Die Bedeutung der peribronchialen Drüsen in der Pathogenese
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Aus dem Institut für Pathologie der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil - Universitätsklinik Leiter: Prof. Dr. med. K. Morgenroth, Prof. Dr. med. K.-M. Müller Die Bedeutung der peribronchialen Drüsen in der Pathogenese obstruktiver Lungenerkrankungen am Beispiel der Infektion mit dem Respiratory Syncytial Virus Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Olaf Anhenn aus Wuppertal 2004 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. K. Morgenroth Koreferent: PD Dr. med. O. Wildner Tag der Mündlichen Prüfung: 24.05.2005 Widmung Zwei Personen, ohne die diese Dissertation nicht existieren würde, gilt mein besonderer Dank. Jenen beiden Personen widme ich daher diese Dissertation. Meiner Mutter schulde ich für Ihre finanzielle Hilfe während des Studiums und ihren stetigen moralischen Beistand meinen immerwährenden Dank. Herrn Professor Morgenroth danke ich für die ungewöhnlich großzügige finanzielle Unterstützung und die freie Hand, die er mir bei den wissenschaftlichen Arbeiten gelassen hat. IV. Inhaltsverzeichnis Kapitel Titel I. Deckblatt 1 II. Blatt 2 2 III. Widmung 3 IV. Inhaltsverzeichnis 4 V. Abkürzungsverzeichnis 9 VI. Verzeichnis der Tabellen 12 VII. Verzeichnis der Abbildungen 13 1. Einleitung 17 2. Stand der Wissenschaft 19 2.1. Respiratory Syncytial Virus (RSV) 19 2.1.1. Historie, Taxonomie und Klassifizierung 19 2.1.2. Struktur und Zusammensetzung des Virions 20 2.1.2.1. Aufbau 20 2.1.2.2. Genom 21 2.1.2.3. Proteine 22 2.1.2.3.1. Oberflächenproteine 22 2.1.2.3.1.1. Das Fusionsprotein (RSV-F) 22 2.1.2.3.1.2. Das Attachmentprotein (RSV-G) 23 2.1.2.3.1.3. Das kleine hydrophobe Protein (RSV-SH) 25 2.1.2.3.2. Matrixproteine 25 2.1.2.3.2.1. Das Matrixprotein (RSV-M) 26 2.1.2.3.2.2. Das zweite Matrixprotein (RSV-M2) 26 2.1.2.3.3. Nucleoproteinkomplex 27 2.1.2.3.3.1. Die Polymerase (RSV-L) 27 2.1.2.3.3.2. Das Nucleoprotein (RSV-N) 27 2.1.2.3.3.3. Das Phosphoprotein (RSV-P) 27 2.1.2.3.4. Nicht-Strukturproteine 28 2.1.3. Antigene Subgruppen 28 Seite 2.1.4. Replikationszyklus des RSV 30 2.1.4.1. Attachment an und Penetration in die Wirtszelle 30 2.1.4.2. Replikation, Transkription und Translation 30 2.1.4.2.1. Transkription 30 2.1.4.2.2. Translation 32 2.1.4.2.3. Bildung der genomischen RNA 32 2.1.4.3. Morphogenese der Virionen 33 2.1.4.4. Budding 33 2.1.5. Mutanten 34 2.1.6. Pathogenese und Pathologie der RSV-Infektion 35 2.1.6.1. Epidemiologie 35 2.1.6.2. Pathogenese 35 2.1.6.2.1. Immunpathogenese 37 2.2. Experimentelle Virusinfektionen 38 2.2.1. Begriff der Suszeptibilität 39 2.2.2. Begriff der Permissivität 39 2.3. Peribronchiale Drüsen 40 2.3.1. Aufbau und Morphologie 40 2.3.1.1. Seröse Drüsenepithelzellen 40 2.3.1.2. Muköse Drüsenepithelzellen 41 2.3.1.3. Myoepithelzellen 41 2.3.1.4. Zellen der Drüsenausführungsgänge 42 2.3.1.5. Zellen des umgebenden Bindegewebes 42 2.3.2. Sekret 42 2.3.3. Lektinmarkierungen 43 2.3.4. Immunhistochemie 43 2.3.4.1. Laktoferrin 43 2.3.4.2. Lysozym 45 2.3.4.3. Sekretorische Komponente des IgA 45 2.3.5. Primärkultur peribronchialer Drüsenepithelzellen 46 2.4. Asthma bronchiale, Atemwegshyperreaktivität und 47 chronisch obstruktive Lungenerkrankungen (COPD) 2.4.1. Definitionen 47 2.4.2. Epidemiologie von Asthma bronchiale und COPD 47 2.4.3. Pathophysiologie - Gemeinsamkeiten und Unterschiede 48 2.4.3.1. Exazerbationen 49 2.4.3.2. Rolle der peribronchialen Drüsen 50 2.4.3.3. Bedeutung des Transkriptionsfaktors NFκB 51 2.4.3.4. Bedeutung von Interleukin 5 (IL-5) 56 2.4.3.5. Einfluss von Viren, insbesondere RSV 57 2.4.3.5.1. RSV und NFκB 58 2.4.3.5.2. RSV, RSV-G und IL-5 59 3. Material und Methoden 60 3.1. Primärkultur humaner peribronchialer Drüsenepithelzellen 60 3.1.1. Isolierung 60 3.1.2. Kultivierung 61 3.1.3. Überprüfung von Reinheit und 61 Differenzierung der Primärkultur 3.2. Experimentelle Infektion mit RSV 62 3.2.1. RSV-Wildtyp (RSV-Wt) und RSV-Mutante (RSV-Mu) 62 3.2.2. Inokulation mit RSV 62 3.2.3. Kontrolle des Infektionserfolges 62 3.2.3.1. Nachweis der Suszeptibilität 62 3.2.3.2. Nachweis der Permissivität 63 3.3. Mikroskopie 64 3.3.1. Lichtmikroskopie 64 3.3.1.1. Phasenkontrastmikroskopie 64 3.3.1.2. Fluoreszenzmikroskopie 64 3.3.1.2.1. Fluoreszenzmarkierungen 64 3.3.1.2.1.1. Allgemeines 64 3.3.1.2.1.2. DNA- oder Kern-Markierungen 65 3.3.1.2.1.3. Markierungen mit fluorochromierten Lektinen 66 3.3.1.2.1.4. Indirekte Immunfluoreszenzmarkierungen 66 3.3.1.2.1.5. Kombinierte Lektin- und indirekte Immunfluoreszenz 66 3.3.1.2.1.6. Konfokale Laser-Raster-Mikroskopie (CLSM) 69 3.3.2. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 71 3.4. IL-5-ELISA 71 4. Ergebnisse 72 4.1. Qualität der Primärkultur 72 4.1.1. Reinheit hinsichtlich des epithelialen Charakters 72 4.1.2. Differenzierung der Primärkultur 74 4.1.2.1. Transmissionselektronenmikroskopie 75 4.1.2.2. Immunfluoreszenz und 80 konfokale Laser-Raster-Mikroskopie 4.1.2.3. Funktion der Primärkultur 87 4.1.2.3.1. Lektinmarkierungen 87 4.1.2.3.2. Immunfluoreszenz 92 4.2. Infektion mit RSV 96 4.2.1. Nachweis der Suszeptibilität 96 4.2.2. Nachweis der Permissivität 98 4.2.3. Vergleich zwischen RSV-Wildtyp und RSV-Mutante 99 4.2.3.1. Morphologie der Infektion im Zeitverlauf 99 4.2.3.1.1. Immunfluoreszenz und konfokale 99 Laser-Raster-Mikroskopie (CLSM) 4.2.3.1.2. Transmissionselektronenmikroskopie 131 4.2.3.2. Immunfluoreszenz der Vakuolen bei 155 Infektion mit der RSV-Mutante 4.2.4. Auswirkungen der RSV-Infektion auf die Funktion der 158 peribronchialen Drüsenepithelzellen in Primärkultur 4.2.5. RSV und NFκB 164 4.2.6. RSV und Interleukin 5 174 5. Diskussion 177 5.1. Reinheit und Differenzierung der Primärkultur 177 5.2. Infizierbarkeit mit RSV 178 5.3. Auswirkungen der RSV-Infektion auf Struktur und 179 Funktion der peribronchialen Drüsenepithelzellen 5.4. RSV-Mutante 180 5.5. RSV und NFκB 181 5.6. RSV und IL-5 183 6. Zusammenfassung 184 7. Literaturverzeichnis 186 VIII. Danksagung 222 IX. Lebenslauf 223 V. Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung AdV-T3 Adenovirus-Typ 3 AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome AP-1 Activator Protein-1 ARD Ankyrin Repeat Domain ATS American Thoracic Society BPE Bovine Pituitary Extract BRSV Bovines RSV c-PA2 Cytosolic Phospholipase A2 c-Rel Zur NFκB-/Rel-Familie gehörender Transkriptionsfaktor CFTR Cystic fibrosis conductance regulator Ck Cytokeratin CLSM Confocal Laser Scanning Microscopy COPD Chronic Obstructive Pulmonary Disease DAPI 4’,6-Diamidino-2-phenylindol DNA Deoxyribo Nucleic Acid, Desoxyribonucleinsäure EDTA Ethylendiamintetraacetic acid EGF(R) Epidermal Growth Factor (Receptor) ELISA Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay ERS European Respiratory Society ESA Epithelial Specific Antigen G-CSF Granulocyte Colony-Stimulating Factor Gly Glycin GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor GOLD Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease HIV Human Immunodeficiency Virus i-COX Inducible Cyclo-Oxygenase i-NOS Inducible Nitric Oxide Synthase IF Immunfluoreszenz IFN Interferon Ig Immunglobulin IκB Inhibitor of kappa B IκK I kappa Kinase IL Interleukin IL-2Rα Interleukin 2-Receptor chain alpha IRF Interferon Regulatory Factor LASER Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation LPS Lipopolysaccharid M-CSF Macrophage Colony-Stimulating Factor MCP Macrophage Chemotactic Protein MG(r) (Relatives) Molekulargewicht MIP Macrophage Inflammatory Protein moi multiplicity of infection MMP Matrix-Metallo-Proteinase mRNA messenger RNA NF-IL-6 Nuclear Factor of IL-6 NFκB Nuclear factor of kappa-light chain inducer in mature B cells NLS Nuclear Localization Signal Objektivvergr. Objektivvergrößerung ORF Open Reading Frame p50 NFκB-Untereinheit p52 NFκB-Untereinheit p65 NFκB-Untereinheit p100 NFκB-Vorläuferprotein (p52-precursor) p105 NFκB-Vorläuferprotein (p50-precursor) PAS periodic acid-Schiff PBS Phosphate Buffered Saline PFA Paraformaldehyd PFU Plaque forming unit p.i. post infectionem PI Propidiumiodid pIκBα Phosphorylierte Form des inhibitorischen Proteins IκBα PIV Parainfluenzavirus PKC Protein-Kinase C PMID PubMed Unique Identifier PP2A Protein-Phosphatase 2A PVM Pneumonia Virus of Mice RANTES Regulated upon Activation, Normally T-cell Expressed and Secreted RHD Rel Homology Domain RI-RNA Replicate Intermediate-RNA RNA Ribo Nucleic Acid, Ribonucleinsäure RSV Respiratory Syncytial Virus RSV-F Fusionsprotein des RSV RSV-G Glyco- oder Attachmentprotein des RSV RSV-L Polymerase des RSV (Large protein of RSV) RSV-M Matrixprotein des RSV RSV-M2 Zweites RSV-Matrixprotein RSV-Mu RSV-Mutante RSV-N Nucleoprotein des RSV RSV-NS Nicht-Strukturprotein des RSV RSV-P Phosphoprotein des RSV RSV-SH Kleines hydrophobes RSV-Protein (Small Hydrophobic RSV-protein) RSV-Wt RSV-Wildtyp SC Secretory Component T3 Triiodthyronin Tab. Tabelle TAD Transkriptions-Aktivierungs-Domäne TCD True Colour Display TCID Tissue culture infectious dose TCR T-cell Receptor TEM Transmissionselektronenmikroskopie Th T-helper cell TLR Toll-like Receptor TNF Tumor Necrosis Factor TRTV Turkey Rhinotracheitis Virus ts temperature sensitive Vim Vimentin VIP Vasoaktives Intestinales Polypeptid VI. Verzeichnis der Tabellen Tab.-Nr. Titel Tab. 1 Zuckerspezifität und Markierungs- Seite 44 verhalten verschiedener Lektine Tab. 2 Moleküle, deren Gentranskription NFκB-abhängig ist 52 und ihre Bedeutung für COPD und Asthma bronchiale Tab. 3 Aktivatoren des NFκB-Komplexes und ihre 53 Bedeutung für COPD und Asthma bronchiale Tab. 4 Verwendete Lektine, Bezugsquellen, Gebrauchs- 67 konzentration und Eigenschaften des Fluorochroms Tab. 5 Verwendete Primärantikörper, Gebrauchs- 67 verdünnung und Bezugsquellen Tab. 6 Eigenschaften, Gebrauchsverdünnungen und Bezugsquellen 68 der eingesetzten Sekundärantikörper Tab. 7 IL-5-Sekretion nicht infizierter Primärkulturen 174 Tab. 8 IL-5-Sekretion von Primärkulturen der Mock-Kontrolle 175 Tab. 9 IL-5-Sekretion der mit dem Adenovirus 175 Typ 3 infizierten Primärkulturen Tab. 10 IL-5-Sekretion von mit dem RSV-Wildtyp 175 infizierten Primärkulturen Tab. 11 IL-5-Sekretion der mit der RSV-Mutante infizierten Primärkulturen 176 VII. Verzeichnis der Abbildungen Abb.-Nr. Titel Seite Abb. 1. Aufbau von Viren der Familie Paramyxoviridae 20 Abb. 2. Nicht-proportionales Venn-Diagramm 49 Abb. 3. Signaltransduktionsweg zur Aktivierung von NFκB 56 Abb. 4. Schematische Darstellung des Strahlenganges im CLSM 70 Abb. 5. Qualität der Primärkultur - Reinheit I 73 Abb. 6. Qualität der Primärkultur - Reinheit II 74 Abb. 7. Differenzierung der Primärkultur - TEM I 75 Abb. 8. Differenzierung der Primärkultur - TEM II 76 Abb. 9. Differenzierung der Primärkultur - TEM III 77 Abb. 10. Differenzierung der Primärkultur - TEM IV 78 Abb. 11. Differenzierung der Primärkultur - TEM V 79 Abb. 12. Differenzierung der Primärkultur - CLSM I 80 Abb. 13. Differenzierung der Primärkultur - CLSM II 81 Abb. 14. Differenzierung der Primärkultur - CLSM III 82 Abb. 15. Differenzierung der Primärkultur - CLSM IV 83 Abb. 16. Differenzierung der Primärkultur - CLSM V 84 Abb. 17. Differenzierung der Primärkultur - CLSM VI 85 Abb. 18. Differenzierung der Primärkultur - CLSM VII 86 Abb. 19. Differenzierung der Primärkultur - CLSM VIII 87 Abb. 20. Funktion der Primärkultur - CLSM I 88 Abb. 21. Funktion der Primärkultur - CLSM II 89 Abb. 22. Funktion der Primärkultur - CLSM III 90 Abb. 23. Funktion der Primärkultur - CLSM IV 91 Abb. 24. Funktion der Primärkultur - CLSM V 92 Abb. 25. Funktion der Primärkultur - CLSM VI 93 Abb. 26. Funktion der Primärkultur - CLSM VII 94 Abb. 27. Funktion der Primärkultur - CLSM VIII 95 Abb. 28. Suszeptibilität der Infektion - CLSM I 96 Abb. 29. Suszeptibilität der Infektion - CLSM II 97 Abb. 30. Permissivität der Infektion 98 Abb. 31. Zeitverlauf der Infektion - CLSM I 99 Abb. 32. Zeitverlauf der Infektion - CLSM II 100 Abb. 33. Zeitverlauf der Infektion - CLSM III 101 Abb. 34. Zeitverlauf der Infektion - CLSM IV 102 Abb. 35. Zeitverlauf der Infektion - CLSM V 103 Abb. 36. Zeitverlauf der Infektion - CLSM VI 104 Abb. 37. Zeitverlauf der Infektion - CLSM VII 105 Abb. 38. Zeitverlauf der Infektion - CLSM VIII 106 Abb. 39. Zeitverlauf der Infektion - CLSM IX 107 Abb. 40. Zeitverlauf der Infektion - CLSM X 108 Abb. 41. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XI 109 Abb. 42. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XII 110 Abb. 43. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XIII 111 Abb. 44. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XIV 112 Abb. 45. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XV 113 Abb. 46. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XVI 114 Abb. 47. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XVII 115 Abb. 48. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XVIII 116 Abb. 49. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XIX 117 Abb. 50. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XX 118 Abb. 51. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXI 119 Abb. 52. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXII 120 Abb. 53. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXIII 121 Abb. 54. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXIV 122 Abb. 55. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXV 123 Abb. 56. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXVI 124 Abb. 57. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXVII 125 Abb. 58. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXVIII 126 Abb. 59. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXIX 127 Abb. 60. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXX 128 Abb. 61. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXXI 129 Abb. 62. Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXXII 130 Abb. 63. Zeitverlauf der Infektion - TEM I 131 Abb. 64. Zeitverlauf der Infektion - TEM II 132 Abb. 65. Zeitverlauf der Infektion - TEM III 133 Abb. 66. Zeitverlauf der Infektion - TEM IV 134 Abb. 67. Zeitverlauf der Infektion - TEM V 135 Abb. 68. Zeitverlauf der Infektion - TEM VI 136 Abb. 69. Zeitverlauf der Infektion - TEM VII 137 Abb. 70. Zeitverlauf der Infektion - TEM VIII 138 Abb. 71. Zeitverlauf der Infektion - TEM IX 139 Abb. 72. Zeitverlauf der Infektion - TEM X 140 Abb. 73. Zeitverlauf der Infektion - TEM XI 141 Abb. 74. Zeitverlauf der Infektion - TEM XII 142 Abb. 75. Zeitverlauf der Infektion - TEM XIII 143 Abb. 76. Zeitverlauf der Infektion - TEM XIV 144 Abb. 77. Zeitverlauf der Infektion - TEM XV 145 Abb. 78. Zeitverlauf der Infektion - TEM XVI 146 Abb. 79. Zeitverlauf der Infektion - TEM XVII 147 Abb. 80. Zeitverlauf der Infektion - TEM XVIII 148 Abb. 81. Zeitverlauf der Infektion - TEM XIX 149 Abb. 82. Zeitverlauf der Infektion - TEM XX 150 Abb. 83. Zeitverlauf der Infektion - TEM XXI 151 Abb. 84. Zeitverlauf der Infektion - TEM XXII 152 Abb. 85. Zeitverlauf der Infektion - TEM XXIII 153 Abb. 86. Zeitverlauf der Infektion - TEM XXIV 154 Abb. 87. RSV-Mutante - CLSM I 155 Abb. 88. RSV-Mutante - Konventionelle Epifluoreszenz I 156 Abb. 89. RSV-Mutante - Konventionelle Epifluoreszenz II 157 Abb. 90. Auswirkungen der RSV-Infektion auf die Funktion der peri- 158 bronchialen Drüsenepithelzellen in Primärkultur - CLSM I Abb. 91. Auswirkungen der RSV-Infektion auf die Funktion der peri- 159 bronchialen Drüsenepithelzellen in Primärkultur - CLSM II Abb. 92. Auswirkungen der RSV-Infektion auf die Funktion der peri- 160 bronchialen Drüsenepithelzellen in Primärkultur - CLSM III Abb. 93. Auswirkungen der RSV-Infektion auf die Funktion der peri- 161 bronchialen Drüsenepithelzellen in Primärkultur - CLSM IV Abb. 94. Auswirkungen der RSV-Infektion auf die Funktion der peri- 162 bronchialen Drüsenepithelzellen in Primärkultur - CLSM V Abb. 95. Auswirkungen der RSV-Infektion auf die Funktion der peri- 163 bronchialen Drüsenepithelzellen in Primärkultur - CLSM VI Abb. 96. RSV und NFκB - Konventionelle Epifluoreszenz I 164 Abb. 97. RSV und NFκB - CLSM I 165 Abb. 98. RSV und NFκB - CLSM II 166 Abb. 99. RSV und NFκB - CLSM III 167 Abb. 100. RSV und NFκB - CLSM IV 168 Abb. 101. RSV und NFκB - CLSM V 169 Abb. 102. RSV und NFκB - CLSM VI 170 Abb. 103. RSV und NFκB - CLSM VII 171 Abb. 104. RSV und NFκB - CLSM VIII 172 Abb. 105. RSV und NFκB - CLSM IX 173 Abb. 106. Auswirkungen von Infektionen auf die IL-5-Sekretion der 176 peribronchialen Drüsenepithelzellen in Primärkultur -11. Einleitung Inzidenz und Prävalenz von Asthma bronchiale und chronisch obstruktiven Lungenerkrankungen (COPD) sowie die damit verbundenen Kosten steigen weltweit. Ätiologie und Pathogenese dieser Erkrankungen sind nicht völlig verstanden, jedoch ist allen obstruktiven Atemwegskrankheiten gemeinsam die klinisch und histopathologisch fassbare Obstruktion der Atemwege, welche mit einer Störung der mukoziliären Clearance einhergeht. Akute Exazerbationen dieser Erkrankungen sind zumeist durch Infektionen der Atemwege bedingt und durch eine Störung der Sekretionsmechanismen gekennzeichnet. Beim Menschen stammt der größte Teil des Atemwegssekretes aus den peribronchialen Drüsen. Die Mechanismen mit denen Infektionen die Störung des Sekretionsablaufes bewirken und den Entzündungsprozess initiieren sind nicht ausreichend verstanden und die bisherigen Untersuchungen fokussieren auf das Oberflächenepithel, was der Bedeutung der peribronchialen Drüsen nicht gerecht wird. Aufgrund ihrer submukösen Lage beim Menschen und da sie bei kleinen Versuchstieren entweder vollkommen fehlen oder nur in den zentralen Abschnitten der Atemwege vorhanden sind, sind die Zellen dieser Drüsen für experimentelle Untersuchungen jedoch nur schlecht erreichbar. Die Atemwegshyperreaktivität, die das Asthma bronchiale kennzeichnet, ist epidemiologisch mit frühkindlichen Virusinfektionen verbunden, wobei insbesondere dem Respiratory Syncytial Virus (RSV) eine besondere Bedeutung zukommt. Jedoch tritt auch bei der COPD, insbesondere im Rahmen von Exazerbationen, eine Atemwegshyperreaktivität auf. Transkriptionsfaktoren wie NFκB besitzen in der Pathogenese dieser Erkrankungen eine herausragende Rolle. Für einige Viren, so auch RSV, ist eine NFκB-Aktivierung beschrieben. Die Mechanismen sind hierbei vielfältig und für das RS-Virus nicht vollständig verstanden. Insbesondere wurden bisher kaum morphologische Untersuchungen im Zeitverlauf der Infektion vorgenommen, sodass über die Lokalisierung einzelner Virusproteine und deren Interaktion mit Bestandteilen des NFκBSignaltransduktionsweges im Verlauf der Infektion nichts bekannt ist. -2Interleukin-5 (IL-5) kommt aufgrund seiner Eosinophilen-aktivierenden Eigenschaften in der Pathogenese von Asthma und Atemwegshyperreaktivität eine besondere Bedeutung zu. Bei der Induktion der IL-5Sekretion durch RSV spielt die Art und Weise, in der das G-Protein des RSVirus dem Immunsystem präsentiert wird, eine entscheidende Rolle. Jedoch können zumindest auch die Zellen des Oberflächenepithels IL-5 synthetisieren. Für die Untersuchungen stand neben dem Long-Stamm eine RSV-Mutante zur Verfügung, der durch eine Spontanmutation die Fähigkeit zur Bildung der löslichen Form des G-Proteins fehlt. Ziele dieser Arbeit waren daher: ¾ Die Etablierung einer Primärkultur humaner peribronchialer Drüsenepithelzellen aus Lungenresektaten. ¾ Die Isolierungs- und Kultivierungsbedingungen hinsichtlich Reinheit bezüglich des epithelialen Zellcharakters und der Zelldifferenzierung zu optimieren. ¾ Um schließlich Veränderungen von Struktur und Funktion durch experimentelle Infektion mit dem humanen RSV untersuchen zu können. ¾ Nähere Einblicke in den Mechanismus der NFκB-Aktivierung durch RSV zu gewinnen. ¾ Die Frage zu beantworten, ob peribronchiale Drüsenepithelzellen IL-5 synthetisieren. ¾ Wenn ja, den Einfluss der RSV-Infektion auf die IL-5-Expression der peribronchialen Drüsenepithelzellen zu ermitteln. ¾ Die Unterschiede im Infektionsablauf zwischen dem RSV-Wildtyp und der -Mutante und ihre mögliche Bedeutung herauszuarbeiten. -32. Stand der Wissenschaft 2.1. Respiratory Syncytial Virus 2.1.1. Historie, Taxonomie und Klassifizierung Das Respiratory Syncytial Virus (RSV) wurde erstmals 1956 bei einem Laboraffen isoliert, der an den typischen Symptomen einer Erkältungskrankheit litt [332] . Nur wenig später wurde es erstmals bei einem Kind mit Pneumonie gefunden, hierbei wurde auch der typische und namensgebende cytopathische Effekt beschrieben [71]. Das humane RSV wird nach der 1993 erfolgten Reklassifizierung der Familie Paramyxoviridae zur Subfamilie Pneumovirinae, Genus Pneumovirus gezählt [92] . Die Subfamilien Pneumo- und Paramyxovirinae bilden zusammen die Familie Paramyxoviridae, die zusammen mit den Familien Rhabdo- und Filoviridae die Ordnung der Mononegavirales bildet, so genannt, weil die Viren dieser Ordnung ein nicht-segmentiertes Negativ-Einzelstrang-RNA-Genom besitzen [55, 370]. Weitere gemeinsame Eigenschaften der Viren dieser Ordnung sind: ¾ es handelt sich um umhüllte Viren, ¾ das Genom ist eng mit Proteinen des Nucleocapsidkomplexes assoziiert, ¾ das Virusgenom codiert eine RNA-Polymerase, die aus dem NegativRNA-Einzelstrang die für die Virusproteinsynthese benötigten mRNAMoleküle und aus einer intermediären (+)-Strang-RNA die für die neu gebildeten Virionen benötigte genomische (-)-Strang-RNA transkribiert, ¾ der Replikationscyclus findet im Cytoplasma der Wirtszellen statt, ¾ neue Virionen entstehen durch Budding neu gebildeter Nucleocapsidkomplexe an der Zellmembran unter Mitnahme einer Membranhülle, inklusive der in dieser eingelagerten viralen Transmembranproteine. Dem RS-Virus fehlt im Vergleich mit dem zum gleichen Genus gehörenden Pneumonia Virus of Mice und den Mitgliedern der Subfamilie Paramyxovirinae die hämagglutinierende Aktivität [290, 380] . Ebenfalls fehlt ihm (und dem gesamten Genus Pneumovirus) die Neuraminidase-Aktivität [380]. -42.1.2. Struktur und Zusammensetzung des Virions 2.1.2.1. Aufbau Das RSV-Virion besitzt eine unregelmäßige Form mit einem Durchmesser von 150 bis 300nm [14, 38, 92, 236, 241, 346] . Der RSV-RNA- Nucleocapsidkomplex besteht aus einer symmetrischen, 12 bis 15nm durchmessenden Helix (Abbildung 1). Die Hülle des RS-Virus entstammt zum einen der Wirtszelle und ist daher eine typische Lipid-Doppelmembran und enthält zum anderen Virus-codierte Glycoproteine, die spikeartig angeordnet sind (Abbildung 1). Diese Spikes aus viralen Glycoproteinen vermitteln das Attachment an und die Inkorporation des Virions in die Zielzelle sowie die Fusion der infizierten Zellen, sind 11 bis 20nm lang und liegen mit einem Abstand von 6 bis 10nm sehr nahe beieinander [92] (Abbildung 1). Abb. 1.: Aufbau von Viren der Familie Paramyxoviridae (aus: Hall C. B. (2001). N Engl J Med 344 (25), 1917-1928 [179]) -52.1.2.2. Genom Das RSV-Genom ist 15.222 Nucleotide lang [327, 423] und besteht aus einem nicht-segmentierten Negativ-RNA-Einzelstrang, der auch als genomische RNA bezeichnet wird, da er für die virale RNA des Virions als Matrize dient [209] . Die genomische RNA ist weder gecapt noch polyadenyliert [327] . Sowohl innerhalb des Virions als auch intrazellulär liegt sie in enger Assoziation mit dem N-Protein vor (siehe 2.1.2.3.3.2.). Ihr 3’-Ende besteht aus einer 44 Nucleotide umfassenden extragenischen Leader-Sequenz, die als der virale Hauptpromoter angesehen wird [327] . Dieser folgen vom 3’- zum 5’-Ende hin zehn Gene für folgende Proteine (siehe 2.1.2.3.): RSV[88, 97] . Dem L-Gen folgt eine NS1, -NS2, -N, -P, -M, -SH, -G, -F, -M2, -L 155 Nucleotide lange extragenische Trailer-Sequenz [327] . Jedes Gen, außer jenem für die Polymerase (L-Gen), beginnt mit dem konservierten neun Nucleotide langen Startsignal 3’-CCCCGUUUA-5’. Das L-Gen beginnt mit der Sequenz 3’-CCCUGUUUUA-5’. semikonservierten zwölf bis 13 Alle Gene Nucleotide enden langen mit der Sequenz 3’-UCA(A/U)UN(A/U)(A/U)(A/U)UUU-5’, die als Transkriptionsterminationssignal dient und zur Polyadenylierung der gebildeten mRNA führt [88] . Die ersten neun RSV-Gene sind nicht überlappend und durch intergenische Sequenzen getrennt, die keine konservierten Sequenzmotive oder besondere Sekundärstrukturen in der abgeleiteten Polypeptidkette enthalten und in ihrer Länge zwischen den RSV-Stämmen variieren [88]. Das M2-Gen und das L-Gen überlappen mit 68 Nucleotiden [97] , womit das Startsignal für die Transkription des L-Genes innerhalb der Gensequenz für das M2-Protein liegt. Diese Genüberlappung findet sich auch beim bovinen RSV [511], jedoch nicht beim PVM oder TRTV [69, 289, 510]. Die 26 Nucleotide am 3’-Ende und die 24 Nucleotide am 5’-Ende der genomischen RNA zeigen eine 81%-ige Komplementarität [327] , womit eine Basenpaarung zwischen diesen Enden während des replikativen Cyclus möglich wäre. Eine solche konnte jedoch bisher nicht nachgewiesen werden. Diese Komplementarität reflektiert den hohen Grad an Sequenzidentität zwischen den 3’-Promotern der genomischen und der replikativen intermediären (RI-) RNA, da der 3’-Promoter der RI-RNA durch das 5’-Ende der genomischen RNA codiert wird. -62.1.2.3. Proteine Der genomische Negativ-RNA-Strang wird in infizierten Zellen in zehn mRNA-Moleküle transkribiert, die in zehn Proteine translatiert werden [92] . Drei sind glycosylierte Transmembran- / Oberflächenproteine (F, G und SH), zwei sind nicht-glycosylierte Matrix-Proteine (M, M2), drei Proteine bilden zusammen mit der genomischen RNA den Nucleocapsidkomplex (N, P, L) und zwei Proteine (NS1, NS2) akkumulieren in infizierten Zellen, kommen im Virion aber nur in Spuren vor und sind daher keine Strukturproteine des RS-Virus [92]. 2.1.2.3.1. Oberflächenproteine 2.1.2.3.1.1. Das Fusionsprotein (RSV-F) Das RSV-F-Protein besitzt enge Ähnlichkeiten mit jenem der anderen Paramyxoviren [91, 420] . Die Namensgebung resultiert aus der Verantwortlichkeit für die Riesenzellbildung durch Fusion infizierter Einzelzellen [191, 479] . Es handelt sich um ein Typ-I-Glycoprotein, mit einer N-terminalen Signalsequenz und einem Membrananker am C-Terminus. Es wird als Vorläuferprotein F0 synthetisiert, das aus einer F2-Untereinheit, einem Spaltungspeptid und einer F1-Untereinheit besteht [91] . Während der Synthese wird das F0-Vorläuferprotein durch N-Glycosylierung modifiziert. In Abhängigkeit von der RSV-Subgruppe besitzt das F-Protein fünf oder sechs mögliche Glycosylierungsstellen, wovon alle bis auf eine in der F2-Untereinheit liegen enthalten [91, 227] . Palminsäure ist ebenfalls im F-Protein [93] . Das F0-Vorläuferprotein wird innerhalb des rauen endoplasmatischen Retikulums in ein Tetrahomomer zusammengesetzt, welches einem einzelnen Virion-Spike entspricht [93] . Die F1-Untereinheit ist hierbei für die Oligomerisierung verantwortlich. In der Elektrophorese bei Raumtemperatur und in der Gegenwart von Natriumdodecylsulfat wird das F-Protein in Form eines Dimers isoliert [478], zwei solcher Dimere setzen entsprechend einen tetrameren Spike zusammen. Innerhalb des TransGolgi-Netzwerkes [93] wird das F0-Vorläuferprotein durch eine zelluläre Protease mit Trypsin-artiger Spezifität in die beiden Untereinheiten F2 und -7F1 gespalten, die durch Disulfidbrücken gebunden bleiben [170] . Diese Spaltung setzt den N-Terminus der F1-Untereinheit frei. Die ersten 19 bis 26 Aminosäuren sind hydrophob und direkt bei der Membranverankerung beteiligt. Diese Aminosäuresequenz ist innerhalb der Subfamilie Paramyxoviren hoch konserviert, zu einem geringeren Grad auch innerhalb der Subfamilie Pneumoviren, nicht jedoch zwischen den beiden Subfamilien. Jedoch existieren zwei identische Positionen innerhalb der Aminosäurensequenz, Gly-3 und Gly-7, die mit einem weiteren Aminosäurenrest als die entscheidensten für die Struktur und die Funktion des F-Proteins identifiziert werden konnten [205]. 2.1.2.3.1.2. Das Attachmentprotein (RSV-G) Da Antikörper gegen das G-, aber nicht solche gegen das F-Protein, die Adsorption der Virionen an Zellen verhindern konnten, wurde das [284] . Es hat G-Protein als Attachmentprotein des RS-Virus identifiziert keine Ähnlichkeiten mit den Attachmentproteinen der Paramyxoviren und besitzt eine nur etwa halb so lange Aminosäurekette [494] . Den Attachmentproteinen der Pneumo- und Paramyxoviren gemeinsam ist jedoch die Tatsache, dass es sich um Typ-II-Membranproteine mit einer Membrananker-Signalsequenz nahe dem N-Terminus und einem extrazellulär gelegenen C-Terminus handelt. Die Namensgebung resultiert aus der Tatsache, dass das G-Protein stark N- und O-glycosyliert ist [87, 94, 487, 495] . Es enthält einen ungewöhnlich hohen Anteil an den für eine O-Glycosylierung erforderlichen Aminosäuren Serin und Threonin (31% verglichen mit ca. 13% für die meisten Proteine). Alleine innerhalb der extrazellulären Proteindomäne O-Glycosylierungsstellen existieren mehr als 70 potentielle [382, 487] . Die N-Glycosylierung des G-Proteins variiert hinsichtlich Ort und Anzahl der potentiellen Glycosylierungsstellen in Abhängigkeit vom RSV-Stamm. So enthält der RSV-A2-Stamm vier, während der eng verwandte Long-Stamm acht N-Glycosylierungsstellen besitzt. Das G-Protein enthält auch einen hohen Anteil an Prolinresten (13% verglichen mit einem Durchschnitt von 5%) und wie das F-Protein Palminsäure [94] . Das ausgereifte Glycoprotein hat ein in der Gelelektrophorese geschätztes Molekulargewicht von 90 Kilo-Dalton -8verglichen mit 32,5 Kilo-Dalton für die reine Polypeptidkette. Ein solch hoch-glycosyliertes Protein findet sich nicht bei den Paramyxo-, den Orthomyxo- oder den Rhabdoviren, nur das Attachmentprotein der Filoviren ist ebenfalls O-glycosyliert. Die cotranslationale Prozessierung des G-Proteins beginnt in der infizierten Zelle mit einer N-Glycosylierung, die zu einem Protein von 45-50 Kilo-Dalton führt. Dieser N-glycosylierte Vorläufer bildet schnell ein nicht kovalent gebundenes Homooligomer (Trioder Tetramer). Die O-Glycosylierung findet später im Trans-GolgiNetzwerk statt [495, 94] . Ca. 15% des in infizierten Zellen synthetisierten G-Proteins wird in einer löslichen Form sezerniert [192, 193] . Die membran- gebundene Form des G-Proteins entsteht, wenn die Translation am ersten Methionin-Codon innerhalb des offenen Leserahmens initiiert wird. Die lösliche Form wird gebildet, wenn die Translation am zweiten MethioninCodon startet [382] . Der kürzeren löslichen Form des G-Proteins fehlen die cytoplasmatische Domäne und ein Teil der Signalankersequenz. Die extrazelluläre Domäne des G-Proteins zeigt starke Sequenzunterschiede von Stamm zu Stamm, jedoch existiert mitten in dieser Domäne eine 13 Aminosäure lange Sequenz (Aminosäuren 164 bis 176), die innerhalb aller humanpathogenen RSV-Stämme exakt konserviert und möglicherweise in die Bindung an einen zellulären Rezeptor involviert ist [231, 454] . Diese konservierte Domäne umspannt vier Cysteinreste (Aminosäuren 173, 176, 182, 186), und koinzidiert mit einer engen Schleife in der vorausgesagten Sekundärstruktur, die möglicherweise durch Disulfidbrücken stabilisiert wird. Die Analyse von gegen neutralisierende monoklonale Antikörper resistenten RSV-Mutanten zeigte, dass ein einzelner Cysteinrest in den Positionen 182 oder 186 ohne Viabilitätsverlust ausgetauscht werden kann [391] . Weitere Mutanten wurden identifiziert, denen große Teile des C-Terminus fehlen oder in deren G-Protein heterologe Sequenzen durch Leserastermutationen eingefügt sind [150, 151, 390] . Bis zu 46% der extrazellulären Domäne des G-Proteins können fehlen oder durch heterologe Sequenzen ersetzt sein, ohne dass es zu einem Viabilitätsverlust des RS-Virus kommt. Deshalb scheint der C-Terminus des G-Proteins nicht für die funktionelle Integrität von Bedeutung zu sein, ganz im Gegensatz zu anderen viralen Oberflächenglycoproteinen. -92.1.2.3.1.3. Das kleine hydrophobe Protein (RSV-SH) Das SH-Protein ist ein kleines Membranprotein mit einer hydrophoben Signalankersequenz, das intrazellulär in mehreren Formen akkumuliert [96, 349] . Die häufigste Form ist die unglycosylierte mit einem relativen Molekulargewicht (MGr) von 7.500 (SH0). Eine weitere Form ist SHg mit einem MGr von 13-15.000, die eine einzelne N-glycosidisch gebundene Kohlenhydratseitenkette besitzt. Wird SHg durch die Anheftung von Polylactosaminoglycanresten weiter modifiziert, entsteht SHp mit einem MGr von 21-40.000 [8] . Auch beim SH-Protein gibt es eine Variante (SHt), die durch Beginn der Translation an einem zweiten Methionin-Codon entsteht. Sie unglycosyliert, besitzt ein MGr von 4.800 und wird zu einem geringen Anteil N-glycosyliert sowie durch Anheftung von Polylactosaminoglycanresten modifiziert. Diese ungewöhnlichen Prozessierungsmechanismen sind zwischen humanen und bovinen RSV-Stämmen konserviert, so dass ihnen möglicherweise eine bisher nicht erkannte Bedeutung zukommt [8, 96] . Die Varianten unterscheiden sich hinsichtlich ihres Bestimmungsortes während der Infektion: SHt wird als einzige Form nicht zur Zelloberfläche transportiert und nur SH0 und SHp werden in Virionen eingebaut. Alle Varianten bilden Oligomere (zumindest Pentamere) [95]. Heminway et al. konnten zeigen, dass die Coexpression des SH-Proteins mit dem F- und G-Protein die Membranfusion verstärkt [191]. 2.1.2.3.2. Matrixproteine Im Gegensatz zu den meisten nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNAViren haben die Pneumoviren zwei Matrixproteine statt einem [208] . Beide sind nicht glycosyliert und beiden fehlt eine hydrophobe Sequenz, die ausreichen würde, eine Membran zu durchspannen. Sie bleiben mit dem Virion assoziiert, wenn die Hülle durch Behandlung mit nichtionischen Detergentien in niedrig konzentrierter Salzlösung entfernt wird, werden aber gelöst, wenn die Salzkonzentration weiter erhöht wird [208]. - 10 2.1.2.3.2.1. Das Matrixprotein (RSV-M) Das M-Protein des RS-Virus ist kleiner als jenes der Paramyxoviren und zeigt keine eindeutigen Sequenzähnlichkeiten mit diesem [92]. Jedoch haben alle diese M-Proteine eine hydrophobe Domäne in der C-terminalen Molekülhälfte, die für eine Interaktion mit oder auch Insertion in Membranen verantwortlich zeichnen könnte [92] . Das M-Protein hat zwei grundsätzliche Funktionen: Einerseits den Nucleocapsidkomplex vor dem Zusammenbau inaktiv zu halten und andererseits die Interaktion des Nucleocapsidkomplexes mit der Hülle zu steuern [92]. 2.1.2.3.2.2. Das zweite Matrixprotein (RSV-M2) Ein zweites Matrixprotein ist typisch für Pneumoviren. Infizierte HeLaZellen exprimieren das M2-Protein auf der Zelloberfläche, wie durch Bindung monoklonaler Antikörper gezeigt wurde. Jedoch war das M2-Protein nicht zugänglich für extrazelluläres Trypsin, so dass die Antikörper möglicherweise mit einer Subpopulation reagierten, der Großteil des M2-Proteins aber intrazytoplasmatisch vorliegt [389] . Im Gegensatz zum M- colokalisiert das M2- mit dem N- und dem P-Protein innerhalb von cytoplasmatischen Einschlusskörpern in infizierten oder transfizierten Zellen [148] . Immunpräzipitationen zeigten ebenfalls eine Interaktion zwischen dem M2- und dem N-Protein in Form von Komplexbildung [148, 398] . Das Gen für das M2-Protein überlappt mit jenem für das L-Protein, und enthält darüber hinaus zwei offene Leserahmen (ORF) [90] . Ein Protein, genannt M2-1 oder 22K, das bei der Transkription des 5’-proximalen ORF der M2-mRNA entsteht, ist notwendig für die Synthese poly- und monocistronischer mRNA-Spezies und damit essentiell für die Bildung neuer infektiöser RSV-Partikel [89] . Es wird daher auch als Transkriptions- Elongations- oder -Antiterminationsfaktor bezeichnet. Auch das Produkt des zweiten ORF, das RSV-M2-2-Protein, ist an der Regulierung der Balance zwischen RNA-Replikation und -Transkription beteiligt. Fehlt es, entstehen weniger vollständige antigenomische und genomische RNAMoleküle sein. [37] . Es scheint daher eher für die Replikation entscheidend zu - 11 2.1.2.3.3. Nucleoproteinkomplex 2.1.2.3.3.1. Die Polymerase (RSV-L) Das L-Protein des RS-Virus enthält sechs hochkonservierte Segmente, die wahrscheinlich funktionellen Domänen entsprechen [423]. Es handelt sich um eine RNA-abhängige RNA-Polymerase, die sowohl die genomische RSVRNA in mRNAs transkribiert, als auch repliziert [92]. Die Mechanismen mit denen Transkription und Replikation der genomischen RSV-RNA gesteuert werden, sind nicht im Detail bekannt, jedoch spielen sowohl das P- als auch das M2-Protein eine Rolle. 2.1.2.3.3.2. Das Nucleoprotein (RSV-N) Das N-Protein ist das Hauptprotein des Nucleocapsidkomplexes und bindet RNA. Es ist kleiner als jenes der Paramyxoviren und zeigt keine Sequenzähnlichkeiten zu diesem. Jedoch enthalten die N-Proteine verschiedener Mononegavirales drei Segmente mit ähnlicher Sequenz und abgeleiteter Sekundärstruktur wahrscheinlich funktionell [28] und . bei Diese der Domänen sind RNA-Bindung daher beteiligt. Immunpräzipitationen zeigten eine Komplexbildung zwischen dem N-, M2und P-Protein [148, 398]. 2.1.2.3.3.3. Das Phosphoprotein (RSV-P) Das P-Protein ist ein phosphoryliertes Protein, das kleiner ist als jenes der meisten Paramyxoviren. Die Phosphorylierung findet an Serin-Resten statt, die hauptsächlich in der zentralen Region des Moleküls lokalisiert sind [341]. Sequenzanalysen der beiden antigenen RSV-Subgruppen zeigten zwei hochkonservierte Regionen, die durch einen unterschiedlich gestalteten Zwischenteil getrennt sind [230] . Wahrscheinlich fungiert das P-Protein als Transkriptions- bzw. Replikationsfaktor und als Chaperon, das lösliche Lund N-Proteine bindet [204]. - 12 2.1.2.3.4. Nicht-Strukturproteine Das NS1- und NS2-Protein werden als Nicht-Strukturproteine klassifiziert, da sie in aufgereinigten Virionen nur in sehr kleinen Mengen gefunden werden [208] . Das NS1-Protein wird wahrscheinlich proteolytisch prozes- siert, da es zu einem Abfall des relativen Molekulargewichtes um 1,5 Kilo[208] . Das NS2-Protein hat eine kurze Dalton während der Infektion kommt intrazelluläre Halbwertszeit von einer Stunde und wird zu einer größeren, sezernierten Form modifiziert [92] . Da es sich um Nicht-Strukturproteine handelt, liegt die vermutete Funktion in der Regulation der RNA-Synthese und der Morphogenese der Virionen. Für die sezernierte Form des NS2Proteins wird eine Interaktion mit dem Immunsystem des Wirtes diskutiert. 2.1.3. Antigene Subgruppen Der erste Hinweis auf die Existenz verschiedener antigener Subgruppen des RS-Virus wurde 1966 beschrieben [82] . Folgende weltweite Stammanalysen mit Hilfe monoklonaler Antikörper ergaben, dass die Virusisolate entweder der Subgruppe A (Stamm A2) oder B (Stamm 18537) angehörten [3, 10, 11, 164, 195, 335, 457] . Dieser antigene Dimorphismus gründet hauptsächlich auf Variationen im G-Protein. Die beiden Subgruppen zeigen eine 25%-ige Beziehung in ihrer Antigenität, wobei die Beziehung auf der Ebene der F-Proteine 50% und auf jener der G-Proteine nur ein bis sieben Prozent beträgt [194, 231] . Während der letzten dreißig Jahre traten die beiden Subgruppen nebeneinander auf, wobei die Subgruppe A in den jährlichen Epidemien vorherrschte, und beide bezüglich ihrer Antigenität relativ stabil waren [3, 31, 195, 334, 457] . Das Ausmaß der Unterschiede zwischen den beiden RSV-Subgruppen wurde durch Vergleich einer Sequenz der genomischen RNA, die acht der zehn Gene des A2- und des 18537-Stammes umfasste, bestimmt [90, 96, 227, 228, 229, 230, 231] . Dabei waren sieben von 16 untersuchten Epitopen des F-Proteins in allen bis auf einen von 23 Stämmen (18 der Subgruppe A und fünf der Subgruppe B) konserviert. Insgesamt waren die Sequenzunterschiede für vier dieser acht Proteine klein (NS2-, N-, P- und M2-Protein) und für drei moderat (NS1-, SH- und F-Protein), während für das G-Protein erhebliche Sequenzunterschiede gefunden wurden (47% - 13 Unterschiede in der Aminosäurensequenz). Diese Sequenzunterschiede konzentrierten sich in der extrazellulären Domäne, welche, im Vergleich mit 17% für die transmembranöse und intrazelluläre Domäne, 56% Unterschiede aufwies [231, 427] . Auch die Akzeptorstellen für die N- und O-Glycosylierung des G-Proteins waren kaum konserviert. Der einzige Bereich des G-Proteins in der extrazellulären Domäne, der hochkonserviert ist, ist ein 13 Aminosäuren langer Bereich, der durch vier exakt konservierte [231] Cystein-Reste flankiert wird (siehe auch 2.1.2.3.1.2.). 58% der Unterschiede in einzelnen Nucleotiden in der extrazellulären Domäne des G-Proteins zwischen den beiden antigenen RSV-Subgruppen wirkten sich auch in Änderungen der Aminosäurensequenz aus. Dieser Wert steht im Vergleich mit zehn bis 22 % bei den anderen RSV-Proteinen [57, 230, 427] . Somit besteht anscheinend ein besonderer Selektionsdruck für Mutationen im G-Protein, wobei dies möglicherweise als Mechanismus dient, der Immunantwort des Wirtes zu entgehen. Das andere Haupt- Neutralisationsantigen, das F-Protein, zeigt nur zu 13% Veränderungen der Aminosäuresequenz [227, 229] . Dies bedeutet andererseits, dass die Funktion des G-Proteins durch Aminosäurenaustausche weniger anfällig ist. Diese Vermutung wurde durch Untersuchungen bestätigt, in denen erhebliche Deletionen oder mehrere Punktmutationen im G-Protein-Gen nicht zum Funktionsverlust führten [149, 390, 391] . Im Gegensatz führten schon geringfügige Mutationen im F-Protein-Gen zu erheblichen Veränderungen von Struktur und Funktion [9] . Ob der antigene Drift des G-Proteins während der Infektion eines einzelnen Individuums, einer einzelnen Epidemie oder im Verlauf von Jahrzehnten auftritt, ist nicht geklärt. In einer Studie wurde eine fortschreitende Akkumulierung von Mutationen gefunden, in einer anderen nicht [101, 426] . Und ob die gefundenen Mutationen mit einer veränderten Antigenität einhergehen, ist ebenfalls nicht bekannt. Das SH-Protein ähnelt mit einer 50%-igen Sequenzidentität in der extrazellulären Domäne und einer von 86% in der transmembranösen und der intrazellulären Domäne dem G-Protein [56, 96] . Das Ausmaß von Sequenzunterschieden innerhalb der jeweiligen antigenen Subgruppe folgt den gleichen Eigenschaften (niedrigste Rate für das N-Protein, höchste für die extrazelluläre Domäne des G-Proteins) [56, 57, 427]. - 14 2.1.4. Replikationszyklus des RSV 2.1.4.1. Attachment an und Penetration in die Wirtzelle Der zelluläre Rezeptor des RSV ist nicht bekannt. Das Fehlen einer Neuraminidase legt nahe, dass er keine Sialinsäure enthält. Der Rezeptor ist auf der Zelloberfläche reichlich vorhanden, wenn man die Effizienz betrachtet, mit der Zellkulturen aufgereinigtes G-Protein binden [480] . Pneumoviren penetrieren ebenso wie Paramyxoviren durch Fusion ihrer Hülle mit der Plasmamembran der Zielzelle. Dieser Vorgang konnte für RSV direkt mittels Videomikroskopie gezeigt werden [14] . Die Initiierung der Fusion durch bereits adsorbierte Virionen scheint ein langsamer Vorgang zu sein, der jedoch, sobald er einmal gestartet ist, sehr schnell abläuft [14, 283] . Nach der Penetration scheint die Virushülle in die Plasmamembran der Wirtszelle inkorporiert zu werden, wie die Detektierung von viralen Glycoproteinen mittels Immunfluoreszenz vermuten lässt [389]. Der Nucleoproteinkomplex wird in das Cytoplasma der Zielzelle freigesetzt und die Transkription des viralen Genoms beginnt mittels der mitgebrachten Polymerase. Alle Ereignisse im Replikationscyclus des RS-Virus finden im Cytoplasma ohne Beteiligung des Zellkerns statt [256] und das Virus kann sich in entkernten Zellen vermehren [141]. 2.1.4.2. Replikation, Transkription und Translation 2.1.4.2.1. Transkription Die meisten viralen mRNA-Moleküle in einer infizierten Zelle sind Transkripte des viralen Genoms. Hierbei handelt es sich um zehn subgenomische monocistronische mRNA-Moleküle und wenige [209] . Ebenso enthält eine polycistronische “read-through“-Transkripte infizierte Zelle genomische RNA, die das Produkt der RNA-Replikation darstellt. Die RSV-Gene werden in 3’-5’-Richtung transkribiert, beginnend an einem Promoter nahe ihres 3’-Endes [112] . Es scheint daher, dass die Transkription des Genoms einem Modell der sequentiellen Transkription - 15 folgt. Die Polymerase kontaktiert hierbei die genomische RNA (in Form des Nucleocapsids) und beginnt mit der Transkription am ersten Nucleotid und setzt sie über einen sequentiellen Start-Stopp-Mechanismus fort, der durch die Gen-Anfang- und -Ende-Signale und möglicherweise weitere strukturelle Merkmale geführt wird. Die mRNAs sind am 5’-Ende gecapt und am 3’-Ende polyadenyliert [22]. Diese beiden Modifizierungen scheinen cotranslational durch die RSV-Polymerase verwirklicht zu werden. Zusätzlich zu den zehn einzelnen mRNA-Molekülen enthalten infizierte Zellen seltenere, größere und polyadenylierte RNA-Moleküle. Hierbei handelt es sich um Polytranskripte, die durch “read-through“ zweier oder mehrerer benachbarter Gene während der Transkription entstehen und den entsprechenden Genen und intergenischen Regionen exakt komplementär sind [88, 91] . Sie entstehen durch eine Fehlerrate von 5-10 % der Polymerase die Gen-Ende-Signale zu erkennen. Das Start-Signal des L-Gens liegt 68 Nucleotide vor dem Ende-Signal des M2-Genes [97] . Diese Gen- Überlappung scheint die Synthese der M2-mRNA nicht zu beeinflussen. Die Präsenz eines Gen-Ende-Signals innerhalb des L-Genes resultiert jedoch in ca. 90 % der Fälle in einer vorzeitigen Termination der Transkription. Das hauptsächliche Produkt ist daher eine 68 Nucleotide lange, polyadenylierte RNA. Die L-mRNA voller Länge ist dagegen sehr viel seltener, da sie ebenso wie die Polytranskripte nur entsteht, wenn die Polymerase das Gen-Ende-Signal des M2-Gens nicht erkennt. Diese GenÜberlappung ist mit dem Modell der linearen sequentiellen Transkription inkompatibel. Ob die Polymerase, die das M2-Gen verlässt, zurück zum Start-Signal des L-Gens springt, oder ob ein zweiter, interner Promoter für das L-Gen existiert ist nicht bekannt. Ebenso möglich ist, dass das L-Gen von jenen Polymerasen erreicht wird, die das Start-Signal des M2-Genes überlesen und zum Start-Signal des L-Genes weiterwandern. Ein ähnliches Modell ist für die Transkription eines SV41-Genes vorgeschlagen worden, das hinter einem nicht-funktionellen Gen-Ende-Signal liegt [456] . Vier bis sechs Stunden post infectionem (p.i.) können die ersten RSV-mRNAMoleküle nachgewiesen werden. Der Peak der mRNA-Synthese liegt bei ungefähr 16 Stunden p.i. - 16 2.1.4.2.2. Translation Vier bis sechs Stunden p.i. können auch die ersten RSV-Proteine nachgewiesen werden. Der Peak der Proteinsynthese liegt bei 18 bis 20 Stunden p.i. Der Level der jeweiligen Akkumulation eines RSV-Proteins scheint ausschließlich durch das Vorkommen des entsprechenden mRNAMoleküls bestimmt zu sein. Wie bei anderen Negativ-Strang-RNA-Viren sinkt die Menge jeder RSV-mRNA-Spezies mit der Distanz ihres Gens zum Promoter, vermutlich durch Ablösung der Polymerasemoleküle vom RNATemplate während der sequentiellen Transkription [112]. 2.1.4.2.3. Bildung der genomischen RNA Die Replikation der genomischen RSV-RNA erfordert einen Wechsel vom Start-Stopp-Modus der mRNA-Synthese zu einem Antiterminations-Modus, in dem die Gen-Start- und -Stopp-Signale ignoriert werden (read through). Das Resultat ist ein intermediäres (+)-Strang-RNA-Molekül, das eine exakte komplementäre Kopie der genomischen RNA darstellt. Diese Kopie dient als Matrize für die Synthese der Provirus-Genome. Der Mechanismus, der zur Umschaltung zum Antiterminationsmodus führt, beinhaltet die cotranslationale Einkapselung der neugebildeten RNA durch das N-Protein [89] . Die RNA-Replikation nicht segmentierter Negativ-Strang-RNA-Viren ist von einer fortdauernden Proteinsynthese abhängig [209]. Das intermediäre RNA-Molekül kommt intrazellulär 10-20-mal seltener vor als das provirale genomische RNA-Molekül [92] . Für Paramyxoviren haben experimentelle Systeme mit Mini-Genomen gezeigt, dass die genomische RNA nur effizient repliziert wird, wenn ihre Nucleotidlänge ein Vielfaches von sechs ist. Dies steht möglicherweise in Zusammenhang mit der Tatsache, dass Nbzw. NP-Monomere immer an eine Einheit aus sechs Nucleotiden binden. Dies scheint für Pneumoviren nicht zu gelten [92] . Für die Replikation der RSV-RNA sind die drei RSV-Proteine L, N und P ausreichend [173]. - 17 2.1.4.3. Morphogenese der Virionen Ähnlich zu anderen Paramyxoviren findet die Zusammensetzung der RSVVirionen an der Plasmamembran statt, wo präformierte Nucleocapsidkomplexe mit Membranregionen assoziieren, die transmembranöse virale Glycoproteine enthalten [92] . RSV-infizierte Zellen enthalten dichte, pleomorphe, eosinophile, perinukleäre Einschlüsse, ebenso wie diffusere fadenartige Aggregate nahe der Plasmamembran. Die letzteren scheinen Nucleocapsidkomplexen zu entsprechen, die vor dem Budding unter der Zelloberfläche aggregieren [148, 275, 346] . In vitro-Experimente mit polarisierten Zellen zeigen, dass das Budding an der apikalen Oberfläche stattfindet [54, 381] . Mittels Videomikroskopie konnte gezeigt werden, dass die Virusreifung innerhalb umschriebener Regionen der Plasmamembran auftritt, was auf ein Clustern von Viruskomponenten oder die Abhängigkeit des Buddings von lokalisierten subzellulären Strukturen hindeutet [14] . Beobachtungen legen nahe, dass das Budding die genaue Umkehr der Penetration ist, was einen gemeinsamen Mechanismus des Membranflusses impliziert [92] . Gelegentlich konnten neu gebildete Virionen beobachtet werden, die rückwärts mit der Membran der Wirtszelle fusionierten [92]. 2.1.4.4. Budding Das Budding neu gebildeter Nucleocapsidkomplexe erfolgt an der Zellmembran in kugeliger Form mit einem Durchmesser von 150 bis 300nm und in der Zellkultur auch in filamentärer Form mit einem Durchmesser von 60 bis 100nm und einer Länge bis zu 10µm. Das Budding geschieht jeweils unter Mitnahme von Wirtszellmembran als Hülle, inklusive der darin enthaltenen viralen Oberflächenproteine [92]. - 18 2.1.5. Mutanten Die Analyse Temperatur-sensitiver (ts-) Mutanten, die durch chemische Mutagenese entstanden, erlaubte die Identifikation von acht nicht überlappenden Komplementationsgruppen, die als A, B, B´, C, D, E, F und [165, 371, 502] . Die Gruppen B, D und E sind mit G bezeichnet werden Vorbehalt bestimmten Genen zugeordnet worden. Die Mutante ts-2 (auch tsA2 genannt), der einzige Repräsentant der Gruppe B, besitzt aufgrund seines nicht-syncytialen Plaque-Phänotyps und seiner verminderten Penetrationsfähigkeit bei nicht-permissiven Temperaturen eine verminderte Fusionsaktivität [33, 162] . Die Analyse der intrazellulären Proteine bei nicht- permissiven Temperaturen ergab, dass das F0-Vorläufer-Protein ineffizient gespalten wird [61] . Dies spricht dafür, dass diese Mutation eine defekte Ausreifung des F-Proteins beinhaltet. Ebenso ist die Konversion des G-Proteins von der Vorläuferform zur vollständig glycosylierten Form vermindert, so dass diese Mutante folglich zumindest in zwei Genen Mutationen aufweist. Die Mutante tsN1 ist der einzige Repräsentant der Komplementationsgruppe D. Sie codiert ein M-Protein, das unter nichtpermissiven Bedingungen instabil ist. Einige nicht-ts-Revertanten konnten isoliert werden, und in jedem dieser Fälle hatte das M-Protein seine Stabilität zurück gewonnen. Dies ordnet die Komplementationsgruppe D dem M-Gen zu [61] . Die Mutante tsN19, welche die Komplementations- gruppe E repräsentiert, zeigt keine zellassoziierten RSV-Antigene, wenn sie unter nicht permissiven Temperaturen angezüchtet wird, was einen Defekt zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion nahe legt [371] . Ein einzelner P-spezifischer monoklonaler Antikörper konnte identifiziert werden, der unter permissiven Bedingungen nicht mit dem P-Protein der tsN19-Mutante reagierte, jedoch mit jenem einiger nicht-ts-Revertanten [62] . Daher wurde die Komplementationsgruppe E dem P-Protein zugeordnet. Die Sequenzanalyse der tsN19-Mutante im Vergleich mit einer nicht-ts-Revertante legte nahe, dass die verantwortliche Mutation einen Aminosäurenaustausch an Position 172 (Glycin zu Serin) beinhaltet [62]. - 19 2.1.6. Pathogenese und Pathologie der RSV-Infektion 2.1.6.1. Epidemiologie Die auf die Erstbeschreibung [332] folgenden, serologischen Untersuchungen zeigten, dass bereits in den sechziger Jahren die meisten Kinder mit einem [70] . Auch Alter unter vier Jahren eine RSV-Infektion durchgemacht hatten spätere Untersuchungen bei Kindern mit Bronchiolitiden oder Pneumonien konnten RSV als eine Hauptursache in fast allen Teilen der Welt [19, 32, 72, 81, 144, 152, 167, 252, 291, 299, 360, 428, 498] . An der nachweisen epidemiologischen Bedeutung für Erkrankungen der unteren Atemwege bei Kindern hat sich seit der Erstbeschreibung nichts geändert [58, 201, 363, 383, 461, 462] , hinzugekommen ist jedoch die Erkenntnis, dass RSV auch bei älteren und immunsupprimierten Patienten eine große Bedeutung besitzt [130, 183, 197, 436] . RSV ist bei Kindern die Ursache für 50-90 % der Bronchiolitiden, 5-40 % der Pneumonien und 10-30 % der Tracheobronchitiden, die im Krankenhaus behandelt werden müssen [179]. 2.1.6.2. Aus Pathogenese Informationen, die während Ausbrüchen in geschlossenen Populationen gesammelt wurden, wurde gefolgert, dass die Inkubationszeit für RSV vier bis fünf Tage beträgt [243, 424] . Diese Schätzung wurde durch Experimente mit erwachsenen Freiwilligen bestätigt, bei denen die Inkubationszeit von der Inokulation bis zur Erkrankung im Mittel fünf Tage betrug [226] . Zum Beginn der Erkrankung repliziert das Virus im Nasopharynx und erreicht dabei einen Titer von 104 bis 106 TCID50 pro Milliliter Nasensekret bei Kindern erwachsenen Freiwilligen [145, [180, 181] und etwas niedrigere Titer in 326] . Der Virustiter sowie die Menge detektierbaren RSV-Antigens wurden in sequentiellen Nasensekreten hospitalisierter Kinder mit unteren Atemwegserkrankungen bestimmt [180, 182, 184, 314, 315, 484] . Bei den meisten Kindern ist der Virustiter zu Anfang 103,5 bis 105 TCID50 pro Milliliter und sinkt kontinuierlich während der Hospitalisierung. Einige Kinder jedoch scheiden Virus bis zu drei Wochen aus. In einer Studie wurden eine Korrelation zwischen der Schwere der - 20 Erkrankung und der Dauer der Virusausscheidung und eine negative Korrelation zwischen dem Kindesalter und dem maximalen Virustiter gefunden [181] . Die Mechanismen, mit denen sich das Virus von den oberen in die unteren Atemwege ausbreitet, sind nicht bekannt. Es wird jedoch angenommen, dass sich das Virus kontinuierlich durch das respiratorische Epithel oder durch aspirierte Sekretbestandteile in die unteren Atemwege ausbreitet. Das Virus besitzt die Fähigkeit, sich von Zelle zu Zelle auszubreiten, ohne in der extrazellulären Flüssigkeit aufzutauchen [407] . Es erscheint jedoch unwahrscheinlich, dass dies der Hauptmechanismus in vivo ist, da in experimentell infizierten Tieren das Trachealepithel zu jeder Zeit nur spärlich infiziert ist [139, 379] . Bei Menschen und Versuchstieren können Synzytien entweder in abgeschilferten Epithelien der oberen Atemwege oder in Autopsiepräparaten von Patienten mit fataler Pneumonie oder Bronchiolitis gefunden werden. Die meisten infizierten Zellen enthalten jedoch nur einen Zellkern und die Formation von Synzytien scheint keine Voraussetzung für die Zellschädigung und den Zelluntergang zu sein. Die RSV-Pneumonie ähnelt bis auf einige wenige Fälle bei immunkompromittierten Patienten [140] nicht der Riesenzellpneumonie bei Masern. Obwohl eine Virämie während der Infektion normaler Säuglinge und Kinder nicht beschrieben wurde, konnten RSV-Antigene in zirkulierenden mononukleären Leukozyten solcher Individuen detektiert werden [116] und RSV-RNA in Zellen des Blutes von Neonaten mittels RT-PCR nachgewiesen werden [386] . Ebenso konnte gezeigt werden, dass das Virus in vitro zu niedrigen Titern in mononukleären Zellen und Makrophagen repliziert [263] . Entsteht in der Folge eine RSV-Bronchiolitis, so ist diese gekennzeichnet durch die Nekrose des Bronchiolusepithels während Ödem und Hypersekretion das Lumen obstruieren [179]. Der Effekt der RSV-Infektion auf das Epithel resultiert in einer gestörten mukoziliären Clearance, die Wiederherstellung der kompletten Epithelfunktion benötigt vier bis acht Wochen [179]. Darüber hinaus veranlasst die RSV-Infektion das Epithel zur Produktion von proinflammatorischen Cytokinen und Chemokinen, die auf chemotaktisch wirken [455]. neutrophile und eosinophile Granulozyten - 21 2.1.6.2.1. Immunpathogenese Die auf eine RSV-Primärinfektion folgende Immunität ist weder vollständig noch lange anhaltend, hinterlässt jedoch einen gewissen Schutz gegen schwere Reinfektionen [179, 201] . Die Produktion spezifischer IgE-Moleküle wird mit der Entwicklung schwererer Verläufe und persistierendem Husten nach einer Bronchiolitis in Verbindung gebracht [492, 493] . Ob eine atopische Disposition die Voraussetzung für die Entwicklung von persistierenden Atemwegsproblemen nach einer RSV-Bronchiolitis ist, wird kontrovers diskutiert [64, 302, 338, 345, 412] . Eine längere Virusreplikation und schwerere Erkrankung wird bei immunsupprimierten Patienten beobachtet [185] , was für die Bedeutung der zellulären Immunabwehr spricht. Zell-TransferExperimente im Mausmodell haben sowohl eine antivirale als auch immunpathogenetische Bedeutung für CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten gezeigt [5] . Kinder mit einer RSV-Bronchiolitis haben während der Rekonvaleszenz im peripheren Blut weniger CD8+-T-Lymphozyten, als Kinder mit anderen RSV-bedingten Erkrankungen [111, 491] . Dies spricht für eine gestörte Modulation der Immunsuppression oder eine Umverteilung der CD8+-T-Lymphozyten in die Lungen dieser Kinder. Entsprechende experimentelle Untersuchungen im Mausmodell zeigten eine ausgeprägte Umverteilung verschiedener T-Lymphozyten-Populationen in die Lunge RSV-infizierter Tiere [254] . Die Bedeutung einer Th2-restringierten Immun- antwort in der Pathogenese der RSV-Bronchiolitis ist nicht klar [467] . Die Hypothese, dass die RSV-Bronchiolitis durch eine Th2-Antwort gekennzeichnet ist, ist nahe liegend, da dies die Persistenz von Atemwegssymptomen nach, sowie das Auftreten von RSV-spezifischem IgE und die Aktivierung von eosinophilen und basophilen Granulozyten während einer RSV-Bronchiolitis erklären würde [153, 467, 493] . Messungen von Cytokin- spiegeln im Blut und in Blutzellen betroffener Kinder als auch von gesunden Kontrollen zeigen jedoch kein einheitliches Bild [352, 378, 388, 466] . Auch die Verhältnisse im Mausmodell lassen keinen klaren Schluss zu. Die primäre RSV-Infektion führt hier eher zu einer Th1- Immunantwort 465] , jedoch zu einer Atemwegshyperreaktivität [402, 464]. [210, 402, - 22 2.2. Experimentelle Virusinfektionen RSV repliziert in einer Vielzahl humaner und animaler Zellen. Die Zellinien HEp-2 und HeLa sind zwei der effizientesten für die Vermehrung [240, 283] . Bis zu 90% der Infektiösität in Zellkulturen verbleiben zellassoziiert, hauptsächlich in der Form nahezu kompletter Virionen, die nicht vollständig gebuddet haben [14, 283] . Ein Großteil dieser zellassoziierten Virusfraktion kann durch Ultraschall oder Schütteln freigesetzt werden. Zehn Plaque-formende Einheiten (PFU) pro Zelle sind ein typisches Ergebnis. Virion-Präparationen enthalten meist große Mengen von zellulärem Membran-material. Ein großer Teil der freigesetzten Virionen [15] . Ein hoher scheint leer und daher nicht infektiös zu sein Aggregationsgrad oder sehr große Virionen sind zumindest für BRSV wahrscheinlich, da nur 1% der Infektiösität nach Passage durch ein 0,45µmFilter verbleiben [353] . RSV verliert seine Infektiösität schnell während Aufbewahrung, Gebrauch oder Aufreinigung. Dies kann jedoch durch Pufferung und Zugabe von Magnesiumsulfat als Stabilisator verhindert werden [133] . Die Virusquantifi-zierung in der Zellkultur geschieht in der Regel mit Hilfe des so genannten Plaque-Assays. RSV-Plaques entwickeln sich nur langsam, so dass schnellere und effizientere Detektionsmethoden [59, 82, 399, 452] . per Immunhistochemie oder -fluoreszenz entwickelt wurden Relativ spät im Ablauf der Infektion erfolgt die Fusion benachbarter Zellen. Die Konzentration von Calcium und Glutamin ist kritisch für diese Form des cytopathischen Effekts [298, 405] . Experimentelle Virusinfektionen peribronchialer Drüsenepithelzellen wurden bisher kaum durchgeführt. Der erste Hinweis, dass diese Zellen ein Ziel für respiratorische Viren sein könnten, ergab sich aus der Beobachtung, dass bei experimentell mit Adenovirus Typ 2 infizierten Hunden Viruspartikel und -antigene in den bronchialen und trachealen submukösen Drüsen nachweisbar waren [67] . Eine experimentelle Infektion trachealer Drüsenepithelzellen der Katze [157] wurde von Gentry et al. mit Influenzaviren durchgeführt eine nicht lytische, produktive Infektion nachweisen . Sie konnten [157] . Beim Nachweis der Infizierbarkeit einer bestimmten Zellart mit einem bestimmten Virus muss zwischen der Suszeptibilität und der Permissivität der Infektion unterschieden werden. - 23 2.2.1. Begriff der Suszeptibilität Lässt sich eine bestimmte Zellart mit dem untersuchten Virus infizieren, so ist sie empfänglich (suszeptibel). Diese Suszeptibilität kann auf verschiedene Art und Weise nachgewiesen werden. Meist bedient man sich hier morphologischer Verfahren, die einen bestimmten Effekt der Infektion auf die Zelle (so genannter cytopathischer Effekt) wie die Bildung von Riesenzellen, intrazytoplasmatischer oder intranukleärer Einschlusskörper nachweisen. Ist die Erkennbarkeit dieses cytopathischen Effekts mit der Phasenkontrastmikroskopie alleine zu schwierig, kann der Einsatz der Immunhistochemie bzw. Immunfluoreszenz mit spezifischen Antikörpern gegen Virusbestandteile die Sensitivität erhöhen. 2.2.2. Begriff der Permissivität Die reine Tatsache, dass eine bestimmte Zellart für das untersuchte Virus suszeptibel ist, bedeutet jedoch noch nicht automatisch, dass in dieser Zellart das Virus dann auch repliziert. Repliziert das Virus in der suszeptiblen Zellart, so ist diese für dieses Virus permissiv. Die Permissivität kann z.B. durch den Nachweis von infektiösen Partikeln im Überstand der infizierten Zellkultur überprüft werden. Meist wird hierzu dieser Überstand auf eine Zelllinie, von der bekannt ist, dass sie gegenüber dem untersuchten Virus suszeptibel ist, überimpft und dann die Infektion morphologisch nachgewiesen. Um auszuschließen, dass die nach der Überimpfung beobachtete Infektion auf ursprünglich zu der untersuchten Zellkultur zugegebene Viren, die noch im Überstand enthalten waren, zurückzuführen ist, kann der Nachweis mittels dekadischer Titrierung auch quantitativ im Zeitverlauf der Infektion geführt werden. - 24 2.3. Peribronchiale Drüsen 2.3.1. Aufbau und Morphologie Bei den peribronchialen Drüsen handelt es sich um verzweigte tubuloalveoläre Drüsen, die in der Wand der Trachea und der Bronchien zwischen dem Oberflächenepithel und dem Knorpel liegen. Die Drüsen nehmen in ihrer Zahl vom kartilaginären zum muskulären Teil der Atemwege hin kontinuierlich ab. Seröse und muköse Zellen sind in der Regel in separate Azini oder Tubuli verteilt. Beim Menschen finden sich die serösen Zellen oft in Form seröser Halbmonde an der Peripherie muköser Tubuli gruppiert [325] . Das Sekret der Drüsen wird über ein Gangsystem auf die Oberfläche der Schleimhaut abgegeben. Die peribronchialen Drüsen bestehen aus zwei funktionellen Einheiten: Dem Azinus, der Granula und Elektrolyte speichert und sezerniert, und dem Ausführungsgangsystem, das eine Rolle in der Flüssigkeits- und Elektrolytbilanz des Sekretes hat [324, 325] . Die Drüsen setzen sich aus drei morphologisch unterscheidbaren Zelltypen zusammen: Seröse Zellen, muköse Zellen und Myoepithelzellen. Bei gesunden Erwachsenen übersteigt das Volumen der submukösen Drüsenzellen jenes der Becherzellen um das vierzigfache [374]. 2.3.1.1. Seröse Drüsenepithelzellen Die pyramidenförmigen serösen Zellen sind meist am Ende eines mukösen Tubulus lokalisiert, häufig in Form eines serösen Halbmondes. Die serösen Zellen haben am basalen Zellende liegende kleine runde Zellkerne mit prominenten Nucleoli. Sie besitzen ein supranukleär liegendes raues endoplasmatisches Retikulum und ein gut entwickeltes Golgi-Feld. Die serösen Granula sind elektronendicht und reichen in ihrer Größe von 100 bis 1.800nm, liegen jedoch meist zwischen 300 und 1.000nm. Die Membranen benachbarter Granula sind deutlich getrennt und fusionieren nicht [324] . Seröse Zellen enthalten und sezernieren einige antibakterielle Substanzen: Laktoferrin, Lysozym, Immunglobulin A in Verbindung mit der Sekretorischen Komponente (SC), β-Defensine sowie die SurfactantApoproteine A und B [49, 303, 417] . Die meisten serösen Azini reagieren mit - 25 Färbungen für sulfatierte Mucine. Dies steht im Einklang mit autoradiographischen Ergebnissen, die zeigen, dass radioaktiv markierte Sulfate sehr schnell von serösen Zellen inkorporiert werden [268] . Die Glycokonjugate seröser Zellen sind stärker sulfatiert als jene muköser Zellen [268]. 2.3.1.2. Muköse Drüsenepithelzellen Diese hochprismatischen Epithelzellen haben basal liegende, abgeflachte Zellkerne, ein prominentes supranukleäres raues endoplasmatisches Retikulum und einen gut entwickelten Golgi-Apparat. In der Transmissionselektronenmikroskopie enthalten sie zahlreiche elektronenlichte Granula, die in ihrer Größe von 300nm nahe des Golgi-Apparates bis zu 1.800nm nahe der apikalen Zelloberfläche reichen [324] . Die Fusion benachbarter Granula-membranen nahe der apikalen Zelloberfläche könnte einem Fixierungs-artefakt bedingt durch die Fragilität der Membranen entsprechen, jedoch auch auf einem apokrinen Sekretionsmechanismus beruhen. Vorwiegend die mukösen Zellen produzieren saure und neutrale Glycoproteine (Mucine). Die sauren Glycoproteine setzen sich aus sulfatierten und sialierten Mucinen zusammen Diese Mucine bestimmen die [237, 238, 258, 267, 269, 416, 418] physikochemischen . Eigenschaften (Viskosität, Wasserspeicherung) des Mucus [49, 239, 250, 251, 262, 303, 396, 417, 422]. 2.3.1.3. Myoepithelzellen Myoepithelzellen umgeben die Azini und sekretorischen Tubuli der peribronchialen Drüsen. Sie sind spindelförmig, angefüllt mit Myofilamenten und liegen zwischen Basalmembran und Drüsenepithelzellen und unterstützen durch ihre Kontraktion die Sekretion [410]. - 26 2.3.1.4. Zellen der Drüsenausführungsgänge Die Drüsenausführungsgänge tragen ein Zylinderepithel aus schmalen, eosinophilen Zellen, die zahlreiche große Mitochondrien enthalten [324, 325] . Das Drüsenausführungsgangsystem spielt eine Rolle in der Flüssigkeitsund Elektrolytbilanz des Sekretes [324, 325] . Die Expression des “cystic fibrosis conductance regulator“ (CFTR) ist im Oberflächenepithel nur sehr gering, während jene in den submukösen Drüsen um ein vielfaches höher ist [86] . 2.3.1.5. Zellen des umgebenden Bindegewebes Hier finden sich Endothelzellen, glatte Muskelzellen, Fibroblasten, Mastzellen, Lymphozyten, Plasmazellen und neutrophile sowie eosinophile Granulozyten. Da die peribronchialen Drüsen häufig zwischen Knorpelplatten eingebettet sind, finden sich in der unmittelbaren Umgebung der Drüsenazini häufig auch Chondrozyten. 2.3.2. Sekret Den größten Teil des Trockengewichts des Mucus machen hochmolekulare kohlenhydratreiche Proteine aus. Diese Moleküle tragen negative Ladungen in unterschiedlicher Dichte, abhängig von ihrem Gehalt an Sialinsäure und Sulfatestern. Die PAS-Reaktion (periodic acid-Schiff’s reaction) färbt komplexe Kohlenhydrate durch die oxidative Spaltung der KohlenstoffKohlenstoff-Bindung in 1,2-Glykolen oder deren Amino-Substituten und bildet dadurch Dialdehyde. Diese Aldehyde reagieren mit schwefeliger Fuchsinsäure, was zur Bildung eines violetten Farbstoffes führt. Alcian Blau ist ein positiv geladener Farbstoff, der elektrostatische Bindungen mit Polyanionen des Gewebes bildet. Gewebsbestandteile, deren reaktive Gruppen beim pH der Färbelösung vollständig ionisiert sind, werden am stärksten gefärbt. Daher ist es durch Variation des pH-Wertes der Färbelösung möglich, zwischen Zellen zu differenzieren, die Sulfatester (pK ≤ 1,0) oder Carboxylgruppen (pK ≈ 2,5) enthalten. - 27 2.3.3. Lektinmarkierungen Während PAS, Alcian Blau und andere Färbungen die Anwesenheit komplexer Kohlenhydrate anzeigen, können mit Hilfe der Lektinhistochemie detailliertere Informationen über die molekulare Zusammensetzung verschiedener Zelltypen gewonnen werden. Lektine sind Proteine, meist selbst Glycoproteine, die eine spezifische Affinität zu Zuckerresten in Kohlenhydratseitenketten von Proteinen, Peptiden und Lipiden aufweisen. In Tabelle 1 werden einige Charakteristika verschiedener Lektine hinsichtlich ihres Markierungsverhaltens gegenüber den Zellen der peribronchialen Drüsen zusammengefasst (adaptiert aus: [39, 108, 168, 312]). 2.3.4. Immunhistochemie 2.3.4.1. Laktoferrin Laktoferrin ist ein 70-75 kD großes, Eisen-bindendes Protein, das zuerst im Sekret der Brustdrüse entdeckt wurde. Später wurde es auch im bronchialen [305] und nasalen Sekret, im Sekret von Tränen- und Speicheldrüsen, sowie in den Granula neutrophiler Granulozyten gefunden [306] . Immunhisto- chemische Untersuchungen zeigten eine Lokalisation in den serösen Azini der peribronchialen Drüsen [48, 304] . Die Verteilung innerhalb der Granula seröser Drüsenepithelzellen unterliegt hierbei großer Variabilität. - 28 - Tab. 1: Zuckerspezifität und Markierungsverhalten verschiedener Lektine Abkürzung Name Zuckerspezifität Con A Concanavalin A α-MetMan, Man, Glc HPA Helix pomatia Agglutinin LCA LTA PHA Lens culinaris Agglutinin Lotus tetragonolobus Agglutinin Phytohemagglutinin PNA Peanut Agglutinin SBA Soybean Agglutinin WGA Wheat Germ Agglutinin Markierungsverhalten Nach 2h nur seröse Zellen ++++, nach 24h auch muköse Zellen ++ und Becherzellen +, α-MetMan inhibiert kompetitiv die Bindung α-D-GalNAc Muköse Zellen ++++, seröse Zellen negativ, Becherzellen von Patienten mit Blutgruppe A +++, GalNAc inhibiert die Bindung Man, Glc Seröse Zellen +++, muköse Zellen und Becherzellen negativ α-L-Fuc Muköse Zellen, Becherzellen ++++, apikale Region seröser Zellen schwach Vor allem seröse Zellen +++, β-D-Gal-β-D-GlcNAc-D-Man in einige wenige muköse Zellen +, Glycanen vom komplexen Typ, Becherzellen negativ Gal, GalNAc Gal-GalNAc > GalNAc, Gal Becherzellen ++++, Muköse Zellen +++, apikale Region seröser Zellen, Gal oder Mucine inhibieren kompetitiv die Bindung an muköse Zellen oder Becherzellen, nicht jedoch die an seröse Zellen GalNAc, Gal Becherzellen +++(+), muköse Zellen +++, seröse Zellen ++ leicht in der Nähe der apikalen Region, GalNAc inhibiert die Bindung Muköse Zellen +++, Becherzellen ++++, β-D-GalNAc und dessen β(1->4)seröse Zellen schwach + bis negativ, verknüpfte Oligosaccharide, endständige GalNAc- und NANA-Reste GlcNAc und Mucine inhibieren kompetitiv die Bindung - 29 2.3.4.2. Lysozym Lysozym ist ein bakteriolytisches Enzym mit einem Molekulargewicht von 14,5 kD. Es ist sowohl im Sekret des respiratorischen Traktes, der Brust-, Tränen- und Speicheldrüsen enthalten, als auch in den sekretorischen Granula neutrophiler und eosinophiler Granulozyten. Mittels Immunhistochemie konnten verschiedene Arbeitsgruppen zeigen, dass die submukösen Drüsen die Hauptquelle von Lysozym in Trachea und Bronchien sind [49, 257, 303, 417, 444] . Kleine Mengen Lysozym konnten in Epithelzellen nachgewiesen werden, doch dies konnte nicht durch Immunhistochemie belegt werden [259] . Bei Nagetieren konnte Lysozym ebenso in den mukösen Zellen und auf der Epitheloberfläche nachgewiesen werden [417] , doch bei den meisten Spezies stellt die seröse Zelle der submukösen Drüsen die Hauptquelle für Lysozym dar. 2.3.4.3. Sekretorische Komponente des IgA Sekretorisches IgA ist das hauptsächliche Immunglobulin des Bronchialsekretes und anderer externer Körperflüssigkeiten [445, 446, 447, 448]. Es besteht aus zwei IgA-Molekülen, die durch eine so genannte J-Peptidkette verbunden sind und dem Glycoprotein “Sekretorische Komponente“ (SC) [445, 446, 447, 448] . Die J-Peptidkette und die zwei IgA-Moleküle werden in Plasmazellen des Drüsenstromas zu Dimeren zusammengesetzt. Die Sekretorische Komponente wird separat in den Drüsenzellen synthetisiert und auf deren basolateralen Oberfläche exprimiert. Die IgA-Dimere binden spezifisch an die Sekretorische Komponente auf der basolateralen Oberfläche der Drüsenzellen, werden als SC-IgA-Komplexe durch Endozytose von den Zellen aufgenommen und zu ihrer luminalen Oberfläche transportiert [169]. - 30 2.3.5. Primärkultur peribronchialer Drüsenepithelzellen Eine der ersten Kulturen trachealer Epithelzellen wurde von Wu und Smith etabliert, die verstreute Zellen aus Kaninchentracheen in Kultur nahmen [503] . Diese Kulturen bestanden aus gemischten Zelltypen und wurden hauptsächlich für das Studium der Mucinsekretion benutzt. Andere Kulturverfahren wurden vorwiegend Ionentransport [84] submukösen Drüsenepithelzellen für Untersuchungen [272] und zur Carcinogenese verwendet Oberflächenepithel herleiten sich zum . Obwohl die ontogenetisch aus dem [124] , weisen die Drüsenepithelzellen einige signifikante Unterschiede im Phänotyp auf. Obwohl es schwieriger ist, die Drüsenepithelzellen aus dem umgebenden Bindegewebe zu isolieren, konnten sie aus Katzentracheen durch mechanische Zerkleinerung und enzymatische Verdauung erfolgreich kultiviert werden [104] . Infolge der Effekte durch mechanische und enzymatische Alteration, fehlte diesen Zellen die physiologische Reaktion auf Stimulantien des autonomen Nervensystems. Durch Aussaat der Zellen auf mit humanem PlazentaKollagen beschichteten Kulturgefäßen, gewannen diese einige ihrer physiologischen Eigenschaften zurück, zeigten einen eher serösen Phänotyp [137, 415] und gaben Glycokonjugate in den Kulturüberstand ab 361] . Ein Einfluss der Beschichtung der Kulturflaschen [29, 102, 103, 321, [35, 449] sowie der Anzahl der Passagen auf die Differenzierung der peribronchialen Drüsenepithelzellen wurde berichtet [34] . Die besten Ergebnisse bezüglich Differenzierung und Funktion der peribronchialen Drüsenepithelzellen in Primärkultur wurden erreicht, wenn Serum-freie Medien verwendet wurden [34] . Die Zusammensetzung des Mediums hat ebenfalls Einfluss auf Proliferation, Differenzierung und Stimulierbarkeit Hervorzuhebende Bedeutung haben hierbei Epinephrin Hydrocortison [78] und Vitamin A Glycoproteinen wurden Cytokeratine Lysozym [322] , Insulin, EGF, . Neben der Synthese von [34, 35, 78, 120] , Laktoferrin , Antileukoprotease (bronchial inhibitor) [78] Zellen. [225] [120, 319, 450] und Lektine der [35, 120, 319] , [319, 321, 322, 450] als biochemische oder immunhistochemische Marker für die Differenzierung der Zellen verwendet. - 31 2.4. Asthma bronchiale, Atemwegshyperreaktivität und chronisch obstruktive Lungenerkrankungen (COPD) 2.4.1. Definitionen Sowohl das Asthma bronchiale als auch die chronisch obstruktiven Lungenerkrankungen (COPD), sind durch eine Obstruktion der Atemwege mit Limitierung des Atemfluss charakterisiert, die insbesondere bei Exazerbationen mit einer Atemwegshyperreaktivität einhergeht [24, 107, 200, 223, 278, 292, 337, 362, 376, 395, 473] . Während bei der COPD die unvollständige Reversibilität der Veränderungen mit meist langsamer Progression im Vordergrund steht, sind die Veränderungen beim Asthma bronchiale in der Regel vollständig reversibel [6, 278, 279, 301, 339, 411]. 2.4.2. Epidemiologie von Asthma bronchiale und COPD Inzidenz und Prävalenz beider Erkrankungen steigen weltweit [24, 132, 214, 219, 249, 296, 310, 344, 362, 364, 369, 373, 435, 460, 468, 497] , ebenso die Mortalität [12, 30, 79, 176, 266] . Weltweit wurde die Prävalenz der COPD 1990 auf 9,34/1.000 Männer und 7,33/1.000 Frauen geschätzt [340] . Gegenwärtig ist die COPD die sechsthäufigste Todesursache weltweit [176] . In Europa liegt sie an der dritten, in den USA an der vierten Stelle der Todesursachenstatistik [364]. In Deutschland leiden knapp drei Millionen Bürger an einer COPD [126] . Die Anzahl der Asthma-Kranken weltweit wird auf 100-150 Millionen geschätzt, mit 180.000 Todesfällen pro Jahr [496]. Die Zahl der Erkrankten in Deutschland beträgt etwa vier Millionen, die Erkrankungshäufigkeit in West-Europa hat sich in den letzten zehn Jahren ca. verdoppelt [496] . Dies bedingt einen Anstieg der Kosten, die das Gesundheitswesen für diese Erkrankungen aufwenden muss [12, 30, 79, 132, 158, 176, 296, 362, 364, 369, 373, 435]. Die durch Asthma weltweit verursachten Kosten werden höher geschätzt als die Summe der durch Tuberkulose und HIV/AIDS verursachten [496]. - 32 2.4.3. Pathophysiologie - Gemeinsamkeiten und Unterschiede Ätiologie und Pathogenese von Asthma bronchiale und COPD sind nicht völlig verstanden [18, 147, 202, 203, 221, 246, 271, 277, 292, 295, 373, 377, 419, 483]. Bei beiden findet sich eine chronische Inflammation der Atemwege, wobei beim Asthma bronchiale eher ein Th2- und bei der COPD eher ein Th1-Typ der immunologischen Reaktion vorherrscht [24, 80, 196, 255, 270, 375, 387, 393, 460, 472, 476, 483, 514] . Bei der COPD finden sich CD8+-T-Lymphozyten, Makrophagen [24, 25, 100, 223, 406, 425, 437, 459] und neutrophile Granulozyten Asthma , während beim CD4+-T-Helfer-Lymphozyten, bronchiale eosinophile Granulozyten und eine variable Anzahl an Mastzellen vorherrschen [2, 50, 77, 186, 196, 223, 270, 309, 483, 514] . Insbesondere im Rahmen von Exazerbationen finden sich jedoch auch bei der COPD häufig eosinophile Granulozyten [46, 80, 127, 146] . Bei beiden Erkrankungen kommt es zu einem Umbau der Atemwege. Während beim Asthma bronchiale eine Verdickung der Basalmembran und eine Vermehrung der glatten Muskulatur im Vordergrund stehen, sind es bei der COPD eine Vermehrung der Becherzellen, eine Fibrose der Atemwege, eine Hypertrophie der bronchiolären glatten Muskulatur und eine Inflammation bevorzugt im Bereich der kleinen Atemwege mit einem Verlust der elastischen Aufhängung der umgebenden Alveolen [24]. Eine Hypertrophie der mukösen peribronchialen Drüsenanteile findet sich bei beiden Erkrankungen [222, 354, 355] . Bei der chronischen Bronchitis ist auch der Anteil an mukösen Zellen in den submukösen Drüsen vermehrt [80, 433, 434] und diese enthalten einen größeren Anteil an Neuraminidase-resistenten sauren Mucopolysacchariden [109] . Beim Asthma bronchiale sind die Atemwege mit einem eingedickten, zähen Sekret angefüllt Curschmann-Spiralen, [117] . Diese Sekretpfropfen enthalten häufig zahlreiche Eosinophile und Charcot-Leyden- Kristalle und stehen häufig in direkter Verbindung mit dem Sekret in den Ausführungsgängen der peribronchialen Drüsen [118, 119] . Morphometrische Analysen der peribronchialen Drüsen zeigten, dass diese hypertrophiert sind, jedoch nicht bis zu dem Grad, der bei der chronischen Bronchitis gefunden werden kann [119, 434] . Die Beziehungen zwischen chronischer Bronchitis, Emphysem sowie Asthma bronchiale und Reversibilität der Atemwegsobstruktion sind in Abbildung 2 dargestellt [296]. - 33 - Abb. 2: Nicht-proportionales Venn-Diagramm. Beziehungen zwischen Chronischer Bronchitis, Emphysem, Asthma bronchiale und dem Grad der Reversibilität der Atemwegsobstruktion. A gibt die Definition der COPD nach der ATS wieder [6], B die der GOLD-Initiative [362]. Aus: [296]. 2.4.3.1. Exazerbationen Bei beiden Erkrankungen findet sich eine Atemwegshyperreaktivität [138, 260, 368, 469, 470, 485] . Auslösende Faktoren sind Infektionen mit Viren (Rhino-, Parainfluenza-, Influenza-, Adenoviren, RSV) oder Bakterien (Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydophila pneumoniae) [21, 40, 68, 83, 128, 159, 172, 175, 234, 235, 323, 343, 351, 377, 385, 401, 413, 414, 475, 485, 488, 489, 506] , aber auch Noxen aus der Umwelt (Stickstoff-, Schwefeldioxid, Ozon, Stäube) [7, 131, 155, 342, 357] . Die Mechanismen mit denen Infektionen die Störung des Sekretionsablaufes bewirken und den Entzündungsprozess initiieren sind nicht ausreichend verstanden [99, 127]. Es kommt zur Eindickung des Sekretes durch Vermehrung der Becherzellen und der mukösen Anteile in den peribronchialen Drüsen. Der Sekrettransport ist gestört durch eingedicktes Sekret, Schleimhautödem und Hypertrophie der glatten Muskulatur [24, 36, 63, 107, 217, 222, 223, 278, 293, 330, 337, 395, 409, 434, 443, 481] . - 34 2.4.3.2. Rolle der peribronchialen Drüsen Beim Menschen sind die peribronchialen Drüsen Hauptquelle des Mucus [320, 408] . Eine Hypertrophie ihrer mukösen Anteile findet sich sowohl beim Asthma bronchiale als auch bei der COPD [119, 434] . Die serösen Anteile sezernieren Funktionsproteine, die eine Rolle in der lokalen Infektabwehr spielen (siehe 2.3.1.1.), während in den mukösen Anteilen die für die physikochemischen Eigenschaften wichtigen Mucine gebildet werden (siehe 2.3.1.2.). Während sich eine Hyperplasie der Becherzellen im respiratorischen Epithel bei Rauchern mit oder ohne COPD findet, ist die Infiltration der Drüsen und des umgebenden Bindegewebes durch neutrophile Granulozyten typisch für die COPD und findet sich nicht bei gesunden Rauchern [293] . Das die Drüsen umgebende Bindegewebe ist bei COPD-Patienten reich an CD8+-T-Lymphozyten [25, 100, 459] insbesondere während einer Exazerbation Eosinophile enthalten und kann [46, 80, 127, 146] . Beim Asthma bronchiale finden sich in der subepithelialen Bindegewebszone neutro- sowie eosinophile Granulozyten, Mastzellen und CD4+-T-Helfer-Lymphozyten [2, 50, 77, 186, 196, 223, 270, 309, 483, 514] . Die Enzyme dieser Entzündungszellen (Mastzellen-Chymase, Elastase der Neutrophilen und Cathepsin G) aktivieren die Sekretion der peribronchialen Drüsen [123, 129, 142, 215, 294, 309, 336, 400, 500] . Die Chymase spielt darüber hinaus eine Rolle bei der akuten Inflammation, da sie in der Lage ist, bronchoaktive Peptide zu aktivieren [309] . Die peribronchialen Drüsenepithelzellen können hierzu über die Expression der neutralen Endopeptidase und von Kallikrein, welches eine Rolle in der Kinin-vermittelten Inflammation spielt, beitragen [20, 403] . Proinflammatorische Cytokine [110] und Faktoren, die bei der Auslösung einer Exazerbation eine Rolle spielen (LPS, erhöhte Osmolarität, Kälte und Ozon) aktivieren ebenso die Sekretion und die Produktion von Cytokinen [122, 211, 212, 242, 313, 320, 365, 429] . Seröse Drüsenepithelzellen können Enzyme bilden, welche extrazelluläre Matrix degradieren (MMP-2, -7), was die Bedeutung der Drüsen beim Umbau der Bronchialwand unterstreicht [288, 392, 451] . Normale Regulationsmechanismen, wie die Hemmung der basalen und der Methacholin-induzierten Sekretion durch vasoaktives intestinales Polypeptid (VIP), versagen bei der COPD [85, 319]. - 35 2.4.3.3. Bedeutung des Transkriptionsfaktors NFκB Der Transkriptionsfaktor NFκB (nuclear factor of kappa-light chain inducer in mature B cells) spielt in der Pathogenese von COPD und Asthma bronchiale eine zentrale Rolle [26, 60, 106, 114, 190, 198, 372, 471, 499, 505, 512] . Dies begründet sich in der Abhängigkeit der Gentranskription vieler Moleküle, die in der Pathophysiologie dieser Erkrankungen bedeutsam sind, von der NFκB-Aktivität. Hierzu gehören Chemokine, die Entzündungszellen zum Ort einer Infektion locken, Zelladhäsionsmoleküle, die den Durchtritt durch die Gefäßwände erleichtern, Cytokine und andere Moleküle, welche die Akut-Phase-Reaktion vermitteln und Enzyme, die bei der Infektabwehr aber auch beim Umbau der Bronchialwand und der Emphysementstehung eine Rolle spielen. In Tabelle 2 sind einige dieser NFκB-abhängigen Moleküle und ihre Bedeutung aufgelistet [4, 13, 16, 23, 27, 45, 47, 73, 74, 75, 98, 115, 125, 174, 187, 188, 190, 198, 206, 216, 224, 244, 245, 247, 253, 261, 265, 273, 280, 281, 282, 285, 286, 311, 317, 348, 404, 430, 439, 440, 458, 474, 477, 482, 501, 504, 505, 508] . Ein weiterer Grund ist die Aktivierbarkeit von NFκB durch Stimuli, die in der Pathogenese von Asthma bronchiale und COPD von Bedeutung sind. Hierzu zählen proinflammatorische Cytokine, virale und bakterielle Produkte sowie oxidativer Stress [113, 188, 216, 220, 247, 253, 285, 318, 356, 359, 421, 439, 440] . Da die Gentranskription einiger der NFκB-Induktoren sowie der NFκB-Vorläuferproteine (p100, p105) selbst NFκB- abhängig ist, ergibt sich die Möglichkeit eines Circulus vitiosus. Jedoch ist auch die Gentranskription des NFκB-Inhibitors IκBα NFκBabhängig, ebenso die Gentranskription der IκBα-Domänen enthaltenden NFκB-Vorläuferproteine (p100, p105), so dass eine NFκB-Aktivierung auch immer gleich die Voraussetzungen zur Beendigung der NFκBAktivierungskaskade im Sinne einer negativen Rückkopplung schafft. Tabelle 3 listet einige der NFκB-aktivierenden Stimuli und ihre Bedeutung bei COPD und Asthma bronchiale auf [17, 26, 188, 190, 356, 372, 505] . - 36 - Tab. 2: Moleküle, deren Gentranskription NFκB-abhängig ist und ihre Bedeutung für COPD und Asthma bronchiale. Molekül c-PA2 c-Rel Ck 17 E-Selectin Eotaxin G-CSF GM-CSF i-COX-2 i-NOS ICAM-1 IFNβ IFNγ IκBα IL-1β IL-2, IL-2Rα IL-4 IL-5 IL-6 IL-8 IRF 5-Lipoxygenase Bedeutung Phospholipase A2, Enzym der Leukotrien-Synthese Transkriptionsfaktor des NFκB-Komplexes Cytokeratin, dessen Gentranskription in RSV-infizierten Riesenzellen NFκB-gesteuert ist Zelladhäsionsmolekül, das bei der Transmigration von neutrophilen Granulozyten beteiligt ist Chemokin für eosinophile Granulozyten Wachstumsfaktur für neutrophile Granulozyten Wachstumsfaktor für myelomonozytäre Zellen Synthetisiert Prostaglandine und Thromboxane, die als Mediatoren bei der Inflammation wirken Induzierbare NO-Synthase, NO gilt als proinflammatorisches Molekül Zelladhäsionsmolekül, das bei der Rekrutierung von Entzündungszellen beteiligt ist Cytokin mit antiviraler, antiproliferativer und immunmodulierender Wirkung Von Th1-Zellen gebildetes antiinflammatorisches Cytokin, inhibiert die Th2-Zell-Differenzierung Inhibitorisches Protein des NFκB-Komplexes Proinflammatorisches Cytokin, das NFκB aktiviert Wachstumsfaktor für T-Lymphozyten, Alpha-Kette des Interleukin-2-Rezeptors Aktiviert B-Lymphozyten, Mastzellen, neutrophile Granulozyten und Makrophagen Cytokin, das eosinophile Granulozyten aktiviert Proinflammatorisches Cytokin Neutrophilen-chemotaktisches Cytokin Faktoren, welche die Transkription von Cytokinen, Chemokinen und Interferonen regulieren Enzym der Leukotrien-Synthese - 37 - Fortsetzung Tab. 2 Molekül M-CSF MCP-1 MIP-1α MMP-1, -2, -3, -9, -13, -14 p100 p105 RANTES TCR TNF-α TNF-β VCAM-1 Bedeutung Wachstumsfaktor für Monozyten / Makrophagen Chemokin für Makrophagen Chemokin für Makrophagen Matrix-Metallo-Proteinasen Precursor für p52, enthält ARD Precursor für p50, enthält ARD Chemokin für neutrophile Granulozyten T-Zell-Rezeptor Proinflammatorisches Cytokin, das NFκB aktiviert Proinflammatorisches Cytokin Zelladhäsionsmolekül, das bei der Transmigration von Entzündungszellen beteiligt ist Tab. 3: Aktivatoren des NFκB-Komplexes und ihre Bedeutung für COPD und Asthma bronchiale. Stimulus CpG-DNA BLP ds-RNA IL-1β IL-2 LPS Oxidativer Stress TNF-α TNF-β Bedeutung Bakterielle DNA aktiviert NFκB über TLR9 Bakterielle Lipoproteine aktivieren NFκB über TLR2 Virale ds-RNA führt zur Phosphorylierung von IκBα und p105 und darüber zur NFκB-Aktivierung NFκB-abhängiges proinflammatorisches Cytokin Cytokin, dessen Gentranskription NFκB-abhängig ist Bakterielles Lipopolysaccharid, aktiviert NFκB über TLR4 Oxidantien entstehen im Rahmen von Inflammation und Infektabwehr und aktivieren NFκB NFκB-abhängiges proinflammatorisches Cytokin NFκB-abhängiges proinflammatorisches Cytokin - 38 Im Cytoplasma liegt NFκB inaktiv als Trimer vor, wobei das inhibitorische Protein IκB an das Kernlokalisierungssignal (NLS) des NFκB-Dimers gebunden ist. Durch die genannten Stimuli werden IκK aktiviert, die IκB phosphorylieren. Dies führt durch Ubiquitinierung und Proteolyse von IκB im 26S-Proteasom zur Freigabe des NFκB-Dimers und damit zur Freilegung des NLS. Der freigesetzte NFκB-Dimer kann in den Zellkern gelangen, an spezifische DNA-Sequenzen (5’-GGGACTTTCC-3’ oder 5’-GGGAATTCCC-3’) binden und so zu einer vermehrten Transkription der abhängigen Gensequenzen führen. Der IκK-Komplex besteht aus zwei katalytischen (IκKα = IκK1, IκKβ = IκK2) und einer regulatorischen Untereinheit (IκKγ). Abbildung 3 illustriert diese Vorgänge [16, 23, 163, 188, 190, 316, 318] . Alle NFκB- bzw. Rel-Proteine enthalten eine konservierte Domäne (Rel homology domain = RHD), welche das NLS enthält und die DNABindung sowie die Dimerisierung vermittelt. Außer RelB können alle NFκB-/Rel-Proteine miteinander Homo- oder Heterodimere bilden. RelB kann nur mit p50 oder p52 dimerisieren. Alle NFκB-/Rel-Proteine außer p50 und p52 tragen Transkriptions-Aktivierungs-Domänen (TAD). Trotz des Fehlens solcher TAD im p50-Molekül sind p50-Homodimere an der Regulation der Transkription einiger Gene beteiligt. Wie die IκB-Proteine (IκBα, IκBβ, IκBε, Bcl-3) enthalten die beiden Vorläuferproteine p100 (Precursor für p52) und p105 (Precursor für p50) sieben Ankyrin-RepeatDomänen (ARD), welche für die Interaktion mit der DimerisierungsDomäne der NFκB- bzw. Rel-Proteine verantwortlich sind. Diese Interaktion verdeckt das NLS der NFκB-Dimere und verhindert so deren Translokation in den Nucleus. IκBα, IκBβ, p100 und p105 bilden bevorzugt im Cytoplasma Trimere mit NFκB-Dimeren, während Bcl-3 Homodimere aus p50 oder p52 bevorzugt im Kern bindet. Während IκBα, IκBβ und die ARD von p100 und p105 (auch als IκBδ und IκBγ bezeichnet) ausschließlich inhibierend auf NFκB wirken, trifft dies für Bcl-3 nicht zu. Zwar kann die Bindung von Bcl-3 an p50- oder p52-Homodimere zu deren Dissoziation von der DNA führen, jedoch kann Bcl-3 Komplexe mit DNAgebundenem p52 bilden, welche die Transkription aktivieren. Auch die Interaktion von IκB-Domänen mit NFκB-Dimeren, führt zu deren Dissoziation von der DNA. IκBα und IκBβ besitzen höchste Affinität für NFκB-Dimere, welche p65 oder c-Rel enthalten, während die IκB- - 39 Domänen (ARD) in p100 und p105 an nahezu alle möglichen Homo- und Heterodimere aus NFκB- und Rel-Proteinen binden. Die Halbwertszeit von IκBα ist relativ kurz, so dass Inhibitoren der Proteinsynthese zu einer Aktivierung von NFκB führen. Nach einer NFκB-Aktivierung ist der cytoplasmatische IκB-Pool signifikant depletiert und muss durch de novo-Synthese wieder aufgefüllt werden. Da die Gentranskription von IκBα, p100 und p105 NFκB-abhängig ist, führt jede NFκB-Aktivierung auch zur Wiederauffüllung des cytoplasmatischen IκBα-Pools. Neu synthetisiertes IκBα kann in den Zellkern diffundieren und durch die Interaktion mit NFκB-Dimeren deren Dissoziation von der DNA und damit die Beendigung der Gentranskription herbeiführen [16, 23, 163, 188, 190, 316, 318] . Eine besondere Funktion kommt IκBβ zu. Obwohl die inhibitorischen Proteine IκBα und IκBβ nach einer NFκB-Aktivierung schnell neu synthetisiert werden, kann es zu einer “persistierenden“ NFκB-Aktivierung kommen. Diese wird durch eine minderphosphorylierte IκBβ-Form vermittelt, die zwar an den NFκB-Komplex binden kann, jedoch weder das NLS noch die DNA-Bindungs-Domäne verdeckt. Dieser Komplex aus NFκB und minderphosphoryliertem IκBβ kann daher in den Zellkern gelangen, an die Zielsequenz binden und die Transkription des entsprechenden Gens induzieren. Weiterhin wird hierdurch die Bindung von IκBα an den NFκB-Komplex und somit seine Dissoziation von der Zielsequenz verhindert, was die lange anhaltende Aktivierung erklärt 163, 188, 190, 316, 318] . [16, 23, - 40 - Abb. 3: Signaltransduktionsweg zur NFκB-Aktivierung. http://www. biocarta.com/pathfiles/h_nfkbPathway.asp (Zugriff vom 17.06.2004) 2.4.3.4. Bedeutung von Interleukin 5 (IL-5) Immunologisch sind Atemwegshyperreaktivität und Asthma bronchiale durch die vermehrte Bildung von Th2-Cytokinen gekennzeichnet [196, 255, 270, 387, 393, 460, 472, 476, 483, 514] . IL-5 nimmt hierbei eine Schlüsselrolle ein [1, 2, 166, 178, 394, 431] . T-Lymphozyten-Subpopulationen (CD4+, CD8+, γδ-TCR+) sind in der Lage, IL-5 zu sezernieren [121, 264, 274, 331, 333, 453] . Auch die Zellen des Oberflächenepithels können IL-5 synthetisieren [397] . IL-5 führt zu einer Proliferation von Vorläuferzellen der Eosinophilen, aktiviert sie und verlängert ihre Lebenszeit über eine Hemmung der Apoptose [51, 52, 53, 105, 143, 178, 347] . In der Gegenwart von IL-3, GM- oder M-CSF ist die Wirkung auf die Knochenmarksvorläuferzellen verstärkt [432, 486] . Die IL-5-Wirkung auf basophile Granulozyten besteht in einer vermehrten Histaminfreisetzung und Leukotrien C4-Produktion, sowie einer Proliferationssteigerung ihrer Vorläuferzellen [41, 44, 287, 509] . Sowohl humane pulmonale Epithelzelllinien (A549 und 16HBE14o-) als auch primäre bronchiale und nasale Oberflächenepithelzellen exprimieren konstitutionell IL-5-mRNA, wobei diese Expression durch TNF-α und IFN-γ hochreguliert wird [397] . Eine - 41 Immunmarkierung an Bronchialschleimhaut, die von Gesunden bioptisch gewonnen wurde, konnte das IL-5-Protein im Bronchialepithel lokalisieren [397] . Hingegen konnte in Lungenresektaten von asymptomatischen Rauchern, Patienten mit chronischer Bronchitis ohne Atemwegsobstruktion und solchen mit COPD die IL-5-mRNA mittels in situ-Hybridisierung in nur sehr geringem Ausmaß im Oberflächenepithel und eher im Bindegewebe zwischen den peribronchialen Drüsen nachgewiesen werden [513] . Bei den positiven Zellen handelte es sich nicht um + CD8 -T-Lymphozyten. Zwischen den Patientengruppen bestand kein Unterschied hinsichtlich der IL-5-mRNA-Expression, wobei in dieser Studie kein Patient eine Exazerbation hatte [513] . Ob die Transkription des IL-5-Gens NFκB-abhängig ist, ist nicht abschließend geklärt. In stimulierten Mastzellen führte eine IκB-Mutante, welche die Translokation von NFκB in den Zellkern auch unter Stimulation verhindert, nicht zu einer Verringerung der IL-5-mRNA-Expression [297] . Jedoch sind homozygote p50-Knockout-Mäuse auch bei Sensibilisierung und Allergen-Challenge nicht in der Lage, in pulmonalen Zellen das IL-5-Gen zu transkribieren [106, 507] . Ein Inhibitor (SP100030) der Transkriptions-faktoren AP-1 und NFκB, verhindert bei sensibilisierten Ratten die durch Allergenexposition ausgelöste IL-5-mRNA-Expression [207] . Es ist davon auszugehen, dass die IL-5-Gentranskription zumindest partiell von NFκB gesteuert wird, wobei jedoch die genauen Mechanismen noch unklar sind. 2.4.3.5. Einfluss von Viren, insbesondere RSV Die Atemwegshyperreaktivität ist epidemiologisch mit frühkindlichen Virusinfektionen verbunden, wobei insbesondere dem RSV eine besondere Bedeutung zukommt [83, 160, 161, 202, 276, 300, 350, 358, 366, 367, 401, 490]. Viele der bei COPD und Asthma bronchiale nachweisbaren Viren aktivieren NFκB. Die Mechanismen sind hierbei vielfältig. Beteiligt sind Sauerstoffradikale (Adeno-, Influenzaviren), Doppelstrang-RNA-Moleküle (Influenza, RSV), eine Überladung des Endoplasmatischen Retikulums mit Virusproteinen (Adenoviren, Influenza, RSV) und direkte Interaktionen von Virusproteinen mit der NFκB-Kaskade (Influenza, Paramyxo-, Rhinoviren) [42, 43, 65, 66, 76, 115, 134, 135, 136, 154, 177, 199, 213, 248, 253, 307, 308, 328, 356, 359, 438, 439, 442] . - 42 2.4.3.5.1. RSV und NFκB Die Infektion humaner respiratorischer Epithelzellen (Zelllinie A549) mit RSV führt zur Transkription des IL-8-Genes und zur Sekretion des Proteins [65, 154, 307] . Wird die RSV-Replikation durch Ribavirin inhibiert, kommt die IL-8-mRNA- und -Protein-Bildung wieder zum Erliegen [136] . Diese IL-8-Bildung ist jedoch nicht nur von der Replikation abhängig, da eine NFκB-Aktivierung bereits 15 Minuten nach Zugabe auch von inaktiviertem RSV nachweisbar ist [135] . Auch ist sie nicht nur von NFκB abhängig. Andere beteiligte Transkriptionsfaktoren sind das activator protein-1 (AP-1) und nuclear factor of IL-6 (NF-IL-6) [308] . Weitere durch RSV über NFκB induzierbare Cytokine in respiratorischen Epithelzellen sind IL-1α, IL-6 und IL-11, sowie die Chemokine RANTES, MIP-1α, MCP-1 und der Kolonie-stimulierende Faktor GM-CSF [43, 65, 66, 384, 439, 440] . Der genaue Mechanismus der NFκB-Aktivierung durch RSV ist nicht bekannt. Die initiale Aktivierung wird über die Phosphorylierung und Degradierung von IκBα vermittelt [134] . Danach kommt es zu einer über mehrere Stunden anhaltenden (persistierenden) Aktivierung, obwohl der IκBα- und IκBβPool inzwischen wieder normale Level erreicht hat [134] . Bedeutsam ist hierbei, dass neu gebildetes IκBβ in einer hypophosphorylierten Form auftritt. Es wirkt in dieser Form eher als Chaperon, in dem es die Bindung von IκBα an DNA-gebundene NFκB-Komplexe und somit deren Dissoziation sowie die Beendigung der Gentranskription verhindert [42]. Der Einsatz selektiver Enzyminhibitoren legt nahe, das bei dieser persistierenden Aktivierung die Protein-Kinase C (PKC) beteiligt ist [42, 329]. Wie Versuche mit Inhibitoren des 26S-Proteasoms zeigten, ist die Proteolyse von phosphoryliertem IκBα nicht an das 26S-Proteasom gebunden [134, 218] . Welche Protease stattdessen für die Degradierung verantwortlich zeichnet, ist bis dato unbekannt. Weiterhin konnte eine Interaktion des viralen Phosphoproteins (RSV-P) mit der ProteinPhosphatase 2A (PP2A) gezeigt werden, wobei RSV-P selbst nicht dephosphoryliert, die PP2A jedoch inhibiert wird. Dieser Mechanismus dürfte daher zu einer Vermehrung der phosphorylierten Form einiger Proteine führen [42]. Welche Proteine durch diesen Mechanismus beeinflusst werden, ist derzeit Gegenstand weiterer Untersuchungen. - 43 2.4.3.5.2. RSV, RSV-G und IL-5 Eine RSV-Infektion führt zu einem Th2-Typ der Immunantwort mit Sekretion von IL-4, IL-5, IL-6 und IL-13 [156, 171, 300, 441, 463, 467]. In der Maus führt die Immunisierung mit dem RSV-G-Protein und dem Adjuvans QS-21 (G/QS-21) nach Challenge zu einer Immunantwort mit niedrigen Leveln Antigen-abhängiger Killerzell-Aktivität, erhöhten IL-5-Titern und Eosinophilenzahlen in der BAL sowie Milz-Immunocyten, die nach in vitro-Stimulation mit aufgereinigtem kompletten Virus-Antigen IL-5, aber kein IFN-γ, sezernieren [189] . Der gleiche Versuchsansatz führt bei Immunisierung mit dem RSV-F-Protein (F/QS-21) eher zu einer Th1-Immunantwort [189]. Die simultane Immunisierung mit dem F- und dem G-Protein (F+G/QS-21) führte zur Th2-Immunantwort [189] . Das RSV-G-Protein existiert in zwei Formen: Einer membrangebundenen und einer löslichen [382] . Untersuchungen im Maus-Modell mit rekombinanten Vakziniaviren, die das F-Protein und entweder nur die membrangebundene (GM), nur die lösliche (GL), oder beide Formen des RSV-G-Proteins (GM+L) exprimierten, ergaben, dass Mäuse, die mit GL immunisiert wurden, nach RSV-challenge einen schwereren Krankheitsverlauf zeigten als Mäuse, die mit GM oder GM+L immunisiert wurden [232, 233] . Die Gabe von aufgereinigtem G-Protein während der Immunisierung mit GM verschob die Immunantwort nach RSV-Challenge in Richtung einer mehr Th2-geprägten (erhöhte IL-5-Werte in den Lungenüberständen und erhöhte G-Proteinspezifische IgG1-Titer). Eosinophile waren im Infiltrat aller Mäuse vorhanden, jedoch am zahlreichsten in denen, die mit GL-exprimierenden Vakziniaviren immunisiert worden waren [232, 233]. Diese Daten zeigen, dass die Form, in der das G-Protein beim ersten Kontakt des Immunsystems mit dem RS-Virus vorliegt, für die weitere Prägung des Immunsystems entscheidend ist. - 44 3. Material und Methoden 3.1. Primärkultur humaner peribronchialer Drüsenepithelzellen Für die durchgeführten Untersuchungen musste die Primärkultur eine hohe Reinheit besitzen und einen hohen Differenzierungsgrad erreichen. Darüber hinaus war eine Serum-freie Kultur wünschenswert. Um dies zu erreichen, wurden systematisch vergleichende Doppelimmunfluoreszenzmarkierungen an Zellen in verschiedenen Passagen und in unterschiedlichen Stadien der Konfluenz und im Vergleich mit Paraffinschnitten des jeweiligen Herkunftsgewebes durchgeführt, während die Bedingungen der Isolierung und Kultivierung der Zellen kontrolliert verändert wurden. 3.1.1. Die Isolierung Isolierung besteht aus zwei Schritten: Einer mechanischen Disaggregation des Gewebes und einer enzymatischen Vereinzelung der peribronchialen Drüsenepithelzellen. Für die Vereinzelung wurden vergleichende Untersuchungen mit Collagenase Typ I (Sigma, Taufkirchen, Deutschland), Dispase (Boehringer, Mannheim, Deutschland) und Trypsin / EDTA (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) unternommen. Als Ausgangmaterial standen Resektate aus humanen Lungen zur Verfügung, die wegen eines Tumorbefalles entnommen wurden. Aus diesen wurden unter keimarmen Kautelen tumorfern Bronchien herauspräpariert, grob von anhängendem Gewebe und Mucusbestandteilen befreit und über eine halbe Stunde in sterilem PBS mit Antibiotika (Penicillin, Streptamycin, Gentamycin, PromoCell, Heidelberg, Deutschland) gespült. Über Nacht wurden die Bronchuszylinder in Bronchialepithelzellmedium (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) mit Zusatz von Antibiotika im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Am folgenden Morgen wurde der Bronchuszylinder von letzten Resten anhängenden Bindegewebes befreit und entlang der Längsachse in Streifen geschnitten. Von der Mucosaseite her wurden Reste anhaftenden Mucus und das respiratorische Epithel mittels eines Skalpells abgeschabt. Der Erfolg der Ablösung des respiratorischen Epithels wurde durch Fixierung einzelner Streifen nach dem Abschaben und nachfolgendes - 45 Einbetten in Paraffin, Schneiden und Färben mit Hämatoxylin/Eosin, Periodic Acid Schiff’s (PAS) und Elastica-van Giesson überprüft. Nach dem Abschaben wurden die Streifen in Stücke mit 1-2 mm Kantenlänge zerteilt und in sterilfiltrierte Collagenase-Lösung gegeben. Es folgte eine Inkubation über eine Stunde bei 37°C auf einem Schüttler. Hiernach wurde bei 200xg über fünf Minuten zentrifugiert, um verbleibende Gewebskomplexe abzusetzen. Der resultierende Überstand wurde bei 500xg über zehn Minuten zentrifugiert, um die enthaltenen Einzelzellen zu pelletieren. Wurde bei diesem Collagenase-Durchgang keine ausreichende Zellmenge (Größe des Pellets) gewonnen, wurde erneut durch Resuspendierung der abgesetzten Gewebskomplexe in sterilfiltrierter Collagenase-Lösung über 30-60 Minuten bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert. In diesem Fall wurden die beiden erhaltenen Zellpellets gepoolt und in fünf Milliliter Bronchial-epithelzellmedium resuspendiert. 3.1.2. Kultivierung Für die Kultivierung der Primärkultur wurden verschiedene Beschichtungen von Zellkulturschalen (unbeschichtet, Fibronectin, Vitronectin, Collagen Typ I, Collagen Typ IV) ausgetestet. Die Kultivierung erfolgte bei 37°C in einer Atmosphäre mit 5% CO2 und 95% O2. Das verwendete Medium ist ein LHC-9-basiertes, definiertes Serum-freies Medium der Firma PromoCell (Heidelberg, Deutschland) und enthält pro ml Medium 0,4% (v/v) BPE, 0,5ng/ml rekombinanten humanen EGF, 5µg/ml bovines Insulin, 0,5µg/ml Hydrocortison, 0,5µg/ml Epinephrin, 6,7ng/ml T3, 10µg/ml Transferrin und 0,1ng/ml Vitamin A. 3.1.3. Überprüfung von Reinheit und Differenzierung der Zellkultur Zur Überprüfung der Differenzierung der Zellen wurden Doppelfärbungen mit verschiedenen Antikörpern und -seren gegen Zelltypmarker durchgeführt. Die Markierungen wurden vergleichend an Paraffinschnitten des Herkunftsgewebes vorgenommen. - 46 3.2. Experimentelle Infektion mit RSV 3.2.1. RSV-Wildtyp (RSV-Wt) und RSV-Mutante (RSV-Mu) Die verwendeten Virusstämme wurden freundlicherweise von der Abteilung für Virologie der Ruhr-Universität Bochum (Prof. Dr. Werchau) zur Verfügung gestellt. Beim RSV-Wildtyp handelte es sich um den LongStamm (Gruppe A), bei der RSV-Mutante um eine Spontanmutation dieses Stammes, bei der durch eine Hypermutation im RSV-G-Gen die Fähigkeit zur Bildung der löslichen Form des G-Proteins verloren gegangen ist. 3.2.2. Für Inokulation mit RSV die Immunfluoreszenz-Untersuchungen wurden Zellen auf achtkammerige Chamberslides (Nunc, Wiesbaden, Deutschland) ausgesät, für TEM-Untersuchungen erfolgte die Inokulation in Zellkulturschalen. Nach Spülen mit sterilem PBS wurden die Zellen mit RSV-Wt oder RSV-Mu bei einer moi von eins im Brutschrank inkubiert. Uninfizierte Kontrollen wurden mit Virus-freiem Medium der Virusanzucht (Mock) oder dem PromoCell-Medium inkubiert. Nach zwei Stunden wurde das Inokulat abgesaugt und durch frisches Zellkulturmedium ersetzt. Die Infektion wurde zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 4, 8, 12, 16, 24, 32, 36, 44, 48 Stunden p.i.) durch Fixierung gestoppt. 3.2.3. Kontrolle des Infektionserfolges 3.2.3.1. Nachweis der Suszeptibilität Die Suszeptibilität wurde durch den typischen cytopathischen Effekt - die Riesenzellbildung - im Phasenkontrastmikroskop belegt, oder durch die Immunmarkierung der intrazytoplasmatischen Einschlüsse mit monoklonalen Antikörpern gegen das RSV-M2- (11F4) oder -P-Protein (3C4). - 47 3.2.3.2. Nachweis der Permissivität Für die Titrierung von infektiösen RSV-Partikeln im Überstand infizierter Primärkulturen wurden HEp2-Zellen in 96well-Mikrotiterplatten (Nunc, Wiesbaden, Germany) ausgesät, bis zur Konfluenz kultiviert und dann mit den Zellkulturüberständen in einer dekadischen Verdünnungsreihe im Doppelansatz inkubiert. Nach 48 Stunden wurde mit 80% (v/v) Ethanol abs. fixiert und eine konventionelle Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz mit dem Primärantikörper gegen das RSV-P-Protein (3C4) durchgeführt. Jede Titrierung eines Überstandes erfolgte in Doppelbestimmung, das Ergebnis wurde als arithmetisches Mittel der beiden Einzelbestimmungen ausgedrückt. Die letzte Verdünnung, in der noch eine positive Immunreaktion gegen das RSV-P-Protein sichtbar ist, wird als diejenige Verdünnung des Zellkulturüberstandes angenommen, in der noch genau 100 = 1 infektiöses Viruspartikel vorhanden ist. Zählt man nun hoch bis zum unverdünnten Zellkulturüberstand, erhält man durch die Anzahl der dekadischen Verdünnungen den ursprünglichen Virustiter. - 48 3.3. Mikroskopie 3.3.1. Lichtmikroskopie 3.3.1.1. Phasenkontrastmikroskopie Die Phasenkontrastmikroskopischen Betrachtungen der Zellkulturen wurden mit einem inversen Mikroskop Typ IMT-2 der Firma Olympus (Hamburg, Deutschland) durchgeführt. 3.3.1.2. Fluoreszenzmikroskopie 3.3.1.2.1. Fluoreszenzmarkierungen 3.3.1.2.1.1. Allgemeines Zellen wurden auf Chamberslides (Nunc, Wiesbaden, Deutschland) bei vier Grad Celsius über zehn Minuten mit Ethanol/Essigsäure (Fluka, Taufkirchen, Deutschland; EtOH/HAc, 5% v/v Eisessig in Ethanol absolut) oder Formalin (Sigma, Taufkirchen, Deutschland, SF, 3% v/v in PBS, pH 7,4) fixiert, mit sterilem PBS gewaschen und bis zur Markierung mit sterilem PBS feucht gehalten. Gewebestücke wurden mit EtOH/HAc oder SF über Nacht bei vier Grad Celsius fixiert, in der aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert und in Paraffin eingebettet. Schnitte mit einer Dicke von ca. 5µm wurden auf Objektträger (Menzel, Braunschweig, Deutschland) aufgezogen, in der absteigenden Alkoholreihe dehydriert und bis zur Markierung in PBS feucht gehalten. Alle Markierungsschritte erfolgten in einer feuchten Kammer, zwischen den einzelnen Schritten wurde in frischem PBS geschwenkt und dreimal je fünf Minuten in PBS gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurde der Kammeraufsatz der Chamberslides entfernt und die Objektträger mit Kaisers Glyceringelatine (Merck, Darmstadt, Deutschland) oder Vectashield (Linaris, WertheimBettingen, Deutschland) eingedeckt. Bei jeder Markierung wurden folgende Kontrollen mitgeführt: - 49 ¾ Ersatz der Lektine bzw. Primär- und Sekundärantikörper durch PBS zur Überprüfung der Eigenfluoreszenz ¾ Ersatz der Lektine bzw. Primärantikörper durch PBS zur Kontrolle unspezifischer Bindungen der Sekundärantikörper ¾ Ersatz der Primärantikörper durch Normalserum der Spezies aus der die Primärantikörper stammen zum Ausschluss von unspezifischen Bindungen der Primärantikörper. Nur solche Markierungen wurden berücksichtigt, bei denen diese Kontrollen keine unspezifischen Bindungen der Primär- und Sekundärantikörper zeigten. Für die Dokumentation stand ein inverses Mikroskop Typ IX70 (Olympus, Hamburg, Deutschland) mit einer DX30CCD-Kamera der Firma Kappa (Gleichen, Deutschland) zur Verfügung. 3.3.1.2.1.2. DNA- oder Kern-Markierungen Die DNA und damit der Kern einer Zelle kann mit Hilfe fluoreszierender Farbstoffe dargestellt werden. Dies ermöglicht eine bessere Orientierung, insbesondere in Präparaten, die nur eine sehr geringe Hintergrundfluoreszenz aufweisen. DAPI (4’,6-Diamidino-2-phenylindol, Sigma, Taufkirchen, Deutschland) ist ein DNA-Farbstoff mit besonderer Affinität zu A/T-Basenpaaren, der im UV-Bereich angeregt wird und dessen Fluoreszenzemission im Blaubereich liegt. Die Inkubation mit DAPI erfolgte in einer Verdünnung von 0,1µg/ml in PBS im Brutschrank bei 37°C. Entparaffinisierte Schnitte wurden über 30 Minuten, Chamberslides über 15 Minuten inkubiert. PI (Propidiumiodid, Sigma, Taufkirchen, Deutschland) ist ein DNA-/RNA-Farbstoff, der im Orange-/Rotbereich emittiert und im Grünbereich angeregt wird. Die Gebrauchsverdünnung für PI betrug 10µg/ml in PBS. Die Inkubation erfolgte für entparaffinisierte Schnitte über 20 Minuten, für Chamberslides über 10 Minuten. - 50 3.3.1.2.1.3. Markierungen mit fluorochromierten Lektinen Lektine sind Proteine (meist selbst Glycoproteine), die endständige Kohlenhydratreste in Seitenketten von Glycoproteinen, Proteoglycanen und Glycolipiden erkennen. Sie eigenen sich daher hervorragend für die Fluoreszenzmarkierung von glycosylierten Proteinen. Inkubationen mit Lektinen erfolgten bei vier Grad Celsius über Nacht. Tabelle 4 listet die verwendeten Lektine, das entsprechende Fluorochrom, die Gebrauchsverdünnung und die Bezugsquelle auf. 3.3.1.2.1.4. Indirekte Immunfluoreszenzmarkierungen Die Inkubation mit den Primärantikörpern erfolgte über Nacht bei vier Grad Celsius im Kühlschrank. Mit Sekundärantikörpern wurden die Präparate für eine Stunde bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Tabelle 5 listet die verwendeten Primärantikörper und ihre Bezugsquellen auf, Tabelle 6 die Eigenschaften und Bezugsquellen der verwendeten Sekundärantikörper. 3.3.1.2.1.5. Kombinierte Lektin- und indirekte Immunfluoreszenz Da Antikörper nichts anderes als Glycoproteine sind, wurden die Präparate in der kombinierten Lektin- und Immunfluoreszenz immer zunächst mit dem Lektin und anschließend mit den Primärantikörpern inkubiert. Auf diese Weise konnte eine unbeabsichtigte Bindung der Lektine an die bereits an ihr Antigen gebundenen Primärantikörper weitgehend ausgeschlossen werden. Die Inkubation mit den Lektinen erfolgte bei 4°C über Nacht. - 51 - Tab. 4: Verwendete Lektine, Gebrauchskonzentration und Bezugsquelle Bezeichnung Con A-FITC HPA-TRITC WGA-FITC Konzentration 10 µg/ml 20 µg/ml 10 µg/ml Bezugsquelle Sigma, Taufkirchen, Deutschland Sigma, Taufkirchen, Deutschland Sigma, Taufkirchen, Deutschland Tab. 5: Verwendete Primärantikörper (Klon), Gebrauchsverdünnung und Bezugsquellen Bezeichnung Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan Kaninchen-Anti-IκKα Kaninchen-Anti-Laktoferrin Kaninchen-Anti-Lysozym Kaninchen-Anti-NFκB-p50 Kaninchen-Anti-NFκB-p65 Kaninchen-Anti-Secretory Component Maus-Anti-α-Actin (asm-1) Maus-Anti-α-Tubulin (DM 1A) Maus-Anti-Cytokeratin 7 (OV-TL 12/30) Maus-Anti-Cytokeratin Pan (AE1/AE3) Maus-Anti-EGFR (EGFR88) Maus-Anti-EMA (E29) Maus-Anti-ESA (VU-1D9) Verdünnung 1:50 1:100 1:200 1:50 1:200 1:200 1:50 1:50 1:500 1:50 1:50 1:50 1:50 1:50 Bezugsquelle DCS, Hamburg , Deutschland Zytomed, Berlin, Deutschland Sigma, Taufkirchen, Deutschland DCS, Hamburg , Deutschland Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Deutschland Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Deutschland DakoCytomatin, Hamburg, Deutschland Boehringer, Mannheim, Deutschland Sigma, Taufkirchen, Deutschland DCS, Hamburg , Deutschland DCS, Hamburg , Deutschland DCS, Hamburg , Deutschland DCS, Hamburg , Deutschland Sigma, Taufkirchen, Deutschland - 52 - Fortsetzung Tab. 5: Bezeichnung Maus-Anti-pIκBα (B-9) Maus-Anti-RSV-F-Protein (18F12) Maus-Anti-RSV-G-Protein (12E2) Maus-Anti-RSV-M2-Protein (11F4) Maus-Anti-RSV-N-Protein (661) Maus-Anti-RSV-P-Protein (3C4) Maus-Anti-Vimentin (V9) Verdünnung 1:50 1:200 1:200 1:200 1:50 1:200 1:50 Bezugsquelle Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Deutschland Virologie, Prof. Werchau Virologie, Prof. Werchau Virologie, Prof. Werchau Dunn, Asbach, Deutschland Virologie, Prof. Werchau DakoCytomation, Hamburg, Deutschland Tab. 6: Eigenschaften, Gebrauchsverdünnungen und Bezugsquellen der eingesetzten Sekundärantikörper Bezeichnung Ziege-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor-488 Ziege-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor-594 Ziege-Anti-Maus-Alexa Fluor-488 Ziege-Anti-Maus-Alexa Fluor-594 Verdünnung 1:400 1:400 1:400 1:400 Bezugsquelle Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande - 53 3.3.1.2.1.6. Konfokale Laser-Raster-Mikroskopie (CLSM) Die konfokale Laser-Raster-Mikroskopie ist eine neuere Methode, die aufgrund einiger technischer Raffinessen ein erhöhtes Auflösungsvermögen erlaubt. Im Folgenden sollen zum besseren Verständnis einige der Besonderheiten und ihre Bedeutung am Beispiel des Typs des verwendeten CLSM mit TCD-Erweiterung der Firma Leica Microsystems (Bensheim, Deutschland) kurz erläutert werden. Im Falle der CLSM kommt als Lichtquelle ein Laser zum Einsatz (daher Confocal Laser Scanning Microscopy). Laserlicht unterscheidet sich von Licht herkömmlicher Quellen durch definierte, für den jeweiligen Lasertyp charakteristische Wellenlängen (Linienspektrum) und durch seine Kohärenz, d.h. seine parallele Ausrichtung der Lichtstrahlen. Der Einsatz von Laserlicht führt daher zu einer Abnahme von Streulicht und Hintergrundfluoreszenz. Durch die Einführung einer Illuminations-Lochblende in den Strahlengang wird nicht mehr das gesamte Objektfeld belichtet, sondern nur noch eine kleine Scheibe des Objektes (idealisiert spricht man von einer punktförmigen Belichtung des Objektes). Hierdurch wird eine erhebliche Minderung der lateralen Streuung erreicht, da bei einer großflächigen Belichtung des Objektes entsprechend Emissionslicht aus einem belichteten Areal in die benachbarten Areale streuen würde. Dieser technische Kniff bringt daher eine Erhöhung des lateralen Auflösungsvermögen mit sich, erfordert jedoch gleichzeitig, dass das Objekt Punkt für Punkt und Zeile für Zeile für den Bildaufbau abgetastet (gescant, daher Confocal Laser Scanning Microscopy) wird. Eine zweite Lochblende, die Detektions-Lochblende, befindet sich mit der Illuminations-Lochblende im gleichen Fokus. Die beiden Lochblenden sind “konfokal“ (daher Confocal Laser Scanning Microscopy). Durch diese zweite Lochblende wird zum einen gewährleistet, das nur von dem belichteten Punkt ausgehendes Emissionslicht zum Bildaufbau beiträgt, zum anderen wird hierdurch jedoch gleichzeitig Streulicht, das aus Ebenen außerhalb der Focusebene stammt, weitgehend ausgeblendet. Die Detektions-Lochblende ist in ihrem Durchmesser variabel. Durch diese Methode ist somit eine optische Schnittbildung durch das Objekt möglich. Fährt man nun das Objekt entlang der z-Richtung des - 54 Strahlenganges um einen definierten Betrag weiter, so erhält man einen neuen optischen Schnitt durch das identische Präparat. Durch Digitalisierung der Schnittbilder und sequentielle Darstellung erhält man einen Stapel von Einzelbildern (Stack), der ein bestimmtes Volumen des Objektes repräsentiert. Da die Ortskoordinaten jedes Bildpunktes somit bekannt sind, wird eine dreidimensionale Rekonstruktion des Objektes möglich. In Abbildung 4 sind die Strahlengänge in einem CLSM schematisch aufgeführt. Emissionslicht, das nicht aus der Fokusebene kommt (in der Abbildung 4 links und rechts skizziert), kann nicht zum Bildaufbau beitragen, das es nicht durch die Detektions-Lochblende (Pinhole) und damit nicht zum Detektor gelangen kann. Emissionslicht aus der Objektebene, die sich mit der Fokusebene deckt (in der Abbildung 4 in der Mitte dargestellt), fällt durch die Detektions-Lochblende auf den Detektor und trägt daher zum Bildaufbau bei. Abb. 4: Schematische Darstellung des Strahlenganges in einem CLSM. D = Detektor, SF = Sperrfilter, P = Pinhole, ST = Strahlteiler, LQ = Lichtquelle, IL = Illuminations-Lochblende, AF = Anregungsfilter, OL = Objektivlinse, O = Objekt. - 55 3.3.2. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Die Fixierung für die TEM erfolgte in 2% (w/v) Glutaraldehyd (pH 7,4) oder Karnovsky-Pikrinsäure (3% (w/v) Paraformaldehyd + 0,5% (w/v) Glutaraldehyd + 0,2% (v/v) Pikrinsäure, pH 7,4) über Nacht bei vier Grad Celsius im Kühlschrank (alle Chemikalien von Sigma, Taufkirchen, Deutschland). Nach zweimaligen Waschen in Aqua bidest. über je vier Stunden erfolgte eine Nachfixierung in zweiprozentigem phosphatgepuffertem Osmiumtetroxid. Es folgte ein dreimaliges Waschen in Aqua bidest. über je 30 Minuten, gefolgt von einer Vorkontrastierung über 15 Minuten in gesättigtem Uranylacetat. Nach erneutem Waschen in Aqua bidest. wurde in der aufsteigenden Alkoholreihe entwässert und im Propylen-Epon-Gemisch über Nacht im Kühlschrank infiltriert. Am nächsten Morgen wurden die Präparate in Epon 812 ausgegossen und bei 80°C ausgehärtet. Semidünnschnitte (1µm Schnittdicke, angefertigt auf einem Ultracut der Firma Reichert-Jung) wurden mit basischem Fuchsin und Methylenblau gefärbt, um Blöcke adäquater Qualität auszuwählen. Von diesen Blöckchen wurden 0,1-0,2µm dicke Ultradünnschnitte angefertigt, auf 200mesh-Kupfernetzchen aufgezogen und im Leica EM Stain (Bensheim, Deutschland) nachkontrastiert (5 Minuten gesättigtes Uranylacetat, Waschen mit Aqua bidest., 5 Minuten gesättigtes Bleicitrat). 3.4. IL-5-ELISA Die Durchführung des IL-5-ELISA richtete sich nach den Empfehlungen des Herstellers. Zunächst wurden verschiedene Zellkultivierungssysteme für die Verwendung mit dem Human IL-5 BD OptEIA ELISA-Set der Firma BD Biosciences (Heidelberg, Deutschland) ausgetestet. Überstände wurden 0, 4, 24 und 48 Stunden nach der Inokulation entnommen. - 56 4. Ergebnisse 4.1. Qualität der Primärkultur humaner peribronchialer Drüsenepithelzellen 4.1.1. Reinheit hinsichtlich des epithelialen Charakters Bezogen auf Zellmenge und Reinheit bezüglich des epithelialen Charakters war die Collagenase Typ I den anderen beiden Enzymen bei der Disaggregation des Gewebes überlegen (siehe Kapitel 3.1.1.). Die Kultivierung der Primärkulturen erfolgte nach Austestung verschiedener Beschichtungen in Zellkulturschalen der Firma Nunc (Wiesbaden, Deutschland), die eine spezielle Oberflächenbehandlung für Primärkulturen besitzen (siehe Kapitel 3.1.2.). Die Reinheit der Primärkultur hinsichtlich des epithelialen Charakters wurde mittels folgender Doppelimmunfluoreszenzfärbungen überprüft (siehe Kapitel 3.1.3.): ¾ Vimentin / Cytokeratin Pan ¾ Epithelial Specific Antigen (ESA) / Cytokeratin Pan ¾ Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) / Cytokeratin Pan. Hierbei zeigte sich, dass die Primärkultur bei Kultivierung unter den beschriebenen Bedingungen zu mehr als 95% aus epithelialen Zellen (Cytokeratin positiv) besteht (Abbildungen 5, 6). In Abhängigkeit vom Konfluenzgrad und der Passageanzahl zeigten die Zellen eine Vimentinkoexpression: Je niedriger der Konfluenzgrad und je höher die Passageanzahl, umso stärker die Vimentinkoexpression (Abbildung 6). Die Expression des membranständigen Epithelzellmarkers ESA (Epithelial Specific Antigen) war ebenfalls vom Konfluenzgrad und der Passageanzahl abhängig: Die ESA-Expression war umso stärker, je höher der Konfluenzgrad der Zellen war und in der zweiten bis dritten Passage am ausgeprägtesten (Abbildung 5). Die Verhältnisse für EGFR entsprachen jenen für ESA. - 57 - Abb. 5: Qualität der Primärkultur humaner peribronchialer Drüsenepithelzellen - Reinheit hinsichtlich des epithelialen Charakters I. CLSM, Objektivvergr. 50x; Maus-Anti-ESA rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Hoher Konfluenzgrad der Zellen (schmale Interzellularräume) insbesondere in der linken Bildhälfte der Abbildung 5. Alle Zellen zeigen eine Expression von Cytokeratin Pan (grün), die meisten Zellen auch eine membranständige Expression von ESA (rot). - 58 - Abb. 6: Qualität der Primärkultur humaner peribronchialer Drüsenepithelzellen - Reinheit hinsichtlich des epithelialen Charakters II. CLSM, Objektivvergr. 50x; Maus-Anti-Vimentin rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Die Abbildung 6 zeigt einen niedrigen Konfluenzgrad der Primärkultur mit großen Interzellularspalten. Alle Zellen sind positiv für Cytokeratin Pan (grün), zwei Zellen (Abbildung 6, blaue Pfeile) zeigen auch eine Koexpression von Vimentin (rot). Es finden sich keine Cytokeratinnegativen Zellen (Abbildung 6). 4.1.2. Differenzierung der Primärkultur Um die Differenzierung zu überprüfen, wurden die Zellen der Primärkultur mit den Zellen im Gewebsverbund der peribronchialen Drüsen verglichen. - 59 4.1.2.1. Die Transmissionselektronenmikroskopie Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sollte insbesondere Einblicke in die ultrastrukturelle Differenzierung der Zellen in Primärkultur geben. Die Abb. sieben bis elf stellen daher die Zellen aus der Primärkultur jenen aus dem Gewebsverbund der peribronchialen Drüsen vergleichend gegenüber. Abb. 7: Differenzierung der Primärkultur – TEM I. Originalvergr. 12.000x; Ultradünnschnitt peribronchialer Drüsenepithelzellen im Gewebsverbund. Muköse Drüsenepithelzelle aus dem Ursprungsgewebe mit basal liegendem, abgeplattetem Kern (Abbildung 7). Die Vakuolen sind elektronendurchlässig und scheinen miteinander verschmolzen (Abbildung 7). - 60 - Abb. 8: Differenzierung der Primärkultur – TEM II. Originalvergr. 12.000x; Ultradünnschnitt peribronchialer Drüsenepithelzellen im Gewebsverbund. Seröse Epithelzelle mit am basalen Zellpol liegendem, gelapptem Zellkern (Abbildung 8). Eine Zweikernigkeit der Zelle kann nicht ausgeschlossen werden. Das Cytoplasma enthält Vakuolen, die nicht so elektronendurchlässig erscheinen wie in den mukösen Drüsenepithelzellen und elektronendichte Bestandteile enthalten (Abbildung 8). - 61 - Abb. 9: Differenzierung der Primärkultur - TEM III. Originalvergr. 4.400x; Ultradünnschnitt einer nicht infizierten peribronchialen Drüsenepithelzelle aus der Primärkultur. Diese Zelle vom mukösen Typ mit erhaltener Polarität zeigt einen basal liegenden, abgeplatteten Kern und elektronendurchlässige Vakuolen (Abbildung 9). Die basolaterale Zellmembran trägt zahlreiche Mikrovilli. - 62 - Abb. 10: Differenzierung der Primärkultur - TEM IV. Originalvergr. 3.000x; Ultradünnschnitt einer nicht infizierten peribronchialen Drüsenepithelzelle aus der Primärkultur. Intermediäre Zelle mit teilweise erhaltener Polarität (Abbildung 10). Diese Zelle aus der Primärkultur besitzt gleichzeitig elektronendurchlässige (rechts unten) und elektronendichte Vakuolen (links oben), die jedoch in zwei getrennten Feldern liegen. Ein Zellpol trägt Mikrovilli, der Kern liegt mit seiner Längsachse jedoch nicht parallel zu diesem Membranbezirk. - 63 - Abb. 11: Differenzierung der Primärkultur - TEM V. Originalvergr. 4.400x; Ultradünnschnitt einer nicht infizierten peribronchialen Drüsenepithelzelle aus der Primärkultur. Drüsenepithelzelle vom serösen Typ, die einen gelappten oder zwei basal liegende Zellkerne besitzt (Abbildung 11). Der apikale Zellpol zeigt einen ausgeprägten Mikrovillibesatz. Das Cytoplasma weist zahlreiche elektronendichte Vakuolen auf, elektronenlichte Vakuolen finden sich nur ganz vereinzelt. - 64 4.1.2.2. Immunfluoreszenz- und konfokale Laser-Raster-Mikroskopie Um die Differenzierung der Zellen in der Primärkultur zu überprüfen, wurden verschiedene Doppelimmunfluoreszenzfärbungen mit Zelltypspezifischen Markern durchgeführt. Die Markierungen wurden jeweils vergleichend an der Primärkultur und Paraffinschnitten des Herkunftsgewebes vorgenommen und die Ergebnisse gegenübergestellt (Abb. 12-19). Abb. 12: Differenzierung der Primärkultur - CLSM I. Objektivvergr. 50x; Maus-Anti-Vimentin rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Niedriger Konfluenzgrad der Zellen (weite Interzellularräume) in der Primärkultur der Abbildung 12. Einzelne Zellen zeigen eine Koexpression von Vimentin (rot) und Cytokeratin Pan (grün) (Abbildung 12, blaue Pfeile). - 65 - Abb. 13: Differenzierung der Primärkultur - CLSM II. Objektivvergr. 50x; Maus-Anti-Vimentin rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Paraffinschnitt des Herkunftsgewebes: Die Drüsenazini sind deutlich Cytokeratin (grün) positiv (Abbildung 13, blaue Pfeile). Die im Interstitium zwischen den Drüsenazini gelegenen Fibroblasten zeigen eine deutliche Vimentinexpression (rot), aber keine Cytokeratinexpression (Abbildung 13, gelbe Pfeile). Die Myoepithelzellen, welche die Drüsenazini umgeben, zeigen zum Teil eine Coexpression von Cytokeratinen (grün) und Vimentin (rot) und sind daher teils gelblich markiert (linker oberer und unterer Bildrand der Abbildung 13). - 66 - Abb. 14: Differenzierung der Primärkultur - CLSM III. Objektivvergr. 50x; Maus-Anti-ESA rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Primärkultur: Hoher Konfluenzgrad der Zellen (schmale Interzellularräume) insbesondere in der linken Bildhälfte der Abbildung 14. Die Zellen zeigen hier eine starke membranständige Expression (rot) von ESA (Abbildung 14, blaue Pfeile). Niedrigerer Konfluenzgrad mit breiteren Interzellularräumen in der rechten Bildhälfte und am unteren Bildrand der Abbildung 14. Die Zellen zeigen hier keine oder nur eine sehr niedrige Expression (rot) von ESA (Abbildung 14, gelbe Pfeile). Alle Zellen reagieren mit dem Antiserum gegen Cytokeratin Pan (grün). Der filamentäre Charakter der Expression dieses Cytoskelettbestandteils ist gut erkennbar (Abbildung 14). - 67 - Abb. 15: Differenzierung der Primärkultur - CLSM IV. Objektivvergr. 50x; Maus-Anti-ESA rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Der Paraffinschnitt des Herkunftsgewebes lässt einen Drüsenazinus mit deutlicher Expression von ESA (rot) an der Zelloberfläche (Abbildung 15, blaue Pfeile) erkennen. Die mukösen Drüsenepithelzellen scheinen optisch leer (Abbildung 15). Die den Azinus umgebenden Myoepithelzellen zeigen eine starke Reaktion mit dem Antiserum gegen Cytokeratin Pan (Abbildung 15, grün). - 68 - Abb. 16: Differenzierung der Primärkultur - CLSM V. Objektivvergr. 50x; Maus-Anti-α-Actin rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Die Drüsenazini im Paraffinschnitt des Herkunftsgewebes der Abbildung 16 werden korbgeflechtartig von deutlich Actin-positiven Myoepithelzellen umgeben (Abbildung 16, blaue Pfeile). (rot) - 69 - Abb. 17: Differenzierung der Primärkultur - CLSM VI. Objektivvergr. 50x; Maus-Anti-α-Actin rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Diese Primärkultur in Abbildung 17 zeigt Zellen, die auch bei niedrigem Konfluenzgrad deutlich Cytokeratin Pan-positiv sind, jedoch keinerlei Reaktion mit dem monoklonalen Antikörper gegen Actin aufweisen (kein rotes Signal). - 70 - Abb. 18: Differenzierung der Primärkultur - CLSM VII. Objektivvergr. 50x; Maus-Anti-Cytokeratin 7 rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Der Paraffinschnitt des Herkunftsgewebes in Abbildung 18 zeigt Drüsenepithelzellen, die Cytokeratin Pan positiv sind (grün) und Cytokeratin 7 exprimieren (rot). Sie wirken daher gelb-orange gefärbt. Die Drüsenazini werden korbgeflechtartig von deutlich Cytokeratin Pan-positiven Myoepithelzellen umgeben (Abbildung 18, blaue Pfeile), die jedoch kein Cytokeratin 7 exprimieren (kein rotes Signal). - 71 - Abb. 19: Differenzierung der Primärkultur - CLSM VIII. Objektivvergr. 50x; Maus-Anti-Cytokeratin 7 rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Die Zellen der Primärkultur sind auch bei niedrigem Konfluenzgrad deutlich Cytokeratin Pan-positiv und zeigen eine unterschiedlich starke Reaktion mit dem monoklonalen Antikörper gegen Cytokeratin 7 (Abbildung 19). 4.1.2.3. Funktion der Primärkultur Um Aussagen zur Funktion der Primärkultur treffen zu können, wurden vergleichende Lektin- und Immunfluoreszenzmarkierungen durchgeführt. 4.1.2.3.1. Lektinmarkierungen Die peribronchialen Drüsenzellen verfügen über die Fähigkeit Glycoproteine zu synthetisieren. Mit Lektinmarkierungen wurde überprüft, ob diese Funktion in der Primärkultur wiederzufinden ist (Abbildungen 20-23). - 72 - Abb. 20: Funktion der Primärkultur - CLSM I. Objektivvergrößerung 50x; Lektinreaktivität der peribronchialen Drüsen am Beispiel von Con A-FITC. In der linken Bildhälfte der Abbildung 20 ist ein muköses Drüsenendstück zu sehen, das nur schwach mit Con A reagiert. Rechts oben in der Abbildung 20 ist ein seröses Drüsenendstück getroffen, dessen kleine Sekretgranula stark mit Con A reagieren. - 73 - Abb. 21: Funktion der Primärkultur - CLSM II. Originalvergrößerung 50x; Lektinreaktivität der peribronchialen Drüsen am Beispiel von HPA-TRITC. In der Abbildung 21 ist ein muköses Drüsenendstück getroffen, dessen Zellen unterschiedlich stark mit HPA reagieren. Im Lumen sind Sekretfäden zu sehen, die ebenfalls eine Reaktion mit HPA zeigen (Abbildung 21). - 74 - Abb. 22: Funktion der Primärkultur - CLSM III. Objektivvergr. 50x; Lektinreaktivität der Zellen aus der Primärkultur am Beispiel von Con A-FITC. Zelle aus der Primärkultur mit einer deutlichen perinukleären Reaktivität von kleinen Granula mit dem Lektin Con A (Abbildung 22). Auch die perinukleäre Zisterne ist gut zu erkennen. Insgesamt vergleichbares Muster wie seröse Drüsenepithelzellen im Gewebsverband (vgl. rechte Bildhälfte der Abbildung 20, seröses Drüsenendstück). - 75 - Abb. 23: Funktion der Primärkultur - CLSM IV. Objektivvergr. 50x; Lektinreaktivität der Zellen aus der Primärkultur am Beispiel von HPA-TRITC. Das perinukleär gelegene Golgifeld der Zelle aus der Primärkultur reagiert sehr stark mit dem Lektin HPA (Abbildung 23). Vergleichbare Reaktion wie eine muköse Drüsenepithelzelle im Gewebsverband (vgl. Abbildung 21). Die Sekretbestandteile färben sich stark mit dem Lektin HPA (Abbildung 23). Kleine Granula, wie sie für seröse Drüsenepithelzellen typisch sind, finden sich nicht. - 76 4.1.2.3.2. Immunfluoreszenz Laktoferrin, Lysozym und die sekretorische Komponente des IgA sind Faktoren der Infektabwehr, die von den peribronchialen Drüsen synthetisiert werden. Es wurde daher überprüft, ob die Zellen in der Primärkultur eine positive Immunreaktion mit Antikörpern gegen diese Funktionsproteine aufweisen (Abb. 24-27). Abb. 24: Funktion der Primärkultur - CLSM V. Objektivvergrößerung 50x; Paraffinschnitt des Herkunftsgewebes; Kaninchen-Anti-Laktoferrin. Die serösen Drüsenazini in der linken Bildhälfte der Abbildung 24 zeigen eine deutliche Reaktion mit dem Laktoferrin-Antiserum. Die mukösen Azini in der rechten Bildhälfte und am oberen Bildrand der Abbildung 24 zeigen keine Reaktion. - 77 - Abb. 25: Funktion der Primärkultur - CLSM VI. Objektivvergrößerung 50x; Zelle aus der Primärkultur; Kaninchen-Anti-Laktoferrin. Die Zelle aus der Primärkultur zeigt eine perinukleäre positive Reaktion mit dem Laktoferrin-Antiserum und mehrere positiv reagierende größere Vakuolen (Abbildung 25). Am Rand des Cytoplasmas sind Ausschleusungsmechanismen zu beobachten. - 78 - Abb. 26: Funktion der Primärkultur - CLSM VII. Objektivvergr. 50x; Paraffinschnitt des Herkunftsgewebes; Kaninchen-Anti-Lysozym. Die serösen Drüsenepithelzellen in Abbildung 26 zeigen eine positive Reaktion in kleinen cytoplasmatischen Granula. - 79 - Abb. 27: Funktion der Primärkultur - CLSM VIII. Objektivvergr. 50x; Zelle aus der Primärkultur; Kaninchen-Anti-Lysozym. Die Zelle aus der Primärkultur in der Abbildung 27 zeigt eine positive perinukleäre Reaktion mit cytoplasmatischen Granula. dem Lysozym-Antiserum in kleinen - 80 4.2. Infektion mit RSV 4.2.1. Nachweis der Suszeptibilität Der Nachweis der Suszeptibilität kann über den typischen cytopathischen Effekt der Riesenzellbildung erfolgen (Abbildung 28). Sensitiver ist jedoch der immuncytochemische Nachweis mit Antikörpern gegen das M2-, Noder P-Protein, da diese Proteine in infizierten Zellen in Form pathognomonischer intracytoplasmatischer Einschlüsse zu finden sind (Abbildung 29). Abb. 28: Suszeptibilität der Infektion CLSM I. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 48h p.i., Maus-Anti-Cytokeratin Pan grün, Propidiumiodid (Kerne) rot. In der Abbildung 28 ist deutlich ein dreikerniges Syncytium zu erkennen, das aus der Fusion einzelner RSV-infizierter Epithelzellen entstanden ist. - 81 - Abb. 29: Suszeptibilität der Infektion CLSM II. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 48h p.i., Maus-Anti-RSV-P-Protein (3C4). Deutlich sind drei intracytoplasmatische RSV-P-Protein-positive Einschluss-körper (so genannte Virusfabriken) zu erkennen (Abbildung 29, blaue Pfeile). - 82 4.2.2. Nachweis der Permissivität Der Nachweis der Permissivität erfolgte über die Titrierung infektiöser RSV-Partikel aus dem Überstand RSV-infizierter Primärkulturen peribronchialer Drüsenepithelzellen (Abbildung 30). 500.000 450.000 400.000 350.000 300.000 250.000 200.000 150.000 100.000 50.000 0 Uninf. Kontr. RSV-Wt RSV-Mu 36h p.i. 48h p.i. Abb. 30: Permissivität der Infektion. Titrierung infektiöser Partikel aus dem Überstand RSV-infizierter Primärkulturen peribronchialer Drüsenepithelzellen 48h p.i., moi 1. 36 und 48 Stunden nach der Infektion der peribronchialen Drüsenepithelzellen lassen sich im Zellkulturüberstand infektiöse RSV-Partikel nachweisen (Abbildung 30). Im Zellkulturüberstand der uninfizierten Kontrolle waren keine infektiösen RSV-Partikel nachweisbar. Bei gleicher Infektionsdosis führt die Infektion mit der RSV-Mutante zu einem um eine log-Stufe höheren Titer (104 für den RSV-Wt, 105 für die RSV-Mu 36h p.i. und 5x104 für den RSV-Wt, 5x105 für die RSV-Mu 48h p.i.). - 83 4.2.3. Vergleich zwischen dem RSV-Wildtyp und der RSV-Mutante 4.2.3.1. Morphologie der Infektion im Zeitverlauf 4.2.3.1.1. Immunfluoreszenz und konfokale Laser-Raster-Mikroskopie Um Unterschiede zwischen der RSV-Mutante und dem -Wildtyp darzustellen, wurden die jeweiligen Zeitverläufe gegenübergestellt (Abb. 31-62). Abb. 31: Zeitverlauf der Infektion - CLSM I. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 24h p.i. Maus-Anti-RSV-F-Protein (18F12) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Beim RSV-Wildtyp werden die ersten infizierten Zellen durch eine positive Reaktion im perinukleären Bereich erkennbar (Abbildung 31). - 84 - Abb. 32: Zeitverlauf der Infektion - CLSM II. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 24h p.i. Maus-Anti-RSV-F-Protein (18F12) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Bei der RSV-Mutante sind zum gleichen Zeitpunkt bereits mehrere infizierte Zellen zu erkennen (Abbildung 32, vgl. Abbildung 31). Die Reaktion mit dem Anti-RSV-F-Antikörper (18F12) fällt insgesamt deutlich stärker aus, auch finden sich bereits in peripheren Cytoplasmaanteilen deutliche Signale (Abbildung 32, vgl. Abbildung 31). - 85 - Abb. 33: Zeitverlauf der Infektion - CLSM III. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 32h p.i. Maus-Anti-RSV-F-Protein (18F12) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Beim RSV-Wildtyp wird das F-Protein (rot) auf der Membran infizierter peribronchialer Drüsenepithelzellen (grün) sichtbar (Abbildung 33). - 86 - Abb. 34: Zeitverlauf der Infektion - CLSM IV. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 32h p.i. Maus-Anti-RSV-F-Protein (18F12) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Bei der RSV-Mutante findet sich das F-Protein (rot) vereinzelt auf der Membran infizierter Zellen, insbesondere fallen jedoch große, in Kernnähe gelegene Vakuolen auf, die positiv mit dem RSV-F-Antikörper reagieren (Abbildung 34). - 87 - Abb. 35: Zeitverlauf der Infektion - CLSM V. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-F-Protein (18F12) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Beim RSV-Wildtyp finden sich einzelne infizierte Zellen, die das F-Protein meist auf der Zellmembran exprimieren (Abbildung 35). - 88 - Abb. 36: Zeitverlauf der Infektion - CLSM VI. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-F-Protein (18F12) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Bei der RSV-Mutante finden sich insgesamt deutlich mehr infizierte Zellen, bei denen sich das F-Protein jedoch nur selten auf der Zellmembran findet (Abbildung 36, vgl. Abbildung 35). Stattdessen werden die perinukleär gelegenen großen Vakuolen, die mit dem RSV-F-Antikörper reagieren, nun noch deutlicher sichtbar (Abbildung 36). - 89 - Abb. 37: Zeitverlauf der Infektion - CLSM VII. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 12h p.i. Maus-Anti-RSV-G-Protein (12E2) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. - 90 - Abb. 38: Zeitverlauf der Infektion - CLSM VIII. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 12h p. i. Maus-Anti-RSV-G-Protein (12E2) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Sowohl beim RSV-Wildtyp (Abbildung 37) als auch bei der RSV-Mutante (Abbildung 38) findet sich das G-Protein zwölf Stunden p.i. im Bereich der Golgi-Felder. - 91 - Abb. 39: Zeitverlauf der Infektion - CLSM IX. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 24h p. i. Maus-Anti-RSV-G-Protein (12E2) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Beim RSV-Wildtyp weisen einzelne Zellen ein eher schwaches Signal mit dem RSV-G-Antikörper auf (Abbildung 39). Beim RSV-Wildtyp ist die filamentäre Struktur der Cytokeratin-Pan-Markierung noch zu erkennen (Abbildung 39). - 92 - Abb. 40: Zeitverlauf der Infektion - CLSM X. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 24h p. i. Maus-Anti-RSV-G-Protein (12E2) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Bei der RSV-Mutante weist nahezu jede Zelle ein Signal für das G-Protein auf (Abbildung 40). Die Reaktion fällt insgesamt deutlich stärker aus (Abbildung 40, vgl. Abbildung 39). Im Bereich der Interzellularspalten sind bereits die ersten Signale für das RSV-G-Protein zu finden (Abbildung 40). Die filamentäre Struktur der Cytokeratin-Pan-Markierung ist bei den mit der Mutante infizierten Zellen kaum noch zu erkennen (Abbildung 40). - 93 - Abb. 41: Zeitverlauf der Infektion CLSM - XI. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 32h p. i. Maus-Anti-RSV-G-Protein (12E2) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Einzelne RSV-G-Protein-positive Zellen finden sich bei der mit dem RSVWildtyp infizierten Zellkultur (Abbildung 41). Gerade zu erkennen ist die teilweise membranständige Expression in den Zellen am linken Bildrand. - 94 - Abb. 42: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XII. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 32h p. i. Maus-Anti-RSV-G-Protein (12E2) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Bei der mit der Mutante infizierten Zellkultur ist das G-Protein nahezu in jeder Zelle nachweisbar (Abbildung 42). Mit beiden Virusstämmen lässt sich eine Membranexpression des G-Proteins nachweisen, bei der Mutante fällt diese jedoch deutlich stärker aus (vgl. Abbildung 43). - 95 - Abb. 43: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XIII. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 48h p. i. Maus-Anti-RSV-G-Protein (12E2) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. 48 Stunden nach der Infektion findet sich auch beim RSV-Wildtyp eine ausgeprägte Reaktion mit dem RSV-G-Antikörper im Bereich der Zellmembran der infizierten Zellen (Abbildung 43). Die Architektur des Cytoskeletts (Cytokeratin Pan, grün) weist praktisch keinen filamentären Charakter mehr auf. Gut zu erkennen ist hier auch das Budding neu gebildeter RSV-Virionen in der filamentären Form in den Interzellularspalt (linke Bildhälfte der Abbildung 43). - 96 - Abb. 44: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XIV. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 48h p. i. Maus-Anti-RSV-G-Protein (12E2) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Bei der RSV-Mutante findet sich ebenso eine starke Expression des G-Proteins auf der Zellmembran infizierter Zellen (Abbildung 44). - 97 - Abb. 45: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XV. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 24h p. i. Maus-Anti-RSV-M2-Protein (11F4) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. 24 Stunden p.i. sind mit dem Anti-RSV-M2-Antikörper (11F4) die ersten infizierten Zellen durch die pathognomonischen intracytoplasmatischen Einschlüsse erkennbar (Abbildung 45). Beim RSV-Wildtyp finden sich nur einzelne infizierte Zellen (Abbildung 45, vgl. Abbildung 46). - 98 - Abb. 46: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XVI. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 24h p.i. Maus-Anti-RSV-M2-Protein (11F4) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Bei der RSV-Mutante ist 24h p.i. bereits nahezu jede Zelle infiziert (Abbildung 46). Pro Zelle finden sich bei den mit der Mutante infizierten Zellen mehr Einschlüsse (Virusfabriken) als bei den mit dem Wildtyp infizierten Zellen (vgl. Abbildung 45). Bei den mit der Mutante infizierten Zellen (Abbildung 46) sind die Virusfabriken größer (vgl. Abbildung 45). - 99 - Abb. 47: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XVII. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 32h p.i. Maus-Anti-RSV-M2-Protein (11F4) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. 32 Stunden nach der Infektion (Abbildung 47) ähnelt beim Wildtyp das Bild jenem 24 Stunden nach der Infektion (Abbildung 45). - 100 - Abb. 48: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XVIII. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 32h p.i. Maus-Anti-RSV-M2-Protein (11F4) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Die Virusfabriken sind bei den mit der RSV-Mutante infizierten Zellen häufig größer als bei den mit dem RSV-Wildtyp infizierten Zellen (Abbildung 48, vgl. Abbildung 47). - 101 - Abb. 49: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XIX. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-M2-Protein (11F4) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. 48 Stunden nach der Infektion zeigt sich der Unterschied am deutlichsten in der Größe der Virusfabriken (Abbildung 49, vgl. Abbildung 50). - 102 - Abb. 50: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XX. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-M2-Protein (11F4) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Bei der RSV-Mutante erreichen Virusfabriken die drei- bis vierfache Größe (Abbildung 50) verglichen mit jenen beim Wildtyp (vgl. Abbildung 49). - 103 - Abb. 51: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXI. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 24h p.i. Maus-Anti-RSV-N-Protein (661) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. 24 Stunden nach der Infektion sind beim RSV-Wildtyp nur einzelne Signale mit dem Anti-RSV-N-Antikörper (BioDesign) zu finden (Abbildung 51). - 104 - Abb. 52: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXII. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 24h p.i. Maus-Anti-RSV-N-Protein (661) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Interessanterweise findet sich das N-Protein bei mit der RSV-Mutante infizierten peribronchialen Drüsenepithelzellen bereits 24h p.i. auf der Membran einzelner infizierter Zellen (Abbildung 52). - 105 - Abb. 53: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXIII. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 32h p.i. Maus-Anti-RSV-N-Protein (661) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. 32 Stunden nach der Infektion ist bei den mit dem RSV-Wildtyp infizierten Zellen das N-Protein auf der Membran einzelner infizierter Zellen zu finden (Abbildung 53). - 106 - Abb. 54: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXIV. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 32h p.i. Maus-Anti-RSV-N-Protein (661) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Bei den mit der Mutante infizierten Zellen fällt die Reaktion mit dem AntiRSV-N-Antikörper (BioDesign) häufiger positiv aus (Abbildung 54, vgl. Abbildung 53). - 107 - Abb. 55: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXV. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-N-Protein (661) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Beim Wildtyp findet sich 48 Stunden nach der Infektion (Abbildung 55) ein gleichartiges Bild wie nach 32 Stunden (Abbildung 53). - 108 - Abb. 56: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXVI. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-N-Protein (661) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Es sind insgesamt mehr Zellen in der mit der RSV-Mutante inokulierten Primärkultur infiziert (Abbildung 56, vgl. Abbildung 55). Die Expression des N-Proteins auf der Membran infizierter Zellen (Abbildung 56) ist verglichen zum gleichen Zeitpunkt nach der Infektion ähnlich wie bei der mit dem Wildtyp infizierten Primärkultur (vgl. Abbildung 55). - 109 - Abb. 57: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXVII. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 24h p.i. Maus-Anti-RSV-P-Protein (3C4) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. 24 Stunden nach der Inokulation sind beim Wildtyp einige wenige Zellen infiziert (Abbildung 57). - 110 - Abb. 58: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXVIII. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 24h p.i. Maus-Anti-RSV-P-Protein (3C4) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Bei der Mutante (Abbildung 58) sind deutlich mehr Zellen infiziert als beim Wildtyp (vgl. Abbildung 57), wenn man mit dem Anti-RSV-P-Antikörper markierte Primärkulturen 24 Stunden nach der Infektion miteinander vergleicht. - 111 - Abb. 59: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXIX. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 32h p.i. Maus-Anti-RSV-P-Protein (3C4) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Auch 32 Stunden post infectionem finden sich bei der mit dem RSVWildtyp inokulierten Primärkultur noch einige nicht infizierte Zellen (Abbildung 59). - 112 - Abb. 60: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXX. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 32h p.i. Maus-Anti-RSV-P-Protein (3C4) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Die Virusfabriken sind bei den mit der Mutante infizierten Zellen prominenter (vgl. Abbildung 59). 32 Stunden nach der Infektion findet sich fast keine uninfizierte Zelle mehr (Abbildung 60). - 113 - Abb. 61: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXXI. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-P-Protein (3C4) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. 48 Stunden nach der Infektion ist der typische cytopathische Effekt der Riesenzellbildung am ausgeprägtesten (Abbildung 61). - 114 - Abb. 62: Zeitverlauf der Infektion - CLSM XXXII. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-P-Protein (3C4) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Sowohl der Wildtyp (Abbildung 61) als auch die Mutante (Abbildung 62) veranlassen die peribronchialen Drüsenepithelzellen zur Riesenzellbildung. Bei den mit der Mutante infizierten Zellen finden sich deutlich mehr und größere intracytoplasmatische Einschlüsse, die mit dem Antikörper gegen das RSV-P-Protein (3C4) reagieren. Es finden sich Cytoplasmabezirke, in denen das P-Protein akkumuliert (links oben), dies entspricht einem Budding. - 115 4.2.3.1.2. Transmissionselektronenmikroskopie Ultrastrukturelle Unterschiede zwischen mit dem RSV-Wildtyp oder der RSV-Mutante infizierten Zellen der Primärkultur wurden mittels Transmissions-elektronenmikroskopie (TEM) herausgestellt (Abb. 63-86). Abb. 63: Zeitverlauf der Infektion - TEM I. Originalvergrößerung 7.000x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 8h p.i. Bereits acht Stunden nach der Infektion geht die Polarität der Epithelzellen verloren. Über dem Kern finden sich die ursprünglichen Sekretvakuolen, jedoch sind solche Vakuolen auch an anderen Stellen direkt neben dem Zellkern zu finden. Die Vakuolen sind zum Teil mit feinem, elektronendichtem Material angefüllt (Abbildung 63). - 116 - Abb. 64: Zeitverlauf der Infektion - TEM II. Originalvergrößerung 12.000x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 8h p.i. Ausschnittsvergrößerung aus Abbildung 63: Die in den Kontrollen optisch leer wirkenden Vakuolen sind bei den mit dem RSV-Wildtyp infizierten Zellen mit zum Teil kontrastreichem Material ausgefüllt. - 117 - Abb. 65: Zeitverlauf der Infektion - TEM III. Originalvergrößerung 30.000x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 8h p.i. Weitere Ausschnittsvergrößerung aus den Abbildungen 63 und 64: In Kernnähe gelegene Vakuole, deren Inhalt aus kontrastreichem Material von rundlicher bis ovaler Form besteht. - 118 - Abb. 66: Zeitverlauf der Infektion - TEM IV. Originalvergrößerung 50.000x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 8h p.i. Weitere Ausschnittsvergrößerung der Abbildungen 63-66: Die in den Kontrollen optisch leer wirkenden Vakuolen sind bei den mit dem RSVWildtyp infizierten Zellen mit zum Teil kontrastreichem Material ausgefüllt, das Virusvorstufen (Nucleocapsidkomplexen) entspricht. - 119 - Abb. 67: Zeitverlauf der Infektion - TEM V. Originalvergrößerung 7.000x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 24h p.i. Die normale Cytoarchitektur ist weitestgehend verloren gegangen. Die ehemaligen Sekretvakuolen sind an den Rand des Cytoplasmas verdrängt. Im linken, oberen und oberen rechten Bildteil sind solche Vakuolen zu sehen, die ihren kontrastreichen Inhalt nach außen abgeben (Pfeile). Die Zelloberfläche wirkt sehr unruhig, ein Mikrovillibesatz ist nicht zu erkennen. - 120 - Abb. 68: Zeitverlauf der Infektion - TEM VI. Originalvergrößerung 50.000x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 24h p.i. Ausschnittsvergrößerung. Die in den Kontrollen optisch leer wirkenden Vakuolen sind bei den mit dem RSV-Wildtyp infizierten Zellen mit relativ kontrastreichen und monomorphen Komplexen Virusvorstufen (Nucleocapsidkomplexen) entsprechen. ausgefüllt, die - 121 - Abb. 69: Zeitverlauf der Infektion - TEM VII. Originalvergrößerung 3.000x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 44h p.i. Die normale Cytoarchitektur ist weitestgehend verloren gegangen. Die ursprünglichen Sekretvakuolen sind an den Rand des Cytoplasmas verdrängt und enthalten Virusvorstufen (Nucleocapsidkomplexe). Die Zelloberfläche wirkt sehr unruhig, ein regulärer Mikrovillibesatz ist nicht zu erkennen. Im Hintergrund findet sich eine große Menge von Zelltrümmern. - 122 - Abb. 70: Zeitverlauf der Infektion - TEM VIII. Originalvergrößerung 4.400x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 44h p.i. Ausschnittsvergrößerung. Die in den Kontrollen optisch leer wirkenden Vakuolen sind bei den mit dem RSV-Wildtyp infizierten Zellen 44 Stunden nach der Infektion mit Virusbestandteilen gefüllt, selten können innerhalb der Vakuolen und von der Zelloberfläche buddende RSV-Partikel in der filamentären Form gesehen werden (Pfeile). - 123 - Abb. 71: Zeitverlauf der Infektion - TEM IX. Originalvergrößerung 7.000x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 24h p.i. 24 Stunden nach der Infektion mit der RSV-Mutante ist der Mikrovillibesatz fast vollständig verloren gegangen. Die meist perinukleär gelegenen Vakuolen sind deutlich mit kontrastreichem Material ausgefüllt. Am unteren Bildrand ist innerhalb einer solchen Vakuole ein buddendes RSV-Partikel in seiner filamentären Form zu sehen (blauer Pfeil). - 124 - Abb. 72: Zeitverlauf der Infektion - TEM X. Originalvergrößerung 7.000x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 24h p.i. Ausschnittsvergrößerung aus Abbildung 71. Auch bei Infektion mit der RSV-Mutante scheinen die sonst optisch leer erscheinenden Sekretvakuolen mit kontrastreichem Material angefüllt. - 125 - Abb. 73: Zeitverlauf der Infektion - TEM XI. Originalvergrößerung 3.000x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 24h p.i. In anderen Zellen, die mit der RSV-Mutante infiziert wurden, finden sich dagegen neben den für muköse Zellen typischen, optisch leer erscheinenden Vakuolen, große, zum Teil mehrfach gekammerte Vakuolen, die mit elektronendichtem Material gefüllt sind. Am rechten unteren Bildrand ist eine Verschmelzungszone mit einer weiteren infizierten Zelle zu erkennen (Synzytienbildung). - 126 - Abb. 74: Zeitverlauf der Infektion - TEM XII. Originalvergrößerung 7.000x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 24h p.i. Ausschnittsvergrößerung der Abbildung 73. Die großen, zum Teil mehrfach gekammerten Vakuolen zeigen fingerförmige kontrastreiche Ausläufer, die von der Vakuolenmembran in das Innere reichen. Die Ausschnittsvergrößerung zeigt am unteren Bildrand die dichte Aneinanderlagerung der Zellmembranen im Bereich der Verschmelzungszone zum Synzytium. - 127 - Abb. 75: Zeitverlauf der Infektion - TEM XIII. Originalvergrößerung 3.000x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 36h p.i. Auch in den mit der RSV-Mutante infizierten Kulturen finden sich in wenigen Zellen neben den mit kontrastreichem Material angefüllten Vakuolen (lange Pfeile) solche, in denen filamentäre Strukturen zu finden sind (kurze Pfeile). - 128 - Abb. 76: Zeitverlauf der Infektion - TEM XIV. Originalvergrößerung 12.000x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 36h p.i. Ausschnittsvergrößerung: Die innerhalb einer Vakuole gelegenen filamentären Strukturen haben einen Durchmesser von ca. 100nm und eine Länge von mehreren Mikrometern. Teilweise ist ein innerer kontrastreicher Core zu erkennen. Dies entspricht der typischen Morphologie neu gebildeter RSV-Partikel in der Zellkultur. - 129 - Abb. 77: Zeitverlauf der Infektion - TEM XV. Originalvergrößerung 3.000x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 36h p.i. In bis zu 30% der mit der RSV-Mutante infizierten Zellen finden sich sehr große, in Kernnähe gelegene Vakuolen (Pfeile). - 130 - Abb. 78: Zeitverlauf der Infektion - TEM XVI. Originalvergrößerung 7.000x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 36h p.i. Ausschnittsvergrößerung aus Abbildung 77. Die Vakuolen weisen häufig eine Auffaltung ihrer Membran auf und sind mit elektronendichtem, parakristallinem Material gefüllt. - 131 - Abb. 79: Zeitverlauf der Infektion - TEM XVII. Originalvergrößerung 3.000x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 36h p.i. Im Bereich einer Synzytienbildung weist eine der infizierten Zellen drei in Kernnähe gelegene, große Vakuolen auf. Die Vakuolen zeigen eine Auffaltung ihrer Membran und sind mit parakristallinem Material gefüllt. - 132 - Abb. 80: Zeitverlauf der Infektion - TEM XVIII. Originalvergrößerung 7.000x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 36h p.i. Ausschnittsvergrößerung der Abbildung 79: Am linken Bildrand ist die Grenze zwischen den beiden Zellen nicht mehr sicher auszumachen, die Bildung des Synzytiums ist hier weit fortgeschritten. Von den Wänden der drei in Kernnähe gelegenen Vakuolen reichen finger- und knospenförmige Gebilde ins Innere. - 133 - Abb. 81: Zeitverlauf der Infektion - TEM XIX. Originalvergrößerung 4.400x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 36h p.i. Eine geordnete Cytoarchitektur ist bei dieser mit der RSV-Mutante infizierten Zelle nicht mehr zu beobachten. In direkter Nähe zum zweigelappten Kern der Zelle findet sich eine einzelne, sehr große Vakuole, an deren Begrenzung papilläre Auffältelungen nachweisbar sind. - 134 - Abb. 82: Zeitverlauf der Infektion - TEM XX. Originalvergrößerung 12.000x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 36h p.i. Ausschnittsvergrößerung aus Abbildung 81: Die papillären Auffältelungen der Vakuolenmembran zeigen knospenartige Vorsprünge. - 135 - Abb. 83: Zeitverlauf der Infektion - TEM XXI. Originalvergrößerung 50.000x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 36h p.i. Ausschnittsvergrößerung aus den Abbildungen 81-82. Die papillären Formationen, die von der Begrenzung der Vakuole ins Innere ragen, tragen Knospen, die einen Durchmesser von ca. 150nm besitzen. - 136 - Abb. 84: Zeitverlauf der Infektion - TEM XXII. Originalvergrößerung 140.000x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 36h p.i. Ausschnittsvergrößerung aus den Abbildungen 81-83. Nach Form und Größe handelt es sich bei diesen Knospen um buddende RSV-Partikel. In der Detailaufnahme ist bei maximaler Vergrößerung die Hülle aus einer Lipid-Doppelmembran nachweisbar. Die von den viralen Glycoproteinen gebildeten Spikes sind gerade noch als Saum zu erkennen (RSV-Partikel links unten). - 137 - Abb. 85: Zeitverlauf der Infektion - TEM XXIII. Originalvergrößerung 4.400x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 48h p.i. 48 Stunden nach der Infektion mit der RSV-Mutante ist die normale Cytoarchitektur kaum noch zu erkennen. Die große Vakuole in der linken Bildhälfte zeigt von ihrer Oberfläche buddende RSV-Partikel in ihrer filamentären Form (kurze Pfeile), an einer Stelle auch in der rundlichen Form (langer Pfeil) und ist mit einem amorphen kontrastreichen Material angefüllt (mittellange Pfeile). - 138 - Abb. 86: Zeitverlauf der Infektion - TEM XXIV. Originalvergrößerung 4.400x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 48h p.i. Fast vollständig nekrotisches dreikerniges Synzytium mit einer großen zwischen den einzelnen Kernen gelegenen Vakuole. Die Cytoplasmastruktur ist fast vollständig aufgelöst. Außer den Kernen lassen sich keine Organellen mehr erkennen. Der obere Kern zeigt eine Karyolysis als Zeichen der fortgeschrittenen Zellnekrose. Auch die Chromatinstruktur der anderen beiden Kerne ist gelockert und die Kernhülle des unteren Kernes zeigt eine unregelmäßige Oberfläche. - 139 4.2.3.2. Immunfluoreszenz der Vakuolen bei Infektion mit der RSVMutante Die Besonderheit der mit Viruspartikeln gefüllten intrazytoplasmatischen Vakuolen in den mit der RSV-Mutante infizierten peribronchialen Drüsenepithelzellen wurde mittels Immunfluoreszenz weiter untersucht (Abbildungen 87-89). Abb. 87: RSV-Mutante - CLSM I. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-F-Protein (18F12) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün. Die perinukleär gelegenen Vakuolen enthalten das RSV-F-Protein (gelbe Pfeile). Darüber hinaus ist das RSV-F-Protein auf der Membran der infizierten Zellen nachweisbar. - 140 - Abb. 88: RSV-Mutante - Konventionelle Epifluoreszenz I. Objektivvergr. 40x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-G-Protein (12E2) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün, DAPI (Kerne) blau. Auch mit dem Antikörper gegen das RSV-G-Protein lassen sich die großen, perinukleär gelegenen Vakuolen in den mit der RSV-Mutante infizierten peribronchialen Drüsenepithelzellen markieren (gelber Pfeil). - 141 - Abb. 89: RSV-Mutante - Konventionelle Epifluoreszenz II. Objektivvergr. 40x; Primärkultur, RSV-Mu, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-P-Protein (3C4) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün, DAPI (Kerne) blau. Das RSV-P-Protein, als Bestandteil des Nucleoproteinkomplexes, ist ebenfalls in den perinukleären Vakuolen nachweisbar (gelbe Pfeile). - 142 4.2.4. Auswirkungen der RSV-Infektion auf die Funktion der peribronchialen Drüsenepithelzellen in Primärkultur Um Auswirkungen der RSV-Infektion auf die Glycosylierungsfunktion der peribronchialen Drüsenepithelzellen zu untersuchen, wurden Lektin- und Immunfluoreszenz-Markierungen, zum Teil auch in Kombination, durchgeführt. Abb. 90: Auswirkungen der RSV-Infektion auf die Funktion der Primärkultur - CLSM I. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 48h p.i. FITC-gekoppeltes Lektin aus Triticum vulgaris (WGAFITC). Die Zelle zeigt über den zentralen Cytoplasmabereich verteilt kleine, WGApositive Granula. - 143 - Abb. 91: Auswirkungen der RSV-Infektion auf die Funktion der Primärkultur - CLSM II. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-F-Protein (18F12). Gleiche Zelle wie in Abbildung 90. Über das gesamte Cytoplasma verteilt, aber in Kernnähe betont, finden sich kleine Granula, die mit dem Anti-RSVF-Antikörper positiv reagieren. - 144 - Abb. 92: Auswirkungen der RSV-Infektion auf die Funktion der Primärkultur - CLSM III. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-F-Protein (18F12) rot, FITC-gekoppeltes Lektin aus Triticum vulgaris (WGA-FITC) grün. Übereinanderlagerung der beiden Einzelbilder (Abbildungen 90 und 91). An Stellen, an denen sowohl das FITC-gekoppelte Lektin als auch der Primärantikörper gegen das RSV-F-Protein binden, erscheint die Farbe durch die Übereinanderlagerung von grün und rot als gelb bis orange. Die meisten der kleinen im zentralen Cytoplasmaanteil gelegenen Granula reagieren sowohl mit dem Lektin als auch mit dem Anti-RSV-F-Antikörper. Nur in den peripheren Cytoplasmabezirken finden sich noch größere Areale, in denen nur das Lektin gebunden hat (grüne Bezirke, mit blauen Pfeilen markiert). - 145 - Abb. 93: Auswirkungen der RSV-Infektion auf die Funktion der Primärkultur - CLSM IV. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-F-Protein (18F12) In mukös differenzierten Zellen der Primärkultur führt die RSV-Infektion 48 Stunden nach der Infektion zu einer Akkumulation der viralen Glykoproteine (hier F-Protein) in den “Sekretvakuolen“. - 146 Um die Auswirkungen der RSV-Infektion der peribronchialen Drüsenepithelzellen auf die Synthese von Funktionsproteinen zu untersuchen, wurden Immunfluoreszenzmarkierungen mit Antikörpern gegen Laktoferrin, Lysozym und die Sekretorische Komponente durchgeführt. Abb. 94: Auswirkungen der RSV-Infektion auf die Funktion der Primärkultur - CLSM V. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, uninfizierte Kontrolle, 48h post inoculationem. Kaninchen-Anti-Lysozym grün, Propidiumiodid (Kerne) rot. Die nicht infizierten Zellen der Primärkultur bilden deutlich detektierbar Lysozym (insbesondere linker Bildbereich), in Form insbesondere perinukleär konzentrierter, sich aber auch Cytoplasmabezirke erstreckender, kleiner Granula. bis in periphere - 147 - Abb. 95: Auswirkungen der RSV-Infektion auf die Funktion der Primärkultur - CLSM VI. Objektivvergr. 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-P-Protein (3C4) rot, Kaninchen-AntiLysozym grün. Die RSV-infizierten Zellen der Primärkultur, erkennbar an den mit dem Anti-RSV-P-Antikörper rot markierten intracytoplasmatischen Einschlüssen, zeigen nur noch in den peripheren Cytoplasmaanteilen eine Immunreaktion mit dem Antiserum gegen Lysozym (Bildbereich rechts). - 148 4.2.5. RSV und NFκB Ausgehend von der Beobachtung, dass das M2-Protein des RS-Virus 16 bis 24 Stunden nach der Infektion im Kern infizierter Zellen nachweisbar ist und der Tatsache, dass eine RSV-Infektion zu einer persistierenden NFκBAktivierung führt, wurden weitere Immunfluoreszenzuntersuchungen durchgeführt, um eine Beteiligung des M2-Proteins an dieser NFκB-Aktivierung nachzuweisen und zugrunde liegende Mechanismen aufzudecken. Abb. 96: RSV und NFκB - Konventionelle Epifluoreszenz I. Objektivvergr. 40x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 16h p.i. Maus-Anti-RSV-M2-Protein (11F4) rot, Kaninchen-Anti-Cytokeratin Pan grün, DAPI (Kerne) blau. Im Zellkern RSV-infizierter peribronchialer Drüsenepithelzellen ist das M2Protein 16 Stunden nach der Infektion nachweisbar (gelbe Pfeile). - 149 - Abb. 97: RSV und NFκB - CLSM I. Objektivvergr. 50x; Uninfizierte Kontrolle, 48h post inoculationem. Maus-Anti-RSV-M2-Protein (11F4) grün, Kaninchen-Anti-NFκB-p65 rot. Uninfizierte Kontrolle: Ausgereifte Zellen, erkennbar an dem dunkel erscheinenden Hof cytoplasmatische um Reaktion den mit Zellkern, zeigen dem Anti-NFκB vorwiegend eine p65-Antiserum. Umliegende, noch nicht ausgereifte Zellen, zeigen eine leichte NFκBAktivierung, erkennbar an der Akkumulation von p65 im Zellkern. Eine Reaktion mit dem Antikörper gegen das RSV-M2-Protein ist nicht zu erkennen. - 150 - Abb. 98: RSV und NFκB - CLSM II. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-M2-Protein (11F4) grün, Kaninchen-Anti-NFκB-p65 rot. 48 Stunden nach der Infektion mit dem RSV-Wildtyp findet sich eine Riesenzelle (zentral im Bild) mit mehreren intracytoplasmatischen Einschlüssen, die sich mit dem Anti-RSV-M2-Antikörper markieren lassen. Die RSV-infizierten Zellen zeigen eine deutlich NFκB-Aktivierung, erkennbar an der homogenen Akkumulation von p65 im Zellkern. Die intracytoplasmatischen Einschlüsse zeigen keinerlei Reaktion mit dem AntiNFκB p65-Antiserum. - 151 - Abb. 99: RSV und NFκB - CLSM III. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 8h p.i. Maus-Anti-RSV-M2-Protein (11F4) grün, Kaninchen-Anti-NFκB-p50 rot. Acht Stunden nach der Infektion formieren sich die ersten intracytoplasmatischen Einschlüsse. In ihnen zeigt sich eine deutliche Akkumulation der p50-Untereinheit (rot) des NFκB-Komplexes (blauer Pfeil). - 152 - Abb. 100: RSV und NFκB - CLSM IV. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 24h p.i. Maus-Anti-RSV-M2-Protein (11F4) grün, Kaninchen-Anti-NFκB-p50 rot. Vierundzwanzig Stunden nach der Infektion enthalten die mit dem AntiRSV-M2-Antikörper markierten intracytoplasmatischen Einschlüsse (grün) die p50-Untereinheit (rot) des NFκB-Komplexes (blauer Pfeil). Im Kern RSV-infizierter peribronchialer Drüsenepithelzellen zeigt die p50- Untereinheit (rot) des NFκB-Komplexes eine partielle Colokalisierung (gelber Pfeil) mit dem RSV-M2-Protein (grün), erkennbar an den durch die Übereinanderlagerung des M2- und des p50-Signals in gelber Farbe erscheinenden Punkten. - 153 - Abb. 101: RSV und NFκB - CLSM V. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 24h p.i. Maus-Anti-RSV-M2-Protein (11F4) grün, Kaninchen-Anti-NFκB-p50 rot. Die Stellen, an denen sich nur das RSV-M2-Protein befindet, sind durch die grüne Farbe gekennzeichnet. Jene Stellen, an denen sich ausschließlich die p50-Untereinheit des NFκB-Komplexes befindet, sind an der roten Farbe zu erkennen. Die gelbe Farbe bezeichnet jene Stellen, an denen sich sowohl das RSV-M2-Protein als auch die p50-Untereinheit des NFκB-Komplexes nachweisen lässt. Es findet sich folglich eine partielle Colokalisierung des RSV-M2-Proteins und der p50-Untereinheit des NFκB-Komplexes in allen hier getroffenen RSV-infizierten Zellen. Auch im Cytoplasma ist zum Teil eine solche Colokalisierung erkennbar. - 154 - Abb. 102: RSV und NFκB - CLSM VI. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-M2-Protein (11F4) grün, Kaninchen-Anti-IκKα rot. Auf der linken Bildseite ist eine RSV-infizierte Riesenzelle mit einem perinukleär gelegenen intracytoplasmatischem Einschluss (gelber Pfeil) zu sehen. Die äußere Begrenzung des intracytoplasmatischen Einschlusses lässt sich mit dem Anti-RSV-M2-Antikörper grün markieren, der Inhalt dieses Einschlusses lässt sich sowohl mit dem Anti-RSV-M2-Antikörper als auch mit dem Antiserum gegen die IκKα markieren und erscheint daher orange. - 155 - Abb. 103: RSV und NFκB - CLSM VII. Objektivvergr. 50x, Zoom 2x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-RSV-M2-Protein (11F4) grün, Kaninchen-Anti-IκKα rot. Zweifacher Zoom mit Focus auf den Kern einer RSV-infizierten peribronchialen Drüsenepithelzelle und den perinukleär gelegenen intracytoplasmatischen Einschluss (gelber Pfeil). Die Vergrößerung zeigt deutlich die Akkumulation der IκKα innerhalb des intracytoplasmatischen Einschlusses und durch die orange Farbe des Inhaltes die Colokalisierung des RSV-M2-Proteines und der IκKα. - 156 - Abb. 104: RSV und NFκB - CLSM VIII. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, uninfizierte Kontrolle, 48h post inoculationem. Maus-AntipIκBα (B-9) grün, Kaninchen-Anti-IκKα rot. Nicht infizierte peribronchiale Drüsenepithelzellen zeigen achtundvierzig Stunden nach der Inokulation sowohl intracytoplasmatisch als auch intranukleär eine Reaktion mit dem Anti- IκKα-Antiserum (rot). Die phosphorylierte Form des inhibitorischen Proteins IκBα (pIκBα, grün) ist im Kern und zum Teil auch im Cytoplasma nachweisbar. - 157 - Abb. 105: RSV und NFκB - CLSM IX. Objektivvergrößerung 50x; Primärkultur, RSV-Wt, moi 1, 48h p.i. Maus-Anti-pIκBα (B-9) grün, Kaninchen-Anti-IκKα rot. In RSV-infizierten peribronchialen Drüsenepithelzellen, erkennbar an der in den perinukleär gelegenen intracytoplasmatischen Einschlüssen akkumulierten IκKα (rot) findet sich nur noch eine geringe intranukleäre Reaktion mit dem Anti-pIκBα-Antikörper (grün). Eine Interaktion der intracytoplasmatischen Einschlüsse mit der phosphorylierten Form des inhibitorischen Proteins IκBα des NFκB-Komplexes fand sich nicht, jedoch zeigte sich in RSV-infizierten Zellen eine Verarmung an diesem inhibitorischen Protein. - 158 4.2.6. RSV und Interleukin 5 Für die Bestimmung von IL-5 aus dem Überstand ganzer Kulturflaschen war für einen Versuchsansatz mit verschiedenen Viren in unterschiedlichen Infektionsdosen und Zeitverläufen eine zu hohe Anzahl an Kulturen nötig. Die Voraussetzung, dass die Zellen einer Versuchsreihe vom gleichen Patienten stammen müssen, wäre nicht erfüllbar gewesen. Auch war hier das Verhältnis von Zellzahl zu Volumen Kulturüberstand zu ungünstig, die Sensitivität des ELISA reichte nicht aus, um IL-5 in diesen Kulturen zu detektieren. Bei der Anzucht der Zellen in Chamberslides mit acht Wachstumskammern, um ermöglichen, sich, zeigte eine anschließende dass das Immunfluoreszenz Verhältnis von Zellzahl zu zu Kulturüberstand zwar günstiger war, die Sensitivität aber immer noch nicht ausreichte, um IL-5 reproduzierbar zu detektieren. Daraufhin wurden die Zellen in 24 well-Platten kultiviert, um eine konventionelle Immunhistochemie anschließen zu können. Nach der zweiten Passage (vier Schwesterkulturen) wurden die Zellen so auf acht 24 well-Platten ausgesät, dass sich auf jeder Platte in den Reihen 1-4 die entsprechenden Schwesterkulturen befanden. Diese Vorgehensweise war nötig, um während der Passagierungen Zusammensetzung auftretende bzw. Unterschiede Differenzierung der in der Zellen zellulären und deren Auswirkungen auf die IL-5-Expression erkennen zu können. Die Ergebnisse des IL-5-ELISA im Überstand nicht infizierter Kulturen zeigen für einzelne Schwesterkulturen eine deutlich erhöhte, im Zeitverlauf stabile, und daher als konstitutiv anzunehmende IL-5-Expression. Tab. 7: IL-5-Sekretion nicht infizierter Primärkulturen; arithmetrisches Mittel, n=5 IL-5 ELISA [pg/ml] nach 0h nach 4h nach 24h nach 48h 1. Schwesterkultur 0 0 0 0 2. Schwesterkultur 22,349 20,490 23,785 28,745 3. Schwesterkultur 0 0 0 0 - 159 Um Effekte durch Bestandteile des Überstandes jener Kulturen, in denen das Virus angezüchtet wurde, auszuschließen, wurden die Zellen mit Überständen nicht infizierter Kulturen inkubiert (Mock-Kontrolle). Hierbei ergab sich kein Hinweis auf eine Beeinflussung der IL-5-Expression (Tab. 8). Tab. 8: IL-5-Sekretion der Mock-Kontrolle; arithmetrisches Mittel, n=5 IL-5 ELISA [pg/ml] Mock-Kontrolle nach 0h nach 4h 0 0 nach 24h nach 48h 1,025 0 Da eine Induzierbarkeit von Interleukin 5 in Zellen des respiratorischen Epithels durch Adenoviren bekannt ist, wurde die Infektion mit Adenovirus Typ 3 als Positivkontrolle eingesetzt. Eine Adenovirus Typ 3-Infektion führt ebenso wie die Infektion mit der RSV-Mutante bereits nach 4h zu einem messbaren Anstieg der IL-5-Konzentration. Es wurde ein Maximalwert um 15 pg/ml detektiert, gefolgt von einem Abfall auf etwa die Hälfte (Tab. 9). Tab. 9: IL-5-Sekretion der mit dem Adenovirus Typ 3 infizierten Primärkulturen, moi 1; arithmetrisches Mittel, n=5 IL-5 ELISA [pg/ml] AdV-T3 nach 0h nach 4h nach 24h nach 48h 0 5,362 14,949 7,518 Die Infektion mit RSV-Wildtyp führt zu einer deutlichen Erhöhung der IL-5-Expression. Das Maximum zeigte sich nach 48h, wobei der Anstieg vom 24h- zum 48h-Wert nicht mehr sehr ausgeprägt war (Tab. 10). Tab. 10: IL-5-Sekretion von mit dem RSV-Wildtyp Primärkulturen, moi = 1; arithmetrisches Mittel, n=5 IL-5 ELISA [pg/ml] nach 0h nach 4h nach 24h nach 48h RSV-Wt moi = 1 0 0 33,889 37,339 infizierten - 160 Bei der Infektion mit der RSV-Mutante konnten bereits nach 4h deutlich erhöhte IL-5-Werte gemessen werden. Dieser Befund passt zu der allgemein akzeleriert verlaufenden Infektion verglichen mit dem Wildtyp. Der Maximalwert nach 48h liegt in der gleichen Größenordnung wie der bei Infektion mit RSV-Wildtyp um 36 pg/ml (Tab. 11). Tab. 11: IL-5-Sekretion der mit der RSV-Mutante infizierten Primärkulturen, moi = 1; arithmetrisches Mittel, n=5 IL-5 ELISA [pg/ml] nach 0h nach 4h nach 24h nach 48h RSV-Mu moi = 1 0 15,911 5,362 35,612 Abbildung 106 fasst die Ergebnisse graphisch zusammen. 40 35 30 25 0h p.i. 4h p.i. 24h p.i. 48h p.i. 20 15 10 5 0 Mock RSV-Wt RSV-Mu AdV-T3 Abb. 106: Auswirkungen von Infektionen auf die IL-5-Sekretion der peribronchialen Drüsenepithelzellen in Primärkultur. - 161 5. Diskussion 5.1. Reinheit und Differenzierung der Primärkultur Das Isolierungs- und Kultivierungsprotokoll wurde auf der Grundlage der bisher vorhandenen Publikationen zur Primärkultur peribronchialer Drüsenepithelzellen entwickelt (siehe Kapitel 2.3.5.). Der Prozentsatz an epithelialen Zellen (Ck Pan+, Nachweis von typischen Zell-Zell-Kontakten) betrug regelmäßig über 95% (siehe Kapitel 4.1.1., Abbildungen 5 und 6). Weitere Marker für peribronchiale Drüsenepithelzellen, wie Laktoferrin, Lysozym und die Sekretorische Komponente ließen sich ebenfalls mittels Immunfluoreszenz nachweisen (siehe Kapitel 4.1.2.2., Abbildungen 12-19 und Kapitel 4.1.2.3.2., Abbildungen 24-27), was im Einklang mit den einschlägigen Publikationen steht (siehe Kapitel 2.3.). Eine Abgrenzung gegenüber den Myoepithelzellen ist leicht, da die Zellen in Primärkultur keine Reaktion mit Antikörpern gegen α-Actin der glatten Muskulatur zeigten (siehe Kapitel 4.1.2.2., Abbildung 17). Die immuncytochemische Abgrenzung gegen Zellen des Oberflächenepithels ist mit den genannten Markern nicht möglich, da alle diese Moleküle auch von den Zellen des Oberflächenepithels synthetisiert werden können. Jedoch zeigten sich weder in der Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen α-Tubulin als Bestandteil der Mikrotubuli noch ultrastrukturell in der Transmissionselektronenmikroskopie Hinweise auf eine auch nur rudimentäre Zilienbildung. Auch die Lektinmarkierungen zeigten im Falle mukös differenzierter Zellen eindeutige Sekretvakuolen, ohne dass die Zellen die typischen morphologischen Eigenschaften von Becherzellen aufwiesen (siehe Kapitel 4.1.2.3., Abbildungen 20-23). - 162 5.2. Infizierbarkeit mit RSV Die Suszeptibilität der peribronchialen Drüsenepithelzellen für RSV konnte durch den typischen cytopathischen Effekt der Riesenzellbildung (siehe Kapitel 4.2.1., Abbildung 28) und die Markierung der intracytoplasmatischen Einschlüsse mit Antikörpern gegen das RSV-M2-, -N- und -PProtein (siehe Kapitel 4.2.1., Abbildung 29) belegt werden. Die Permissivität der Infektion konnte durch die Titrierung infektiöser RSVPartikel im Kulturüberstand 48 Stunden nach der RSV-Infektion nachgewiesen werden (siehe Kapitel 4.2.2., Abbildung 30). Eine Infektion der peribronchialen Drüsenepithelzellen in vivo ist auf verschiedenen Wegen möglich: ¾ Canaliculär, da das Ausführungsgangsystem und letztlich auch die Drüsenazini mit dem Oberflächenepithel in Verbindung stehen. ¾ Lateral über infiziertes Oberflächenepithel, da eine RSV-infizierte Zelle grundsätzlich die benachbarten Zellen infizieren kann. In vivo wird dieser Mechanismus angezweifelt, da immer nur sehr umschriebene Abschnitte des Oberflächenepithels infiziert sind. ¾ Hämatogen, da bei RSV-infizierten Individuen das RS-Virus in mononukleären Zellen des Blutes nachweisbar ist. ¾ Lymphogen, da die drainierenden Lymphwege des Oberflächenepithels durch das submuköse Bindegewebe ziehen und dabei in Nachbarschaft zu den peribronchialen Drüsen liegen. ¾ Zellulär über die Infiltration der peribronchialen Drüsen durch RSVinfizierte mononukleäre Zellen. - 163 5.3. Auswirkungen der RSV-Infektion auf Struktur und Funktion Das für Epithelzellen typische Cytoskelett besteht aus Cytokeratinen, die zu den Intermediärfilamenten zählen. Dieser Teil des Cytoskeletts verliert im Laufe der Infektion zunehmend seinen filamentären Charakter (siehe Kapitel 4.2.3.1.1., Abbildungen 31-62). Der geregelte Ablauf der Sekretbildung und -reifung ist vollständig aufgehoben. Die Fähigkeit der serös differenzierten peribronchialen Drüsenepithelzellen, Funktionsproteine wie Laktoferrin, Lysozym und Secretory Component zu bilden, geht zunehmend verloren (siehe Kapitel 4.2.4., Abbildungen 94 und 95). Dies hat Bedeutung für die lokale Infektabwehr und erklärt die häufigen bakteriellen Superinfektionen auf dem Boden einer viralen Infektion. In den mukös differenzierten Zellen akkumulieren die Glycoproteine des RS-Virus in den Sekretvakuolen und beanspruchen nahezu die gesamte Glycosylierungsaktivität der Zellen für sich (siehe Kapitel 4.2.4., Abbildungen 90-93). Auf diesem Wege gelangen die viralen Glycoproteine an die Zelloberfläche, wo sie mit den Proteinen des Nucleoproteinkomplexes assemblieren und wo, unter Mitnahme von Membranmaterial der Wirtszelle als Hülle, neue Virionen budden (siehe Kapitel 4.2.3.1.1., Abbildung 62). In seltenen Fällen findet sich bei Infektion mit dem RSV-Wildtyp ein intravakuoläres Budding, wobei die neu gebildeten Virionen die schmale längliche Form besitzen (siehe Kapitel 4.2.3.1.2., Abbildungen 70, 85). Dies ist für Zellkulturen nicht ungewöhnlich und in der Literatur bereits beschrieben (siehe Kapitel 2.1.4.4.). - 164 5.4. RSV-Mutante Der Ablauf der Infektion bei der RSV-Mutante unterscheidet sich in einigen Punkten von dem des RSV-Wildtyps: ¾ Die Infektion verläuft schneller (siehe Kapitel 4.2.3.1.1., Abbildungen 31-62, Kapitel 4.2.3.1.2., Abbildungen 63-86). ¾ Die infizierten Zellen zeigen häufig eine größere Zahl an intracytoplasmatischen Einschlüssen und / oder deren Volumen ist größer (siehe Kapitel 4.2.3.1.1., Abbildungen 31-62). ¾ Entsprechend ist der Effekt auf das Cytoskelett ausgeprägter (siehe Kapitel 4.2.3.1.1., Abbildungen 31-62). ¾ In bis zu 30% der mit der RSV-Mutante infizierten Zellen finden sich große, perinukleär gelegene Vakuolen (siehe Kapitel 4.2.3.1.2., Abbildungen 77-84), die sich mit Antikörpern gegen das F-, G-, M2-, N- und P-Protein markieren lassen (siehe Kapitel 4.2.3.2., Abbildungen 87-89). Diese Vakuolen sind ultrastrukturell durch papilläre Auffaltungen der Vakuolenmembran gekennzeichnet, von denen RS-Virionen in rundlicher Gestalt budden (siehe Kapitel 4.2.3.1.2., Abbildungen 77-84). Der letzte Punkt spricht dafür, dass dem RSV-G-Protein, insbesondere der membrangebundenen Form, nicht nur eine Rolle beim Attachment an die Wirtszelle, sondern auch bei der Morphogenese neu gebildeter Virionen zukommt. Da das Gen für das RSV-G-Protein bei der Mutante nicht seltener transkribiert werden dürfte als beim RSV-Wildtyp, werden die mit der RSVMutante infizierten Zellen mit der membrangebundenen Form des RSV-GProteins quasi überschwemmt. Das G-Protein steht damit früher, nämlich schon innerhalb der perinukleär gelegenen intracytoplasmatischen Einschlüsse, für die Bildung neuer Virionen in ausreichender Menge zur Verfügung. Darüber hinaus reicht die Menge membrangebundenen G-Proteins aus, um eine größere Zahl von infektiösen RSV-Virionen in rundlicher Gestalt zu bilden. Welche Rolle dagegen die lösliche Form des RSV-G-Proteins bei der in vivo-Infektion hat, ist unklar. Eine Möglichkeit wäre z.B. die Neutralisation von Antikörpern gegen RSV. - 165 5.5. RSV und NFκB Dass die Infektion mit dem RS-Virus zu einer persistierenden Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB führt, ist bereits länger bekannt (siehe Kapitel 2.4.3.5.1.). Die Mechanismen, mit denen das RS-Virus diese lange anhaltende Aktivierung erreicht, sind jedoch noch nicht ganz verstanden, auch gibt es bisher keine morphologischen Untersuchungen zu dieser Fragestellung. Bekannt ist, dass die Infektion mit dem RS-Virus in Epithelzellen durch die Proteolyse des inhibitorischen Proteins IκB zu einer Freisetzung des NFκB-Komplexes, seiner Translokation in den Zellkern und damit zur Aktivierung der Transkription der NFκB-abhängigen Gene führt. Weder die erhöhte Transkription des IκBα-Gens noch die Hemmung der Proteasom- und Ubiquitin-abhängigen IκBα-Degradation sind in der Lage, diese NFκB-Aktivierung rückgängig zu machen. Nach der initialen NFκBAktivierung kommt es durch die Phosphorylierung von IκB mit konsekutiver Ubiquitinierung und Proteolyse im 26S-Proteasom zu einer vorübergehenden Verarmung der Zelle an IκB. Diese Verarmung wird durch die von der NFκB-Aktivierung geförderte Neusynthese ausgeglichen und führt auf diesem Wege normalerweise zur Beendigung der NFκBAktivierung im Sinne einer negativen Rückkopplung. Im Falle der “persistierenden“ NFκB-Aktivierung befindet sich das neu synthetisierte inhibitorische Protein IκBβ jedoch in einem hypophosphoryliertem Zustand. In dieser Form wirkt IκBβ gleichsam als Chaperon für den NFκB-Komplex, indem es zwar an diesen bindet, dabei jedoch dessen Kernlokalisierungssignal nicht blockiert und somit die nukleäre Translokation des NFκBKomplexes gestattet. Gleichzeitig kann an diesen Komplex aus NFκB und hypophosphoryliertem IκBβ das neu gebildete IκBα nicht binden, den NFκB-Komplex nicht von seinen Zielsequenzen in der DNA dissoziieren und somit auch die NFκB-Aktivierung nicht beenden. Bei der Bildung der hypophosphorylierten Form des inhibitorischen IκBβ-Proteins sind die Sequestrierung und Deaktivierung der Protein-Phosphatase 2A durch das RSV-P-Protein beteiligt. - 166 Über diese in der Literatur genannten Mechanismen hinaus konnten vier weitere Mechanismen der Interaktion von RSV-Proteinen mit Proteinen des NFκB-Signaltransduktionsweges aufgezeigt werden: ¾ Der Nachweis des RSV-M2-Proteins im Zellkern infizierter Zellen (siehe Kapitel 4.2.5., Abbildung 96) und die partielle Colokalisierung dieses Proteins mit der p50-Untereinheit von NFκB im Zellkern infizierter Zellen (siehe Kapitel 4.2.5., Abbildungen 100, 101). ¾ Die Akkumulation der p50-Untereinheit in den intracytoplasmatischen Einschlüssen RSV-infizierter Zellen (siehe Kapitel 4.2.5., Abb. 100). ¾ Die Sequestrierung Einschlüssen der IκKα RSV-infizierter in den Zellen intracytoplasmatischen (siehe Kapitel 4.2.5., Abbildungen 102 und 103). ¾ Der verminderte Nachweis von phosphoryliertem IκBα in RSVinfizierten Zellen (siehe Kapitel 4.2.5., Abbildung 105). Der erste und zweite Punkt deuten auf eine Funktion des M2-Proteins bei der Aktivierung des NFκB-Komplexes hin. Da hierbei jedoch nur eine partielle Colokalisierung mit p50 nachweisbar ist, in den intracytoplasmatischen Einschlüssen lediglich eine geringe Menge an p50 vorzuliegen scheint, und sowohl im Kern als auch im Cytoplasma RSVinfizierter Zellen stets auch p50 ohne Assoziation mit dem M2-Protein gefunden werden konnte, ist es möglich, dass es sich hierbei nicht um eine direkte Interaktion handelt, sondern lediglich um die Interaktion über eine dritte Partei, die an die p50-Untereinheit gebunden ist. Da eine Colokalisierung mit der p65-Untereinheit nicht gefunden wurde, scheidet diese als dritte Partei aus. In Frage kommen daher die Protein-Phosphatase 2A, die IκKα oder IκBβ, sowie ein bisher nicht identifiziertes Molekül (siehe Kapitel 2.4.3.5.1.). Der genaue Mechanismus und seine Auswirkungen müssen daher Gegenstand weiterer Untersuchungen sein. Die Sequestrierung der IκKα in den intracytoplasmatischen Einschlüssen RSV-infizierter Zellen dürfte zu einer Dissoziation der NFκB-Signaltransduktion von extrazellulären Mediatoren führen, was für das RS-Virus recht sinnvoll erscheint, da auch die Apoptose Virus-infizierter Zellen über einen NFκB-abhängigen Signaltransduktionsweg vermittelt wird. - 167 Der vierte Punkt, der verminderte Nachweis von phosphoryliertem IκBα, ist wahrscheinlich eine direkte Folge der IκKα-Sequestrierung in den intracytoplasmatischen Einschlüssen. Ob darüber hinaus auch insgesamt weniger IκBα in RSV-infizierten peribronchialen Drüsenepithelzellen nachweisbar ist, kann zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht beantwortet werden. Dies ist aber wahrscheinlich, da in der Literatur die Proteasom- und Ubiquitin-unabhängige IκBProteolyse in RSV-infizierten Epithelzellen nachgewiesen ist (siehe Kapitel 2.4.3.5.1.). Auch dieser Mechanismus trägt dann zum einen zu der persistierenden Aktivierung von NFκB und zum anderen zu der Dissoziation der NFκB-Signaltransduktion von extrazellulären Mediatoren bei. 5.6. RSV und IL-5 Dass Zellen des respiratorischen Epithels konstitutiv IL-5 exprimieren können, ist aus der Literatur bereits bekannt (siehe Kapitel 2.4.3.4.). In der vorliegenden Arbeit konnte der Nachweis erbracht werden, dass dies auch auf die Epithelzellen der peribronchialen Drüsen zutrifft (siehe Kapitel 4.2.6., Abbildung 106). Darüber hinaus konnte eine RSV-induzierte IL-5Bildung in einem Teil der Primärkulturen gezeigt werden (siehe Kapitel 4.2.6., Abbildung 106), wobei diese zeitlich mit dem Ablauf der Infektion parallel läuft. Bei Infektion mit der RSV-Mutante steigen die IL-5-Titer entsprechend dem insgesamt schnelleren Infektionsablauf früher an (siehe Kapitel 4.2.6., Abbildung 106). Diese Induzierung der IL-5-Sekretion ist wahrscheinlich indirekt über die NFκB-Aktivierung vermittelt. P50-/-, also homozygote p50-Knock out-Mäuse, sind nicht in der Lage, auf eine Allergensensibilisierung mit einer IL-5-Produktion zu reagieren. Da die Transkription des IL-5-Gens nach bisherigem Wissensstand nicht direkt über NFκB vermittelt wird, wird dieser Effekt wahrscheinlich über einen weiteren Transkriptionsfaktor, GATA-3, vermittelt, dessen eigene Gentranskription wiederum NFκB-abhängig ist. Welche Mechanismen darüber entscheiden, ob die Primärkultur konstitutiv IL-5 exprimiert und / oder auf die RSV-Infektion mit einer erhöhten IL-5-Sekretion reagiert, ist nicht bekannt. Diesem Mechanismus kommt jedoch eine erhebliche pathogenetische Bedeutung in der RSV-vermittelten, Eosinophilen- - 168 getriggerten Atemwegsentzündung und -hyperreaktivitiät zu. Darüber hinaus erklärt dieser Befund die früh einsetzende und lange anhaltende Bronchokonstriktion, da die glatten Muskelzellen der bronchialen Muskulatur über IL-5-Rezeptoren verfügen, welche diese Muskelzellen bei Aktivierung empfindlicher für kontraktionsauslösende Reize machen. 6. Zusammenfassung Es ist gelungen, eine hochreine und differenzierte Primärkultur humaner peribronchialer Drüsenepithelzellen zu etablieren. Die Infizierbarkeit dieser Kulturen mit RSV konnte nachgewiesen werden. Sie führt zu einer erheblichen Störung der Cytoskelettarchitektur dieser Zellen und ihrer Funktion, Glykoproteine sowie Proteine mit antimikrobieller Wirkung zu synthetisieren. Die RSV-Infektion interferiert mit dem geordneten Ablauf der Sekretbildung und -reifung und beeinflusst so die mukoziliäre Clearance weiter negativ. Die Folge kann eine bakterielle Superinfektion der respiratorischen Schleimhaut sein. Es konnte der Nachweis erbracht werden, dass peribronchiale Drüsenepithelzellen in der Lage sind, IL-5 zu synthetisieren, und dass die RSV-Infektion zu einer erhöhten IL-5-Sekretion führt, was eine wesentliche Komponente in der Pathogenese der RSVInfektion, der Atemwegshyperreaktivität und der Atemwegsobstruktion darstellt. Die RSV-Mutante, der die Fähigkeit zur Bildung der löslichen Form des G-Proteins fehlt, ist gekennzeichnet durch einen schnelleren Ablauf der Infektion, wobei auch das Maximum der IL-5-Sekretion entsprechend früher erreicht wird. Der membrangebundenen Form des G-Proteins kommt eine Bedeutung nicht nur im Attachment des RS-Virus an die Zielzelle, sondern auch in der Morphogenese neuer Virionen zu, was durch das exzessive intravakuoläre Budding des RS-Virions in kugeliger Form gezeigt werden konnte. Dies steht auch im Einklang mit den bisherigen Modellen, wonach das RSV-Budding die genaue Umkehr der Penetration darstellt. - 169 Die RSV-Infektion führt neben den schon bekannten Mechanismen der “persistierenden“ NFκB-Aktivierung zu einer Sequestration der IκKα in den intracytoplasmatischen Einschlüssen. Zusätzlich konnte der Nachweis geführt werden, dass das RSV-M2-Protein ab 16 Stunden post infectionem im Kern infizierter Zellen nachweisbar wird und hierbei eine partielle Colokalisierung mit der p50-Untereinheit des NFκB-Komplexes zeigt. Auch in den intracytoplasmatischen Einschlüssen ist eine solche Interaktion nachweisbar. Sie wird wahrscheinlich über ein drittes Molekül vermittelt, das sowohl an die p50-Untereinheit als auch an das RSV-M2-Protein bindet, da die Interaktionen nur partieller Natur sind und eine große Zahl nicht mit dem M2-Protein interagierender p50-Moleküle in Cytoplasma und Zellkern RSV-infizierter Zellen verbleiben. Dieses dritte Molekül könnte mit der Protein-Phosphatase 2A oder der IκKα identisch sein, da Interaktionen von RSV-Proteinen mit ersterer bereits in der Literatur beschrieben sind und mit letzterer in der vorliegenden Arbeit beschrieben wurden. Diese Mechanismen tragen zu der persistierenden NFκB-Aktivierung und der Dissoziation des NFκB-Signaltransduktionsweges von extrazellulären Signalen bei. Insgesamt liefert diese Arbeit einige neue Aspekte im Verständnis der durch eine RSV-Infektion ausgelösten pathogenetischen Mechanismen und trägt somit auch zum Verständnis der Pathogenese der obstruktiven Lungenerkrankungen, die mit einer RSV-Infektion einhergehen können, bei. - 170 7. Literaturverzeichnis Zu jedem Journal-Artikel, der in der MEDLINE gelistet ist, wurde die PMID ans Ende der Quellenangabe gestellt. Der entsprechende Hyperlink führt zum jeweiligen Abstract des zitierten Artikels, sofern ein solches existiert und in der MEDLINE-Datenbank vorhanden ist. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Adamko D., Lacy P., Moqbel R. (2002). Mechanisms of eosinophil recruitment and activation. Curr Allergy Asthma Rep 2 (2), 107-116. PMID: 11892090. Akbari O., Stock P., DeKruyff R. H., Umetsu D. T. (2003). Mucosal tolerance and immunity: regulating the development of allergic disease and asthma. Int Arch Allergy Immunol 130 (2), 108-118. PMID: 12673064. Akerlind B., Norrby E. (1986). Occurrence of respiratory syncytial virus subtypes A and B strains in Sweden. J Med Virol 19 (3), 241-247. PMID: 3525747. Alaoui-El-Azher M., Wu Y., Havet N., Israel A., Lilienbaum A., Touqui L. (2002). Arachidonic acid differentially affects basal and lipopolysaccharide-induced sPLA(2)-IIA expression in alveolar macrophages through NF-kappaB and PPAR-gamma-dependent pathways. Mol Pharmacol 61 (4), 786-794. 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PMID: 12589338. - 206 VIII. Danksagung In erster Linie gilt mein Dank Herrn Prof. Dr. med. Konrad Morgenroth für die Überlassung des Themas und die großzügige finanzielle Unterstützung. Ich danke insbesondere auch den Medizinisch Technischen Assistentinnen Frau Carina Kruip, Frau Nellia Schatz und Frau Anja Koch für ihre Hilfe bei der Durchführung der technischen Arbeiten, sowie allen weiteren Mitarbeitern des Institutes für Pathologie. Herrn Emeritus Prof. Dr. Werchau, sowie Herrn Dr. rer. nat. Thorsten Krusat und Herrn Dipl. Biochemiker Christian Roder danke ich für das zur Verfügung stellen von RSV-Wildtyp, RSV-Mutante und den monoklonalen Antikörpern sowie die Einarbeitung in die virologische Arbeitsmethodik. Mein Dank gilt auch den anderen Doktoranden des Institutes für Pathologie, denen ich die Funktionsweise von Immunfluoreszenz und insbesondere Konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie sowie die Zellkultur näher bringen bzw. sie bei der Durchführung unterstützen durfte, und die mich dadurch immer mit neuen Anregungen und Fragen konfrontierten. - 207 IX. Lebenslauf Persönliche Daten: Name: Olaf Anhenn Geburtsdatum: 29.09.1969 Geburtsort: Wuppertal Familienstand: Ledig Konfession: Evangelisch Schulausbildung: 1976-1980: Gemeinschafts-Grundschule Wetter (Ruhr) 1980-1990: Städtisches Gymnasium Wetter (Ruhr) 1990: Abitur: Durchschnittsnote 1,8 Zivildienst: 1990-1991: Innerbetrieblicher Krankentransportdienst des Allgemeinen Krankenhauses für die Stadt Hagen, Akademisches Lehrkrankenhaus der Ruhr-Universität Bochum Studium der Humanmedizin: 1991-1996: Ruhr-Universität Bochum 1996-1997: Praktisches Jahr im Knappschaftskrankenhaus Bochum-Langendreer, Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum, Innere Medizin: Direktor Prof. Schmiegel, Chirurgie: Direktor Prof. Klempnauer, Neurologie: Direktor Prof. Gehlen 1994: 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung, Note: Gut 1996: 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung, Note: Gut (1,66) 1997: 3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung, Note: Sehr Gut Gesamtnote der Ärztlichen Prüfung: Sehr Gut (1,49) - 208 Ärztliche Tätigkeit: 26.11.1997: Teilapprobation durch die Bezirksregierung Arnsberg 05.01.1998- Arzt im Praktikum in der Abteilung für Pathologie 29.01.1999: der Ruhr-Universität Bochum, Leiter Prof. Morgenroth 01.03.1999- Arzt im Praktikum in der Medizinischen Klinik des 29.02.2000: Allgemeinen Krankenhauses für die Stadt Hagen, Akademisches Lehrkrankenhaus der Ruhr-Universität Bochum, Chefarzt Prof. Scholten 01.07.1998- Wissenschaftlicher Mitarbeiter in der Abteilung 30.04.2003: für Pathologie der Ruhr-Universität Bochum, Leiter Prof. Morgenroth 25.02.2000: Approbation durch die Bezirksregierung Arnsberg 2000-2001: Berufsbegleitende Fortbildung zur Erlangung der Zusatzbezeichnung Medizinische Informatik an der Akademie der Ruhr-Universität Bochum Seit 01.03.2000: Assistenzarzt in der Medizinischen Klinik des Allgemeinen Krankenhauses für die Stadt Hagen, Akademisches Lehrkrankenhaus der Ruhr-Universität Bochum, Chefarzt Prof. Scholten
