Abstract - ETH E

Diss. ETH Nr. 14315
pCytTS - A NOVEL TEMPERATURE-REGULATED REPLICONBASED DNA EXPRESSION SYSTEM
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH
for the degree of
Doctor ofNatural Seiences
Presented by
MARCO BOORSMA
Drs. Molecular Biology, University of Groningen (NL)
Born November 9, 1974
in Lllst, The Netherlands
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Ari Helenius
Dr. Martin F. Bachmann
Dr. Martin Fussenegger
Zurich, 2001
CHAPTER I
Summary
With the rapid discovery of new potential drugs and drug-targets, many proteins need to
be routinely produced in large quantities. A considerable part of these proteins has
detrimental effects on host cell metabolism leading to poor cell growth and low
production levels. By using inducible expression systems, a large biomass can be
produced under non-permissive conditions resulting in high levels of recombinant
protein upon induction.
To be of broad benefit an inducible system should be specifically induced by the
exogenous inducer, should be independent of endogenous cellular factors, and should
leave unrelated cellular pathways unaffected. Furthermore, induction should be
reversible and precise; the inducer should rapidly penetrate to the site of interest and be
easily removed after induction.
Alphaviruses are positive-stranded cytopathic RNA viruses with a small genome that
is amplified in the cytoplasm by the alphaviral RNA-dependent RNA replicase. The high
levels of alphaviral RNA and envelope proteins produced in infected cells suggested
their use for powerful transient expression vectors. Several alphavirus-based expression
technologies have been developed in which the genes encoding the envelope proteins
were replaced by the gene ofinterest. To facilitate the study and handling ofthese RNAbased vectors, layered cDNA-based vectors were developed that contain the alphavirus
sequences under control of a strong RNA polymerase 11 promotor. Upon DNA
transfection of a host cell, RNA encoding the viral replicon is transcribed and
transported to the cytoplasm where it replicates as during viral infection.
By introduction of two mutations in the viral replicase, we constructed a temperatureinducible alphavirus replicon-based DNA expression system, designated pCytTS. The
first mutation retained the replicase noncytopathic; the second mutation rendered the
replicase temperature-sensitive, resulting in a temperature-regulated expression system.
The system is characterised by undetectable basal level expression at 37°C and a linear
increase in expression by lowering the temperature. Maximal protein production was at
29°C. Several proteins, including toxic proteins have been produced in different cell
lines and in different reactor formats, including spinner flasks and hollow fiber reactors.
The pCytTS system produced high quality proteins as determined by different functional
assays.
The study of the processes leading to inducible expression revealed an important role
for RNA transcription and nuclear export. Increasing these processes resulted in
increased cytoplasmic RNA levels and over 80-fold increased protein production without
influencing basal level expression. Furthermore, uncoupling of transcription and RNA
transport in the non-induced state from the cytoplasmic replication events in the induced
state facilitated the study and optimisation of the expression system. A mathematical
model of the RNA production in inducible expression systems was designed and tested
Chapter 1
using real-time PCR. The model predicted a strong effect of RNA degradation on
pCytTS-mediated expression.
The presented study resulted in the development of an inducible expression system
that combined the high expression levels of alphavirus-based vectors with the simple
mode of induction by temperature shift and that meets all criteria for the production of
difficult-to-produce proteins.
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CHAPTER2
Zusammenfassung
Mit der raschen Entdeckung potentieller neuer Drogen und Drogen-Targets, müssen
viele Proteine in großen Quantitäten routinemäßig produziert werden. Ein beträchtliches
Teil dieser Proteine hat Schädliche Effekte auf dem Stoffwechsel des Gastgeberzelles,
der zu schlechten Zellenwachstum und niedrige Produktions-levels. Indem man
induzierbare expressionssysteme benutzt, kann eine große Biomasse unter nicht
freizügigen Bedingungen produziert werden und hohe Stufen des recombinanten
Proteins erhalten werden.
Um von breiten Nutzen zu sein, sollte ein inducierbares System ausdrücklich von der
exogene Inducer aktiviert werden, sollten von endogene zellulare Faktoren unabhängig
sein und sollten nicht zusammenhängende zelluläre Pathways unberührt lassen.
Weiterhin sollte die Induktion reversibel sein und leicht zu entfernen sein nach der
Induktion.
Alphaviren sind positiv gestrandete cytophatische Viren mit einer kleinen Genome,
die im Zytoplasma von der Alphavirus RNA abhängigen RNA replicase amplifiziert
wird. Die hohe Konzentrationen von Alphavirus RNA und in infizierten Zellen
hergestellten enevlope proteinen vorschlugen ihren gebrauch für leistungsfähige
auf
Alphavirus
basierte
transiente
Expressionsvektoren.
Mehrere
Expressionstechnologien sind entwickelt worden in welcher die Gene, die für die
Envelope Gene kodieren, ausetauscht sind für das Gen von Interesse. Um die Studie und
die Bearbeitung dieser RNA basierten Vektoren zu erleichtern, wurden "layered" cDNA
basierte Vektoren entwickelt die Alphavirus sequenzen enthielten unter kontrolle einer
starke RNA Polymerase 11 Promotor. Auf DNS transfecktion einer Gastgeberzelle wird
RNA transcribiert das für das virus Replicon kodiert und transportiert zum Zytoplasma
wo es repliziert wird wie es passiert bei einer Virus Infektion.
Durch einbauung von zwei zwei Mutationen in der Virus-replicase bauten wir ein
Temperatur induzierbares Alphavirus replicon ein basiert auf einen DNS
Expressionssystem. Es wurde pCytTS genannt. Die erste Mutation bewahrte die
Replicase
Noncythpatisch;
die zweite
Mutation
machte die replicase
temperaturempfindlich, was in ein enzymatisch regulierbares Expressionssystem
resultierte.
Das system ist Charakterisiert durch eine undetektierbare basale expression bei 37°C
und eine lineare zunahme der Expression, indem man die Temperatur senkt. Maximale
Proteinproduktion trat auf bei 29°C. Mehrere Proteine einschließlich giftigen Eiweißen
sind in verschiedene Zelllinien und in verschiedene Reaktor aufbauten, einschließlich
Spinner Flasks und hohle Faserreaktoren hergestellt worden. Das pCytTS System stellte
eine hohe Qualität von eiweißen her, wie durch verschiedene Funktionelle Prüfungen
bestätigt wurde.
Chapter2
Die Studie über die zu induzierbare Expression führende Prozesse zeigte eine
wichtige Rolle für RNA Transkription und Kemexport. Durch die Optimierung der
Prozesse, die zu durch Induktion erhältlichen Expression führen, konnten die
Expressions-Levels 80-fach erhöht werden ohne die basale Expression zu beeinflüssen.
Ausserdem erleichterte das Lösen der Kopplung zwischen Transkription und RNA
Ttransport in der nicht-Induzierte Zustand von den Cytoplasmatische Replizierungs
"events" im Induzierten Zustand die Studie und die Optimierung des
Expressionssystems.
Ein
mathematisches
Modell
der
RNA-Produktion
in
induzierbare
Expressionssysteme wurde entworfen und getestet durch Real-Time PCR. Das Modell
sagte eine starke Einfluß von RNA Degradierung auf die pCytTS Expression vorher und
unterstützte experimentelle Daten die die Wichtigkeit zeigten von erhöhte RNA
Konzentration in der nicht-Induzierte Zustand von "High-level" Expression.
Die geführte Studie führte zur Entwicklung eines induzierbares Exressionssystems,
das die hohe Expressionslevels von Alphavirus stammende Vektoren mit dem einfachen
Modus der Induktion durch eine Temperatursprung kombinierte und dazu alle Kriterien
für die Produktion von schwer-zu-produzierende Proteine Entspricht.
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