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Aus der Abteilung Virologie des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Rolle der Fenton-Reaktion für die Wasserstoffperoxid-induzierte Apoptose Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 2006 von Cordula Meincke, geb. Hahn geboren in Witten Dekan: Prof. Dr. med. Christoph Peters 1. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Georg Bauer 2. Gutachter: PD Dr. med. Oliver Opitz Jahr der Promotion: 2006 meinen Eltern Inhaltsverzeichnis 1 2 Einleitung ........................................................................................................................... 1 1.1 Apoptose - ein Überblick ............................................................................................ 1 1.2 Auslösung der Apoptose ............................................................................................. 2 1.3 Interzelluläre Apoptoseinduktion durch Reaktive Sauerstoffspezies (Reactive oxygen species) und Reaktive Stickstoffspezies (Reactive nitrogen species) ............ 3 1.4 Intrazelluläre Apoptoseinduktion durch interzelluläres ROS- und RNS-Signalling .. 8 1.5 Geschichte der Fenton-Reaktion ................................................................................. 9 1.6 Zielsetzung ................................................................................................................ 12 Material und Methoden .................................................................................................... 13 2.1 2.1.1 Zelllinien .......................................................................................................... 13 2.1.2 Reagenzien ....................................................................................................... 13 2.1.3 Kulturmedium, Stammlösungen und Puffer.................................................... 16 2.1.4 Kunststoffmaterial ............................................................................................ 18 2.1.5 Geräte und Sonstiges ........................................................................................ 18 2.2 3 Material ..................................................................................................................... 13 Methoden................................................................................................................... 19 2.2.1 Zellkultivierung im Monolayer ........................................................................ 19 2.2.2 Bestimmung von Zellzahlen............................................................................. 20 2.2.3 Aussaat von Zellen ........................................................................................... 20 2.2.4 Einfrieren von Zellen ....................................................................................... 20 2.2.5 Auftauen von Zellen......................................................................................... 21 2.2.6 Ermittlung der Apoptoserate ............................................................................ 21 2.2.7 Statistik............................................................................................................. 23 Ergebnisse ........................................................................................................................ 24 3.1 Zielsetzung ................................................................................................................ 24 3.2 Effekte von DFO (Desferrioxamin) auf transformierte und nicht-tranformierte Fibroblasten............................................................................................................... 24 3.2.1 Empfindlichkeit von 208F / 208F src3 Zellen auf verschiedene DFO (Desferrioxamin) Konzentrationen .................................................................. 24 3.2.2 Ist der toxische Effekt von DFO auf den Entzug von Fe2+/Fe3+ zurückzuführen?............................................................................................... 26 3.2.3 Beruht die toxische Wirkung von DFO auf einer über ROS (reactive oxygen species) induzierten Apoptose?........................................................................ 29 3.2.4 Verstärkung der DFO - induzierten Apoptose durch TGF-β ........................... 31 3.3 Mechanismus der Apoptoseinduktion durch H2O2 ................................................... 34 3.3.1 Sensitivität von 208F /208F src3 Zellen auf H2O2 ........................................... 34 4 3.3.2 Wie wirkt DFO auf die von direkt hinzugegebenem H2O2 induzierte Apoptose? .......................................................................................................................... 36 3.3.3 Läuft die Apoptoseinduktion durch höhere H2O2 Konzentrationen Eisenunabhängig ab?................................................................................................. 38 3.3.4 Verstärkt FeCl2 die Apoptoseinduktion durch Wasserstoffperoxid? ............... 44 3.3.5 Ist die Hemmung der H2O2-induzierten Apoptose durch DFO nach Zugabe eines Eisensalzes aufgehoben?......................................................................... 48 3.3.6 Wird die H2O2 induzierte Apoptose über ROS (reactive oxygen species) vermittelt? ........................................................................................................ 51 Diskussion ........................................................................................................................ 56 4.1 Mechanismus der Apoptoseinduktion durch Wasserstoffperoxid ............................ 56 4.2 Rolle der Fenton-Reaktion für die durch Wasserstoffperoxid induzierte Apoptose. 64 4.3 Auslösung der Apoptose durch DFO (Desferrioxamin) ........................................... 68 4.4 Klinische Relevanz der Ergebnisse ........................................................................... 75 5 Zusammenfassung............................................................................................................ 76 6 Literaturverzeichnis.......................................................................................................... 77 7 Danksagung...................................................................................................................... 86 8 Lebenslauf ........................................................................................................................ 87 Abkürzungen Abkürzungen - ·O2- Superoxidanion - ·OH Hydroxylradikal - ABH 4-Aminobenzoyl-hydrazide - Apo Apocynin - CaCl2 Kalziumchlorid - Cl- Chlorid-Ion - DFO Desferrioxamin - DMTHU Dimethylthiourea - Fe2+ 2-wertiges Eisenion 3+ - Fe 3-wertiges Eisenion - FeCl2 Eisen-(II)-chlorid - H2O2 Wasserstoffperoxid - HOCl hypochlorige Säure - KCl Kaliumchlorid - Man Mannitol - MgCl2 Magnesiumchlorid - MnTMPyP Mn(II)tetrakis(1-Methyl-4-pyridyl)porphyrin Pentachloride - MPO Myeloperoxidase-analoges Enzym - NaCl Natriumchlorid - ONOO- Peroxynitrit - ROS „reactive oxygen species“ - RNS „reactive nitrogen species“ - SOD Superoxiddismutase - Tau Taurin - Ter Terephthalat - TGF-β transforming growth factor-β1 -æ Symbol für den jeweiligen Kontrollversuch der Versuchsserien in den Abbildungen -1- Einleitung 1 Einleitung 1.1 Apoptose - ein Überblick In der Natur unterscheidet man zwei verschiedene Formen des Zelltodes: Nekrose und Apoptose. Als Nekrose bezeichnet man einen Zelltod, der durch äußere Einflüsse wie zum Beispiel durch mechanische Verletzungen ausgelöst wird. Morphologisch ist bei der Nekrose ein Anschwellen der Zelle zu beobachten, anschließend erfolgt die Zerstörung der Zellmembran und es kommt zur Freisetzung des Zytosols und der Zellorganellen in den Interzellulärraum. Der Nekrose folgt eine Entzündungsreaktion des umliegenden Gewebes. Im Gegensatz zur Nekrose handelt es sich bei der Apoptose (auch altruistischer Zelltod genannt) um einen physiologischen Prozess, bei dem Zellen sich aktiv über ein genetisch gesteuertes Programm selber eliminieren, man spricht daher auch vom so genannten „programmierten Zelltod“. Morphologisch läuft die Apoptose in verschiedenen Stadien ab: zunächst schrumpfen Zellkern und Cytoplasma, währenddessen löst die Zelle sich von den Nachbarzellen ab, es folgt eine Verdichtung und danach eine Zerstückelung des Chromatins. Im Folgenden ist die Bildung von Ausstülpungen und Bläschen an der Cytoplasmamembran zu beobachten, die sich schließlich als membranumschlossene Vesikel – sogenannte „apoptotic bodies“ von der Zelle abschnüren. Diese apoptotischen Körperchen werden von den Nachbar- und Fresszellen phagozytiert und somit ohne lokale Entzündungsreaktion eliminiert. Die Morphologie der Apoptose wurde 1972 erstmals detailliert durch Kerr et al. beschrieben, gleichzeitig führten Kerr et al. auch den Begriff der Apoptose ein. Für vielzellige Organismen ist die Apoptose ein lebensnotwendiger Prozess, der es ermöglicht, nutzlos gewordene, infizierte und potentiell maligne Zellen zu eliminieren. Bereits während der Embryogenese spielt der gezielte apoptotische Tod bestimmter Zellen eine wichtige Rolle. Beispielsweise sterben durch Apoptose die Zellen in den Fingerzwischenräumen ab, wodurch sich erst die endgültige Form der Hände ausbilden kann. Nach dem gleichen Mechanismus verschwindet der Schwanz der Kaulquappe bei der Reifung zum erwachsenen Frosch. Auch bei der Regulation der Zellzahl übernimmt der altruistische Zelltod eine bedeutende Funktion. Gewebe wie das Darmepithel oder die oberen Hautschichten erneuern sich ständig, nur durch ein reguliertes Gleichgewicht zwischen Mitose und Apoptose kann die Gewebehomöostase bestehen bleiben. -2- Einleitung Eine Fehlregulation der Apoptose kann jedoch zahlreiche Erkrankungen auslösen. Eine zu hohe Apoptoserate kann beispielsweise zu einer Colitis ulcerosa oder zu einem Myokardinfarkt führen, wohingegen eine zu niedrige Apoptoserate Autoimmunerkrankungen oder solide Tumore hervorrufen kann. 1.2 Auslösung der Apoptose Unterschiedliche Ursachen können Zellen dazu veranlassen, ihr Apoptoseprogramm einzuleiten. Der Entzug von Überlebensfaktoren, Signale über Apoptoserezeptoren und Zellschädigender Stress wirken dabei als Pro-apoptotische Stimuli (Jarpe et al. 1998). Auf molekularer Ebene fungieren die Caspasen als Schlüsselkomponenten des Selbstzerstörungsprogramms. Neben Caspase-abhängigen Signalwegen der Apoptose existieren zwar auch noch andere, Caspase-unabhängige Apoptosewege (Candé et al., 2002; Philchenkov, 2004; Belmokhtar et al., 2003), diese scheinen jedoch nur eine untergeordnete Rolle zu spielen. Bei Caspasen handelt es sich um Proteasen mit einem Cystein im aktiven Zentrum. Sie spalten ihre Substrate hinter einem Aspartatrest, daher leitet sich auch ihr Name „Caspase“ ab. Derzeit sind 14 verschiedene Caspasen bei Säugetieren bekannt, wobei 12 davon beim Menschen nachgewiesen werden konnten. In der Zelle liegen die Caspasen als inaktive Vorläuferproteine (Procaspasen) vor, die erst durch die Abspaltung einer Untereinheit aktiviert werden. Nach der Induktion der Apoptose aktivieren sich die Caspasen in einer komplexen Enzymkaskade gegenseitig und erreichen dadurch eine lawinenartige Verstärkung des initialen Signals. Einige Autoren unterteilen die Caspasen in Initiatorcaspasen und Effektorcaspasen, wobei manche Initiatorcaspasen zusätzlich auch die Funktion von Effektorcaspasen übernehmen können. Die Initiatorcaspasen, zu denen unter anderem die Caspasen 2, 8, 9 und 10 gehören, sind hauptsächlich für die Verstärkung des apoptotischen Signals verantwortlich, indem sie andere Caspasen aktivieren. Die Effektorcaspasen (Caspase 3, 6, 7) stehen hingegen am Ende der Kaskade und haben die Funktion Struktur- und Steuerproteine zu zerschneiden (Adams 2003). Die Kaskade der Caspasen kann über zwei verschiedene Signalwege ausgelöst werden: einerseits über den Rezeptor-vermittelten Weg, der auch als „extrinsic pathway“ bezeichnet wird, oder andererseits über den Mitochondrien-abhängigen Weg, der auch als „intrinsic pathway“ bezeichnet wird. Derzeit sind 8 verschiedene Todesrezeptoren bekannt, die das Signal der Apoptose übermitteln können, Fas (CD95, Apo-1) ist dabei der bisher am Besten charakterisierte -3- Einleitung Rezeptor. Bindet Fas Ligand (FasL) oder ein agonistischer Antikörper an den Rezeptor, so wird intrazellulär am Rezeptor ein Multiprotein-Komplex aufgebaut, der aus dem Rezeptor, dem Adapter (FADD) und der Procaspase-8 besteht. Dieser Komplex wird auch als DISC (death inducing signaling complex) bezeichnet. Sobald sich der DISC gebildet hat, wird die im DISC integrierte Procaspase-8 durch auto-protolytische Spaltung aktiviert und bringt dann über die Aktivierung der Caspase-3 die Caspase-Kaskade sowie die Proteolyse von zellulären Substanzen in Gang (Rossi et al. 2003; Philchenkov 2004). Alternativ kann die Caspase-Kaskade auch über einen Mitochondrien-abhängigen Weg angeschaltet werden. Durch einen Stimulus kommt es zum Ausstrom von Cytochrom c aus dem Mitochondrium. Im Zytosol fügen sich Cytochrom c, Apaf-1, Procaspase-9 und ATP zu einem Supermolekülkomplex zusammen, der als „Apoptosome“ bezeichnet wird (Hill et al.,2003). Durch die Zusammenlagerung zu diesem Molekül wird die Procaspase-9 aktiviert um nun selber die Caspasen -3 und -7 zu aktivieren. Dieser Signalweg wird durch Bcl-2 und einige andere Mitglieder der Bcl-2 Familie blockiert (Hill et al., 2003; Philchenkov 2004, Adams 2003). Der Fas-abhängige-Signalweg ist eng mit dem Mitochondrien-abhängigen Signalweg verbunden. Nachdem die Protease-8 durch Bildung des DISC aktiviert wurde, spaltet sie ein kleines Protein namens Bid. Die enzymatisch aktivierte Form von Bid, auch tBid genannt, veranlasst am Mitochondrium über ein weiteres Protein einen Ausstrom von Cytochrom c und leitet damit den Mitochondrien-abhängigen Signalweg der Apoptose ein. Vom jeweiligen Zelltyp hängt es ab, ob der Todesrezeptor-Signalweg Mitochondrien-unabhängig oder Mitochondrien-abhängig und damit durch Bcl-2 und Bcl-xL blockierbar, abläuft (Hill et al. 2003; Scaffidi et al. 1998; Rossi et al. 2003). 1.3 Interzelluläre Apoptoseinduktion durch Reaktive Sauerstoffspezies (Reactive oxygen species) und Reaktive Stickstoffspezies (Reactive nitrogen species) Durch Parchment et al. und Pierce et al. konnte 1991 gezeigt werden, dass H2O2 einen Apoptose-induziernden Effekt auf Blastozysten ausübt, wodurch bestätigt wurde, dass ROS eine wichtige Rolle bei der Einleitung des programmierten Zelltods spielen. Seither konnte in vielen physiologischen und pathologischen Vorgängen ROS-vermittelte Apoptose nachgewiesen werden. So sind beispielsweise der Mechanismus des Verschwindens des Kaulquappenschwanzes bei der Reifung zum erwachsenen Frosch (Hanada et al., 1997) aber -4- Einleitung auch Erkrankungen wie die bakterielle Meningitis (Leib et al., 1996) und die Atheriosklerose (Dimmeler et al., 1997) auf ROS-abhängige Apoptose zurückzuführen. Auch an der Umsetzung von natürlichen Tumorabwehrstrategien sind ROS als entscheidende Signalmoleküle beteiligt. So konnten Jürgensmeier et al., 1994 und Bauer 1996 nachweisen, dass transformierte Fibroblasten selektiv durch ihre nicht-transformierten Nachbarzellen über ROS-vermittelte Apopotse eliminiert werden (Jürgensmeier et al., 1994; Bauer 1996). Diese Erkenntnisse führten zur Entwicklung eines Modells der inter- und intrazellulären Apoptoseinduktion über ROS und RNS (reactive nitrogen species), das im Folgenden näher vorgestellt werden soll. Transformierte Zellen zeichnen sich durch die Bildung von O2- an ihrer Zellmembran und durch die Sekretion von TGF-β aus. Beide Substanzen sind essentiell für die Aufrechterhaltung des transformierten Phänotyps der sezernierenden Zelle. Verantwortlich für die Synthese von O2- ist dabei eine in der Zytoplasmamembran befindliche NADPH-Oxidase ( Irani et al., 1997; Suh et al., 1999). Über eine autokrine Rückwirkung auf die transformierte Zelle bewirken die O2--Radikale die Aufrechterhaltung des transformierten Phänotyps (Yan et al., 1996; Irani et al., 1997). Der von den transformierten Zellen sezernierte Wachstumsfaktor TGF-β trägt ebenfalls über eine autokrine Rückkopplungsschleife dazu bei, den transformierten Status der Zelle zu wahren (Wehrle et al., 1994). TGF-β besitzt jedoch nicht nur eine autokrine Wirkung auf transformierte Zellen, sondern wirkt auch auf benachbarte, nicht-transformierte Zellen, die durch TGF-β zur Produktion und Sekretion von NO und einer Peroxidase, die enzymatisch analog zu Myeloperoxidase ist, angeregt werden und dadurch die interzelluläre Apoptose der transformierten Zelle einleiten (Bauer 2000). NO diffundiert als relativ stabiles Molekül unter anderem an die Zellmembran transformierter Zellen, wo es mit den sezernierten O2--Anionen zu Peroxynitrit reagiert (Saran et al., 1990). Peroxynitrit ist ein Molekül, das als starkes Oxidans Lipidperoxidation hervorrufen kann (Radi et al., 1991; Darley-Usmar et al., 1992). Da Superoxidanionen als hochreaktive, kurzlebige Moleküle nur einen sehr begrenzten Diffusionsweg von wenigen µm zurücklegen können (Saran and Bors, 1994) findet diese Reaktion spezifisch nur in unmittelbarer Nachbarschaft der Zellmembran von transformierten Zellen statt, da dort die Superoxidanionen gebildet werden. Superoxidanionen kommt somit eine Schlüsselfunktion in der selektiven Apoptose zu (siehe Abb. 1.3a). Durch Experimente in denen SIN-1, ein NO-Donor der neben NO auch Superoxidanionen freisetzt, konnten Heigold et al., 2002 und Ivanovas et al., 2002 nachweisen, dass Peroxynitrit -5- Einleitung selbst sowohl in transformierten als auch in nicht transformierten Zellen Apoptose induziert. NO alleine ist jedoch nicht in der Lage, Lipidperoxidation hervorzurufen, sondern benötigt immer Superoxidanionen um indirekt über Peroxynitrit Apoptose zu induzieren. Da Superoxidanionen nur an der Zellmembranoberfläche transformierter Zellen vorhanden sind, ist die Apoptoseinduktion durch NO über Peroxynitrit selektiv, es sei denn, es wird noch eine externe Superoxid-Anionen-Quelle hinzugefügt. Von transformierten Zellen gebildete Superoxidanionen können auch spontan zu Wasserstoffperoxid dismutieren (Bielski and Allen, 1977). Im Gegensatz zum Superoxidanion ist Wasserstoffperoxid ein Molekül mit weiter Reichweite. H2O2 kann im Extrazellulärrum in einer von Peroxidase (welche von nicht-transformierten Zellen sezerniert wurde) katalysierten Reaktion mit Chloridanionen zu Hypochloriger Säure weiterreagieren (Engelmann et al., 2000). HOCl übt selber keinen direkten Apoptose-induzierenden Effekt aus, da es in diesem System nur in sehr niedrigen Konzentrationen gebildet wird (Hu et al., 1993; Panasenko et al., 1997). Allerdings reagiert HOCl mit an der Zellmembran transformierter Zellen gebildeten Superoxidanionen weiter zu hochreaktiven Hydroxylradikalen welche selektiv über Lipidperoxidation Apoptose in transformierten Zellen induzieren, da sie als hochreaktive Moleküle nur eine geringe Reichweite haben (review Bauer, 2000) (siehe Abb. 1.3a). TGF-b eta - Nicht-transformierte Zelle Transformierte Zelle - Abb. 1.3 a: Interzelluläres Signalling -6- Einleitung Von transformierten Zellen gebildetes TGF-β stimuliert nicht-transformierte Zellen NO und Peroxidase freizusetzen. NO reagiert an der Zellmembran transformierter Zellen mit Superoxidanionen zu Peroxynitrit. Peroxynitrit führt über Lipidperoxidation und Reaktion mit DNA und Proteinen zur Apoptose. Durch spontane Dismutation von Superoxidanionen, welche an der Zelloberfläche transformierter Zellen regeneriert werden, entsteht Wasserstoffperoxid. Wasserstoffperoxid kann in einer von Peroxidase katalysierten Reaktion zu Hypochloriger Säure umgesetzt werden. HOCl reagiert an der Zellmembran transformierter Zellen mit Superoxidanionen zu molekularem Sauerstoff, Chloridanionen und Hydroxylradikalen. Die Hydroxylradikale induzieren über Lipidperoxidation Apoptose. Wasserstoffperoxid selber induziert ab einer Konzentration von 20µM sowohl in transformierten als auch in nicht-transformierten Zellen Apoptose (Ivanovas et. al., 2002). Konzentrationen von weniger als 20µM H2O2 haben weder auf transformierte noch auf nichttransformierte Fibroblasten einen Apoptose-induzierenden Effekt. Da die H2O2-induzierte Apoptose in Bezug auf den transformierten Phänotyp unselektiv abläuft, ist offenbar unerheblich, wie hoch die Superoxidanionkonzentration an der Zelloberfläche der untersuchten Zelllinie ist. Desweiteren ist die H2O2-induzierte Apoptose weder durch den Hydroxalradikalfänger Terephthalat noch durch den Superoxydanionenfänger SOD hemmbar, daher schlussfolgerten Ivanovas et al., dass H2O2 einen direkten Apoptose-induzierenden Effekt auf Zellen ausübt. Die Haber-Weiss-Reaktion, bei der H2O2 in einer Metall- katalysierten Reaktion zu Hydroxylradikalen umgesetzt wird, wobei Superoxydanionen als Elektronendonator für die Rückreduktion des Katalysators benötigt werden, schien für die Vermittelung der Wasserstoffperoxid-induzierten Apoptose keine Rolle zu spielen. Wie Schimmel et al. 2002 zeigen konnten, kommt der Haber-Weiss-Reaktion dennoch biologische Relevanz zu. Unter biologischen Bedingungen dismutieren Superoxidanionen, welche durch eine Membran-assoziierte NADPH-Oxidase von transformierten Zellen gebildet werden, spontan zu Wasserstoffperoxid. Gleichzeitig reduzieren Superoxidanionen Fe3+ zu Fe2+. Fe2+ reagiert mit H2O2 in der klassischen Fenton-Reaktion wobei extrazellulär an der Zellmembran Hydroxylradikale gebildet werden. Dem Apoptose-induzierende Effekt der Hydroxylradikale (Faure et al., 1996; Oettl et al., 1999) wirkt Glutathion intrazellulär entgegen. Glutathion kann oxidierte Lipidmoleküle zurückreduzieren und so die Lipidperoxidation hemmen (Kretzschmar and Muller, 1993), des weiteren benötigt die Glutathionperoxidase Glutathion als Substrat zum Abfangen von ROS. Erst wenn der intrazelluläre Glutathion-Spiegel gesenkt wird, induzieren Hydroxylradikale, welche in der Haber-Weiss-Reaktion gebildet wurden, Apoptose. Eine extrazellulär ablaufende HaberWeiss-Reaktion ist also für die Apoptose-Induktion in transformierten Zellen mit reduziertem Glutathion-Spiegel verantwortlich (siehe Abb. 1.3b). Glutathion ist auch dafür verantwortlich, intrazelluläres Wasserstoffperoxid, welches von Mitochondrien erzeugt wird, abzufangen. Zusätzlich produzieren transformierte Fibroblasten, -7- Einleitung angeregt durch eine hohe extrazelluläre Konzentration an Wasserstoffperoxid, intrazellulär eine hohe Menge an Katalase. Die Katalase übernimmt ebenfalls die Aufgabe, intrazelluläres Wasserstoffperoxid abzufangen. Auch nach Senkung des intrazellulären Gluthathion-Spiegels ist die intrazelluläre Katalase nach wie vor in der Lage, intrazelluläres Wasserstoffperoxid abzufangen, so dass unter biologischen Bedingungen, unter denen nur niedrige Wasserstoffperoxid-Konzentrationen erreicht werden, allein die extrazellulär ablaufende Haber-Weiss-Reaktion für die Apoptose-Induktion in transformierten Zellen mit reduziertem Glutathion-Spiegel verantwortlich ist. In nicht-transformierten Fibroblasten ist die Situation hingegen eine andere: nichttransformierte Zellen produzieren nur eine vernachlässigbar geringe Menge an Superoxidanionen an ihrer Zelloberfläche, es entsteht somit auch kein extrazelluläres Wasserstoffperoxid durch spontane Dismutation der Superoxidanionen. Somit kann eine nicht-transformierte Zelle auch nicht durch eine an der Zellplasmamembran ablaufende Haber-Weiss-Reaktion in Apoptose getrieben werden. Nicht-transformierte Zellen werden dadurch jedoch auch nicht zur Produktion von intrazellulärer Katalase angeregt, so dass ihr Level an intrazellulärer Katalase im Vergleich zu transformierten Zellen deutlich geringer ist (Deichman et al., 1998). Sinkt der Gluthationspiegel innerhalb der nicht-transformierten Zelle ab, so reicht die intrazelluläre Katalase nicht aus, um intrazelluläres Wasserstoffperoxid abzufangen. In nicht-transformierte Fibroblasten wird daher nach Gluthation-Senkung durch intrazelluläre ROS Apoptose induziert. -8- Einleitung Abb. 1.3b: Apoptose-Induktion durch die extrazellulär ablaufende Haber-Weiss-Reaktion in transformierten Zellen mit reduziertem Glutathion-Spiegel Wasserstoffperoxid wird über die Eisen(Fe2+)-getriggerte Fenton-Reaktion zu Hydroxylradikalen und Hydroxydanionen umgesetzt. Die Hydroxylradikale stellen das eigentliche Apoptose-induzierende Agens dar und treiben die Zellen in den programmierten Zelltod. Damit das in der Fenton-Reaktion oxidierte Eisen (Fe3+) wieder für die Fenton-Reaktion zur Verfügung steht, wird es durch Superoxidanionen, welche von einer Membran-assoziierten NADPH-Oxidase gebildet werden, rückreduziert. 1.4 Intrazelluläre Apoptoseinduktion durch interzelluläres ROSund RNS-Signalling Interzelluläres Signalling kann über verschiedene intrazelluläre Prozesse den altruistischen Zelltod einleiten. Einer der wichtigsten Mechanismen, über die extrazellulärer ROS und RNS die intrazelluläre Apoptoseinduktion hervorrufen ist wahrscheinlich die Lipidperoxidation. Sowohl für Hydroxylradikale (Liu Bet al., 1997) als auch für Peroxynitrit (Darley-Usmar et al., 1992), -9- Einleitung Singulett-Sauerstoff (Wagner et al., 1993) und Nitrylchlorid (Panasenko et al., 1997) konnte eine Lipidperoxidiernde Wirkung nachgewiesen werden. Als Folge der Lipidperoxiadation sinkt der intrazelluläre Glutathionspiegel ab, da Glutathion bei der Rückreduktion der Lipide verbraucht wird. Dadurch entfällt die hemmende Wirkung, die Glutathion auf Sphingomyelinasen ausübt (Liu B et al., 1997), wodurch Ceramide vermehrt produziert werden. Durch verschiedene Forschungsgruppen (review Costantini et al., 2000) konnte nachgewiesen werden, dass Ceramide auf die sogennante „mitochondrial permeability transition pore“, einem als funktioneller Kanal wirkenden Proteinkomplex in innerer und äusserer Mitochondrienmembran, wodurch es zur Freisetzung von ROS und anderen Apoptose-auslösenden Substanzen wie Cytochrom c kommt. Ein weiterer Mechanismus über den extrazellulärer ROS und RNS intrazelluläre Apoptosewege einleiten könnten, könnte die Aktivierung von Todesrezeptoren durch ROS und RNS sein, wodurch die oben beschriebenen intrazellulären Apoptosewege eingeleitet werden würden. 1.5 Geschichte der Fenton-Reaktion Im Jahre 1876 beschrieb Henry John Horstman Fenton in einer kurzen Notiz an Chemical News, dass bei der Zugabe von einer Lösung von H2O2 und geringen Mengen an Eisen(II)Salzen zu einer Lösung von Weinsäure ein violettes Produkt gebildet wird. Diese Reaktion schlug Fenton als analytische Nachweis von Weinsäure vor: „I have lately noticed the following reaction, which besides presenting one or two peculiarities, may as far as I can judge at present, be proposed as a test for tartaric acid. To a very dilute solution of ferrous sulphate or chloride, a small quantity of a solution of tartaric acid or tartrate is added, followed by a few drops of chlorine water or hydrogen peroxide, and lastly an exess of caustic potash or soda, when a fine violet colour is obtained…” (review W. H. Koppenol 1993). Es dauerte einige Jahre bis Fenton das violette Produkt als Oxidationsprodukt der Weinsäure mit der Summenformel C4H4O6 isoliert hatte. Weiterhin erwähnte Fenton in einem 1894 erschienenen Artikel, dass die Menge des Eisen(II)-Salzes für die Reaktion unerheblich sei, da Eisen katalytisch reagiere (review W. H. Koppenol 1993). Einige Monate später konnte Fenton nachweisen, dass es sich bei dem violetten Reaktionsprodukt mit der Summenformel C4H4O6 um 2,3-Dihydroxy-Maleinsäure handelt. Den genauen Mechanismus der oben beschriebenen Reaktion konnte Fenton jedoch nicht ermitteln. Später konnte gezeigt werden, - 10 - Einleitung dass für den Mechanismus der von Fenton beobachteten Reaktion Hydroxylradikale eine wichtige Rolle spielen. Laut Koppenol (review W. H. Koppenol 1993) waren es Haber und Willstätter, die das Hydroxylradikal erstmals im Jahre 1931 in ihrer Veröffentlichung „Unpaarigkeit und Radikalketten im Reaktionsmechanismus organischer und enzymatischer Vorgänge“ erwähnten. Sie stellten folgende Reaktionsgleichungen auf: OH + H2O2 → H2O + O2H O2H + H2O2 → O2 + H2O + OH Haber und Weiss nutzten diese beiden Gleichungen, um die Zerlegung von Wasserstoffperoxid unter Katalyse von Eisen zu erklären, indem sie folgende Kettenreaktion postulierten (Haber und Weiss, 1932) : FeII + H2O2 → FeIIIOH + OH OH + H2O2 → H2O + O2H O2H + H2O2 → FeII + OH → O2 + H2O + OH FeIIIOH Heute wird als Fenton-Reaktion die Reduktion von Wasserstoffperoxid durch Fe2+ zu Hydroxidanionen und Hydroxylradikalen bezeichnet. Diese Reaktion steht in engem Zusammenhang mit einer weiteren Reaktion, bei der Fe3+ durch Superoxidanionen zu Fe2+ zurückreduziert werden. Beide Reaktionen zusammen werden als Haber-Weiss-Reaktion oder auch als Haber-Weiss-Zyklus bezeichnet. Reaktionsgleichungen der Eisen-Katalysierten Haber-Weiß-Reaktion: 1. O2ּ- + Fe 3+ → O2 + Fe 2+ 2. Fe2+ + H2O2 → OHּ + OH + Fe3+ (die 2. Reaktion stellt die klassische Fenton-Reaktion dar) Im Wandel der Zeit hat sich auch die Rolle der Fenton-Reaktion verändert. Zunächst wurde die Fenton-Reaktion zum analytischen Nachweis von Weinsäure eingesetzt und bald darauf - 11 - Einleitung zur Synthese von hydroxylierten organischen Verbindungen benutzt. Nach wie vor verwendet man das sogenannte Fentons Reagens (eine wässrige Lösung von Wasserstoffperoxid mit Eisen(II)-Salzen) zur Oxidation von 1,2-Diolen. Heute spielt die Fenton-Reaktion eine wichtige Rolle in der freien-Radikal-Biologie und in der Medizin. - 12 - 1.6 Einleitung Zielsetzung Ziel der vorliegenden Dissertation ist die detaillierte Untersuchung des Mechanismus der durch H2O2 induzierten Apoptose. Die vorliegende Arbeit soll klären, ob hohe Konzentrationen an Wasserstoffperoxid direkt oder doch indirekt, über eine weitere Noxe, Apoptose induzieren. Eine zentrale Rolle nimmt für die vorliegende Arbeit die Fenton-Reaktion ein, bei der H2O2 über eine Fe 2+ getriggerte Reaktion zu Hydroxylradikalen umgesetzt wird, welche verantwortlich sein könnten für die indirekte Induktion der H2O2-vermittelten Apoptose. Wie Ivanovas et. al. 2002 zeigen konnten, induziert Wasserstoffperoxid ab einer Konzentration von 20µM unselektiv, also sowohl in transformierten als auch in nichttransformierten Fibroblasten Apoptose (Ivanovas et al., 2002). Desweiteren ist die H2O2induzierte Apoptose weder durch den Hydroxylradikalfänger Terephthalat noch durch den Superoxydanionenfänger SOD hemmbar, daher schlussfolgerten Ivanovas et al., dass H2O2 einen direkten Apoptose-induzierenden Effekt auf Zellen ausübt. Niedrige Konzentrationen von Wasserstoffperoxid induzieren unter biologischen Bedingungen keine Apoptose. Allerdings können geringe Mengen Wasserstoffperoxid, die auf spontane Dismutation von Superoxidanionen zurückzuführen sind, in transformierten Zellen mit reduziertem Glutathion-Spiegel Apoptose induzieren. Diese Apoptose-Induktion ist, wie Schimmel et al. zeigen konnten, auf eine extrazellulär ablaufende Fenton-Reaktion zurückzuführen (Schimmel et al., 2002). Die Ergebnisse von Ivanovas et al. deuten darauf hin, dass hohe Konzentrationen Wasserstoffperoxid unabhängig von der Fenton-Reaktion Apoptose induzieren. Allerdings berücksichtigten Ivanovas et al. nicht, dass sowohl der Hydroxylradikalfänger Terephthalat als auch der Superoxydanionenfänger SOD nicht Zellmembran-permeabel sind und somit nur im Extrazellulärraum vorliegen. Die vorliegende Dissertation soll klären, ob hohe Konzentrationen an Wasserstoffperoxid direkt Apoptose induzieren, oder ob eine intrazellulär ablaufende Fenton-Reaktion für die Apoptose-Induktion verantwortlich ist. - 13 - Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Zelllinien 208F Fibroblasten Bei dieser Zelllinie handelt es sich um eine nicht-transformierte Rattenfibroblastenlinie. Diese Zelllinie zeichnet sich in der Monolayer-Zellkultur durch stabiles, permanentes Wachstumsverhalten mit ausgeprägter Kontaktinhibition aus (Quade, 1979). 208F Zellen zeigen eine sehr niedrige spontane Transformationsrate und sind unempfindlich gegenüber der interzellulären Apoptoseinduktion. 208F src3 Fibroblasten Diese transformierte Zelllinie entstand durch Transfektion der Parentallinie 208F mit dem pSV2gpt-src-Plasmid. Auf das so eingeschleuste virale Onkogen V-src ist der transformierte Phänotyp zurückzuführen (Iten et al., 1989). 208F src3 Zellen zeigen folgenden typischen Merkmale einer transformierten Zelllinie: hohe Proliferationsrate, fehlende Kontaktinhibition, criss-cross-Wachstum, und Fähigkeit zur Kolonienbildung im Weichagar. Beide Zelllinien wurden von Dr. R. Schäfer von der Charité Berlin zur Verfügung gestellt. 2.1.2 Reagenzien ABH (4-Aminobenzoyl-hydrazide) (Firma: Acros) Bei ABH handelt es sich um einen spezifischen Inhibitor der Myeloperoxydase. (Burner et al. 1999 ; Kettle et al., 1995; Kettle et al. 1997) Die Ausgangslösung enthielt 1mM ABH gelöst in EMEM mit 0,1% DMSO. Aufbewahrt wurde die Stammlösung bei –20°C. Eingesetzt wurde eine Konzentration von 50µM. Apocynin (Firma: Calbiochem) Apocynin blockiert die in der Zellmembran sitzende NADPH-Oxidase (T’Hart, 1990; Stolk et al., 1994). Bisher nahm man an, dass dieses Enzym nur in der Zellmembran existiert (Babior et al., 1984), neuere Publikationen postulieren jedoch, dass dieses Enzym auch intrazellulär - 14 - Material und Methoden vorhanden ist (Sijtsema et al., 2000; Li JM und Shah AM, 2002; Vaisiere et al, 1995). Die Versuchsergebnissse legen nahe, dass auch die intrazelluläre NADPH-Oxidase durch zellmembrangängiges Apocynin blockierbar ist. Aufbewahrt wurde Apocynin in einer Konzentration von 2,5mg/ml bei –20°C. In den Versuchen wurde eine Konzentration von 50µg/ml eingesetzt. DFO (Desferrioxamin) (Firma: Sigma) Bei Desferrioxamin handelt es sich um einen Fe2+/Fe3+-Chelatbildner. Die DFO-Stammlösung hatte eine Konzentration von 10mM und wurde bei –20°C gelagert. Eingesetzt wurde DFO in Konzentrationen zwischen 6µM und 400µM. DMTHU (1,3-Dimethyl-2-thiourea) (Firma: Aldrich) DMTHU ist ein Hydroxyl-Radikal-Fänger, der sowohl extrazellulär als auch intrazällulär wirksam ist, da er in der Lage ist die Zellmembran zu passieren. DMTHU wurde in einer Konzentration von 1M in PBS bei –20°C gelagert. Die verwendete Konzentration betrug 10mM. H2O2 (Wasserstoffperoxid) (Firma: Merck) H2O2 lag in einer 30%-igen Stammlösung in einer Konzentration von 10M vor. Vor Versuchsbeginn wurde H2O2 in PBS auf die gewünschte Konzentration (20 bis 80µM) verdünnt und direkt anschließend zu den Versuchsansätzen gegeben. MnTMPyP (Firma: Calbiochem) Mn(II)tetrakis(1-Methyl-4-pyridyl)porphyrin Pentachloride (Summenformel: C44H36Cl5MnN8) Bei MnTMPyP handelt es sich um ein zellmembranpermeables SOD-Mimetric. MnTMPyP ist also in der Lage, das hochreaktive Superoxid-Radikal über folgenden Mechanismus zu eleminieren: 2O -ּ + 2H + → H2O2 + O2 - 15 Man Material und Methoden (Mannitol) (Firma: Sigma) Summenformel: C6H14O6 Mannitol ist ein Hydroxyl-Radikal-Fänger, der nur extrazellulär wirksam ist, da er nicht in der Lage ist die Zellmembran zu passieren. Als Ausgangslösungen dienten Aliquots der Konzentration 1M. Die Aliquots wurden bei –20°C gelagert. Eingesetzt wurde Mannitol in einer Konzentraton von 10mM. NAME (Firma: Sigma) N-Omega-Nitro-L-Arginine-Methylester-Hypochloride NAME hemmt spezifisch die NO-Synthese. Als Ausgangslösungen dienten Aliquots der Konzentration 60mM. Die Aliquots wurden bei –20°C gelagert. Eingesetzt wurde NAME in einer Konzentraton von 1,2mM. Salze: FeCl2 (FeCl2 · 4H2O) (Firma: Sigma) KCl (Firma: Merck) MgCl2 (MgCl2 · 6H2O) (Firma: Merck) NaCl CaCl2 (Firma: Fluka) (CaCl2 · 2H2O) (Firma: Merck) Alle Salze lagen in einer Stammlösung mit der Konzentration 10mM vor, die in Aliquots von 100µl bei –20°C gelagert wurden. SOD (Firma: Sigma) 2+ (Superoxid-Dismutase(Cu ), gewonnen aus Rindererythrozyten) Dieses Enzym katalysiert, wie der Name schon sagt, die Dismutation von Superoxidanionen zu Wasserstoffperoxid und molekularem Sauerstoff. SOD ist als Enzym membrangängig und entfaltet seine Wirkung dementsprechend nur extrazellulär. SOD wurde immer in einer Konzentration von 150U/ml eingesetzt. Katalysierte Reaktion: 2O2ּ- + 2 H+ → H2O2 + O2 nicht - 16 Tau (Taurin) Material und Methoden (Firma: Sigma) Bei Taurin handelt es sich um einen HOCl-Fänger. Taurin wurde in einer Konzentration von 500mM bei –20°C aufbewahrt. Wenn nicht anders angegeben wurde eine Konzentration von 25mM eingesetzt. TGF-β1 (Transforming Growth Factor-β) Das verwendete TGF-β1 wurde von Prof. Bauer aus menschlichen Thrombozyten gewonnen und gereinigt (Bauer et al., 1991). Die Stammlösung mit einer Konzentration von 15ng/ml wurde bei –20°C gelagert. Die Ausgangslösung wurde jeweils vor Versuchsbeginn mit EMEM verdünnt. Die in den Experimenten eingesetzten Konzentrationen lagen zwischen 0,3ng/ml und 20ng/ml. Ter (Terephthalat) (Firma:Aldrich) Terephthalat ist ein Hydroxyl-Radikal-Fänger, der nur extrazellulär wirksam ist, da er nicht in der Lage ist die Zellmembran zu passieren. Terephthalat wurde in einer Konzentration von 40mM bei –20°C aufbewahrt. Eingesetzt wurde Terephthalat in einer Konzentration von 200µM. 2.1.3 Kulturmedium, Stammlösungen und Puffer EMEM (Eagle’s Minimal Essential Medium) Das EMEM-Medium (Firma: Seromed, Berlin) wurde mit Zusatz folgender Substanzen steril für sämtliche Experimente und Zellkulturen verwendet: L-Glutamin (280µg/ml) Penicillin (40 U/ml) Streptomycin (50µg/ml) Neomycin (10µg/ml) Moronal (10 U/ml) FKS (5%) - 17 - Material und Methoden Fetales Kälberserum (FKS) FKS (Firma: Bio Whittaker, Belgien) wurde dem Zellkulturmedium als Nährstoff- und Wachstumsfaktorquelle zugesetzt. Zur Komplementinaktivierung wurde es vor dem ersten Gebrauch über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 56°C im Wasserbad inkubiert. Einfriermedium Das Einfriermedium setzte sich aus EMEM mit 20% FKS und 7%DMSO zusammen. DMSO (Dimethylsulfoxid) (Firma: Merck) Summenformel: C2H6OS DMSO wurde als ein Zusatz zum Einfriermedium verwandt. Es schützt die Zellen während des Einfrier- und Auftauvorganges. Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7,5) Bei PBS handelt es sich um eine sterile, isotone Pufferlösung, die u.a. zum Verdünnen von Reagenzien benutzt wurde. Die Lösung enthält folgende Elektrolyte: NaCl 140 mM KCl 25 mM MgCl2 0,5 mM CaCl2 1 mM Na/K Phosphat 10 mM Trypsin/Versen (1:4) Bei Trypsin handelt es sich um eine Protease, die es ermöglicht, die den Zellkultur-Flaschen anhaftenden Zellen von der Flaschenoberfläche abzulösen und die Zellen untereinander zu trennen. - 18 - Material und Methoden 2.1.4 Kunststoffmaterial Zellkulturflaschen und –platten: Die Zellen wurden in 75cm2 Kulturflaschen gezüchtet. Für die verschiedenen Versuche wurden die Zellen in 12-Loch-Platten oder in 24-LochPlatten eingesät. (Firmen: Greiner, Frickenhausen und Costar, USA) Zentrifugen-Gefäße 50 ml Röhrchen, Falcon, Becton Dickinson, USA 2.1.5 Geräte und Sonstiges Zählkammer Zellzahlen wurden in einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer (Firma: Brand, Wertheim/Main) bestimmt. In der Zählkammer wurde die Anzahl der Zellen in einem Volumen von 0,2mm3 ermittelt, anschließend wurde mit 5000 mutlipliziert, um die Anzahl von Zellen pro ml Medium zu erhalten. Zentrifugen Megafuge 1.0R (Firma: Heraeus) Die Zentrifugen liefen im Rahmen der Bestimmung von Zellzahlen über sieben Minuten mit 1800U/min. bei ca. 25°C. Brutschränke Zellkulturflaschen und Versuchsansätze wurden im Brutschrank (Firma: Heraeus) bei 37°C, 5% CO2 und Wasserdampf-gesättigter Luft inkubiert. Umkehrmikroskop (Leitz) Labovert FS - 19 - Material und Methoden Fluoreszenzmikroskop (Leitz) Fluovert FU Kamera (Leica) Leica WILD MPS 52/48 Filme Elite Chrome, 200ASA, Kodak Extrachrome, 1600ASA, Kodak 2.2 Methoden 2.2.1 Zellkultivierung im Monolayer Sowohl transformierte als auch nicht-transformierte Fibroblasten wachsen in 2 Zellkulturflaschen (Bodenfläche 75cm ) als einschichtiger Zellrasen (Monolayer). Beide Zelllinien wurden in Zellkulturflaschen mit ca. 20ml Medium (EMEM mit Zusätzen, siehe 2.1.3) bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank kultiviert. Zur Gewährleistung eines konstanten CO2-Gehaltes wurden die Schraubverschlüsse der Zellkulturflaschen nur unvollständig geschlossen. Auf diese Weise wachsen die Zellen innerhalb von 2-4 Tagen zu einem dichten Zellrasen heran. Um optimale Bedingungen für das Weiterwachsen zu erreichen, werden die Zellen zu diesem Zeitpunkt in geringerer Anzahl in einen neue Zellkulturflasche überführt („Zellteilung“ oder „Splitten“), oder für einen Versuchsansatz ausgesät. Zur Zellteilung wurden die 20ml Medium aus den Zellkulturflaschen entnommen und die Zellen mit 5ml Trypsin kurz gespült. Nachdem die 5ml Trypsin entfernt wurden, wurde erneut Trypsin zugefügt (diesmal 3ml). Das Trypsin wurde so lange in der Zellkulturflasche geschwenkt, bis die Zellen durch Proteolyse ihre Haftung untereinander und zum Flaschenboden vollständig verloren hatten. Unter dem Mikroskop konnte der Ablösevorgang verfolgt werden. Anschließend wurden 7ml Medium zugesetzt, um die Wirkung des Trypsins auf die Zellen zu unterbrechen. Zur Trennung von großen Zellaggregaten wurde die Zellsuspension mehrmals resuspendiert. Zur Weitezüchtung wurde 1ml der Zellsuspension in eine neue Zellkulturflasche mit 20ml frischem Medium überführt (auf diese Weise wurden die Zellen - 20 - Material und Methoden 1:10 gesplittet). Der Rest der Zellsuspension wurde verworfen oder konnte für Experimente verwendet werden. 2.2.2 Bestimmung von Zellzahlen In allen Experimenten wurden genau definierte Zellzahlen verwendet, um Effekte, die auf Zelldichte- oder Zellmengenunterschieden beruhen, innerhalb eines Versuches ausschließen zu können. Zur Bestimmung der Zellkonzentration wurden die Zellen zunächst mit 5ml Trypsin abtrypsiniert und zusammen mit 15ml Medium (um die Wirkung des Trypsins auf die Zellen zu beenden) in ein Falcon-Röhrchen gegeben und über einen Zeitraum von 7 Minuten bei 1800U/min und 25°C zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand vorsichtig entfernt und das Zell-Pellet in 5-10 ml Medium resuspendiert. Ca. 20µl dieser Zellsuspension wurden in die Zählkammer überführt. In der Zählkammer wurden mindestens 5 Quadrate (mit jeweils 0,2mm3 Volumen) ausgezählt. Multipliziert man den Mittelwert der in den Quadraten bestimmten Zellzahlen mit 5000, so erhält man die Zellmenge pro ml Zellsuspension. Mit Medium wurde die Zellsuspension auf die für den jeweiligen Versuchsansatz gewünschte Zellkonzentration verdünnt. 2.2.3 Aussaat von Zellen Nach der Bestimmung der Zellzahl und der Verdünnung auf die für den jeweiligen Versuchsansatz gewünschte Zellkonzentration wurde die Zellsuspension in die 12- bzw. 24Lochplatten gefüllt (1ml/Loch in 24-Lochplatten, 1,9ml/Loch in 12-Lochplatten). Nach einer Anwachszeit von mind. 6 Stunden im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 wurden die Reagenzien des jeweiligen Experimentes zugefügt. Bevor die Substanzen zugegeben wurden erfolgte meist noch ein Mediumwechsel, um den Versuchsansatz von Antioxidantien, die in der Zwischenzeit von den Zellen produziert und ins Medium abgegebenen worden waren, zu befreien. 2.2.4 Einfrieren von Zellen Zur längeren Lagerung von Zellen im flüssigen Stickstoff wurden die Zelle wie folgt eingefroren: Zuerst wurden die Zellen wie oben beschrieben abtrypsiniert und zentrifugiert. Danach wurde der Überstand vorsichtig abpippetiert und die Zellen in Einfriermedium resuspendiert, wobei ca. der Inhalt einer 75cm2 Kulturflasche in 1ml Einfriermedium aufgenommen wurde. In Einfrierröhrchen abgefüllt wurden die Zellen zunächst mehrere Tage im –70°C Eisschrank gelagert und anschließend in den Stickstofftank überführt. - 21 - Material und Methoden 2.2.5 Auftauen von Zellen Das Auftauen umfasst folgende Schritte: Der aufgetaute Inhalt eines Einfrierröhrchens aus dem Stickstofftank wird in 10ml Medium aufgenommen und wie oben beschrieben zentrifugiert Der Überstand wird abgenommen, das Zellpellet mit Medium resuspendiert und in eine Kulturflasche gefüllt. Nach 24 Stunden erfolgte ein Mediumwechsel, die weiter Kultivierung der Zellen erfolgte wie unter 2.2.1 beschrieben. 2.2.6 Ermittlung der Apoptoserate Unter dem Phasenkontrastmikroskop wurde der prozentuale Anteil von apoptotischen Zellen an der Gesamtzahl der Zellen bestimmt. Dazu wurden pro Ansatz mindestens 200 Zellen in für den Ansatz repräsentativen Gesichtsfeldern ausgezählt und als intakt oder als apoptotisch eingestuft. Als morphologische Kriterien für apoptotische Zellen wurden folgende Apoptose-Kriterien herangezogen: 1.membrane blebbing 2.Kernfragmentation 3.Kernkondensation war mindestens eines der drei Kriterien erfüllt, so wurde die Zelle als apoptotisch eingestuft. Abb. 2.2a und Abb. 2.2b zeigen anhand einzelner Zellen die Morphologie von intakten und apoptotischen Zellen von 208F und 208F src3 Fibroblasten. - 22 - Material und Methoden Abb. 2.2a Morphologie intakter und apoptotischer 208F Fibroblasten Abb. 2.2b Morphologie intakter und apoptotischer 208F src3 Fibroblasten - 23 - Material und Methoden 2.2.7 Statistik Alle Experimente wurden im Doppelansatz durchgeführt. Aus den beiden ausgezählten Prozentsätzen der apoptotischen Zellen an der Gesamtzahl der Zellen wurde der Mittelwert und die Standardabweichung berechnet. Die Wiederholbarkeit eines Versuchsergebnisses wurde in einem oder mehreren nachfolgenden Experimenten überprüft. Da der Gegenstand der Versuche das lebende Zellsystem ist, ergeben sich Schwankungen hinsichtlich der Apoptosekinetik, die von Variablen wie z.B. Passagezahlen, Anwachsdauer, Dichte der Zellen vor dem Aussäen, unterschiedliche Zellmengen und Zelldichten in den verschiedenen Versuchen abhängig ist. - 24 - Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Zielsetzung Im Mittelpunkt der Arbeit stand der Mechanismus der durch Wasserstoffperoxid ausgelösten Apoptose in transformierten und nicht transformierten Fibroblasten. Es sollte geklärt werden, ob Wasserstoffperoxid direkt Apoptose-auslösend wirkt, oder ob die Apoptose-induzierende Wirkung erst nach der Spaltung von H2O2 mithilfe der Fenton Reaktion in Hydroxylanionen und Hydroxylradikale zum Tragen kommt. Bei der Fenton-Reaktion wird Fe2+ als Katalysator eine besondere Rolle zuteil. Ein großer Teil der Arbeit befasst sich daher mit der Apoptoseinduktion durch DFO (Desferrioxamin), einem Eisen-Chelatbildner, der die Fe2+/Fe3+-Konzentration im System senkt. Sämtliche Experimente wurden zunächst an transformierten Fibroblasten (Zellen) durchgeführt, später wurde überprüft, ob sich die Ergebnisse auch auf nichttransformierte Fibroblasten (208F) übertragen lassen. 3.2 Effekte von DFO (Desferrioxamin) auf transformierte und nicht-tranformierte Fibroblasten 3.2.1 Empfindlichkeit von 208F / 208F src3 Zellen auf verschiedene DFO (Desferrioxamin) Konzentrationen Zur Überprüfung, wie transformierte und nicht-transformierte Zellen auf die Zugabe von DFO (Desferrioxamin, ein Fe2+/Fe3+-Chelator) reagieren, wurden 208F und 208F src3 Zellen ausgesät und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden die Zellen gewaschen, um extrazellulär vorhandene Antioxidantien zu entfernen. Anschließend erfolgte die DFO-Zugabe in ansteigender Konzentration. Der Anteil der apoptotischen Zellen an der Gesamtzahl der Zellen wurde 1-2 Mal täglich bis 120h bzw. 80h nach Zugabe bestimmt. - 25 - 100 Ergebnisse A. 208F Apoptotische Zellen ( % ) 119,8h 77,3h 75 54h 50 28,5h 25 0h 0 0 100 6 12,5 25 50 100 200 400 B. 208F src3 Apoptotische Zellen ( % ) 79h 48h 75 32,5h 50 24,5h 25 0h 0 0 6 12,5 25 50 100 200 400 Konzentration von DFO ( µM ) Abb. 3.2 a: Abhängigkeit der Apoptoseinduktion von der DFO-Konzentration Je 57000 208F bzw. 208F src3 Zellen pro Loch wurden in 12-Well-Platten eingesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden die Ansätze mit Medium gewaschen. Mit DFO wurden Konzentrationen zwischen 6µM und 400µM eingestellt. 1-2 mal täglich wurden die Ansätze ausgezählt. Ausgezählt wurde der prozentuale Anteil der Apoptosen von je 200 ausgezählten Zellen. Der Kontrollansatz war unbehandelt. In Dieser Abbildung ist der Prozentsatz der Apoptosen an der Gesamtzahl der Zellen gegenüber der DFO-Konzentration aufgetragen. Die verschiedenen Kurven entsprechen unterschiedlichen Zeitpunkten. - 26 - Ergebnisse Wie auf Abb. 3.2a zu erkennen ist, ruft eine DFO-Konzentration von 6µM keine oder nur eine späte, relativ geringe Steigerung des Prozentsatzes apoptotischer Zellen hervor, während Konzentrationen von 100-400 µM DFO bereits nach 28,5h bzw. 24h zu einem Anteil von 3055% apoptotischer Zellen führen. 50µM DFO führen bei 208F src3 Zellen ebenfalls nach 24h zu einer deutlichen Apoptosesteigerung, wohingegen die gleiche DFO-Konzentration bei 208F Zellen einen vergleichbaren Apoptoseeffekt erst mit einigen Stunden Verzögerung zeigt. Nach 77h bzw. nach 48h sind die Zellen der Versuchsansätze mit 100-400 µM DFO bzw. 50400 µM DFO nahezu vollständig in Apoptose übergegangen.. Aus diesen Ergebnissen läßt sich schließen, dass sowohl transformierte als auch nichttransformierte Zellen empfindlich auf DFO reagieren, 208F src3 Zellen reagieren im Vergleich zu 208F Zellen etwas sensibler und daher zeitlich schneller auf die apoptoseinduzierende Wirkung von DFO. Bei DFO handelt es sich um einen Chelatbildner, der mit Fe2+/Fe3+ Ionen einen stabilen Chelat-Komplex eingehen kann. Aufgrund dieser Tatsache ist es wahrscheinlich, dass die beobachteten Effekte auf einen Eisenentzug zurückzuführen sind. 3.2.2 Ist der toxische Effekt von DFO auf den Entzug von Fe2+/Fe3+ zurückzuführen? Ziel der folgenden Experimente war es, zu überprüfen, ob dem toxische Effekt, den DFO sowohl auf transformierte als auch auf nicht-transformierte Zellen ausübt, ein Mangel an Eisenionen zugrunde liegt. 3.2.2.1 Überprüfung, ob sich die durch DFO induzierte Apoptose durch Zugabe von Eisen aufheben lässt Zu diesem Zweck wurde zunächst DFO sowie DFO + Eisen in äquimolaren Mengen zu 208F src3 Zellen gegeben. Eisen wurde in Form von FeCl2 zugeführt. - 27 - Ergebnisse B. 208F src3 Apoptotische Zellen ( % ) 100 DFO 75 50 DFO + FeCl 2 25 æ / FeCl2 0 0 25 50 75 100 125 Zeit ( h ) Abb. 3.2b: Kinetik der Apoptoseinduktion durch DFO und/oder FeCl2 Je 20000 208F src3 Zellen pro Loch wurden in 24-Well-Platten eingesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. Nach 18 Stunden wurde DFO und/oder FeCl2 hinzugefügt, so daß die Endkonzentration jeweils bei 50µM lag. Bis zu einer Dauer von 120 Stunden wurden die Ansätze in regelmäßigen Abständen ausgezählt. . Ausgezählt wurde der prozentuale Anteil der Apoptosen von je 200 ausgezählten Zellen. Der Kontrollansatz war unbehandelt. Wie in Abb. 3.2b zu sehen ist, konnte die Apoptoseinduktion durch DFO langfristig durch Zugabe von FeCl2 gehemmt werden. Die Versuchsdauer betrug in diesem Fall 120h, am Ende des Versuches waren mithilfe von DFO sämtliche Zellen in Apoptose übergegangen, wohingegen der Prozentsatz apoptotischer Zellen des Versuchsansatzes DFO + FeCl2 dem Wert der Kontrolle entsprach. 3.2.2.2 Ist die DFO-induzierten Apoptose nur durch die Zugabe eines Eisensalzes hemmbar, oder können auch andere Salze die DFOinduzierte Apoptose hemmen? Im Folgeexperiment wurde DFO (50µM) mit verschiedenen Salzen (50µM) zu 208F src3 Zellen gegeben. Wie aus Abb. 3.2c deutlich hervorgeht, ließ sich die Apoptoseinduktion durch DFO nur durch Zugabe von FeCl2 komplett blockieren, CaCl2, MgCl2, NaCl und KCl beeinflussten die Apoptoseinduktion durch DFO hingegen in keiner Weise. Auch höhere Salzkonzentrationen (150µM) von CaCl2, MgCl2, NaCl und KCl beeinflussten die Apoptoseinduktion durch DFO nicht (siehe Abb. 3.2c). Die Apoptose-induzierende Wirkung von DFO ist also offensichtlich auf den Entzug von Eisenionen zurückzuführen. - 28 - Ergebnisse 100 50µM Salz 75 50 100 CaCl2 + DFO MgCl2 + DFO FeCl2 + DFO NaCl + DFO KCl + DFO DFO MgCl2 FeCl2 NaCl KCl CaCl2 150µM Salz 75 50 MgCl2 + DFO FeCl2 + DFO NaCl + DFO KCl + DFO DFO CaCl2 + DFO KCl 0 MgCl2 FeCl2 NaCl 25 CaCl2 Apoptotische Zellen ( % ) 0 æ 25 æ Apoptotische Zellen ( % ) B. 208F src3 Abb. 3.2c: Apoptoseinduktion durch DFO und/oder CaCl2, MgCl2, FeCl2, NaCl, KCl Je 30000 208F src3 Zellen pro Loch wurden in 24-Well-Platten eingesät. und bei 37°C über Nacht inkubiert. Nach 18 Stunden wurde DFO und/oder das jeweilige Salz hinzugefügt. Mit DFO wurde eine Konzentration von50µM eingestellt, die verschiedenen Salze wurden in den Konzentration 50 und 150µM eingestellt. Bis zu einer Dauer von 120 Stunden wurden die Ansätze in regelmäßigen Abständen ausgezählt. Ausgezählt wurde der prozentuale Anteil der Apoptosen von je 200 ausgezählten Zellen. Der Kontrollansatz war unbehandelt - 29 - Ergebnisse 3.2.3 Beruht die toxische Wirkung von DFO auf einer über ROS (reactive oxygen species) induzierten Apoptose? Zur Aufklärung dieser Frage wurden 208F src3 mit DFO und verschiedene ROS-Inhibitoren behandelt. Bei den ROS-Inhibitoren handelte es sich um ABH (ein Myeloperoxidaseinhibitor), SOD (Superoxiddismutase, ein Superoxidanion-Inhibitor), Tau (Taurin, ein HOCl-Inhibitor) und Ter (Terephthalat, ein Hydroxylradikal-Fänger). Zusätzlich wurde außerdem auch der RNS-Inhibitor NAME (ein Hemmstoff der NO-Synthese) eingesetzt. Der Versuch lief über eine Dauer von 100 Stunden, die Ansätze wurden in regelmäßigen Abständen ausgezählt. Aus Übersichtlichkitsgründen sind in Abb. 3.2d nur zwei aufeinanderfolgende Zeitpunkte als Säulendiagramme dargestellt. 100 Ergebnisse B. 208F src3 Zeitpunkt: 23h 75 50 100 TGF + DFO ABH + TGF + DFO SOD + TGF + DFO Tau + TGF + DFO Ter + TGF + DFO DFO ABH + DFO SOD + DFO Tau + DFO Ter + DFO TGF ABH + TGF SOD + TGF Tau + TGF Ter + TGF 0 æ ABH SOD Tau Ter 25 B. 208F src3 Zeitpunkt: 30,5h 75 50 TGF + DFO ABH + TGF + DFO SOD + TGF + DFO Tau + TGF + DFO Ter + TGF + DFO DFO ABH + DFO SOD + DFO Tau + DFO Ter + DFO 0 TGF ABH + TGF SOD + TGF Tau + TGF Ter + TGF 25 æ ABH SOD Tau Ter Apoptotische Zellen ( % ) Apoptotische Zellen ( % ) - 30 - Abb. 3.2d: Wirkung verschiedener ROS-Inhibitoren auf die Apoptose-Induktion durch TGF-β und DFO Je 20000 208F src3 Zellen pro Loch wurden in 24-Well-Platten eingesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden zunächst die verschiedenen ROS-Inhibitoren, anschließend TGF-β und zuletzt DFO hinzugefügt. Die Inhibitoren wurden in folgenden Konzentrationen verwendet: ABH:50µM, SOD: 150U/ml, Tau: 25mM, Ter: 200µM. Die Endkonzentration von DFO betrug 50µM, die TGF-β−Konzentration lag bei 20ng/ml. Die verschiedenen Versuchsansätze wurden in regelmäßigen Abständen ausgezählt. . Ausgezählt wurde der prozentuale Anteil der Apoptosen von je 200 ausgezählten Zellen. Der Kontrollansatz war unbehandelt. - 31 - Ergebnisse Zum Zeitpunkt 23,3 Stunden kann die toxische Wirkung von DFO auf transformierte Zellen durch ABH, Tau und Ter gehemmt werden, SOD hemmt hingegen nicht. Zum späteren Zeitpunkt (30,5h) bleibt nur die Hemmung durch Tau deutlich bestehen, SOD und ABH hemmen nur minimal die Apoptose-induzierende Wirkung von DFO (beachte hohe Standardabweichung von DFO). Eine Apoptoserate vermindernde Wirkung von Ter ist zu diesem Zeitpunkt nicht mehr zu erkennen. Der RNS-Inhibitor NAME hat zu keinem Messzeitpunkt einen hemmenden Effekt auf die DFO-induzierte Apoptose ausgeübt, nach 30,5 Stunden scheint NAME die DFO-induzierte Apopotose im Gegenteil eher noch ein wenig zu beschleunigen. Gleichzeitig wurde in diesem Experiment untersucht, wie die eingesetzten ROS-Inhibitoren und NAME wirken , wenn der toxische DFO-Effekt durch TGF-β verstärkt wird (Verstärkung der DFO - induzierten Apoptose durch TGF-β siehe unter 3.2.4). Wie aus Abb. 3.2d hervorgeht, konnte nur Tau die Apoptose-induzierende Wirkung von DFO + TGFβ vermindern. In einem von Prof. Bauer durchgeführten Folgeexperiment (nicht dargestellt) sollte noch einmal näher untersucht werden, welche Rolle Hydroxylradikale bei der Apoptoseinduktion durch DFO spielen. Zu diesem Zweck wurden erneut 208F src3 Zellen ausgesät. Die ausgesäten Zellen wurden mit DFO und zur Verstärkung des DFO-Effekts mit DFO + TGFβ behandelt. Zusätzlich wurden die Hydroxylradikalinhibitoren Ter (Terephthalat), Man (Mannitol) und DMTHU (1,3-Dimethyl-2-thiourea, ein Hydroxylradikalfänger der auch in der Lage ist, die Zellmembran zu passieren) eingesetzt. Nach 16,5 Stunden lag der prozentuale Anteil der apoptotischen Zellen an der Gesamtzahl der Zellen im Ansatz DFO allein in etwa doppelt so hoch wie in den Versuchsansätzen DFO + Inhibitoren. Wurde zu allen Versuchsansätzen noch TGF-β hinzugefügt, so trat die Verringerung der Apoptoserate durch die Hydroxylradikalfänger noch deutlicher in den Vordergrund. Nach diesem letzten Experiment zu urteilen, spielen Hydroxylradikale bei der Vermittlung des toxischen Effektes von DFO eine Rolle. 3.2.4 Verstärkung der DFO - induzierten Apoptose durch TGF-β β Zur Untersuchung welche Wirkung TGF-β auf den DFO-Effekt ausübt, wurden 208F src3 mit TGF-β und/oder DFO behandelt. Die DFO-Konzentration betrug 50µM, TGF-β wurde in verschiedenen Konzentrationen zwischen 0,3 ng/ml und 20 ng/ml eingesetzt. Wie in Abb. - 32 - Ergebnisse 3.2e zu erkennen ist, läßt sich der toxische DFO-Effekt bereits durch die niedrigste eingesetzte TGF-β Konzentration von 0,3 ng/ml massiv steigern. Nach 24 Stunden verstärken 0,3ng/ml TGF-β den toxischen Effekt von DFO auf mehr als das 4-fache, wobei die gleiche TGF-β-Konzentration allein nur einen geringfügig höheren Apoptoseanteil als die Kontrolle zeigt. Durch noch höhere TGF-β Konzentrationen läßt sich der Prozentsatz apoptotischer Zellen weiter steigern, allerdings ist kein Unterschied in der Steigerbarkeit durch TGFβ−Κonzentrationen von 1,25 ng/ml-20ng/ml feststellbar. - 33 - Ergebnisse 100 75 50 20 ng TGF DFO 0,3 ng TGF + DFO 1,25 ng TGF + DFO 5 ng TGF + DFO 20 ng TGF + DFO DFO 0,3 ng TGF + DFO 1,25 ng TGF + DFO 5 ng TGF + DFO 20 ng TGF + DFO 5 ng TGF 1,25 ng TGF 0,3 ng TGF 20 ng TGF 100 æ 25 0 Zeitpunkt: 33,7h 75 50 5 ng TGF 0 1,25 ng TGF 25 0,3 ng TGF Apoptotische Zellen ( % ) Zeitpunkt: 24h æ Apoptotische Zellen ( % ) B. 208F src3 Abb. 3.2e: Verstärkung des toxischen Effekts von DFO durch TGF-β Je 40000 208F src3 Zellen pro Loch wurden in 24-Well-Platten eingesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. Nach 14 Stunden wurde DFO und/oder TGF-β in verschiednen Konzentrationen hinzugefügt. Die eingestellte Konzentration von DFO betrug 50µM, die TGF-β−Konzentrationen lagen zwischen 0,3ng/ml und 20ng/ml. Die verschiedenen Versuchsansätze wurden in regelmäßigen Abständen ausgezählt. . Ausgezählt wurde der prozentuale Anteil der Apoptosen von je 200 ausgezählten Zellen. Der Kontrollansatz war unbehandelt. - 34 - 3.3 Ergebnisse Mechanismus der Apoptoseinduktion durch H2O2 3.3.1 Sensitivität von 208F /208F src3 Zellen auf H2O2 Ziel des folgenden Versuches war es, die Empfindlichkeit von 208F und 208F src3 Zellen gegenüber H2O2 zu testen. Für diesen Versuch wurden transformierte bzw. nichttransformierte Fibroblasten mit ansteigenden Konzentrationen von Wasserstoffperoxid behandelt. - 35 - Ergebnisse A. 208F 80µM H 2O2 100 Apoptotische Zellen ( % ) 60µM H 2O2 40µM H 2O2 75 30µM H 2O2 50 20µM H 2O2 25 Kontrolle 0 B. 208F src3 80µM H 2O2 Apoptotische Zellen ( % ) 100 60µM H 2O2 40µM H 2O2 75 30µM H 2O2 50 25 20µM H 2O2 Kontrolle 0 0 5 10 15 20 25 Zeit ( h ) Abb. 3.3a: Apoptose-Induktion durch H2O2 Je 57000 208F bzw. 208F src3 Zellen pro Loch wurden in 12-Well-Platten eingesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden die Ansätze mit Medium gewaschen. Anschließend wurden durch H2O2 Zugabe Konzentrationen von 30, 40 und 80µM H2O2 realisiert. Die Ansätze wurden bis 10 Stunden in regelmäßigen Abständen ausgezählt, abschließend wurde noch ein 24 Stundenwert ermittelt. Ausgezählt wurde der prozentuale Anteil der Apoptosen von je 200 ausgezählten Zellen. Der Kontrollansatz war unbehandelt. - 36 - Ergebnisse Wie in Abb. 3.3a zu sehen ist, wirken 20µM H2O2 auf beide Zelllinien nur gering toxisch, während bei 30-80µM H2O2 ein deutlicher toxischer Effekt auf die Zellen zu beobachten ist, der die Zellen in den apoptotischen Zelltod treibt. Beide Zelllinien reagieren vergleichbar sensibel auf H2O2 Konzentrationen zwischen 30 und 40µM, die Sensitivität gegenüber H2O2 ist also vom transformierten Phänotyp unabhängig. 3.3.2 Wie wirkt DFO auf die von direkt hinzugegebenem H2O2 induzierte Apoptose? Für den hier beschriebenen Versuch wurden 208F bzw. 208F src3 Zellen zuerst mit DFO behandelt, anschließend wurde eine H2O2-Lösung zugegeben. H2O2 wurde also direkt zugefügt. Die Konzentrationen von H2O2 lagen im Bereich 30-80µM, die Konzentration von DFO entsprach 50µM. Der Anteil der apoptotischen Zellen wurde bis zu einer Versuchsdauer von 10 Stunden alle 2,5 Stunden bestimmt, abschließend wurde noch ein 24-Stundenwert ermittelt. - 37 - A. 208F V32+V33 B. 208F src3 100 100 80µM H 2 O2 80µM H 2 O2 + DFO 75 Ergebnisse 80µM H 2 O2 80µM H 2 O 2 + DFO 75 50 50 25 25 æ / DFO æ / DFO 0 100 60µM H 2 O2 60µM H 2 O 2 + DFO 75 Apoptotische Zellen ( % ) 0 100 60µM H 2 O2 75 50 50 25 25 60µM H 2 O 2 + DFO æ / DFO æ / DFO 0 100 0 100 40µM H 2 O2 40µM H 2 O2 75 75 40µM H 2 O2 + DFO 50 40µM H 2 O2 + DFO 50 25 25 æ / DFO æ / DFO 0 100 0 100 Time (hrs) 75 75 50 30µM H 2 O2 + DFO 25 30µM H 2 O2 50 30µM H 2 O2 30µM H 2 O2 + DFO 25 æ / DFO 0 æ / DFO 0 0 5 10 15 Zeit ( h ) 20 25 0 5 10 15 20 25 Zeit ( h ) Abb. 3.3b.:Hemmung der H2O2 induzierten Apoptose durch 50µM DFO Je 57000 208F bzw. 208F src3 Zellen pro Loch wurden in 12-Well-Platten eingesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden die Ansätze mit Medium gewaschen. Nachdem DFO (Endkonzentration 50µM) zu den Zellen gegeben worden war, wurde zur Verbesserung der DFOMischungsverhältnisse eine Wartezeit von 10 Minuten eingelegt. Anschließend wurden durch H2O2 Zugabe Konzentrationen von 30, 40 und 80µM H2O2 realisiert. Die Ansätze wurden bis 10 Stunden in regelmäßigen Abständen ausgezählt, abschließend wurde noch ein 24 Stundenwert ermittelt. Ausgezählt wurde der prozentuale Anteil der Apoptosen von je 200 ausgezählten Zellen. Der Kontrollansatz war unbehandelt. - 38 - Ergebnisse Wie in Abb. 3.3b zu sehen, hemmt DFO sowohl bei 208F als auch bei 208F src3 die Apoptoseinduktion durch 40 und 60µM H2O2. Beispielsweise beobachtet man bei 208F Zellen nach 10 Stunden mit 40µM H2O2 eine Apoptoserate von 75%, 40µM H2O2 + 50µM DFO liegen hingegen erst bei 25%. Die Wirkung von 30µM H2O2 wird nur bei den 208F Zellen durch DFO gehemmt. Die Apoptose-induzierende Wirkung von 80µM H2O2 wird durch 50µM DFO bei beiden Zelllinien nicht beeinflußt (der Kurvenverlauf von 80µM H2O2 + 50µM DFO entspricht fast deckungsgleich dem Kurvenverlauf von 80µM H2O2 allein). Zusammenfassend zeigt sich also, daß 50µM DFO die Apoptose-induzierende Wirkung mittlerer H2O2-Konzentrationen (40-60µM) hemmt. 3.3.3 Läuft die Apoptoseinduktion durch höhere H2O2 Konzentrationen Eisen-unabhängig ab? Wie bereits unter 3.3.2 beschrieben, läßt sich die Apoptose-induzierende Wirkung von 80µM H2O2 durch 50µM DFO nicht hemmen (siehe auch Abb. 3.3b). Daher stellte sich die Frage, ob hohe H2O2 Konzentrationen Eisenion-unabhängig Apoptose induzieren können. Im darauffolgenden Versuch wurden daher zusätzlich zu 50µM DFO noch eine weitere, höhere DFO-Konzentration von 200µM verwendet. 208F bzw. 208F src3 Zellen wurden zunächst mit DFO und direkt anschließend mit H2O2 behandelt. Die H2O2-Konzentrationen betrugen 40, 60, 80 µM. Anfangs wurden die apoptotischen Zellen in den Ansätze alle 2-2,5 Stunden ausgezählt, abschließend wurde auch hier ein 24-Stundenwert ermittelt. - 39 - Abb. g1 3.3-3 A.208F Apoptotische Zellen ( % ) 100 control B.208F src3 40µM H 2O2 40µM H 2O2 40µM H 2O2 50µM DFO 75 50µM DFO+40µM H 2O2 200µM DFO 50 200µM DFO+40µM H 2O2 25 0 100 Apoptotische Zellen ( % ) Ergebnisse 60µM H 2O2 60µM H 2O2 75 50 25 Apoptotische Zellen ( % ) 0 100 80µM H 2O2 75 80µM H 2O2 50 25 0 0 5 10 15 20 25 0 5 Zeit ( h ) 10 15 Zeit ( h ) 20 25 ø 50µM DFO 200µM DFO H2O2 50µM DFO + H 2O2 200µM DFO + H 2O2 Abb. 3.3c-1 : Hemmung der H2O2 induzierten Apoptose durch 50µM und 200µM DFO Je 30000 208F bzw. 208F src3 Zellen pro Loch wurden in 24-Well-Platten eingesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden die Ansätze mit Medium gewaschen. Zuerst wurde DFO (Endkonzentrationen 50µM und 200µM) zu den Ansätzen gegeben. Anschließend wurden durch H2O2 Zugabe Konzentrationen von 40, 60 und 80µM H2O2 realisiert. Die Ansätze wurden bis 10 Stunden in regelmäßigen Abständen ausgezählt, abschließend wurde noch ein 24 Stundenwert ermittelt. Ausgezählt wurde der prozentuale Anteil der Apoptosen von je 200 ausgezählten Zellen. Der Kontrollansatz war unbehandelt. - 40 - Ergebnisse 2 2 A. 208F : ø H 2 O2 60µM H 2 O2 80µM H 2 O2 75 50 200µM DFO 50µM DFO æ 200µM DFO 50µM DFO æ 200µM DFO 0 50µM DFO 25 æ Apoptotische Zellen ( % ) 100 Abb. 3.3c-2: Hemmung der H2O2 induzierten Apoptose durch 50µM und 200µM DFO Diese Abbildung zeigt einen Teil des Versuches wie unter Abb. 3.3c-1. Hier ist die Hemmung der H2O2 induzierten Apoptose durch 50µM und 200µM DFO bei 208F Zellen als Säulendiagramm dargestellt. Bei 208F Zellen wird die durch 80µM H2O2 induzierte Apoptose durch die niedrigere DFO Konzentration nicht signifikant gesenkt, berücksichtigt man die Standardabweichungen, so ist der Verlauf der beiden Kurven Wasserstoffperoxid mit oder ohne DFO in etwa gleich (Abb. 3.3c-1). Vergleicht man jedoch 80µM H2O2 + 200µM DFO mit 80µM H2O2, so stellt man fest, daß diese höhere DFO-Konzentration die Apoptoseinduktion durch 80µM H2O2 massiv hemmt. In Abb. 3.3c-2, die einen Teil des unter Abb. 3.3c-1 dargestellten Experimentes zeigt, tritt dieser Aspekt besonders deutlich hervor. So sind nach 7,5 Stunden die 208F Zellen mit 80µM H2O2 nahezu vollständig in Apoptose übergegangen, wurden zusätzlich zu H2O2 noch 200µM DFO hinzugefügt, so lag die Apoptoserate lediglich im Bereich der Kontrolle. Bei 208F src3 Zellen liegen nach 2 Stunden mit 80µM H2O2 folgende Werte der Apoptoserate vor: H2O2 allein: 66% H2O2 + 50µM DFO: 45% H2O2 + 200µM DFO: 23% Kontrolle: 10% - 41 - Ergebnisse Bei der transformierten Zelllinie führen in diesem Versuch also bereits die niedrigere DFOKonzentration zu einer Hemmung der Apoptose durch 80µM H2O2, durch die höhere DFOKonzentration wird die Apoptose noch gravierender gehemmt. Bei beiden Zelllinien senken 200µM DFO deutlich besser als 50µM DFO die Apoptoseinduktion durch 40-80µM H2O2. Noch eine kurze Anmerkung zu dem 24 Stundenwert bei 208F: hier mag man sich vielleicht fragen, wieso der Apoptosewert von 40µM H2O2 + 200µM DFO höher als der Wert von 40µM H2O2 + 50µM DFO liegt, dies ist damit zu erklären, daß zu diesem Zeitpunkt schon der direkte DFO-Effekt von 200µM DFO eine Rolle spielt. Es handelt sich bei der hohen Apoptoserate von 40µM H2O2 + 200µM DFO also um einen Effekt, der auf die toxische Wirkung von 200µM DFO zurückzuführen ist. Weitere Versuche bestätigten, daß verschiedene DFO Konzentrationen die durch H2O2 induzierte Apoptose unterschiedlich stark beeinflussen. - 42 - Ergebnisse A. 208F Apoptotische Zellen ( % ) 100 26,7h 75 7,3h 50 4,8h 25 0 2,4h 0h 0 25 50 100 200 50 100 200 B. 208F src3 Apoptotische Zellen ( % ) 100 25h 8h 75 6,3h 50 4h 25 2h 0h 0 0 25 Konzentration von DFO ( µM ) Abb. 3.3d-1: DFO-Konzentrationsabhängige Hemmung der durch 40µM H2O2 induzierten Apoptose Je 57000 208F bzw. 208F src3 Zellen pro Loch wurden in 12-Well-Platten eingesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden die Ansätze mit Medium gewaschen. Nachdem DFO (Endkonzentrationen 25, 50, 100,200µM) zu den Zellen gegeben worden war, wurde zur Verbesserung der DFOMischungsverhältnisse eine Wartezeit von 10 Minuten eingelegt. Anschließend wurde H2O2 -Lösung hinzugegeben (Endkonzentrationen von H2O2: 40µM). Die Ansätze wurden bis 10 Stunden in regelmäßigen Abständen ausgezählt, abschließend wurde noch ein 24 Stundenwert ermittelt. Ausgezählt wurde der prozentuale Anteil der Apoptosen von je 200 ausgezählten Zellen. Der Kontrollansatz war unbehandelt. 100 Zeitpunkt:9,75h 75 50 25 200µM DFO H2O2 H2O2+25µM DFO H2O2+50µM DFO H2O2+100µM DFO H2O2+200µM DFO 200µM DFO H2O2 H2O2+25µM DFO H2O2+50µM DFO H2O2+100µM DFO H2O2+200µM DFO 100µM DFO 50µM DFO 25µM DFO 0 100 B. 208F src3: Zeitpunkt: 8h 75 50 25 100µM DFO 50µM DFO 25µM DFO 0 control Apoptotische Zellen ( % ) Ergebnisse A. 208F: control Apoptotische Zellen ( % ) - 43 - Abb. 3.3d-2: DFO-Konzentrationsabhängige Hemmung der durch 40µM H2O2 induzierten Apoptose Bei diesen Säulendiagrammen handelt es sich um eine andere Darstellung der Versuche von Abb. 3.3d-1. - 44 - Ergebnisse Bei den unter Abb. 3.3d-1 und Abb. 3.3d-2 gezeigten Experimenten wurden transformierte und nicht-transformierte Zellen wie oben beschrieben eingesät und am darauffolgenden Tag mit DFO und H2O2 behandelt. Für H2O2 wurde nur eine Konzentration gewählt: 40µM, die DFO Konzentrationen lagen zwischen 25 und 200µM. Abb. 3.3d-1 zeigt eine Auftragung der apoptotischen Zellen gegen die DFO-Konzentration. Mit zunehmender Zeit liegen die Graphen entsprechend höher, jeder Graph weist über den gesamten Verlauf eine negative Steigung auf, d.h. der Anteil von durch H2O2 induzierten apoptototischen Zellen wird um so mehr gesenkt, je höher die DFO Konzentration ist. Abb. 3.3d-2 gibt Teile der unter Abb. 3.3d-1 dargestellten Experimente wider. Das Säulendiagramm zeigt für 208F Zellen die Situation zum Zeitpunkt 9,75 Stunden, für 208F src3 zum Zeitpunkt 8 Stunden. Die Höhe der Säulen entspricht dem prozentualen Anteil an Apoptosen. Im Vergleich zu H2O2 ohne DFO nimmt die Höhe der Säulen mit H2O2 + DFO mit zunehmender DFO-Konzentrationen ab, wobei bei beiden Zelllinien kein Unterschied zwischen H2O2 + 100µM DFO und H2O2 + 200µM DFO erkennbar ist. Zusammenfassend läßt sich aus den Experimenten folgern, daß auch die Apoptoseinduktion durch hohe H2O2-Konzentrationen von DFO in höheren Konzentrationen gehemmt werden kann und folglich nicht Eisenion-unabhängig ablaufen. 3.3.4 Verstärkt FeCl2 die Apoptoseinduktion durch Wasserstoffperoxid? Wie unter 3.3.2 gezeigt, läßt sich die Apoptose-induzierende Wirkung von direkt zugegebenem H2O2 durch DFO, einem Fe2+/Fe3+-Chelatkomplexbildner, hemmen. Anschließend stellte sich daher die Frage, ob umgekehrt Fe2+/Fe3+ eine Verstärkung der H2O2 induzierten Apoptose bewirkt. Um dies zu überprüfen, wurden 208F src3 Zellen mit 50µM FeCl2 und verschiedenen H2O2 Konzentrationen (20, 40, 80µM) behandelt. - 45 - Apoptotische Zellen ( % ) 100 Ergebnisse æ 20µM H2O2 75 40µM H2O2 80µM H2O2 50 FeCl 2 FeCl 2 + 20µM H2O2 25 FeCl 2 + 40µM H2O2 0 0 5 10 15 20 FeCl 2 + 80µM H2O2 Zeit ( h ) Abb. 3.3e: Beeinflußt FeCl2 die H2O2 induzierte Apoptose? Je 30000 208F src3 Zellen pro Loch wurden in 24-Well-Platten eingesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. Zuerst wurde FeCl2 (Endkonzentration 50µM) zu den Ansätzen gegeben. Anschließend wurden durch H2O2 Zugabe Konzentrationen von 20, 40 und 80µM H2O2 realisiert. Volumina an H2O2-Lösung hinzugefügt. Die Ansätze wurden bis 10 Stunden in regelmäßigen Abständen ausgezählt, abschließend wurde noch ein 24 Stundenwert ermittelt. Ausgezählt wurde der prozentuale Anteil der Apoptosen von je 200 ausgezählten Zellen. Der Kontrollansatz war unbehandelt. - 46 - Ergebnisse Apoptotische Zellen ( % ) 100 75 50 25 0 0 5 10 15 20 25 Zeit ( h ) æ FeCl 2 20µM H2 O2 FeCl 2 +20µM H2 O2 30µM H2 O2 FeCl 2 +30µM H2 O2 40µM H2 O2 FeCl 2 +40µM H2 O2 80µM H2 O2 FeCl 2 +80µM H2 O2 Abb. 3.3f : Beeinflußt FeCl2 die H2O2 induzierte Apoptose? Je 30000 208F src3 Zellen pro Loch wurden in 24-Well-Platten eingesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. Zuerst wurde FeCl2 (Endkonzentration 50µM) zu den Ansätzen gegeben. Anschließend wurden durch H2O2 Zugabe Konzentrationen von 20,30, 40 und 80µM H2O2 realisiert. Die Ansätze wurden bis 10 Stunden in regelmäßigen Abständen ausgezählt, abschließend wurde noch ein 24 Stundenwert ermittelt. Ausgezählt wurde der prozentuale Anteil der Apoptosen von je 200 ausgezählten Zellen. Der Kontrollansatz war unbehandelt. Wie aus Abb. 3.3e hervorgeht, beeinflusst FeCl2 die durch H2O2 induzierte Apoptose offenbar nicht. Bei der Wiederholung dieses Versuches (siehe Abb. 3.3f), bei der zusätzlich noch eine weitere H2O2 Konzentration von 30µM eingesetzt wurde, konnte dieses Ergebnis allerdings nicht bestätigt werden. Hier ist bei 80µM H2O2 eine leichte Steigerung, bei 40µM H2O2 eine - 47 - Ergebnisse leichte Hemmung und bei 30µM H2O2 eine deutliche Hemmung der Apoptoserate durch den Zusatz von 50µM FeCl2 erkennbar. Im Folgeexperiment wurde lediglich eine einzige, mittlere H2O2 Konzentration eingesetzt, gleichzeitig wurde die FeCl2 Konzentration variiert, sie lag zwischen 12,5 und 200µM. Wie aus dem Säulendiagramm(siehe Abb. 3.3g)zum Zeitpunkt 2,7 Stunden hervorgeht, beträgt der Anteil der apoptotischen Zellen im Versuchsansatz H2O2 + 12,5µM FeCl2 mit 29% deutlich weniger als im Ansatz ohne FeCl2 Zusatz (41 %). Mit zunehmender FeCl2 Konzentration steigt die Apoptoserate, wobei H2O2 + 200µM FeCl2 mit 66% einen erheblich höheren Prozentsatz aufweist, als H2O2 ohne FeCl2 Zugabe. Fasst man diese Versuchsergebnisse zusammen, so lässt sich sagen, dass FeCl2 sowohl einen 100 75 50 200µM FeCl2 + H2O2 50µM FeCl2 + H2O2 100µM FeCl2 + H2O2 12,5µM FeCl2 + H2O2 25µM FeCl2 + H2O2 H2O2 0 50µM FeCl2 100µM FeCl2 200µM FeCl2 25 æ 12,5µM FeCl2 25µM FeCl2 Apoptotische Zellen ( % ) steigernden, als auch einen hemmenden Effekt auf die H2O2 induzierte Apoptose ausübt. Abb. 3.3g: Beeinflußt FeCl2 die H2O2 induzierte Apoptose? Je 57000 208F src3 Zellen pro Loch wurden in 12-Well-Platten eingesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden die Ansätze mit Medium gewaschen. Nachdem FeCl2 (Endkonzentrationen 12.5, 25, 50, 100, 200µM) zu den Zellen gegeben worden war, wurde zur Verbesserung der FeCl2Mischungsverhältnisse eine Wartezeit von 10 Minuten eingelegt. Anschließend wurde H2O2 -Lösung hinzugegeben (Endkonzentrationen von H2O2: 40µM). Die Ansätze wurden bis 10 Stunden in regelmäßigen Abständen ausgezählt, abschließend wurde noch ein 24 Stundenwert ermittelt. Ausgezählt wurde der prozentuale Anteil der Apoptosen von je 200 ausgezählten Zellen. Der Kontrollansatz war unbehandelt. - 48 - Ergebnisse 3.3.5 Ist die Hemmung der H2O2-induzierten Apoptose durch DFO nach Zugabe eines Eisensalzes aufgehoben? Wie unter 3.3.2 beschrieben, hemmt DFO den durch H2O2 induzierten apoptotischen Zelltod. Wenn diese Hemmung auf dem Entzug von Fe2+/Fe3+ beruht, so müsste sie durch die Zugabe von FeCl2 aufhebbar sein. Dadurch dass FeCl2 selber jedoch auch auf die H2O2 vermittelte Apoptose einwirkt und diese sowohl hemmend als auch steigernd beeinflussen kann, lässt sich die oben beschriebene Fragestellung durch einen Versuchsansatz in dem die drei Substanzen H2O2, DFO, FeCl2 eingesetzt werden, nicht aufklären. Die Tabelle soll verdeutlichen, wie FeCl2 + DFO die H2O2 induzierte Apoptose beeinflusst und welche Wirkung gleichzeitig FeCl2 alleine ausübt. FeCl2+H2O2 > H2O2 FeCl2+H2O2 = H2O2 FeCl2+H2O2< H2O2 DFO+FeCl2+H2O2 > H2O2 DFO+FeCl2+H2O2 = H2O2 DFO+FeCl2+H2O2 < H2O2 Anhand folgenden Säulendiagramme sollen beispielhaft einige der Kombinationsmöglichkeiten erläutert werden. Aus Übersichtlichkeitsgründen sind jeweils nur Teile verschiedener Experimente dargestellt. Für alle Versuche wurden 208F src3 Zellen ausgesät, über Nacht bei 37°C inkubiert und am darauffolgenden Tag mit FeCl2, DFO und H2O2 behandelt. Die Konzentrationen der verschiedenen Substanzen variieren zwischen den verschiedenen Versuchen nur geringfügig. Ergebnisse 100 75 50 DFO + FeCl2 + H2O2 DFO + H2O2 FeCl2 + H2O2 H2O2 DFO + FeCl2 DFO 0 FeCl2 25 æ Apoptotische Zellen ( % ) - 49 - Abb. 3.3h-1: Wirkung von FeCl2 und DFO auf die H2O2-induzierte Apoptose Je 57000 208F src3 Zellen pro Loch wurden in 12-Well-Platten eingesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden die Ansätze mit Medium gewaschen. Zunächst wurden FeCl2 und DFO (Endkonzentrationen jeweils 50µM) zugefügt. Anschließend wurde H2O2 -Lösung hinzugegeben (Endkonzentration von H2O2: 40µM). Die Ansätze wurden bis 10 Stunden in regelmäßigen Abständen ausgezählt, abschließend wurde noch ein 24 Stundenwert ermittelt. Ausgezählt wurde der prozentuale Anteil der Apoptosen von je 200 ausgezählten Zellen. Der Kontrollansatz war unbehandelt. Säulendiagramm Abb. 3.3h-1 zeigt einen Versuch, bei dem FeCl2 die H2O2 induzierte Apoptose nicht beeinflusste (Hemmung und Verstärkung der H2O2 vermittelten Apoptose durch FeCl2 heben sich offenbar gegenseitig auf). Wurde zusätzlich zu FeCl2 und H2O2 noch DFO hinzugefügt, so lag die Apoptoserate nur wenig niedriger als bei H2O2 allein, die durch DFO beobachtbare Hemmung der H2O2 induzierten Apoptose war im Ansatz FeCl2 + DFO + H2O2 also aufgehoben. Ergebnisse 100 75 50 DFO + FeCl2 + H2O2 DFO + H2O2 FeCl2 + H2O2 H2O2 DFO + FeCl2 DFO 0 FeCl2 25 æ Apoptotische Zellen ( % ) - 50 - Abb. 3.3h-2: Wirkung von FeCl2 und DFO auf die H2O2-induzierte Apoptose Je 57000 208F src3 Zellen pro Loch wurden in 12-Well-Platten eingesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden die Ansätze mit Medium gewaschen. Zunächst wurden FeCl2 und DFO (Endkonzentrationen jeweils 50µM) zugefügt. Anschließend wurde H2O2 -Lösung hinzugegeben (Endkonzentration von H2O2: 30µM). Die Ansätze wurden bis 10 Stunden in regelmäßigen Abständen ausgezählt, abschließend wurde noch ein 24 Stundenwert ermittelt. Ausgezählt wurde der prozentuale Anteil der Apoptosen von je 200 ausgezählten Zellen. Der Kontrollansatz war unbehandelt. Im darauf folgenden Versuch (Diagramm Abb. 3.3h-2 hebt FeCl2 die durch DFO Zusatz beobachtbare Verminderung der H2O2 induzierten Apoptose nicht auf. Die hohe Standardabweichung der Apoptoserate im Versuchsansatz FeCl2 + H2O2 weist noch einmal darauf hin, dass FeCl2 sowohl hemmend als auch verstärkend auf die H2O2 induzierte Apoptose wirken kann: hier scheint in einem Ansatz die Hemmung und im anderen die Verstärkung in den Vordergrund zu treten (alle Versuchsansätze wurden doppelt bestimmt). Ergebnisse 100 75 50 DFO + FeCl2 + H2O2 DFO + H2O2 FeCl2 + H2O2 H2O2 DFO + FeCl2 DFO 0 FeCl2 25 æ Apoptotische Zellen ( % ) - 51 - Abb. 3.3h-3: Wirkung von FeCl2 und DFO auf die H2O2-induzierte Apoptose Je 57000 208F src3 Zellen pro Loch wurden in 12-Well-Platten eingesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden die Ansätze mit Medium gewaschen. Zunächst wurden FeCl2 (Konzentration: 100µM) und DFO (Endkonzentrationen 50µM) zugefügt. Anschließend wurde H2O2 -Lösung hinzugegeben (Endkonzentration von H2O2: 40µM). Die Ansätze wurden bis 10 Stunden in regelmäßigen Abständen ausgezählt, abschließend wurde noch ein 24 Stundenwert ermittelt. Ausgezählt wurde der prozentuale Anteil der Apoptosen von je 200 ausgezählten Zellen. Der Kontrollansatz war unbehandelt. Das letzte Experiment (Diagramm Abb. 3.3h-3) zeigt eine Verstärkung der durch H2O2 verursachten Apoptose durch FeCl2, diese Verstärkung wird auch durch den Zusatz von DFO nicht gemindert. 3.3.6 Wird die H2O2 induzierte Apoptose über ROS (reactive oxygen species) vermittelt? Ziel der folgenden Experimente war es, zu erforschen auf welche Art und Weise Wasserstoffperoxid Apoptose induziert. In Vorversuchen wurden wiederholt verschiedene extrazelluläre ROS-Inhibitoren, wie beispielsweise SOD (Superoxiddismutase, ein extrazellulärer O2—Fänger) und Ter (Terephtalat, ein extrazellulärer OH-Radikalfänger) eingesetzt. Eine Hemmung der H2O2 induzierten Apoptose konnte durch diese Inhibitoren nie beobachtet werden. Dies könnte die Hypothese bestätigen, daß H2O2 induzierte Apoptose über direkte Lipidperoxidation der Zellmembran abläuft. - 52 - Ergebnisse Für die in Abb. 3.3i dargestellten Versuche wurden wie in den vorangegangenen Experimenten die beiden Zellinien 208F und 208F src3 verwandt. Bevor die Zellen mit H2O2 (40µM) behandelt wurden, wurden die verschiedenen Inhibitoren zu den Versuchsansätzen hinzugefügt. Eingesetzt wurden die in der Tabelle aufgeführten Substanzen: Terephthalat (Ter) ein extrazellulärer OH-Radikal-Fänger Superoxiddismutase (SOD) extrazellulärer O2—Fänger Apocynin: NADPH-Oxidase-Inhibitor Mannitol: extrazellulärer OH-Radikal-Fänger Deferrioxamin (DFO): Fe2+/Fe3+-Chelator Dimethylthiourea (DMTHU): zellmembranpermeabler OH-Radikal-Fänger Mn(II)tetrakis(1-Methyl-4-pyridyl)porphyrin Pentachloride (MnTMPyP): zellmembranpermeabler O2--Fänger - 53 - Ergebnisse 2 2 A. 208F æ HH O22 22O 40µM 40µM H O 40 µM H2O22 2 Ohne H2O2 75 50 DMTHU æ Ter SOD DFO MnTMPyP Apocynin Mannitol 0 DMTHU 25 æ Ter SOD DFO MnTMPyP Apocynin Mannitol Apoptotische Zellen ( % ) 100 B. 208F src3 : æ H2O2 Ohne H2O2 40µM H2O2 40 µM H2O2 75 50 æ Ter SOD DFO MnTMPyP Apocynin Mannitol DMTHU 0 DMTHU 25 æ Ter SOD DFO MnTMPyP Apocynin Mannitol Apoptotische Zellen ( % ) 100 Abb. 3.3i: Kann die H2O2 induzierte Apoptose durch bestimmte Inhibitoren gehemmt werden? Je 30000 208F bzw. 208F src3 Zellen pro Loch wurden in 24-Well-Platten eingesät und bei 37°C über Nacht inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden die Ansätze mit Medium gewaschen. Zunächst wurden die - 54 - Ergebnisse verschiedenen Hemmstoffe zu den Versuchsansätzen pippetiert, dann wurde die Hälfte der Ansätze mit H2O2 behandelt. Es wurden folgende Substanzen in den unten aufgeführten Konzentrationen eingesetzt: Substanz: Konzentration: Funktion: Terephthalat (Ter): 200µM extrazellulärer OH-Radikal-Fänger Superoxiddismutase (SOD): 150U/ml extrazellulärer O2--Fänger Deferrioxamin (DFO): 200µM Fe2+/Fe3+-Chelator MnTMPyP: 100µM zellmembranpermeabler O2--Fänger Apocynin: 50µg/ml NADPH-Oxidase-Inhibitor Mannitol: 10mM extrazellulärer OH-Radikal-Fänger DMTHU: 10mM zellmembranpermeabler OH-Radikal-Fänger H 2O 2: 40µM Der Kontrollansatz war unbehandelt. Die Ansätze wurden bis 10 Stunden in regelmäßigen Abständen ausgezählt, abschließend wurde noch ein 24 Stundenwert ermittelt. Ausgezählt wurde der prozentuale Anteil der Apoptosen von je 200 ausgezählten Zellen. Die prozentualen Anteile der Apoptosen für die Zellinie 208F sind hier zum Zeitpunkt 5 Stunden, für 208F src3 zum Zeitpunkt 6 Stunden dargestellt. Die Säulendiagramme (siehe Abb. 3.3i) zeigen die prozentualen Anteile der apoptotischen Zellen an der Gesamtzahl der Zellen für die Zellinie 208F nach 5 Stunden Versuchsdauer, für 208F src3 nach 6 Stunden. Der H2O2-Apoptoseprozentsatz liegt für 208F Zellen bereits bei 83%, wurden zusätzlich zu H2O2 noch die extrazellulären ROS-Inhibitoren Ter, SOD oder Mannitol hinzugefügt, so lagen die Werte zwischen 83 und 88%, eine Senkung gegenüber H2O2 allein ist also nicht erkennbar. Alle anderen ROS-Inhibitoren zeigen jedoch eine Hemmung der H2O2 induzierten Apoptose. So liegen die Apoptoseprozentsätze von H2O2+Apocynin mit 27% und die von H2O2+DFO mit 12% deutlich unter dem Apoptoseprozentsatz von H2O2 (83%). Die beiden übrigen ROS-Inhibitoren MnTMPyP und DMTHU senken die H2O2-Apoptoseprozentsätze sogar auf Werte, die dem Wert des unbehandelten Kontrollansatz entsprechen (4%). Bei 208F src3 Zellen zeigt sich die gleiche Charakteristik der Hemmbarkeit der durch zugefügtes H2O2 induzierten Apoptose: die extrazellulären ROS-Inhibitoren Ter, SOD, Mannitol senken die H2O2-induzierte Apoptose nicht, während die zellmembranpermeablen Substanzen MnTMPyP, Apocynin und DMTHU zu einer Hemmung führen. DFO, das zwar nicht zellmembranpermeabel ist, aber in der Lage ist, den intrazellulären Fe2+/Fe3+-Spiegel zu senken, senkt ebenfalls die H2O2-induzierte Apoptose. - 55 - Ergebnisse Aufgrund der Versuchsergebnisse ist nachgewiesen, daß auch die durch zugeführtes H2O2 induzierte Apoptose über ROS abläuft, die Hypothese, daß H2O2 über direkte Lipidperoxidation zum apoptotischen Zelltod führt, konnte somit widerlegt werden. Ein wichtiger Punkt der durch zugeführtes Wasserstoffperoxid induzierten Apoptose ist, dass das entscheidende Signal für die Auslösung des apoptotischen Zelltods über intrazelluläre oder intramembranäre und nicht über extrazelluläre ROS vermittelt wird. - 56 - Diskussion 4 Diskussion 4.1 Mechanismus der Apoptoseinduktion durch Wasserstoffperoxid Ivanovas et al. (2002) zeigten in ihrer Arbeit, daß die H2O2-induzierte Apoptose weder durch den Superoxydradikal-Inhibitor SOD noch durch den Hydroxylradikalfänger Terephthalat hemmbar ist. Aufgrund dieser Ergebnisse schlussfolgerten sie, daß die H2O2-induzierte Apoptose direkt durch H2O2 vermittelt wird. Wegen der fehlenden Abhängigkeit der Apoptoseinduktion durch H2O2 von der extrazellulären O2- -Generation (einem Kennzeichen transformierter Zellen) war erklärbar, dass die H2O2-induzierte Apoptose nicht selektiv auf transformierte Zellen wirkte, sondern transformierte und nicht-transformierte Zellen gleichermassen beeinflusste. Allerdings bezogen sich diese Schlüsse auf Versuchsergebnisse, die durch den Einsatz von extrazellulären ROS-Fängern gewonnen wurden. In der hier vorliegenden Arbeit wurde unter Einbeziehen von intrazellulären ROS-Fängern untersucht, ob die Apoptose induzierende Wirkung von H2O2 tatsächlich auf eine direkte Wirkung von H2O2 zurückzuführen ist, oder doch indirekt über Hydroxylradikale aus der Fenton-Reaktion hervorgerufen wird (siehe Abb. 4.1a). - 57 - Diskussion Abb. 4.1 a: Apoptose-Induktion durch die extrazellulär ablaufende Haber-Weiss-Reaktion Wasserstoffperoxid wird über die Eisen(Fe2+)-getriggerte Fenton-Reaktion zu Hydroxylradikalen und Hydroxydanionen umgesetzt. Die Hydroxylradikale stellen das eigentliche Apoptose-induzierende Agens dar und treiben die Zellen in den programmierten Zelltod. Damit das in der Fenton-Reaktion oxidierte Eisen (Fe3+) wieder für die Fenton-Reaktion zur Verfügung steht, wird es durch Superoxidanionen, welche von einer Membran-assoziierten NADPH-Oxidase gebildet werden, rückreduziert. Transformierte Zellen zeichnen sich im Gegensatz zu nicht-transformierten Zellen durch eine hohe Superoxidanionen-Reaktion aus, während nichttransformierte Zellen nur eine vernachlässigbare Menge an Superoxidanion bilden (Bauer G. 2002). - 58 - Diskussion Eine Senkung der H2O2-induzierten Apoptose durch die extrazellulär wirkenden ROSInhibitoren SOD und Ter kann in der hier vorliegenden Arbeit ebenfalls nicht beobachtet werden. Auch Mannitol, ein weiterer extrazellulärer Hydroxylradikalfänge, hat keinen Einfluß auf die H2O2-induzierten Apoptose, aber sowohl der zellmembranpermeable Hydroxylradikalfänger DMTHU als auch das zellgängige SOD-Mimetikum MnTMPyP hemmen die H2O2-induzierten Apoptose deutlich (siehe Abb. 3.3i). Entscheidend für die Senkung der H2O2-induzierten Apoptose durch einen ROS-Inhibitor ist also die intrazelluläre Wirksamkeit des Inhibitors. Weitergehend kann auch durch den zellmembranpermeablen Eisenchelator DFO und durch Apocynin, einem Inhibitor der NADPH-Oxidase eine gravierende Verminderung der H2O2induzierten Apoptose erzielt werden. Mit den eingesetzten ROS-Inhibitoren konnte nicht nur gezeigt werden, dass intrazellulär Hydroxylradikale für die H2O2-induzierte Apoptose verantwortlich sind, weitergehend konnte geklärt werden, dass Wasserstoffperoxid tatsächlich über die intrazelluläre ablaufende Fenton-Reaktion die Zellen in den apoptotischen Zelltod treibt (siehe Abb. 4.1b), somit konnte die Hypothese von Ivanovas et al., dass H2O2 direkt und nicht über Hydroxylradikale seine schädigende Wirkung entfaltet, widerlegt werden. - 59 - Diskussion Abb. 4.1 b: Apoptose-Induktion in transformierten und nicht-transformierten Fibroblasten durch eine intrazellulär ablaufende Haber-Weiss-Reaktion Von extern zugegebenes Wasserstoffperoxid permeiert die Zellmembran von transformierten und nichttransformierten Fibroblasten. Intrazellulär wird Wasserstoffperoxid über die Haber-Weiss-Reaktion zu Hydroxydanionen und Hydroxylradikalen umgesetzt. Die Hydroxylradikale vermitteln anschließend über Lipidperoxidation das entscheidende Signal für die Einleitung der Apoptose. (Reaktionsgleichungen der Eisen-Katalysierten Haber-Weiss-Reaktion: 3. O2ּ- + Fe 3+ → O2 + Fe 2+; 4. Fe2+ + H2O2 → OHּ + OH + Fe3+ (die 2. Reaktion stellt die klassische Fenton-Reaktion dar)) - 60 - Diskussion Aufgrund dieser Ergebnisse postulieren wir folgenden Mechanismus für die H2O2-induzierte Apoptose (siehe Abb. 4.1c): Wasserstoffperoxid passiert die Zellmembran und wird intrazellulär mithilfe der Fenton-Reaktion in Hydroxylradikale und Hydroxylanionen zerlegt. Die Hydroxylradikale vermitteln anschließend über Lipidperoxidation das entscheidende Signal für die Einleitung der Apoptose (Latour et al., 1992). Da es sich bei der FentonReaktion um eine Reaktion handelt, welche von der Fe2+-Konzentration abhängt, ist sie durch den Zellmembran permeablen Eisen-Chelator DFO hemmbar. Auch der intrazellulär wirksame Hydroxylradikalfänger DMTHU senkt die H2O2-vermittelte Apoptose, während die nur extrazellulär wirkenden Reaktanden Terephthalat und Mannitol die H2O2-induzierte Apoptose nicht beeinflussen. Bei der Fenton-Reaktion wird Fe2+ zu Fe3+ oxidiert. Um wieder für die Fenton-Reaktion zur Verfügung zu stehen, muß Fe3+ reduziert werden, dies erfolgt, indem Superoxidanionen, die von den Zellen regeneriert werden, ein Elektron auf Fe3+ übertragen. Diese Reaktion wird zusammen mit der Fenton-Reaktion als Haber-Weiss-Reaktion bezeichnet. Bei der HaberWeiss-Reaktion handelt es sich also eigentlich um das Aneinanderketten von zwei verschiedenen Vorgängen: Reaktionsgleichungen der Metall-Katalysierten Haber-Weiss-Reaktion: 1. O2ּ- + Fe 3+ → O2 + Fe 2+ 2. Fe2+ + H2O2 → OHּ + OH + Fe3+ (die 2. Reaktion stellt die klassische Fenton-Reaktion dar) Durch das Wegfangen von intrazellulären Superoxidanionen durch den 2+ zellmembranpermeablen ROS-Scavenger MnTMPyP wird die Reduktion von Fe verhindert, die intrazelluläre Fenton-Reaktion kann dann nicht mehr ablaufen. Da die für die für die Apoptose auslösende Wirkung von H2O2 entscheidende intrazelluläre Haber-Weiss-Reaktion nicht mehr stattfindet, wird in Anwesenheit von MnTMPyP der Prozentsatz der apoptotischen Zellen an der Gesamtzahl der Zellen deutlich gesenkt. Die nicht-zellgängige SOD kann diese intrazellulär ablaufende Reaktion im Gegensatz zum zellgängigen MnTMPyP nicht beeinflussen. Produziert werden die Superoxidanionen von der NADPH-Oxidase. Bisher nahm man an, dass diese Enzym nur in der Zellmembran existiert (Babior et al., 1984) neuere Publikationen postulieren jedoch, dass dieses Enzym auch intrazellulär vorhanden ist (Sijtsema et al., 2000; Li JM und Shah AM, 2002; Vaisiere et al, 1995). - 61 - Diskussion Für die Existenz einer intrazellulären NADPH-Oxidase spricht außerdem der Befund, dass Apocynin, ein Inhibitor der NADPH-Oxidase, der offenbar auch in der Lage ist, die Zellmembran zu passieren, ebenfalls die H2O2-induzierte Apoptose stark senkt. Transformierte Zellen unterscheiden sich von nicht-transformierten Zellen durch eine höhere ּO2--Abgabe an der Zellmembran (Irani et al., 1997; Jürgensmeier et al., 1997). Diese vermehrteּ O2--Abgabe ermöglicht es den transformierten Zellen ihren transformierten Phänotyp aufrechtzuerhalten. Wären allein die an der Zellmembran gebildeten Superoxidanionen für die Reduktion von Fe3+ verantwortlich, so müssten transformierten Zellen empfindlicher auf Wasserstoffperoxid reagieren, da sie aufgrund der vermehrten Superoxidanionen-Produktion Fe3+ schneller zu Fe2+ reduzieren könnten. Dies ist jedoch nicht der Fall. Auch hier könnte eine intrazellulär vorhandene NADPH-Oxidase die Erklärung für diesen Sachverhalt sein. Wenn transformierte und nicht-transformierte Zellen sich in dem Gehalt ihrer intrazellulären NADPH-Oxidase nicht unterscheiden, so werden sie auch keine unterschiedliche Sensitivität gegenüber Wasserstoffperoxid aufweisen. In der Literatur wird DFO als sehr effizienter Eisenchelator beschrieben, der jedoch wegen seiner hydrophilen Eigenschaften nur langsam durch die Zellmembran permeiert (Einsele et al., Günther et al.; Zanninelli et al.). Festzuhalten ist jedoch, dass DFO den intrazellulären FeSpiegel senken kann, daher ist es plausibel, dass DFO die über eine intrazelluläre FentonReaktion ablaufende Apoptoseinduktion durch H2O2 hemmt. Unter der Annahme, dass DFO zwar nach 24h zu eine deutliche Komplexierung von intrazellulärem Eisen führt, nach einer kürzeren Zeitspanne von 2h der intrazelluläre Fe2+/Fe3+-Spiegel jedoch kaum durch DFO beeinflusst wird (Zanninelli et al., 1997; Kicic et al.,2001) mag eine intrazellulär ablaufende Fenton-Reaktion als Hauptursache für eine H2O2induzierte Apoptose unwahrscheinlich erscheinen. Berücksichtigt werden muß jedoch, dass Zellmembranen unterschiedlicher Zelllinien auch unterschiedliche Permeabilitäten aufweisen, da in der mir bekannten Literatur keine Angaben über die Permeabilitäten der hier verwandten Zelllinien existieren, lassen sich über die DFO-Permeabilität nur Angaben machen, denen Daten anderer Zellmembranen oder Lipiddoppelschichten zu Grunde liegen. Alle in diesem Abschnitt besprochenen Ergebnisse beruhen auf Experimenten, in denen DFO zusätzlich zu H2O2 zu den Zellen gegeben wurde, die Konzentration von H2O2 war also recht hoch, da es sich um von extern zugeführte Mengen handelte. Wie Gardner et al., 1997 in ihrer Arbeit zeigen konnte, besitzt H2O2 die Eigenschaft, die Membranpermeabilität für [3H]Saccharose zu steigern, dieser Aspekt unterstützt wiederum die These einer frühzeitigen Senkung des Fe2+/Fe3+-Spiegels durch DFO. - 62 - Diskussion Eine gesteigerte Membranpermeabilität könnte es einerseits dem langsam Zellmembranpermeablen DFO erleichtern, die Zellmembran zu passieren und/oder es andererseits Fe2+/Fe3+ ermöglichen in den Extrazellulärraum zu diffundieren, wo die Ionen durch DFO komplexiert werden. Gleichzeitig könnte trotzdem eine Impermeabilität für andere Stoffe wie z. Bsp. große Moleküle wie SOD bestehen bleiben. Eine alternative Erklärung für die Hemmbarkeit der H2O2-induzierten Apoptose durch intrazellulär wirkende ROS-Inhibitoren (DMTHU, MnTMPyP) und DFO, nicht aber durch extrazelluläre ROS-Inhibitoren (Mannitol, Terephthalat, SOD) könnte die Apoptoseinduktion über eine innerhalb der Zellmembran ablaufende Metall-katalysierte Haber-Weiss-Reaktion sein. Intrazelluläre ROS-Inhibitoren müssten in der Lage sein, eine innerhalb der Membran ablaufende Zerlegung von zugefügten H2O2 über die Haber-Weiss-Reaktion zu hemmen, indem sie entweder das entstehende Hydroxylradikal wegfangen (DMTHU) oder die zur Reduktion von Fe3+notwendigen Superoxidanionen entfernen (SOD) oder gar nicht erst entstehen lassen (Apocynin). In verschiedenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass DFO imstande ist an die Zellmembran gebundenes Fe2+/Fe3+ von der Membran abzulösen und zu komplexieren (Günther et al, 1994; Driomina et al., 1992), dadurch kann auch DFO eine innerhalb der Zellmembran ablaufende Zerlegung von H2O2 in Hydroxylradikale und Hydroxylanionen mithilfe der Fenton-Reaktion verhindern. Anschließende kann keine Lipidperoxidation durch auf diesem Wege erzeugte Hydroxylradikale stattfinden. - 63 - Diskussion Abb. 4.1 c: Mechanismus der Apoptose-Induktion in transformierten und nichttransformierten Fibroblasten durch eine intrazellulär ablaufende Haber-Weiss-Reaktion Von extern zugegebenes Wasserstoffperoxid permeiert die Zellmembran von transformierten und nichttransformierten Fibroblasten. Intrazellulär wird Wasserstoffperoxid über die Haber-Weiss-Reaktion zu Hydroxydanionen und Hydroxylradikalen umgesetzt. Die Hydroxylradikale vermitteln anschließend über Lipidperoxidation das entscheidende Signal für die Einleitung der Apoptose. Die in der Haber-Weiss-Reaktion oxidierten Eisen(Fe3+)-Ionen werden durch Suoeroxidanionen, welche von einer intrazellulären NADPHOxidase gebildet werden, zu Fe2+ rückreduziert. (Reaktionsgleichungen der Eisen-Katalysierten Haber-Weiss-Reaktion: 5. O2ּ- + Fe 3+ → O2 + Fe 2+; 6. Fe2+ + H2O2 → OHּ + OH + Fe3+ (die 2. Reaktion stellt die klassische Fenton-Reaktion dar)) Da es sich bei der intrazellulär ablaufenden Haber-Weiss-Reaktion um eine Eisen-Ion und Superoxidanionabhängige Reaktion handelt, wird die Reaktion durch den zellmembran-permeablen Eisenchelator DFO und durch den intrazellulär wirksamen Superoxidanionen-Fänger MnTMPyP gehemmt. Der nicht zellmembranpermeable Superoxid-Anion-Fänger SOD hemmt nur die extrazelluläre Haber-Weiss-Reaktion und beeinflusst daher die über eine intrazelluläre Haber-WeissReaktion induzierte Apoptose durch von extern zugegebenes Wasserstoffperoxid nicht. Das entscheidende Signal zur Apoptose-Induktion durch Wasserstoffperoxid wird durch die in der Haber-Weiss-Reaktion intrazelllulär gebildeten Hydroxylradikale hervorgerufen, daher hemmt der Hydroxylradikalfänger DMTHU, der in der Lage ist, die Zellmembran zu passieren, die H2O2-induzierte Apoptose, während die nur extrazellulär wirksamen Hydroxylradikalfänger Terephthalat und Mannitol keine Apoptose-senkende Wirkung ausüben. - 64 - 4.2 Diskussion Rolle der Fenton-Reaktion für die durch Wasserstoffperoxid induzierte Apoptose Werden Fe2+/Fe3+-Ionen durch DFO komplexiert, so sinkt die Konzentration von freiem Fe2+, es steht also weniger freies Fe2+ als Elektronendonator der Fenton-Reaktion zur Verfügung, somit entstehen weniger Hydroxylradikale, die die Zellen in die Apoptose treiben (siehe Abb. 4.2a). Abb. 4.2 a: Apoptose-Induktion in transformierten und nicht-transformierten Fibroblasten durch eine intrazellulär ablaufende Haber-Weiss-Reaktion Von extern zugegebenes Wasserstoffperoxid permeiert die Zellmembran von transformierten und nichttransformierten Fibroblasten. Intrazellulär wird Wasserstoffperoxid über die Haber-Weiss-Reaktion zu Hydroxydanionen und Hydroxylradikalen umgesetzt. Die Hydroxylradikale vermitteln anschließend über Lipidperoxidation das entscheidende Signal für die Einleitung der Apoptose. (Reaktionsgleichungen der Eisen-Katalysierten Haber-Weiss-Reaktion: 1. O2ּ- + Fe 3+ → O2 + Fe 2+; 2. Fe2+ + H2O2 → OHּ + OH + Fe3+ (die 2. Reaktion stellt die klassische Fenton-Reaktion dar)) Die Toxizität von alleinigem DFO spielt für diese Effekte keine Rolle. Da die Wirkung von zugeführtem H2O2 sehr schnell vollständig ausgeprägt ist (alle H2O2-Experimente liefen über einen Zeitraum von maximal ca. 24h, während der direkt toxische DFO-Effekt auch von hohen Konzentrationen frühestens nach 12-24h sichtbar ist), konnte die Wirkung von DFO auf die H2O2-induzierte Apoptose ohne Probleme studiert werden. - 65 - Diskussion Durch DFO komplexiertes Eisen reagiert laut Einsele et al., 1986 nicht mit Superoxidanionen, komplexiertes Fe3+ kann auf diesem Wege also nicht reduziert werden und steht daher anschließend auch nicht als Elektronendonator zur Verfügung. Dies steht im Einklang mit der deutlichen Herabsetzung der toxischen Wirkung von Wasserstoffperoxid durch DFO. Nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit der Fenton-Reaktion durch die reduzierte Fe2+Konzentration stark ab, so können andere Reaktionen des H2O2 an Bedeutung gewinnen. Vorstellbar ist zum Beispiel, dass Wasserstoffperoxid in diesem Fall vermehrt Serumbestandteile (Proteine) oxidiert, oder einfach in Wasser und Sauerstoff zerfällt: 2 H2O2 → 2H2O + O2 Die Apoptoseinduktion durch Wasserstoffperoxid ist wie oben beschrieben Eisen-abhängig, denn H2O2 treibt die Zellen letztendlich über eine intrazellulär ablaufende Fenton-Reaktion in den natürlichen Zelltod. DFO entzieht der Fenton-Reaktion die notwendigen Eisenionen und hemmt dadurch die durch H2O2 induzierte Apoptose. Trotzdem ist, wie im Ergebnisteil unter 3.3.4 dargestellt, nach Zugabe von FeCl2 sowohl ein steigernder als auch ein hemmender Effekt von FeCl2 auf die H2O2 induzierte Apoptose zu beobachten. Wie lässt sich dies erklären? Entscheidend für die erfolgreiche Entfaltung des toxischen Effektes einer Noxe ist, dass die Noxe ihren Wirkort erreicht. Auf Zellebene bedeutet dies, dass die Noxe in das Innere der Zelle oder zumindest in die Nähe der Zellmembran gelangen muß. Räumlich sind folgende drei Vorgänge, die auch in Abb. 4.2b dargestellt sind, zu berücksichtigen: a) Wasserstoffperoxid diffundiert in die Zelle hinein und wird hier mithilfe der FentonReaktion in Hydroxylradikale und Hydroxylanionen zerlegt. Die Hydroxylradikale treiben die Zellen anschließend in den natürlichen Zelltod. b) Die Zerlegung von Wasserstoffperoxid findet in unmittelbarer Nähe der Zellmembran oder sogar unmittelbar innerhalb der Zellmembran statt. Die entstehenden Hydroxylradikale treiben die Zelle in Apoptose. c) Wasserstoffperoxid wird fernab der Zelle in Hydroxylradikale und Hydroxylanionen zerlegt. Da die Hydroxylradikale nur eine limitierte Reichweite von wenigen nm haben, gelangen sie erst gar nicht in Zellnähe und können daher auch keinen Schaden anrichten. Dieser Vorgang übt auf diese Weise sogar einen zellprotektiven Effekt aus, denn auch die Konzentration von Wasserstoffperoxid in unmittelbarer Umgebung der - 66 - Diskussion Zellen wird so gesenkt werden, da fernab der Zellen weniger H2O2 übrig bleibt, das bis auf Reichweite der Zellen diffundieren kann. Alle drei Vorgänge laufen nebeneinander ab. Ab einer Konzentration von ca. 20µM H2O2 ist der Schwellenwert erreicht, an dem sowohl transformierte als auch nicht transformierte Fibroblasten beginnen in Apoptose überzugehen, dass heißt, ab 20µM H2O2 summieren sich Vorgang a und b zu einem Signal, das stark genug ist, um die Zellen in den natürlichen Zelltod zu treiben. Wird dem System zusätzlich FeCl2 in hohen Konzentrationen zugeführt, so wird die Reaktionsgeschwindigkeit der Fenton-Reaktion beschleunigt, da die Wahrscheinlichkeit, dass ein H2O2-Molekül auf ein Fe2+-Ion trifft, gesteigert wird. Außerdem ist bei einer hohen Fe2+ Konzentration im System die Fenton-Reaktion weniger auf die Reduktion von Fe3+ zu Fe2+angewiesen. Von den lokalen Mischungs- und Konzentrationsverhältnissen wird es abhängen, welcher der drei räumlichen Vorgänge durch die Behandlung mit Fe2+ am meisten beschleunigt wird und so einen senkenden oder steigernden Einfluß auf die Wasserstoffperoxid-induzierte Apoptose ausübt. Bereits Fritz Haber hat über den Einfluß verschiedener Mischungsverhältnissse beim Einträufeln von Ferrosalzlösung in überschüssige, sehr verdünnte Hydroperoxidlösung geäußert: „Man kann mit denselben Lösungen ebenso wohl die kleineren wie die größeren Verbrauchsverhältnisse erlangen, weil es sich um eine Reaktion handelt, bei der die Vermischungsgeschwindigkeit mit der Reaktionsgeschwindigkeit konkurriert und das Reaktionsergebnis von den Konzentrationsverhältnissen abhängt“ (Haber und Weiss, Naturwissenschaften 1931). Obwohl in allen Experimenten die zugeführten Substanzen durch mehrmaliges Auf-und Abziehen in der Pipette gut im Versuchsansatz durchmischt wurden, wird die lokale Konzentration an einem bestimmten Ort im Versuchsansatz nie genau gleich sein, da sie von vielen lokalen Faktoren abhängt. Überwiegt der Apoptose-steigernde Effekt der Vorgänge a und b, so scheint Fe2+ eine Apoptose erhöhende Wirkung auszuüben. Steht hingegen die Steigerung der Fenton-Reaktion fernab der Zelle (also Vorgang c) im Vordergrund, so übt Fe2+ für den Betrachter einen senkenden Effekt auf die H2O2-induzierte Apoptose aus. Die dritte Möglichkeit besteht darin, dass sich durch zusätzlich zugeführtes Fe2+ die Effekte der Vorgänge a + b und c gegenseitig aufheben, so dass nach außen hin keine Veränderung der H2O2-vermittelten Apoptose durch Fe2+ Zufuhr zu erkennen ist. Da Fe2+ sowohl einen - 67 - Diskussion Apoptose-steigernden als auch einen Apoptose-senkenden Effekt auf die Wasserstoffperoxid vermittelte Apoptose zeigen kann, lässt sich durch einen Versuchsansatz in dem die Zellen mit H2O2, DFO und FeCl2 behandelt werden, nicht überprüfen, ob der Apoptose-hemmende Effekt auf die Wasserstoffperoxid-induzierte Apoptose auf einen Eisenentzug zurückzuführen ist. Abb. 4.2 b: Bedeutung der Lokalisation der Fenton-Reaktion für die Apoptose-induzierende Wirkung von aus der Fenton-Reaktion hervorgegangenen Hydroxylradikalen Abhängig von dem Ort, an dem die Fenton-Reaktion abläuft, üben aus der Fenton-Reaktion entstandene Hydroxylradikale eine Apoptose-induzierende Wirkung aus oder nicht. Drei verschiedene Lokalisationen werden unterschieden: a) Intrazellulär:Wasserstoffperoxid diffundiert in die Zelle hinein und wird hier mithilfe der FentonReaktion in Hydroxylradikale und Hydroxylanionen zerlegt. Die Hydroxylradikale treiben die Zellen anschließend in den natürlichen Zelltod. b) Zellmembran:Die Zerlegung von Wasserstoffperoxid findet in unmittelbarer Nähe der Zellmembran oder sogar unmittelbar innerhalb der Zellmembran statt. Die entstehenden Hydroxylradikale treiben die Zelle in Apoptose. c) Zellfern:Wasserstoffperoxid wird fernab der Zelle in Hydroxylradikale und Hydroxylanionen zerlegt. Da die Hydroxylradikale nur eine limitierte Reichweite von wenigen nm haben, gelangen sie erst gar nicht in Zellnähe und können daher auch keinen Schaden anrichten. - 68 - 4.3 Diskussion Auslösung der Apoptose durch DFO (Desferrioxamin) Es konnte nachgewiesen werden, dass DFO (Desferrioxamin), ein Eisenchelatbildner, abhängig von der zugeführten Konzentration Apoptose induziert (siehe 3.2.1). Dies steht zunächst in scheinbarem Widerspruch zum Metall katalysierten Haber-Weiss-Zyklus. Zur Untersuchung des toxischen Effekts von DFO auf Zellen wurde DFO entweder allein, gemeinsam mit ROS-Inhibitoren oder zusammmen mit TGF-β eingesetzt, externes Wasserstoffperoxid wurde nicht zugeführt. Ist in diesem Abschnitt von Wasserstoffperoxid die Rede, so handelt es sich um spontan durch Dismutation von Superoxidanionen entstandenes Wasserstoffperoxid. Die H2O2-Konzentrationen von spontan entstandenem Wasserstoffperoxid sind normalerweise so niedrig, dass die Zellen sie ohne weiteres über einen längeren Zeitraum tolerieren (M. Herdener et al., 2000). Dismutation: 2 O2ּ- + 2 H+ → H2O2 + O2 k = 2 · 105 M-1 s-1 für die spontane Reaktion, SOD beschleunigt die Reaktion Wird zusätzlich zu DFO noch TGF-β zu den Zellkulturen gegeben, so ist der Prozentsatz apoptotischer Zellen deutlich höher als in den Ansätzen, die lediglich mit DFO alleine behandelt wurden. TGF-β verstärkt also die Apoptose-induzierende Wirkung von DFO - oder handelt es sich dabei vielmehr umgekehrt um eine Verstärkung des TGF-β Signaling durch DFO? TGF-β veranlasst Effektorzellen sowohl NO als auch eine Peroxidase freizusetzen (Herdener et al., 2000). Wie von Eynatten et al., 2001 zeigen konnten, kann die Effektorzellfunktion von den gleichen Zellen übernommen werden, die auch als Zielzellen fungieren; in homogenen Zellkulturansätzen, wie sie in dieser Arbeit verwendet wurden, sind also sowohl Zielzellen als auch Effektorzellen enthalten. Auch in nicht mit exogenem TGF-β behandelten Ansätzen ist Peroxidase und NO enthalten, da von Zielzellen gebildetes TGF-β (Herdener et al., 2000) die Effektorzellen stimuliert NO und Peroxidase freizusetzen (siehe Abb. 4.3a). - 69 - Diskussion Abb. 4.3 a: Interzelluläres Signalling: Von Zielzellen gebildetes TGF-β stimuliert Effektorzellen NO und Peroxidase freizusetzen. Da die Effektorzellfunktion von den gleichen Zellen übernommen werden kann, die auch als Zielzellen fungieren sind in homogenen Zellkulturansätzen, wie sie in dieser Arbeit verwendet wurden, sowohl Zielzellen als auch Effektorzellen enthalten. Daß Peroxidase offenbar eine wichtige Rolle für die Apoptoseinduktion durch DFO spielt, wird dadurch deutlich, dass ABH, ein spezifischer Myeloperoxidase-Inhibitor (Kettle et al., 1995), in der Lage ist, die DFO-induzierte Apoptose, erheblich zu senken. Auch die durch DFO und exogen zugeführtes TGF-β hervorgerufene Apoptose kann bis zu einem bestimmten Zeitpunkt durch ABH vermindert werden. Peroxidase katalysiert die Umsetzung von H2O2 und Cl- zu HOCl, welches anschließend direkt mit O2- zu Hydroxylradikalen, Chlorid-Anionen und Sauerstoff reagiert (siehe Abb. 4b). Reaktionsgleichung: HOCl + O2.- → .OH+ Cl- + O2 k = 107 M-1 s-1 - 70 - Diskussion Abb. 4.3 b: Interzelluläres Signalling: Verstärkung des HOCl-Wegs durch DFO: Durch spontane Dismutation von Superoxidanionen entsteht Wasserstoffperoxid, welches Peroxidase- katalysiert zu Hypochloriger Säure umgesetzt wird. HOCl reagiert an der Zellmembran mit Superoxidanionen zu molekularem Sauerstoff, Chloridanionen und Hydroxylradikalen. Die Hydroxylradikale stellen die eigentliche Apoptose-induzierende Noxe dar. Dieser Weg wird duch DFO verstärkt, indem DFO die Eisen-abhängige Fenton-Reaktion, welche Wasserstoffperoxid fernab der Zelle „konsumiert“, verhindert. DFO verhindert weiterhin die Reaktion von HOCl mit Eisenionen fernab der Zelle, wodurch mehr HOCl für die ApoptoseInduktion zur Verfügung steht. Der HOCl-Weg wird durch den Myeloperoxidase-Inhibitor ABH, den HOCL-Fänger Taurin und durch die Hydroxylradikalfänger Terephthalat, Mannitol und DMTHU gehemmt. SOD (Superoxiddismutase) bewirkt keine Hemmung des durch DFO verstärkt ablaufenden HOCl-Wegs, was wahrscheinlich auf eine Interaktion von DFO mit dem Kupfer-Ion des katalytischen Zentrums der SOD zurückzuführen ist. Transformierte Zellen reagieren empfindlicher auf DFO als nicht transformierte Zellen, da sie eine erhöhte O2Konzentration an der Zellmembran aufweisen. HOCl kann zwar auch Eisen-abhängig über eine Fenton-Reaktion zu Hydroxylradikalen umgesetzt werden, diese Reaktion ist jedoch im Vergleich zur direkten Reaktion mit Superoxid-Anionen deutlich langsamer, so dass in der Nähe der Zellmembran, wo sich von der NADPH-Oxidase der Zelle gebildete Superoxidanionen befinden, vor allem die oben beschriebene Reaktion stattfindet. Reaktionsgleichung: HOCl + Fe2+ → .OH+ Cl- + Fe3+ k = 2,20 · 102 M-1 s-1 (Candeias L.P et al., 1994) - 71 - Diskussion Die Beobachtung, dass Taurin, ein HOCl-Fänger (Kearns et al., 2000; Nakamori et al., 1990), die Apotoseinduktion durch DFO und DFO+TGF-β deutlich und anhaltend hemmt, unterstützt die Hypothese eines vermehrt ablaufenden HOCl-Wegs nach DFO Behandlung. HOCl selber besitzt keine Lipidperoxidation auslösende Wirkung (Hu, M.L. et al. 1993; Panasenko et al., 1997),sondern führt über Lipidperoxidation durch Hydroxylradikale den natürlichen Zelltod herbei, daher hemmen die Hydroxylradikalfänger Ter, DMTHU und Man die durch DFO und DFO+TGF-β induzierte Apoptose (siehe Abb. 4.3b). Eisen wirkt hemmend auf das TGF-β Signaling. Diese Hemmung ist normalerweise für den Betrachter nicht sichtbar, da sich immer Eisen im System befindet, erst wenn DFO Eisenionen komplexiert und somit hemmende Nebenreaktionen verhindert, wird diese Hemmung auch erkennbar. Indem DFO die Fenton-Reaktion von H2O2 durch Wegfangen von Fe2+ verhindert, erhöht es die Menge von H2O2, das für die Einspeisung in den HOCl-Weg zur Verfügung steht (siehe Abb. 4.3b). Theoretisch kann zwar auch H2O2 direkt mit Superoxidanionen, die von den Zellen gebildet werden und sich nur in der unmittelbaren Nähe der Zelle befinden, (Superoxidanionen haben nur einen sehr geringe Diffusionsweg von wenigen µm (Saran und Bors, 1994)) reagieren, dieser Reaktion kommt praktisch jedoch keine Bedeutung zu , da sie nur sehr langsam verläuft. Im Gegensatz dazu läuft die Reaktion von HOCl mit Superoxidanionen deutlich schneller ab – die Reaktionskonstante der HOCl-Reaktion ist mit einer Reaktionskonstante von k = 107 M-1 s-1 erheblich höher als die der H2O2-Reaktion mit k = 100 M-1 s-1 (Saran M. et al., 1998). Reaktionsgleichungen: HOCl + O2.- → .OH+ Cl- + O2 k = 107 M-1 s-1 H2O2 + O2.- → .OH + OH- + O2 k = 100 M-1 s-1 Allerdings bewirkt SOD (Superoxiddismutase) keine Hemmung des toxischen DFO-Effekts, dies ist ein Befund, der auf den ersten Blick gegen die Hypothese eines vermehrt ablaufenden HOCl-Wegs nach Blockade der Fenton-vermittelten H2O2-Umsetzung spricht. Bei SOD handelt es sich um ein Enzym, das in seinem katalytischen Zentrum ein Cu-Ion enthält, es ist durchaus denkbar, dass DFO mit diesem Ion interagiert und dadurch das Enzym unwirksam wird. DFO besitzt zwar als Chelatbildner eine sehr hohe Spezifität für Fe-Ionen, komplexiert jedoch mit geringerer Affinität auch Cu-Ionen. - 72 - Diskussion Fernab der Zelle, wo HOCl auf keine Superoxidanionen (Superoxidanionen befinden sich nur in unmittelbarer Nähe der Zellmembran) trifft, reagiert HOCl normalerweise mit Fe2+ und wird auf diese Weise unschädlich gemacht. Reaktionsgleichung: HOCl + Fe2+ → .OH+ Cl- + Fe3+ k = 2,20 · 102 M-1 s-1 (Candeias L.P et al., 1994) Bei Anwesenheit von DFO findet auch diese Nebenreaktion nicht statt, wodurch wiederum mehr HOCl in die Reaktion mit zellnahen Superoxidanionen fließt und zu zellschädigenden Hydroxylradikalen reagiert. Transformierte Zellen zeichnen sich durch eine höhere O2-. Produktion an ihrer Zelloberfläche aus, dadurch stehen mehr O2- für die Dismutation zu H2O2 zur Verfügung, mehr H2O2 kann zu HOCl umgewandelt werden, welches wiederum mit einer erhöhten Menge von O2- an der Zelloberfläche von transformierten Zellen reagieren kann. Die erhöhte O2- Konzentration an der Zellmembran ist also dafür verantwortlich, dass transformierte Zellen empfindlicher auf DFO reagieren als nicht transformierte Zellen. Die toxische Wirkung von DFO beruht also letztendlich auf einer Verstärkung des TGF-β Signaling über eine Ankurbelung des HOCl-Wegs. Neben der Stimulierung der Freisetzung einer Peroxidase stimuliert TGF-β die Effekorzellen . NO freizusetzen, welches anschließen an der Zellmembran mit O2-. zu Peroxynitrit reagiert (Squadrito GL and Pryor WA, 1998; Huie RE and Padmaja S, 1993). Reaktionsgleichung: . NO + O2- → ONOO- Peroxynitrit führt über Lipidperoxidation und Reaktion mit DNA und Proteinen zum natürlichen Zelltod (Salgo MG et al., 1995; Radi R et al., 1991), trotzdem führte NAME, ein Hemmstoff der NO-Synthese nicht zu einer Abschwächung der DFO-induzierte Apoptose – wie lässt sich dies erklären? Laut P. Di Mascio et al., 2000 fungiert DFO auch als ONOO- Fänger, so dass ONOO- seine zellschädigende Wirkung in Anwesenheit von DFO gar nicht ausüben kann (siehe Abb. 4.3c). - 73 - Diskussion Abb. 4.3 c: Interzelluläres Signalling:DFO und der NO-Weg (erster Teil) Von Zielzellen gebildetes TGF-β stimuliert Effektorzellen NO und Peroxidase freizusetzen. NO reagiert an der Zellmembran mit Superoxidanionen zu Peroxynitrit. Peroxynitrit führt über Lipidperoxidation und Reaktion mit DNA und Proteinen zur Apoptose. DFO wirkt als Peroxynitrit-Fänger und inhibiert daher die Peroxynitritinduzierte Apoptose. NAME, ein Hemmstoff der NO-Synthese, schwächt die DFO-induzierte Apoptose nicht ab, da der Peroxynitrit-Weg für die DFO-induzierte Apoptose keine Rolle spielt, weil DFO Peroxynitrit abfängt. In Anwesenheit von DFO läuft der HOCl-Weg verstärkt ab, bei dem Wasserstoffperoxid mit Chloridionen durch eine Peroxidase zu HOCl umgesetzt wird, welches über Hydroxylradikale Apoptose induziert. Weil Peroxynitrit, das das Apoptose auslösende Agens von .NO darstellt, in Anwesenheit von DFO gar nicht erst zum Zuge kommt, übt NAME auch keinen hemmenden Einfluß auf die DFO-induzierte Apoptose aus. NAME kann im Gegenteil noch eine leichte Verstärkung der DFO-induzierte Apoptose bewirken, da einerseits kein Peroxynitrit mehr mit DFO reagiert, somit also mehr DFO zum Chelatieren von Fe2+/Fe3+ zur Verfügung steht und andererseits Peroxynitrit auch nicht mehr mit H2O2 reagiert (P. Di Mascio et al., 1994; Alvarez B. et al.,1995), so dass auch mehr H2O2 in den HOCl-Weg eingespeist werden kann (siehe Abb. 4.3d). Reaktionsgleichung: ONOO- + H2O2 → O2 + H2O + NO2- - 74 - Diskussion Abb. 4.3 d: Interzelluläres Signalling: DFO und der NO-Weg (zweiter Teil) Von Zielzellen gebildetes TGF-β stimuliert Effektorzellen NO und Peroxidase freizusetzen. NO reagiert an der Zellmembran mit Superoxidanionen zu Peroxynitrit. Peroxynitrit führt über Lipidperoxidation und Reaktion mit DNA und Proteinen zur Apoptose. DFO wirkt als Peroxynitrit-Fänger und inhibiert daher die Peroxynitritinduzierte Apoptose. NAME, ein Hemmstoff der NO-Synthese, schwächt die DFO-induzierte Apoptose nicht ab, da der Peroxynitrit-Weg für die DFO-induzierte Apoptose keine Rolle spielt, weil DFO Peroxynitrit abfängt. NAME kann die DFO-induzierte Apoptose sogar noch leicht verstärken, da einerseits kein Peroxynitrit mehr mit DFO reagiert , somit also mehr DFO zum Chelatieren von Fe2+/Fe3+ zur Verfügung steht und andererseits Peroxynitrit auch nicht mehr mit H2O2 reagiert so dass auch mehr H2O2 in den HOCl-Weg eingespeist werden kann. Langzeiteffekte, die über eine Verarmung der Zelle an Fe-haltigen Enzymen die Zellen schließlich in den natürlichen Zelltod treibt, spielen für den innerhalb der ersten Tage nach DFO-Behandlung zu beobachtenden toxischen Effekt von DFO keine Rolle. Den unschlagbaren Beweis, dass die DFO-induzierte Apoptose über eine Verstärkung des TGF-β-Signaling ausgelöst wird, lieferte ein Experiment von Georg Bauer, in dem die Apoptose-induzierende Wirkung von DFO durch TGF-β-Antikörper komplett inhibiert werden konnte. - 75 - 4.4 Diskussion Klinische Relevanz der Ergebnisse Eine Fehlregulation der Apoptose kann zu zahlreichen Erkrankungen führen. Eine zu hohe Apoptoserate kann beispielsweise zu einer chronischen Hepatits oder zu einem Myokardinfarkt führen, wohingegen eine zu niedrige Apoptoserate Autoimmunerkrankungen oder Tumorerkrankungen hervorrufen kann. Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen der Apoptose ist daher notwendig, um die Entwicklung neuer Therapieansätze für Erkrankungen, denen Fehlsteuerungen der Apoptose zugrunde liegen, zu ermöglichen. Die Aufklärung des Mechanismus der H2O2-induzierten Apoptose trägt dazu einen Teil bei. Auch die Erkenntnisse der Untersuchung der von räumlichen Mischungs- und Konzentrationsbedingungen abhängigen Wirkung von Fe2+ auf die über eine Fenton-Reaktion vermittelte Apoptoseinduktion durch H2O2 ergänzen das bisherige Wissen über intra- und extrazelluläre Apoptoseinduktion. Desweiteren konnte in der vorliegenden Dissertation gezeigt werden, dass transformierte Fibroblasten deutlich empfindlicher auf DFO reagieren als nicht-transformierte Fibroblasten. Dass diesem Punkt auch in vivo eine wichtige Bedeutung zukommt, belegen klinische Studien, in denen DFO als Chemotherapeutikum eingesetzt wurde. Bereits 1990 konnten Donfrancesco et al. eine anti-tumore Wirkung von DFO in Patienten mit Neuroblastom belegen, in Ratten wurde DFO erfolgreich zur Therapie des Adenokarzinoms der Mamma eingesezt (Xian P. Jiang et al., 2002). Bislang war der genaue Mechanismus, über den DFO die Apoptose in den Tumorzellen anschaltete, jedoch unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass die DFO-induzierte Apoptose auf eine Verstärkung des TGF-β-Signaling zurückzuführen ist. Diese Erkenntnisse ergänzen das bisherige Wissen über intra- und extrazelluläre Apoptoseinduktion durch ROS-vermittelte Signalwege. - 76 - Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden Zellkulturexperimente mit einer transformierten und einer nicht-transformierten Fibroblastenlinie durchgeführt. Im Mittelpunkt stand dabei die Fenton-Reaktion, bei der H2O2 über eine Fe2+ getriggerte Reaktion zu Hydroxylradikalen umgesetzt wird, sowie die Rolle, die die Fenton-Reaktion für die durch H2O2 induzierte Apoptose spielt. Desweiteren wurde untersucht, welchen Effekt DFO, ein Eisenchelator, auf transformierte und nicht-transformierte Zellen ausübt. Folgende Punkte konnten herausgearbeitet werden: 1) H2O2 induziert indirekt über eine intrazelluläre oder innerhalb der Zellmembran ablaufende Fenton-Reaktion Apoptose. 2) Fe2+ übt sowohl einen Apoptose steigernden, als auch einen Apoptose senkenden Effekt auf die durch Wasserstoffperoxid vermittelte Apoptose aus. Von den lokalen Mischungs- und Konzentrationsverhältnissen hängt es ab, ob eher eine Erhöhung oder eine Verminderung der Apoptoseinduktion durch Fe2+ vermittelt wird. Steht eine Steigerung der Fenton-Reaktion innerhalb der Zelle oder innerhalb bzw. in unmittelbarer Nähe der Zellmembran im Vordergrund, so ist eine Steigerung der Apoptoseinduktion zu beobachten, wohingegen eine Steigerung der Fenton-Reaktion fernab der Zelle einen zellprotektiven Effekt ausübt. 3) Bei niedrigen H2O2-Konzentrationen, die auf spontane Dismutation von O2zurückzuführen sind, steht eine Verstärkung des TGF-β-Signaling durch DFO im Vordergrund. Indem DFO als Eisenchelator die Fenton-Reaktion verhindert, wird die H2O2 Konzentration gesteigert und somit steht anschliessend mehr H2O2 für die Einspeisung in den TGF-β-abhängigen HOCl-Weg zur Verfügung, wodurch die TGF-β-vermittelte Apoptose verstärkt wird. Auf diesem Wege induziert DFO selber Apoptose. Da transformierte Zellen sich durch eine höhere O2- Produktion an ihrer Zelloberfläche auszeichnen, welches einerseits für die Dismutation zu H2O2 benötigt wird und andererseits direkt im HOCl-Weg verbraucht wird, reagieren transformierte Zellen empfindlicher auf DFO als nicht transformierte Zellen. - 77 - Literaturverzeichnis 6 Literaturverzeichnis Adams M J (2003) review: “Ways of dying.multiple pathways to apoptosis” Genes & development 17:2481-2495 Alvarez B. et al. 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Ich danke Herrn Prof. Dr. G. Bauer für die Betreuung und Diskussionsbereitschaft während der Durchführung dieser Arbeit. Seine ansteckende Begeisterung hat auch mich motiviert und in mir den Drang geweckt, mehr auf dem Gebiet der reaktiven Sauerstoffspezies entdecken zu wollen. Herrn Dr. O. Opitz danke ich für sein Interesse an dieser Arbeit und für die freundliche Übernahme des Korreferats. Meinen Mitdoktoranden Wibke Bechtel, Amei Ludwig und Sandra Schütz danke ich für die schöne gemeinsame Zeit im Labor und die zahlreichen anregenden Diskussionen zum Thema. Susanne Zabel danke ich für ihre Hilfsbereitschaft im Laboralltag. Ebenso möchte ich mich bei all meinen Freunden, insbesondere Astrid und Christina bedanken, die immer ein offenes Ohr für mich hatten. Meinem Bruder Christian sei Dank für sein Interesse an dieser Arbeit. Meinem Ehemann Olaf Meincke danke ich für die Unterstützung während des gesamten Studiums und der Promotion, für die Hilfe beim Aufrüsten des Computers (jetzt ist er wirklich leiser) und beim Lösen sonstiger PC-Probleme sowie für das Korrekturlesen der Dissertation. Besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mir das Studium ermöglicht haben und mir stets enormen Rückhalt gegeben haben. - 87 - Lebenslauf Persönliche Angaben Name: Cordula Meincke Anschrift: Stockerenweg 9 3014 Bern Geburtsdatum/-ort: 17.04.1978 in Witten Familienstand: verheiratet Nationalität: deutsch Schulbildung 1984 - 1986 Grundschule Witten 1986 - 1988 Grundschule Heinsberg 1988 - 1997 Kreisgymnasium Heinsberg; Erwerb der Allgemeinen Hochschulreife am 11.06.1997, Note: 1,3 Hochschulstudium 1997-2004 Studium der Medizin an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg 09/1999 Ärztliche Vorprüfung; Note: 2,0 08/2000 1. Staatsexamen; Note: 2,0 09/2003 2. Staatsexamen; Note: 2,3 10/2003-08/2004 Praktisches Jahr mit Wahlfach Pädiatrie 10/2004 3. Staatsexamen; Note: 1,0 Promotion und Berufserfahrung 04/ 2001 Beginn der experimentellen Doktorarbeit in der virologischen Abteilung des Institutes für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene; Thema: „Rolle der Fenton-Reaktion für die Wasserstoffperoxid-induzierte Apoptose“ seit 03/2005 Assistenzärztin am Spital des Sensebezirks in Tafers - 88 Auslandserfahrung 2002 5-wöchige Famulatur auf einer Station der inneren Medizin in Hobart, Australien 2002 8-wöchige Famulatur auf den Gebieten "Emergency Medicine" und "Cardiology" im Concord Repatriation Hospital Sydney, Australien 2003 - 2004 1. PJ-Tertial (16 Wochen) Pädiatrie am All Children's Hospital St. Petersburg, USA im Rahmen eines bilateralen Austauschprogramms der Universität Freiburg mit der University of South Florida; Stipendium der Landesstiftung BadenWürttemberg 2004 2. PJ-Tertial (14 Wochen) Chirurgie am Kantonsspital Glarus, Schweiz weitere Kenntnisse und Interessen 1999 - 2002 Beteiligung an organisatorischen und betreuenden Aufgaben des Deutschen Famulantenaustausches (DFA) 2001 - 2002 Leitung der Lokalvertretung Freiburg des DFA Hobbys: Reisen, Skifahren, Wandern, Segeln Sprachen: Englisch (fließend in Wort und Schrift) Französisch (Grundkenntnisse) Spanisch (Grundkenntnisse) Latein Bern, den 17. Dezember 2006
