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DISS. ETH NO. 22696 Phospholipid Hydroperoxide Scavenger Glutathione Peroxidase 4 in the Immune System A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH Presented by Mai Matsushita MSc Kobe University Born on November 21,1983 Citizen of Japan Prof. Dr. Manfred Kopf, examiner Prof. Dr. Sabine Werner, co-examiner Prof. Dr. Georg W. Bornkamm, co-examiner 2015 ABSTRACT 4 ABSTRACT The classical view of reactive oxygen species (ROS) production has long been associated as harmful byproducts of intrinsic oxygen metabolism or cellular responses to hazardous stimuli. Indeed, accumulation of ROS and the consequent oxidative stress have been implicated in a number of pathologies, including neurodegenerative diseases, cancer, diabetes and aging. However, with increasing evidence suggesting that ROS participates in a wide range of biological functions, it is becoming increasingly appreciated that the production and detoxification of ROS is a regulated process. ROS production is not unique in the immune system. They participate in the effector function for host defense, a well-known mechanism of phagocytosis in innate immunity. However, ROS production is not limited to the action of pathogen elimination, other cell types in the immune system also produce ROS for cellular function or as secondary signaling products. In spite of these recent advances in understanding the role of ROS production in immunology, the knowledge of how ROS is neutralized still remains imprecise. In the current study, we focused on the detoxification of lipid hydroperoxides in the immune system. The selenoenzyme glutathione peroxidase 4 (Gpx4) represents one of the major scavengers of phospholipid hydroperoxides. Yet, the underlying molecular mechanism by which Gpx4 functions in the immune system has been undefined. As global Gpx4 knockout mice are embryonically lethal, we generated respective cell type-specific conditional knockout mice that specially lack the expression of Gpx4 in dendritic cells, neutrophils and macrophages of the innate immunity and T cells of the adaptive immunity. Our findings revealed that the selective disruption of Gpx4 in myeloid 5 ABSTRACT cells did not affect the homeostasis, growth and proliferation, indicating that Gpx4 is dispensable for myeloid cell development. These cells were also fully functional, as they were able to secrete pro-inflammatory cytokines after TLR stimulation, which correlated with sustainable clearance of L. monocytogenes and L. major. In contrast to myeloid cells, absence of Gpx4 in T cells revealed a defect in maintaining homeostatic balance in the periphery, especially of naïve CD8+ T cells. Reconstitution analysis of mixed bone marrow chimera further confirmed an intrinsic defect in both CD4+ and CD8+ T cell survival in the periphery. These cells rapidly accumulated lipid peroxides driven by ferroptotic cell death in vitro. Furthermore, Gpx4 was identified as a necessary enzyme for primary T cell response to infections, as Gpx4 deficient T cells failed to expand and protect against lymphocytic choriomeningitis virus and L. major. The impaired virusspecific CD8+ T cells were rescued upon diet supplementation with high concentrations of lipophilic antioxidant vitamin E, suggesting that activated T cells are susceptible to phospholipid hydroperoxide accumulation in the absence of Gpx4. More notably, inducible depletion of Gpx4 during the secondary memory response to viral infection displayed fully functional memory T cells, indicating that the lipid peroxidation occurs during primary but not secondary infections. Together these findings revealed that neutralization of lipid hydroperoxides by Gpx4 is an essential process for T cell homeostasis and effector functions. ZUSAMMENFASSUNG 6 ZUSAMMENFASSUNG Die klassische Sichtweise, dass reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bloss schädliche Nebenprodukte darstellen, welche durch intrinsische, aerobe metabolische Prozesse oder als zelluläre Reaktion auf gefährliche Substanzen generiert werden, hatte für lange Zeit Bestand. Tatsächlich wird die Anreicherung von ROS und der damit einhergehende oxidative Stress mit einer Reihe von pathologischen Prozessen wie etwa neurodegenerativen Erkrankungen, Krebs, Diabetes oder dem Altern in Verbindung gebracht. Neuere Ergebnisse legen jedoch den Schluss nahe, dass ROS in der Regulation einer Vielzahl von biologischen Prozessen involviert sind und dass sowohl deren Produktion als auch deren Entgiftung starken regulatorischen Mechanismen unterliegen. Die Produktion von ROS ist nicht nur auf Zellen des Immunsystems beschränkt sondern findet ubiquitär im gesamten Organismus statt. Diese reaktiven Sauerstoffspezies repräsentieren aber eine integrale Komponente des angeborenen Immunsystems wo sie der Eliminierung von phagozytierten Mikroben dienen. Darüber hinaus übernehmen sie eine wichtige Funktion in zellulären Signaltransduktionskaskaden. Trotz der jüngsten Fortschritte im Feld der ROS-Biologie liegen die Mechanismen der Neutralisierung dieser hochreaktiven Substanzen im Kontext des Immunsystems immer noch weitestgehend im Dunklen. In der vorliegenden Studie haben wir uns deshalb auf die Entgiftung von Lipidperoxiden im Immunsystem fokussiert. Das Selenoenzym Glutathionperoxidase 4 (Gpx4) stellt eines der wichtigsten Entgiftungsenzyme für Phospholipidhydroperoxide dar. Da globale Gpx4 Knock-out Mäuse keine überlebensfähigen Nachkommen produzieren können haben wir zelltyp- 7 ZUSAMMENFALSSUNG spezifische Knock-out Mäuse generiert, denen Gpx4 gezielt in dendritischen Zellen, Neutrophilen und Makrophagen oder T-Zellen fehlt. Unsere Resultate zeigen, dass selektives Entfernen von Gpx4 in myeloiden Zellen weder zelluläre Homöostase, noch Wachstum oder Proliferation stört und dass es entbehrlich für deren Entwicklung zu sein scheint. Gpx4 defiziente myeloide Zellen waren darüber hinaus funktionsfähig, wie sich sowohl durch eine ungestörte Zytokinantwort auf TLR Stimulation als auch durch eine unbeeinträchtigte Eliminierung von L. monocytogenes und L. major gezeigt hat. Im Gegensatz dazu resultierte die T-Zell spezifische Absenz von Gpx4 in einer gestörten homöostatischen Balance in der Peripherie, speziell in naiven CD8 T-Zellen. Rekonstitutionsanalysen von gemischten Knochenmarkschimären bestätigten einen intrinsischen Defekt im Überleben von CD4 und CD8 T-Zellen in der Peripherie. In vitro führte ferroptotischer Zelltod ausserdem zu einer schnellen Anreicherung von Lipidperoxiden in diesen Zellen. Des Weiteren war Gpx4 essentiell für eine intakte primäre Immunantwort von CD8 T-Zellen, wie sich sowohl durch eine verminderte Expansion als auch durch einen abgeschwächten Schutz von Gpx4 defizienten T-Zellen nach Infektionen mit dem Lymphozytären-Choriomeningitis-Virus oder L. major zeigte. Die beeinträchtigte Immunantwort von virus-spezifischen CD8 T-Zellen konnte durch eine hochdosierte, Vitamin E supplementierte Diät neutralisiert werden, was auf eine Anfälligkeit von Gpx4 defizienten, aktivierten T-Zellen auf die Akkumulation von Hydroperoxiden hinweist. Interessanterweise war die Funktionalität von TGedächtniszellen nach induzierter Ablation von Gpx4 während einer sekundären Immunantwort gegen eine virale Infektion völlig normal, was impliziert, dass Lipidperoxidation hauptsächlich als Reaktion auf eine primäre, nicht aber sekundäre Infektion auftritt. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die ZUSAMMENFALSSUNG 8 Neutralisierung von Lipidhydroperoxiden durch Gpx4 ein essentieller Prozess, sowohl für die Homöostase, als auch für die Effektorfunktion von T-Zellen darstellt.
