidmedikation zwischen Colitis ulcerosa im akuten Schub bzw. in Remission kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Auf dem oben abgebildeten Säulendiagramm imponiert ein deutliches Überwiegen der Extinktion von IL-5 bei aktiver Colitis ulcerosa gegenüber inaktiver Colitis. Aufgrund der stark streuenden Meßwerte erreicht dies jedoch keine statistische Signifikanz. 61 Tab. 13a: Statistik der Extinktionen von IL-10 pro Lymphozyt bei Colitis ulcerosa unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich akuter Schub und Remission Anzahl Mittelwert Standardabweichung Colitis ulcerosa aktiv 5 0,003 0,0024 Colitis ulcerosa inaktiv 4 0,007 0,0052 => p = 0,18 Tab. 13b: Statistik der relativen Häufigkeiten der IL-10-produzierenden Lymphozyten bei Colitis ulcerosa unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich akuter Schub und Remission Anzahl Mittelwert Standardabweichung Colitis ulcerosa aktiv 5 0,03 0,040 Colitis ulcerosa inaktiv 4 0,06 0,066 => p = 0,39 Anders als bei Morbus Crohn lassen die Meßwerte in der IL-10-Produktion zwischen aktiver und inaktiver Colitis ulcerosa unter Steroideinfluß keine signifikanten Unterschiede erkennen. 62 3.4 IL-2, IL-5 und IL-10 bei aktiven chronisch entzündlichen Darmerkrankungen unter Glukokortikoidmedikation (GC); Vergleich Morbus Crohn (MC) und Colitis ulcerosa (CU) 0,035 0,030 MC aktiv mit GC CU aktiv mit GC Extinktion 0,025 0,020 0,015 0,010 ns ns 0,005 ns 0,000 1 IL2 2 IL5 3 IL10 ns: nicht signifikant; s: signifikant Abb. 14a: Extinktionen von IL-2, IL-5 und IL-10 pro Lymphozyt bei aktiven chronisch entzündlichen Darmerkrankungen unter Glukokortikoiden; Vergleich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa 0 ,25 MC aktiv m it GC CU aktiv m it GC 0 ,20 Rel. Häufigkeit ns 0 ,15 0 ,10 0 ,05 s ns 0 ,00 1 2 IL2 IL5 ns: nicht signifikant; s: signifikant Abb. 14b: 3 IL10 Relative Häufigkeiten von IL-2-, IL-5- und IL-10-produzierenden Lymphozyten bei aktiven chronisch entzündlichen Darmerkrankungen unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa 63 Tab. 14a: Statistik der Extinktionen von IL-2-pro Lymphozyt bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im akuten Schub unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn aktiv 9 0,007 0,0032 Colitis ulcerosa aktiv 5 0,009 0,0049 => p = 0,46 Tab. 14b: Statistik der relativen Häufigkeiten der IL-2-produzierenden Lymphozyten bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im akuten Schub unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn aktiv 9 0,17 0,058 Colitis ulcerosa aktiv 5 0,15 0,043 => p = 0,95 Morbus Crohn und Colitis ulcerosa zeigen im aktiven Stadium unter Behandlung mit Steroiden keine Unterschiede bezüglich der IL-2-Produktion. 64 Tab. 15a: Statistik der Extinktionen von IL-5 pro Lymphozyt bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im akuten Schub unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn aktiv 9 0,005 0,0033 Colitis ulcerosa aktiv 5 0,016 0,0190 p = 0,55 Tab. 15b: Statistik der relativen Häufigkeiten der IL-5-produzierenden Lymphozyten bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im akuten Schub unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn aktiv 9 0,04 0,034 Colitis ulcerosa aktiv 5 0,10 0,040 => p = 0,02 Im Gegensatz zu IL-2 zeigt IL-5 auch unter Glukokortikoideinfluß deutliche Unterschiede zwischen Morbus Crohn und Colitis ulcerosa. So ist bei aktiver Colitis ulcerosa der relative Anteil der IL-5-produzierenden Blutlymphozyten gegenüber aktivem Morbus Crohn signifikant erhöht. Die ebenfalls deutlich erhöhte IL-5-Menge pro Lymphozyt bei Colitis ulcerosa gegenüber Morbus Crohn ist aufgrund der hohen Standardabweichung statistisch nicht relevant. 65 Tab. 16a: Statistik der Extinktionen von IL-10 pro Lymphozyt bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im akuten Schub unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn aktiv 9 0,002 0,0039 Colitis ulcerosa aktiv 5 0,003 0,0024 => p = 0,31 Tab. 16b: Statistik der relativen Häufigkeiten der IL-10-produzierenden Lymphozyten bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im akuten Schub unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn aktiv 9 0,01 0,015 Colitis ulcerosa aktiv 5 0,03 0,040 => p = 0,45 Unter Steroideinfluß unterscheidet sich die IL-10-Produktion im akuten Schub eines Morbus Crohn nicht signifikant vom akuten Schub einer Colitis ulcersa. 66 3.5 IL-2, IL-5 und IL-10 bei inaktiven chronisch entzündlichen Darmerkrankungen unter Glukokortikoidmedikation (GC); Vergleich Morbus Crohn (MC) und Colitis ulcerosa (CU) 0,014 MC inaktiv mit GC 0,012 CU inaktiv mit GC Extinktion 0,010 0,008 0,006 ns 0,004 ns ns 0,002 0,000 1 2 IL2 IL5 ns: nicht signifikant; s: signifikant Abb. 15a: 3 IL10 Extinktionen von IL-2, IL-5 und IL-10 pro Lymphozyt bei inaktiven chronisch entzündlichen Darmerkrankungen unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa MC inaktiv m it GC 0,20 CU inaktiv m it GC Rel. Häufigkeit 0,15 ns 0,10 ns ns 0,05 0,00 1 IL2 2 IL5 3 IL10 ns: nicht signifikant; s: signifikant Abb. 15b: Relative Häufigkeiten von IL-2-, IL-5- und IL-10-produzierenden Lymphozytent bei inaktiven chronisch entzündlichen Darmerkrankungen unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa 67 Tab. 17a: Statistik der Extinktionen von IL-2-pro Lymphozyt bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen in Remission unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn inaktiv 8 0,005 0,0028 Colitis ulcerosa inaktiv 4 0,008 0,0059 => p = 0,61 Tab. 17b: Statistik der relativen Häufigkeiten der IL-2-produzierenden Lymphozyten bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen in Remission unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn inaktiv 8 0,13 0,076 Colitis ulcerosa inaktiv 4 0,13 0,070 => p = 1,0 Morbus Crohn und Colitis ulcerosa zeigen unter Behandlung mit Steroiden in Remission, ähnlich wie im akuten Schub der beiden Erkrankungen, keine Unterschiede bezüglich der IL-2-Produktion. 68 Tab. 18a: Statistik der Extinktionen von IL-5 pro Lymphozyt bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen in Remission unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn inaktiv 7 0,002 0,0015 Colitis ulcerosa inaktiv 4 0,007 0,0058 => p = 0,09 Tab. 18b: Statistik der relativen Häufigkeiten der IL-5-produzierenden Lymphozyten bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen in Remission unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn inaktiv 7 0,05 0,040 Colitis ulcerosa inaktiv 4 0,08 0,084 => p = 0,57 Auch bezüglich der IL-5-Produktion besteht bei Steroidmedikation unter Remissionsbedingungen zwischen Morbus Crohn und Colitis ulcerosa kein signifikanter Unterschied. Dennoch wird tendenziell bei Colitis ulcerosa mehr IL-5 pro Lymphozyt gebildet. Bezogen auf den relativen Anteil an IL-5-produzierenden Zellen läßt sich diese Tendenz nicht feststellen. 69 Tab. 19a: Statistik der Extinktionen von IL-10 pro Lymphozyt bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen in Remission unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn inaktiv 8 0,003 0,0035 Colitis ulcerosa inaktiv 4 0,007 0,0052 => p = 0,31 Tab. 19b: Statistik der relativen Häufigkeiten der IL-10-produzierenden Lymphozyten bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen in Remission unter Glukokortikoidmedikation; Vergleich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Anzahl Mittelwert Standardabweichung Morbus Crohn inaktiv 8 0,07 0,056 Colitis ulcerosa inaktiv 4 0,06 0,066 => p = 0,61 Morbus Crohn und Colitis ulcerosa zeigen im inaktiven Stadium unter Glukokortikoidmedikation bezüglich der IL-10-Produktion keine signifikanten Unterschiede. 70 3.5 Zusammenfassung der Meßergebnisse Im Kollektiv der Patienten mit Morbus Crohn in Remission führt eine systemische Steroidmedikation interessanterweise zu einer signifikanten Zunahme der IL-2Konzentration pro Lymphozyt, und auch die IL-5-Konzentration steigt tendenziell an. Im Gegensatz zu dieser Konzentrationszunahme pro Zelle bleibt der relative Anteil IL2- bzw. IL-5-bildender Zellen unverändert. Demgegenüber nimmt bei Patienten mit inaktivem Morbus Crohn unter Steroidmedikation der relative Anteil IL-10produzierender Zellen deutlich zu, auch wenn hier keine statistische Siginifikanz erreicht wird. Dennoch ist die Tendenz verglichen mit IL-2 und IL-5 deutlich. Es zeigen sich also unter dem Einfluß von systemischer Steroidmedikation im Kollektiv der Patienenten mit Morbus Crohn in Remission gegensätzliche Verhältnisse von IL-2 und IL-5 einerseits und IL-10 andererseits. Zwischen Morbus-Crohn-Patienten im akuten Schub und in Remission besteht unter systemischer Glukokortikoidmedikation bezüglich IL-2 und IL-5 kein signifikanter Unterschied, auch wenn im akuten Schub zumindest eine tendenziell höhere IL-2- und IL-5-Konzentration pro Lymphozyt beobachtet werden kann. Dagegen nimmt bei Erreichen des Remissionsstadiums bei Morbus Crohn der relative Anteil IL-10produzierender Blutlymphozyten signifikant zu. Im Gegensatz zu Morbus Crohn läßt sich bei Colitis ulcerosa unter laufender Steroidmedikation kein Unterschied bezüglich der Interleukine IL-2, IL-5 und IL-10 zwischen akutem Schub und Remissionsstadium feststellen. Im Vergleich der beiden Krankheitsbilder der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen zeigt die Colitis ulcerosa im akuten Schub auch unter Steroideinfluß gegenüber aktivem Morbus Crohn eine signifikante Mehrproduktion an IL-5, wobei diese Erhöhung auch unter Remissionsbedingungen tendenziell noch vorhanden ist. Dagegen ließ sich kein Unterschied in der IL-2- und IL-10-Produktion zwischen den beiden Krankheitsbildern feststellen. 71 4. Diskussion Die in der Literatur vorliegenden Daten über das Zytokinprofil bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen sind zum Teil widersprüchlich. Dies betrifft einerseits die Differenzierung der beiden Krankheitsbilder Morbus Crohn und Colitis ulcerosa bezüglich der Interleukine (Kapitel 1.3.5) und andererseits die Beeinflussung dieser Mediatoren durch eine Glukokortikoidmedikation (Kapitel 1.5.6). Weiterhin wurden bislang nur wenige und auch konträre Aussagen darüber getroffen, ob die unterschiedlichen Zytokinmuster sowie eine eventuelle Glukokortikoidwirkung auf einer Änderung der Anzahl zytokinproduzierender Zellen oder einer Änderung der Zytokinproduktion der Einzelzelle beruhen. 4.1 Einfluß einer Steroidmedikation auf das Zytokinprofil bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen Einige Autoren gehen davon aus, daß es sich beim Morbus Crohn um eine TH1- und bei der Colitis ulcerosa um eine TH2-gewichtete Immunitätslage handelt. So unterstützen FUSS et al. diese Hypothese, indem sie in der Lamina propria für den Morbus Crohn bei verminderter IL-5-Produktion erhöhte IFN-γ-Werte und für die Colitis ulcerosa erhöhte IL-5-Werte zeigten, was auf eine erhöhte Anzahl an TH1bzw. TH2-Zellen zurückgeführt wurde [FUSS 96]. Die IL-5-Dominanz bei Colitis ulcerosa gegenüber Morbus Crohn konnte in der vorliegenden Arbeit in peripheren Lymphozyten auch unter Steroideinfluß bestätigt werden, wobei auch hier die Mehrproduktion von IL-5 im akuten Schub durch einen höheren relativen Anteil an IL-5-produzierenden Lymphozyten bedingt ist. Die zur TH1-Antwort bei Morbus Crohn im Widerspruch stehende verminderte IL-2Produktion stimulierter Zellen wurde von FUSS et al. unter Hinweis auf leicht erhöhte IL-2-Werte bei nicht stimulierten Zellen mit einer chronischen T-Zellaktivierung und somit Erschöpfung der IL-2-Produktion begründet [FUSS 96]. Verschiedene andere Autoren wiesen gerade für den Morbus Crohn eine reduzierte TH1-Antwort in Form einer verminderten IL-2- und INF-γ-Konzentration nach. Diese wurde zum einen auf eine verminderte Produktion pro Zelle [MIURA 85] und zum anderen auf eine Abnahme der CD4+ T-Zellsubpopulation [GIBSON 94] zurückgeführt. 72 Auch MULLIN et al. erwähnen, daß eine stetige in-vivo-Aktivierung von T-Zellen zu einer temporären Refraktärität der IL-2-Synthese bei in-vitro-Aktivierung führen könnte; dennoch konnten diese Autoren - ebenso wie BREESE et al. - für den Morbus Crohn eine gesteigerte IL-2-Produktion nachweisen [MULLIN 92, BREESE 93]. Anzumerken ist, daß bei den Untersuchungen von BREESE, FUSS sowie MULLIN et al. ein Teil der Patienten Steroide erhielt, ohne daß diesen ein Einfluß zugeschrieben wurde [BREESE 93, FUSS 96, MULLIN 92]. In der vorliegenden Arbeit ließ sich unter Glukokortikoidmedikation zwischen Morbus Crohn und Colitis ulcerosa kein Unterschied bezüglich IL-2 ausmachen. Interessanterweise fand sich in dieser Arbeit unter Therapie mit Steroiden bei Patienten mit inaktivem Morbus Crohn ein signifikanter Anstieg von IL-2 pro peripherem Lymphozyt, und auch die IL-5-Konzentration in den Lymphozyten war unter Steroideinfluß tendenziell erhöht. Weiterhin zeigt sich in dem Kollektiv mit den Steroiden eine Zunahme des relativen Anteils an IL-10-bildenden Zellen. ANDUS et al. beschreiben bei aktivem Morbus Crohn unter Steroidmedikation höhere IL-6-Serumlevel als bei aktivem Morbus Crohn ohne Steroidmedikation und führen diese Beobachtung darauf zurück, daß eben die Patienten mit besonders schwerer Krankheit die Steroide erhielten. Mit Erreichen der Remission unter Steroidmedikation nehmen die IL-6-Serumwerte deutlich ab. Dabei gehen die Autoren davon aus, daß die Glukokortikoide teilweise die Synthese von IL-6, teilweise aber auch die Sekretion von IL-6 blockieren [ANDUS 91]. GROSS et al. haben bei der Untersuchung der IL-6Level im Serum von Morbus-Crohn-Patienten keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen Patienten mit und ohne Steroidtherapie festgestellt, weder in Remission noch im akuten Schub [GROSS 92]. Ähnlich wie ANDUS et al. (s.o.) sehen auch GROSS et al. in der Steroidmedikation bei hoher Krankheitsaktivität eine Begründung für die fehlende Korrelation zwischen erhöhten IL-6-Werten und der Krankheitsaktivität bei Morbus Crohn gegenüber einer starken Korrelation zwischen Krankheitsaktivität und Akute-Phase-Proteinen. Denn die hemmende Wirkung von Steroiden führe bei dem kurzlebigen IL-6 gegenüber den längerlebigen Akute-PhaseProteinen schneller zu einem Effekt [GROSS 92]. Dies kann eine Erklärung für die in dieser Arbeit bei beiden Krankheitsbildern unter Steroidtherapie nicht nachweisbaren Unterschiede zwischen akutem Schub und Remission bezüglich IL-2 und IL-5 sein. Demgegenüber zeigte sich bei Morbus Crohn - nicht aber bei Colitis ulcerosa - ein Anstieg von IL-10 in Remission gegenüber einem akuten Schub. 73 Der Einfluß von Steroiden auf die Interleukinproduktion bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen ist also komplex, da in der Regel die Patienten mit aktiver Krankheit auch höher dosiert bzw. länger mit Steroiden therapiert werden. So zeigte sich auch in dem hier untersuchten Kollektiv, daß die Patienten im akuten Schub im Mittel mit höheren Steroiddosen therapiert wurden als die Patienten in Remission. Ein über das Erreichen der Remission hinausgehender Einfluß der Steroide auf die Zytokinsynthese wird von KUCHARZIK und NIEDERAU abgelehnt. Folglich hätte auch die Art der antiinflammatorischen Therapie keinen unterschiedlichen Einfluß auf die Zytokine oder Akute-Phase-Proteine. Diese Thesen bauen auf der Begründung auf, daß erhöhte Aktivitätsindizes mit erhöhten Konzentrationen bestimmter Inter-leukine korrelieren, und daß eine Verbesserung der Klinik durch Steroide oder andere entzündungshemmende Therapien - wie z.B. 5-Aminosalicylsäure - als Folge der niedrigeren Entzündungsaktivität auch die Interleukinspiegel senke [KUCHARZIK 95, NIEDERAU 97]. Die Beurteilung der gemessenen Zytokinkonzentrationen in Hinblick auf ihre Bedeutung für die Krankheitsaktivität ist insofern schwierig, als daß die Aktivitätsindizes als numerischer Ausdruck lediglich einen Teil der Aspekte der Krankheit reflektieren und nicht immer mit dem Entzündungsprozess korrelieren müssen. Weiterhin wurden Resistenzen gegenüber antiinflammatorischen Zytokinen beschrieben [SCHREIBER 95]. Auch können solche Zytokine reaktiv erhöht sein, ohne daß ihre antiinflammatorische Aktivität zur Begrenzung der Entzündung ausreicht. Neben diesem physiologischen reaktiven Anstieg der antiinflammatorischen Interleukine ist nicht auszuschließen, daß es sich bei den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen um eine Dysregulation dieser Zytokine handelt [KUCHARZIK 95]. Steroideinfluß auf IL-2 bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen: Wie oben bereits erwähnt, konnte im Rahmen der in dieser Arbeit durchgeführten Messungen im Kollektiv der Morbus-Crohn-Patienten in Remission insofern ein Einfluß durch Glukokortikoide festgestellt werden, als daß die IL-2-Menge pro Lymphozyt signifikant zunahm. Eine Erklärung für dieses etwas überrachende Ergebnis könnte sein, daß durch Steroide die Ausschleusung von IL-2 aus den Lymphozyten gehemmt wird. Der Anteil an IL-2-bildenden Zellen änderte sich dagegen unter Steroideinfluß nicht. NIEDERAU et al. führten dagegen Serummessungen von IL-2 durch und konnten hier keinen über das Erreichen des Remissionsstadiums hinausgehenden Effekt von Steroiden auf IL-2 feststellen. So 74 nehmen nach diesen Autoren die erhöhten IL-2-Serumwerte sowohl bei Morbus Crohn als auch bei Colitis ulcerosa und die von MUELLER et al. gemessenen erhöhten Werte für IL-2-Rezeptoren bei aktivem Morbus Crohn nach Erreichen der Remission signifikant ab, ohne daß dabei ein signifikanter Einfluß von Steroiden bestünde (NIEDERAU 97, MUELLER 90]. Ebenso beschreiben DOI et al. unter einwöchiger oraler Glukokortikoidtherapie bei Asthmatikern keine Änderung der IL-2-Werte, wobei diese allerdings auch zuvor nicht von der Norm abwichen [DOI 94]. SHER et al. stellten dagegen erniedrigte IL-2-Konzentrationen im intestinalen Gewebe von Patienten mit Morbus Crohn, von denen die Mehrheit Steroide erhielt, gegenüber ähnlichen Bestimmungen ohne Kortikoide fest [SHER 95]. Weiterhin zeigen zahlreiche in-vitro-Untersuchungen eine deutliche Abnahme der IL2-Produktion unter Steroidapplikation [GILLIS 79, SCHLEIMER 84]. Eine Erklärung für die Diskrepanz dieser Ergebnisse könnte sein, daß Steroide zu einer zwar starken, aber nur kurzfristigen, IL-2-Dezimierung führen; ähnlich wie für INF-γ beschrieben [VERHOEF 99]. Glukokortikoide könnten aber auch, wie bereits erwähnt, die zelluläre Ausschleusung von IL-2 hemmen und so zu einer Akkumulation dieses Zytokins in Lymphozyten führen [KERN 88, FUSCHIMI 97], was den hier vorliegenden signifikanten intrazellulären Anstieg von IL-2 unter Steroidmedikation erklären könnte. Weiterhin ist für Patienten mit Morbus Crohn eine signifikante Verminderung der Glukokortikoidsensibiltät der Blutlymphozyten beschrieben worden [FRANCHIMONT 99a]. So kann man eine abgeschwächte Sensibilität der T-Zellen auf Steroide infolge des chronischen Entzündungszustandes mit körpereigenem Streß und konsekutiver Cortisolproduktion annehmen. WALKER et al. wiesen bei steroidresistenten Probanden eine deutlich erhöhte IL-2-Aktivität ohne Kortikoidmedikation nach, welche unter Medikation nur auf Werte entsprechend denen nicht therapierter, steroidsensitiver Probanden abnahm [WALKER 87]. Wie oben bereits beschrieben, fanden BREESE et al. und MULLIN et al. in Darmbiopsien von Patienten mit Morbus Crohn im Gegensatz zu Patienten mit Colitis ulcerosa erhöhte IL-2-Werte, unabhängig von einer Steroidmedikation eines Teiles beider Patientengruppen [BREESE 93, MULLIN 92]. Bei den hier durchgeführten Messungen an peripheren Lymphozyten zeigte sich demgegenüber sowohl bei aktiven als auch bei inaktiven chronisch entzündlichen 75 Darmerkrankungen unter laufender systemischer Steroidmedikation kein Unterschied bezüglich der IL-2-Produktion bei Morbus Crohn bzw. Colitis ulcerosa. Die Tatsache, daß sowohl bei Morbus Crohn als auch bei Colitis ulcerosa bezüglich IL-2 kein signifikanter Unterschied zwischen Remission und akutem Schub besteht, kann darauf hindeuten, daß Cortison, ähnlich wie oben für IL-6 beschrieben, früher zu einer Abnahme der IL-2-Produktion führt, als die Entzündungsaktivität im Körper nachläßt. Ursächlich kann aber auch die bereits erwähnte Tatsache sein, daß die Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im akuten Schub mit etwas höheren Steroiddosen behandelt wurden als die Patienten in Remission. Schwierigkeiten in der Beurteilung einer Steroidmedikation auf die IL-2-Produktion ergeben sich vor allem auch daraus, daß bereits bei gesunden Probanden die Bildung insbesondere von IL-2 in weiten Bereichen variiert. Weiterhin liegen bei chronischen Entzündungszuständen bereits alterierte Lymphozyten infolge stetiger T-Zellstimulation vor. Steroideinfluß auf IL-5 bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen: In der vorliegenden Arbeit konnte bei Morbus Crohn in Remission mit Glukokortikoidmedikation ein tendenzieller Anstieg von IL-5 pro Lymphozyt im Vergleich zum Kollektiv ohne Kortikoide gemessen werden. Ebenso wie oben bereits für IL-2 beschrieben, kann eine mögliche Erklärung hierfür sein, daß durch Steroide die Ausschleusung und somit Wirksamkeit von IL-5 gehemmt wird. In den vorliegenden Messungen bestätigte sich die in der Literatur beschriebene Erhöhung von IL-5 bei aktiver Colitis ulcerosa gegenüber Morbus Crohn auch unter Steroidmedikation, wobei diese Differenz nach Erreichen der Remission weniger ausgeprägt ist. Zwischen aktivem Morbus Crohn und inaktivem Morbus Crohn sowie zwischen aktiver Colitis ulcerosa und inaktiver Colitis ulcerosa zeigten sich in der IL-5-Produktion keine Unterschiede. Dies kann, wie oben bereits erwähnt, einerseits darauf zurückgeführt werden, daß die Steroide bereits vor Abnahme der Entzündungsaktivität zu einer IL-5Reduktion und somit einer Nivellierung der IL-5-Meßwerte zwischen aktiver und inaktiver Krankheit geführt haben. Andererseits wurden die Patienten mit einem akuten Schub auch mit höheren Steroiddosen gegenüber den Patienten in Remission behandelt, so daß es zu einem Angleichen der Meßergebnisse durch hohe Krankheitsaktivität und hohe Steroiddosis einerseits, bzw. niedrige Krankheitsaktivität und niedrge Steroiddosis andererseits, kommt. 76 Steroideinfluß auf IL-10 bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen: Die in dieser Arbeit dargestellten Messungen zeigen in der Gruppe der Morbus-CrohnPatienten in Remission, die Steroide erhalten, eine - allerdings nicht signifikante Zunahme des relativen Anteils IL-10-produzierender Lymphozyten gegenüber der vergleichbaren Gruppe ohne Steroidmedikation. Auch FRANCHIMONT et al. und HODGE et al. beschreiben eine IL-10-Stimulation unter Steroidmedikation [FRANCHIMONT 99b, HODGE 99]. Dagegen lehnen KUCHARZIK und NIEDERAU et al. bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen einen über die allgemeine Beeinflussung der Entzündungsaktivität hinausgehenden speziellen Effekt von Steroiden auf die IL-10-Produktion ab. Diese Autoren haben im akuten Schub im Serum erhöhte IL-10-Werte sowohl bei Morbus Crohn als auch Colitis ulcerosa gemessen, die unabhängig von einer Steroidmedikation mit Abnahme der Aktivitätsindizes zurückgingen [KUCHARZIK 95, NIEDERAU 97]. Dennoch zeigten auch KUCHARZIK et al. unter Behandlung mit Steroiden einen über einige Tage andauernden Anstieg der IL-10-Level, gleichzeitig allerdings auch einen weiteren Anstieg der Aktivitätindizes, und mit Abnahme der Aktivität auch eine Abnahme der IL-10-Level. Die positive Korrelation mit den Aktivitätsindizes wurde als antiinflammatorische Antwort auf das gesteigerte Entzündungsgeschehen interpretiert, die dennoch nicht ausreiche, um pro- inflammatorische Zytokine zu blockieren [KUCHARZIK 95/97]. Auch GELATI et al. stellten fest, daß weder eine einmalige niedrige Dosis Prednisolon (25 mg per os), noch eine fünftägige hochdosiert Methylprednisolontherapie (1000 mg i.v. pro Tag) ausreichen, um zu einer Änderung der IL-10-Produktion zu führen. Allerdings erwägen diese Autoren für erniedrigte Werten von IL-10 unter Steroidmedikation bei Lupus erythematodes, einer weiteren chronisch entzündlichen Erkrankung, sowohl einen direkten Einfluß der Steroide als auch eine IL-10-Dezimierung inflolge verminderter Entzündungsaktivität. Die demgegenüber deutlich gesteigerte IL-10-Freisetzung nach Stimulation wurde auf die teilweise Wiederherstellung einer erschöpften IL-10-Produktion durch Steroide bei chronischem Entzündungszustand zurückgeführt [GELATI 97]. Dieser Effekt könnte eine Erklärung für die differierenden Ergebnisse bezüglich einer Abnahme oder Zunahme von IL-10 sein. Auch die bereits beschriebene Stimulation der IL-10-Produktion bei niedriger Steroidmedikation und Inhibition bei höheren [FRANCHIMONT 99b]. Konzentrationen könnte hierfür eine Erklärung sein 77 Weiterhin steigt unter laufender Glukokortikoidmedikation bei Morbus Crohn - nicht aber bei Colitis ulcerosa - mit Erreichen der Remission gegenüber einem akuten Schub die IL-10-Bildung signifikant an, wobei diese Mehrproduktion hier ausschließlich auf einer Zunahme des relativen Anteils an IL-10-produzierenden Zellen beruht. Es stellt sich die Frage, ob dieser IL-10-Anstieg zur Remission beigetragen hat - eventuell als Wirkungsvermittler von Glukokortikoiden - oder ob sich eine im akuten Schub erschöpfte IL-10-Produktion unter Remissionsbedingungen wieder erholt hat. NIEDERAU et al. beschreiben zumindest keine signifikante Abnahme von IL-10 bei Erreichen der Remission, im Gegensatz zur signifikanten Abnahme der proinflammatorischen Zytokine, und auch nur eine leichte Erhöhung von IL-10 im akuten Schub gegenüber der starken Erhöhung proinflammatorischer Zytokine [NIEDERAU 97]. IL-10 ist ein antiinflammatorisch wirksames Zytokin [KUCHARZIK 97] und kann die Entstehung einer chronisch granulomatösen intestinalen bzw. systemischen Entzündung abschwächen, wobei dieser Effekt bereits durch subtherapeutische Dosen von Dexamethason verstärkt wird [HERFARTH 98]. Nach FRANCHIMONT et al. wirken IL-10 und Glukokortikoide synergistisch, indem IL-10 die Anzahl der Glukokortikoidrezeptoren erhöht [FRANCHIMONT 99b]. Glukokortikoide wiederum führen zu einer gesteigerten Transkription der für IL-10 kodierenden Gene [BARNES 98]. Die in der Literatur teilweise beschriebenen erhöhten IL-10-Werte bei Colitis ulcerosa gegenüber Morbus Crohn konnte unter Glukokortikoidmedikation nicht bestätigt werden. 4.2 Ursachen der Differenzen in den Meßergebnissen Zahlreiche Untersuchungen belegen einen deutlichen Einfluß von Steroiden auf die Zytokinsynthese. Allerdings wurden Glukokortikoideinflüsse auf die Entzündungszellen und ihre Mediatoren bislang hauptsächlich durch in-vitro-Applikation und nur wenig durch in-vivo-Medikation untersucht. Dabei wurden bei den in-vitro- Untersuchungen Steroidkonzentrationen von ungefähr 10-10 mol/l [SCHLEIMER 84] bis 10-4 mol/l Dexamethason [REED 86] eingesetzt. Die Vergleichbarkeit mit in-vivoUntersuchungen wird unter anderem dadurch erschwert, daß hier die wirksamen Konzentrationen freier Glukokortikoide von der Pharmakokinetik mit Resorption und Plasmaproteinbindung abhängen. 78 Unterschiede zwischen in-vivo- und in-vitro-Versuchen können sich auch daraus ergeben, daß in-vitro das Glukokortikoid meist zusammen mit den Stimulatoren der Zyokinsynthese verabreicht wurde, wohingegen die Steroide in-vivo ihre Wirkung auf die Zellen bereits ausüben konnten. Darin ist ein Vorteil der in-vivo-Messung bei Glukokortikoidmedikation zu sehen, da die in-vitro applizierten Kortikoide mit den Stimulatoren der Zytokinsynthese reagieren, bzw. um dieselben Reaktionswege konkurrieren können [ADCOCK 95, ROLFE 92]. Neben der Unterscheidung in-vivo oder in-vitro ist zusätzlich zwischen gesunden und kranken Probanden zu unterscheiden, denn spezielle Effekte der Kortikosteroide können dadurch maskiert werden, daß keine gesunden Kontrollpersonen untersucht werden, sondern Probanden mit vorexistierenden immunologischen Besonderheiten. Somit ist der exogene Steroideinfluß auf die Interleukinsynthese bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen komplex, je nach Entzündungszustand und auch Dauer des Entzündungsgeschehens. Eine Schwierigkeit bei in-vivo-Untersuchungen liegt also darin, daß zwei gegensätzliche Faktoren auf die Entzündungsmediatoren bestehen, nämlich zum einen die Steroidmedikation und zum anderen die Entzündungsaktivität, wegen welcher die Steroidmedikation indiziert ist. Da die Patienten mit schwerer Krankheit also auch vermehrt mit Steroiden therapiert werden, interagieren diese gegensätzlichen Einflüsse meist miteinander. Ähnlich verhält es sich bei der Beurteilung antiinflammatorischer Zytokine, da diese zwar einerseits bei verminderter Produktion zur Entzündung führen können, andererseits aber bei vorliegender Entzündungsaktivität auch reaktiv ansteigen. Weiterhin ist zu berücksichtigen, daß die Patienten neben einer Steroidmedikation meist auch mit 5-Aminosalicylsäure oder Sulfasalazin therapiert werden, die zwar weniger eine immunsuppressive, aber dennoch vielfältige immunmodulierende Wirkungen auch auf Interleukine haben [GAGINELLA 92]. Unterschiedliche Meßergebnisse der Zytokinsynthese unter Glukokortikoidapplikation können zumindest teilweise auf den nicht einheitlichen Differenzierungsgrad der CD4+ T-Zellen zurückgeführt werden, da naive bzw. Gedächtnis-T-Zellen unter Kortikoideinfluß zum Teil gegensätzliche Zytokinmuster zeigen (Abb. 6) [BRINKMANN 95]. Dabei ist zu berücksichtigen, daß nach fünfstündiger Stimulation die zytokinproduzierenden T-Helferzellen zum größten Teil der Gedächtniszellpopulation angehören [SANDER 91]. Auch die Art und Menge der Stimulatoren zur Zytokinproduktion resultiert in unterschiedlichen Ergebnissen [ANDUS 91, FUSS 96, UMLAND 97]. So konnten ANDUS 79 et al. z.B. zeigen, daß nach systemischer Behandlung mit Glukokortikoiden die IL-6Produktion peripherer Zellen nach moderater Stimulation stark gehemmt war, daß nach maximaler Stimulation aber nur noch eine leicht reduzierte IL-6-Bildung festzustellen war. Allgemein wirft die Stimulation von Zellen zur Interleukinproduktion in der Differenzierung aktiver und inaktiver Krankheitszustände Probleme auf. Denn auch bei inaktiver Krankheit liegen voraktivierte Immunzellen vor, die in-vitro zur Bildung immunologischer Mediatoren aktiviert werden können [MUELLER 90]. Dadurch lassen sich z.B. Differenzen zwischen Interleukinmessungen im Serum einerseits und im Überstand oder Zytoplasma isolierter und stimulierter Zellen andererseits erklären. Die unterschiedlichen Untersuchungsmethoden, die an Darmresektaten, Darmbiopsien, Zellkulturen, isolierten Lymphozyten oder direkt im Plasma vorgenommen wurden, tragen ebenso zu verschiedenartigen Ergebnissen bei. In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, daß einige Autoren Studien an peripheren Lymphozyten mit der Begründung ablehnen, daß der Hauptanteil dieser Zellen nicht dem Mukosakompartiment des Darmes angehöre, zumal vor allem bei aktiver Krankheit eine Rekrutierung der T-Lymphozyten in die Darmwand stattfinde [SELBY 84]. Demgegenüber wurde im akuten Schub einen Anstieg zirkulierender Monozyten als Vorläufer der Gewebsmakrophagen beschrieben [MAZLAM 92]. Unter Bezug auf eine gesteigerte Rezirkulation ziehen andere Autroren als Quelle aktivierter Lymphozyten und somit auch der Serumspiegel von Zytokinen Darmlymphozyten in Betracht [GROSS 92, MULLIN 92]. Dennoch spiegeln diese natürlich nicht uneingeschränkt die Veränderungen der Darmschleimhaut mit den hierbei gemessenen Zytokinprofilen in Darmbiopsien oder sogar Darmresektaten wider [NIEDERAU 97]. Beispielsweise wurde jeweils intestinal bei Morbus Crohn die IL-2-mRNA erhöht [MULLIN 92] und bei Colitis ulcerosa die IL-10-mRNA erniedrigt [NIELSEN 96] gemessen im Gegensatz zu unauffälligen Meßergebnissen der mRNA in peripheren Lymphozyten bzw. der Proteine im Serum. In bezug auf die Quelle des zirkulierenden IL-10 bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen werden sowohl periphere mononukleäre Zellen als auch Zellen der intestinalen Mukosa angenommen [KUCHARZIK 95]. 80 4.3 Beurteilung der Methode der intrazellulären Zytokindetektion Wie bei DOLHAIN et al. beschrieben, korreliert die Messung der intrazellulären Zytokinakkumulation in zeitlicher Versetzung sehr gut mit den Messungen zur Zytokinproduktion auf mRNA-Level mit Hilfe der PCR-Technik und ebenso mit den Zytokinbestimmungen auf Proteinniveau in Kulturüberständen mit der ELISA- oder RIA-Technik [DOLHAIN 93]. SANDER et al. haben in ihren Untersuchungen festgestellt, daß die Antikörper, die zu guten Markierungen führten, auch die Bioaktivität der Zyokine kompetent blockieren konnten [SANDER 93]. Somit ist davon auszugehen, daß das intrazellulär sichtbar gemachte Interleukin in Form und Funktion der extrazellulären Form entspricht. Ein Vorteil der quantitativen intrazellulären Interleukindetektion ist darin zu sehen, daß man neben der Anzahl an zytokinproduzierenden Zellen auch eine Aussage über die Interleukinproduktion der Einzelzelle erhält. Bei lediglicher Verwendung der konventionellen Lichtmikroskopie ohne angeschlossene Computerbildanalyse könnte beispielsweise eine vermehrte Synthese der einzelnen Zellen ohne Zunahme der Anzahl synthetisierender Zellen nicht erkannt werden. Dieses Problem hat die Forschergruppe um FUSS et al. dadurch zu lösen versucht, indem sie die Zytokinmessung in Überständen stimulierter Lymphozyten mit einem ELISPOT kombiniert hat [FUSS 96]. Dabei handelt es sich beim ELISPOT um einen EnzymSandwich-Test auf Zellebene, durch welchen sich die Anzahl intrazellulärer Zytokinspots darstellen läßt [HERR 97]. In vergleichbarer Absicht haben BREESE et al. einen Haemolytic-plaque-assay zur Bestimmung des Anteils an IL-2- und IFN-γproduzierenden Zellen mit einem Northern-Blot zur Detektion der exprimierten mRNA kombiniert [BREESE 93]. Das in dieser Arbeit verwendete Prinzip der computergestützten Bildanalyse der intrazellulären Zytokindetektion vereinigt den qualitativen Nachweis zytokinproduzierender Zellen mit einer quantitativen Bestimmung der Zytokinproduktion. Allerdings erhält man keine Aussage über das freigesetzte Zytokin. So sind nach SANDER et al. vor allem dadurch aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten, indem man die Anzahl an zytokinproduzierenden Zellen, die Zytokinproduduktion der Einzelzelle und die freigesetzten Zytokinlevel im Überstand bestimmt und diese Messungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Stimulation durchführt [SANDER 93]. 81 Ein weiterer Vorteil der intrazellulären im Vergleich zur extrazellulären Zytokindetektion liegt in den kürzeren Stimulationszeiten und somit in der Möglichkeit des Verzichts auf Antibiotika mit ihren Interaktionen [DOLHAIN 93]. Besonders im Hinblick auf eine Glukokortikoidwirkung können sich aus der intrazellulären Zytokinmessung allerdings Fehldeutungen ergeben, da die Steroidwirkung auf Interleukine in der Hemmung posttranslationeller Prozesse wie Ausschleusung aus der Zelle bestehen kann [KERN 88, FUSCHIMI 97]. Dadurch kann es intrazellulär zu einer Akkumulation von Zytokinen kommen, welche aber nicht mehr interzellulär wirksam sind. So konnten KERN et al. unter in-vitro-Applikation von Dexamethason intrazellulär im Gegensatz zu extrazellulär nur eine geringe Abnahme der IL-1-Level feststellen [KERN 88], wohingegen SOUSA et al. mit Hilfe der computergestützen Bildanalyse signifikante Abnahmen von IL-1 unter Steroidmedikation messen konnten [SOUSA 97]. In dieser Arbeit zeigte sich unter Glukokortikoiden dagegen sogar eine signifikante Zunahme von IL-2 und zumindest tendenzielle Zunahme von IL-5 pro Lymphozyt bei inaktivem Morbus Crohn. Hier könnte eine Messung von freien Interleukinen zu einer Klärung führen, wobei jedoch, wie bereits oben erwähnt, Interleukine auch durch Interaktion von Zelle zu Zelle wirken und somit extrazellulär nicht meßbar sind. WITTEKIND weist in einem Review über die Standardisierung von Zellanfärbungen besonders auf die Notwendigkeit einer solchen Standardisierung in Hinblick auf die computerisierte Zellmustererkennung hin. Ein Bildanalysesystem kann nicht zwischen zufälligen oder spezifischen Markierungen unterscheiden, und es kann nur die Informationen objektiv und reproduzierbar verarbeiten, die ihm angeboten werden [WITTEKIND 85]. 82 5. Zusammenfassung und Ausblick Die Erforschung der Zytokine bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen hat zum Ziel, weitere Hinweise in der Pathogenese zu erhalten, und auf diese Weise eine Basis für die gezielte Entwicklung neuer Therapien zu schaffen. Die Herausforderung besteht darin, Faktoren zu ermitteln, welche bei Morbus Crohn bzw. Colitis ulcerosa über- oder auch unterexprimiert sind und dadurch zur Pathogenese der Erkrankung beitragen. Eine Modulation solcher Faktoren könnte in einer Stärkung schützender Wirkungen durch Applikation antiinflammatorischer Zytokine oder in einer Blockade von Rezeptoren für inflammatorische Zytokine bestehen [JÄRNEROT 98, KUCHARZIK 97, VAN HOGEZAND 96]. Da allerdings viele Mediatoren sowohl schützende als auch pathogene Effekte vermitteln und es sich immer um ein Netzwerk von Wirkungen handelt, ist die Bestimmung einer einzelnen inhibitorischen oder zu inhibierenden Substanz schwierig. Aus diesem Grund sind vor allem die Glukokortikoide so effektiv, denn sie greifen an vielen verschiedenen Stellen der Immunkaskade inklusive der Interleukinproduktion an. Da es sich also bei den Glukokortikoiden bislang um die wirksamste Therapie zur Überführung eines akuten Schubs in die Remission handelt, ist es von Vorteil, möglichst detaillierte Einblicke in ihre Wirkmechanismen zu erhalten. Auf diese Weise können dann Wirkstoffe zum Einsatz kommen, die gezielt die positiven Wirkungen der Glukokortikoide vermitteln, ohne mit den zahlreichen Nebenwirkungen einer Glukokortikoidtherapie belastet zu sein. Verschiedene Autoren ziehen darüber hinaus die Zytokindetektion als Möglichkeit eines Monitoring einer Glukokortikoidmedikation in Betracht [BRYNSKOV 92b, JUNG, ZABEL 90]. In dieser Arbeit fand sich ein weiterer Hinweis für die in der Literatur beschriebene Wirkungsvermittlung der Glukokortikoide über das antiinflammatorisch wirkende IL-10. So wurden bereits Untersuchungen mit IL-10 als Einlauf unternommen, wobei hier sowohl lokal im Darm, als auch systemisch im Blut eine Verminderung proinflammatorischer Zytokine gezeigt werden konnte [SCHREIBER 95]. Neue immunmodulatorische Therapien mit rekombinanten Zytokinen wie IL-10 und Zytokin-Antikörpern wie anti-TNF-α sind also vielversprechend [HERESBACH 99, JÄRNEROT 98, ROBINSON 98]. 83 6. Literaturverzeichnis • Adcock IM, Brown CR, Gelder CM, Shirasaki H, Peters MJ, Barnes PJ: Effects of glucocorticoids on transcription factor activation in human peripheral blood mononuclear cells. In: Am. J. 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Erklärung Hiermit versichere ich, daß ich diese Dissertation selbständig und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt, nur die angegebenen Quellen benutzt und die den benutzten Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe. Diese Arbeit hat in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner anderen Prüfungsbehörde vorgelegen. Frankfurt a.M., im Januar 2001 Lebenslauf Persönliche Daten Name Geburt Familienstand Anja Engel, geb. Neumann 05.04.1972 in Ingolstadt verheiratet Schulbildung Mai 1991 Abitur am Gymnasium Fallersleben Berufsausbildung 1991 - 1993 Studium 1993-2000 30.08.1995 29.08.1996 25.03.1999 15.05.2000 Famulaturen 1996 - 1998 PJ April 1999 - August 1999 August 1999 - November 1999 November 1999 - März 2000 AIP seit 01.07.2000 Frankfurt a.M., Januar 2001 Ausbildung zur biologisch-technischen Assistentin an der Berufsfachschule Heinemann in Braunschweig Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum Physikum 1. Staatsexamen 2. Staatsexamen 3. Staatsexamen Gynäkologie am Oshakati-State-Hospital / Namibia, weitere Famulaturen in Gastroenterologie und Kardiologie, Neurologie, Anästhesie und Dermatologie Neurologie am Knappschaftskrankenhaus Bochum-Langendreer, Prof. Dr. Gehlen Innere Medizin am Knappschaftskrankenhaus Bochum-Langendreer, Prof. Dr. Schmiegel Chirurgie am Knappschaftskrankenhaus Bochum-Langendreer, Prof. Dr. Büsing Städtische Kliniken Frankfurt a.M.-Höchst, Innere Medizin, Gastroenterologie, Prof. Dr. Haag
