Tierärztliche Hochschule Hannover

Tierärztliche Hochschule Hannover
Etablierung einer primären bovinen
Hepatozytenzellkultur als Modell zur Untersuchung
der Expression des Wachstumshormonrezeptors
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Sonja Ehrhardt
Hildesheim
Hannover 2017
Wissenschaftliche Betreuung:
Frau JProf. Dr. Marion Schmicke
Tierärztliche Hochschule Hannover,
Klinik für Rinder, Endokrinologie
1. Gutachterin:
Frau JProf. Dr. Marion Schmicke
2. Gutachterin:
Frau Prof. Dr. Maren von Köckritz-Blickwede
Tag der mündlichen Prüfung:
18.05.2017
Meinen Eltern
und meinen Kindern David und Lucas
Auszüge aus der vorliegenden Arbeit wurden bereits unter folgendem Titel der
Öffentlichkeit vorgestellt:

„Growth hormone receptor (GHR) and Insulin-like Growth Factor I (IGF-I)
expression in bovine primary hepatocytes: potential model for endocrine
studies?”
Ehrhardt,
Wilkening,
Jordan,
Baumgarten,
Hettel,
Müller,
Hoedemaker, Piechotta (8th International Congress on Farm Animal
Endocrinology, August 27-29, 2015 in Billund, Dänemark)

“Growth hormone receptor (GHR) and Insulin like Growth Factor I (IGF-I)
expression in primary hepatocytes obtained either from rats and from abattoir
derived bovine liver” Ehrhardt, Wilkening, Stoeber, Hengstler, Schmicke
(Tagung
der
DVG-Fachgruppe
“Physiologie
und
Biochemie”,
30.03.-
01.04.2016 in Berlin)

“Isolation and Cultivation of adult primary bovine Hepatocytes from abattoir
derived liver” Ehrhardt S.; Schmicke M. EXCLI Journal 2016; 15:858-866
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ................................................................................................................ 1
2
Literatur ................................................................................................................... 3
2.1
2.1.1
Aufbau und Funktion der Leber ................................................................. 3
2.1.2
Aufbau und Funktion der Hepatozyten ...................................................... 5
2.2
Isolierung von Hepatozyten .............................................................................. 7
2.2.1
Geschichtliche Entwicklung ....................................................................... 7
2.2.2
Techniken der Isolierung von primären Hepatozyten ............................... 9
2.3
Kultivierung von Hepatozyten ......................................................................... 15
2.3.1
Einsatz von Hepatozytenkulturen und Kulturbedingungen ..................... 15
2.3.2
Apoptosemechanismen der primären Hepatozyten ................................ 18
2.3.3
Studien an primären bovinen Hepatozyten ............................................. 22
2.4
3
Leber und Leberzellen ...................................................................................... 3
Wachstumshormonrezeptor und Insulin-like Growth Faktor ......................... 25
2.4.1
Struktur und Funktion des Wachstumshormonrezeptors........................ 25
2.4.2
Insulin-like Growth Faktor I ...................................................................... 26
2.4.3
Besonderheiten bei der peripartalen Milchkuh ........................................ 28
2.4.4
In vitro Studien an Hepatozyten zum GHR und IGF-I ............................. 29
Material und Methoden........................................................................................ 30
3.1
Vorversuch primäre Rattenhepatozyten ......................................................... 30
3.1.1
Isolation der primären Rattenhepatozyten .............................................. 30
3.1.2
Kultivierung der Rattenhepatozyten ........................................................ 34
3.2 Etablierung der Isolation und Kultivierung von primären bovinen Hepatozyten
aus Schlachthofmaterial ............................................................................................ 38
3.2.1
Vorversuch mit einem humanen Isolationsprotokoll ............................... 38
3.2.2
Etablierung der Isolation von primären bovinen Hepatozyten ................ 39
3.2.3
Etablierung der Kultivierung primärer boviner Hepatozyten ................... 49
3.3
PCR Analysen der Gewebe- und Zellproben (Ratten, Rind) ......................... 51
3.3.1
Extraktion der RNA................................................................................... 51
3.3.2
Qualitätsmessung und Konzentration der RNA ...................................... 52
3.3.3
Reverse Transkription, Synthese der cDNA ........................................... 53
I
Inhaltsverzeichnis
3.3.4
3.4
Bestimmung von Vitalitätsparametern............................................................ 56
3.4.1
Harnstoffanalyse....................................................................................... 57
3.4.2
Lactat-Dehydrogenase-Test .................................................................... 58
3.5
4
Durchführung der quantitativen PCR ....................................................... 54
Statistische Auswertung.................................................................................. 58
Ergebnisse ............................................................................................................ 60
4.1
Vorversuch primäre Rattenhepatozyten ......................................................... 60
4.1.1
Morphologie .............................................................................................. 60
4.1.2
PCR –Analysen ........................................................................................ 62
4.2 Ergebnisse der Etablierung von Isolation und Kultivierung von primären
bovinen Hepatozyten aus Schlachthofmaterial ........................................................ 65
4.2.1
Vorversuch nach humanem Protokoll...................................................... 65
4.2.2
Etablierung der Perfusion und Isolation der Hepatozyten ...................... 65
4.2.3
Etablierung der Kultivierung ..................................................................... 72
4.2.4
Morphologische Ergebnisse ..................................................................... 73
4.3
4.3.1
Analysen von Lebergewebe und Zellen im Rahmen der Zellisolierung . 79
4.3.2
Analysen der Zellkulturproben ................................................................. 81
4.4
5
PCR Analysen ................................................................................................. 79
Harnstoff und LDH Analysen des Mediums ................................................... 88
Diskussion ............................................................................................................ 92
5.1
Isolation primärer boviner Hepatozyten ......................................................... 93
5.2
Zellkultur .......................................................................................................... 98
5.2.1
Morphologie primärer Hepatozyten ......................................................... 98
5.2.2
Mediumzusammensetzung für primäre bovine Hepatozyten ............... 102
5.3
Vitalitätsmessungen ...................................................................................... 105
5.3.1
Harnstoff ................................................................................................. 105
5.3.2
LDH ......................................................................................................... 106
5.3.3
Apoptosemarker ..................................................................................... 106
5.4
GHR und IGF-I Expression ........................................................................... 107
5.5
Schlussfolgerung ........................................................................................... 109
5.6
Ausblick ......................................................................................................... 110
II
Inhaltsverzeichnis
6
Zusammenfassung ............................................................................................ 112
7
Summary ............................................................................................................. 115
8
Literaturverzeichnis ........................................................................................... 117
9
Anhang ................................................................................................................ 134
9.1
Protokolle....................................................................................................... 134
9.2
Rezepturen .................................................................................................... 140
9.3
Tabellen ......................................................................................................... 145
10 Danksagung ........................................................................................................ 147
III
Abkürzungen
Abkürzungen
Neben den allgemein gültigen Abkürzungen wurden folgende Kurzformen verwendet:
cDNA
komplementäre Desoxyribonukleinsäure
DMEM
Dulbeccos modified Eagle Medium
EC
Eurocollins Puffer
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
EGTA
Ethylenglycol-bis-tetraessigsäure
FCS
fetales Kälberserum
GAPDH
Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
GH
Wachstumshormon
GHR
Wachstumshormonrezeptor
h
Stunde
HEPES
Hydroxyethylpiperazinyl-Ethansulfonsäure
IGF-I
Insulinähnlicher Wachstumsfaktor I
IGFBP
Insulinähnlicher Wachstumfaktor-Bindungsprotein
LDH
Lactat-Dehydrogenase
min
Minute
mRNA
messenger Ribonukleinsäure
NaOH
Natriumhydroxid
PBS
Phosphat Buffered Saline
PCR
Polymerase Kettenreaktion
qPCR
quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion
T3
Trijodthyronin
T4
Thyroxin
V.
Vena
Vv.
Venae
IV
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Leberläppchen nach Kiernan,
Glissonsches Dreieck Quelle: Dancygier, H., Klinische Hepatologie, Mikroskopische
Anatomie, 2003 ............................................................................................................... 4
Abbildung 2: Schematische Zeichnung eines idealen Leberstückes für die Perfusion
mit nur einer Schnittfläche. In den Gefäßöffnungen befinden sich Kanülen Quelle:
Strom et al. 1982 .......................................................................................................... 12
Abbildung 3: Schematische Darstellung einer Sandwich Kultur ............................... 34
Abbildung 4: Schematischer Ablauf des rGH-Stimulationsversuches ...................... 37
Abbildung 5: Darstellung einer optimalen Schnittführung eines Leberstückes zur
Perfusion. Erkennbar sind vier größere Gefäßanschnitte (gelber Pfeil) und eine
Anschnittsfläche ............................................................................................................ 39
Abbildung 6: Darstellung des Geräteaufbaus für ein nicht-rezirkulierendes
Perfusionssystem ......................................................................................................... 42
Abbildung 7: Darstellung des Geräteaufbaus für ein zirkulierendes
Perfusionssystem ......................................................................................................... 43
Abbildung 8: Es werden Knopfkanülen in entsprechende Gefäßöffnungen verbracht
und mit Gewebekleber fixiert. ....................................................................................... 45
Abbildung 9: Das Leberstück wird an das Schlauchsystem angeschlossen und in
einen Büchnertrichter verbracht. .................................................................................. 45
Abbildung 10: Darstellung eines Leberstückes nach erfolgter Two-StepKollagenaseperfusion. Die aufgequollene Struktur des Gewebes ist zu erkennen. .. 46
Abbildung 11: Darstellung des Leberstückes nach Eröffnung der Leberkapsel. ...... 46
Abbildung 12: Gewonnene Zellsuspension im Falconröhrchen ................................ 47
Abbildung 13: Filtrieren der Zellsuspension durch eine sterile Gaze in ein
Falconröhrchen ............................................................................................................. 47
Abbildung 14: Röhrchen nach Easycoll-Zentrifugation. Die Schichtenbildung ist gut
zu erkennen. ................................................................................................................. 47
Abbildung 15: Zellpellet nach zweimaligem Waschen mit Williams E Medium. Im
Überstand befinden sich Nicht-Parenchymzellen und Zelltrümmer............................ 47
Abbildung 16: mikroskopische Darstellung der Zellen in der Neubauer Zählkammer
mit Trypanblau-Färbung. 100-fache Vergrößerung. Färbung nach EasycollZentrifugation. ............................................................................................................... 48
Abbildung 17: mikroskopische Darstellung der Hepatozyten in 400facher
Vergrößerung nach Easycoll Zentrifugation. Es sind lebende Zellen (ungefärbt) zu
erkennen. ...................................................................................................................... 48
Abbildung 18: Primäre Rattenhepatozyten in Sandwich Kultur, mikroskopische
Aufnahmen bei 56-facher Vergrößerung. Es sind Aufnahmen der Tage 0, 2, 3 und 5
dargestellt...................................................................................................................... 61
V
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 19: Leberstück nach Spülen mit EC Puffer auf dem Schlachthof. Der
entfärbte Bereich ist deutlich erkennbar (gelber Pfeil) ................................................ 69
Abbildung 20: primäre bovine Hepatozyten nach Adhäsionszeit .............................. 73
Abbildung 21: Monolayer Tag 1 ................................................................................. 74
Abbildung 22: Monolayer Tag 1 ................................................................................. 74
Abbildung 23: Monolayer Tag 1 ................................................................................. 74
Abbildung 24: Monolayer Tag 2 ................................................................................. 74
Abbildung 25: Monolayer Tag 2 ................................................................................. 74
Abbildung 26: Monolayer Tag 4 ................................................................................. 75
Abbildung 27: Monolayer Tag 4 ................................................................................. 75
Abbildung 28: Monolayer Tag 10 ............................................................................... 75
Abbildung 29: Sandwich Tag 1................................................................................... 76
Abbildung 30: Sandwich Tag 1................................................................................... 76
Abbildung 31: Sandwich Tag 1................................................................................... 76
Abbildung 32: Sandwich Tag 2................................................................................... 76
Abbildung 33: Sandwich Tag 2................................................................................... 76
Abbildung 34: Sandwich Tag 4................................................................................... 77
Abbildung 35: Sandwich Tag 4................................................................................... 77
Abbildung 36: Sandwich Tag 7................................................................................... 77
Abbildung 37: Sandwich Tag 7................................................................................... 77
Abbildung 38: Sandwich Tag 7................................................................................... 77
Abbildung 39: Sandwich Tag 10................................................................................. 78
Abbildung 40: Sandwich Tag 10................................................................................. 78
Abbildung 41: Sandwich Tag 10................................................................................. 78
Abbildung 42: Sandwich Tag 14................................................................................. 78
Abbildung 43: Sandwich Tag 14................................................................................. 78
Abbildung 44: mRNA Expression von GHR1A und IGF-I der Lebergewebestücke auf
dem Schlachthof und nach Transport .......................................................................... 79
Abbildung 45: mRNA Expression von BAX, BCl-xL und FasL der
Lebergewebestücke auf dem Schlachthof und nach Transport.................................. 80
Abbildung 46: GHR1A mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Monolayer
an Tag 0 bis Tag 3 ........................................................................................................ 81
Abbildung 47: IGF-I mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Monolayer an
Tag 0 bis Tag 3 ............................................................................................................. 82
Abbildung 48: BAX mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Monolayer von
Tag 0 bis Tag 3 ............................................................................................................. 83
Abbildung 49: FasL mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Monolayer von
Tag 0 bis Tag 3 ............................................................................................................. 83
Abbildung 50: BCL-xL mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Monolayer
von Tag 0 bis Tag 3 ...................................................................................................... 84
VI
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 51: GHR1A mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Sandwich
von Tag 0, 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 14 ............................................................................... 85
Abbildung 52: IGF-I mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Sandwich von
Tag 0, 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 14 ...................................................................................... 85
Abbildung 53: BAX mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Sandwich von
Tag 0, 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 14 ...................................................................................... 86
Abbildung 54: FasL mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Sandwich von
Tag 0, 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 14 ...................................................................................... 87
Abbildung 55: BCL-xL mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Sandwich
von Tag 0, 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 14 ............................................................................... 87
Abbildung 56: Graphische Darstellung der Harnstoffkonzentration in mmol/l im
Medium der Monolayer Zellkultur über drei Tage........................................................ 88
Abbildung 57: Graphische Darstellung der LDH-Konzentration in mU/ml im Medium
der Monolayer Kultur über drei Tage ........................................................................... 88
Abbildung 58: Graphische Darstellung der Harnstoffkonzentration in mmol/ml
Medium der Sandwich Kultur der Kulturtage 1,2,3,4,7 und 10 ................................... 89
Abbildung 59: Graphische Darstellung der LDH Konzentration in mU/ml Medium der
Sandwich Kultur der Kulturtage 1,2,3,4,7, 10 und 14 .................................................. 90
VII
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Zusammensetzung des Mastermix für die qPCR ...................................... 54
Tabelle 2: Programmablauf der 43 qPCR Zyklen ....................................................... 55
Tabelle 3: Zusammensetzung des Urea Reaction Mix ............................................... 57
Tabelle 4: Übersicht der morphologischen Ergebnisse der mikroskopischen
Untersuchung der primären Rattenhepatozyten in der Sandwich Kultur. n.s.= nicht
sichtbar .......................................................................................................................... 60
Tabelle 5: mRNA Expression von GHR1A und IGF-I von Rattenhepatozyten in
Sandwich Kultur an den Versuchstagen 0,1,2,3,4,7. Die Daten sind dargestellt als
der Mittelwert ±Standardfehler. Die mRNA Expression ist als berechneter ΔCt-Wert
angegeben. n=Stichprobengröße. **** P<0,0001 ........................................................ 62
Tabelle 6: mRNA Expression von GHR1A und IGF-I von primären
Rattenhepatozyten in Sandwichkultur. Angegeben sind die Tage in Kultur sowie die
jeweilige Inkubationszeit von rGH in den entsprechenden Wells. Die Expression ist
als ΔCt-Wert angegeben. n=Stichprobenmenge, die in die Untersuchung
eingeflossenen Wells. Berechnet wurden Interaktionen zwischen Tag (4, 7) * Zeit (20,
120 min) ........................................................................................................................ 63
Tabelle 7: Effekt von Tag (4 und 7) und rGH Einfluss auf die Expression von GHR1A
und IGF-I. n= Stichprobenmenge. **** P<0,0001, *** P<0,001 .................................. 64
Tabelle 8: Übersicht der Ergebnisse der Leberperfusion nach Endprotokoll.
Aufgeführt sind die Zellausbeute in ml nach Zentrifugation sowie die Viabilität in %
nach Zentrifugation und Easycoll Zentrifugation ......................................................... 71
Tabelle 9: Tabellarische Darstellung der Konzentrationen von Harnstoff und LDH im
Medium. Vergleichend zwischen Monolayer (ML) und Sandwich (SW) Kultur. Die mit
einem Sternchen markierten Reihen zeigen signifikante Unterschiede zwischen ML
und SW an. (* P<0.05) ................................................................................................ 91
Tabelle 10: Übersicht der verwendeten Primer......................................................... 145
Tabelle 11: Variablentabelle ...................................................................................... 146
VIII
Einleitung
1
Einleitung
Die Leber ist die größte exokrine Drüse des Säugetierorganismus und gilt als
zentrales Stoffwechselorgan mit vielfältigen Aufgaben im Metabolismus von
Kohlenhydraten,
Fetten
und
Proteinen
und
ist
ebenso
eingeschlossen
in
endokrinologischen Prozessen.
In der späten Trächtigkeit von Hochleistungsmilchkühen ist eine endokrinologische
Stoffwechseladaptation unerlässlich, um den erhöhten Energiebedarf zu decken und
den Organismus auf die einsetzende Laktation vorzubereiten (Aschenbach et al.,
2010). Eine Schlüsselkomponente bei dieser Adaptation nimmt die somatotrope
Achse
ein.
Diese
besteht
aus
dem
Wachstumshormon
(GH),
dem
Wachstumshormonrezeptor (GHR) an den Zielzellen (z.B. Leber, Muskulatur,
Fettgewebe) sowie dem Insulin-like Growth Faktor I und II (IGF-I, IGF-II) mit sechs
spezifischen Bindungsproteinen (IGFBP 1-6). Das in den Zielzellen gebildete IGF-I
steuert über einen Feedback-Mechanismus die Ausschüttung des GH aus der
Hypophyse.
Bei Hochleistungsmilchkühen kommt es in den letzten drei Wochen der Trächtigkeit
zu einer hepatischen Wachstumshormon-Resistenz in der Leber (Escalada et al.,
1997; Lucy et al., 1998). Hierbei sinkt die Ansprechbarkeit des GHR, was bedeutet,
dass die Leber verminderte Mengen an IGF-I produziert (Lucy et al., 2001; Piechotta
et al., 2014; Radcliff et al., 2003b). Demnach zeichnet sich die metabolische
Adaptationsphase der Milchkuh peripartal unter anderem durch sinkende IGF-IKonzentrationen in der Peripherie aus. Aufgrund des fehlenden negativen Feedbacks
an der Hypophyse kommt es aber gleichzeitig zu einer vermehrten Ausschüttung von
Wachstumshormon. Man spricht auch von der Entkopplung der somatotropen Achse.
Es ist bisher jedoch nicht bekannt, welche Mechanismen genau zu einer
verminderten GHR-Bildung oder Ansprechbarkeit des GHR in der Leber bei
peripartalen Milchkühen führen.
Da es im peripartalen Zeitraum der Milchkuh zu enormen endokrinen, metabolischen
als
auch
immunologischen
Veränderungen
kommt,
ist
es
in
dieser
Stoffwechselphase nicht sinnvoll Studien an einem Tiermodell durchzuführen. Eine
1
Einleitung
Untersuchung in der Zellkultur bietet daher eine bessere Möglichkeit. Hier könnten
gezielt Wirkungen einzelner Faktoren sowie auch additive Effekte auf die GHRExpression in Leberzellen untersucht werden.
Primäre Hepatozyten von Ratten und Mäusen finden zahlreich Verwendung in
toxikologischen und metabolischen Studien (Hewitt et al., 2007; Shulman and
Nahmias, 2013). In der Literatur lassen sich auch einige Studien finden, die bovine
primäre
Hepatozyten
isolieren
und
als
Grundlage
für
Stoffwechsel-
oder
pharmakologische Analysen in der Zellkultur einsetzen (Giantin et al., 2012; Jiang et
al., 2013; Panda et al., 2015). Konkrete in vitro Studien bezüglich der Expression und
Funktionalität des GHR von bovinen primären Hepatozyten sind bislang nicht
beschrieben.
Es ist bekannt, dass dreidimensionale Kulturen, z.B. Sandwich Kulturen, bei der die
Zellen zwischen zwei Lagen von Kollagen wachsen, den in vivo Zustand gut
reflektieren und eine erhöhte Übertragbarkeit der Ergebnisse auf die in vivo Situation
liefern (Godoy et al., 2013).
Daher ist Ziel dieser Arbeit ein Protokoll zur Isolierung von bovinen primären
Hepatozyten aus Schlachthofmaterial, sowie deren folgende Kultivierung in einer
dreidimensionalen Zellkultur zu entwickeln. Die primären bovinen Hepatozyten
sollten weiterhin auf ihre Expression des GHR und dessen Funktionalität untersucht
werden, um eine Aussage auf einen möglichen zukünftigen Einsatz dieser Kultur für
endokrinologische Studien am GHR und damit der somatotropen Achse treffen zu
können.
2
Literatur
2
2.1
Literatur
Leber und Leberzellen
2.1.1 Aufbau und Funktion der Leber
Die Leber eines ausgewachsenen Rindes wiegt je nach Rasse, Geschlecht und Alter
zwischen 4-9 kg, und hat abhängig vom Fütterungs- und Ernährungszustand des
Tieres eine braunrote bis hellbraune Farbe. Die Blutversorgung der Leber erfolgt
über die Leberpforte durch die Vena portae mit funktionellem, nährstoffreichen, sowie
durch die Arteria hepatica mit sauerstoffreichen Blut. Beide Gefäße verbreiten sich im
Leberparenchym vielfältig und besitzen einen gemeinsamen Abfluss in die Vena
cava caudalis (Nickel et al., 2001).
Die Leber ist die größte exokrine Drüse des Säugetierorganismus und gilt als
zentrales Stoffwechselorgan mit vielfältigen Synthese- und Umwandlungsleistungen
im Metabolismus von Kohlenhydraten, Fetten und Proteinen. Sie nimmt zudem
lebenserhaltende Entgiftungsfunktionen durch den Abbau und die Elimination
unterschiedlicher Stoffe, wie z.B. Ammoniak oder Pharmaka, wahr und ist zusätzlich
Speicherorgan für Glykogen, fettlösliche Vitamine und Spurenelemente. Eine weitere
wichtige Funktion der Leber ist die Bildung von Gallenflüssigkeit aus Cholesterin,
welche für den Abbau von Lipiden verantwortlich ist (Sallmann and Fuhrmann, 2000).
Diese zahlreichen und vielfältigen Aufgaben der Leber werden im Wesentlichen von
den Leberzellen, den Hepatozyten, ausgeführt, die, beschrieben beim Menschen, bis
zu 80 % das Leberparenchym ausmachen (Blouin, 1977).
Die polygonalen Leberzellen sind untereinander in Strängen angeordnet, den
sogenannten Leberzellbalken, und bilden zusammen winzige Leberläppchen, Lobuli
hepatici, die in ihrem histologischen Anschnitt hexagonal erscheinen und erstmals
1833 von Kiernan beschrieben wurden. Im Zentrum eines Leberläppchens befindet
sich
die
Zentralvene,
Vena
centralis.
An
den
Eckpunkten
benachbarter
Leberläppchen liegen die sogenannten Portalfelder. Hier verläuft jeweils ein Ast der
Arteria hepatica, die Arteria interlobularis, ein Ast der Vena portae, die Vena
interlobularis und ein Gallengang, Ductus biliferus. Diese drei Gefäße bezeichnet
3
Literatur
man als Glisson-Trias oder Glissonsches Dreieck (s. Abbildung 1). Feine periportale
Bindegewebsausläufer grenzen benachbarte Leberläppchen ab (Dancygier, 2003;
Nickel et al., 2001).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Leberläppchen nach Kiernan, Glissonsches Dreieck
Quelle: Dancygier, H., Klinische Hepatologie, Mikroskopische Anatomie, 2003
Zwischen den einzelnen Leberzellen liegen die erweiterten Kapillaren der Leber, die
Lebersinusoide. Die Sinusoide transportieren das Blut der Pfortader zusammen mit
dem Blut aus der Leberarterie durch die Leberläppchen in Richtung der
Läppchenzentren, wo es jeweils von einer Zentralvene aufgenommen wird
(Dancygier, 2003). Den Spaltraum zwischen den Endothelzellen der Lebersinusoide
und den Leberzellen nennt man den Disse Raum (benannt nach Josef Disse), in dem
der eigentliche Stoffaustausch zwischen Blut und Hepatozyten stattfindet (Dancygier,
2003).
Neben der oben beschriebenen Einteilung der Leber in die klassischen
Leberläppchen, ist die Einteilung in sogenannte Leberazini für eine funktionelle
Betrachtungsweise hilfreich. Die mittlere Achse eines Azinus stellt ein Bündel mit den
Gefäßen des Glissonschen Dreiecks dar, die am Rand des klassischen Läppchens
verlaufen. Hierbei wird berücksichtigt, dass ein Versorgungsbündel das Blut in beide
benachbarten Läppchen entlassen kann. Die am nächsten am Versorgungsbündel
4
Literatur
liegenden Hepatozyten werden somit am besten mit Sauerstoff und Nährstoffen
versorgt, weshalb sie als Zone 1 des Azinus bezeichnet wird. Weiter zum Zentrum
des klassischen Läppchens liegen dann Zone 2 und 3 (Rappaport et al., 1954).
Zum
Leberparenchym
gehören
neben
den
Hepatozyten
auch
die
Sinusendothelzellen, Kupffer-Zellen, die Fettspeicherzellen (Ito-Zellen), Pit-Zellen
sowie der extrazelluläre Raum. Die Kupffer-Zellen finden sich neben den
Sinusendothelzellen in den Sinusoiden. Sie sind in der Lage Fremdstoffe zu
phagozytieren und Antigene zu präsentieren und gehören demnach zu den
Makrophagen. Die Pit-Zellen, welche als natürliche Killerzellen fungieren, findet man
ebenfalls
in
den
Sinusoiden.
Die
Fettspeicherzellen
sind
der
äußeren
Endothelschicht aufgelagert und befinden sich im Disse-Raum. Sie speichern zu
einem großen Teil Vitamin A und bilden Kollagen (v.a. Kollagen I, III und IV) für die
extrazelluläre Matrix (Benninghoff and Drenckhahn, 2003; Dancygier, 2003).
2.1.2 Aufbau und Funktion der Hepatozyten
Hepatozyten machen ca. 60% der Gesamtzellzahl in der Leber und ca. 80 % des
Leberparenchyms aus (Blouin, 1977). Ein Hepatozyt ist zwischen 25-35 µm groß, hat
ein Volumen von 5000-6000 µm3
und weist eine polygonale Form auf (Weibel,
1969). Die „turn-over-rate“ von Hepatozyten beträgt 400 Tage (Grisham, 1962). Es
handelt sich um epitheliale, polare Zellen, die von einer Plasmamembran umgebenen
sind. Der Zellkern ist rund, euchromatinreich und weist einen deutlichen Nukleolus
auf. Oft besitzen Hepatozyten auch zwei oder mehrere Zellkerne. Aufgrund der
hohen Stoffwechselleistungen und vielfältigen Zellfunktionen ist das Zytoplasma
einer Leberzelle reich an Organellen. Hierzu zählen vor allem das raue und das
glatte endoplasmatische Retikulum, der Golgi-Apparat sowie eine Vielzahl von
Mitochondrien. Die Zellorganellen machen ca. 50% des gesamten Zellvolumens aus.
Des Weiteren finden sich im Zytoplasma zahlreiche Glykogeneinschlüsse, kristalline
Strukturen aus Phospholipiden und Fettvakuolen als Speicher (Blouin, 1977; Weibel,
1969).
5
Literatur
Die Plasmamembran von Hepatozyten ist hochkomplex. Morphologisch und
funktionell unterscheidet man drei spezialisierte Abschnitte, sogenannte Domänen.
Man unterteilt die Plasmamembran in die sinusoidale (basolaterale), die interzelluläre
(laterale) und die kanalikuläre (apikale) Domäne. Diese unterscheiden sich
biochemisch, in ihrer Enzym-und Rezeptorausstattung, in den Transportsystemen
und in ihrer Fluidität (Bartles et al., 1985; Gissen and Arias, 2015; Treyer and Müsch,
2013). Die sinusoidale Membran macht 35% der Plasmamembran aus und steht mit
dem Disse-Raum in Verbindung (Weibel, 1969). Sie weist zahlreiche Mikrovilli auf,
die für die Reabsorption von Stoffen verantwortlich sind, aber auch als Rezeptoren
für Hormone wie zum Beispiel Insulin und Glukagon dienen. Über diese Membran
erfolgt zudem die Abgabe von Zellprodukten an die Blutbahn. Die interzelluläre
Membran ist verantwortlich für die Zell-Zell-Kontakte der Leberzellen untereinander
und dient der interzellulären Kommunikation. Sie hat einen Anteil von ca. 50 % der
Gesamtmembran. Die Kontakte bestehen vor allem aus Tight junctions und
Desmosomen
(Théard
et
al.,
2007).
Sie
bilden
eine
Barriere
zwischen
Sinusoidalraum und dem Gallensystem. Am apikalen Pol eines Hepatozyten befindet
sich die kanalikuläre Membran. Hier erfolgt die Abgabe der Gallenflüssigkeit, die in
den Hepatozyten aus Cholesterol gebildet wird. Die Galle wird in die sogenannten
Gallenkanalikuli, Canaliculi biliferi, die durch mikrovilliartige Ausstülpungen der
apikalen Zellmembran benachbarter Hepatozyten gebildet werden, abgegeben.
Diese Canaliculi münden im Ductus interlobularis bilifer (Gissen and Arias, 2015).
Untersuchungen von Feracci et al. (1987) an Mäuseleberzellen haben ergeben, dass
die Polarisation der Hepatozyten um den 14ten Tag der Fetalentwicklung beginnt.
Das fetale kanalikuläre Netzwerk entwickelt sich um den 20ten Tag der
Embryonalentwicklung. Postnatal wird es dann in den ersten zwei bis drei Tagen, wie
Untersuchungen an Ratten zeigten, vollständig ausgebildet (Wood, 1965).
Die Ausbildung dieser Polarisation ist essentiell für die physiologische Funktionalität
der Leberzellen. Störungen dieser Polarisation sind genetisch, infektiös oder tumorös
bedingt und können in vielfältigen pathophysiologischen Konsequenzen, wie zum
6
Literatur
Beispiel intrahepatische Cholestase, familiäre Hypercholanämie und Leberfibrose
resultieren (Gissen and Arias, 2015).
Hepatozyten stehen weiterhin in engem Verbund mit den anderen Zellpopulationen
der Leber als auch der extrazellulären Matrix. Dieses Netzwerk dient dem Transport
von Signalproteinen wie Zytokinen und Chemokinen und über gap junctions
zwischen den Zellen kann ein direkter Transport kleiner Moleküle stattfinden. Nur so
können die gesamten Leberfunktionen ausgeführt werden (Gissen and Arias, 2015;
Kmiec, 2001).
Bei einer erhöhten Stoffwechselleistung des Organs kommt es vorrangig zu einer
Hypertrophie der Zellen als zu einer Hyperplasie. Das Zellvolumen ist wiederum
abhängig vom Ernährungsstatus des Individuums. Nach einem Hungerzustand von
48 h kann das Zellvolumen um bis zu 45% abnehmen (Epstein, 1967; Puviani et al.,
1998).
2.2
Isolierung von Hepatozyten
2.2.1 Geschichtliche Entwicklung
Die ersten Versuche zur Isolierung von Hepatozyten von zunächst Ratten- und
Mäuselebern beruhten im Wesentlichen auf einer Separation der Zellen durch
alleinige mechanische Krafteinwirkung auf die Leber oder in Kombination mit einer
Bindung von Calcium durch EDTA oder Zitrat (Anderson, 1953; Jacob and Bhargava,
1962; Kaltenbach, 1954). Diese Isolierungstechniken führten zu großen Schäden an
der
Zellmembran
sowie
den
Zellorganellen
wie
Berry
(1962)
durch
elektronenmikroskopische Untersuchungen belegen konnte. Howard und Pesch
beschrieben 1967 die erste Technik des enzymatischen Verdauens der Leber von
Ratten mit Kollagenase und Hyaluronidase (Howard, 1967). Hierbei wurden
Leberschnitte hergestellt, die in einer enzymhaltigen Lösung geschwenkt wurden.
Die durch diese Technik gewonnenen Zellen hatten eine intakte Zellmembran, doch
die Zellausbeute war sehr gering. Sie lag bei nur 5% des Ausgangsgewebes
(Howard and Pesch, 1968). Die erste Isolierung von Hepatozyten mit hoher
7
Literatur
Zellausbeute intakter Zellen, die sogenannte „High-Yield Preparation“ wurde erstmals
1969 von Berry und Friend beschrieben (Berry, 1969). Die Autoren beschreiben eine
verbesserte enzymatische Verdauung der Leber, in dem sie die Leber direkt mit einer
enzymhaltigen Pufferlösung zirkulierend perfundierten. Das Versuchstier, eine
erwachsene Sprague-Dawley Ratte, wurde vor Perfusionsbeginn anästhesiert. Die
Perfusionslösung enthielt Kollagenase Typ I und Hyaluronidase Typ I. Der Puffer
wurde während der Perfusion zudem mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlenstoffdioxid
begast. Diese Art der Zellisolierung ergab bei Berry und Friend eine bis zu sechsmal
höhere Zellausbeute als die Methode nach Howard und Pesch (Berry, 1969). Eine
weitere wichtige Modifikation dieser Perfusionstechnik erfolgte 1972 durch Seglen
(Seglen, 1972). Der Autor demonstrierte, dass Calcium eine sehr wichtige Rolle bei
der Zellisolierung der Hepatozyten spielt, und dass das Calcium durch eine
sogenannte „Prä-Perfusion“ der Leber zunächst entfernt werden muss und der
folgenden Kollagenaselösung wieder zugesetzt wird. Durch diese neu eingeführte
„Prä-Perfusion“ wurde durch Zusatz von EGTA das Calcium dem Gewebe entzogen,
und damit Desmosomen im Zellverband irreversibel gespalten. Die Zellausbeute lag
nach Seglen bei dieser Technik bei nahezu 100% bei einer Viabilität der isolierten
Zellen von 95%. Seglens Technik wurde fortwährend als „Two-Step-KollagenasePerfusionstechnik“ bezeichnet und bildet bis heute die Grundlage für die Isolierung
von Hepatozyten verschiedener Spezies.
Ingebretsen and Wagle (1972) vereinfachten die Präparation und verwenden die
Kollagenase als einziges Enzym für den Verdau des Gewebeverbandes. Zudem
führen sie die Prä-Perfusion erstmals mit einem Bicarbonat-Puffer durch. Nach dieser
ersten Perfusion entnehmen sie das Leberstück und überführen es zur weiteren
Perfusion in eine Apparatur nach Miller (Ingebretsen and Wagle, 1972; Miller, 1951).
Zahlten und Stratman stellen 1974 für die Isolation von Rattenhepatozyten erstmals
eine Apparatur eines rezirkulierenden Perfusionssystems vor. Die Leber des Tieres
wurde bereits vor der Perfusion entnommen und in die Apparatur verbracht. Die
Vena portae wurde kanuliert, die anderen größeren Gefäße ligiert und somit die
Leber durch die Pfortader perfundiert (Zahlten and Stratman, 1974).
8
Literatur
Die Isolierung von Hepatozyten erfolgte vorerst ausschließlich an kleinen Labortieren
wie Ratten, Mäusen und Kaninchen. Da die isolierten Hepatozyten vornehmlich für
Untersuchungen zum Metabolismus der Leberzellen verwendet wurden, war es nötig
auch von größeren Tieren Zellen gewinnen zu können, da im Verständnis des
Stoffwechsels dieser Tiere viel Informationsbedarf steckte, und der Stoffwechsel von
kleinen Labortieren nicht prinzipiell mit anderen Spezies vergleichbar ist (Hewitt et
al., 2001; Oldham et al., 1990). So wurden in den folgenden Jahren vermehrt
Isolationen von Hepatozyten aus größeren Säugetieren beschrieben. Clark et al.
veröffentlichten 1976 die Gewinnung von Leberzellen von Lämmern und adulten
Schafen zur Untersuchung der Glukoneogenese (Clark et al., 1976). Ebenfalls
wurden 1976 Zellisolierungen vom Rhesusaffen dargestellt mit dem Ziel den
Metabolismus von C14 Nikotin zu analysieren (Poole and Urwin, 1976). Die ersten
Isolationen primärer humaner Hepatozyten wurden Anfang der 1980er Jahre
veröffentlicht (Liddiard et al., 1980; Reese and Bryard, 1981; Strom et al., 1982). Die
erste Veröffentlichung für die Technik zur Isolation boviner primärer Hepatozyten
erfolgte 1985 durch Forsell et al. (1985).
2.2.2 Techniken der Isolierung von primären Hepatozyten
Die Grundlage der Isolierung von Hepatozyten bildet bis heute die „Two-StepCollagenase-Perfusion“ nach Seglen (1972). Diese Technik wird jeweils modifiziert
bei allen Spezies angewandt. Sie basiert im Wesentlichen darauf, dass durch die
Perfusion mit einem chelatbildenden EGTA- oder EDTA-haltigen Puffer das Blut aus
dem Gewebe entfernt wird und durch die Bindung von Calcium Desmosomen im ZellZell-Verband
gelöst
werden.
Die
folgende
Kollagenaselösung
zerstört
die
Verbindungen der Zellen zur extrazellulären Matrix (Alpini et al., 1994; Papeleu et al.,
2006; Seglen, 1972). Im Folgenden sollen die Isolationstechniken einzelner Spezies
näher beschrieben werden. Ein besonderes Kapitel (2.2.2.3) befasst sich speziell mit
dem Ausgangsmaterial aus dem Schlachthof.
9
Literatur
2.2.2.1 Isolation von Hepatozyten aus kleinen Labortieren
Die Perfusion der Leber von kleinen Labortieren erfolgt am anästhesierten Tier in situ
direkt durch die Vena portae (Annaert et al., 2001; Hengstler et al., 2000;
Ingebretsen and Wagle, 1972; Schug et al., 2008).
Die unterschiedlichen Modifikationen der Perfusionstechnik nach Seglen (1972), die
in der Literatur zu finden sind, bestehen hauptsächlich in der Verwendung
verschiedener Pufferzusammensetzungen und Pufferzusätze sowie unterschiedlicher
Perfusionszeiten. So perfundieren Schug et al. 2008 zunächst mit einem EGTAhaltigen HEPES-Puffer für 15 min. Daran anschließend weitere 15 min Perfusion mit
einem Kollagenasepuffer und Calciumchlorid (Schug et al., 2008). Annaert et al.
(2001) beschreiben eine Perfusion am anästhesierten Tier mit Kollagenase und
einem Trypsininhibitor, die dem EGTA-Puffer nach 10 min zugefügt werden. Eine
Minute danach wird Calciumchlorid zugesetzt und 10 min perfundiert (Annaert et al.,
2001). Chatterjee et al. (2014) übernehmen diese Technik, allerdings ohne Zusatz
des Trypsininhibitors. Bei Borlak and Klutcka (2002) wird die Leber der Ratte in situ
zunächst mit 100 ml Krebs-Ringer Puffer (KRB) für 10 min perfundiert, dann weitere
10 min mit einem EDTA-Zusatz von 1 mmol/l. Es folgen 8-10 min Perfusion mit KRB
und einem Zusatz von Kollagenase IV und 0,5 mM Calciumchlorid (Borlak and
Klutcka, 2002; Borlak et al., 2015). Aiken et al. veröffentlichen 1990 eine Studie für
eine optimale Zellausbeute von Hepatozyten aus Rattenleber (Aiken et al., 1990). Sie
perfundierten 128 Rattenlebern mit unterschiedlichen Modifikationen nach der
Technik von Seglen (1972). Sie untersuchten Variationen der Perfusion wie
Durchflussrate, Zeit, Temperatur, pulsatiler und kontinuierlicher Durchfluss des
Puffers,
ebenso
verschiedene
Pufferzusammensetzungen.
Kollagenasetypen
und
variable
Die beste Zellausbeute und Viabilität der Zellen
ergaben sich in dieser Studie bei einer in situ Perfusion und einer Durchflussrate von
25 ml/min. Das Wasserbad sollte laut den Autoren eine Temperatur von 38 °C
aufweisen. Als Puffer eignet sich ein nichtoxygenierter, auf HEPES basierender
Puffer mit einem pH-Wert von 7,4, der für die Kollagenaseperfusion mit 4,8 mmol/L
Calciumchlorid (CaCl2) versetzt wurde. Die Viabilität der Zellen belief sich in diesen
10
Literatur
Studien auf 85-95% bei einer Zellausbeute von 500-700 x 105
Zellen/ g
Lebergewebe (Aiken et al., 1990).
Zudem wurden auch Perfusionen ohne Kollagenase durchgeführt, denn die Isolation
mit Kollagenase weist auch Nachteile auf. Sie ist sehr teuer und ihre Effektivität als
auch Zytotoxizität variiert chargenabhängig (Li, 2007; Rivas et al., 1993). So
beschreiben Wang et al. (1985) eine Isolation von Rattenleberzellen lediglich mit
einer Perfusion mit einem 2mM EDTA-Puffer. Die Viabilität, Zellausbeute sowie die
morphologische
Beschaffenheit
der
Zellen
waren
vergleichbar
mit
einer
Kollagenaseperfusion. Rivas et al. (1993) führen erfolgreich eine Isolation von
Kaninchenhepatozyten mit einer EDTA Perfusion durch.
2.2.2.2 Isolation von Hepatozyten aus großen Säugetieren und Menschen
Für die Isolation von Hepatozyten größerer Säugetiere werden in der Literatur
unterschiedliche Methoden beschrieben. Dabei entscheiden hauptsächlich die Größe
und das Alter des Tieres über die angewandte Methodik. Nach Literaturrecherche
werden vor allem neonatale oder junge Tiere verwendet. Das Versuchstier wird in
diesen Studien zunächst ebenfalls, wie die kleinen Labortiere, anästhesiert und die
Leber oder ein Teil der Leber, meist der Lobus caudatus, wird dem Tierkörper
entnommen. Das Tier wird anschließend euthanasiert. Obwohl das Lebergewebe von
größeren Säugetieren schwerer zu dissoziieren ist, da es mehr Kollagen und
fibrilläres
Gewebe
aufweist,
wird
auch
hier
überwiegend
die
„Two-step-
Kollagenaseperfusionstechnik“ eingesetzt (Aiello and Armentano, 1987; Donkin and
Armentano, 1993; Li et al., 2005; Wang et al., 2012; Zhang et al., 2012). Das
Leberstück wird für die Perfusion in eine Apparatur modifiziert nach Zahlten und
Stratman gegeben (Aiello and Armentano, 1987). Die Perfusion erfolgt über die Vena
portae bei einem intakten Organ (Li et al., 2005) oder über Kanülen in
Gefäßanschnitten, wenn es sich um einen Teil der Leber handelt, was in Abbildung 2
schematisch dargestellt ist (Bakala et al., 2003; Giantin et al., 2012).
11
Literatur
Abbildung 2: Schematische Zeichnung eines idealen Leberstückes für die Perfusion mit nur einer
Schnittfläche. In den Gefäßöffnungen befinden sich Kanülen Quelle: Strom et al. 1982
Rozga et al. (1993) perfundieren den ersten Puffer in situ und entnehmen die Leber
erst für die Kollagenaseperfusion aus dem Tierkörper.
beschriebenen
Perfusionsverfahren
unterscheiden
sich
vor
allem
mit
in
der
ihrer
Alle in der Literatur
Two-Step-Kollagenaseperfusion
Pufferzusammensetzung,
der
Kollagenaseeinwaage und den einzelnen Perfusionszeiten. Generell kann gesagt
werden, dass für die Isolation der Leberzellen großer Säugetiere eine größere Menge
an Kollagenase notwendig ist als für die kleinen Labortiere (Li, 2007). Aiello und
Armentano 1987 verwenden zur Isolierung von Ziegenhepatozyten einen ersten
Perfusionspuffer mit Krebs-Ringer Bicarbonat (KRB) und perfundieren dann für 30-40
min mit einem Kollagenasepuffer (Aiello and Armentano, 1987). Li et al. (2005)
wenden für die Isolierung von Schweinehepatozyten erfolgreich einen EDTA-Puffer
mit nachfolgender Kollagenaseperfusion an.
Neben der Two-Step-Kollagenaseperfusion sind aber auch bei den großen
Säugetieren andere Methoden beschrieben. So führten Rozga et al. (1993) eine
Perfusion mit EDTA-Puffer an Mischlingshunden durch. Die Hunde wurden
anästhesiert und die Leber wurde vollständig entnommen. Zunächst wurde das
Organ fünf min über die Vena portae mit physiologischer Kochsalzlösung (NaCl)
12
Literatur
gespült und dann für 30 min mit einer oxygenierten 2mM EDTA-Lösung perfundiert.
Für weitere 10 min folgte dann eine Calciumchloridlösung (CaCl 2) ohne EDTA. Die
Viabilität der isolierten Zellen lag in dieser Studie unter 60 % (Rozga et al., 1993).
Lemley und Wilson (2010) stellen eine Zellisolation ohne Perfusion an Schweinen
und Rindern dar. Sie verwendeten Lebergewebe von euthanasierten Tieren, sowie
Biopsiematerial. Das jeweilige Gewebestück wurde mit einem Skalpell fein zerkleinert
und mit einer EGTA-haltigen Lösung gewaschen. Darauf folgte ein Waschschritt
ohne EGTA, dann verblieb das Gewebe für 45 Minuten in einer Kollagenaselösung
bei 37°C. Danach wurde die Lösung mehrfach gefiltert. Die Viabilität lag bei 83%
bzw. 84% bei Leberbiopsien. Die Zellausbeute betrug ~ 41,0 x 106 lebende Zellen/g
Lebergewebe. Allerdings geben die Autoren zu bedenken, dass rund 60% der Zellen
morphologisch eine eher Fibroblasten-ähnliche Gestalt aufweisen, 25% der Zellen
zeigten Albuminsynthese (Lemley and Wilson, 2010).
Die Isolation von humanen Hepatozyten erfolgt vor allem aus Leberresektaten, die
intra operationem entnommen werden (Hueging et al., 2015), oder aus Organen, die
aus unterschiedlichen Gründen nicht für eine weitere Transplantation in Frage
kommen (Li, 2007). Die Isolationstechnik entspricht der der großen Säugetiere wobei
die Two-Step-Kollagenaseperfusion vorrangig Verwendung findet (Damm et al.,
2013; Pfeiffer et al., 2015).
2.2.2.3 Isolation von Hepatozyten aus Schlachthofmaterial
In
der
Literatur
lassen
sich
auch
Studien finden,
die Hepatozyten
aus
Schlachthofmaterial verschiedener Spezies gewinnen. Für die Verwendung von
Schlachthofmaterial ist es wichtig die sogenannte warme Ischämiezeit der Leber so
kurz wie möglich zu halten. Als warme Ischämiezeit bezeichnet man die Zeit, in der
die Leber sich noch im Tierkörper befindet nachdem der Blutstrom nach Tötung des
Tieres, geendet hat. Diese Zeit ist für die Viabilität der Hepatozyten entscheidend,
denn in dieser Zeit sind Hepatozyten noch stoffwechselaktiv, werden aber nicht mehr
mit Sauerstoff versorgt um den Stoffwechsel aufrecht zu erhalten (persönliche
13
Literatur
Mitteilung Dr. Georg Damm, Charité Berlin). Ebenso spielt der Ernährungszustand
des Schlachttieres eine große Rolle für die Viabilität der Zellen (persönliche
Kommunikation Dr. Georg Damm, Charité Berlin). Hoogenboom et al. beschreiben
1989 die Isolierung von porcinen Hepatozyten (Hoogenboom et al., 1989). Die Tiere
wurden im Schlachthof durch Elektroschock betäubt und im Folgenden ausgeblutet.
Die Bauchhöhle wurde eröffnet und ein Teil der Leber entnommen. Die Gefäße
wurden mit physiologischer Kochsalzlösung gespült, um das Blut zu entfernen. Das
ca. 100g schwere Leberstück wurde auf eiskalter NaCl-Lösung in das Labor
transportiert. Die Zeit zwischen Tötung des Tieres und der Perfusion betrug 20-30
min (Hoogenboom et al., 1989). Stefanski et al. (2013) führen eine Studie zur
Isolation von Hepatozyten aus Pferdelebern durch und verwenden für den Transport
aus dem Schlachthof Custodiol®HTK-Lösung. Die Leberstücke wurden vorher mit
dieser Lösung bei 4°C gespült (Stefanski et al., 2013). Bakala et al. (2003)
verwenden für den Transport von Pferdeleber die „University of Wisconsin Lösung“
(UW), die auf einer Kalium-Phosphat-Grundlage basiert.
Auch von Rindern sind bereits Isolierungen von Hepatozyten aus Schlachthoflebern
beschrieben (Giantin et al., 2012; Panda et al., 2015). Giantin et al. (2012)
verwenden den Lobus caudatus von geschlachteten Färsen. Sie spülen das
Leberstück mit eiskaltem Eurocollins-Puffer mit EDTA-Zusatz vor. Der Transport
erfolgt ebenfalls in Eurocollins-Puffer. Panda et al. (2015) verwenden zum Spülen
und für den Transport des Leberstückes eiskalten HEPES-Puffer mit EGTA-Zusatz.
Alle aufgeführten Isolierungen wurden im Anschluss an den Transport mit einer
modifizierten Two-Step-Kollagenaseperfusion durchgeführt (Bakala et al., 2003;
Giantin et al., 2012; Panda et al., 2015; Stefanski et al., 2013).
Eine Technik ohne Perfusion aus Schlachthofleber wird von Spotorno et al.
beschrieben. Die Autoren verwenden Lebern von Kälbern und Bullen, extrahieren
den Lobus caudatus und lassen fein zerkleinertes Gewebe in Kollagenaselösung
inkubieren (Spotorno et al., 2006).
Bei Ausgangsmaterial aus dem Schlachthof spielt der Transport des Gewebes eine
große Rolle. In vielen Studien wird daher der Einsatz eines kalten, sogenannten
Transportpuffers oder Konservierungspuffers vorgeschlagen. Diese Puffer wurden in
14
Literatur
der Humanmedizin für den Transport von Organen zu Transplantationszwecken
entwickelt und eingesetzt (Li, 2007). Sie dienen der Organkonservierung und sollen
die Schäden an den Zellen so gering wie möglich halten. Eine Schlüsselrolle nimmt
hierbei die tiefe Hypothermie ein, bei der ein Organ transportiert wird. Eine
Temperatur von 4°C senkt die Stoffwechselrate rapide ab und der Sauerstoffbedarf
der Zellen nimmt entsprechend ab (Tolba et al., 2000). Trotzdem kommt es dabei zu
zellschädigenden Einflüssen wie einer Depolarisation der Zellmembran und
folgendem Chloridioneneinstrom, was zu einem Zellödem und Zelltod führt. Das Ziel
der Transportpuffer ist die Reduzierung der durch Hypothermie bedingten
zellschädigenden Einflüsse, sowie die Supplementation von Substraten und Energie.
Zu den bekanntesten Puffern zählen der bereits erwähnte „University of Wisconsin
Puffer“ (UW), der 1979 von F.O. Belzer entwickelt wurde und für die Konservierung
von Lebergewebe (Jamieson et al., 1988), Pankreas und Niere verwendet wird. Der
Histidin- Tryptophan- Ketoglutarat Puffer (HTK) oder auch Custodiol-Puffer wurde
von Bretschneider entwickelt und wird für Herzkonservierungen eingesetzt. Als erster
Konservierungspuffer wurde 1969 der Eurocollins Puffer entwickelt, der ebenfalls für
Leber und Niere verwendet wird (Collins and Wicomb, 1992). Den Toom et al. (1991)
führen in einer Studie einen Vergleich zwischen dem Eurocollins-Puffer und dem
UW-Puffer an einer isolierten Rattenleber durch und geben an, dass die
metabolische Kapazität sowie die Morphologie bei einer gekühlten Rattenleber in UW
Puffer optimaler zu sein scheint.
2.3
Kultivierung von Hepatozyten
2.3.1 Einsatz von Hepatozytenkulturen und Kulturbedingungen
In den letzten 40 Jahren wurden Hepatozytenkulturen in zahlreichen Studien mit
vielfältigsten Anwendungsgebieten in der Literatur beschrieben. Es finden sich
Studien zum Lebermetabolismus und Signaltransduktionswegen, zur fetalen
Leberentwicklung, und der Leberregeneration. Ebenso dienen Hepatozytenkulturen
der Untersuchung von viralen Infektionen und Entzündungsgeschehen. Ein
15
Literatur
Haupteinsatzgebiet der Hepatozytenkulturen stellen aber pharmazeutische- und
Toxizitätsstudien von Medikamenten und Stoffen auf den Metabolismus der
Leberzelle (Ellis and Nilsson, 2010; Hewitt et al., 2007; Sahi et al., 2010; Shulman
and Nahmias, 2013).
Im Jahr 1973 beschrieben Bissell et al. die erste Rattenhepatozytenkultur aus
primären Zellen als „Monolayer“ und die Autoren untersuchten daran metabolische
Funktionen der Leberzellen (Bissell et al., 1973). 1982 veröffentlichen GuguenGuillouzo et al. die erste primäre Zellkultur humaner Hepatozyten (Guguen-Guillouzo
et al., 1982). Für das Ziel der Erhaltung und Schaffung von in vivo ähnlichen
Verhältnissen in der Zellkultur sind eine Vielzahl von Studien veröffentlicht worden
(Dash et al., 2009; Guguen-Guillouzo et al., 1986). Der Monolayer zählt zu den
sogenannten 2D-Zellkulturen, bei dem die Zellen auf einer Schicht aus Plastik oder
auch einer Matrix aus Kollagen oder Laminin wachsen. Hierbei konnte allerdings
nicht nur ein Verlust von leberzellspezifischen Funktionen
beobachtet werden
(LeCluyse et al., 2005), sondern auch eine geringe Adhäsionseffizienz sowie schnell
auftretende morphologische Veränderungen der Hepatozyten wurden beschrieben.
So wird die Übertragbarkeit von Ergebnissen auf eine in vivo Situation als eher
gering eingeschätzt. In der Literatur lassen sich zahlreiche Untersuchungen
verschiedener
Parenchymzellen
Hepatozytenkultursyteme
wie
Kupffer-
oder
finden.
Co-Kulturen
Endothelzellen,
mit
Nicht-
3D-Kultursysteme
mit
verschiedenen Matrices, Spheroidkulturen sowie Flusskulturen in Bioreaktoren
werden als erfolgsversprechend genannt, um die in-vivo Situation besser
nachzuahmen mit dem Ziel das in vitro System zu verbessern (Dash et al., 2009;
Guguen-Guillouzo and Guillouzo, 2010; Hamilton et al., 2001; Henkens et al., 2006;
Hewitt et al., 2007; Schug et al., 2008).
Als Goldstandard für metabolische Studien an Leberzellen gelten primäre humane
Hepatozyten (Ellis and Nilsson, 2010; Li, 2007; Sahi et al., 2010). Aufgrund
mangelnder Verfügbarkeit und genetischer Diversität hat sich aber die Verwendung
von isolierten Rattenhepatozyten durchgesetzt (Bierwolf et al., 2011; Ellis and
Nilsson, 2010).
16
Literatur
Die
ersten
Optimierungsversuche
zur
Schaffung
von
in
vivo
ähnlicheren
Verhältnissen für die in vitro Kultur von Hepatozyten war die sogenannte
Sandwichkultur, bei denen die Hepatozyten zwischen zwei Schichten einer
extrazellulären Matrix kultiviert werden, welche meistens aus Kollagen, Laminin oder
Fibronektin bestehen. Hierdurch soll durch direkte Zell-Zell- und Zell-MatrixWechselwirkungen die Umgebung der Zellen besser imitiert werden, und eine
Förderung der Zelldifferenzierung der Hepatozyten ermöglicht werden. Die positiven
Auswirkungen auf die Viabilität der Hepatozyten bestätigen zahlreiche Studien
(Bierwolf et al., 2011; Farkas et al., 2005; Hewitt et al., 2001; Murray et al., 2014;
Page et al., 2007). Primäre Hepatozyten durchlaufen während der Isolation und der
folgenden Kultivierung eine sogenannte phänotypische Dedifferenzierung (Godoy et
al., 2009). Diese Dedifferenzierung ist abhängig von den Kulturbedingungen sowie
der verwendeten Tierart. Als Dedifferenzierung versteht man einen Verlust
hepatozytenspezifischer Eigenschaften und der Polarität der Zelle. Es können zum
Beispiel keine Gallenkanälchen mehr ausgebildet werden. Sie resultiert aus einer
Antwort des Hepatozyten auf einen entzündungsähnlichen Stimulus durch die
Ischämie, der Gewebezerreißung und eines partiellen Plasmamembranverdaues, der
während der Isolation auftritt (Fraczek et al., 2013; Godoy et al., 2009). Typische
Anzeichen der Zelldedifferenzierung sind die Ausbreitung der Zellen, der Verlust ihrer
Polarität und Häufung von Apoptose. Zudem zeigen die dedifferenzierten Zellen
große Unterschiede in ihrer Proteinexpression einschließlich des Verlustes des
leberspezifischen Cytochrom P 450 (CYP P450) (Elaut et al., 2006; Fraczek et al.,
2013; Godoy et al., 2009). Ebenso ist die Fähigkeit der Hepatozyten zur Sekretion
und zum Transport von organischen Anionen während der ersten Kultivierungsphase
gestört, wie in Studien an Rattenhepatozyten gezeigt werden konnte (Liang et al.,
1993; Rippin et al., 2001). Zahlreiche Studien belegen, dass die dreidimensionale
Sandwichkultur-Technik den Phänotyp der Hepatozyten, also ihre Differenzierung,
über Wochen in Kultur erhält und somit dem 2D-System deutlich überlegen ist
(Godoy et al., 2013; Murray et al., 2014; Swift et al., 2010; Treyer and Müsch, 2013).
Für den Erhalt des Differenzierungsgrades der Hepatozyten, und somit auch der
Überlebensdauer der Zellen, sind die Kulturbedingungen von entscheidender Rolle.
17
Literatur
Zahlreiche Studien über die Einflüsse von Medien und Mediumzusätzen, Wirkungen
von Co-Kulturen, serumfreier gegen serumhaltiger Kulturen und verschiedener 3D
Modelle wurden veröffentlicht (Du et al., 2008; Schug et al., 2008; Shulman and
Nahmias, 2013; Tuschl et al., 2009; Tuschl and Mueller, 2006; Vinken et al., 2006;
Vinken
et
al.,
2014).
Tuschl
und
Müller
(2006)
untersuchten
primäre
Rattenhepatozyten in Monolayer und in Sandwichkultur. Dabei verglichen sie zudem
jeweils ein serumhaltiges mit einem serumfreien Medium. Nach 72 Stunden in Kultur
fanden die Forscher ausgeprägte morphologische Zellveränderungen in der
Monolayer Kultur unabhängig vom Serumzusatz im Medium. Die Sandwich Kultur
zeigte
weiterhin
hepatozytenspezifische
polygonale
Zellen
mit
erkennbaren
Zellgrenzen. Die Zellen mit serumhaltigen Medium wiesen allerdings eine
Verschlechterung der zytoplasmatischen Integrität und Stabilität der Gallenkanälchen
Strukturen auf. Im serumfreien Medium konnte dies nicht beobachtet werden. Schug
et
al.
(2008)
konnten
zeigen,
dass
die
Gen-Expression
von
primären
Rattenhepatozyten in der Sandwich Kultur am besten mit dem in vivo Zustand
überein stimmt im Vergleich zur Monolayer Kultur oder Kultur im Matrigel.
2.3.2 Apoptosemechanismen der primären Hepatozyten
Die Apoptose stellt als kontrollierter, selbst ausgelöster Zelltod die letzte Phase der
Entwicklung einer Zelle dar und gehört somit zum Stoffwechsel der Zellen (Hale Aj,
1996; Kerr et al., 1972). Bei einer gesunden Leber ist die Rate des spontanen
Zelltodes sehr gering. Sie lag bei Untersuchungen an Rattenlebern bei 0,05% aller
Leberzellen, bei Mäusen betrug sie 0,1% (Qiao L, 1999). Die Apoptose tritt dabei in
vivo überwiegend bei perivenös liegenden Hepatozyten auf (Baier et al.; Ni et al.,
1994). Als entscheidender Unterschied zur Nekrose bleibt die Membranintegrität bis
zur abschließenden Phagozytose durch Makrophagen erhalten. Zur Apoptose von
Leberzellen in der Kultur gibt es zahlreiche Untersuchungen. Da in der Kultur keine
Phagozytose stattfindet, kann so der gesamte Apoptoseverlauf dargestellt werden
(Gomez-Lechon
et
al.,
2002;
Raffray
18
and
Gerald
M,
1997).
Für
diese
Literatur
Apoptosestudien eignen sich primäre Zellen, da Zelllinien wie HepG2-Zellen, aus
Tumormaterial gewonnen werden und eine hohe Resistenz gegen Apoptose
aufweisen(Schulze-Bergkamen
et
al.,
2006).
So
kann
weiterführend
die
Apoptoserate in einer primären Zellkultur ein Maß zur Viabilität des Kultursystems
darstellen.
Bei der Isolation der Hepatozyten durch die Two-Step-Kollagenaseperfusion werden
die Zell-Zell-Kontakte gelöst. Die Aufhebung dieser Kontakte löst eine zelluläre
Antwort aus, die durch die mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) vermittelt wird.
Die Hepatozyten treten von dem Ruhestatus G0 in die G1 Phase ihres Zellzyklus
über. Dieser vermittelt die Produktion von Protoonkogenen. Gleichzeitig wird eine
entzündliche
Reaktion
induziert,
welche
zusätzlich
durch
die
zwangsläufig
vorkommende Ischämie und Reperfusion begünstigt wird. Auch Verunreinigungen in
der Kollagenase wie Lipopolysaccharide (LPS) fördern eine Entzündungsreaktion der
Hepatozyten (Elaut et al., 2006; Malhi et al., 2006). Vinken et al. (2011) haben
nachgewiesen, dass es während der Kultivierung im Monolayer zwei Höhepunkte an
Zelltod in den kultivierten Primärzellen gibt. Dabei kommen sowohl Apoptose als
auch Nekrose als Formen des Zelltodes vor. Die erste Welle ereignet sich zu einem
sehr frühen Zeitpunkt der Kultivierung und lässt sich aus den entstandenen
Zellschäden während der Isolation erklären. Hierbei spielt eine spezielle Form der
Apoptose, die sogenannte Anoikis, die durch den Verlust von Zell-Matrix Kontakten
entsteht, eine große Rolle (Elaut et al., 2006; Zvibel et al., 2002). Die zweite Spitze
des Zelltodes registrieren die Forscher um den zweiten Tag in Kultur, welche durch
die Kulturbedingungen hervorgerufen wird (Vinken et al., 2011). Demnach eignet sich
die Untersuchung der Apoptoserate als Maß für die Stabilität der Zellen während der
Perfusion und auch nachfolgend in Kultur.
Es ist bekannt, dass ein spontaner Zelltod über einen extrinsischen (rezeptorvermittelten, Typ I) und einen intrinsischen (mitochondrien-vermittelten, Typ II)
Signalweg ausgelöst werden kann und eine entsprechende Signalkaskade nach sich
zieht (s. Abbildungen 3 und 5). Beim extrinsischen Signalweg binden spezifische
Liganden wie der Tumor-Nekrose Faktor α (TNFα), TNFα-ähnliche Apoptose-
19
Literatur
induzierenden Liganden (TRAIL) und der Fas-Ligand/CD95 an entsprechende
Rezeptoren auf der Membranoberfläche und induzieren damit die Spaltung von
Procaspase 8 (Decrock et al., 2009; Malhi and Gores, 2008; Paraskevas et al., 1997;
Schulze-Bergkamen et al., 2006; Yoon and Gores, 2002). Die aktivierte Caspase 8
führt direkt zur Aktivierung der Effektor-Caspase-3, durch welche schließlich die
Exekutionsphase der Apoptose eingeleitet wird (Walczak and Krammer, 2000;
Wieder et al., 2001). Hepatozyten zählen zu den sogenannten Typ-II Zellen, das
heißt, sie besitzen nur geringe Mengen an aktivierter Caspase 8 und müssen den
mitochondrialen Weg zur Signalamplifizierung aktivieren. Die aktivierte Caspase 8
spaltet hierzu das proapoptotische Bid-Protein (BH3 interacting domain death
agonist). Das entstandene Spaltprodukt tBid (truncated Bid) wandert in die
Mitochondrienmembran ein (Luo et al., 1998), und es kommt zu einer Freisetzung
proapoptotischer Moleküle wie Cytochrom C (Malhi and Gores, 2008; Malhi et al.,
2006; Orrenius et al., 2011). Dieses spaltet zahlreiche zelluläre Proteine, unter
anderem
Proteine
phänotypischen
des
Zytoskeletts.
Apoptosemerkmalen
Dies
wie
führt
zu
Auswölbung
den
charakteristischen
der
Plasmamembran,
Schrumpfen der Zellen, Kondensation des Zellkerns und des Zytoplasmas und
Bildung von sogenannten Apoptose-Körperchen (Decrock et al., 2009; Malhi and
Gores, 2008; Malhi et al., 2006; Schulze-Bergkamen et al., 2006; Wieder et al.,
2001).
2.3.2.1 BCL-xL und BAX
Die Proteine BCL-xL und BAX gehören zur BCL-2-Familie. Namensgeber dieser
Familie ist das BCL-2, das erstmals 1985 als ein Onkogen aus einem humanen BZell-Lymphom isoliert wurde (Bakhshi et al., 1985; Tsujimoto et al., 1985). Basierend
auf ihrer genetischen Sequenzhomologie und der Fähigkeit an BCL-2 zu binden sind
immer neue verwandte Proteine isoliert worden, die der BCL-2-Familie zugeordnet
werden (Adams and Cory, 1998). Zurzeit gehören 25 Proteine der BCL-2 Familie bei
20
Literatur
Säugetieren an (Cory and Adams, 2002). Einige Mitglieder der Familie fördern die
Apoptose, während andere sie verhindern. Deshalb werden die Proteine in antiapoptotische und pro-apoptische Proteine unterteilt. Die BCL-2-Familie bildet eine
kritische intrazelluläre Kontrollstelle der Apoptose, wobei das Verhältnis von antiapoptotischen und pro-apoptotischen Proteinen von entscheidender Rolle ist (Chao
and Korsmeyer, 1998; Zucchini et al., 2005). Die BCL-2-Familie reguliert die
Apoptose
durch
induzieren
oder
inhibieren
des
programmierten
Zelltodes
entsprechend eines vorangegangenen Reizes (Alibek et al., 2014).
Das BCL-xL (B-cell lymphoma-extra large oder BCL2-like 1 isoform 1) gehört zu den
anti-apoptotisch wirkenden Onkoproteinen (Alibek et al., 2014). Zusammen mit BCL2 ist es in der Membran der Mitochondrien sowie des endoplasmatischen Retikulums
lokalisiert. Wie verschiedene Studien belegen konnten, verhindern die mitochondrial
gelegenen BCL-xL Proteine die Freisetzung von Apoptose-assoziiertem Cytochrom P
(Kluck et al., 1997) und Apoptose-induzierenden Faktoren (Susin et al., 1996) aus
dem Intermembranraum der Mitochondrien in das Cytoplasma (Tsujimoto, 1998).
Untersuchungen von Liu et al. (1996) und Susin et al. (1996) konnten zeigen, dass
Cytochrom P und apoptose-induzierende Faktoren direkt die Aktivierung von
Caspase 9 vermitteln, wenn sie in das Zytoplasma gelangen. Das BCL-xL besitzt im
Gegensatz zum BCL-2 die Fähigkeit direkt mit dem Cytochrom P zu interagieren
(Kharbanda et al., 1998; Mahajan et al., 1998). Dadurch kann dessen Freisetzung
aus den Mitochondrien verhindert werden. Das BAX Protein gehört zu den proapoptotischen Mitgliedern der BCL-2-Familie. Es handelt sich um ein Homodimer,
besteht aus 192 Aminosäuren und weist acht unterschiedliche Isoformen auf.
Verschiedene in vitro-Studien an isolierten Mitochondrien belegen, das BAX die
Freisetzung von Cytochrom P aus den Mitochondrien induziert (Narita et al., 1998;
Reed et al., 1998). BCL-2 ist der Hauptinhibitor von BAX (Sato et al., 1994). BCL-2
bindet an BAX und neutralisiert somit seine Aktivität. Das Verhältnis von BCL-2 und
BAX determiniert somit die Antwort auf ein apoptotisches Signal. Beide Proteine
agieren als ein Kontrollpunkt des Zelltodes, bevor Caspasen aktiviert werden und es
zu irreversiblen Zellschäden kommt (Chao and Korsmeyer, 1998). Verschiedene
Studien zeigen einen Anstieg von BAX innerhalb von 15 Minuten nach Beginn der
21
Literatur
Zellisolierung (Kucera et al., 2006; Wang et al., 2003). Zudem wandert es zusammen
mit der Caspase 9 kurz nach der Zellisolierung vom Zytoplasma in den Zellkern
(Nipic et al., 2010). Vinken et al. (2011). konnten einen deutlichen Anstieg von BAX,
BID und Caspase 3 kurz nach der Kultivierung von Rattenhepatozyten in einem
Monolayer auf einer Plastikoberfläche zeigen.
2.3.2.2 Fas-Ligand und Fas-Ligand Rezeptor
Der Fas-Rezeptor (FasR, CD95, APO-I) ist ein Typ I Transmembran Protein, welches
zur Familie der Tumor-Nekrose Faktor(TNF)/Nerve Growth Faktor (NGF)-Rezeptoren
gehört. Er besitzt drei cysteinreiche Wiederholungssequenzen in der extrazellulären
Proteindomäne, welche für die Ligandenbindung verantwortlich sind (Nagata, 1996).
Der Fas-Rezeptor wird auf einer Vielzahl von Zellen exprimiert, darunter auch
aktivierte T- und B-Lymphozyten, Hepatozyten und Epithelzellen des Ovars und des
Dünndarms (Nagata and Golstein, 1995; Suda et al., 1995).
Die spezifische Bindung des Fas-Liganden (FasL) an seinen Rezeptor führt zu einer
Trimerisierung der bis dahin als Monomere vorliegenden FasR-Moleküle. Diese
Trimerisierung ist entscheidend für die Wirkung des Rezeptors (Ware et al., 1996).
Die intrazelluläre Domäne des Rezeptors besteht aus 80 Aminosäuren und wird als
„Death Domaine“ bezeichnet. Diese erlaubt nach der Trimerisierung die Freisetzung
eines „death-inducing signaling complex“ (DISC) (Medema et al., 1998). Dieser
Komplex führt über einige Zwischenstufen zur Aktivierung von Caspase 8 (Sharma et
al., 2000), und diese Aktivierung wiederum zur Induktion von Apoptose.
2.3.3 Studien an primären bovinen Hepatozyten
Viele in der Literatur veröffentlichte Studien an primären bovinen Hepatozyten
beschäftigen sich mit dem Metabolismus der Zellen sowie hormonellen und
nahrungsabhängigen Effekten auf die Zellfunktion und der Signaltransduktion. In
22
Literatur
einer Veröffentlichung von Lemley and Wilson (2010) wird der Effekt von Cytochrom
P450 und von Aldo-Keto Reduktase Inhibitoren auf die Inaktivierung von Progesteron
untersucht. Auch xenobiotische Einflüsse auf Leberzellen sind Bestandteil von
Studien (Klooster et al., 2008; Shull et al., 1986). Ebenso zahlreich lassen sich
Studien zur Verbesserung der Vitalität durch modifizierte Isolationstechniken und
Kulturbedingungen finden. Dabei werden an den primären Hepatozyten neben der
Morphologie vor allem Stoffwechselleistungen der Zellen wie die Produktion von
Harnstoff, LDH und Albumin aus dem Mediumüberstand der Zellkultur charakterisiert
(Zhang et al., 2012). Donkin and Armentano (1993) führten eine Studie an bovinen
Hepatozyten durch bei der sie die Glukoneogenese- sowie Harnstoffrate der Zellen
vergleichend zwischen Monolayer und Hepatozyten in Suspension analysiert haben.
Im Monolayer verringerte sich die Glukoneogeneserate sowie Harnstoffproduktion
nach 120 h. In Suspension konnte keine Harnstoffproduktion nachgewiesen werden
(Donkin and Armentano, 1993). Jiang et al. (2013) bestimmen Albumin an isolierten
und kultivierten Hepatozyten mittels Immunhistochemie und Western Blot um die
Viabilität einzuschätzen. Bei Untersuchungen an Büffelhepatozyten analysieren
Panda et al. (2015) die Morphologie und Polarität der Zellen, sowie hepatozytenspezifische Markergene oder -proteine wie Albumin, Glucose-6-Phosphatase,
Tyrosin
Aminotransferase,
Cytokeratin
und
α1-Antitrypsin
mit
Hilfe
von
Immunfluoreszenz und Western Blotting. Sie untersuchen dabei die Vitalität der
Zellen nach Kultivierung auf unterschiedlich beschichteten Platten über fünf Tage in
Kultur (Panda et al., 2015). Ein weiterer Studienschwerpunkt an bovinen primären
Hepatozyten beinhaltet pharmazeutische und toxikologische Studien. In einer Studie
von Giantin et al. (2012) werden Untersuchungen zur Charakterisierung des
Metabolismus von Hepatozyten nach Verabreichung von illegalen Steroiden und
Prohormonen zur Wachstumsbeschleunigung, deren Einsatz in Europa in der
Rindermast verboten ist, analysiert. Die Forscher verwenden für ihre Studien eine
Monolayerkultur über zwei Tage (Giantin et al., 2012). Weitere Studien zur Analyse
des Metabolismus und der Bioaktivität boviner Hepatozyten nach Steroidzugabe sind
veröffentlicht (Clouet et al., 1998; Merlanti et al., 2007; Wang et al., 2012).
23
Literatur
Allerdings
finden
sich
bisher,
nach
eingehender
Literaturrecherche,
keine
spezifischen Studien über die Vitalität von bovinen Hepatozyten im Vergleich
zwischen Monolayer und Sandwichkultur aus Schlachthofmaterial. Überdies sind,
speziell beim Rind, keine endokrinologischen Untersuchungen an Hepatozyten zur
Expression des GHR bekannt. Diese sind Gegenstand der hier beschriebenen
Dissertation.
Kürzlich wurde in der Literatur eine bovine Zelllinie veröffentlicht (Gleich et al., 2016).
Diese Zelllinie stammt von fetalen bovinen Hepatozyten, welche mit einem
retroviralen Vektor transduziert wurden. Der Einsatz dieser Zelllinie sollte im Hinblick
auf die Expression dieser Zellen von GHR und IGF-I überprüft werden. Studien an
HepG2 Zellen zeigten, dass diese eine Überexpression von IGF-I und IGF-II zeigen,
und für den Einsatz für Studien am GHR nicht verwendet werden können (Mense,
2014).
24
Literatur
2.4
Wachstumshormonrezeptor und Insulin-like Growth Faktor
2.4.1 Struktur und Funktion des Wachstumshormonrezeptors
Der Wachstumshormonrezeptor (GHR) gehört zur Familie der Cytokinrezeptoren,
und ist ein transmembranes Glykoprotein, welches beim Rind und Schaf aus 616
Aminosäuren besteht (Mensch 620 Aminosäuren). Er vermittelt die Wirkungen des
Wachstumshormons (GH), welches aus der Hypophyse pulsatil freigesetzt wird und
in der Blutbahn frei oder gebunden zirkuliert (Baumann et al., 1986; Butler et al.,
2003). Der Rezeptor setzt sich aus einer extrazellulären, hormonbindenden Domäne,
einer transmembranen Region sowie einer zytoplasmatischen Domäne zusammen
(Kelly et al., 1991). Beim Rind wurden bislang neun GHR mRNA Transkripte
beschrieben, das GHR 1A – 1I (Jiang and Lucy, 2001). Diese bilden die Grundlage
für die Proteinbiosynthese an den Ribosomen (Kobayashi et al., 1999). Der GHR
wird in höchster Dichte in der Leber aber auch im Fettgewebe exprimiert. Zudem
wurde GHR mRNA im Darm, Herz, Skelettmuskulatur, Gehirn, Niere und
Hodengewebe nachgewiesen (Frick et al., 1990; Mathews et al., 1989). In diesen
Studien konnte allerdings kein mRNA Transkript in Milz und Thymus der Ratte
detektieret werden. Innerhalb eines Gewebes ist die Expression des GHR abhängig
vom Entwicklungsstand des Individuums (Adams et al., 1990; Mathews et al., 1989),
vom Ernährungszustand (Dauncey et al., 1994) und unterliegt anderen endokrinen
Einflüssen (Butler et al., 2003; Kobayashi et al., 1999). Für die Expression des GHR
in der Leber der erwachsenen Milchkuh ist vor allem die Expression des GHR1AmRNA Transkripts von Bedeutung, welches die Hälfte der gesamt GHR mRNA
repräsentiert und bei Rindern leberspezifisch ist (Jiang and Lucy, 2001; Kobayashi et
al., 1999). In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass der GHR in
höherer Anzahl an Membranen vorkommt, die mit intrazellulären Strukturen in
Kontakt stehen, im Vergleich zur Plasmamembran (Hocquette et al., 1989; Picard
and Postel-Vinay, 1984). Ontogenetische Studien des GHR zeigten, dass in
25
Literatur
neugeborenen Ratten die Expression des GHR sehr gering war. In der postnatalen
Entwicklung stiegen die Werte bis zu einem maximalen Level in der 5.-8.
Lebenswoche der Ratten (Mathews et al., 1989). Ebenso konnte nachgewiesen
werden, dass es zwischen männlichen und weiblichen Ratten keine Unterschiede in
der Expression des GHR in der Leber gibt. In vivo Studien an Ratten belegen, dass
die Konzentration des GHR mRNA Transkriptes nicht durch Hypophysektomie oder
GH-Behandlung beeinflusst wird. Die Forscher vermuten demnach eine Regulation
des GHR auf
posttranskriptionaler Ebene. Zudem
scheint die Regulation
gewebespezifisch zu sein, denn nach Hypophysektomie zeigten sich ansteigende
GHR-mRNA Werte in der Skelettmuskulatur, aber sinkende Werte im Fettgewebe
(Kelly et al., 1991; Mathews et al., 1989).
Durch Bindung eines GH Moleküls an der extrazellulär gelegenen Domäne kommt es
zu einer Dimerisierung zweier GHR Monomere (Cunningham et al., 1991; de Vos et
al., 1992; Frank, 2002). Die Dimerisierung des GHR löst einen JAK-STATSignaltransduktionsweg aus (Argetsinger and Carter-Su, 1996; Zhu et al., 2001),
welcher in der Ausschüttung von IGF-I und wahrscheinlich auch IGF-II resultiert
(Frago and Chowen, 2005). Neben dem JAK-STAT-Weg werden auch der mitogenactivated
protein
kinase
(MAPK)-
Signaltransduktionsweg,
und
der
Phophatidylinositol-3-kinase-Signaltransduktionsweg (PI3) vorrangig durch das GH
an den Leberzellen aktiviert, wie verschiedene Studien an Rattenhepatozyten zeigten
(Beauloye et al., 2002; Murray et al., 2004; Ram et al., 1996).
2.4.2 Insulin-like Growth Faktor I
Der dem GHR nachgeschaltete Signaltransduktionsweg führt zur Synthese und
Freisetzung von IGF-I aus den Leberzellen (Frago and Chowen, 2005). Erstmals
wurde das IGF-I im Jahre 1978 durch Rinderknecht und Humbel auf gereinigt und
extrahiert (Rinderknecht and Humbel, 1978). Der Terminus „insulinähnlich“ wurde
gewählt, da IGF-I wie Insulin die Glukoseaufnahme in Fett- und Muskelzellen
26
Literatur
stimuliert und bis zu 50% Übereinstimmung in der Struktur zu Insulin aufweist
(Blundell et al., 1983; Rinderknecht and Humbel, 1978). Durch diese Ähnlichkeit ist
IGF-I in der Lage, nicht nur an spezifische IGF-Rezeptoren zu binden sondern auch
an den Insulin-Rezeptor. Die Bindungsaffinität ist allerdings im Vergleich zu Insulin
eingeschränkt (Steele-Perkins et al., 1988).
In verschieden wissenschaftlichen Arbeiten wurde dargestellt, dass IGF-I für das
Zellwachstum, die intrauterine Entwicklung des Embryos und Fetus sowie besonders
für das postnatale Wachstum wichtig ist (Grimberg and Cohen, 2000; Lassarre et al.,
1991; Valentinis and Baserga, 2001).
Die Produktion von IGF-I findet bereits in fetalen Geweben statt und setzt sich
postnatal fort (D'Ercole, 1996). Yakar et al. (1999) zeigten, dass die Synthese und
Sekretion von IGF-I fetal wie auch postnatal zu 75 % in der Leber stattfindet. Die
restlichen 25% werden unter anderem in der Niere, der Muskulatur und im
Fettgewebe gebildet und in das Blut abgegeben (Yakar et al., 1999).
Das im Blut zirkulierende IGF-I wird an spezifischen Bindungsproteinen (IGFBP)
transportiert, wobei bisher sechs verschiedene IGFBPs mit hoher Affinität für IGF-I
nachgewiesen wurden (Hwa et al., 1999; Rajaram et al., 2011).
Der größte Anteil von IGF-I bildet im Blut einen Komplex mit dem Bindungsprotein
IGFBP-3 und einem zweiten Protein, der „acid labile subunit“ (ALS) (Spagnoli and
Rosenfeld, 1996). Als Funktion der Bindung von IGF an IGFBPs wird in der Literatur
die Verlängerung der Halbwertszeit, durch Schutz des Komplexes vor Proteolyse
genannt (Guler et al., 1989). Zudem vermindert die Bindung an IGFBP den
hypoglykämischen Effekt von freiem IGF-I, der durch die Wirkung von freiem IGF auf
Insulinrezeptoren vermittelt wird (Baxter and Daughaday, 1991).
Zu den vielfältigen Wirkungen von IGF-I gehört die Beeinflussung des Zellwachstums
und der Zellproliferation, der eine Beschleunigung des Zellzyklus, inklusive der
Mitose, zugrunde liegt. Die IGF-I Konzentration im Blut wird als ein Indikator für die
Energiebilanz bei Kühen beschrieben (Spicer et al., 1990). In einer Studie von Breier
et al. (1991) wurde nachgewiesen, dass während einer anabolen Stoffwechsellage,
durch IGF-I die Konzentration von Triglyceriden, freien Fettsäuren (FFS) und
Ketonkörpern (BHB) gesenkt und die Aufnahme von Aminosäuren in die Muskulatur
27
Literatur
gesteigert
wird.
Des
Weiteren
konnte
gezeigt
werden,
dass
IGF-I
die
Glukoseaufnahme in das Gewebe erhöht und die GH- und Glukagon-Ausschüttung
im Sinne eines negativen Feedbacks hemmt (Heemskerk et al., 1999). Liegt eine
katabole Stoffwechsellage vor, so kommt es nach Breier (1991) zu einer GHResistenz im Gewebe und in Folge zu einer geringeren IGF-I Konzentration im Blut
wodurch Glukose und FFS für die metabolische Homöostase (z.B. Laktogenese) und
nicht für Zellwachstum und Proliferation verwertet werden.
2.4.3 Besonderheiten bei der peripartalen Milchkuh
Hochleistungsmilchkühe entwickeln in den letzten drei Wochen der Trächtigkeit eine
hepatische Wachstumshormonresistenz (Escalada et al., 1997; Lucy et al., 1998).
Hierbei sinkt die Ansprechbarkeit des GHR auf das GH und die Hepatozyten
produzieren in Folge geringere Mengen an IGF-I (Piechotta et al., 2014; Radcliff et
al., 2003b). Man spricht hier von einer Entkopplung der somatotropen Achse (Lucy
et al., 2001). Bereits zwei Wochen ante partum sinkt die Expression des
leberspezifischen GHR1A-Transkriptes deutlich ab, während die Expression der
anderen GHR-Subtypen gleich bleibt (Radcliff et al., 2003a). Auch eine Reduktion
der IGF-I Konzentration im Blut wurde bereits 3-2 Wochen ante partum gemessen
(Piechotta et al., 2012). Radcliff et al. (2003b) fassen zusammen, dass die
Verminderung der GHR1A-Transkription einen endokrinen Mechanismus darstellt,
der durch Verlust des negativen Feedbacks durch IGF-I an der Hypophyse zu einer
erhöhten GH-Aussschüttung beiträgt, welche für die Lipomobilisation während der
Laktogenese der Milchkuh notwendig ist. Welche Faktoren peripartal in der Leber
einen Einfluss auf die bestehende Verminderung des IGF-I haben, ist bislang nicht
hinreichend geklärt. Basierend auf Ergebnissen von Ratten, die ebenfalls eine
Entkopplung der somatotropen Achse ante partum zeigen, vermutet man ebenso
einen Einfluss von hohen Steroidhormonkonzentrationen (17-ß Östradiol) sowie
proinflammatorischen Zytokinen (Escalada et al., 1997; Piechotta et al., 2014). Auch
wird Insulin als ein wichtiger Faktor angesehen, der bei der GHR-Expression eine
Rolle spielt (Butler et al., 2003; Kobayashi et al., 1999).
28
Literatur
Hier gestalten sich in vivo Untersuchungen schwierig, da nicht einzelne Faktoren
gezielt untersucht werden können. Aus diesem Grund ist Ziel der hier beschriebenen
Dissertation, die GHR und IGF-I Produktion in bovinen primären Hepatozyten näher
zu charakterisieren.
2.4.4 In vitro Studien an Hepatozyten zum GHR und IGF-I
Untersuchungen an Zellkulturen, die speziell zum GHR durchgeführt wurden finden
sich
in
der
Literatur
bislang
nur
wenig.
Für
Untersuchungen
des
Signaltransduktionsweges des GHR wurde eine Osteosarkom-Zelllinie von Ratten
verwendet. Allerdings exprimiert diese Zelllinie unphysiologisch hoch affine GHRezeptoren (Gerland et al., 2000). Des Weiteren finden sich Untersuchungen an
primären Rattenhepatozyten, die den Einfluss von Zink auf die mRNA Expression
von IGF-I und GHR untersuchen (Lefebvre et al., 1998). Eine Verminderung von
verfügbarem Zink führte hier zu einer ansteigenden GHR Expression und
unveränderter IGF-I Expression. An porcinen Hepatozyten wurde der hormonelle
Einfluss von Schilddrüsenhormonen (T4, T3) sowie Dexamethason auf die mRNAExpression von IGF-I und GHR dargestellt und man konnte zeigen, dass nach
Zugabe von Dexamethason ein Anstieg von GHR und IGF-I mRNA-Transkripten
erfolgte. Die Zugabe von T4 und T3 verursachte in Kombination mit Dexamethason
ebenfalls einen Anstieg von GHR mRNA, die IGF-I-mRNA verzeichnete allerdings mit
Addition von T4 einen leichten Rückgang (Brameld et al., 1995). Eine Studie an
bovinen primären Hepatozyten wurde über den Effekt von IGF-I auf die
Gluconeogenese an Kälberhepatozyten durchgeführt (Wang et al., 2012). Die
Autoren untersuchten den Einfluss von IGF-I auf die an der Gluconeogenese
beteiligten Enzyme Pyruvatcarboxylase und Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und
konnten im Monolayer nach 72 Stunden eine Reduzierung der Enzymaktivitäten bei
erhöhter
IGF-I
Konzentration
29
nachweisen.
Material und Methoden
3
Material und Methoden
Die Dissertation gliedert sich in einen Vorversuch mit einem gut etablierten Protokoll
zur Isolierung und Kultivierung von primären Rattenhepatozyten sowie der
Etablierung eines Protokolls zur Gewinnung von bovinen primären Hepatozyten aus
Schlachthofmaterial, dem ein Vorversuch mit einem humanen Isolationsprotokoll
vorweg geht.
3.1
Vorversuch primäre Rattenhepatozyten
3.1.1 Isolation der primären Rattenhepatozyten
Die Isolierung von primären Rattenhepatozyten erfolgte am Leibniz Institut für
Arbeitssicherheit der TU Dortmund (IFADO), in der Arbeitsgruppe von Herrn Prof.
Hengstler unter der Anleitung von Frau Regina Stoeber, MSc.
3.1.1.1 Verwendetes Tier
Für die Isolation der primären Hepatozyten wurde eine männliche Wistar-Ratte mit
einem Gewicht von 180 g verwendet. Das Tier wurde von Charles River, Sulzfeld
Deutschland bezogen. Es hatte freien Zugang zu Wasser und Futter (ssniff
Spezialdiäten, Soest, Deutschland), wie in der Arbeit von Hengstler et al. (2000)
angegeben.
3.1.1.2 Chirurgische Vorbereitung und Geräteaufbau
Der chirurgische Ablauf zur Leberperfusion der Ratte basiert auf der Arbeit von Per
O. Seglen (Seglen, 1976) und wurde wie folgt modifiziert:
30
Material und Methoden
Das Tier wurde mit Xylazin, 20 mg/kg (Rompun 2%, Bayer, Leverkusen,
Deutschland) und Ketamin, 120mg/kg (Ratiopharm, Ulm, Deutschland) anästhesiert.
Die Applikation erfolgte per injectionem intraperitoneal.
Durch Kontrolle des Lidreflexes und Testen auf Schmerzempfindlichkeit (durch
Setzen eines Schmerzreizes mit einer Kanüle an einer Hinterpfote) wurde die Tiefe
der Narkose sichergestellt und das Tier in dorsaler Lage an allen vier Extremitäten
fixiert. Um eine aseptische Umgebung zu schaffen wurde das Abdomen mit 70%
Ethanol durch Sprühdesinfektion desinfiziert.
Die Eröffnung der Bauchdecke erfolgte durch einen longitudinalen Schnitt entlang
der Linea alba ausgehend von der suprapubischen Region bis cranial in den Bereich
der Axillae ohne das Peritonaeum zu verletzen. Danach wurde die Bauchdecke
vorsichtig vom Peritonaeum abgelöst, und dorsolateral zu den Hinterläufen
eingeschnitten.
Das Peritonaeum sowie das bislang verwendete chirurgische Besteck wurden im
Anschluss mit 1xPBS abgespült um ein sauberes OP-Feld zu erhalten und
anhaftende Haare zu entfernen.
Anschließend wurde das Peritonaeum mit einer chirurgischen Pinzette nach ventral
angehoben und mit einem Schnitt von der suprapubischen Region bis zum Sternum
longitudinal eröffnet. Hierbei wurde darauf geachtet, dass die Leber und andere
Organe nicht verletzt wurden. Im Folgenden wurde dieser Longitudinalschnitt durch
weitere Transversalschnitte im Bereich des Rippenbogens und der Hinterläufe
erweitert.
Der Magen-Darm-Trakt des Tieres wurde komplett nach links aus dem Tierkörper
hinaus verlagert um einen Zugang zur Vena portae zu erhalten. Um die Perfusion
durch die V. portae zu ermöglichen, wurde zunächst maximal distal zur Leber eine
Ligatur lose vorbereitet, die zum Halten der V. portae dient. Proximal zur Leber hin
wurde eine zweite Ligatur in einem Abstand von ungefähr 5mm zur ersten Ligatur
gesetzt, aber nicht fest angezogen. Die V. portae wurde im Folgenden zwischen
beiden Ligaturen angeschnitten und eine abgestumpfte Kanüle (20G x 1½, 0,9 x
40mm, B.Braun Sterican, Melsungen, Deutschland) durch die entstandene Öffnung
in die Vene in einem flachen Winkel eingeführt. Die Kanüle wurde durch die
31
Material und Methoden
proximale Ligatur hindurchgeführt und diese dann zur Fixierung der Kanüle fest
angezogen. Wenn die Kanüle richtig positioniert ist, entfärbt sich die Leber sofort.
Durch eine folgende Durchtrennung der Vv. jugulares wird einem zu hohen Druck in
den Hepatozyten sowie im Tierkörper während der Perfusion vorgebeugt. Die beiden
Perfusionspuffer, deren Protokolle im Anhang zu finden sind, laufen während der
Isolation in eine Schale unter dem Tierkörper ab.
Die Perfusion der Rattenleber erfolgte in einem nicht-rezirkulierenden System. In
dem hier beschriebenen Versuch wurde als Perfusionspumpe ein kommerziell
erhältliches Infusionssystem (Volumat Agilia, Fresenius Kabi, Bad Homburg,
Deutschland) genutzt, das die Verwendung von Einmalmaterial erlaubt. Zudem
wurden die Lösungen nicht vorgewärmt, da ein Inline-Heizsystem (SAHARA inline
System, Transmed Sarstedt, Bad Wuennenberg, Deutschland) integriert wurde, das
die Lösungen unmittelbar vor Eintritt in die Leber erwärmt.
3.1.1.3 Perfusion der Rattenleber
Alle hier verwendeten Puffer sind dem Anhang (Kapitel 9) zu entnehmen. Nach der
Fixierung der Perfusionsnadel in der V. portae wurde die Leber zunächst über 15 min
mit einem EGTA-haltigen Puffer gespült, der das Blut aus den Gefäßen entfernt und
durch den Entzug von Calcium-Ionen durch Komplexbildung zur irreversiblen Lösung
von Desmosomenverbindungen zwischen den Zellen führt. Die Durchflussrate des
Puffers wurde auf 15ml/min eingestellt. Im Anschluss wurde mit einem auf 37°C
vorgewärmten Kollagenase-Puffer perfundiert. Der Perfusionsfluss wurde hierbei
angepasst, wenn erkannt wurde, dass der Perfusionsdruck zu stark ansteigt. Hierfür
wurde der Flüssigkeitsstand im Druckausgleichsschlauch zu Beginn der Perfusion
markiert und beobachtet. Die Perfusion mit dem Kollagenase-Puffer wurde beendet,
als die Leber aufgequollen und weich erschien, einen kompletten Strukturverlust
aufwies und die Dispersion der Leberzellen deutlich zu erkennen war. Die
perfundierte Leber wurde nun vorsichtig aus dem Tierkörper herauspräpariert und in
eine sterile Petrischale mit Suspensionspuffer verbracht. Alle weiteren Schritte
32
Material und Methoden
wurden unter einer sterilen Werkbank und mit sterilen Instrumenten durchgeführt.
Zunächst wurde die Leberkapsel vorsichtig mit einem Skalpell und einer Pinzette
eröffnet und die Zellen durch vorsichtiges Hin- und Herschwenken der Leber in dem
Suspensionspuffer herausgelöst. Bei allen Schritten wurde darauf geachtet, dass die
Zellen möglichst geringen mechanischen Beanspruchungen ausgesetzt sind.
Die erhaltene Zellsuspension wurde anschließend durch ein 100µm Zellsieb gefiltert,
um anhängende Gewebereste zu entfernen. Die daraus erhaltene Zellsuspension ist
auf mehrere 50 ml Falcon-Röhrchen gleichmäßig verteilt worden und diese wurden
mit Suspensionspuffer auf 20 ml aufgefüllt. Im Folgenden wurden die Röhrchen bei
50xg für 5 min bei 4°C zentrifugiert. Die im Überstand verbliebenen NichtParenchymzellen wurden verworfen und das verbliebene Zellpellet in 10 ml
Suspensionspuffer aufgenommen. Danach erfolgte eine weitere Zentrifugation wie
oben beschrieben. Der Überstand wurde erneut verworfen und das Zellpellet in 5 ml
Suspensionspuffer resuspendiert. Die so gewonnenen Zellen wurden in einem 50 ml
Falcon-Röhrchen gepoolt und mit Suspensionspuffer auf 50 ml versehen. Da
gesunde und vitale Hepatozyten zur Agglutination neigen müssen sie durch
vorsichtiges Schwenken des Röhrchens resuspendiert werden. Die Zellsuspension
wurde bis zur Weiterverwendung auf Eis aufbewahrt.
3.1.1.4 Zellzählung und Vitalitätsbestimmung
Für die anschließende Kultivierung der primären Rattenhepatozyten wurden die
Zellzahl pro ml sowie die Viabilität der Zellen ermittelt. Dies erfolgte mittels einer
Zellzählung in einer Neubauer-Zählkammer (0,0025mm2/Kästchen, Tiefe 0,1 mm;
Rainer Medizintechnik, Frensdorf, Deutschland) sowie einer Färbung der toten Zellen
mit Trypanblau (Biochrom, Berlin, Deutschland). Trypanblau färbt Zellen blau, deren
Zellwand nicht mehr intakt und somit für den Farbstoff durchlässig ist. Die Zellwand
noch vitaler Hepatozyten hingegen ist nicht permeabel für Trypanblau und intakte
Zellen erscheinen somit farblos.
33
Material und Methoden
Es wurden 450 µl der Zellsuspension mit 50 µl Trypanblau vermischt und davon
jeweils 10µl in die beiden Kammern der Zählkammer gegeben. Insgesamt wurden 8
Eckquadrate ausgezählt. Dabei wurden die Gesamtzahl sowie die Anzahl an toten
und lebenden Zellen gezählt.
Die Bestimmung der Zellzahl pro ml und die Viabilität wurden nach folgender
Formeln ermittelt:
Zellen pro ml = gezählte Zellen x 104 x Verdünnungsfaktor
Viabilität (%) = lebende Zellen x 100
tote Zellen
3.1.2 Kultivierung der Rattenhepatozyten
3.1.2.1 Sandwich Kultur
Die frisch isolierten primären Rattenhepatozyten wurden in Folge in Kultur
genommen. Hierfür wurde eine Sandwich Kultur verwendet, bei der die Zellen
zwischen zwei Lagen von Kollagen kultiviert werden (s. Abbildung 3).
Abbildung 3: Schematische Darstellung einer Sandwich Kultur
Zur Herstellung der Sandwich Kulturen wurden 18 6-well-Platten (Sarstedt,
Nümbrecht, Deutschland) im Vorfeld mit einer Kollagenschicht vorbeschichtet. Dazu
wurden 10 mg Kollagen Typ I (Fa. Roche, Deutschland) in 12 ml steriler 0,2%
Essigsäure gelöst, 1,2 ml 10x DMEM (Sigma, St. Louis, USA) zugesetzt und mit 1 M
34
Material und Methoden
NaOH-Lösung bis zum Farbumschlag von gelb auf pink neutral titriert. Diese Schritte
erfolgten auf Eis um einer vorzeitigen Gelbildung vorzubeugen. Von dieser Lösung
wurden 250 µl in jedes Well der 6-well-Platten pipettiert, die Platten kurz geschwenkt
und über Nacht bei Raumtemperatur bis zur Gelbildung stehengelassen.
In jedes Well wurden vor der Einsaat der frisch isolierten Hepatozyten 3 ml
Vollmedium (s. Anhang S.144) vorgelegt und die Zellen in einer Konzentration von
jeweils 1x106 Zellen pro Well ausplattiert. Nach einer 3-stündigen Adhäsionszeit im
Inkubator bei 37°C und 5% CO2 wurden die Zellen zweimal mit reinem Williams E
Medium ohne Zusätze gewaschen und anschließend die zweite Schicht Kollagen Typ
I (250µl) in o.a. Weise hinzugefügt. Zur Gelbildung wurden die Platten dann 45 min
bei 37°C in den Inkubator gestellt und anschließend mit jeweils 2 ml serumfreien
Mediums (s. Anhang S.144) in jedem Well überdeckt.
Im Folgenden wurden die Kulturplatten in einen transportablen Inkubator bei 37°C
und 5% CO2 verbracht und nach Hannover transportiert.
Dort wurden die Platten unverzüglich in einen Brutschrank (Panasonic, SANYO North
America Corporation, San Diego, USA), ebenfalls bei gleichen Bedingungen
verbracht, wo sie über die gesamte Versuchsdauer von sieben Tagen verblieben.
Jeden zweiten Tag erfolgte ein Medienwechsel mit jeweils 2 ml serumfreiem Medium
(s. Anhang S).
3.1.2.2 Morphologische Untersuchungen
An jedem Versuchstag wurde eine morphologische Untersuchung der Zellen unter
dem Mikroskop (Olympus, Tokio, Japan) bei einer 100- fachen Vergrößerung
durchgeführt. Dabei wurden die Zellen pro Gesichtsfeld ausgezählt sowie deren
Form beurteilt. Es erfolgte hierbei eine Einteilung in rund, polygonal, eckig oder
gestreckt. Zudem wurden Anzahl und Form der Zellkerne betrachtet, das
Vorhandensein von Zell-Zell-Kontakten sowie die Ausbildung und Anzahl von
vermuteten Canaliculi pro Gesichtsfeld (s. Anhang Protokoll 4).
35
Material und Methoden
3.1.2.3 Probenentnahme
Die Entnahme von Zell-und Mediumproben aus der Zellkultur erfolgte an den Tagen
1, 2, 3, 4 und 7. Der Tag der Isolation und Ausplattierung der Zellen wurde als
Versuchstag 0 bezeichnet. An Versuchstag 0 wurden direkt aus der gewonnenen
Zellsuspension, die anschließend in Kultur genommen wurde, jeweils 1 ml mit einer
Pipette aufgenommen und in mehrere Eppendorfgefäße (Sigma Aldrich, Biochemie
GmbH, Hamburg, Deutschland) gegeben, die zunächst auf Eis gelagert wurden.
Nach dem Transport nach Hannover wurden die Proben 2 min bei 13000g
zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet bei - 80°C eingefroren.
Für die Entnahme von Mediumproben aus der Zellkultur ab Versuchstag 1 wurden
aus dem entsprechenden Well 1 ml des Mediums vorsichtig abpipettiert und in ein
1,5ml Eppendorfgefäß gegeben. Folgend wurde für die Gewinnung der Zellprobe aus
dem gleichen Well der noch verbliebene Rest des Mediums bis auf eine geringe
Menge abpipettiert und verworfen. Mit einem Zellschaber (Biochrom GmbH, Berlin,
Deutschland) wurde das Kollagen nun mechanisch aus dem Well gelöst und
anschließend aus dem Well entnommen. Da sich die Hepatozyten zwischen den
Kollagenschichten befinden, ist es wichtig, das gesamte Kollagen aus dem Well zu
entnehmen. Die Probe wurde infolge in ein Eppendorfgefäß verbracht und 2 min bei
13000g
zentrifugiert
(MiniSpin
plus
Tischzentrifuge;
Eppendorf,
Hamburg,
Deutschland)). Der Überstand wurde verworfen und das entstandene Pellet im
Eppendorfgefäß bei -80°C bis zur weiteren Analyse gelagert.
36
Material und Methoden
3.1.2.4 Stimulationsversuch mit Ratten-Wachstumshormon (rGH)
An den Versuchstagen 4 und 7 wurde jeweils ein Stimulationsversuch mit rGH
durchgeführt. Dafür wurde Medium vorbereitet, das eine rGH-Konzentration von
500ng pro ml enthielt (s. Anhang S. 144).
Aus denen für den Versuch benötigten Wells wurde das Medium abpipettiert und die
Wells einmal mit 1xPBS gewaschen.
Infolge wurde eine Hälfte der in den Versuch einfließenden Wells mit jeweils 2 ml des
mit
rGH
versetzen
Mediums
(+rGH)
versetzt,
die
andere
Hälfte
bekam
entsprechendes Medium ohne rGH Zusatz (-rGH). Die Platten wurden anschließend
zur Inkubation in den Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 verbracht.
Nach 20 min sowie nach 2 h Inkubationszeit erfolgte jeweils eine Entnahme von Zellund Mediumproben (siehe auch 3.1.2.3). Dabei wurden nach 20 min Inkubation 6
Wells mit rGH-Medium (+rGH 20 min) entnommen sowie 6 Wells mit Medium ohne
rGH (-rGH 20 min). Entsprechendes erfolgte nach 2 Stunden (+rGH 2h, -rGH 2h), (s.
Abbildung 7). Die Lagerung der Zell- und Mediumproben erfolgte bis zur Analyse bei
-80°C.
Abbildung 4: Schematischer Ablauf des rGH-Stimulationsversuches
37
Material und Methoden
3.2
Etablierung der Isolation und Kultivierung von primären bovinen
Hepatozyten aus Schlachthofmaterial
Zur Etablierung eines Protokolls für die Isolation primärer boviner Hepatozyten aus
Schlachthofmaterial wurden insgesamt 38 Lebern perfundiert. Von diesen kamen
sechs Lebern aus dem Schlachthof Hannover, und 32 vom Schlachthof MindenLübbecke (Westfleisch). Da der Zeitabstand zwischen Schlachtzeitpunkt und
Probennahme des Leberstückes in Minden-Lübbecke durch Produktionsprozesse
standardisiert bei 25 Minuten liegt, wurde dieser Schlachthof für die weiteren
Versuche ausgewählt. Von den 38 Lebern kamen 2 von weiblichen Tieren und 36
von Bullen der Rassen Holstein Friesian und Angus.
3.2.1 Vorversuch mit einem humanen Isolationsprotokoll
Im Vorfeld zur Etablierung der Isolation von primären bovinen Hepatozyten aus
Schlachthofmaterial wurde ein Vorversuch mit Schlachthofleber vom Rind mit einem
Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von humanen primären Hepatozyten
durchgeführt (Damm et al., 2013). Das Protokoll für diesen Vorversuch ist im Anhang
aufgeführt (Protokoll 1). Es wird an der Charité Berlin, Klinik für Allgemein-, Viszeralund
Transplantationsmedizin
für
die
Isolation
von
Leberzellen,
die
aus
Leberresektaten intra operationem entnommen werden, angewandt.
Für diesen Vorversuch wurde ein Stück einer Leber eines frisch geschlachteten
Rindes aus dem Schlachthof Hannover verwendet. Das Leberstück wurde mit einer
Schnittführung vom apikalen Rand des Processus caudatus der Leber entnommen,
wog ca. 60 g und wies nur an einer Seite eine Schnittfläche auf. Der Rest des
Leberstückes war von der Leberkapsel überzogen. An der Schnittfläche waren
kleinere und größere Gefäßanschnitte zu erkennen (s. Abbildung 5).
38
Material und Methoden
Abbildung 5: Darstellung einer optimalen Schnittführung eines Leberstückes zur Perfusion.
Erkennbar sind vier größere Gefäßanschnitte (gelber Pfeil) und eine Anschnittsfläche
Das Leberstück wurde unverzüglich nach Entnahme in ein Schraubglas mit
eisgekühlten Williams E Medium mit 10% FCS gegeben und auf Eis in eine
Styroporbox verbracht und mit dem Auto nach Berlin transportiert (Transportzeit 2h
40min).
Die Isolierung der Hepatozyten erfolgte an der Charité Berlin, Klinik für Allgemein-,
Viszeral- und Transplantationsmedizin, unter der Anleitung von Herrn Dr. Georg
Damm.
3.2.2 Etablierung der Isolation von primären bovinen Hepatozyten
3.2.2.1 Probennahme Schlachthof
Wie im Vorversuch beschrieben wurden die benötigten Leberstücke auf dem
jeweiligen Schlachthof vom Processus caudatus der Leber mit einem sauberen
Messer abgetrennt. Die Leberstücke durften nur eine Schnittfläche mit vier bis sechs
größeren Gefäßöffnungen aufweisen. Die anderen Seiten mussten von der
Leberkapsel umhüllt sein (s. auch Abbildung 5). Im Laufe der Etablierungsphase
wurden die Leberstücke zunächst in Williams E-Medium mit 20% FCS auf Eis
transportiert, später wurde das jeweilige Leberstück mit etwa 100 ml eisgekühltem
Eurocollins Puffer (EC) (Rezept s. Anhang S. 143) durch die angeschnittenen
Gefäßöffnungen vorgespült, um verbleibende Blutreste heraus zu waschen und die
39
Material und Methoden
Vitalität der Zellen für die Transportzeit zu sichern. Das Leberstück wurde in diesem
Puffer eisgekühlt in einer Weithalsflasche in das Labor transportiert.
Des Weiteren erfolgte bereits am Schlachthof eine Probennahme eines kleinen
Gewebestückchens der jeweils entsprechenden Leber zur späteren PCR Analyse.
Hierzu wurde mit einer sterilen Skalpellklinge (Otto Rüttgers, Solingen Deutschland)
ein Stückchen von ca. 2x2 cm Kantenlänge entnommen und in einem
Eppendorfgefäß unverzüglich in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff verbracht.
Die Transportzeit der Proben betrug vom Schlachthof Hannover ungefähr 15
Minuten, vom Schlachthof Minden-Lübbecke ca. zwei Stunden. Um den Einfluss der
Transportzeit auf das Leberstück und den Zellerhalt beurteilen zu können wurden
von den Lebern aus dem Schlachthof Hannover sowie von einigen Lebern des
Schlachthofes
Minden-Lübbecke,
weitere
Gewebeproben
für
eine
PCR
Untersuchung genommen. Hierfür wurde Lebergewebe über zwei Stunden in dem
Transportmedium auf Eis belassen und dann eine Probe nach Ankunft im Labor
genommen, die ebenfalls in ein Eppendorfgefäß in flüssigen Stickstoff gegeben
wurde.
3.2.2.2 Kollagenaseperfusion und Isolation der primären Hepatozyten vom
Rind
Im Rahmen der Etablierung wurde ein Protokoll für die Isolierung von primären
bovinen Hepatozyten entwickelt, das auf dem Protokoll der Charité Berlin für humane
Leberzellen aus dem Vorversuch basierte. Im Laufe der Etablierungsphase wurden
sowohl Pufferprotokolle wie auch das Perfusionsprotokoll bedarfsgerecht nach den
eigenen Ergebnissen im Rahmen der Etablierung modifiziert. Dem Perfusionspuffer I
wurden im Verlauf Zusätze wie Glucose, bovines Insulin, Dexamethason (Sigma
Aldrich, Saint Louis, USA), nicht essentielle Aminosäuren und Na-Pyruvat (Biochrom,
Berlin, Deutschland) hinzugegeben. Dem Perfusionsprotokoll wurden einige Schritte
wie ein Erwärmen des transportierten Leberstückes bei Raumtemperatur in ECPuffer und ein unten näher bezeichneter Zwischenspülschritt hinzugefügt. Zudem
40
Material und Methoden
wurde im eigenen Labor ein entsprechender Geräteaufbau für die Durchführung
einer Two-Step-Kollagenaseperfusion entwickelt und eingeführt. Veränderungen die
während der Etablierungsphase der Isolation der Leberzellen vorgenommen wurden
sind in einer Variablentabelle Im Tabellenanhang (Tabelle 11) zusammengestellt.
Dies gilt auch für die oben beschriebene Probennahme und den Transport. Aus
dieser Tabelle ist zudem ersichtlich auf welche Variablen im Versuchsverlauf
besonderer Bezug genommen wurde und deren Einfluss genauer geprüft wurde. Auf
Basis dieser Tabelle wurde das eigene Protokoll erstellt.
Das Endprotokoll sowie die etablierten Pufferprotokolle sind dem Ergebnisteil zu
entnehmen (Kapitel 4.2.2).
Das
Leberstück
wurde
im
Labor
nach
Entnahme
aus
dem
jeweiligen
Transportmedium, später nach Erwärmungsphase, mit sterilen Gaze-Tupfern
vorsichtig abgetupft und in eine Petrischale gelegt. An der Schnittfläche wurden
geeignete größere Gefäße aufgesucht, in die Knopfkanülen (Henry Schein Vet,
Deutschland) eingeführt wurden (s. Abbildung 9). Um die Kanülen dicht im
Lebergewebe zu fixieren und somit eine Perfusion über die Kanülen zu
gewährleisten wurden die Gefäßöffnungen mittels eines Gewebeklebers (Histoacryl,
B.Braun, Rubi, Spanien) verschlossen. Das Leberstück wurde im Folgenden in einen
Büchnertrichter gelegt und in die Versuchsapparatur (s. Abbildung 6) verbracht.
41
Material und Methoden
Leberstück
Büchnertrichter
Pumpe
Perfusionspuffer im Wasserbad
Waste/Abfall
Abbildung 6: Darstellung des Geräteaufbaus für ein nicht-rezirkulierendes
Perfusionssystem
Zur Isolierung der bovinen Hepatozyten wurde eine modifizierte „Two-StepKollagenaseperfusionstechnik“ nach Seglen (1972) angewendet. Im ersten Schritt
erfolgte eine „single pass“ Perfusion (nicht-rezirkulierend). Eine EGTA-haltige
Perfusionslösung I wurde im Wasserbad auf 39°C erwärmt und über eine Pumpe
durch Schläuche und Kanülen in das Leberstück gespült. Die aus dem Leberstück
wieder austretende Perfusionslösung wurde in einem gesonderten Gefäß unter dem
Büchnertrichter aufgefangen und später entsorgt. Diese erste Perfusionslösung dient
dazu das restliche Blut aus den Gefäßen zu spülen sowie Calcium- Ionen zu
komplexieren und Desmosomen, welche die Zellen miteinander verbinden, zu lösen.
Im Laufe der Etablierung wurde zwischen beiden Perfusionsschritten eine
Zwischenspülphase etabliert. Diese besteht aus dem Perfusionspuffer II ohne
Kollagenasezusatz und dient dazu dem Gewebe wieder Calcium zuzuführen,
welches die Kollagenase später für ihre Aktivität benötigt.
42
Material und Methoden
Leberstück
Büchnertrichter
Perfusionspuffer II im Wasserbad
Abbildung 7: Darstellung des Geräteaufbaus für ein zirkulierendes
Perfusionssystem
Der anschließende Perfusionsschritt erfolgte in einem rezirkulierenden System. Der
Aufbau ist der Abbildung 7 zu entnehmen. Die Perfusionslösung II mit der
zugesetzten Kollagenase (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) wurde
ebenfalls durch das Leberstück gespült. In diesem Fall wurde die Perfusionslösung
aufgefangen und erneut durch die Leber gepumpt. Das Gefäß stand während der
Perfusionszeit im Wasserbad bei 39°C. Die Perfusionszeit ist bei diesem Schritt
abhängig von der jeweiligen Kollagenasecharge und dem Leberstück. Aus diesem
Grund
wurden
makroskopische
Kriterien
geprüft
um
den
Erfolg
der
Kollagenaseperfusion zu verifizieren. Das Gewebe erscheint aufgequollen und
farblich heller. Durch leichten Druck von außen mit einem Gewebespatel kann das
Leberstück irreversibel deformiert werden. An dieser Stelle wurde die Perfusion
gestoppt. Die Kanülen wurden in Folge zügig aus dem Gewebe entfernt.
Das Stück Leber wurde aus dem Trichter in eine Petrischale verbracht, und mit einer
FCS-haltigen Stopp-Lösung (s. Anhang S.143) übergossen. Die Leberkapsel wurde
mit einer Pinzette eröffnet und das Leberstück in der Petrischale mit Hilfe der
Pinzette vorsichtig geschwenkt um somit die Hepatozyten aus dem Gewebeverband
zu lösen und in Suspension zu bringen. Es erfolgte eine Zellzählung direkt aus der
43
Material und Methoden
gewonnenen Zellsuspension aus der Petri Schale mit Trypanblau (s. Anhang
Protokoll 3). Hier wurde die Vitalität der Zellen nach Perfusion ermittelt.
Die gewonnene Zellsuspension wurde in Folge durch einen Trichter mit steriler Gaze
(Gazin, WDT, Hannover, Deutschland) filtriert, um Gewebereste und größere
Zellverbände zu entfernen und in 50 ml Falconröhrchen verbracht. Alle folgenden
Schritte erfolgten auf Eis gekühlt.
Die Zellsuspension wurde für 3 min bei 80 x g und 4°C ohne Bremse zentrifugiert.
Nicht-Parenchym Zellen und Zelltrümmer verblieben dabei im Überstand. Dieser
wurde in Folge abgegossen und das Zellpellet in kaltem Williams E Medium
gewaschen. Dieser Waschvorgang wurde insgesamt zweimal wiederholt. Folgend
wurde das erhaltene Zellpellet in 30-50 ml Williams E- Medium aufgenommen.
Der Zeitraum zwischen der Beendigung der Kollagenaseperfusion und dem ersten
Zentrifugationsschritt darf nicht länger als 30 Minuten betragen, da die Kollagenase
bis zum Zentrifugieren noch nachverdaut.
Nach einer Zellzählung nach erstelltem Protokoll (s. Anhang Protokoll 3) erfolgte eine
Dichtegradientenzentrifugation
mit
Easycoll©
(Easycoll,
Biochrom,
Berlin,
Deutschland) um tote Zellen aus der Suspension zu entfernen. Die Zentrifugation
muss zügig erfolgen, da die Easycoll-Lösung toxisch wirkt und die Zellen nicht zu
lange Kontakt haben sollten. Nach der Zentrifugation kann man zwei Schichten
voneinander unterscheiden (s. Abbildung 14). In der obersten Schicht befinden sich
Zelltrümmer und tote Zellen, in der unteren Schicht vitale Zellen. Im Anschluss
erfolgte erneut eine Zählung der Zellviabilität sowie Bestimmung der Zellzahl in der
Neubauer Zählkammer nach o.g. Protokoll. Zudem wurden Zellsuspensionsproben
nach der Easycoll Zentrifugation in ein Eppendorfgefäß gegeben, abzentrifugiert und
bei -80°C zur späteren PCR Analyse eingefroren.
Im Versuchsverlauf der gesamten Etablierungsphase wurde für jede Perfusion ein
Laborprotokoll ausgefüllt. Hier wurden zunächst der Entnahmezeitpunkt auf dem
Schlachthof sowie das Gewicht des Leberstückes vermerkt. Weiterhin die Anzahl der
befestigten Kanülen und die genutzte Durchflussrate der Pumpe (Behr Labortechnik
GmbH, Düsseldorf, Deutschland). Während der Perfusion wurde die Dauer des
44
Material und Methoden
Durchflusses der einzelnen Puffer notiert sowie die Einwaage und Charge der
verwendeten Kollagenase.
Eine Zusammenfassung der Methodik der Isolation der primären bovinen
Hepatozyten zeigen die folgenden Abbildungen 8 bis 17:
Abbildung 8: Es werden Knopfkanülen in entsprechende
Gefäßöffnungen verbracht und mit Gewebekleber fixiert.
Abbildung 9: Das Leberstück wird an das Schlauchsystem
angeschlossen und in einen Büchnertrichter verbracht.
45
Material und Methoden
Abbildung 10: Darstellung eines Leberstückes
nach erfolgter Two-Step-Kollagenaseperfusion.
Die aufgequollene Struktur des Gewebes ist zu
erkennen.
Abbildung 11: Darstellung des Leberstückes nach
Eröffnung der Leberkapsel.
46
Material und Methoden
Abbildung 12: Gewonnene
Zellsuspension im Falconröhrchen
Abbildung 13: Filtrieren der Zellsuspension
durch eine sterile Gaze in ein Falconröhrchen
Überstand – tote Zellen
Überstand
Zellpellet
Zellpellet – lebende
Zellen
Abbildung 15: Zellpellet nach
zweimaligem Waschen mit Williams E
Medium. Im Überstand befinden sich
Nicht-Parenchymzellen und Zelltrümmer.
Abbildung 14: Röhrchen nach
Easycoll-Zentrifugation. Die
Schichtenbildung ist gut zu
erkennen.
47
Material und Methoden
Abbildung 16: mikroskopische Darstellung der Zellen in der
Neubauer Zählkammer mit Trypanblau-Färbung. 100-fache
Vergrößerung. Färbung nach Easycoll-Zentrifugation.
Abbildung 17: mikroskopische Darstellung der Hepatozyten in
400facher Vergrößerung nach Easycoll Zentrifugation. Es sind
lebende Zellen (ungefärbt) zu erkennen.
48
Material und Methoden
3.2.3 Etablierung der Kultivierung primärer boviner Hepatozyten
Neben der Isolation der Zellen wurde im Anschluss die Zellkultur etabliert. Dazu
erfolgte eine Kultivierung der Zellen im Monolayer und im Sandwich. Die isolierten
Zellen wurden nach der Easycoll Aufreinigung auf kollagenbeschichtete 6-well
Platten ausgesät. Hierzu wurden entweder bereits vorbeschichtete Platten verwendet
(Life Technologies, Darmstadt, Deutschland), oder die Kollagenbeschichtung wie
unter 3.1.2.1 beschrieben, selbst hergestellt. Die Zellen wurden in einer Dichte von
1x106 Zellen pro Well in 2 ml Williams E Medium (PanBiotech, Aidenbach,
Deutschland) mit 10% FCS (PanBiotech, Aidenbach, Deutschland) ausgesät.
Innerhalb der Etablierungsphase wurden verschiedene Dichten ausprobiert. Diese
reichten von 1x105 bis 2x106 Zellen pro Well. Ebenso wurde die Menge des FCS
Zusatzes
variiert.
Weiterhin
kamen
im
Rahmen
des
Versuchsverlaufes
Mediumzusätze wie Dexamethason (100nM), bovines Insulin (1,74 nmol/L), nicht
essentielle Aminosäuren und Natrium-Pyruvat (0,2µM) hinzu.
Nach einer Adhäsionszeit von drei Stunden im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2
erfolgte für die Monolayer Kultur ein Mediumwechsel auf ein FCS-freies Williams E
Medium. Die Zusammensetzungen der genannten Medien sind dem Ergebnisteil zu
entnehmen (Kapitel 4.2.3) Die Sandwich Kulturen erhielten nach dieser Zeit eine
zweite Kollagenschicht (siehe 3.1.2.1 und Protokoll 5 Anhang) und wurden für 45
Minuten in den Brutschrank verbracht bevor sie 2 ml FCS-freies Williams E Medium
pro Well erhielten. Ein Mediumwechsel erfolgte bei allen Kulturen jeweils nach 24
Stunden.
Für die Entnahme von Mediumproben aus der Zellkultur an den Versuchstagen 1, 2,
3, 4, 7, 10 und 14 in der Sandwich Kultur und 1, 2, 3, 4 in der Monolayer Kultur
wurden aus dem entsprechenden Well 1 ml des Mediums vorsichtig abpipettiert, in
ein 1,5ml Eppendorfgefäß gegeben und bei -80° C gelagert. Folgend wurde für die
Gewinnung der jeweiligen Zellprobe aus dem gleichen Well der noch verbliebene
Rest des Mediums bis auf eine geringe Menge abpipettiert und verworfen. Mit einem
Zellschaber (Biochrom, Berlin, Deutschland) wurde das Kollagen
mit den
Hepatozyten mechanisch aus dem Well gelöst und anschließend mit einer Pipette mit
49
Material und Methoden
abgeschnittener Pipettenspitze aus dem Well entnommen. Die Probe wurde infolge
in ein Eppendorfgefäß verbracht und 2 min bei 13.000g zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen und das Zellpellet bei -80°C bis zur weiteren Analyse gelagert.
3.2.3.1 Morphologische Untersuchungen
Eine morphologische Untersuchung der Zellen erfolgte täglich nach einem erstellten
Protokoll. Hierzu wurden die Zellen unter einem Lupenmikroskop (Olympus, Tokyo,
Japan) mit einer 56-fachen Vergrößerung beurteilt. Morphologische Kriterien waren
hierbei der geschätzte Anteil zwischen abgelösten und adhärenten Zellen, die
Zellform, Ausbildung von Zell-Zellverbindungen sowie eine mögliche Ausbildung von
Canaliculi (s. Anhang Protokoll 4).
3.2.3.2 Lebend/Tot Färbung
Zur direkten Überprüfung der Zellviabilität in der Zellkultur wurde eine Lebend/TotFärbung mit dem Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit (Life technologies, Carlsbad,
Kalifornien, USA) an den Versuchstagen 1-7, 10 und 14 bei der Sandwich Kultur, und
bei der Monolayer Kultur an den Versuchstagen 1-4 und 10 durchgeführt. Die
Anwendung erfolgte nach Herstellerangaben, das Protokoll ist im Anhang (Protokoll
2) aufgeführt.
Grün fluoreszierendes Calcein-AM weist bei dieser Färbung auf intrazelluläre
Esterase-Aktivität hin, färbt also lebende Zellen an, rot fluoreszierendes EthidiumHomodimer 1 zeigt einen Integritätsverlust der Plasmamembran und färbt somit tote
Zellen.
Die mikroskopische Auswertung erfolgte mit einem Phasenkontrastmikroskop
(Axiovert 200M, Zeiss, Oberkochen) am Institut für Anatomie der Tierärztlichen
Hochschule Hannover (Objektive: 10x/0,3Ph1(EC-Plan), 20x/0,5(EC-Plan)).
50
Material und Methoden
3.3 PCR Analysen der Gewebe- und Zellproben (Ratten, Rind)
Übersicht des Probenmaterials des Rinderversuches für die PCR-Analyse:

Lebergewebe Schlachthof

Lebergewebe nach Transport (2Stunden)

Zellproben nach Easycoll-Zentrifugation

Zellproben aus Monolayer Kultur Tag 1-3

Zellproben aus Sandwich Kultur Tag 1-4, 7,10, 14
Im Rattenvorversuch wurde aus den gewonnenen Zellproben mittels einer
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die relative Menge (relativ abundance, RA) der
mRNA von GHR1A und IGF-I bestimmt. Bei den Gewebe- und Zellproben der
Rinderleber die relative Menge an mRNA für GHR1A, IGF-I, den Apoptosemarkern
BAX und FasL sowie dem Antiapoptosemarker BCL-xL. Die entsprechenden Primer
und Accession Numbers sind im Anhang (Tabelle 10) aufgeführt.
Die RNA wurde hierfür extrahiert und anschließend in die komplementären
Desoxyribonucleinsäuren (complementary desoxyribonucleic acid, cDNA) durch
reverse Transkription umgeschrieben. Im Folgenden wurde die cDNA mittels einer
quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (quantitative real-time Polymerase
Chain Reaction, qPCR) vervielfältigt und analysiert.
3.3.1 Extraktion der RNA
Die Gesamt-RNA der Rattenproben sowie der Gewebeproben der Rinderleber und
Zellproben nach Easycoll Zentrifugation wurden mit Hilfe des kommerziell
erhältlichen RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) aus den Zellproben
extrahiert. Alle Arbeitsschritte wurden hierbei entsprechend des RNeasy® Mini Kit
51
Material und Methoden
Handbuches auf Eis gekühlt ausgeführt. Die noch gefrorenen Proben wurden
zunächst bei 4°C im Kühlschrank aufgetaut. Zu den aufgetauten Proben wurden in
Folge 350 µl des zelllytischen RLT-Puffer sowie 5 µl ß-Mercapto-Ethanol (Sigma
Chemicals, St Louis, USA), welches Ribonukleasen denaturiert, gegeben und mit
einer Pipette homogenisiert. Das entstandene Homogenisat wurde anschließend auf
eine Qia-Shredder-Säule pipettiert und für 2 min bei 8000 x g in einer Biofuge Fresco
(Heraeus,
Hanau,
Deutschland)
zentrifugiert.
Das
Lysat
wurde
aus
dem
Auffanggefäß in ein neues 2ml-Eppendorfreaktionsgefäß überführt. Alle nun
folgenden Schritte wurden in dem Pipettier-Automaten QIAcube (Qiagen, Hilden,
Deutschland)
nach
Arbeitsanleitung
des
RNeasy®
Mini
Kit
Handbuches
durchgeführt. Zunächst fand die Bindung der RNA an die Silica-Membran der
RNeasy Mini Elute Säule statt, danach folgten Waschschritte mit den im Kit
enthaltenen Puffern (RW1-Puffer und RPE-Puffer) sowie 70% Ethanol. Schließlich
erfolgte die Elution der gereinigten RNA mit RNase-freiem Wasser.
Bei den Zellproben von Monolayer und Sandwich der bovinen Hepatozyten wurde
eine Trizol Aufarbeitung zur Extraktion der mRNA durchgeführt. Das verwendete
Protokoll ist im Anhang (Protokoll 6) aufgeführt.
3.3.2 Qualitätsmessung und Konzentration der RNA
Die Qualität der nach der Extraktion gewonnenen RNA wurde in Form der relativen
Integrität mit dem RNA 6000 Nano® Assay Kit im Agilent 2100 Bioanalyzer® (Agilent
Technologies, Waldbronn, Deutschland) bestimmt. Zudem wurde hierbei die
Konzentration der RNA mittels Kapillarelektrophorese ermittelt. Zu Beginn wurde eine
RNA Gel Matrix durch Säulenfilter-Zentrifugation hergestellt, auf welche das Nano
Dye Konzentrat pipettiert wurde. Die zu untersuchende RNA Probe wurde derweil für
2 min bei 70°C im Eppendorf Thermomixer (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland)
denaturiert und auf Eis gelagert. Nach der Vorbereitung der RNA-Probe und des GelDye Mix wurde der Agilent RNA 6000 Nano Chip bestückt. Hierzu wurden 9µl des
Gel-Dye-Mix in eine bestimmte Vertiefung des Chips pipettiert und mittels Überdruck
52
Material und Methoden
durch die Chip Priming Station in den Chip verbracht. In zwei andere Vertiefungen
wurden in Folge jeweils weitere 9 µl des Gel-Dye-Mix gegeben. Es wurden folgend 5
µl des RNA Markers in alle für die Proben vorgesehenen Vertiefungen pipettiert
sowie 5 µl für den Größenstandard (Ladder). Dazu kamen dann je 1 µl der jeweiligen
Probe und 1µl des Ladders in die vorgesehene Vertiefung. Der bestückte Chip wurde
für 1 Minute gevortext (2400rpm) und dann in den Agilent 2100 Bioanalyzer
verbracht. Hier erfolgte die Bestimmung der Konzentration und der Reinheit der
Gesamt-RNA
mittels
elektrophoretischer
Auftrennung
der
einzelnen
Nukleinsäurenfragmente an Hand ihrer Größe.
3.3.3 Reverse Transkription, Synthese der cDNA
Mittels der reversen Transkriptase wurde aus der extrahierten RNA die cDNA
synthetisiert. Zu Beginn erfolgte die Erstellung des Master-Mixes, welcher u.a. die
Enzyme Reverse Transkriptase (RT) und RNase Inhibitor (RI) enthielt. Das
Endvolumen der Probenansätze betrug 20 µl. Zusätzlich zur Probe wurde eine
Negativkontrolle der Probe, eine Negativkontrolle des Standards und eine
Negativkontrolle, die anstelle von mRNA steriles Wasser (Ampuwa®, Fresenius, Bad
Homburg, Deutschland) enthielt, mitgeführt. Letztgenannte Negativkontrolle erfolgte,
um
eine
Kontamination
der
verwendeten
Medien
auszuschließen.
Die
Probenansätze ohne RT und RI dienten der Überprüfung der Reinheit der
verwendeten
mRNA
(keine
Kontamination
mit
genomischer
DNA).
Die
Volumenangaben des RNA-Isolats wurden hierbei für jede Probe individuell
berechnet und richteten sich nach der RNA-Konzentration. Alle Pipettier-Schritte der
cDNA-Synthese wurden auf Eis durchgeführt. Der Mastermix wurde entsprechend
Tabelle 1 hergestellt. Es wurden 250 ng RNA verwendet in einem Reaktionsvolumen
von 20 μl. Danach wurden die Ansätze in das CFX96TMReal-Time System (Bio-Rad,
München, Deutschland) verbracht, in welchem nun die in den Proben vorhandene
RNA in cDNA umgewandelt wurde und anschließend bei -20 °C gelagert. Der Ablauf
des Programms war wie folgt:
53
Material und Methoden
o 25 °C → 10 min
o 42 °C → 60 min (reverse Transkription der mRNA in cDNA)
o 99 °C → 5 min (Denaturierung)
3.3.4 Durchführung der quantitativen PCR
Die Polymerase Kettenreaktion vervielfältigt bestimmte Nukleinsäureabschnitte der
cDNA mit Hilfe entsprechender Primerpaare. Die Quantifizierung in Echtzeit erfolgte
mittels Fluoreszenz-Messung mit dem SYBR-Green-Farbstoff während des PCRZyklus. Hierbei wird zugrunde gelegt, dass die Fluoreszenz proportional zur Menge
der PCR-Produkte zunimmt.
Alle vorbereitenden Pipettierschritte für die qPCR wurden auf Eis durchgeführt. Die
cDNA wurde hierbei mit reinem Wasser (Ampuwa®, Fresenuis Kabi, Bad Homburg,
Deutschland) im Verhältnis 1:2,5 verdünnt. Der benötigte Mastermix wurde
entsprechend der Tabelle 1 angesetzt. Dieser enthielt jeweils 0,2µM des
entsprechenden 5‘- bzw. 3‘- Primers für die zu untersuchenden Transkripte. Die in
diesem Versuch verwendeten Primer und deren Sequenzen sind im Tabellenanhang
aufgeführt.
Tabelle 1: Zusammensetzung des Mastermix für die qPCR
Volumen pro Probe (µl)
Konzentration
Reaction Mix
10
Primer forward
0,4
0,2µM
Primer reverse
0,4
0,2 µM
cDNA
1,0
Ampuwa H2O
8,2
ad 20 µl
54
Material und Methoden
Es wurden 19 µl des hergestellten Mastermixes sowie 1 µl der verdünnten cDNAProbe in jeweils eine Kavität einer Mikrotiterplatte pipettiert. Diese wurde dann in das
CFX96TMReal Time System (BioRad, München, Deutschland) eingelegt. In einem
ersten Schritt wurden die Proben 10 Minuten bei 95°C gehalten um eine
Denaturierung der cDNA und den Primern sowie eine Aktivierung der Polymerase zu
erreichen. Daran schlossen sich 43 qPCR-Zyklen (Tabelle 2) an.
Tabelle 2: Programmablauf der 43 qPCR Zyklen
Temperatur (°C)
Dauer (Sekunden)
Reaktion/Effekt
95
15
Denaturierung der cDNA
60
30
Hybridisierung der Primer
72
30
Elongation
Durch die Messung des Fluoreszenzsignals des SYBR-Green-Farbstoffes konnte
nach jeder DNA-Elongation eines qPCR-Zyklus die relative Menge der mRNA mittels
der Δct-Methode bestimmt werden. Von jeder Probe wurde der Mittelwert des
Housekeeping-Gene (ß-Aktin bei Ratte, GAPDH bei bovinen Zellen) vom Ct Wert der
entsprechenden mRNA subtrahiert und in die Formel 2-ΔCtx eingesetzt und
anschließend mit 100 multipliziert.
Die RA der mRNA von GHR1A und IGF-I wurde auf die RA der mRNA des
Housekeeping-Gens β-Actin der Ratte bezogen. Und die RA der mRNA von GHR1A,
IGF-I, BAX, FasL und Bcl2-xl auf die RA der mRNA des Housekeeping Gens GAPDH
des Rindes.
55
Material und Methoden
Da SYBR-Green unspezifisch in doppelsträngiger DNA einlagert wurde zur
Spezifizierung der qPCR-Produkte eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Hierbei
wurde die Temperatur schrittweise von 55°C bis 95°C um 0,5°C erhöht und dabei
jeweils die Fluoreszenz bestimmt, um die spezifischen Schmelzpunkte der Produkte
zu erfassen.
3.4
Bestimmung von Vitalitätsparametern
Zur Überprüfung der Vitalität und Integrität der primären bovinen Hepatozyten
während der Kultivierung wurden neben einem Live/Dead-Staining und der
mikroskopischen Analyse die zwei Parameter Harnstoff und Lactatdehydrogenase
(LDH) aus den jeweiligen Mediumproben der Versuchstage 1, 2, 3, 4, 7 und 10
analysiert.
Der qualitative Nachweis der Harnstoffsynthese ist in der Leberzellkultur ein wichtiger
Funktionsparameter,
der
auf
die
Erhaltung
metabolischer
Kompetenz
der
Hepatozyten hinweist. Im Rahmen des Proteinstoffwechsels entsteht vorwiegend
durch den Abbau von Aminosäuren das Molekül Ammoniak. Beim Abbauprozess der
Aminosäuren wird der Aminostickstoff als Ammoniak unter Bildung von Ketosäuren
abgespalten. Die Ausscheidung von Ammoniak erfolgt zu ca. 70% als Harnstoff
durch die Harnstoffbiosynthese im periportalen Bereich der Leber. Die restlichen 30%
werden
durch
die
Glutaminsynthethasereaktion
in
der
perivenösen
Leberzellpopulation verstoffwechselt.
Die Enzymaktivität der Lactat- Dehydrogenase wird nach der Reaktion
Pyruvat + NADH + H+ → Laktat + NAD+
photometrisch über die Abnahme der Extinktion des NADH quantitativ bestimmt.
Aufgrund des ubiquitären Vorkommens der LDH spielt dieses Enzym in der
klinischen Leberdiagnostik keine besondere Rolle. In der Leberzellkultur stellt LDH
jedoch ein Maß für die Integrität der Zellen dar. Bei Zellschäden wird von den Zellen
LDH freigesetzt (Maes et al., 2015).
56
Material und Methoden
3.4.1 Harnstoffanalyse
Die Bestimmung der Harnstoffkonzentration aus den Mediumproben erfolgte mit dem
kommerziell erhältlichen Urea Assay Kit ab83362 (Abcam, Cambridge, UK).
Zunächst wurde eine Standardkurve erstellt, in dem die zum Kit gehörende
Standardlösung von 100 mM auf 0,5 mM verdünnt wurde und daraus Standards von
1,2,3,4 und 5 nmol hergestellt wurden. Eine Blindprobe mit einer Konzentration von 0
nmol wurde ebenfalls hergestellt. Folgend wurden jeweils 50 µl der entsprechenden
Standardverdünnungen
sowie
der
Blindprobe
in
die
Vertiefungen
einer
Mikrotiterplatte pipettiert. In die verbleibenden Vertiefungen wurden 50 µl der zu
untersuchenden Mediumproben gegeben. Danach wurden zu jeder Vertiefung 50 µl
eines frisch angesetzten Reaktionsmixes (s. Tabelle 3) hinzugefügt und für 60 min
lichtgeschützt bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die optische Dichte bei einer
Wellenlänge von 570 nm im Spectra II (Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz)
bestimmt und anhand der erstellten Standardkurve die Konzentration an Harnstoff
bestimmt. Dazu wurde das Programm Magellan (Magellan SoftwareGmbH,
Dortmund, Deutschland) verwendet.
Tabelle 3: Zusammensetzung des Urea Reaction Mix
Probe µl
Kontrolle µl
Urea Assay Buffer
42
44
OxiRed Probe
2
2
Enzyme Mix
2
2
Developer
2
2
Converter Enzyme
2
57
Material und Methoden
3.4.2 Lactat-Dehydrogenase-Test
Die Bestimmung der LDH-Konzentration aus den Mediumproben erfolgte mit dem
kommerziell erhältlichen Lactate Dehydrogenase Activity Assay Kit (Sigma-Aldrich,
St. Louis, USA). Es wurde zunächst eine Standardkurve erstellt mit Konzentrationen
von 2,5, 5, 7,5, 10 und 12,5 nmol des 12,5 mM NADH Standards sowie eines Blanks.
Es wurden jeweils 50 µl der jeweiligen Standardverdünnungen und des Blindwertes
sowie der zu analysierenden Mediumprobe in die Vertiefungen einer 96-well-Platte
vorgelegt. Dazu kamen jeweils 50 µl eines frisch angesetzten Reaktionsmixes (48 µl
LDH Assay Buffer + 2 µl LDH Substrate Mix). Jedes Well wurde mit einer Pipette gut
durchmischt. Die Inkubation der Platte erfolgte dann lichtgeschützt bei 37°C. Nach
zwei Minuten erfolgte die erste Initialmessung der optischen Dichte bei einer
Absorptionswellenlänge von 450 nm im Spectra II (Tecan Group Ltd, Männedorf,
Schweiz). Es folgten weitere Messungen alle fünf Minuten, bis der Wert der aktivsten
Probe größer als der Wert des höchsten Standards (12,5 nmol/well) beträgt. Um die
Enzymaktivität anhand der Standardkurve berechnen zu können wurde der finale
Messpunkt als der vorletzte Wert festgelegt, bevor der Wert des hohen Standards
überschritten wurde. Die Umrechnung der Werte erfolgte von nmol/l in die
Maßeinheit mU/ml.
3.5
Statistische Auswertung
Alle Daten wurden in dem Programm Excel (Microsoft, Redmond, Washington, USA)
gesammelt und sortiert. Anschließend wurde die statistische Auswertung und
Erstellung der Grafiken mit dem Programm GraphPad Prism 5 (GraphPad Software,
La Jolla, USA) durchgeführt.
Die RA der mRNA in den Lebergewebeproben sowie Zellproben wurde mit der ΔCtMethode berechnet. Von jeder Probe wurde der Mittelwert des Housekeeping-Gene
(ß-Aktin bei Ratte, GAPDH bei bovinen Zellen) vom Ct Wert der entsprechenden
58
Material und Methoden
mRNA subtrahiert und in die Formel 2-ΔCtx eingesetzt und anschließend mit 100
multipliziert.
Die mRNA Daten als auch Harnstoff und LDH Konzentrationen wurden mit dem
Saphiro-Wilk Test auf Normalverteilung getestet und Unterschiede zwischen
verschiedenen Tagen in der Kultur mit dem Wilcoxon Signed Rank Test analysiert.
Weiterhin wurden Unterschiede zwischen Monolayer und Sandwich Kultur mit dem
nicht parametrischen Mann-Whitney Test ausgewertet.
P-Werte <0,05 werden als signifikant gewertet. Die Daten werden im Folgenden als
arithmetischer Mittelwert und Standardabweichung angegeben.
Für die Signifikanzangaben in der vorliegenden Dissertation gilt folgendes:
P>0,10
n.s.
nicht signifikant
P<0,10
(*)
statistische Tendenz
P<0,05
*
schwach signifikant
P<0,01
**
signifikant
P<0,001
***
hoch signifikant
P<0,0001 ****
höchst signifikant
59
Ergebnisse
4
Ergebnisse
Im Folgenden werden zunächst die Ergebnisse des Vorversuchs mit primären
Rattenhepatozyten und anschließend die Ergebnisse von Isolation und Kultivierung
der primären bovinen Hepatozyten beschrieben.
4.1
Vorversuch primäre Rattenhepatozyten
4.1.1 Morphologie
Die Beurteilung der Zellmorphologie der Rattenhepatozyten wurde von Tag 0 bis Tag
7 mikroskopisch bei einer 100-fachen Vergrößerung vorgenommen. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Die Abbildung 18 zeigt
mikroskopische
Aufnahmen der Zellkultur an den Tagen 0, 2, 3 und 5.
Tabelle 4: Übersicht der morphologischen Ergebnisse der mikroskopischen Untersuchung der
primären Rattenhepatozyten in der Sandwich Kultur. n.s.= nicht sichtbar
Tag
Form
rund
0
x
1
x
Zellkern
kuboid eckig
lang
Anzahl Form
Zellverbindungen
ja
nein
Canaliculi
ja
1
rund
x
x
1-2
rund
x
x
2
x
1-2
rund
x
x
3
x
x
1-2
rund
x
x
4
x
x
1-2
rund
x
x
5
x
x
1-2
rund
x
x
6
x
x
n.s.
n.s.
x
x
7
x
x
n.s.
n.s.
x
n.s.
nein
x
n.s.
60
Ergebnisse
Tag 0
Tag 2
Tag 3
Tag 5
Abbildung 18: Primäre Rattenhepatozyten in Sandwich Kultur, mikroskopische Aufnahmen bei 56facher Vergrößerung. Es sind Aufnahmen der Tage 0, 2, 3 und 5 dargestellt.
Die morphologische Form der Hepatozyten wechselte von rund an Tag 0 zu einer
kuboiden bis eckigen Form, die sich über die Dauer des Versuches nicht mehr
veränderte. Die Zellen beinhalteten im Schnitt ein bis zwei runde Zellkerne. Die
Ausbildung von Zell-Zellverbindungen sowie von Canaliculi war ab Tag 1 in der
Sandwich Kultur zu erkennen. Am Ende des Versuches ab Tag 6 waren sowohl die
Zellkerne wie auch die Canaliculi nicht mehr eindeutig zu identifizieren. Im
Versuchsverlauf ab Tag 5 konnten kleine braune Ablagerungen an den Zellrändern
erkannt werden sowie auch komplett bräunlich gefärbte Zellen. Diese wurden bis Tag
61
Ergebnisse
7 ausgeprägter. Die Zellanordnung ließ ab Tag 2 eine hepatozytenspezifische
Bälkchenanordnung erkennen.
4.1.2 PCR –Analysen
4.1.2.1 GHR1A und IGF-I Expression
Tabelle 5 zeigt die relative Menge (RA) der mRNA-Expression von GHR1A und IGF-I
an den Versuchstagen 0,1,2,3,4 und 7. Als Housekeeping-Gene wurde ß-Aktin
verwendet. Die Stichprobenmenge n gibt die Anzahl der Wells an, die zur Analyse
am jeweiligen Tag verwendet wurden. An Tag 0 handelt es sich um Proben der
erhaltenen Zellsuspension nach Zellisolation, berechnet auf jeweils 1x10 6 Zellen pro
Stichprobe.
Tabelle 5: mRNA Expression von GHR1A und IGF-I von Rattenhepatozyten in Sandwich Kultur
an den Versuchstagen 0,1,2,3,4,7. Die Daten sind dargestellt als der Mittelwert ±Standardfehler.
Die mRNA Expression ist als berechneter ΔCt-Wert angegeben. n=Stichprobengröße. ****
P<0,0001
Tag
ΔCt GHR1A
ΔCt IGF-I
a****
n
0
93,33 ± 8,43
1
2,81 ± 0,2
2
11,76 ± 2,09
3
19,7 ± 1,22
4
12,21 ± 1,23
b
9,72 ± 0,88
7
14,69 ± 1,58
b
5,18 ± 0,33
a****
4
a
5
b
5
270,75 ± 41,16
c
59,81 ±2,27
b
19,59 ± 3,97
b
22,64 ± 1,4
b
5
c
13
d
12
Die GHR1A-Expression der Rattenhepatozyten nimmt zwischen der Separation an
Tag 0 und dem Tag 1 in Kultur signifikant ab (P<0,0001). Zu Tag 2 steigt die GHR1A
Expression nummerisch wieder leicht an und bleibt relativ konstant bis zu Tag 7.
62
Ergebnisse
Die IGF-I Expression zeigt einen signifikanten Abfall von Tag 0 zu Tag 1 (P<0,0001).
Von Tag 1 zu Tag 2 ist eine weitere nummerische Abnahme der IGF-I Expression zu
sehen, und im weiteren Verlauf eine erneute Abnahme der Expression zwischen Tag
1 und Tag4 bzw. zwischen Tag 4 und Tag 7.
4.1.2.2 Stimulationsversuch mit rGH
Die Tabelle 6 zeigt den Effekt der rGH Stimulation auf die Expression von GHR1Aund IGF-I mRNA in den primären Rattenhepatozyten. Dargestellt sind die ΔCt Werte
der GHR1A und IGF-I mRNA- Expression an den Versuchstagen 4 und 7 sowie der
jeweiligen Inkubationszeit von 20 min und 120 min.
Tabelle 6: mRNA Expression von GHR1A und IGF-I von primären Rattenhepatozyten in
Sandwichkultur. Angegeben sind die Tage in Kultur sowie die jeweilige Inkubationszeit von
rGH in den entsprechenden Wells. Die Expression ist als ΔCt-Wert angegeben.
n=Stichprobenmenge, die in die Untersuchung eingeflossenen Wells. Berechnet wurden
Interaktionen zwischen Tag (4, 7) * Zeit (20, 120 min)
Tag
Zeit (min)
ΔCt GHR1A
ΔCt IGF-I
4
20
16,49±1,35
4
120
8,96±0,5
9,24±0,85
7
20
17,02±2,37
6,12±0,52
7
120
13,3±0,99
6,09±0,55
12,55±0,56
a****
n
11
b
12
c
12
c
12
Es zeigt sich ein signifikanter Abfall der IGF-I Expression an Tag 4 zwischen 20 min
Inkubation und 120 min (P<0,0001). Es ist zudem eine nummerische Abnahme der
GHR1A Expression von 20 min Inkubationszeit des rGH zu 120 min Inkubationszeit
zu sehen. Dies ist unabhängig vom jeweiligen Kulturtag.
63
Ergebnisse
In Tabelle 7 sind die Unterschiede der GHR1A und IGF-I Expression zwischen den
Tagen 4 und 7 dargestellt. Zudem zeigt sie die Wirkung des rGH in einem Vergleich
von behandelten Wells (mit rGH) und unbehandelten Wells.
Tabelle 7: Effekt von Tag (4 und 7) und rGH Einfluss auf die Expression von GHR1A und IGF-I.
n= Stichprobenmenge. **** P<0,0001, *** P<0,001
ΔCt GHR1A
Effekt
Tag
4
7
rGH
12,56±1,05
15,16±1,31
***
ohne
13,6±1,08
mit
14,17±1,34
ΔCt IGF-I
n
a****
23
b
24
10,82±0,62
6,1±0,37
a
23
a****
24
7,36±0,71
9,43±0,64
Zwischen Tag 4 und 7 zeigt sich eine signifikante Zunahme der GHR1A mRNA
Expression (P<0,001). Die Zugabe von rGH hat dabei allerdings keinen Einfluss.
Die IGF-I mRNA Expression zeigt einen signifikanten Abfall zwischen Tag 4 und 7
(P<0,0001). Die IGF-I mRNA steigt signifikant nach der Zugabe von rGH an (P<0,5).
64
Ergebnisse
4.2
Ergebnisse der Etablierung von Isolation und Kultivierung von primären
bovinen Hepatozyten aus Schlachthofmaterial
4.2.1 Vorversuch nach humanem Protokoll
Bei der Anwendung des Protokolls für die Isolierung primärer humaner Hepatozyten
wurde das bovine Leberstück insgesamt 20 min mit ungefähr 800 ml EGTA Puffer
perfundiert. Die Perfusion mit dem Kollagenasepuffer erfolgte neun Minuten, bis das
Leberstück irreversible Formveränderungen aufwies.
Die Zellausbeute lag bei 2 Milliarden Zellen bei einer Viabilität von 51.7%. Nach der
durchgeführten Percoll Zentrifugation betrug die Viabilität 33,5%.
4.2.2 Etablierung der Perfusion und Isolation der Hepatozyten
4.2.2.1 Protokoll der Perfusion
Nach Durchführung von insgesamt 38 Leberperfusionen ist als Ergebnis folgendes
Perfusionsprotokoll etabliert worden:
65
Ergebnisse
Protokoll Leberperfusion
Schlachthof:
1. Leberstück mit ca. 50 -100 ml eiskalten Eurocollins-Puffer durchspülen
2. In frischen Eurocollins Puffer in Weithalsflasche geben, auf Eis transportieren
Labor:
1. Leberstück in ein Becherglas mit Eurocollins Puffer bei Raumtemperatur legen
und 5 Minuten erwärmen. Dabei Gefäße durchspülen.
2. Pumpe mit Perfusionspuffer I vorspülen bis die Schläuche gefüllt sind, Pumpe
auf 15,0 stellen
3. Schläuche abklemmen
4. Kanülen in geeignete Gefäßöffnungen einführen und mit Histoacryl befestigen
5. Schlauchsystem anschließen, Pumpe anstellen und Druck im Leberstück prüfen
→ evtl. mit Histoacryl weitere Gefäße verschließen
→dann Leberstück in Büchner Trichter legen
6. Perfusion mit Perfusionspuffer I (EGTA) im nicht-rezirkulierenden System
Puffer dabei carbogenieren
10 Minuten perfundieren
→während dieses Schrittes den Kollagenasepuffer (100ml) ansetzen und in ein
Wasserbad bei 39°C stellen
abgewogene Kollagenase IV (Sigma) (60-90 mg) in 100 ml warmen Puffer II
7. Zwischenspülung mit Puffer II ohne Kollagenase, nicht-rezirkulierend für
5 Minuten
8. Perfusion mit Kollagenasepuffer (Puffer II)
Ca. 40 ml aus der Zwischenspülung als Waste auffangen
→dann Perfusionssystem in rezirkulierendes System umbauen
→terminiert bis Leberstück weich und mit Pinzette leicht zu durchstoßen ist
(etwa 4-7 min)
9. Perfusion beenden, Pumpe abstellen, Kanülen herausziehen, Histoacryl ablösen
66
Ergebnisse
10. Leberstück in eine Petrischale mit Stopp-Lösung bei Raumtemperatur
übergießen, mit Skalpell die Leberkapsel eröffnen. Zellen in eine Petri Schale
mit Stopp Lösung herauslösen/schütteln.
11. Zellsuspension durch einen Trichter mit Gaze filtrieren und in 50 ml
Falconröhrchen auf Eis auffangen.
12. Zentrifugation bei 80g für 3 min bei 4°C ohne Bremse
13. Überstand verwerfen
14. Zellpellet mit reinem Williams E Medium suspendieren (4°C)
15. 1x waschen (Zentrifugation wie unter 12.)
16. Zellen in ein Falconröhrchen poolen und mit reinem Williams E Medium
auffüllen, ca. 30-40 ml
17. Zellzählung mit Neubauer Zählkammer
Easycoll-Zentrifugation:
Lösung ansetzen: 7,5 ml PBS + 2,5 ml Easycoll + 2,5 ml Zellsuspension
1. Zentrifugation bei 1300g, 8 min, 4°C ohne Bremse
2. Überstand verwerfen
3. Zellpellet in PBS aufnehmen (5-10ml)
4. Zentrifugation bei 80 g, 3min, 4°C ohne Bremse
5. Überstand verwerfen
6. Zellpellet in Williams E Medium aufnehmen, Menge je nach Größe des Pellet
(2-4 ml)
7. Zellzählung in Neubauer Zählkammer
67
Ergebnisse
4.2.2.2 Pufferprotokolle
Die Protokolle für die Perfusionspuffer wurden dabei wie folgt etabliert:
Perfusionspuffer I
NaCl
8,3 g
=142 mM
KCl
0,04 g
=0,5 mM
Hepes
2,2 g
= 9,2 mM
EGTA
0,38 g
= 1 mM
Glucose
0,9 g
= 0,005 mM
bovines Insulin
20µl
= 1,74 nM/l
Dexamethason
20µl
= 100 nM
Aminosäuren
100 µl
Na-Pyruvat
100µl
= 0,2 µM
Auf ein Volumen von 1000 ml mit ddH2O auffüllen, pH 7,4
Perfusionspuffer II
NaCl
4g
= 68 mM
KCl
0,5 g
= 0,6 mM
Hepes
2,2 g
= 9,2 mM
CaCl2 * H2O
0,8 g
= 4,8 mM
Auf ein Volumen von 1000ml mit ddH2O auffüllen, pH 7,4
+ Kollagenase (60-90mg)
Die Protokolle des Eurocollins Puffer sowie der Stopp-Lösung sind im Anhang
aufgeführt.
68
Ergebnisse
4.2.2.3 Ergebnisse der Perfusion
Beim Spülen des Leberstückes mit Eurocollins Puffer auf dem Schlachthof ist zügig
eine Entfärbung der Leber an den gespülten Bereichen erkennbar (Abbildung 19).
Abbildung 19: Leberstück nach Spülen mit EC Puffer auf dem
Schlachthof. Der entfärbte Bereich ist deutlich erkennbar (gelber Pfeil)
Eine Perfusionszeit von 10 Minuten mit dem Perfusionspuffer I stellte sich während
der Etablierung als optimal heraus. Nach dieser Zeit war das gesamte Blut aus den
Gefäßen herausgespült und die Zell-Zell Verbindungen erschienen hinreichend
gelockert zu sein.
Ein Zwischenspülschritt wurde eingeführt, um dem Gewebe das entzogene Calcium
durch das EGTA wieder zu zuführen, da die Kollagenase calciumabhängig arbeitet.
Die Kollagenase Einwaage variiert mit der verwendeten Calciumcharge. Im Rahmen
der Etablierung fanden 60-90 mg Einwaage auf 100 ml Puffer vorrangig
Verwendung. Ein Strukturverlust des Leberstückes zeigte sich meist in einem
Bereich von ca. 5 Minuten. Hier muss individuell terminiert werden, je nach Größe
und
Konsistenz
des
Leberstückes.
Das
Gewebe
erscheint
nach
Kollagenaseperfusion aufgequollen und lässt sich mit einer Pinzette leicht
durchstoßen. Als Ergebnis konnte herausgefunden werden, dass eine zu lange
69
Ergebnisse
Einwirkzeit der Kollagenase die Zellen schädigt und die Viabilität vermindert ist. Des
Weiteren konnte festgestellt werden, dass das erhaltene Zellpellet nach der
Zentrifugation bei einem Überverdau von Kollagenase sehr schleimig wirkt und sich
vermehrt Zelldebris mikroskopisch in der Zählkammer als Hintergrund darstellt. Diese
Zellen adhärierten zudem auch schlecht in der sich anschließenden Zellkultur.
Während der Etablierungsphase des Perfusionsprotokolls (vgl. Tabelle 11 im
Anhang), wurden schließlich nach dem oben aufgeführten Endprotokoll 13 Lebern
perfundiert.
Tabelle 8 zeigt die jeweilige Zellausbeute pro ml Zellsuspension nach der
Zentrifugation, die Viabilität der Zellen nach Zentrifugation sowie nach EasycollZentrifugation. Der Mittelwert der Zellausbeute nach Zentrifugation lag bei 5.064.038
Millionen Zellen/ml Zellsuspension. Die Viabilität der Zellen nach Zentrifugation
betrug im Mittel 35,0%±11,7, nach Easycoll- Zentrifugation 60,5%±9,6.
70
Ergebnisse
Tabelle 8: Übersicht der Ergebnisse der Leberperfusion nach Endprotokoll. Aufgeführt sind die
Zellausbeute in ml nach Zentrifugation sowie die Viabilität in % nach Zentrifugation und
Easycoll Zentrifugation
Leber Nr.
Zellen/ml
Zellsuspension
Viabilität %
nach Zentrifugation
Viabilität%
nach Easycoll
26
3.630.000
40,2
71,2
27
4.642.500
43,6
55
28
3.472.500
36,2
50,3
29
3.412.500
20,8
60,8
30
2.040.000
11,4
-
31
7.720.000
26
59,4
32
6.460.000
36,9
74,2
33
8.310.000
53,5
54
34
5.700.000
42,7
63,8
35
3.460.000
25,1
64,7
36
4.710.000
46,2
67
37
7.650.000
30
39,5
38
4.625.000
42,1
66
Weiterhin wurde im Rahmen der Etablierung ein Perfusionsversuch nur mit
Perfusionspuffer I (EGTA) durchgeführt, ohne Kollagenase. Hierbei lag die
Zellausbeute nur bei 520.000 Zellen/ml bei einer Viabilität von 9,8%. Die perfundierte
Leber zeigte kaum Formveränderungen und blieb fest. Eine weitere Perfusion
erfolgte nur mit Kollagenasepuffer über 20 min mit einer Einwaage von 150 mg
Kollagenase, ohne vorherigen Perfusionspuffer I. Hier lag die Gesamtzellzahl /ml
nach Zentrifugation bei 1.695.000 Millionen Zellen. Die Viabilität lag bei 24,4%. Das
Zellpellet nach Zentrifugation erschien schleimig.
71
Ergebnisse
4.2.3 Etablierung der Kultivierung
Zur Kultivierung der primären bovinen Hepatozyten wurden für Monolayer und
Sandwich Kulturen folgende Medienprotokolle im Rahmen des Versuchsverlaufes
etabliert:
Vollmedium (zum Ausplattieren):
Williams E Medium
500 ml
FCS 10%
55 ml
Pen/Strep
5 ml
= 0,1 mg/ml
500µl
= 10 µg/ml
Gentamicin
bovines Insulin:
Dexamethason
5 µl
= 1,74 nmol/l
10 µl
Aminosäuren
100 µl
Na-Pyruvat
100µl
= 100 nM
= 0,2 µM
Kulturmedium
Williams E Medium
Pen/Strep
Gentamicin
500 ml
5 ml
= 0,1 mg/ml
500 µl
= 10µg/ml
bovines Insulin:
5 µl
=0,1µg/ml
Dexamethason
10 µl
Aminosäuren
100 µl
Na-Pyruvat
100 µl
= 100nM
= 0,2 µM
72
Ergebnisse
Die Einsaat der Zellen erfolgte mit 1x106 lebenden Zellen pro Well einer 6-wellPlatte. Eine erfolgreiche Adhäsion der eingesäten Zellen hing sehr stark von der
vorherigen Isolation und der damit verbundenen (Vor)Schädigung der Zellen ab. So
konnten im Rahmen der Etablierung nicht von jeder perfundierten Leber auch
erfolgreich Zellen in Kultur genommen werden.
Nach Einführung des gültigen Perfusionsprotokolls kamen von den 13 nach diesem
Protokoll perfundierten Lebern, von insgesamt 7 Lebern Zellen in Kultur zur weiteren
Analyse der Morphologie, Vitalität und anschließenden PCR Untersuchungen.
4.2.4 Morphologische Ergebnisse
In den folgenden Abbildungen sind angefertigte mikroskopische Aufnahmen der
Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop nach Färbung mit der Lebend/Tot Färbung
dargestellt. Es sind Bilder der Monolayer Kultur der Tage 1,2, 4 und 10 aufgeführt,
sowie Bilder der Sandwich Kultur der Tage 1,2,4,7,10 und 14. Vorangestellt ist eine
Abbildung nach Adhäsionszeit von 3 Stunden und erfolgtem Medienwechsel.
Abbildung20:
fluoreszenzmikroskopische Darstellung
der primären bovinen Hepatozyten nach
Adhäsionzeit von drei Stunden und
erfolgtem Medienwechsel.
Grün = lebende Zellen
Rot = tote Zellen/Zellkerne
Die Hepatozyten liegen vereinzelt, es
sind scharfe Zellgrenzen erkennbar. Die
Zellform ist rund bis leicht polygonal.
Abbildung 20: primäre bovine Hepatozyten nach
Adhäsionszeit
73
Ergebnisse
Monolayerkultur
Abbildung 21: Monolayer Tag 1
Abbildung 22: Monolayer Tag 1
Abbildung 21-23: fluoreszenzmikroskopische
Darstellung der primären bovinen Hepatozyten im
Monolayer an Tag 1 in Kultur. Lebend/tot
Färbung. 21: 100-fache Vergrößerung, 22: 400fache Vergrößerung. 23: Aufnahme ohne
Fluoreszenz, 400-fache Vergrößerung. Die
Hepatozyten zeigen eine polygonale Form mit
scharfen Zellgrenzen. Es sind ein bis drei
Zellkerne in einer Zelle erkennbar. Die Zellen
liegen zum größten Teil einzeln.
Abbildung 23: Monolayer Tag 1
Abbildung 24: Monolayer Tag 2
Abbildung 25: Monolayer Tag 2
Abbildungen 24 und 25: fluoreszenzmikroskopische Darstellung der primären bovinen Hepatozyten
im Monolayer an Tag 2 in Kultur. Lebend/tot Färbung. 400-fache Vergrößerung. Die Hepatozyten
zeigen vermehrt unschärfere Zellgrenzen mit Membranausstülpungen- und Ausläufern. Man erkennt
eine Zusammenlagerung von einzelnen Zellen.
74
Ergebnisse
Abbildung 26: Monolayer Tag 4
Abbildung 27: Monolayer Tag 4
Abbildungen 26 und 27: fluoreszenzmikroskopische Darstellung der primären bovinen Hepatozyten
im Monolayer an Tag 4 in Kultur. Lebend/tot Färbung. 400-fache Vergrößerung. Die Hepatozyten
zeigen deutlich unschärfere Zellgrenzen und viele Membranausläufer. Die Zellen weisen intrazellulär
vermehrte Vakuolenbildung auf. Der Zusammenschluss von Zellen ist erkennbar. In Abbildung 26 sind
neben den Hepatozyten auch fibroblastoide Zellen erkennbar. Diese traten erst ab Tag 3 in Kultur in
Erscheinung.
Abbildung 28: fluoreszenzmikroskopische
Darstellung
der
primären
bovinen
Hepatozyten im Monolayer an Tag 10 in
Kultur. Lebend/tot Färbung. 400-fache
Vergrößerung. Die Zellen schließen sich
vermehrt zusammen. Die gelben Pfeile
geben Hinweise auf die Bildung von
Gallenkanälchen zwischen benachbarten
Zellen. Zusätzlich lassen sich auch hier
fibroblastoide Zellen erkennen.
Abbildung 28: Monolayer Tag 10
75
Ergebnisse
Sandwichkultur
Abbildung 30: Sandwich Tag 1
Abbildung 29: Sandwich Tag 1
Abbildung 29-31: fluoreszenzmikroskopische
Darstellung der primären bovinen Hepatozyten
im Sandwich an Tag 1 in Kultur. Lebend/tot
Färbung. 29: 100-fache Vergrößerung, 30:
400-fache Vergrößerung. 31: Aufnahme ohne
Fluoreszenz, 400-fache Vergrößerung. Die
Hepatozyten zeigen eine rund bis polygonale
Form mit scharfen Zellgrenzen. Die Zellkerne
sind gut erkennbar. Die Zellen liegen zum
größten Teil einzeln.
Abbildung 31: Sandwich Tag 1
Abbildung 33: Sandwich Tag 2
Abbildung 32: Sandwich Tag 2
Abbildungen 32 und 33: fluoreszenzmikroskopische Darstellung der primären bovinen Hepatozyten im
Sandwich an Tag 2 in Kultur. Lebend/tot Färbung (33), ohne Fluoreszenz (32), 400-fache
Vergrößerung. Die Hepatozyten zeigen eine Neigung zum Zusammenschluss. Zell-Zellverbinndungen
sind noch nicht deutlich zu erkennen.
76
Ergebnisse
Abbildung 34: Sandwich Tag 4
Abbildung 35: Sandwich Tag 4
Abbildungen 34 und 35: fluoreszenzmikroskopische Darstellung der primären bovinen Hepatozyten
im Sandwich an Tag 4 in Kultur. Lebend/tot Färbung. (34) 100-fache Vergrößerung, (35) 400-fache
Vergrößerung. Die Hepatozyten zeigen weiter eine Neigung zum Zusammenschluss. Es sind
teilweise Zell-Zellverbindungen zu erkennen. Die Zellgrenzen werden zum Teil unscharf und es
lassen sich Zellausstülpungen erkennen. Zudem sind auch viele einzeln liegenden Zellen zu sehen.
Der gelbe Pfeil deutet auf eine Struktur, die als Gallenkanälchen angesprochen werden könnte.
Abbildung 37: Sandwich Tag 7
Abbildung 36: Sandwich Tag 7
Abbildung
36
bis
38:
fluoreszenzmikroskopische Darstellung der
primären bovinen Hepatozyten im Sandwich
an Tag 7 in Kultur. Lebend/tot Färbung. 400fache Vergrößerung. Man erkennt erste
Bälckchenstrukturen der Zellverbindungen.
Die Zellen zeigen teilweise Vakuolenbildung.
Die Morphologie reicht von polygonal bis
fibroblastenartig/gestreckt. Die gelben Pfeile
geben Hinweise auf Canaliculi-Bildung.
Abbildung 38: Sandwich Tag 7
77
Ergebnisse
Abbildung 39: Sandwich Tag 10
Abbildung 40: Sandwich Tag 10
Abbildungen
39
bis
41:
fluoreszenzmikroskopische Darstellung der
primären bovinen Hepatozyten im Sandwich an
Tag 10 in Kultur. Lebend/tot Färbung (39, 40),
ohne
Fluoreszenz
(41).
400-fache
Vergrößerung. Die zusammengeschlossenen
Hepatozyten weisen eine physiologische
Bälkchenanordnung auf. Es sind ZellZellverbindungen zu erkennen, sowie eine
vermutete Ausprägung von Gallenkanälchen
(gelber Pfeil).
Abbildung 41: Sandwich Tag 10
Abbildung 42: Sandwich Tag 14
Abbildung 43: Sandwich Tag 14
Abbildung 42 und 43: fluoreszenzmikroskopische Darstellung der primären bovinen Hepatozyten im
Sandwich an Tag 14 in Kultur. Lebend/tot Färbung. 400-fache Vergrößerung. Die Bälkchenstruktur ist
weiterhin erkennbar. Die gelben Pfeile deuten die Gallenkanälchen an. Intrazellulär lassen sich einige
Vakuolen finden.
78
Ergebnisse
4.3
PCR Analysen
4.3.1 Analysen von Lebergewebe und Zellen im Rahmen der Zellisolierung
In den folgenden Abbildungen ist die relative Menge der mRNA Expression von
GHR1A, IGF-I, den Apoptosemarkern BAX und FAS, sowie dem Antiapoptosemarker
BCL-xL, jeweils direkt nach Schlachtung sowie nach Transport von 2 Stunden aus
den entsprechenden Lebergewebsproben dargestellt.
Abbildung 44: mRNA Expression von GHR1A und IGF-I der Lebergewebestücke
auf dem Schlachthof und nach Transport
Die mRNA Expressionen von GHR1A sowie IGF-I blieben nach der Transportzeit
vergleichbar zu den Expressionen direkt auf dem Schlachthof.
79
Ergebnisse
Abbildung 45: mRNA Expression von BAX, BCl-xL und FasL der Lebergewebestücke
auf dem Schlachthof und nach Transport.
Die mRNA Expression von BAX, FasL und Bxl-xl blieb annähernd konstant während
des Transportes im Vergleich zur frischen Entnahme der Probe auf dem Schlachthof.
Die Expression des antiapoptotischen Markers BCL-xL liegt im Vergleich zu den
Apoptosemarkern BAX und FasL höher.
80
Ergebnisse
4.3.2 Analysen der Zellkulturproben
Es wurden Zellproben von insgesamt 7 nach gleichem Protokoll perfundierten Lebern
in die Analysen mit einbezogen. Von jedem Versuchstag standen n=6 Proben für
Monolayer- und Sandwichkulturproben zur Verfügung. Diese wurden jeweils aus zwei
Wells der identischen Kultur und des gleichen Kulturtages gepoolt.
Monolayer
***
-------------------
(*)
-----------------
Abbildung 46: GHR1A mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Monolayer an
Tag 0 bis Tag 3
81
Ergebnisse
***
-------------------
*
------------------
Abbildung 47: IGF-I mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Monolayer an Tag 0
bis Tag 3
Die mRNA Expressionen von GHR1A und IGF-I nahmen jeweils signifikant zwischen
Tag 0 und Tag 1 ab. Die Expression von GHR1A nimmt in der Tendenz weiter von
Tag 1 zu Tag 2 ab, die Expression des IGF-I zeigt weiterhin eine schwach
signifikante Abnahme von Tag 1 zu Tag 2.
82
Ergebnisse
*
------------------
Abbildung 48: BAX mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Monolayer von Tag 0 bis Tag 3
*
------------------
Abbildung 49: FasL mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Monolayer von Tag 0 bis Tag 3
Die Expressionen der Apoptosemarker BAX und FasL steigen zwischen der Isolation
an Tag 0 und dem ersten Tag in Kultur schwach signifikant an (P<0,05) und bleiben
dann während des Kulturverlaufes konstant erhöht.
83
Ergebnisse
***
----------------------
Abbildung 50: BCL-xL mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Monolayer von Tag
0 bis Tag 3
Die Expression des antiapoptotischen Markers BCL-xL steigt hoch signifikant von
Tag 0 zu Tag 1 (P<0,001) und steigt dann während der Versuchsdauer numerisch
weiter an.
84
Ergebnisse
Sandwich
***
-----------------
**
-----------------
Abbildung 51: GHR1A mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Sandwich von
Tag 0, 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 14
**
-----------------
**
-----------------
Abbildung 52: IGF-I mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Sandwich von
Tag 0, 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 14
85
Ergebnisse
Die mRNA Expression des GHR1A Transkriptes nimmt signifikant ab von Tag 0 zu
Tag 1. An Tag 2 zeigt sich die niedrigste Expression. Zu Tag 4 und Tag 7 erfolgt ein
leichter Anstieg, an Tag 10 fällt die mRNA Expression wieder ab.
Die IGF-I Expression zeigt einen deutlichen Abfall von Tag 0 zu Tag 1 und bleibt
dann über die Kulturtage auf einem niedrigen Level.
***
-----------------
*
-----------------
Abbildung 53: BAX mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Sandwich
von Tag 0, 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 14
86
Ergebnisse
**
-----------------
*
-----------------
Abbildung 54: FasL mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im Sandwich
von Tag 0, 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 14
Es zeigt sich ein deutlicher Anstieg der BAX- und FasL Expression von Tag 0 zu Tag
1. Die Expression nimmt zu Tag 2 jeweils wieder leicht ab und verbleibt dann
konstant während der Versuchstage.
(*)
-----------------
Abbildung 55: BCL-xL mRNA Expression der bovinen Hepatozyten im
Sandwich von Tag 0, 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 14
Die Expression von BCL-xL nimmt zwischen Tag 0 und Tag 1 in der Tendenz ab
(P<0,10), und bleibt über den Versuchsverlauf konstant.
87
Ergebnisse
4.4
Harnstoff und LDH Analysen des Mediums
Monolayer
**
---------------------
*
---------------------
Abbildung 56: Graphische Darstellung der Harnstoffkonzentration in mmol/l im
Medium der Monolayer Zellkultur über drei Tage
Abbildung 57: Graphische Darstellung der LDH-Konzentration in mU/ml im
Medium der Monolayer Kultur über drei Tage
88
Ergebnisse
Die Harnstoffkonzentration im Medium sinkt zwischen Tag 1 und Tag 2 stark ab,
steigt dann an Tag 3 wieder an. Die LDH Konzentration blieb vergleichbar während
der Versuchstage.
Sandwich
**
-----------------
**
-----------------
Abbildung 58: Graphische Darstellung der Harnstoffkonzentration in mmol/ml
Medium der Sandwich Kultur der Kulturtage 1,2,3,4,7 und 10
89
Ergebnisse
**
-----------------
**
-----------------
**
-----------------
Abbildung 59: Graphische Darstellung der LDH Konzentration in mU/ml
Medium der Sandwich Kultur der Kulturtage 1,2,3,4,7, 10 und 14
In der Sandwich Kultur bleibt die Harnstoffkonzentration in den ersten drei
Kulturtagen relativ konstant und fällt dann an Tag 4 ab. Zu Tag 7 hin steigt sie erneut
an und nimmt zu Tag 10 ab.
Die LDH Konzentration zeigt einen Abfall zwischen Tag1 und Tag 2 sowie erneut zu
Tag 3. Zu Tag 10 ist wiederum ein deutlicher Anstieg zu erkennen.
90
Ergebnisse
In Tabelle 9 ist eine Übersicht sowie Vergleich der Harnstoff- und LDHKonzentrationen zwischen Monolayer und Sandwich Kultur der Tage 1 bis 3
aufgeführt.
Tabelle 9: Tabellarische Darstellung der Konzentrationen von Harnstoff und LDH im Medium.
Vergleichend zwischen Monolayer (ML) und Sandwich (SW) Kultur. Die mit einem Sternchen
markierten Reihen zeigen signifikante Unterschiede zwischen ML und SW an. (* P<0.05)
Tag
Kulturart
Harnstoff (mmol/l)
LDH (mU/ml)
1
ML
190,6 ± 18,6
5,41 ± 1,59
SW
164,8 ± 21,1
8,53 ± 5,74
ML
127,9 ± 5,9
6,22 ± 1,36
SW
161,8 ± 21,9*
7,10 ± 0,91
ML
126,9 ± 22,6
4,19 ± 2,37
SW
138,4 ± 26,2
4,04 ± 1,03
2
3
An Tag 2 zeigt sich ein signifikanter Unterschied in der Harnstoffkonzentration
zwischen Monolayer und Sandwich Kultur. Die Harnstoffkonzentration liegt in der
Sandwich Kultur signifikant höher.
91
Diskussion
5
Diskussion
Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Protokolls zur Isolation und zur
Kultivierung primärer boviner Hepatozyten aus Schlachthofmaterial. Damit sollte ein
in vitro Modell etabliert werden, um endokrinologische Fragestellungen bezüglich der
somatotropen Achse zu untersuchen und im speziellen die Faktoren, die die GHR
Expression bei der Milchkuh beeinflussen, zu bearbeiten. Demnach wurde in der hier
vorliegenden Dissertation die Expression des GHR-Rezeptors bzw. der IGF-I mRNA
Expression neben Vitalitätsparametern besonders untersucht. Zellkulturen von
primären Hepatozyten werden bereits seit über 40 Jahren mit vielfältigsten
Anwendungsgebieten in der Literatur beschrieben. Ein Haupteinsatzgebiet der
Hepatozytenkulturen stellen hierbei vor allem pharmazeutische Anwendungs- und
Toxizitätsstudien von Medikamenten auf den Stoffwechsel der Leberzelle dar.
Weitere Einsatzgebiete sind Untersuchungen zum Lebermetabolismus und zu
Signaltransduktionswegen, Leberregeneration sowie fetale Leberentwicklung (Ellis
and Nilsson, 2010; Hewitt et al., 2007; Shulman and Nahmias, 2013). Hierbei gelten
als Goldstandard für metabolische Studien nach wie vor humane primäre
Hepatozyten (Li et al., 2010; Sahi et al., 2010). Aufgrund mangelnder Verfügbarkeit
humaner Zellen hat sich allerdings die Verwendung von primären Ratten- und
Maushepatozyten im Labor durchgesetzt. Da die gesamte Stoffwechsellage beim
Rind als ruminierende Tierart nicht vergleichbar ist mit den gängigen Labornagern
oder dem Menschen sollte für Studien von endokrinologischen Funktionen der Leber
der Milchkuh eine bovine Zellkultur verwendet werden. Somit war es in dieser Arbeit
zudem Forschungsgegenstand, auf Besonderheiten in den Zellkulturbedingungen
speziell für bovine Zellen zu achten.
92
Diskussion
5.1
Isolation primärer boviner Hepatozyten
In dieser Dissertation konnte gezeigt werden, dass sich primäre Hepatozyten des
Rindes aus Schlachthofmaterial erfolgreich gewinnen lassen. Die Isolation primärer
Hepatozyten größerer Nutztiere wurde in der Literatur ebenfalls kürzlich beschrieben
(Giantin et al., 2012; Panda et al., 2015; Spotorno et al., 2006; Stefanski et al., 2013).
Dabei finden sich unterschiedliche Isolations- und Perfusionsverfahren, welche im
Literaturteil dieser Arbeit bereits näher aufgezeigt wurden, Anwendung. In dieser
Arbeit
wurde
als
Isolationsmethodik
eine
modifizierte
Two-Step
Kollagenaseperfusionstechnik nach Seglen (1972) angewendet. Giantin et al. (2012)
und Panda et al. (2015) verwenden ebenfalls modifiziert diese Perfusionstechnik
nach Seglen (1972) für ihre Isolation von Rinder- bzw. Büffelhepatozyten.
Wie bereits erwähnt konnte nach einer Etablierungsphase in dieser Arbeit ein
Endprotokoll erstellt werden, nachdem vitale bovine Hepatozyten aus Lebermaterial
vom Schlachthof erfolgreich gewonnen werden können. Im Durchschnitt wurden
nach diesem Protokoll mit einer zusätzlichen Dichtegradientenzentrifugation mit
Easycoll®-Aufreinigung 60,5 ± 9,6% vitale Zellen gewonnen. Die Viabilität der
isolierten
Zellen
liegt
im
Vergleich
zu
anderen
Studien
aus
bovinem
Schlachthofmaterial etwas geringer. So erhielten im Vergleich dazu Giantin et al.
(2012) durchschnittlich 88,0 ± 4,2% vitale Hepatozyten bei einer Zellausbeute von
459,76±119,59x106 Zellen aus zwei gesunden Färsen nach Schlachtung. Panda et
al. (2015) konnten 82,0% ± 3,5% lebende Hepatozyten aus gesunden Büffeln nach
Schlachtung isolieren. In beiden Arbeiten wird die Zeitdauer zwischen Schlachtung
und der Entnahme der Leber bzw. des Leberstückes, also die sogenannte warme
Ischämiezeit, nicht genau definiert. Im eigenen Protokoll beläuft sich diese Zeit durch
einen standardisierten Schlachtprozess auf dem Schlachthof auf 25 Minuten. In den
Vergleichsstudien wird diesbezüglich nur die Angabe „direkt nach Schlachtung“
gemacht.
Hier
könnte
eine
mögliche
Erklärung
für
die
unterschiedlichen
Viabilitätsraten liegen, da die warme Ischämiezeit einen wesentlichen Faktor für die
Vitalität der isolierten Zellen darstellt (persönliche Mitteilung Dr. Georg Damm,
Charité Berlin). Dies bestätigt auch eine dieser Dissertation nachfolgende Studie der
93
Diskussion
eigenen
Arbeitsgruppe,
wonach
die
Viabilität
der
Hepatozyten
sowie
die
Zellausbeute bei kurzer warmer Ischämiezeit (fünf Minuten) signifikant höher lag als
bei längerer warmer Ischämiezeit (30 Minuten) (Witte S. et al., 2017).
Im Gegensatz zur eigenen Arbeit kommen beide o. a. Studien ohne Dichtegradienten
Zentrifugation zur Aufreinigung der lebenden Zellen auf eine im Vergleich
verhältnismäßig hohe Viabilitätsrate der frisch isolierten Hepatozyten. Unterschiede
zum eigenen Protokoll lassen sich in der Zusammensetzung der Perfusionspuffer,
der angewandten Perfusionszeiten, der Kollagenasekonzentration sowie der
Durchführung der verwendeten Kollagenaseperfusionstechnik finden. Durch diese
individuellen Unterschiede könnte die geringere Vitalität der eigenen Zellen im
Vergleich zu den anderen Studien spekuliert werden. Panda et al. (2015) führen die
erste Perfusion bereits auf dem Schlachthof durch. Sie verwenden 500 ml eines 4°C
kühlen, Calcium- und Magnesiumfreien 33 mM HEPES-Puffers mit 0,5 mM EGTA,
welcher mittels Spritze und Kanüle durch die Gefäßanschnitte gespült wurde.
Folgend werden weitere 250 ml des 33mM HEPES-Puffers perfundiert und das
Leberstück in diesem Puffer eisgekühlt transportiert. Erst im Labor folgte der zweite
Perfusionsschritt mit 100 ml eines 37°C warmen HEPES-Puffers mit CalciumchloridZusatz sowie Kollagenase Typ IV (500 ng/ml) und 0,125% Hyaluronidase. Nach der
Perfusion wurde das Leberstück für 10 min inkubiert bei 37°C, bevor die Zellen mit
Hilfe
eines
Skalpells
isoliert
wurden.
Obwohl
auch
hier
die
Two-Step-
Kollagenaseperfusion nach Seglen (1972) modifiziert angewendet wurde, sind große
Unterschiede zum eigenen Protokoll zu sehen. Vergleichbar ist das gekühlte
Vorspülen auf dem Schlachthof mit einem EGTA-haltigen Puffer. Auch der in der
eigenen Arbeit verwendete Eurocollins Puffer enthält EGTA, allerdings 1 mM in der
Konzentration. Dieses Vorspülen dient in beiden Arbeiten dem Entfernen der
Blutreste aus dem Gefäßsystem sowie der Bindung von Calciumionen durch das
EGTA und der Lösung von Zell-Zellkontakten. Die Einwirkzeit des EGTA ist bei
Panda et al. (2015) im Vergleich zur eigenen Arbeit länger. Das EGTA wird dem
Gewebe in dieser Studie nur gekühlt zugeführt. In der eigenen Arbeit findet die
Perfusion mit dem EGTA-haltigen Perfusionspuffer I bei 37°C statt. Möglicherweise
ist diese gekühlte Perfusion von Panda et al. (2015) schonender für die Zellen. Dies
94
Diskussion
müsste in nachfolgenden Untersuchungen an den primären Hepatozyten geprüft
werden. Die Perfusionstechnik von Giantin et al. (2012) ist mit dem eigenen Protokoll
vergleichbarer als die von Panda et al. (2015). Auch bei Giantin et al. (2012) wird mit
gekühltem Eurocollins-Puffer mit 1 mM EGTA-Zusatz vorgespült. Es folgt eine
sogenannte „Three-Step-Perfusion“ mit einer peristaltischen Pumpe, welche auch im
eigenen
Protokoll
durchgeführt
wird.
Der
zweite
Perfusionsschritt,
der
Zwischenspülschritt, besteht im Gegensatz zur eigenen Arbeit bei Giantin et al.
(2012) aus einer Spülung des Leberstückes mit dem Perfusionspuffer I ohne EGTAZusatz. Im eigenen Protokoll wird der Kollagenasepuffer ohne Kollagenasezusatz
über fünf Minuten verwendet, um dem Gewebe wieder Calcium für eine bessere
Kollagenasewirkung zu geben. Anhand der höheren Vitalitätsrate von Giantin et al.
(2012) wäre im eigenen Protokoll der Zwischenspülschritt zu überprüfen. Es kann
spekuliert werden, ob das zugeführte Calcium im eigenen Zwischenspülschritt von
dem im Gewebe verbliebenen EGTA abgefangen wurde und so nicht mehr in
ausreichender Menge verfügbar ist für die anschließende Kollagenase. Eventuell
könnte der Zwischenspülschritt verlängert werden oder die Zwischenspülung
vergleichbar zu Giantin et al. (2012) modifiziert werden. Dies müssten ebenfalls
weitere Versuche zeigen.
Das Vorspülen des Leberstückes auf dem Schlachthof wird in der eigenen Arbeit, wie
bereits erwähnt, mit 100 ml eisgekühltem Eurocollins-Puffer mit 1 mM EGTA-Zusatz
durchgeführt. Giantin et al. (2012) spülen ebenfalls mit diesem Puffer, allerdings mit
300-400 ml. Hier könnte ein weiterer Grund für die im Vergleich niedrigere Vitalität
der Zellen in der eigenen Arbeit liegen. Das Gewebe erhält mit dem größeren
Spülvolumen über einen längeren Zeitraum vermehrt die Möglichkeit die protektiven
Eigenschaften des Transportpuffers zu nutzen. Diese bestehen aus der Reduzierung
der durch Hypothermie bedingten zellschädigenden Einflüsse durch Supplementation
von Substraten und Energiezufuhr (Tolba et al., 2000).
Ein weiterer entscheidender Faktor für eine höhere Viabilität der gewonnenen Zellen
kann die Qualität der verwendeten Kollagenasecharge sein. Dies zeigt sehr eindeutig
eine Studie von Bakala et al. (2003) an equinen Hepatozyten. Hier wurden
verschiedene Kollagenase-Typen vergleichend untersucht und der Einfluss auf die
95
Diskussion
Viabilität isolierter Pferdehepatozyten geprüft. Die Viabilitätsraten liegen hierbei
zwischen 10% bis über 80% je nach verwendeter Charge. Dies wurde auch von der
Arbeitsgruppe Prof. Hengstler, IFADO Dortmund, mündlich bestätigt. Nicht jede
Charge besitzt die gleiche Aktivität, so dass chargenabhängig neu geprüft werden
muss, in wie weit die Kollagenase sich für die Gewinnung der Hepatozyten eignet.
Auch die eingesetzte Menge an Kollagenase, sowie die Perfusionszeiten variieren
dadurch
deutlich.
In
der hier
beschriebenen
Arbeit
kamen
während
der
Etablierungsphase verschiedene Kollagenasechargen zum Einsatz. Die eingesetzte
Menge wurde allerdings nur in der Einwaage des Puffers in mg je nach dem
vorherigen Ergebnis angepasst. Hier sollte in Folge versucht werden standardisierter
zu arbeiten, indem bezogen auf das Gewicht der Leber in g, die Kollagenaseaktivität
bzw. Kollagenaseeinwaage berechnet und eingesetzt wird. Eine zu lange Einwirkzeit
der Kollagenase erwies sich in den eigenen Versuchen als negativ. Das gewonnene
Zellmaterial erschien überverdaut und die Vitalität der Zellen lag insgesamt niedrig.
Die Perfusionszeit des Kollagenasepuffers in der Arbeit von Giantin et al. (2012)
erscheint mit 17-20 min aus eigener Erfahrung recht lang. Demnach könnte die
eingesetzte Kollagenase nur eine geringe Aktivität besitzen und ggf. schonender die
Zellen lösen, als die eigene Charge, bei der es zu einem verhältnismäßig schnelleren
Verdau des Gewebes kam.
Im Zuge der Etablierungsphase wurden dem Perfusionspuffer I Zusätze wie
Aminosäuren, Na-Pyruvat, Glucose, Dexamethason und bovines Insulin als Energieund Nährstoffquelle hinzugegeben, um die Zellen während der Perfusionszeit optimal
versorgen zu können. Diese finden sich in den Protokollen von Giantin et al. (2012)
und Panda et al. (2015) nicht. Da durch die Zusätze keine höheren Viabilitäten erzielt
werden konnten, kann zum einen diskutiert werden, dass die Zellen dadurch eine
eventuell höhere Stoffwechselrate hatten, was eher negativ zu werten wäre, oder
dass der protektive Nutzen den zellschädigenden Einflüssen während der Isolation
nicht ausreichend war. Panda et al. (2015) geben diese Zusätze erst nach dem
dreimaligen Waschen der Zellen zur Resuspensionslösung des Zellpellets.
Spotorno et al. (2006) beschreiben in ihrer Arbeit eine Technik zur Zellisolation ohne
Perfusion. Sie entnehmen den Lobus caudatus gesunder Kälberlebern vom
96
Diskussion
Schlachthof. Nach einer Transportzeit von 30 min werden kleine Leberstückchen aus
dem Lobus caudatus herausgeschnitten, manuell zerkleinert und in PBS ohne EGTA
gewaschen. Das Gewebe wurde anschließend in kühler Kollagenase II-Lösung (500
ng ml-1) gegeben und 12 min inkubiert. Als Ergebnis werden 1,60 ± 0,57 x10 8
lebende Zellen pro g Gewebe angegeben. In der eigenen Arbeit wurde ebenfalls bei
einer Leber nur Kollagenase-Einwirkung getestet ohne vorherige EGTA Perfusion. Im
Unterschied zu Spotorno et al. (2006) wurde im eigenen Versuch die KollagenaseLösung allerdings durch das Leberstück perfundiert und die Puffertemperatur betrug
37°C. Die Zellausbeute vitaler Zellen lag bei 1,7x10 6 Zellen pro ml Zellsuspension,
die Viabilität bei nur 24%. Spotorno et al. (2006) beschreiben, dass sie mit kaltem
Puffer inkubieren. Da die Zellausbeute vitaler Zellen bei Spotorno et al. (2006) als
recht hoch angesehen werden kann im Vergleich zu eigenen Ergebnissen, stellt sich
hier die Frage, ob durch diesen kühlen Temperaturbereich die Leberzellen eventuell
nicht so stark angegriffen werden. Dieser Hypothese entgegen spricht allerdings,
dass die Kollagenase ein Enzym ist, dessen optimale Aktivität bei einer Temperatur
im Bereich der Körpertemperatur liegt. Das Ergebnis von Spotorno et al. (2006) kann
hier durchaus kritisch betrachtet werden. Eine modifizierte Technik nach Spotorno et
al. (2006) geben Lemley and Wilson (2010) an. Sie inkubieren das zerkleinerte,
gewaschene Gewebe 45 min in einer 37°C warmen Kollagenaselösung und erhalten
eine Viabilität von 83% bei einer Zellausbeute von 40,8x 10 6 Zellen.
Brameld et al. (1995) führen Isolationen von Hepatozyten aus Schlachthofmaterial
vom Schwein durch. Bei ihnen wird eine Viabilität der Zellen von 75-94% angegeben.
Dies
ist
vergleichbar
zu
den
Ergebnissen
aus
den
o.g.
Studien
mit
Rinderhepatozyten und den eigenen Ergebnissen.
Im Vergleich zu Hepatozytenisolationen von Nutztieren, die nicht nach Schlachtung,
sondern unmittelbar nach Euthanasie stattfinden, fallen die Zellausbeute sowie die
Viabilität der Zellen insgesamt bei Schlachttieren etwas geringer aus. So geben Jiang
et al. (2013) eine Viabilität von über 95% einer Studie mit euthanasierten Rindern,
nach
Percoll-Aufreinigung,
Dichtegradientenzentrifugation
an.
in
Zhang
ihrer
et
Studie
al.
(2012)
kommen
ohne
bei
Kälberhepatozyten
nach
Euthanasie auf durchschnittlich 85,7% bei einer Zellausbeute von 1,12x10
97
7
Zellen.
Diskussion
Die
Viabilitätsrate
ist
hier
vergleichbar
zu
Giantin
et
al.
(2012)
aus
Schlachthofmaterial, jedoch liegt die Zellausbeute bei Zhang et al. (2012) deutlich
höher.
Nach Shulman and Nahmias (2013) liegt die durchschnittliche Viabilität von isolierten
primären Hepatozyten bei Ratten bei >90% sowie einer Zellausbeute von 100-400
Millionen Zellen pro Tier. Dies deckt sich mit den Ergebnissen der eigenen Arbeit an
Rattenhepatozyten. Die am IFADO Dortmund nach standardisiertem Protokoll
gewonnenen Rattenhepatozyten zeigten eine Viabilität von 97% bei einer
Zellausbeute von 110 Millionen Zellen. Ratten stellen eine der am häufigsten
genutzten Quellen zur Gewinnung von primären Hepatozyten dar (Shulman and
Nahmias, 2013). Die Viabilität der isolierten Hepatozyten von Nutztieren ist
wesentlich aufwendiger, und die Viabilität liegt insgesamt im Vergleich zu kleinen
Labortieren etwas niedriger. Dennoch geht aus der eigenen Arbeit sowie anderen
o.a. Studien hervor, dass es möglich ist vitale Zellen aus großen Nutztieren zu
isolieren und zu nutzen. Es ist zudem zu erwarten, dass die Viabilität der Zellen
höher ist, wenn die Leber bereits in situ perfundiert wird. Die eigenen bovinen Lebern
wurden erst nach einem Transport und einer ersten Kühlung des Gewebes wieder
erwärmt und dann perfundiert. Diese erneute Erwärmung des zuvor kalten Gewebes
ist ebenfalls ein kritischer Punkt und kann zu den Divergenzen in den Viabilitäten
zwischen Schlachthofleber und frischer Rattenleber führen.
5.2
Zellkultur
5.2.1 Morphologie primärer Hepatozyten
In dieser Arbeit wurden in einem Vorversuch primäre Rattenhepatozyten über sieben
Tage in einer Sandwichkultur kultiviert. Primäre bovine Hepatozyten wurden
vergleichend in Monolayer- als auch in Sandwichkultur genommen. Ratten- sowie
bovine primäre Hepatozyten zeigten kurz nach der Einsaat sowohl in der Sandwich
als auch in der Monolayer Kultur bis zu Tag 1 vergleichbare Zellmorphologien mit
98
Diskussion
runder bis polygonaler Form und scharfen Zellgrenzen. Die Zellen lagen zum größten
Teil einzeln. Ab Tag 2 wiesen die Zellen in der Monolayer Kultur der bovinen
Hepatozyten bereits vermehrt unschärfere Zellgrenzen mit Membranausläufern und
eine eckigere Form auf. Einzelne Zellen lagerten sich zusammen. In der Sandwich
Kultur der ratten- und bovinen Hepatozyten bestand hingegen weiterhin eine
polygonale Form mit scharfen Zellgrenzen. Ein Zellzusammenschluss war zu
erkennen. Ab Tag 3 wurde der morphologische Unterschied beider Zellkultursysteme
vergleichend bei den bovinen Hepatozyten immer deutlicher. In der Monolayer Kultur
fanden sich ab Tag 3 vermehrt Zellen mit fibroblastoidem Aussehen und die
Zellgrenzen waren unscharf. Zellen in der Sandwich Kultur wiesen weiterhin vermehrt
polygonales Aussehen auf. Die Tendenz zum Zusammenschluss einzelner Zellen
bestand allerdings in beiden Kultursystemen. Das fibroblastoide Aussehen der Zellen
im Monolayer deckt sich mit Studien an primären Rattenhepatozyten, welche
ebenfalls im Monolayer kultiviert wurden. Auch diese weisen nach 72h diese
fibroblastische Form auf (Tuschl et al., 2009; Tuschl and Mueller, 2006). Shulman
and Nahmias (2013) sprechen davon, dass die kuboide Gestalt der primären
Hepatozyten im Monolayer schnell verloren geht und die Zellen durch Stress
Aktinfilamente bilden um die Zellintegrität zu erhalten. Dieses äußere sich nach den
Autoren in einer „fibroiden Gestalt“. Nach persönlicher Mitteilung von Frau Dr. Nina
Hambruch, Anatomisches Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover besteht für
die vitalen Zellen im Monolayer zudem die Möglichkeit der Fortbewegung auf der
Suche nach einer Nachbarzelle für einen Zusammenschluss der Zellen. So ist es
möglich,
dass
die
Zellen
auf
der
Kollagenfläche
wandern
und
dafür
Zellausstülpungen sichtbar werden. Die morphologische Gestalt würde sich demnach
über die Zeit hinweg ändern. Damit wäre diese fibroide Gestalt nicht unbedingt nur
ein Zeichen für gestresste Zellen kurz vor dem Zelltod. Dies könnte in
weiterführenden Studien mit Hilfe eines Live Imaging Mikroskops untersucht werden.
Die Zellen in der Sandwich Kultur zeigten in der eigenen Arbeit über die
Versuchsdauer hinweg zumeist eine polygonale Form und die Tendenz zum
Zusammenschluss. Es bildeten sich gut erkennbare Zell-Zellverbindungen. Einige
Zellen wiesen eine eher langgestreckte Form auf. Diese Ergebnisse decken sich mit
99
Diskussion
den eigenen Ergebnissen aus dem Vorversuch mit Rattenhepatozyten sowie mit
anderen Studien an Rattenhepatozyten in Sandwich Kultur (Shulman and Nahmias,
2013; Tuschl and Mueller, 2006; Vinken et al., 2006). Vinken et al. (2006)
beschreiben
in
ihrer
Arbeit
die
Bedeutung
der
Zell-Zellkontakte
für
die
leberspezifische Funktionalität der Zellen in vitro. Gerade die Ausbildung von tight
junctions und gap junctions seien den Autoren nach für den inter- und intrazellulären
Stoffwechsel und zum Erhalt der Zellen von besonderer Bedeutung. Durch die
Zellverbindungen wird die Differenzierung der Hepatozyten ausgeprägt, und
Funktionen wie die Albuminsynthese, Gluconeogenese und Gallensekretion können
ablaufen. Da auch in der eigenen Arbeit, sowohl bei den Ratten- als auch den
bovinen Hepatozyten, diese Zell-Zellkontakte mikroskopisch nachgewiesen werden
konnten, kann auch hier auf die positiven Effekte einer Differenzierung der Zellen in
eigener
Kultur
spekuliert
werden.
Die
Anordnung
der
Zellen
wies
die
charakteristische, anatomische leberspezifische Bälkchenstruktur auf. Hieraus lässt
sich schließen, dass auch die Ausprägung von apikaler, lateraler und basaler
Membran in gewisser Weise stattfindet und die Ausprägung spezifischer Funktionen
der Hepatozyten könnte spekuliert werden. Die dreidimensionale Kultur soll Studien
zur Folge den Phänotyp der Leberzelle über Wochen erhalten und ist somit einem
2D-System wie dem Monolayer überlegen (Dunn et al., 1989; Swift et al., 2010;
Treyer and Müsch, 2013). In der hier beschriebenen Arbeit konnten mit Hilfe der
Lebend/Tot Färbung über 14 Tage lebende Hepatozyten mikroskopisch in der
Sandwich Kultur nachgewiesen werden.
Weiterhin ließen sich in der eigenen Arbeit in der Sandwich Kultur der
Rattenhepatozyten und auch der bovinen Hepatozyten zwischen den Zellen
Strukturen erkennen, die auf die Ausbildung von Gallenkanälchen schließen lassen.
Dies deckt sich auch mit anderen Studien an Rattenhepatozyten, bei der die
Ausbildung von Gallenkanälchen in der Sandwich Kultur ab Tag 2 als
charakteristisch beschreiben (LeCluyse et al., 2005; Reif et al., 2015). Allerdings
wurde in der eigenen Arbeit nur eine lichtmikroskopische Betrachtung der
Zellgrenzen durchgeführt. Nach LeCluyse et al. (2005) erscheinen diese Canaliculi
im Lichtmikroskop irregulär und doppelwandig. Es gilt zu bedenken, dass es sich
100
Diskussion
hierbei nicht um einen spezifischen Nachweis handelt. Hierzu sollte in folgenden
Versuchen mit spezifischen Markern für Gallenkanälchen gearbeitet werden und ggf.
auch deren Funktion geprüft werden. Die Struktur der Gallenkänälchen kann über
einen immunhistologischen Nachweis der Expression des apikalen Membranmarkers
DPPIV, Dipeptidylpeptidase 4, mittels eines spezifischen Antikörpers erfolgen
(LeCluyse et al., 2005; Reif et al., 2015). Die Überprüfung der Funktionalität gelingt
zum
Beispiel
mit
der
Messung
der
Metabolisation
des
CMFDA
(5-
chloromethylfluorescein diacetat) (Reif et al., 2015), oder des Carboxy-DCFDA
(Hoffmaster et al., 2004). Reif et al. (2015) geben ab Tag drei der Sandwich Kultur
von Maushepatozyten ein Medium mit einem 1,6 Mm CMFDA Zusatz hinzu. Die
Kultur wurde unverzüglich unter ein Mikroskop mit einem Laserlicht von 740 nm
Wellenlänge gestellt und als Live Imaging alle zehn Sekunden fotografiert. Das
Grundprinzip dieses Nachweises ist, dass das fluorogene Substrat CMFDA passiv
die Membran der Hepatozyten durchquert und intrazellulär zu ihrem fluoreszierenden
Metaboliten umgewandelt wird. Dieser Metabolit wird dann in die Gallenkanälchen
eliminiert und kann dort mit einem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden.
Reif et al. (2015) geben weiterhin an, dass die Sandwich Kultur eine sehr ähnliche
Metabolisierung des CMFDA aufweist, vergleichend zur in vivo Situation, allerdings
mit reduzierter Effizienz. Liu et al. (1999) geben in ihrer Studie an, dass die biliäre
Effizienz der Ausscheidung von Gallensäuren eine gute Korrelation im Vergleich von
Sandwich Kulturen und der in vivo Situation aufweist.
Abschließend lässt sich zusammenfassen, dass die Morphologie der primären
bovinen Hepatozyten mit den primären Rattenhepatozyten vergleichbar war. Die
Rattenhepatozyten wurden, wie bereits erwähnt, aus der Arbeitsgruppe des IFADO
Dortmund gewonnen, welche jahrelange Erfahrung in der Isolation dieser Zellen hat.
Daher
kann
davon
ausgegangen
werden,
dass
basierend
auf
der
rein
makroskopischen Betrachtung in der eigenen Arbeit vitale Rattenhepatozyten
kultiviert wurden. Daher kann in der eigenen Arbeit ein Vergleich in der Beurteilung
der Morphologie der bovinen Hepatozyten mit diesen Zellen durchgeführt werden.
Die morphologischen Veränderungen der bovinen Hepatozyten über die Kulturtage
war mit denen der Rattenhepatozyten vergleichbar, obwohl diese zur Zeit der
101
Diskussion
Gewinnung, aufgrund der sehr kurzen warmen Ischämiezeit als viel „frischer“ zu
beurteilen sind. Panda et al. (2015) beschreiben in der Sandwich Kultur
vergleichbare Resultate zur eigenen Arbeit. Die Hepatozyten wurden bei Panda et al.
(2015) über sieben Tage kultiviert. Sie wiesen, genau wie die eigenen gewonnenen
bovinen Hepatozyten als auch die Rattenhepatozyten eine polygonale Form auf und
bildeten Zell-Zellkontakte sowie eine Ausprägung zellulärer Polarität.
5.2.2 Mediumzusammensetzung für primäre bovine Hepatozyten
Für optimale Kulturbedingungen ist neben dem Kultursystem die Zusammensetzung
des Kulturmediums ein entscheidender Faktor. In der eigenen Arbeit wurde bei den
Rattenhepatozyten sowie den bovinen Hepatozyten serumhaltiges Medium nur in der
Adhäsionszeit der Zellen über einen Zeitraum von vier Stunden verwendet. Nach
Vinken et al. (2006) fördert der Serumzusatz in dieser Phase für die Adhäsion der
frisch isolierten Zellen an die Oberfläche der Kulturplatte. Nach dem Folgenden
Mediumwechsel wurde ausschließlich serumfreies Medium benutzt. Tuschl et al.
(2009) untersuchten den Einfluss von Serum im Medium auf die Morphologie der
Zellen in der Kultur, die Zellviabilität, funktionelle Parameter wie beispielsweise die
Aktivität von Cytochrom P450 und der Metabolisierung von Carboxy-DCFDA zur
Überprüfung biliärer Aktivität. Dazu verwendeten sie Monolayer und Sandwich
Kulturen jeweils mit und ohne Serum im Medium. Sie kamen zu dem Ergebnis, dass
die primären Rattenhepatozyten am optimalsten unter serumfreien Medium in der
Sandwich Kultur kultiviert wurden. Es zeigte sich über 10 Tage eine gute Ausprägung
von
Zell-Zellkontakten
sowie
scharfen
Zellgrenzen.
Die
Ausbildung
von
Gallenkanälchen sowie deren Funktionalität konnten die Autoren nur bei der
serumfreien Sandwichkultur beobachten. In der Sandwich Kultur mit Serumzusatz
wurde ab Tag 3 eine Ansammlung „tropfenähnlicher“ Einschlüsse in den Zellen
beschrieben, die sich über die Zeit vermehrte. Giantin et al. (2012) verwenden für
ihre Monolayer Kultur ebenfalls serumhaltiges Medium für die Adhäsionszeit und
führen dann einen Mediumwechsel auf serumfreies Medium durch. Dies ist
102
Diskussion
vergleichbar mit der eigenen Arbeit an Rattenhepatozyten und bovinen Hepatozyten.
Shulman and Nahmias (2013) geben weiterhin an, dass serumfreies Medium gut
geeignet sei für „short term cultures“ bis zu 10 Tage und für „long term cultures“ über
mehrere Wochen serumhaltiges Medium mit einer benötigten Adaptationsphase, in
welcher Serum schrittweise zugesetzt und die Konzentration erhöht wird, zu
bevorzugen wäre. Hier geben die Autoren die Verwendung von DMEM als
Mediumgrundlage an. In der eigenen Arbeit wurden die bovinen Hepatozyten über 14
Tage in der Sandwich Kultur kultiviert. Hierbei ist kritisch zu diskutieren, ob es sich
hierbei um eine „short term“ oder „long term“ Kultur per oben aufgeführter Definition
handelt. In weiterführenden Untersuchungen könnte mit einer oben genannten
Adaptationsphase unter Verwendung des DMEM-Mediums mit Serumzusatz eine
Überprüfung der Kultivierung der bovinen Hepatozyten als „long term“ Kultur
eventuell vergleichend zum bestehenden Mediumprotokoll durchgeführt werden.
Zur Verbesserung der Überlebensrate sowie der Vitalität der Zellen in Kultur sind
auch andere Zusätze im Medium entscheidend. Insulin und Glukagon kontrollieren
den Glukosespiegel im Blut. Beide Hormone dienen der Verbesserung der
hepatozellulären Funktion der Zellen (Vinken et al., 2006). Insulin, welches auch in
der eigenen Arbeit dem jeweiligen Kulturmedium zugesetzt wird soll laut Bresgen et
al. (2008) den spontanen Zelltod in primären Zellen reduzieren. Zudem soll die
Expression
Apoptoserate
des
antiapoptotischen
reduziert
werden
Markers
(Bilodeau
BCL-xL
et
al.,
ansteigen
2004).
Der
und
Zusatz
damit
von
Dexamethason, ebenfalls in der eigenen Arbeit als Mediumzusatz eingesetzt, soll die
Expression von BAX und weiterer Apoptosegene inhibieren. Zudem soll der
Dedifferenzierung der Zellen entgegengewirkt werden und so einen positiven
Einfluss auf die Zellmorphologie und Funktionalität haben (Vinken et al., 2014). In
Zukunft könnten dem Medium zur Verbesserung der Kulturbedingungen noch weitere
Zusätze zugeführt werden und deren Einfluss in eigener Kultur der bovinen
Hepatozyten getestet werden. Häufig verwendete und beschriebene Mediumzusätze
sind der Epidermal Growth Factor (EGF) sowie der Hepatocyte Growth Factor (HGF)
(Vinken et al., 2006). Wachstumsfaktoren sind bekannt dafür, dass sie die Zellen vor
einer Vielzahl von Apoptosestimuli schützen sollen (Ethier et al., 2003). Nach
103
Diskussion
Schulze-Bergkamen et al. (2004) inhibiert der HGF Fas-mediierten Zelltod bei
primären humanen Hepatozyten. Zudem reguliert es das antiapoptotische Bcl2-xL
hoch und wirkt protektiv gegen oxidativen Stress (Gómez-Quiroz et al., 2008). Ethier
et al. (2003) konnten ebenfalls für EGF eine reduzierte Fas-mediierte Apoptose an
Maushepatozyten nachweisen. Zusammen mit Insulin reduziert EGF den spontanen
Zelltod in primären Hepatozytenkulturen (Bresgen et al., 2008). Phenobarbital als
weiterer Zusatz zeigt laut Vinken et al. (2006) einen positiven Einfluss auf die
Funktionalität von primären Hepatozyten.
Eingehend auf den besonderen Glucosestoffwechsel des Rindes als ruminierendes
Tier wurde Na-Pyruvat in der eigenen Kultur der bovinen Hepatozyten hinzugefügt.
Diese soll neben der Glucose als weitere Energiequelle von den Zellen genutzt
werden können. Pyruvat ist ein Spaltprodukt der Glykolyse und wird über Acetyl-CoA
dem Citratzyklus zugeführt. So steht es dem Stoffwechsel der Wiederkäuer zur
Glukoneogenese zur Verfügung. Aufgenommene Kohlenhydrate werden im Pansen
zu kurzkettigen Fettsäuren fermentiert. Wiederkäuer beanspruchen den größten Teil
ihres Glukosebedarfs aus einer De-Novo Synthese nach dem wiederkäuen. Der
qualitative
Unterschied
zum
Nicht-Wiederkäuer
besteht
darin,
dass
beim
Wiederkäuer das Proprionat, eine kurzkettige Fettsäure, als Hauptsubstrat zur
Gluconeogenese verwendet wird (Aschenbach et al., 2010). Allerdings sind in
eigener Arbeit keine Vergleiche der Zellkultur mit und ohne Na-Pyruvat Zusatz
gemacht worden, um gezielte Aussagen zur Wirksamkeit zu machen. Dies sollte in
nachfolgenden Studien überprüft werden.
104
Diskussion
5.3
Vitalitätsmessungen
5.3.1 Harnstoff
Zur Überprüfung der Vitalität und Integrität der primären bovinen Hepatozyten
während
der
Kultivierung
wurde
neben
dem
Live/Dead-Staining
und
der
mikroskopischen Analyse der Stoffwechselparameter Harnstoff aus den jeweiligen
Mediumproben der Versuchstage 1,2,3,4,7 und 10 analysiert.
Der qualitative Nachweis der Harnstoffsynthese gilt in der Leberzellkultur als ein
wichtiger Funktionsparameter, der auf die Erhaltung metabolischer Kompetenz der
Hepatozyten
hinweist
(Shulman
and
Nahmias,
2013).
Im
Rahmen
des
Proteinstoffwechsels entsteht vorwiegend durch den Abbau von Aminosäuren das
Molekül Ammoniak. Beim Abbauprozess der Aminosäuren wird der Aminostickstoff
als Ammoniak unter Bildung von Ketosäuren abgespalten. Die Ausscheidung von
Ammoniak erfolgt zu ca. 70% als Harnstoff durch die Harnstoffbiosynthese im
periportalen Bereich der Leber.
Die Ergebnisse der eigenen Arbeit zeigen, dass die Harnstoffkonzentration im
Monolayer der bovinen Hepatozyten zwischen Tag 1 und Tag 2 stark absinkt, dann
aber zu Tag 3 wieder ansteigt. Dies ist vergleichbar mit der Arbeit von Zhang et al.
(2012) an Kälberhepatozyten. Auch diese zeigen einen leichten Anstieg der
Harnstoffkonzentration ab Tag 3 im Monolayer, welche dann über sieben Tage
annähernd konstant blieb. Bei Donkin and Armentano (1993) verringerte sich die
Harnstoffrate nach 120 Stunden im Monolayer. In der Sandwich Kultur bleibt in der
eigenen Arbeit die Harnstoffkonzentration in den ersten drei Kulturtagen annähernd
konstant, fällt zu Tag 4 ab und steigt an Tag 7 wieder an. Vergleichend zur eigenen
Monolayer Kultur, lag der Harnstoffwert der Sandwich Kultur deutlich höher. Es kann
daher spekuliert werden, dass die Sandwich Kultur den primären Hepatozyten
bessere Kulturbedingungen bietet.
105
Diskussion
5.3.2 LDH
Die LDH stellt in der Leberzellkultur ein wichtiges Maß für die Integrität der Zellen
dar, da es bei Zellschäden freigesetzt wird und im Mediumüberstand zu messen ist
(Maes et al., 2015). Die LDH Konzentration blieb in der eigenen Arbeit bei den
bovinen Hepatozyten im Monolayer über drei Versuchstage vergleichbar. In der
Sandwich Kultur kann ein Abfall der LDH Konzentration bis Tag 7 verzeichnet
werden. Die LDH Werte lagen im Sandwich zudem deutlich unter den Werten der
Monolayer Kultur. Demnach kann spekuliert werden, das es in der eigenen Sandwich
Kultur zu weniger Zellschäden kam. Zhang et al. (2012) verzeichnen in ihrer Studie
an
isolierten
Kälberhepatozyten
hingegen
einen
leichten
Abfall
der
LDH
Konzentration im Monolayer bis zu Tag 3, danach bis zu Tag 7 einen allmählichen
Anstieg. Dieser Unterschied zur eigenen Arbeit könnte damit zusammenhängen,
dass die isolierten Hepatozyten von einem Kalb direkt nach Euthanasie entnommen
wurden. Die Vorteile einer kurzen Ischämiezeit wurden bereits zuvor erläutert.
5.3.3 Apoptosemarker
Des Weiteren
wurden
die
Apoptose
Marker
BAX
und
FasL
sowie
der
antiapoptotische Marker BCl-xL zur Überprüfung der Vitalität in der Kultur mittels
PCR bestimmt. Die eigenen Ergebnisse zeigen, dass die Apoptoserate in der
Sandwich Kultur insgesamt niedriger ist im Vergleich zum Monolayer. Die höhere
BAX Expression in der Sandwich Kultur an Tag 1 im Gegensatz zum Monolayer lässt
sich vermutlich damit erklären, dass in Apoptose befindliche Zellen ggf. im Sandwich
verbleiben, wohingegen die nicht mehr adhärenten Zellen im Monolayer weg
gewaschen werden.
Wie bereits in der Literaturübersicht beschrieben, konnten Vinken et al. (2011)
zeigen, dass es während der Kultivierung im Monolayer zwei Höhepunkte des
106
Diskussion
Zelltodes bei kultivierten Primärzellen gibt. Dabei kommen sowohl Apoptose als auch
Nekrose als Formen des Zelltodes vor. Die erste Welle ereignet sich zu einem sehr
frühen Zeitpunkt der Kultivierung und lässt sich aus den entstandenen Zellschäden
während der Isolation erklären. Vor allem beim Apoptosemarker BAX zeigt sich auch
in der eigenen Arbeit vergleichbar ein Anstieg der Expression an Tag1, sowohl im
Monolayer als auch im Sandwich. Auch Kucera et al. (2006) geben an, dass die
Expression von BAX bereits nach 15 min nach Beginn der Isolationsprozedur
ansteigt. Die zweite Spitze des Zelltodes registrieren Vinken et al. (2011) um den
zweiten Tag in Kultur, welche durch die Kulturbedingungen hervorgerufen wird. Diese
zweite Welle kann in der eigenen Arbeit für den Monolayer an Tag 3 spekuliert
werden, an dem die Expressionen sowohl von BAX und Fas, als auch BCl-xL
ansteigend sind. Im Sandwich hingegen wird ein zweiter Anstieg von BAX erst an
Tag 7 gemessen, der in Folge wieder abnimmt. Auf die beschriebene zweite Welle
des Zelltodes an Tag 2 in Kultur kann in der eigenen Arbeit im Monolayer ebenfalls
vergleichbar zu Vinken et al. (2011) anhand der gemessenen niedrigen Harnstoffund erhöhten LDH Konzentrationen geschlossen werden.
5.4
GHR und IGF-I Expression
Das Ziel dieser Arbeit war es, ein in vivo Modell für Studien am bovinen GHR zu
etablieren. Dazu ist es zunächst wichtig zu wissen, ob isolierte bovine Hepatozyten in
Kultur den GHR1A exprimieren und an welchem Tag in Kultur gegebenenfalls der
optimale Zeitpunkt für spätere Studien am Rezeptor liegt. Die Funktionalität des
Rezeptors sollte über die Expression von IGF-I bestimmt werden. In eigener Arbeit
konnte in einem Vorversuch mit Rattenhepatozyten gezeigt werden, dass die
Expression des GHR1A in der Sandwich Kultur von Tag 0 zu Tag 1 stark abfällt. Es
zeigt sich dann ein Anstieg zu Tag 3 hin und bis zu Tag 7 verbleibt die Expression
relativ konstant. Dieses Ergebnis ist vergleichbar mit der Sandwich Kultur mit bovinen
primären Hepatozyten aus der eigenen Arbeit. Auch hier wird ein starker Abfall der
GHR1A Expression von Tag 0 zu Tag1 verzeichnet. Die niedrigste Expression liegt
107
Diskussion
hier allerdings an Tag 2. Bis zu Tag 7 ist ein konstanter Anstieg zu messen. Im
Monolayer der bovinen Hepatozyten kann im Gegensatz kein Anstieg der GHR1A
Expression über drei Tage analysiert werden. Die Expression von IGF-I verzeichnet
in eigener Arbeit in allen Kultursystemen einen starken Abfall von Tag 0 zu Tag 1 und
bleibt konstant erniedrigt oder fällt weiter ab. Dies scheint unabhängig von der
jeweiligen Expressionshöhe des GHR1A zum jeweiligen Zeitpunkt zu sein. Dies ist
vergleichbar zu Studien von Brameld et al. (1995) an porcinen Hepatozyten. Die
Autoren geben an, dass die GHR Expression über die Dauer im Monolayer abnimmt
und die IGF-I Expression auf einem niedrigen Level verbleibt. Auch ein
Stimulationsversuch mit GH zeigt keinen Einfluss auf die IGF-I Expression. Anhand
der eigenen analysierten GHR1A Expression kann spekuliert werden, dass sich die
Sandwich Kultur für Studien am GHR besser eignet als der Monolayer. Nach eigenen
Ergebnissen sollten diese Studien nicht vor Tag 3 oder Tag 4 durchgeführt werden,
da sich erst ab diesem Zeitraum ein Anstieg der GHR Expression verzeichnen lässt.
An den Rattenhepatozyten wurde in eigener Arbeit ein GH-Stimulationsversuch
durchgeführt. Es zeigte sich ein Anstieg der IGF-I Expression zwischen
unbehandelten und mit rGH behandelten Zellen, wodurch auf eine Funktionalität des
GHR bei den Rattenhepatozyten geschlossen werden kann. Dieser Versuch sollte
nach Optimierung der Gewinnung und Kultivierung der Zellen im Folgenden auch an
den bovinen Hepatozyten durchgeführt werden, um eine gezieltere Aussage zur
Funktionalität des GHR treffen zu können. Brameld et al. (1995) konnten wie oben
aufgeführt an porcinen Hepatozyten keinen erfolgreichen Stimulationsversuch mit GH
im Monolayer durchführen. Zudem könnte in Folgearbeiten auch Insulin in
unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt werden, da Butler et al. (2003) in vivo
gezeigt haben, dass es durch Infusion mit Insulin zu einem Anstieg der GHR1A
Expression kommt.
Verschiedene Studien belegen, dass die Expression von Genen in vitro sehr stark
von den gegebenen Kulturbedingungen und verwendeten Kultursystemen abhängig
sind (Schug et al., 2008; Tuschl and Mueller, 2006). Schug et al. (2008) analysierten
die Expression von vier unterschiedlichen
Genen (Abat, Gsk3beta, Myd116 und
Sult1a1) und vergleichen Monolayer, Sandwich und Matrigelkultur von primären
108
Diskussion
Rattenhepatozyten. Für bestimmte Gene unterschieden sich hier die Expressionen
um das fünf- bis siebenfache abhängig von dem verwendeten Kultursystem. Es kann
für die eigene Arbeit spekuliert werden, dass der GHR im Monolayer möglicherweise
nicht oder nicht ausreichend von den kultivierten primären Hepatozyten exprimiert
wird. Dies könnte in weiterführenden Studien untersucht werden.
Untersuchungen an Hepatozytenzellkulturen, die speziell zum GHR durchgeführt
wurden, finden sich in der Literatur bislang nur wenig. Lefebvre et al. (1998) führen
eine Studie zum Einfluss von Zink auf die mRNA Expression von IGF-I und GHR
durch. Sie benutzen dafür eine Monolayer Kultur von Rattenhepatozyten und führen
ihre Messungen nach 6, 24 und 48 Stunden in Kultur durch. An porcinen
Hepatozyten wurde von Brameld et al. 1995 der hormonelle Einfluss von
Schilddrüsenhormonen (T4, T3) sowie Dexamethason auf die mRNA-Expression von
IGF-I und GHR dargestellt und es konnte gezeigt, dass nach
Zugabe von
Dexamethason ein Anstieg von GHR1A- und IGF-I mRNA-Transkripten erfolgte. Die
Zugabe von T4 und T3 verursachte in Kombination mit Dexamethason ebenfalls
einen Anstieg von GHR mRNA, die IGF-I-mRNA verzeichnete allerdings mit Addition
von T4 einen leichten Rückgang (Brameld et al., 1995). Zusammenfassend kann
gesagt werden, dass in zukünftigen Studien an bovinen Hepatozyten die
Kulturbedingungen zu Untersuchungen am GHR und die IGF-I Expression noch
verbessert werden sollten.
5.5
Schlussfolgerung
Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung einer dreidimensionalen Zellkultur aus
primären bovinen Hepatozyten aus Schlachthofmaterial. Es konnte erfolgreich
gezeigt werden, dass es möglich ist, mit einer modifizierten
„Two-Step-
Kollagenaseperfusionstechnik“ nach Seglen (1972), vitale bovine Hepatozyten aus
Schlachthofmaterial zu gewinnen. Diese Zellen können weiterhin erfolgreich in Kultur
genommen werden. Dabei wurden in eigener Arbeit für die bovinen Hepatozyten die
zwei Kultursysteme Monolayer und die Sandwich Kultur als dreidimensionales
System miteinander verglichen. In der Sandwich Kultur weisen die bovinen
109
Diskussion
Hepatozyten vergleichbar zu den Rattenhepatozyten im eigenen Versuch eine
typische
hepatozytenspezifische
polygonale
Morphologie
auf.
Die
bovinen
Hepatozyten konnten in diesen Kulturbedingungen über 14 Tage in Sandwich Kultur
gehalten werden. Vergleicht man in der eigenen Arbeit beide Kultursysteme
(Monolayer und Sandwich) miteinander, so lässt sich schlussfolgern, dass die
Sandwich Kultur für die Kultivierung der bovinen Hepatozyten von Vorteil ist. Dies
belegen die Auswertungen der Analysen der Apoptosemarker sowie Harnstoff- und
LDH Konzentrationen und der Expression des GHR.
5.6
Ausblick
Auf der Grundlage der hier erfolgreich erarbeiteten Protokolle zu Isolation und
Kultivierung von bovinen primären Hepatozyten aus Schlachthofmaterial sollten in
weiterführenden Studien noch weitere Modifizierungen durchgeführt werden. So
sollte geprüft werden, ob ein Vorspülen auf dem Schlachthof mit einem größeren
Spülvolumen einen positiven Einfluss auf die Vitalität der Hepatozyten hat. Eine
weitere Modifizierung während der Perfusion der Leber wäre im Zwischenspülschritt
gegeben. Dieser könnte vergleichend mit dem Perfusionspuffer I ohne EGTA Zusatz
durchgeführt werden. Ein wichtiger folgender Schritt bei der Kollagenaseperfusion
wäre die Berechnung der Kollagenaseeinwaage auf das g Leber, um die
Kollagenaseinkubation zu standardisieren. Die Verwendung der Sandwich Kultur
bietet eine sehr gute Grundlage für die Kultivierung der primären bovinen
Hepatozyten.
Hier
könnten
in
Folge
noch
Studien
mit
unterschiedlichen
Mediumzusammensetzungen durchgeführt werden. So wäre zum Beispiel zu prüfen,
ob der Einsatz von EGF oder HGF einen positiven Effekt auf die Vitalität der Zellen
hat. Auch eine höhere Konzentration als die bislang verwendete von Dexamethason
oder dem bovinen Insulin könnte auf einen positiven Einfluss untersucht werden.
Laut Shulman and Nahmias (2013) beeinflusst eine Reihe von extrazellulären
Faktoren die zelluläre Funktion der kultivierten Zellen. So spielen laut den Autoren
auch nicht-parenchymale Nachbarzellen eine große Rolle. In Studien mit
sogenannten Co-Kulturen konnte der positive Einfluss nachgewiesen werden. Auch
110
Diskussion
dies könnte in weiterführenden Studien untersucht werden. Es ist zukünftig sicher
möglich die Vitalität der Zellen in der Sandwich Kultur noch zu verbessern.
111
Zusammenfassung
6
Zusammenfassung
Sonja Ehrhardt
Etablierung einer primären bovinen Hepatozytenzellkultur als Modell zur
Untersuchung der Expression des Wachstumshormonrezeptors
Es ist bekannt, dass es in der Hochträchtigkeit von Milchkühen in den letzten
Wochen ante partum zu einer hepatischen Wachstumshormon-Resistenz kommt,
bei der die Ansprechbarkeit des GH auf den GHR sinkt, so dass es zu einem
Absinken der IGF-I- Konzentration kommt (Piechotta et al., 2014; Radcliff et al.,
2003a). Bislang konnte am Tiermodell nicht hinreichend geklärt werden, welche
Faktoren zu dieser reduzierten GHR Expression führen. Es ist hinreichend
beschrieben, dass es im peripartalen Zeitraum der Milchkuh zu enormen endokrinen,
immunologischen und metabolischen Veränderungen kommt. Ziel dieser Arbeit war
es daher, ein in vitro Modell zu etablieren, um zukünftig gezieltere Untersuchungen
am GHR und dessen Regulationsmechanismen zu ermöglichen. Aus Aspekten des
Tierschutzes sowie aus Kostengründen wurde sich für die Etablierung einer Zellkultur
aus Schlachthofmaterial entschieden, um Tierversuche, gerade da es sich hier um
große Nutztiere handelt, zu reduzieren. In dieser Arbeit wurde ein Protokoll zur
Isolation der primären bovinen Hepatozyten sowie der folgenden Kultivierung der
Zellen etabliert. Ein Vorversuch mit frisch isolierten Rattenhepatozyten nach gut
etabliertem Protokoll wurde durchgeführt, um später die Expressionen von GHR1A
und IGF-I, aber auch die Morphologie der Ratten- und bovinen Zellen miteinander
vergleichen zu können. Für die Etablierung des Perfusionsprotokolls für die
Rinderleber
wurden
Etablierungsphase
insgesamt
wurden
38
einige
Leberstücke
Modifikationen
perfundiert.
zum
Während
der
Ausgangsprotokoll
durchgeführt. Das verwendete Ausgangsprotokoll bildete hier ein gut etabliertes
Protokoll zur Isolation humaner primärer Hepatozyten der Charité Berlin. Dieses
basiert auf der Grundlage einer Two-Step-Kollagenaseperfusion nach Seglen (1972).
Nach etabliertem Endprotokoll wurden in dieser Arbeit 13 Leberstücke perfundiert.
112
Zusammenfassung
Die Vitalität der isolierten bovinen Hepatozyten lag im Mittel bei 60,5% ± 9,6 bei einer
mittleren Zellausbeute von 5,1x106 Zellen/ml Zellsuspension. Diese Werte liegen im
Vergleich zu anderen Arbeiten zur Isolation primärer boviner Hepatozyten aus
Schlachthofmaterial etwas niedriger (Giantin et al., 2012; Panda et al., 2015).
Unterschiede zur eigenen Arbeit finden sich vor allem in der Pufferzusammensetzung
und der Technik der Perfusion, obwohl beide Autoren ebenfalls eine modifizierte
Two-Step-Kollagenaseperfusion
anwenden.
Die
Kultivierung
der
bovinen
Hepatozyten erfolgte in dieser Arbeit vergleichend im Monolayer und in der Sandwich
Kultur als dreidimensionales Kultursystem. Anhand einer Lebend/Tot Färbung konnte
an den Versuchstagen die Vitalität der Zellen gut mikroskopisch analysiert, und die
jeweiligen morphologischen Veränderungen festgestellt werden. Anhand der
morphologischen Ergebnisse sowie der Laboranalysen der Parameter Harnstoff,
LDH und der Apoptosemarker BAX und FasL kann in dieser Arbeit gezeigt werden,
dass die Sandwich Kultur der Monolayer Kultur in der Vitalität der Zellen überlegen
ist. In der Sandwich Kultur konnten über 14 Tage vitale Zellen nachgewiesen
werden. Nach dieser Zeit wurde der Versuch beendet. Allerdings wurden auch in der
Monolayer Kultur bis zu Tag 10 vitale Zellen detektiert. Laut Literaturangaben spielt
die Ausprägung von Zell-Zellkontakten sowie einer charakteristischen polygonalen
Zellmorphologie eine entscheidende Rolle für die Differenzierung der Hepatozyten in
der Kultur, und somit auch für die Ausübung hepatozytenspezifischer Funktionen
(Vinken et al., 2006). In der eigenen Arbeit konnten in der Sandwich Kultur diese
morphologischen
Charakteristika
nachgewiesen
werden,
wodurch
auf
eine
Funktionalität der Hepatozyten spekuliert werden kann. Da die etablierte Zellkultur
zukünftig als Grundlage für Studien am GHR verwendet werden soll, wurden die
Expressionen der mRNA von GHR1A und IGF-I analysiert. Die Ergebnisse dieser
Arbeit zeigen, dass die Expression des GHR sowohl bei Ratten- als auch bei
Rinderhepatozyten zunächst deutlich sinkt und in der Sandwich Kultur ab Tag 3
langsam ansteigt.
Auf der Grundlage dieser Arbeit kann in weiterführenden Arbeiten die Vitalitätsrate
der bovinen Hepatozyten während der Isolation und der Kultivierung durch
113
Zusammenfassung
Modifikationen noch erhöht werden um folglich höhere Zellzahlen von vitalen Zellen
für
Studienzwecke
zu
114
erhalten.
Summary
7
Summary
Sonja Ehrhardt
Establishment of a cell culture system for primary bovine hepatocytes to
analyse the growth hormone receptor expression
It is already known, that dairy cows show a growth hormone resistance in the last few
weeks before calving associated with a decrease in IGF-I concentration due to
reduced responsiveness of the growth hormone receptor (GHR) (Piechotta et al.,
2014; Radcliff et al., 2003a). However the underlaying mechanism is still not
completely understood. Several endocrine, immunological and metabolic changes
take place in the transition period of dairy cows. The aim of this study was to
establish a cell culture system for primary bovine hepatocytes to allow targeted
studies of factors influencing the GHR expression. To reduce animal research,
especially because it concerns great animals, hepatocytes from abattoir derived
livers were used. In this study a protocol for isolation of the primary bovine
hepatocytes as well as a protocol for cultivation of these cells was established.
Therefore a preliminary test with primary rat hepatocytes, isolated using a wellestablished protocol was carried out to compare the morphology and the expressions
of GHR1A and IGF-I with the bovine hepatocytes. For the establishment of the
isolation protocol for bovine hepatocytes 38 livers were perfused. Some modifications
were made to the first used protocol which was a well-established protocol for
isolation of primary human hepatocytes from the Charité Berlin, based on the “TwoStep-Collagenase Perfusion” by Seglen (1972).
According to the established isolation protocol 13 livers were perfused in this study.
The viability of the isolated cells following Easycoll separation was 60.5% ± 9.6 in the
middle with a yield of viable cells of 5.1x10 6 cells/ml cell suspension. This result was
slightly lower compared to other studies for isolation of bovine primary hepatocytes
115
Summary
from abattoir derived liver (Giantin et al., 2012; Panda et al., 2015). Differences to
the present study can be found in the composition of the used perfusion buffers and
in the used perfusion technique although all are based of the Two-Step-Collagenase
Perfusion by Seglen (1972).
The cultivation of the primary bovine hepatocytes was performed comparative in a
monolayer and a sandwich culture system. On the basis of a live/dead staining the
vitality and morphologic changes of the cultivated cells were well detected by
microscopy. Due to the analyzed parameters urea and LDH as well as the analyzed
apoptotic markers BAX and FasL and morphological criteria the present study
indicates the advantage of the sandwich culture compared to the monolayer. Viable
cells could be detected over 14 d in the sandwich culture. It is already known, that the
development of cell-cell-contacts and the hepatocytes characteristic morphology of
polygonal shape plays an important role for the differentiation of the cultured
hepatocytes and their liver specific functions (Vinken et al., 2006). In the sandwich
culture these characteristics were detected in this study whereby functionality of the
cultured hepatocytes can be speculated. Because of the cell culture should be the
basis for further studies of the GHR, the expressions of mRNA of GHR1A and IGF-I
were analyzed. The results of this study pointed out, that the expression of GHR1A
transcript slowly increased by day 3 in the sandwich culture. For that reason future
studies of the GHR should not be done before day 3 in culture.
In conclusion, viable hepatocytes can be gathered from abattoir derived livers and
cultured in Sandwich culture. This established technique provides the basis for
different studies with adult bovine primary Hepatocytes. In continuing studies it
should be possible to increase the viability and cell yield with some modifications.
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133
Anhang
9
Anhang
9.1
Protokolle
Protokoll 1:
Isolierung von primären humanen Hepatozyten (Charité Berlin)

Das Leberstück aus dem Transportmedium entnehmen, in eine Petri Schale
verbringen und mit steriler Gaze Blutreste entfernen

3-4 Kanülen in geeignete Gefäßöffnungen verbringen und mit Gewebekleber
fixieren. Weitere Gefäßanschnitte mit Gewebekleber verschließen

Perfusionsschritt
I:
Perfusion
des
Leberstückes
in
einem
nicht
rezirkulierenden System mit mindestens 500ml Perfusionslösung I mit EGTA,
mindestens 20-30 Minuten bis gesamtes Blut aus dem Gewebe entfernt ist

30 mg Collagenase P in 100 ml Perfusionslösung II verbringen, steril filtrieren
und bei 37°C lagern

Perfusionsschritt II: Perfusion in einem rezirkulierenden System mit
Perfusionslösung II. Terminierung des Prozesses nach 20-30 Minuten oder
wenn Leberstück irreversible Verformungen aufweist

Leberstück in Petri Schale mit Stopp-Lösung verbringen

Leberkapsel mit Skalpell eröffnen, die Zellen mit dem Skalpell „heraus
kämmen“ in die Stopp-Lösung

Zellsuspension durch einen Trichter mit Gaze filtrieren

Zentrifugieren der Zellsuspension bei 100g, 5 Minuten bei 4°C

Resuspendieren des Zellpellets in PBS und lagern bei 4°C
134
Anhang
Protokoll 2:
Protokoll Lebend/Tot Färbung (Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit, Life Technologies)

1 ml PBS in ein Eppendorfgefäß vorlegen bei Raumtemperatur

2µl Component B zugeben und vortexen

0,5µl Component A hinzugeben, vortexen

Benötigte Wells absaugen und 1x waschen mit PBS

PBS absaugen

300µl der Färbelösung in ein Well geben und leicht schwenken

30 Minuten bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren
135
Anhang
Protokoll 3: Zellzählung
Ansatz der Probe: Verdünnung:
Auszählen: alle vier Eckquadrate, jeweils alle lebenden und toten Zellen notieren
Lebend:
Lebend:
Tot:
Tot:
Lebend:
Lebend:
Tot:
Tot:
Gesamt lebend:
Gesamt tot:
Lebende Zellen /Quartil: Gesamt lebend/4 =
Tote Zellen/Quartil: Gesamt tot/4 =
Gesamtzahl /Quartil:
Viabilität:
lebende Zellen/Quartil x 100 = _______%
Gesamtzellzahl/Quartil
136
Anhang
Protokoll 4: Morphologische Auswertung bovine Hepatozyten
Monolayer:
O
Sandwich: O
Tag:
Vergrößerung/Objektiv:
Zellen/Gesichtsfeld:
Form:
rund
O
cuboid
O
eckig
O
gestreckt
O
Zellkern: Anzahl:
Form:
Ausbildung von Zellverbindungen: ja
O
nein O
Ausbildung Canaliculi: ja O
nein O
Häufigkeit/Gesichtsfeld: _________
Weitere Anmerkungen:
137
Anhang
Protokoll 5: Kollagenbeschichtung/Overlayer
Konzentration Kollagen: 1mg/ml
9 ml einer 0,2% Essigsäure in das Kollagenfläschchen geben zum Lösen, mind. 3
Stunden, besser über Nacht
Alle Schritte sollten nun auf Eis durchgeführt werden um eine frühzeitige Gelbildung
zu verhindern.




dazu 1 ml 10xDMEM
mit 1 M NaOH bis zum Farbumschlag (pink) neutral titrieren
auf jedes Well einer 6-well Platte 350 µl der Kollagenlösung geben und gleich
mäßig durch Schwenken verteilen
45 min in den Brutschrank
138
Anhang
Protokoll 6: RNA-Isolierung der Sandwich-Kultur-Proben mit Trizol




Probe auf Eis auftauen lassen
1 ml Trizol-Reagenz hinzugeben
Homogenisieren (ca. 15 Sekunden), bis ausgefallenes Pellet gelöst ist
5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren
Phasentrennung




0,2 ml Chloroform hinzugeben
vortexen bis alles gut vermischt ist
2-3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren
Zentrifugieren bei 12.000x g für 15 Minuten bei 4°C
o Unten: rote Phenol-Chloroform-Phase
o Mitte: Interphase
o Oben: farblose, wässrige Phase (hier befindet sich die RNA)

Obere Phase vorsichtig abpipettieren und in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß
überführen
RNA-Präzipitation





0,5 ml Isopropanol hinzugeben
vortexen
10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren
Zentrifugieren bei 12.000x g für 10 Minuten bei 4°C
Überstand abkippen und verwerfen
Waschen







1 ml 80% Ethanol in das Gefäß geben
vortexen
Zentrifugation bei 7500 x g für 5 Minuten bei 4°C
Überstand abkippen und verwerfen
Vorgang wiederholen mit 1 ml 70 % Ethanol
Überstand abkippen und verwerfen
Eppendorfgefäß zum Trocknen geöffnet stehen lassen (30 Minuten)
Lösen der RNA


In 15 µl RNase freiem Wasser die RNA lösen
Einfrieren der Probe bei -20 °C
139
Anhang
9.2
Rezepturen
Versuch Rattenhepatozyten
EGTA Perfusions Puffer:
248 ml
Glucose Lösung (9 g/L H2O)
40 ml
KH Puffer pH 7, 4 (60g/L NaCl, 1,75 g/L KCL, 1,6 g/L KH2PO4
in H2O)
40 ml
HEPES pH 8, 5 (60g/L H2O)
60 ml
Aminosäure Lösung (PAN Biotech)
4 ml
1,6 ml
Glutamin (7 g/L)
EGTA Lösung pH 7, 6 (47,5 g/L in H2O)
Kollagenase Puffer:
155 ml
Glucose Lösung (9 g/L)
25 ml
KH Buffer pH 7, 4
25 ml
HEPES pH 8, 5
30 ml
Aminosäure Lösung (PAN Biotech)
10 ml
CaCl2 (19 g/L)
2, 5 ml Glutamin (7 g/L)
 80 mg Kollagenase Typ I während der EGTA Perfusion
hinzufügen
140
Anhang
Suspensions Puffer:
124 ml
Glucose Lösung (9 g/L)
20 ml
KH Buffer pH 7,4
20 ml
HEPES pH 7,6
30 ml
Aminosäure Lösung (PAN Biotech)
2 ml
Glutamin (7 g/L)
1,6 ml
CaCl2 (19 g/L *2 H2O)
0,8 ml
MgSO4 (24,6 g/L * 7 H2O)
 800 mg BSA während der EGTA oder Kollagenase Perfusion
zufügen
Perfusionspuffer Charité Berlin
Perfusionslösung I Stock 10x
NaCl
83g
1,42 M
KCl
5g
67 mM
HEPES
24g
100 mM
Auf 1000ml ddH2O
Perfusionslösung I (1x)
Perf.lsg I 10x
50 ml
EGTA
0,475 g
2,4 M
N-Acetyl-L-Cystein
0,408 g
5 mM
Zu 450 ml ddH2O
141
Anhang
Perfusionslösung II
Lösung 1: NaCl
5,85 g
67 mM
0,75 g
6,7 mM
HEPES
36 g
100 mM
Albumin
7,5 g
0,5%
KCl
Zu 1300 ml ddH2O
Lösung 2: CaCl2*2H2O
1,05 g
4,8 mM
Auf 150 ml ddH2O
Lösung 1 und 2 zusammengeben und auf 1500 ml mit ddH2O auffüllen
142
Anhang
Eurocollins Puffer
Ansatz für 1000 ml:
KH2PO4
2,04 g
= 15 mM
K2HPO4
7,3 g
= 42 mM
KCl
1,1 g
=15 mM
EGTA
0,38 g
= 1mM
NaHCO3
0,09 g
= 1 mM
Glucose
3,6 g
= 0,02M
Auf ein Volumen von 1000 ml mit ddH2O auffüllen, pH 7,4
Stopp-Lösung
1xPBS
FCS
180 ml
20ml
143
Anhang
Medien
Vollmedium Rattenhepatozyten
500 ml
Williams E Medium
50 ml
FCS (Sera Plus)
5 ml
Penicillin/Streptomycin (100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin)
500 µl
Gentamycin
5 µl
Insulin (ITS)
Dexamethason 100 nM
Kulturmedium Rattenhepatozyten
500 ml
5 ml
Williams E Medium
Penicillin/Streptomycin (100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin)
500 µl
Gentamycin
5 µl
Insulin (ITS)
Dexamethason 100 nM
Medium für Stimulationsversuch mit rGH
24 ml Kulturmedium
120 µl rGh (= 500 ng rGH/ml Medium)
144
Anhang
9.3
Tabellen
Tabelle 10: Übersicht der verwendeten Primer
Gen
GAPDH
ß-Aktin
GHR1A
IGF-I
BAX
BCL-xL
FasL
forward
reverse
forward
reverse
forward
reverse
forward
reverse
forward
reverse
forward
reverse
forward
reverse
Primer Sequenz (5‘ – 3‘)
CAA CAT CAA GTG GGG TGA TG
GGC ATT GCT GAC AAT CTT GA
GAC ATC CGC AAG GAC CTC TA
ACA TCT GCT GGA AGG TGG AC
CGT CTC TGC TGG TGA AAA CA
GGA TGT CGG CAT GAA TCT CT
TTG CAC TTC AGA AGC AAT GG
ACT GGA GAG CAT CCA CCA AC
TCT GAC GGC AAC TTC AAC TG
TGG GTG TCC CAA AGT AGG AG
ATG GAG CCA CTG GCC ACA GCA GAA G
GTT GCG ATC CGA CTC ACC AAT ACC T
AGT TGG GGA GAT GAA TGC TG
AAT TCA TGG AAT GGG GTC AA
145
Accession
Number
NM_001034034.1
NM_173979
Start
Produkt
315
516
954
1158
202 bp
301
505
514
820
1341
1531
205bp
205bp
NM_176608.1
NM_001077828.1
NM_173894.1
NM_001077486.1
NM_174662.2
307bp
191bp
Anhang
Tabelle 11: Variablentabelle
Leber
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
SH
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
WIZM
60
50
45
35
60
50
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
TZEM
35
30
30
35
30
35
120
120
120
120
120
120
120
120
120
120
120
120
120
180
180
120
120
120
180
180
600
600
120
180
120
120
180
120
180
120
180
180
TP
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
DFRML GLSG
25
40
40
40
40
40
45
40
40
60
60
40
40
42
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
40
43
41
53
51
51
42
40
39
48
52
64
72
48
60
49
74
47
38
33
66
58
52
64
61
62
60
71
82
75
PP1M
24
11
27
18
15
24
12
14
17
29
12
8
10
8
10
13
11
13
14
12
12
10
12
0
14
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
ZPM
5
18
3
2
2
2
5
7
3
6
4
6
2
5
5
2
5
6
6
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
PP2M
20
16
20
15
12
13
8
6
5
9
14
15
12
14
7
7
11
14
8
10
9
10
14
20
15
6
7
4
5
6
8
4
3
3
5
6
7
5
GZM
COLG
49
45
50
35
29
39
25
27
25
44
30
29
24
27
22
22
27
33
28
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
60
30
90
60
60
90
90
26
25
31
25
34
21
22
19
20
21
23
19
18
18
20
21
22
20
90
90
90
150
90
90
90
90
40
30
90
90
90
60
60
60
60
60
EGTA mM PP1
2,4
2,4
2,4
2,4
2,4
2,4
2,4
2,4
2,4
1
1
1
1
1
1
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
LONV
schlecht
LZ%
30
55,5
40
29,9
10,1
12,3
11,5
15,1
15,8
19,6
31,6
LZNP% PCO VSH
80
36,1
schlecht
25,8
86,9
gut
hell, fest
nicht gut
25,7
20,5
19,1
39,1
77,5
78,5
90,5
84,9
74,9
71,9
nur Kollagenase
25,7
25,5
49,4
34,9
24,4
2
2
2
1
1
1
1
1
1
40,2
43,6
36,2
20,8
11,4
26
36,9
53,5
42,7
25,1
46,2
30
42,1
71,2
55
50,3
60,8
1
1
1
1
59,4
74,2
54
63,8
64,7
67
39,5
66
1
1
1
1
1
1
1
1
schlecht
gut
schleimig
recht fest
schleimig
schleimig
gut
gut
leicht schleimig
92,6
SH: Schlachthof (1= Hannover 2= Minden; WIZM: warme Ischämiezeit min; TZEM: Transportzeit min; TP: Transportpuffer(3=EC); DFRML: Durchflussrate ml; GLSG: Gewicht Leberstück g;
PP1M: Perfusionspuffer 1min; ZPM: Zwischenspülung min; PP2M: Perfusionspuffer 2 min; GZM: Gesamtspülzeit; COLG: Collagenase g; EGTA: EGTA Einwaage nM; LONV: Leber optisch
nach Verdau; LZ%: lebende Zellen %; LZNP: lebende Zellen nach Percoll; VSH: Vorspülen Schlachthof (1=ja, 2=nein)
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2
2
2
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1
1
Danksagung
10 Danksagung
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Allen voran möchte ich mich ganz herzlich bei meiner Doktormutter Frau
JProf. Dr. Marion Schmicke bedanken. Ich danke dir für die Überlassung
dieses wirklich sehr interessanten Themas. Danke für dein Vertrauen, deine
fortwährende Unterstützung und dein immer offenes Ohr bei kleineren und
größeren Problemen. Du warst die beste Betreuerin, die ich mir hätte
wünschen können. Wir beide haben in dieser Zeit viel erlebt und es ist einiges
passiert. Ich wünsche mit sehr, dass wir auch in Zukunft unseren Kontakt
halten werden. Und ich werde nie den Abend vergessen, an dem wir beide
beim Aqua Spinning die Adhäsionszeit unserer Hepatozyten abgewartet
haben!
Ein großer Dank geht an Frau M.Sc. Regina Stoeber und Prof. Dr. Hengstler
des IFADO Dortmund. Regina, vielen Dank für die Isolierung der
Rattenhepatozyten für meine Arbeit und die sehr kompetente und freundliche
Hilfe bei offenen Fragestellungen.
Ein weiterer großer Dank gilt Herrn Dr. Georg Damm der Charité Berlin für die
Demonstration der ersten Perfusion eines bovinen Leberstückes in seinem
Labor. Vielen Dank für die genommene Zeit und die sehr kompetente
fachliche Beratung zu Perfusionspuffern und –zeiten.
Ein großes Dankeschön auch an Herrn Dr. Dusinski und seinem Team vom
Schlachthof Westfleisch Minden-Lübbecke. Vielen Dank für die gegebene
Möglichkeit Probenmaterial für meine Arbeit zu bekommen und die immer sehr
nette Unterstützung und Betreuung bei auftauchenden Fragen. Herr Dusinski,
vielen Dank für die Zeit, die sie sich genommen haben in ihrem Büro bei einer
Tasse Kaffee! Auch Frau Steinkamp vom Empfang möchte ich danken, für die
immer freundliche Begrüßung und Ausstattung mit Overalls bei meiner
Ankunft.
Frau Dr. Nina Hambruch vom Anatomischen Institut der Tierärztlichen
Hochschule Hannover möchte ich ebenfalls ganz herzlich Danke sagen, für
die Durchführung der mikroskopischen Aufnahmen meiner Zellen während
des Versuches. Vielen Dank für deine kompetente Unterstützung und
Beratung zur Zellmorphologie und Zellkulturen! Ich habe mich immer sehr
gefreut mit meinen Zellen zu dir zu kommen.
Ein ganz herzlicher Dank gilt Sandra Wilkening aus der eigenen
Arbeitsgruppe. Sandra, vielen Dank für deine labortechnische Unterstützung
bei der Isolation der Zellen bis manchmal sehr spät am Abend und der
147
Danksagung
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

gemeinsamen Fahrten zum Schlachthof! Vielen Dank für die tollen Gespräche,
die wir in dieser Zeit hatten. Es hat immer sehr viel Spaß gemacht mit dir! Das
werde ich nie vergessen. Ebenso möchte ich dir herzlich für die Durchführung
und Unterstützung der PCR-Analysen meiner Proben danken!
Weiterhin möchte ich Christel Hettel danken für dein immer offenes Ohr und
deine tolle Unterstützung im Labor während der Zellisolationen! Du warst
immer für mich da und hast dir arbeitstechnische aber auch private
Problemchen angehört. Vielen lieben Dank dafür!
Ein weiterer großer Dank gilt Angela Jordan und Martina Baumgarten.
Martina, vielen lieben Dank für die Bestimmungen der Harnstoff- und LDH
Konzentrationen! Bei dir wusste ich meine Proben immer in besten Händen!
Angela, dir möchte ich noch besonders Danken für deine Hilfe auf dem
Schlachthof! Für die Probennahme und Vorbereitung! Die gemeinsamen
Fahrten mit dir haben mir sehr viel Spaß gemacht! Vielen Dank für eure
Freundlichkeit über die ganze Zeit und den immer sehr interessanten
gemeinsam verbrachten Mittagspausen.
Ein ganz lieber Dank geht auch an Frau Dr. Corinna Weber von Laboklin.
Vielen Dank für das Angebot und der Messung des Mikroalbumins meiner
Proben! Zudem möchte ich mich auch persönlich für die tolle Zusammenarbeit
bei Laboklin bedanken. Danke für deine Freundschaft und die netten
gemeinsamen Abendessen in Bad Kissingen, bei dem wir ja auch zusammen
über Leberzellisolationen sprechen konnten!
Juri, ein riesen Dank geht an dich für die tolle Unterstützung beim Formatieren
dieser Arbeit und die immer netten Gespräche!
Yette, dir möchte auch ganz herzlich danken, dafür dass du mir immer so lieb
den Büroschlüssel hinterlegt hast, und wir uns sogar dafür in Hildesheim
getroffen haben!
Meinen Eltern kommt ein ganz besonderer Dank zu! Ihr lieben, ohne euch
beide hätte ich dies alles niemals schaffen können! Ich kann gar nicht in Worte
fassen wie sehr ich mich bedanken möchte! Dass ihr immer auf David und
Lucas aufgepasst habt während der ganzen Zeit, wenn ich länger im Labor
oder im Büro saß! Für eure fortwährende Unterstützung und das Vertrauen in
allen Lebenslagen! Ihr seid die aller Besten!! Tausend Dank!!
David und Lucas, auch bei euch möchte ich mich ganz herzlich bedanken! Ihr
musstet während dieser Zeit des Öfteren einmal auf eure Mama verzichten
und ihr habt das ganz prima gemeistert! Auch die Umzüge in dieser Zeit habt
ihr so toll mitgemacht. Ihr beide seid das aller Wichtigste in meinem Leben
und ich bin absolut stolz eure Mama zu sein! Danke dass es euch gibt!
Lieber Thomas, auch bei dir möchte ich mich herzlich bedanken. Ich habe die
Gespräche mit dir über meine Arbeit sehr genossen. Du hast immer zugehört
148
Danksagung
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und hast mir auch mit konstruktiver Kritik immer zur Seite gestanden. Vielen
Dank für dein immer offenes Ohr und die wunderschönen und entspannenden
Mittagspausen bei einem Käffchen und Spaghetti Eis in Hannover!
Letztlich möchte ich mich bei allen Freunden aus Hildesheim und Bad
Kissingen bedanken, die mich während der Anfertigung meiner Dissertation so
toll unterstützt haben!
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