PDF, 1 MB - Verlag Dr. Köster

Inhaltsverzeichnis
1.
2.
Einleitung .......................................................................................................................................... 1
1.1
Verkapselung von Säugerzellen .............................................................................................. 1
1.2
Aktuelle Entwicklung des Tissue Engineering ......................................................................... 2
1.3
Zielsetzungen dieser Arbeit ..................................................................................................... 3
Charakterisierung der Polyelektrolytkapseln bezüglich ihrer materialtechnischen Eigenschaften .. 7
2.1
Einleitung ................................................................................................................................. 7
2.1.1
Die Polyelektrolytkapseln .................................................................................................... 7
2.1.2
Die Charakterisierung der Polyelektrolytkapseln ................................................................. 8
2.2
Material und Methoden .......................................................................................................... 10
2.2.1
Herstellung der Polyelektrolytkapseln ............................................................................... 10
2.2.2
Stabilitätsmessungen......................................................................................................... 10
2.2.3
Permeabilitätsmessungen ................................................................................................. 11
2.2.4
Größe und Quellverhalten der Kapseln ............................................................................. 11
2.3
Ergebnisse und Diskussion ................................................................................................... 12
2.3.1
Stabilität der Polyelektrolytkapseln .................................................................................... 12
2.3.2
Permeabilität der Polyelektrolytkapseln............................................................................. 13
2.3.3
Quellverhalten der Polyelektrolytkapseln .......................................................................... 14
2.4
3.
Melanie Werner
Charakterisierung von Polyelektrolytkapseln hinsichtlich materialtechnischer und
zellbiologischer Eigenschaften
und Anwendung dieser für die Analyse der Mikroumgebung verkapselter T-Lymphozyten
2013 / 170 Seiten / 29,80 € / ISBN 978-3-89574-812-7
Verlag Dr. Köster, Berlin / www.verlag-koester.de
Fazit und Ausblick.................................................................................................................. 19
Charakterisierung der Polyelektrolytkapseln hinsichtlich ihrer zellbiologischen Eigenschaften .... 20
3.1
Einleitung ............................................................................................................................... 20
3.1.1
Die Analyse der Zelldichten in den Kapseln ...................................................................... 20
3.1.2
Die Kultivierung verkapselter Jurkat T-Zellen .................................................................... 21
3.1.3
Die vertiefende Analyse verkapselter Zellen ..................................................................... 23
3.2
Material und Methoden .......................................................................................................... 25
3.2.1
Toxitizitätstests .................................................................................................................. 25
3.2.2
Methoden der Zelldichtebestimmung ................................................................................ 25
3.2.3
Kapselherstellung und Kultivierung von Jurkat T-Zellen ................................................... 26
3.2.4
Die Analyse verkapselter Zellen ........................................................................................ 29
3.3
3.3.1
Ergebnisse und Diskussion ................................................................................................... 32
Einfluss des Kapselmaterials auf die Jurkat T-Zellen ........................................................ 32
II
3.3.2
Die Zelldichte- und Viabilitätsbestimmung verkapselter Zellen ......................................... 34
3.3.3
Kultivierung der Jurkat T-Zellen ......................................................................................... 40
3.3.4
Vertiefende Analyse der verkapselten Jurkat T-Zellen...................................................... 48
3.4
4.
Fazit und Ausblick.................................................................................................................. 61
Analyse der Mikroumgebung verkapselter humaner primärer T Lympho-zyten hinsichtlich der
Entwicklung eines artifiziellen Lymphknotens ....................................................................................... 63
4.1 Einleitung ..................................................................................................................................... 63
4.1.1 Aufbau eines Lymphknotens ................................................................................................. 63
4.1.2 Die angeborene und die adaptive Immunantwort ................................................................. 64
4.1.3 Die Aktivierung der T-Lymphozyten ...................................................................................... 66
4.1.4 aktuelle Forschungen an artifiziellen Lymphknoten .............................................................. 67
4.2
Material und Methoden .......................................................................................................... 69
4.2.1
Isolierung von Lymphozyten aus gesunden Spendern ..................................................... 69
4.2.2
Kultivierung der Lymphozyten unverkapselt und verkapselt ............................................. 69
4.2.3
Bestimmung der Zelldichte und Viabilität unverkapselt und verkapselt ............................ 69
4.2.4
Analyse der Oberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie ......................................... 70
4.2.5
Bestimmung der Konzentrationen der Zytokine IL-2, IFN-γ und IL-4 mittels ELISA ......... 70
4.3
Ergebnisse und Diskussion ............................................................................................... 72
4.3.1
Kinetik der PHA-Aktivierung und Ermittlung des optimalen Verkapselungszeitpunktes ... 72
4.3.2
Einfluss des Kapselmaterials und des Verkapselungsprozesses auf T-Lymphozyten ..... 80
4.3.3
Wachstum verkapselter humaner primären T-Lymphozyten ............................................ 84
4.3.4
Verkapselung von Aktivierungssubstanzen zusammen mit T-Lymphozyten .................... 89
4.3.5
Proliferation humaner primärer T-Lymphozyten in Alginatkapseln ................................... 99
4.3.6
Aktivierung isolierter CD3 Zellen .................................................................................... 103
4.4
Fazit und Ausblick ............................................................................................................ 106
+
5.
Gesamtfazit und Ausblick ............................................................................................................. 109
6.
Anhang .............................................................................................................................................. I
Anhang I - Etablierungen ...................................................................................................................... I
1.
Etablierung der Oberflächenmarkeranalyse verkapselter Zellen ............................................. I
2.
Etablierung der Zellzyklusanalyse verkapselter Zellen .......................................................... IV
3.
Genauigkeit der ELISA in Anwesenheit des Kapselmaterials ................................................. V
4.
Optimierung der Stimulierung ............................................................................................... VIII
III
Anhang II - Diagramme .....................................................................................................................XIV
Anhang III - verwendete Materialien ..................................................................................................XX
Abbildungsverzeichnis................................................................................................................. XXV
Tabellenverzeichnis ................................................................................................................... XXXII
Literaturverzeichnis .................................................................................................................. XXXIV
IV
Zusammenfassung
Um eine Proliferation humaner primärer T-Lymphozyten in Polyelektrolytkapseln zu erreichen, wurden
diese hinsichtlich ihrer materialtechnischen und zellbiologischen Eigenschaften untersucht.
Die hier vorliegenden Polyelektrolytkapseln, bestehend aus Natriumcellulosesulphat, zeigen eine hohe
Stabilität und Elastizität, d.h. sie sind deformierbar und platzen erst unter der Einwirkung hoher Kräfte
von 3 N. Die Membran weist einen geringen molecular weight cut off von unter 10 kDa auf. Sogar bei
einem Ausdehnen der Kapseln bleiben die Stabilität und die Elastizität erhalten.
Unter
Kultivierungsbedingungen wurde im Gegensatz zu Alginat-PLL Kapseln kein Anschwellen der
Polyelektrolytkapseln beobachtet.
Das verwendete Kapselmaterial Natriumcellulosesulphat zeigt keine Toxizität und keine Aktivierung
von Jurkat T-Zellen. Dadurch ergibt sich eine hohe Biokompatibilität. Nach außen hin weisen die
Polyelektrolytkapseln ebenfalls keine Toxizität oder Aktivierung nicht verkapselter Zellen auf. Es
konnten Methoden etabliert werden, die eine exakte Ermittlung der Lebendzelldichte in den Kapseln
ermöglichen. Durch den schonenden Aufschluss mittels Cellulase können die Zellen lebend aus den
Kapseln freigesetzt und so verschiedenen Analysemethoden wie der Durchflusszytometrie zugeführt
werden. Zusätzlich kann der Überstand aus den Kapseln selbst mittels ELISA auf Wachstumsfaktoren
und andere Proteine hin untersucht werden. Die Kultivierung verkapselter Jurkat T-Zellen ergeben
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sowohl im Spinner als auch in der T-Flasche Lebendzelldichten bis zu 130x10 Zellen/mlKapsel.
6
6
Gleichzeitig werden unverkapselt Zelldichten von 13x10 Zellen/ml im Spinner und 5x10 Zellen/ml in
der T-Flasche erreicht. Wird ein für die Kultivierung verkapselter Zellen konzipiertes und optimiertes
6
System, der Wirbelschichtreaktor, verwendet, können Lebendzelldichten bis zu 180x10 Zellen/mlKapsel
erreicht werden. Dabei ergibt sich bei gleicher spezifischer Wachstumsrate eine verlängerte
exponentielle Wachstumsphase. Gleichzeitig bestätigen die Zellzyklusanalysen einen höheren Anteil
an Zellen in der S-Phase und in der G2/M-Phase gegenüber der verkapselten Kultivierung im Spinner
und
gegenüber
den
unverkapselten
Kultivierungen.
Die
verbesserte
Sauerstoff-
und
Nährstoffversorgungversorgung bis an die Kapseln heran ist hier Grundlage für die höheren erreichten
Zelldichten. Die dichte Packung der Zellen weist darauf hin, dass bei der Erreichung von knapp
8
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1,8x10 Zellen/mlKapsel Gewebezelldichte erreicht ist. In der Literatur wird ab 1x10 Zellen/ml von
gewebeähnlichen Zelldichten gesprochen (Seewöster et al., 1997). Die Verwendung des
Standardmaterials Alginat beschichtet mit PLL ergibt bei der Kultivierung im Spinner vergleichbar hohe
6
Zelldichten von 130x10 Zellen/mlKapsel.
Als Vorbereitung auf die Verkapselung humaner primärer T-Lymphozyten erfolgte die Analyse der
Kinetik der Aktivierung mit dem Mitogen PHA hinsichtlich der pro Zellen sekretierten Menge Zytokin,
sowie des Aktivierungsmarkers CD25. Damit konnte ein Protokoll zur Verkapselung humaner primärer
T-Lymphozyten etabliert werden. Ziel hierbei war es einen Zeitpunkt der Verkapselung zu wählen, an
dem die Zellen maximal aktiviert sind und gleichzeitig Zytokine sekretieren, die die Mikroumgebung in
den Kapseln konditionieren können. Ein Einfluss des Beschichtens mit autologem Serum und der
Trennung von der adhärenten Zellfraktion im Zuge des Verkapselungsprozesses auf das Wachstum,
die Entwicklung der Subpopulationen und der Menge sekretierter Zytokine wurde nicht gefunden. Es
konnte gezeigt werden, dass verkapselte T-Lymphozyten eine nahezu gleiche Teilungsanzahl
V
aufweisen, wie jeweils die unverkapselte Kontrolle des gleichen Spenders. Dabei können in den
Kapseln höhere Zelldichten erreicht werden, wenn mit einer höheren Startzelldichte inokuliert wird.
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Eine maximale Lebendzelldichte von 5x10 Zellen/ml konnte in der Kulturschale festgestellt werden.
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Im Mittel teilen sich die Zellen dreimal, so dass bei Startzelldichten um 2,5x10 Zellen/mlKapsel 20x10
Zellen/mlKapsel erreicht werden können. Die unverkapselten Parallelkultivierungen weisen bei einer
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Startzelldichte von 0,5x10 Zellen/ml eine maximale Lebendzelldichten in der T-Flasche von 4x10
Zellen/ml auf. Die höchste im Rahmen dieser Arbeit detektierte Lebendzelldichte wurde durch T6
Lymphozyten eines Spenders erhalten, die sich viermal teilten. Dadurch wurden unverkapselt 8x10
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Zellen/ml und verkapselt 40x10 Zellen/mlKapsel erreicht. Das Verkapseln unter Zugabe von 11 ng/ml
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IL-2 zeigte bei dem gleichen Spender maximale Lebendzelldichten von 70x10 Zellen/mlKapsel. Die
Entwicklung der Subpopulationen verläuft parallel zu der unverkapselt kultivierten Fraktion. Dies
bedeutet, dass keine Beeinflussung durch das Kapselmaterials vorliegt oder die dichte Packung der
Zellen diese Entwicklung stört. Analysen der von den Zellen sekretierten Zytokine IL-2 und IFN-γ
ergaben eine Anreicherung in den Kapseln. Das Kapselmaterial ist demnach für die Proliferation
humaner primärer T-Lymphozyten geeignet, wobei das Kapselmaterial gegenüber den Zellen inert ist.
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