Universitätsklinikum Ulm Zentrum für Innere Medizin Klinik für Innere
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Universitätsklinikum Ulm Zentrum für Innere Medizin Klinik für Innere Medizin II Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. Wolfgang Rottbauer Telmisartan inhibiert die Proliferation von humanen glatten Gefäßmuskelzellen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm von Pamela Proissl Göppingen 2015 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Daniel Walcher 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Lars Bullinger Tag der Promotion: 09. Februar 2017 I INHALTSVERZEICHNIS Abkürzungsverzeichnis III 1. Einleitung 1 1.1. Atherosklerose 1 1.1.1. Definition, Epidemiologie, Risikofaktoren und Klinik 1 1.1.2. Pathogenese 4 1.1.2.1. Entstehung der Plaques 4 1.1.2.2. Rolle der glatten Muskelzellen in der Pathogenese 6 1.1.3. Therapie 8 1.2. Telmisartan 9 1.2.1. RAS, Vorläufer und die Wirkgruppe Angiotensin-IIRezeptorantagonisten 1.2.2. 9 Telmisartan, AT1- Rezeptor, Nebenwirkungen, Interaktionen und Kontraindikationen 10 1.2.3. Pharmakokinetik 11 1.2.4. Wirkmechanismus und Sonderstellung 12 1.3. Fragestellung 15 2. Material und Methodik 16 2.1. Material 16 2.1.1. Substanzen und Lösungen 16 2.1.2. Geräte und Kits 23 2.2. Methodik 26 2.2.1. Kulturen 26 2.2.1.1. Zellkultur 26 2.2.1.2. Vorbereitung und Erhaltung der Zellkulturen 26 2.2.1.3. Herstellung der Lysate 28 2.2.2. Micro BCATM Protein Assay 29 2.2.3. Western Blot 30 2.2.3.1. Durchführung des Western Blot 30 2.2.3.2. Wet Blot 32 II 2.2.3.3. Ladungskontrolle 34 2.2.4. PI-3-Kinase Assay 35 2.2.5. Ki-67 Färbung 39 2.2.6. Statistik 40 3. Ergebnisse 41 3.1. Telmisartan inhibiert konzentrationsabhängig die Expression von Cyclin D1 41 3.1.1. Vorversuche 41 3.1.2. Versuch 43 3.2. Inhibition der PDGF induzierten Aktivierung der PI-3-Kinase 45 3.3. Verminderte Expression von Ki-67 in humanen glatten Gefäßmuskelzellen durch Stimulation mit Telmisartan 47 3.4. Zusammenfassung aller Ergebnisse 49 4. Diskussion 50 4.1. Zusammenhang Telmisartan und Atherosklerose 50 4.1.1. Allgemein 50 4.1.2. Antiinflammatorische Eigenschaften von Telmisartan 52 4.1.3. Sonderfunktion PPAR- 53 4.2. Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen 54 4.2.1. Allgemein 54 4.2.2. Mögliche Hemmstoffe der Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen 58 4.3. Fazit 61 5. Zusammenfassung 62 6. Literaturverzeichnis 64 Danksagung 77 III Abkürzungsverzeichnis ACE-Hemmer Angiotensin-Conversions-EnzymHemmer Ak Antikörper AMPK Adenosinmonophosphat-aktivierte Proteinkinase ApoE Apolipoprotein E APS Ammoniumpersulfat AT1-Rezeptor Angiotensin-II-Rezeptor Typ 1 AT2-Rezeptor Angiotensin-II-Rezeptor Typ 2 AOSMC Aortic Smooth Muscle Cell ATP Adenosintriphosphat BCA Bicinchoninic Acid - Bicinchoninsäure bFGF basic Fibroblast Growth Factor bzw. beziehungsweise CD Cluster of Differentiation cGMP Cyclisches Guanosinmonophosphat Co Kontrolle CO2 Kohlenstoffdioxid cPLA Cytosolic Phospholipase CRP C-reaktives Protein CTGF Connective Tissue Growht Factor Cytochrom P450 Cytochrom Pigment 450 DAPI 4´,6-Diamino-2-phenylindole IV DES Drug Eluting Stent d.h. das heißt DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraessigsäure Egr-1 Early growth response protein 1 EGTA Ethylene glycol tetraacetic acid ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay ERK Extracellular-signal regulated kinases etc. et cetera EZM Extrazelluläre Matrix GLUT1 Glukosetransporter 1 GTP Guaninnukleotid-bindendes Protein H2O Wasser HCl Chlorwasserstoff HCT Hydrochlorothiazid HDL High Density Lipoprotein - Lipoprotein hoher Dichte HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)ethansulfonsäure HMG-CoA Reduktase-Inhibitor 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoenzymA-Reduktase-Inhibitor HRP Horseradish peroxidase – Meerrettichperoxidase V Il Interleukin INF- Interferon- Ki-67 Kiel-67 LDL Low Density Lipoprotein – Lipoprotein niederer Dichte LIMK LIM-Kinase LKB1 Leberkinase B1 LVEF Linksventrikuläre Ejektionsfraktion MAPKs Mitogen-aktivierte Proteinkinasen mo-LDL minimal oxidiertes Low Density Lipoprotein n Versuchsanzahl NADPH Nikotinsäureamid-Adenin-DinukleotidPhosphat (reduzierte Form) NF Nuclear Factor „Kappa-light-chainenhancer“ of activated B-cells NOS (eNOS/ iNOS) Stickstoffmonoxid-Synthasen (Endothelzellen/ in Makrophagen) NQ01 Quinone Oxidoreductase 1 p Signifikanzwert PBS without Ca & Mg Phosphate buffered saline ohne Calcium & Magnesium PDGF Platelet Derived Growth Factor PI-3-Kinase Phosphoinositid-3-Kinase PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid VI PPAR- Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor- PTCA Perkutane transluminale koronare Angioplastie PVDF-Membran Polyvinylidenfluorid-Membran RAS Renin-Angiotensin-System ROS Reactive Oxygen Species rpm revolutions per minute – Umdrehungen pro Minute SDS sodium dodecyl sulphate – Natriumdodecylsulfat SMGM Smooth Muscle Growth Medium TBST Tris Buffered Saline with Tween TEMED Tetramethylethylendiamin TLC-Platte Dünnschichtchromatographie-Platte TNF- Tumornekrosefaktor- TNS Trypsin-Neutralisationssolution Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan USA The United States of America v.a. Vor allem VLDL Very Low Density Lipoprotein Lipoprotein mit sehr niedriger Dichte WHO World Health Organization Weltgesundheitsorganisation z.B. zum Beispiel 1 1. Einleitung 1.1. Atherosklerose 1.1.1. Definition, Epidemiologie, Risikofaktoren und Klinik Arteriosklerose bezeichnet verschiedene Arterienerkrankungen. Diese sind durch Verfestigung der Arterienwand, Elastizitätsverlust und Lumenverkleinerung aufgrund einer Wandverdickung charakterisiert. Atherosklerose, die wichtigste Unterform, ist durch intimale Zellproliferation, progressive herdförmige Lipideinlagerungen und Bildung fibröser Plaques in der Intima mit Übergriff auf die Media gekennzeichnet.[8, 48, 52, 81, 82] Es ist die häufigste Systemerkrankung der größeren und mittelgroßen Arterien vom elastischen und muskulären Typ.[8, 82, 87] Sie stellt sich als einen in Stadien ablaufenden, schleichenden und fortschreitenden degenerativen Alterungsprozess dar, der über viele Jahre bis Jahrzehnte andauern kann.[52] Dabei handelt es sich um eine entzündliche Erkrankung, welche in jedem Lebensalter vorkommen kann.[87] Laut WHO wird Atherosklerose definiert als „eine variable Kombination von Veränderungen der Intima, bestehend aus einer herdförmigen Ansammlung von Fettsubstanzen, komplexen Kohlenhydraten, Blut und Blutbestandteilen, Bindegewebe und Kalziumablagerungen, verbunden mit Veränderungen der Arterienmedia“.[8, 52, 81, 82] Die Erkrankung weist aktuell eine höhere Morbidität auf als jede andere Erkrankung. [1, 8] Kardiovaskuläre Erkrankungen sind zudem die Haupttodesursache in den Vereinigten Staaten von Amerika, Europa und einem großen Teil von Asien.[13, 15] Es wird davon ausgegangen, dass Atherosklerose eine Erkrankung multifaktorieller Genese ist.[8] Neben genetischen Faktoren, spielen auch Umweltfaktoren eine wichtige Rolle. 2 Zu den Risikofaktoren 1.Ordnung gehört eine Vielzahl von Faktoren, welche häufig durch genetische Prädispositionen bedingt sind. Neben arterieller Hypertonie, einem erhöhten LDL/VLDL-Spiegel, Fettstoffwechselstörungen, einem Diabetes reduzierten mellitus, HDL-Spiegel, einer erhöhten Thrombozytenaggregation[52] sowie einer Hyperhomozysteinämie spielen zudem ein höheres Lebensalter und das männliche Geschlecht eine Rolle. Zu den Klasse-II-Faktoren gehören ein erhöhter Lipoprotein(a)-Spiegel, familiäre Häufung, Erbkrankheiten, Gerinnungsfaktoren, Adipositas, Depressionen Entzündungserkrankungen, ein und mütterliche erhöhter Spiegel Verhaltensstörungen, von generalisierte Hypercholesterinämie[75] und das metabolische Syndrom. Einen weiteren Risikofaktor für die Entstehung der Atherosklerose können spezifische arterielle Bereiche, wie Abzweigungen, Gabelungen und Krümmungen, darstellen. Diesen bedingen charakteristische Veränderungen im Blutfluss, verminderte Scherkräfte und verstärkte Turbulenzen.[87] Bei den Umweltfaktoren stellt Nikotinabusus einen Klasse-I-Faktor dar. Zu den Klasse-II-Faktoren zählen fettreiche Ernährung, ein niedriger Antioxidantienspiegel, Hyperurikämie, chronischer Stress, Bewegungsmangel, hormonelle Faktoren und infektiöse Mikroorganismen wie Chlamydia pneumoniae oder Herpesviren.[8, 52, 87] Weitere Risikofaktoren sind Transfettsäuren und das C-reaktive Protein.[81] Eine Entzündung in der Gefäßwand führt zur Freisetzung proinflammatorischer Zytokine und prokoagulatorischer Faktoren ins Blut und steigert somit das Atheroskleroserisiko. Infammation beeinflusst des Weiteren Eigenschaften der Plaquestruktur, wie zum Beispiel die Thrombogenität und Integrität der schützenden fibrösen Kappe der Plaque, welche thrombotische Komplikationen der Atherosklerose triggern können.[61, 82] Dies könnte die mögliche Risikosenkung des atherosklerotisch bedingten Herzinfarktes durch das nichtsteroidale Antiphlogistikum Acetylsalicylat erklären.[82] 3 Komplizierte atherosklerotische Läsionen können nachstehende klinische Ereignisse zur Folge haben. Im fortgeschrittenen Stadium weisen beinahe alle atherosklerotische Plaques eine fleckförmige oder diffuse Verkalkung auf, welche die Elastizität der Arterienwände vermindert. Patienten mit hochgradigen Verkalkungen der Koronararterien scheinen ein erhöhtes Myokardinfarktrisiko zu haben.[8] Eine weitere Komplikation ist die fokale Ruptur oder Ulzeration. Aufgrund von Defekten der Plaqueoberfläche kommt es zur Freilassung von stark thrombogenen Fettbrei oder zur mikroembolischen Verschleppung von Plaquematerial mit dem Blutstrom.[8] Bestandteile des Atheroms gelangen somit als Embolien in die Blutzirkulation.[52] Plaque-Rupturen und Thrombosen können für mehr als 50% der Fälle von akutem Koronarsyndrom und Myokardinfarkt verantwortlich gemacht werden.[27] Zudem besteht das Risiko von Hämorrhagien. Durch die Ruptur der dünnen fibrösen Kappe oder neu gebildeter Kapillaren im Plaquebereich, besteht die Gefahr von Einblutungen, insbesondere in den Koronararterien. Sie können zur akuten Stenosierung des Gefäßes oder zur Plaqueruptur führen.[8] Aufgrund verminderter Gefäßwandstabilität rupturieren atherosklerotisch beschädigte Gefäße leichter und es kann zur Gefäßruptur kommen.[52] Eine Thrombosebildung auf dem Boden einer rupturierten oder ulzerierten Plaque ist die gefürchtetste Komplikation. Thromben können das Gefäßlumen teilweise oder vollständig verschließen.[8] Der akute Gefäßverschluss durch einen aufgelagerten Thrombus mit nachfolgender Ischämie und Nekrose ist zudem die häufigste klinische Komplikation. Der daraus entstehende Sauerstoffmangel im nachgeschaltetem Versorgungsgebiet ist Ausgangspunkt für zahlreiche womöglich zum Tode führende Erkrankungen, wie der akute Myokardinfarkt, die akute zerebrale Ischämie, Gefäßverschlüsse z.B. der Organinfarkt, der andernorts Extremitätenarterien, lokalisierte Gefäßrupturen akute und Aneurysmen.[52, 87] Aufgrund der atherombedingten Stenosierung des Gefäßlumens kann die Durchblutung einzelner Organe beeinträchtigt werden und so eine sekundäre Organatrophie verursachen.[52] In schweren Fällen kann durch beträchtliche Störungen in der Media mit Atrophie elastischer Fasern eine progressive Wandschwächung mit aneurysmatischer Gefäßaussackung entstehen.[8, 52] 4 Bei atherosklerotisch beschädigten Gefäßen kann es zu einer Dissektion, insbesondere im Bereich der Aorta, kommen.[52] Die oben genannten Komplikationen verstärken den atherosklerotischen Gefäßumbau. Die Folgen sind eine Abnahme der Elastizität und ein Anstieg des Blutdrucks, welche Teile des Teufelskreislaufs bilden.[52] 1.1.2. Pathogenese 1.1.2.1. Entstehung der Plaques Zur initialen Phase der Atherosklerose zeigt sich eine Endothelläsion mit endothelialer Dysfunktion. Dabei können die Beschädigungen der Intima durch verschiedene Risikofaktoren, wie etwa Wirbelbildungen an Gefäßverzweigungen verursacht werden.[8, 52, 87] Dies führt zu einer Erhöhung der Endothelpermeabilität.[87] Durch eine anschließende Thrombozytenaggregation kommt es zu einer Freisetzung von Zytokinen wie etwa PDGF und anderen Wachstumsfaktoren.[8] Adhäsionsmolekülen Dies für bewirkt die Blutmonozyten Bildung und von Chemokinen Lymphozyten, und welche proinflammatorische Zytokine[61] bilden. Es wird vermutet, dass Produkte von oxidierten Lipoproteinen und Angiotensin II, welche mit Risikofaktoren wie Hyperlipidämie und Hypertonie assoziiert werden, vaskuläre Zellwände zur Zytokinproduktion veranlassen können.[55, 64] Dies hat einen proliferationsfördernden Effekt auf glatte Muskelzellen und Fibroblasten. Dabei können sich Lipide und Zucker in proliferierendes fibromuskuläres Gewebe einlagern und Proteine glykieren. Begünstigt wird dieser Prozess durch Hyperlipidämie und Hyperglykämie bei Adipositas oder Diabetes mellitus.[52] Zudem findet ein Lipoproteineinstrom in die Intima statt, v.a. von small-dense LDL. Hier kann aus LDL minimal oxidiertes LDL (mo-LDL) entstehen.[8] Kommt es zur Akkumulation von mo-LDL, können die Endothelzellen zur Produktion von Chemokinen angeregt werden, welche die Adhäsion und Einwanderung von Monozyten aus dem Blut und die Umwandlung von Monozyten in Makrophagen fördern.[8, 75, 81] Dieser lokale unspezifische inflammatorische Prozess wird außerdem von einer systemischen Antwort begleitet, wie z.B. einer erhöhten Plasmakonzentration von CRP.[8] Inflammatorische Mediatoren sind an allen Phasen der Atherogenese beteiligt.[61] 5 Die stark oxidierten, aggregierten LDL werden dann von Makrophagen, die in die Intima eingewandert sind, durch Bindung an Scavenger-Rezeptoren viel leichter und schneller aufgenommen als unveränderte LDL.[8] Nach der Rekrutierung von Monozyten findet deren Differenzierung zu aktivierten, lipidgeladenen Makrophagen, auch Schaumzellen oder Lipophagen genannt, statt. Das morphologische Korrelat dazu sind die sogenannten „Fatty Streaks“.[52, 63, 83] Sie zeigen sich als in der Intima gelegene, gelblich erhabene, streifenförmige Herde der Arterieninnenseite.[81, 82] In der Plaque dienen die meisten Makrophagen als „Friedhof“ für Lipide, weniger als aktive Teilnehmer an der Atherogenese. Der Tod von Schaumzellen führt zur Bildung des nekrotischen Kerns im Plaque, welches ein Depot für Zellschrott, Fettbrei, Cholesterinkristalle, zellulären Debris, lipidspeichernde Schaumzellen, Fibrin und andere Plasmaproteine darstellt.[8, 61] Das Lipid besteht dabei überwiegend aus Cholesterin und Cholesterinestern.[8] Die Veränderungen in der Intima mit Entstehung von chemotaktischen Stoffen führen zur Einwanderung zahlreicher Lymphozyten. Die Interaktion von CD40/CD40L auf T-Lymphozyten und Makrophagen stimuliert zusätzlich die Produktion von INF- und fördert damit die entzündliche Reaktion in der entstanden Lipidplaque. Die entzündliche Reaktion mit Ausschüttung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren wie Interleukin 6 und bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) fördert die Einwanderung glatter Muskelzellen und deren Proliferation: Die fibröse Plaque entsteht.[8] Arteriosklerotische Läsionen ergeben sich folglich aus einer Vielzahl an pathologischen Prozessen, einschließlich der Makrophagen-Schaum-Zellbildung und deren Apoptose, der Akkumulation von extrazellulären Fetten, Ablösung und Reduktion der intrazellulären Strukturmatrix und der glatten Muskelzellen, Generierung von Mineralablagerungen, chronischer Inflammation, Neovaskularisation, Störungen der Läsionsoberfläche, sowie Bildung und Transformation des Hämatoms und Thrombus` zu fibromuskulärem Gewebe. Die Atherosklerose kann in verschiedene Stadien und Läsionstypen eingeteilt werden. Diese reichen von Typ1 bis Typ8.[98] 6 Die Zellzusammensetzung heterogen. Die von Variationen humanen der arteriosklerotischen atherosklerotischen Plaques ist Plaquemorphologie charakterisieren sich durch einen unterschiedlichen Anteil an Akkumulation glatter Muskelzellen, Makrophagen und anderen Leukozyten sowie durch die Menge und Verteilung von Kollagen, extrazellulärer Matrix wie elastische Fasern und Proteoglykane und die Formation eines zentralen Kerns bestehend aus extrazellulären Lipidablagerungen.[8, 48, 63] 1.1.2.2. Rolle der glatten Muskelzellen in der Pathogenese In der Initiation der Atherogenese haben Zytokine einen proliferationsfördernden Effekt auf glatte Muskelzellen und Fibroblasten. Dabei können sich Lipide und Zucker in proliferierendes fibromuskuläres Gewebe einlagern.[52] Makrophagen und glatte Muskelzellen innerhalb der arteriosklerotischen Plaques exprimieren den potenten prokoagulativen Gewebsfaktor, vasoaktive Moleküle, Wachstumsfaktoren und Zytokine, wodurch die Atherosklerose gefördert wird.[61, 63, 87] Die entzündliche Reaktion mit Ausschüttung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren fördert die Einwanderung glatter Muskelzellen und deren Proliferation: Die fibröse Plaque entsteht.[8] Rezidivierende Intimaschädigungen und entzündliche Faktoren verstärken den Prozess und führen zur Proliferation und Migration von glatten Muskelzellen der Media, welche sich im Inflammationsareal integrieren und eine Intimaverdickung bilden.[9, 11, 52, 84-87] Die Verdickung der Arterienwand kann durch eine graduelle Dilatation kompensiert werden, sodass bis zu einem bestimmten Punkt das Lumen unverändert bleibt - das sogenannte Remodelling.[39] So entsteht ein Zyklus aus Akkumulation von mononukleären Zellen, Migration und Proliferation von glatten Muskelzellen und der Entstehung von fibrösem Gewebe, welcher zu einer weiteren Ausdehnung und Restrukturierung der Läsion und letztendlich zu einer sogenannten fortgeschrittenen Läsion führt.[52] Ab einem gewissen Grad kann die Arterie durch Dilatation nicht mehr kompensieren; die Läsion kann dann in das Lumen eindringen und den Blutfluss verändern.[87] Im Bereich der Atherome verbreitert sich die Gefäßwand und die Media wird im fortgeschrittenen Stadium mitbeschädigt, ebenso die Elastika.[52] 7 Typischerweise besteht die fibröse Kappe aus glatter Muskulatur mit wenigen Lymphozyten und relativ dichtem Bindegewebe.[8, 48] Ein zellreiches Areal im Randbereich der Plaque setzt sich aus einer Mischung aus Makrophagen, glatten Muskelzellen und T-Lymphozyten zusammen.[8] Schaumzellen entstehen vorwiegend aus eingewanderten Blutmonozyten, die sich in Makrophagen umwandeln, jedoch können auch glatte Muskelzellen und Endothelzellen Lipide aufnehmen und zu Schaumzellen transformieren.[6, 8, 48] Wenn arteriosklerotische Läsionen entstehen, können Schaumzellen und glatte Muskelzellen Apoptose erleiden. Die Apoptose von Schaumzellen trägt zur Lipidkernformation bei. Der durch Apoptose auftretende Mangel an glatten Muskelzellen, der durch inflammatorische Mediatoren verstärkt wird, verringert den Kollagenanteil in inflammatorischen Plaques und erhöht dadurch die Gefahr der Ruptur bestimmter Regionen im Plaque und der Thrombosebildung. Die Anzahl der Läsionskomplikationen steigt.[36, 37, 61, 62] Die Integrität der fibrösen Kappe und ihre Rupturresistenz sind abhängig von der kollagenen extrazellulären Matrix der fibrösen Kappe der Plaque.[62] Die Synthese und Aufrechterhaltung der kollagenen Matrix und somit die Stärke und Stabilität der fibrösen Kappe ist primär die Aufgabe der arteriellen glatten Muskelzellen. Für die Degradierung von extrazellulären Makromolekülen sind Makrophagen verantwortlich.[63] Das in der Entzündungsreaktion ausgeschüttete INF- hemmt die glatten Muskelzellen bei der Produktion extrazellulärer Matrix.[8] Dieser Prozess der zunehmenden Matrixinstabilität und Degradierung der fibrösen Kappe wird durch die Produktion verschiedener Metalloproteinasen wie Kollagenasen, Elastasen, Gelatinasen und Stromolysin durch die Makrophagen in den Läsionen noch verstärkt.[8, 33] Aktivierte T-Zellen können die Produktion der Metalloproteinasen stimulieren.[91] Die Plaqueinstabilität und somit die Gefahr einer Ulzeration der atheromatösen Plaque steigt.[8] Die Produktion des prokoagulativen Gewebsfaktors und andere hämostatischen Faktoren[66, 101] können die Gefahr einer Thrombose ebenfalls erhöhen.[87] 8 1.1.3. Therapie Der erste therapeutische Schritt ist die Reduzierung der beeinflussbaren Risikofaktoren, wie Zigarettenrauch, Bewegungsmangel, fettreiche Ernährung und chronischer Stress.[8, 52, 87] Wenn hierdurch und durch eine strikte diätische Cholesterinaufnahme eine Progression nicht verhindert werden kann, sollte eine medikamentöse Therapie eingeleitet werden. Bisher gibt es noch kein Medikament, welches Gefäßablagerungen auflösen kann. Jedoch kann die weitere medikamentöse Therapie auf die Behandlung der Risikofaktoren wie Diabetes mellitus und Bluthochdruck sowie die Behandlung von Symptomen und Folgeerkrankungen wie Angina pectoris, einen Myokardinfarkt oder ischämischen Insult ausgerichtet werden. HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren, die sogenannten Statine, sind die am häufigsten verwendeten Pharmaka weltweit für Patienten mit Hypercholesterinämie. Auch Fibrate können effektiv bei Hypercholesterinämie und Hypertriglyceridämie verwendet werden.[93] Klinische Studien zeigen, dass Statine die Plaquegröße, den zellulären und chemischen Aufbau sowie biologische Aktivitäten rund um die Inflammation und den Cholesterinmetabolismus günstig beeinflussen. Durch eine signifikante Beeinflussung arterieller Läsionen wird das Risiko für klinische Komplikationen gesenkt.[45] Aufgrund von Präventionsmaßnahmen wie Lebensstiländerungen, besseren Behandlungsmöglichkeiten der Folgeerkrankungen und einer besseren Rückfallprophylaxe, geht die Mortalität statistisch zurück. So kann etwa durch pharmakologische Substanzen der Plasmacholesterinspiegel gesenkt werden.[1, 8] Operative Interventionen sind neben minimalinvasiven angioplastischen Prozeduren, wie einer Angioplastie oder Stentimplantation, auch große invasive Operationen, wie Bypass-Operationen. Durch diese operativen Maßnahmen wird die Versorgung minderdurchbluteter Areale verbessert. Nach Ballondilatation besteht ein Restenoserisiko von bis zu 40%. Durch Narbenbildung bei der Einheilung des Stents in die Arterienwand besteht in gestenteten Gefäßabschnitten nach Stentimplantation ein Restenoserisiko von < 30% und nach Drug eluting Stents (DES) <10%. Dabei bilden sich 95% der Restenosen innerhalb von 6 Monaten.[3, 43] 9 1.2. Telmisartan 1.2.1. RAS, Vorläufer und die Wirkgruppe Angiotensin-IIRezeptorantagonisten Die Blockierung des Renin-Angiotensin-Systems hat kardiovaskuläre Vorteile, welche in großen, langfristigen klinischen Studien bezüglich Patienten mit Herzversagen, Myokardinfarkten oder erhöhtem kardiovaskulärem Risiko demonstriert wurden.[95] Die Entwicklung von pharmakologischen Stoffen, welche das Renin-Angiotensin-System spezifisch blockieren, hat die Beteiligung am Blutdruckkontrollsystem und somit auch am Herzversagen und chronischen Nierenversagen gezeigt.[18] Das neue, sichere, spezifischere und effektivere Konzept zur Diagnose und Behandlung von Bluthochdruck und Herzversagen wurde zuerst 1970 mit Saralasin, einem peptiden Antagonisten von Angiotensin-II-Rezeptoren etabliert.[17] Es folgten die ACE-Hemmer, welche heute zur Blutdruckkontrolle, sowie zur Senkung der Morbidität und Mortalität durch Herzversagen verwendet werden. Außerdem dienen sie zur langfristigen Reduzierung der Anzahl an Myokardinfarkten, Reinfarkten, Schlaganfällen, Herzstillständen und Herzversagen.[2, 70, 95, 105] ACE-Hemmer beeinträchtigen neben Angiotensin I auch noch andere Peptide. Dieser Mangel an Spezifität ist der Grund für die meisten Nebenwirkungen der Präparate, wie etwa trockener Husten und Angio-Ödeme. Durch diese wird die Behandlung limitiert.[5, 18] Die oral aktiven Angiotensin-II-Rezeptorantagonisten wurden entwickelt, um diese Nebenwirkungen durch eine spezifischere Hemmung des Renin-Angiotensin-Systems zu minimieren.[18] 10 Bei dem ersten nicht-peptidischen AT1-Rezeptor-Antagonisten handelte es sich um das Losartan.[4] Weitere Beispiele sind Candesartan, Irbesartan, Eprosartan, Valsartan, Olmesartan und Telmisartan.[49] Diese neue Klasse ist den ACEInhibitoren in der Rezeptorantagonisten Effektivität sind ebenfalls gleichzustellen.[18] bei arterieller Angiotensin-IIHypertonie und Herzinsuffizienz indiziert. Durch ihre Spezifität sind sie verträglichere Präparate, jedoch fehlen Langzeiterfahrungen. Verwendung finden sie daher besonders als Reservemedikamente bei Nebenwirkungen oder Unverträglichkeit von ACEHemmern.[49] Angiotensin-II-Rezeptor-Antagonisten antagonisieren selektiv die Effekte von Angiotensin II am Angiotensin-II-Rezeptor Typ 1 (AT1).[18] 1.2.2. Telmisartan, AT1-Rezeptor, Nebenwirkungen, Interaktionen und Kontraindikationen Telmisartan ist ein potenter, lang andauernder, nonpeptider Antagonist des Angiotensin-II-Rezeptors Typ 1 (AT1), welcher für die Behandlung der essentiellen Hypertonie verwendet wird.[109] Telmisartan besitzt eine hohe Affinität zum Angiotensin II Rezeptor Typ 1.[51] Er wirkt selektiv und antagonisiert die Stimulation des AT1-Rezeptors durch Angiotensin II ohne andere Rezeptorsysteme der kardiovaskulären Regulation zu beeinflussen.[71, 109] Telmisartan zeigt eine ≥ 10.000fache Selektivität für den AT1- im Vergleich zum AT2-Rezeptor.[4] Die AT1-Rezeptoren werden vorwiegend in Organen und Geweben exprimiert, die am Flüssigkeits-Elektrolyt-Gleichgewicht und der Blutdruckregulation beteiligt sind, wie etwa in der Niere, im Herzen, in glatten Gefäßmuskelzellen, im Gehirn, in den Nebennieren, in Blutplättchen, in Adipozyten und in der Plazenta.[102, 106] Die AT1-Rezeptor Aktivierung kann für fast alle der Effekte von Angiotensin II auf den Blutdruck und die Osmoregulation in der Niere, in der Nebenniere und an den Blutgefäßen verantwortlich gemacht werden.[97, 106] 11 Als AT1-Antagonist weist Telmisartan wenige Nebenwirkungen auf. Zu den bekannten gehören unter anderem: Hyperkaliämie, erhöhte Retentionsparameter, sehr selten Husten, vereinzelt Angioödeme, Hypotonie und Schwindel.[49] Wichtige Interaktionen von Telmisartan sind Hyperkaliämie bei Kombination mit kaliumsparenden Antiphlogistika Diuretika, sowie Kaliumsalzen, Ciclosporin, Wirkungsverminderung nicht-steroidalen durch nicht-steroidale Antiphlogistika.[4] Die Gabe von Telmisartan ist bei Vorliegen folgender Erkrankungen kontraindiziert: Schwangerschaft, Stillzeit, Nierenarterienstenose, schwere Nierenfunktionseinschränkung, schwere Leberinsuffizienz, Kombination mit kaliumsparenden Diuretika oder Kaliumgabe, hämodynamische bedeutsame Aortenklappenstenose und Mitralklappenstenose.[49] Telmisartan ist verschreibungspflichtig. Der Markenname von Telmisartan lautet „Micardis“ von Boehringer Ingelheim und „Pritor“ von Glaxo Wellcome.[18] 1.2.3. Pharmakokinetik Telmisartan besitzt laut BIBR 277 ein gut tolerables Profil und ähnlich wenige Nebenwirkungen wie ein Placebo. Die Dosierungen von Telmisartan belaufen sich auf 20mg bis 160mg am Tag. Es wird oral und einmal täglich eingenommen.[71] Dabei wird es rasch resorbiert.[49] Telmisartan hat eine Spitzenplasmakonzentration von 44,7μg/l bei einer 40mg Dosis, welche nach circa 1 Stunde erreicht wird. Die Bioverfügbarkeit von Telmisartan liegt bei 43%[49] und die Plasmaproteinbindung ist mit über 99% sehr hoch.[71] Das Wirkungsmaximum wird nach 3 bis 5 Stunden erreicht.[4] Es wird nicht durch Cytochrom P450 metabolisiert und hat ein niedriges Risiko für P450-basierte Arzneimittelinteraktionen.[109] Sein Verteilungsvolumen erstreckt sich auf etwa 500l, was eine zusätzliche Gewebsbindung bewirkt.[51] Es findet nur eine minimale Biotransformation statt und Telmisartan wird somit zu über 98% hepatisch eliminiert und über den Stuhl ausgeschieden. Telmisartan ist sehr stark lipophil und bewirkt gekoppelt mit einem hohen Verteilungsvolumen den klinisch wichtigen Vorteil einer guten Gewebepenetration. Weitere Eigenschaften sind die langsame Dissoziation vom Rezeptor und eine Plasmahalbwertszeit von 24 Stunden bei Dosen von 20mg bis 160mg.[49, 51, 71] Telmisartan ist kein Prodrug und hat eine längere Eliminierungshalbwertzeit als andere kommerzielle verfügbare Sartane (24h). So ist eine einmalige Gabe des Pärparats ausreichend. 12 1.2.4. Wirkmechanismus und Sonderstellung Das Renin-Angiotensin System reguliert den Blutdruck über die Aktivierung des AT1 Rezeptors durch Angiotensin II, was zur Vasokonstriktion, Ausschüttung von Vasopressin und Aldosteron, Natriumretention in den Nierentubuli und verminderten Nierenperfusion führt. Dies hält die Volumenhomöostase und den Blutdruck aufrecht und verhindert Ischämien bei akutem Volumenverlust.[106] Die hypertensiven Effekte Herzremodelling können verantwortlich für Strukturpathologien wie Gefäß- sein. Vasokonstriktion induziert also und eine Hypertrophie der glatten Muskelzellen und Herzmuskelzellen. Die Aktivierung von AT1 Rezeptoren durch Angiotensin II hat pathologische kardiovaskuläre, renale und zerebrale Prozesse zur Folge, welche einen Beitrag in der Entstehung von linksventrikulärer Myokardinfarkten, Hypertrophie, chronischem Hypertonie, Herzversagen, kardialen Arrythmien, Glomerulosklerose, Demenz, ischämischen Ereignissen und Arteriosklerose einschließlich oxidativen Stresses, inflammatorischer Prozesse, LDL-Cholesterin Transfer und prothrombotischer Zustände leisten.[26, 65, 104, 105] Die lokale Produktion von Angiotensin II kann enorme Auswirkungen auf die Endothelfunktion, den Phänotyp glatter Muskeln, entzündliche Prozesse und die Pathobiologie von Gefäßerkrankungen (Koronararterienveränderungen) haben.[26] Bei Hypertonie ist die Konzentration von Angiotensin II oft erhöht. Angiotensin II trägt durch Stimulierung des Wachstums von glatten Muskelzellen zur Atherogenese bei.[16] Angiotensin II bindet an spezifischen Rezeptoren am glatten Muskel und aktiviert so die Phospholipase C, welche zu einem erhöhten intrazellulären Calciumspiegel und somit zur Kontraktion des glatten Muskels, erhöhter Proteinsynthese und Hypertrophie des glatten Muskels führt.[38] Es erhöht ebenfalls die Aktivität der Lipoxygenase des glatten Muskels, welche die Inflammation und Oxidation von LDL verstärken kann.[87] AT1-Rezeptor-Aktivierung vermittelt zudem Zellwachstum und Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen[35], Kardiomyozyten[77] und Koronarendothelzellen[65, 100]. Die Hemmung der Effekte von Angiotensin II durch die spezifische AT1-Rezeptor-Blockade bietet einen therapeutischen Vorteil bei diesen Pathologien.[106] 13 Das Peptidhormon Angiotensin II ist ein Haupteffektor des Renin-Angiotensin Systems und als solcher besitzt es potente blutdrucksteigernde Aktivität.[71] Der Angiotensin-II-Rezeptorantagonist Telmisartan hat sich daher weltweit zur Behandlung von Hypertonie bewährt.[105] Telmisartan hemmt die Angiotensin II Effekte. Es führt also zu Vasodilatation und verminderter Aldosteronsekretion mit reduzierter Natrium- und Wasserretention und somit zur Blutdrucksenkung und Besserung der Herzinsuffizienz.[4, 49] Zudem wirkt Telmisartan nephroprotektiv. Bei Nierenerkrankungen führt es zu verminderter Proteinurie und verminderter Progression der Nierenerkrankung. Außerdem fördert Telmisartan die Ausscheidung von Harnsäure in der Niere.[49] Der Abbau von Bradykinin wird durch Telmisartan nicht beeinflusst. Der für ACEHemmer typische Husten, tritt bei Telmisartan nur selten als Nebenwirkung auf.[49] Durch Telmisartan wird die Kontraktilität glatter Muskelzellen gesenkt, was zu einer Senkung des peripheren Gefäßwiderstandes und folglich zur Senkung des Blutdrucks führt. Telmisartan senkt bei Patienten mit milder bis moderater Hypertonie signifikant den systolischen und diastolischen Blutdruck im Vergleich zu einem Placebo.[71, 88] Die Effizienz ist zu vergleichen mit der Wirkung von ACE-Hemmern, Beta-Blockern und Calciumantagonisten wie Enalapril[96], Lisinopril[76], Atenolol[28] und Ramipril.[108, 109] Die doppelte RAS-Blockade durch Telmisartan und einem ACE-Hemmer wurde mit keinem zusätzlichen Vorteil assoziiert und die Inzidenz der Nebenwirkungen war in der Kombination erhöht.[108] Eine Anzahl an Studien mit ACE-Hemmern[58] und Angiotensin-II- Rezeptorantagonisten[14, 59, 78] haben renoprotektive Effekte und protektive Effekte für Herzversagen gezeigt.[14, 59, 88, 109] Zudem reduzieren Angiotensin II Rezeptorantagonisten Proteinurie um 22% und führen zum Anstieg des Kreatinins im Serum. Sie sind somit ein essentieller Bestandteil in der Behandlung von chronischem Nierenversagen.[58, 67, 88] 14 Der Angiotensin-Rezeptorantagonist Telmisartan reduziert signifikant die Mortalität, den Anteil an kardiovaskulären Todesfällen sowie Anzahl an Krankenhausaufnahmen. Ursächlich hierfür können dekompensiertes Herzversagen bei Patienten mit Hämodialyse, chronisches Herzversagen oder eine LVEF < 40% sein. Die positiven Effekte können erreicht werden, wenn Telmisartan zur Standardtherapie mit Betablockern hinzugefügt wird. Diese Erkenntnisse könnten die Prognose von Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz und chronischen Herzversagen verbessern.[22] In transgenen Ratten reduziert Telmisartan kardiale Hypertrophie und Glomerulosklerose.[71] Außerdem wurde Telmisartan mit einer signifikant geringeren Inzidenz von behandlungsbedingtem Husten wie Enalapril oder Lisinopril und behandlungsbedingtem Ödem wie Amlodipin assoziiert.[76, 96] Telmisartan unterscheidet sich innerhalb der Angiotensin-II-Rezeptorantagonisten und den meisten anderen antihypertensiven Medikamenten durch die lange Halbwertzeit (etwa 24 Stunden) und Dauer der blutdrucksenkenden Wirkung.[105] Telmisartan ist besonders wirksam zur 24-stündigen Blutdruckkontrolle und dient gut zur Reduzierung des während der Morgenstunden ansteigenden Blutdruckes und senkt somit das erhöhte Risiko für kardiovaskuläre Ereignisse, einschließlich Myokardinfarkten[23, 73], plötzlichen Herztod[110, 111] und zerebrovaskulären Ereignissen.[57, 69, 105] 15 1.3. Fragestellung In dieser Arbeit wurde die Wirkung des Angiotensin-II-Rezeptorantagonisten Telmisartan auf humane glatte Gefäßmuskelzellen untersucht. Die therapeutische Stentimplantation in Folge eines atherosklerosebedingten Myokardinfarktes birgt die Gefahr einer möglichen Restenose. Beteiligt an der Atherosklerose und ebenso an der Restenosierung sind glatte Gefäßmuskelzellen. Hierbei stellen sich folgende Fragen: Inhibiert Telmisartan die Proliferation von humanen glatten Gefäß- muskelzellen? a) Inhibiert Telmisartan die PDGF induzierte Expression von Cyclin D1 in humanen glatten Gefäßmuskelzellen? b) Welchen Effekt hat Telmisartan auf die PDGF induzierte Aktivierung der PI-3 Kinase? c) Führt die Stimulation mit Telmisartan zur verminderten Expression von Ki-67 in humanen glatten Gefäßmuskelzellen? 16 2. Material und Methodik 2.1. Material 2.1.1. Substanzen und Lösungen Substanzen Acrylamide 30% Bio-Rad Laboratories, China α – Actin Santa Cruz SC1616 Santa Cruz Biotechnology, USA Alpha-phosphatdiliositol ammonium salt solution from bovine Liver > 98% SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA Ammonia Solution 25% Merck KGaA, Darmstadt, Germany Ampuwa Spüllösung Fresenius Kabi, Sèvres, France Anti-PI-3-kinase p-85 AK Upstate (Millipore), Massachusetts, USA APS 10% SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA 32p-ɣ ATP 1µl=10µCi Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig, Germany BenchMark Prestained Protein Ladder Life Technologies, Darmstadt, Germany β-Glycerolphosphate 1M SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA β-Glycerophosphatedisodium salt hydrate L-alpha isomer < 20% SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA β-Mercaptoethanol SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA Bidest Wasser Apotheke, Germany Bio Rad Protein Assay dye reagent concentrat Bio Rad, Karlifornien, USA Bradfordlösung Bio-Rad Protein Assay Bio Rad Laboratories GmbH, München, Germany Bromphenolblue SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA Chloroform VWR International GmbH, Darmstadt, Germany DAPI-Lösung SERVA, Heidelberg, Germany DMSO SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA 17 DTT AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany Dulbecco´s PBS without Ca & Mg Steril PAA The cell culture company, Pasching, Austria EGTA SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA Eis Eismaschine Ethanol absolut Merck KGaA, Darmstadt, Germany Fluorescent Mounting Medium DakoCytomation GmbH, Hamburg, Germany Glycerol Carl Roth GmbH +Co, Karlsruhe, Germany Glycin AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany Goat anti-mouse Cy3 Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., Pennsylvania, USA HCl 1M Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1M HEPES pH=7,5 SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA 1M HEPES pH=7,4 SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA HRP mouse Ak Dako, Glostrup, Denmark Insulin from bovine Pancreas 2,5mg SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA Ki-67 Monoclonal mouse anti-human DakoCytomation GmbH, Ki-67 antigen Clone MIB-1 Hamburg,Germany Kollagen (calf skin) SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA Kulturmedium SMGM-2 Smooth Muscle Growth Medium-2 LONZA, Walkersville, USA Magnesiumchlorid MgCl2 Merck KGaA, Darmstadt, Germany Manganchlorid MnCl2 SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA Methanol 2,5l SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA Micro BCA Reagent A MA Thermo Scientific, Rockford, USA Micro BCA Reagent B MB Thermo Scientific, Rockford, USA Micro BCA Reagent C MC Thermo Scientific, Rockford, USA Milchpulver Carl Roth GmbH +Co, Karlsruhe, Germany 18 Natriumchlorid NaCl 0.9% B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany Natriumfluorid NaF SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA Natriumsulfat NaSo4 SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA Nonidet P40 NP-40 100% AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany PBS Phosphat gepufferte Kochsalzlösung PAA Laboratories GmBH, Pasching, (phosphate buffered saline) Austria Phosphatidylinositol SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA PI Proteaseinhibitor Cocktail SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA Protein A/G PLUS-Agarose SC-2003 Santa Cruz Biotechnology, USA PMSF Stabilisator SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA Polyclonal Rabbit Anti-mouse Immunoglobulins/ HRP DakoCytomation GmbH, Hamburg, Germany Polyclonal Rabbit Anit-Goat Immunoglobulins/ HRP DakoCytomation GmbH, Hamburg, Germany PS (Penicillin 10000Units/ml – Streptomycin 10mg/ml) PAA Laboratories GmBH, Pasching, Austria Purified Mouse Anti-Human Cyclin D1 BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Germany Recombinant Human PDGF-BB Peprotech, New Jersey, USA SDS ultra pure 10% Carl Roth GmBH, Karlsruhe, Germany SmBM Smooth Muscle Cell Basal Medium 500ml LONZA, Walkersville, USA Sodium orthovanadate Na3VO4 200mM SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA SOV Sodium-Ortho-Vanadate 10µl SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA Standardreihe-Epis 10-60µg/ml (aus Albumin Standard: bovine serum albumin) Thermo Scientific, Rockford, USA Stickstoff VWR International GmbH, Darmstadt, Germany Stripping Puffer, Restore Western Blot Thermo Scientific, Rockford, USA 19 Super Signal West Pico Stable Peroxide Solution Thermo Scientific, Rockford, USA Super Signal West Pico Luminal/ Enhancer Solution Thermo Scientific, Rockford, USA TLC Silicia gel 60 F254 Analytica Chromatography Merck KGaA, Darmstadt, Germany Telmisartan 10µM solid, > 98% SIMGA-Aldrich, St.Louis, USA TEMED SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA TNS Trypsin-Neutralisationssolution LONZA, Walkersville, USA Transferrin human > 98%, 2,5mg SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA Tris-base SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA 1,5M Tris basisch pH=8,8 SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA 0,5M Tris pH=6,8 SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA 1M Tris pH=7,4 SIGMA-Aldrich, St.Louis, USA Trypsin/ EDTA Lonza, Basel, Switzerland 1ml Tween Polyoxyethylene-Sorbitan Monolaurate Tween 20 Sigma Ultra SIMGA-Aldrich, St.Louis, USA X-Ray developer for roller machines Tetenal Europe GmbH, Norderstedt, Germany X-Ray fixing solution for roller machines Tetenal Europe GmbH, Norderstedt, Germany Lösungen Alkohol 70% Ethanol absolut 70% demineralisiertes Wasser 30% ELISA-Substanz: Micro BCA Reagent B MA 50% Micro BCA Reagent B MB 48% Micro BCA Reagent C MC 2% 20 Sampelgel - Gel 1.Teil 10% APS 150μl 12% Sampelgel 15ml TEMED 30μl Stackgel - Gel 2.Teil 5% Stackgel 5ml 10% APS 50μl TEMED 10μl Hungermedium SmBM Smooth Muscle Cell Basal Medium 500ml Insulin from bovine Pancreas 2,5mg Transferrin human > 98%, 2,5mg PS (Penicillin Streptomycin) 5ml Läemli 5x Ladepuffer 0,5M Tris pH 6,8 5ml Glycerol 4ml SDS 10g β – Mercaptoethanol 0,5ml Bromphenolblue 125mg Aqua 10ml LIMK-Puffer für 1 x 5 Petrischalen ( je 150µl): LIMK 1ml SOV Sodium-Ortho-Vanada 10µl PI Proteaseinhibitor Cocktail 5µl PMSF Stabilisator 10µl 21 3xLipidkinasepuffer 60 mM TRIS pH 7,4 600µl 12 mM MgCl2 120µl 100 mM NaCl 600µl H2O 8,68ml Lysis Puffer für PI-3-Kinase Assay 20nm HEPES pH 7,5 1ml 10nM EGTA 5ml 1% NP-40 500µl 2.5nM MgCl2 125µl 2mM Na3VO4 (SOV) (-20°C) 500µl 40mM ß-glycerophosphate 2ml 1mM DTT (-20°C) 50µl Protease Inhibitor (-20°C) 250µl H2O 40ml LIMK Kinase Lysis Puffer für Western 50mM HEPES pH 7,4 5ml 150mM NaCl 3ml 1% NP-40 1ml 5% Glicerol 5ml 1mM DTT 100µl 1mM MgCl2 100µl 1mM MnCl2 100µl 10mM NaF 1ml 1mM NaSo4 fresh 1mM PMSF fresh Protease inh. fresh 22 Mastermix 3x Lipid-Kinase –Puffer 22,5µl Wasser 16,5µl Phosphatdiliositol 12,5µl 32 p - y-ATP 1µl Milch 5% Milchpulver 5g TBST 100ml 10x Running Puffer Stock (pH=8,3) Tris-Base 30,3g Glycin 141g SDS 10g Aqua 1l Sampelgel 12% 30% Acrylamide 72ml Ampuwa 59,04ml 1,5M Tris basisch pH=8,8 45ml 10% SDS ultra pure 1,8ml Stackgel 5% 30% Acrylamide 15ml Ampuwa 61,8ml 1,0M Tris pH=6,8 11,25ml 10% SDS ultra pure 0.9ml TBST 10xTBS stock 100ml Wasser bidest 900ml Tween Polyoxyethylene-Sorbitan Monolaurate Tween 20 Sigma Ultra 1ml 23 10xTBS Stock (pH=7,6) Tris base 42,2g NaCl 80g H2O 1l TLC Puffer Methanol 93ml Chlorophorm 112ml Ammonia Solution 25% 16ml H2O 10,5ml Transferpuffer 10xStock 100ml Methanol 100ml Wasser aus bidest Box 800ml 10x Transferpuffer Stock (pH=8,3) Tris Base 15,15g Glycin 56,3g Bidest 500ml 2.1.2. Geräte und Kits Absaugvorrichtung Brand GmbH, Wertheim, Germany Abzug Waldner Holding GmbH, Wangen, Germany Amersham Hyperfilm Ecl GE Healthcare Life Sciences GmbH, Freiburg, Germany Bradford-Platte Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany Brutschrank Thermo Scientific, Rockford, USA Cellstar ELISA-Platte Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany Culture Slide BD Falcon BD Biosciences, Heidelberg, Germany 24 Eppendorfgefäße/ Safe-lock Tubes 1,5ml Eppendorf AG, Hamburg, Germany Eppendorfpipette/ Multipette plus Eppendorf AG, Hamburg, Germany Falcons/ High-Clarity Polypropylene Conical Tube 15ml BD Biosciences, Heidelberg, Germany Falcons/ High-Clarity Polypropylene Conical Tube 50ml BD Biosciences, Heidelberg, Germany Filmbox rego Filterpapier Bio Rad Laboratories GmbH, München, Germany Fluoreszenzmikroskop Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany Heizblock/ Thermomixer compact Eppendorf AG, Hamburg, Germany Heizmaschine/ Biometra compact line Biometra GmbH, Goettingen, Germany Kulturflaschen Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany Kühlschrank Liebherr, Ehingen, Germany Kühlraum/ -labor Weiss Technik AG, Altendorf, Schweiz Küvette VWR International GmbH, Darmstadt, Germany Lichtmikroskop Nikon, Düsseldorf, Germany Magnetrührer RCT basic Ikamag safety control Mischgerät Duomax 1030/ Wippe Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach, Germany Petrischalen 90mm VWR International GmbH, Darmstadt, Germany Pipetten/ Pipetman Gilson, Inc., Middleton, USA Pipetto/ Pipetus-akku Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany Photometer MWG-Biotech GmbH, Ebersberg, Germany PVDF-Transfer Membrane Thermo Scientific, Rockford, USA Rotating Machine/ Überkopf-Mischer Reax 2 Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach, Germany 25 Rührfisch VWR International GmbH, Darmstadt, Germany Schaber/ Cell Scraper BD Biosciences, Heidelberg, Germany Tips Eppendorf AG, Hamburg, Germany TLC- Platte Merck KGaA, Darmstadt, Germany Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc., New York, USA Wasserbad Sonikaten/ Sonorex Bandelin RK 100 Bandelin Electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany Wärmebad Julabo SW23, Seelbach, Germany Western Blot Geräte: Biometra GmbH, Goettingen, Germany Vier Platten Biometra GmbH, Goettingen, Germany Zwischengummi Biometra GmbH, Goettingen, Germany Drei Klammern Biometra GmbH, Goettingen, Germany Kamm Biometra GmbH, Goettingen, Germany Kammer Biometra GmbH, Goettingen, Germany Ampere/Voltstation Standard Power Pack P25 Biometra GmbH, Goettingen, Germany Wet Blot Geräte: Bio-Rad Laboratories GmbH, München, vier Schwämme Germany vier Filterpapiere zwei Membranen zwei Gele Gerät Zentrifuge/ Biofuge pico Heraeus Instruments GmbH, Hanau, Germany 26 2.2. Methodik 2.2.1. Kulturen 2.2.1.1. Zellkultur Als Zellkultur wird die Kultivierung einer Zellpopulation außerhalb eines Organismus ("in vitro") unter kontrollierten Bedingungen bezeichnet. In dieser Versuchsreihe handelt es sich um adhärente Zellkulturen, d.h. dass sich die adhärenten Zellen AOSMC bei der Proliferation an die Böden der Kulturflasche oder Petrischale heften. Zellkulturen werden in der Forschung, Entwicklung aber auch in der Diagnostik genutzt. Die aortalen glatten Muskelzellen wurden bei der Firma Cambrex eingekauft. Dabei handelt es sich um Zellen eines 49-jährigen männlichen Kaukasiers, welche am 18. Mai 2005 erstmals in Kultur gebracht wurden. Der Produktname lautet AOSMC – Aortic Smooth Muscle cells, SMGM – 2, cyro amp.. 2.2.1.2. Vorbereitung und Erhaltung der Zellkulturen Zur Vorbereitung wird sowohl das Kulturmedium SMGM-2 als auch PBS für 15 Minuten in eine Wärmebad von 37°C gegeben. Zudem werden Trypsin und TNS bereitgestellt – Substanzen, die im Kühlschrank bei 4°C aufbewahrt werden. Medienwechsel: Zur optimalen Versorgung der Kulturen wird ein regelmäßiger Mediumwechsel durchgeführt. Hierfür wird mehrmals in der Woche das alte Kulturmedium aus den Kulturflaschen und Petrischalen abgesaugt und neues Kulturmedium SMGM-2 hinzugefügt – je 10ml pro Flasche und 5ml pro Petrischale. Durch dieses Vorgehen werden optimale Proliferationsbedingungen für die aortalen glatten Muskelzellen hergestellt. Die Kulturen werden außerdem im Brutschrank bei 37°C inkubiert, was näherungsweise ihrer physiologischen Umgebung entspricht. 27 Splitten: Die Zellen der Kulturflaschen werden je nach Dichtegrad 1-2 Mal pro Woche gesplittet – dies wird bis zur achten Passage durchgeführt. Um die Proliferation der Zellen zu stoppen, wird folgendermaßen vorgegangen. Nach Absaugen des Kulturmediums werden die Zellen mit 10ml PBS gewaschen. Dabei werden die Flaschen vorsichtig geschwenkt. Anschließend wird das PBS abgesaugt und 2ml Trypsin pro Kulturflasche zugefügt. Die mit Trypsin versehenen Zellen werden für 1-2 Minuten im Brutschrank inkubiert. Durch vorsichtiges Beklopfen der Flaschenwand werden die Zellen dann vom Boden abgelöst. Ein erfolgreicher Proliferationsstopp mit Trypsin wird mit Hilfe eines Lichtmikroskops festgestellt. Abschließend wird der Kulturflasche 2ml Trypsin-Neutralisationssolution zugegeben, um das Trypsin zu inaktivieren. Die Muskelzellen, welche nun gelöst vorliegen, werden in ein 50ml Falcon pipettiert und in diesem bei 1200rpm für 5 Minuten zum Pellet zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstandes, werden die Zellen mit 1ml Kulturmedium resuspendiert. In Abhängigkeit von der gewünschten Kulturflaschenzahl, wird je 1ml Medium hinzugefügt. Man erhält somit eine Zell-Medium-Suspension. Zur Herstellung neuer Kulturflaschen wird jeweils 1ml der ursprünglichen ZellMedium-Suspension verwendet und zu einem Gesamtvolumen von 10ml mit Kulturmedium aufgefüllt – also 9ml. Entsprechend wird bei der Herstellung neuer Petrischalen 1ml Zellsuspension weitere 4ml zugegeben. Die Inkubation der Zellen findet im Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 statt. Für einige Methoden müssen die Zellen für 1-2 Tage im Brutschrank „hungern“, d.h. dass der Stoffwechsel heruntergefahren wird, um auf eine Stimulation eine stärkere Reaktion zu erhalten. Hierfür wird das übliche Kulturmedium durch 3ml Hungermedium pro Petrischale ersetzt. Das Hungermedium wird im Kühlschrank bei 4°C aufbewahrt und besteht aus Basalmedium 500ml Insulin 2,5mg Transferrin 2,5mg Penicillin Streptomycin (PS) 5ml 28 2.2.1.3. Herstellung der Lysate Die Herstellung der Lysate erfolgt nachdem die AOSMCs in den Petrischalen 2 Tage lang gehungert wurden. Die Petrischalen sollten bis zu 80% konfluent sein. Fünf Petrischalen mit je 3ml Hungermedium sind für folgendes Schema vorgesehen: 1. Co 2. PDGF 10ng/ml 3. PDGF 10ng/ml + 120´ Telmisartan 1µM 4. PDGF 10ng/ml + 120´ Telmisartan 5µM 5. PDGF 10ng/ml + 120´ Telmisartan 10µM Die Telmisartan-Konzentrationen werden durch Verdünnung mit Hilfe von DMSO hergestellt. Die Zellen der jeweiligen Petrischalen werden mit je 3µl der entsprechenden Telmisartan-Konzentration vorstimuliert. Die Inkubationszeit beträgt 2 Stunden, in welcher die Petrischalen im Brutschrank inkubiert werden. In der Zwischenzeit werden drei Reihen mit je 5 Epis vorbereitet und beschriftet. Für 5 Petrischalen mit je 150µl wird zudem ein LIMK-Puffer in einem 15ml Falcon hergestellt. Dieser setzt sich aus folgenden Bestandteilen zusammen: LIMK Lysepuffer (siehe Lösungen) 1ml PMSF Stabilisator 200mM (1: 100) 10µl PI Proteaseinhibitor (1: 200) SOV Sodium-Ortho-Vanada Na3VO4 200mM (1:100) 5µl 10µl Nach Ablauf der Inkubationszeit im Brutschrank erfolgt die Weiterverarbeitung der Petrischalen. Die Zellen werden eine Minute lang mit je 3µl PDGF Human stimuliert. Anschließend wird auf Eis die Flüssigkeit sofort abgesaugt und zweimal mit kaltem PBS gewaschen und abgesaugt. Danach werden jeweils 150µl LIMKPuffer hinzugefügt und nun können die Zellen mit Hilfe eines Zellschabers in die Flüssigkeit geschabt werden. Diese wird dann mit einer 200µl-er Pipette in die vorbereiteten Epis pipettiert, welche anschließend für 15 Minuten auf Eis im Kühlraum inkubiert werden. Daraufhin werden die Zellen für 10min bei 13000rpm abzentrifugiert und dann auf Eis gestellt. Der Überstand wird abgenommen und in die vorbereiteten Epis pipettiert, welche in flüssigem Stickstoff transportiert und bei -80°C aufbewahrt werden. Die Herstellung der Lysate ist somit abgeschlossen. 29 2.2.2. Micro BCATM Protein Assay Der Micro BCATM Protein Assay ist eine saure Rezeptur zur colorimetrischen Erfassung und Quantifizierung von Gesamtprotein. Es wurde optimiert zur Verwendung verwendet bei verdünnten Bicinchoninsäure Proteinproben (BCA) zur (0.5-20μg/mL). quantitativen, Die Methode photometrischen Bestimmung von Proteinen. Bei der BCA-Reaktion reagieren zweiwertige Kupferionen quantitativ mit Protein zu einwertigen Kupferionen. Es entsteht ein violetter Farbstoff durch die Chelation von zwei Molekülen BCA mit einem Kupferion. Anschließend erfolgt die photometrische Bestimmung der Antigenkonzentration bei einer Wellenlänge von 562nm im Vergleich zu einer Verdünnungsreihe mit bekannten Konzentrationen (Albumin-Standardreihe). Zu allererst wird eine Cellstar ELISA-Platte und die Epis der Standardreihe (1060μg/ml Albumin) aus dem Gefrierschrank bereitgestellt. Die ELISA-Platte wird beschriftet und mit Hilfe der Eppendorfpipette je 100µl Wasser in die Probenreihen pipettiert. Die Lysate werden gevortext und mit einer 2µl-Pipette wird jeweils 1µl des Lysats in eine Probenreihe pipettiert. Anschließend werden die Standardepis gevortext und je 100µl in die Standardreihen pipettiert. Daraufhin wird das Substrat angesetzt: Micro BCA Reagent A MA 50% Micro BCA Reagent B MB 48% Micro BCA Reagent C MC 2% Die drei Substanzen werden vermischt, gevortext und anschließend kann je 100µl des Substrats mit der Eppendorfpipette in jedes Fach pipettiert werden. Das Micro BCA Protein Assay Kit dient zum Nachweis von Proteinkonzentrationen verdünnter Protein-Lösungen (0.5-20μg/ml). Die ELISA-Platte wird nun für 1 Stunde in der Heizmaschine bei 60C inkubiert. Abschließend wird der ELISA photometrisch ausgewertet. Dies findet bei einer Wellenlänge von 562nm statt. 30 2.2.3. WESTERN BLOT 2.2.3.1. Durchführung des Western Blot Als Western Blot bezeichnet man ein molekularbiologisches Verfahren zum Nachweis von Proteinen. Die Proteine werden in dem Sammelgel gesammelt und nach Anlegen ektrophoretisch des Stroms nach ihrer werden Größe unterschiedlich weit auf diesem die und Proteine Ladung durch das Trenngel getrennt und wandern Gel. Danach werden die Proteine durch das sogenannte Blotting ihrer Ladung entsprechend auf eine PVDF-Membran übertragen. Anschließend werden die Membranen mit einem Primär-Antikörper behandelt, welches spezifisch Proteine bindet. Danach erfolgt die Sichtbarmachung mit Hilfe des Zweit-Antikörpers, an welchem das Enzym HRP, die Meerrettichperoxidase, gekoppelt ist. Daraus entsteht eine Chemolumineszenz-Reaktion, welche auf einem Röntgenfilm detektiert werden kann. Gelherstellung Zu Beginn werden zwei Glasplatten mit 70% Alkohol gereinigt. Das Zwischengummi wird angelegt, die Platten direkt übereinander gelegt und mit 3 Klammern fixiert. Im 50ml Falcon wird der erste Teil des Gels, das Sampelgel und Trenngel, hergestellt: 10% APS 150μl 12% Samplegel 15ml TEMED 30μl. Das Gemisch wird kurz gevortext und in den Plattenspalt bis mindestens 1,5cm unter den Rand einpipettiert. Bis zum Rand wird mit Aqua dest. aufgefüllt, um eine glatte Oberfläche zu schaffen. Nach einer Wartezeit von zehn Minuten ist das Gel polymerisiert und das destillierte Wasser kann abfließen. Nun wird der zweite Teil des Gels, das Stackgel und Sammelgel, in einem 50ml Falcon hergestellt. 5% Stackgel 5ml 10% APS 50μl TEMED 10μl 31 Nach dem Vortexen wird der Rest des Plattenspaltes mit dem Stackgel aufgefüllt und ein Kamm mit 10 Taschen eingefügt. Erneut ist mit einer Polymerisationszeit von 10 Minuten zu rechnen. Materialvorbereitung Nun wird aus den ELISA-Ergebnissen die maximale Proteinmenge berechnet, die in die Taschen einpipettiert wird. Um eine jeweils gleiche Proteinmenge zu erhalten, wird den Epis die entsprechende Lysat- und Wassermenge zugefügt. Die Epis werden gevortext und auf Eis gelagert. Hinzu kommt nun zusätzlich noch jeweils 8,75μl 5x Läemli Ladepuffer – dies findet unter dem Abzug statt. Die Epis werden abschließend gevortext und für 10min bei 99°C im Heizblock erwärmt. Die Western Blot Kammer Die Kammer der Station wird mit Running Puffer befüllt. Es werden die Klammern, der Kamm und das Gummi von den Glasplatten entfernt und mit 2 Klammern am Gerät festgemacht. Der Rest wird nun mit Running Puffer aufgefüllt und die Luftblasen entfernt. Dann werden die Proben aus dem Heizblock geholt und kurz abzentrifugiert. Im Folgenden werden die Taschen mit Hilfe der langen Tips gefüllt: 15μl Bench Mark Prestained Protein Ladder als Kontrolle 43,75μl Proben aus den Epis 20μl 2xLäemli in die restlichen leeren Taschen Die Kammer wird geschlossen und an die Stromquelle angeschlossen. Nun erfolgt die Elektrophorese für 2,5-2,75 Stunden bei 109V. Abschließend wird das Gerät ausgeschaltet, der Deckel und die Klammern werden entfernt und die Platten auseinandergeklappt. Das Gel wird letztendlich in den Transferpuffer gelegt. 32 2.2.3.2. WET BLOT Es wird für eine Kammer 1l Transferpuffer vorbereitet: 100ml 10xStock 100ml Methanol 800ml bidest Wasser Der Transferpuffer wird im Kühlschrank vorab gekühlt und aufbewahrt. Es werden zusätzlich vier Schwämme und vier Filter in den Transferpuffer gelegt. Die beiden PVDF-Membranen werden zuerst equilibriert, d.h. Rücken an Rücken zehn Sekunden lang in Methanol gelegt. Das Methanol wird dann abgegossen und die Membranen zwei Minuten in bidest Wasser stehen gelassen. Nun kann man die Membranen zu den entsprechenden Gelen in den Transferpuffer hinzufügen. Die sogenannte Sandwich-Methode wird durchgeführt. Von der Anode aus gesehen, dem sogenannten Plexi-Anteil, werden die Bestandteile in folgender Reihenfolge aufeinander gelegt: ein Schwamm, ein Filterpapier, die PVDFMembran, das Gel, ein Filterpapier, und zuletzt erneut ein Schwamm. Dann wird das „Sandwich“ mit dem schwarzen Anteil an die Kathode angeschlossen. Das Gerät wird mit Transferpuffer aufgefüllt und im 4°C kalten Kühlraum auf einen Magnetrührer gestellt. Der Strom wird angeschlossen und so bei einer konstanten Voltzahl von 80V für 40 Minuten geblottet. Hinterher werden die Membranen dem Wet Blot entnommen und in ein kleines Gefäß mit TBST - Tris Buffered Saline mit Tween - gelegt. Das TBST wird weggegossen. Um eine gleichmäßige Verteilung der Substanzen auf der Membran zu gewährleisten, wird im folgenden Teil des Versuchs das Gefäß auf eine Wippe gestellt. Die Membranen werden mit 5% Milch bedeckt und eine Stunde lang auf der Wippe geschwenkt. Dies bewirkt, dass die freien unspezifischen Proteinbindungsstellen auf der Membran mit Proteinen blockiert werden. Die Lösung von entfettetem Milchpulver eignet sich hierfür, da diese nicht von den Antikörpern erkannt werden können. Somit ist ein spezifischer Nachweis von Antigenen möglich. 33 Abschließend werden die Membranen in einzelne Boxen gelegt und mit dem ersten Antikörper Cyclin D1, der in Milch gelöst ist, versehen, welcher an das gesuchte Protein bindet. Die Membranen werden so bei 4°C im Kühlraum über Nacht auf der Wippe belassen. Der erste Antikörper Cyclin D1 wird in einer 1: 500 Konzentration in einem 15ml Falcon hergestellt. Hierfür benötigt man 5% Milch und den Antikörper Cyclin D1 (4°C) mit einer Masse von 36kDa. Das Gemisch wird gevortext und im Kühlschrank aufbewahrt. Am folgenden Tag werden die Membranen dreimal mit TBST für je 10 Minuten gewaschen um unspezifisch bindende Antikörper zu entfernen. Nach der Waschung wird der zweite Antikörper hinzugefügt und für eine Stunde belassen. Dieser wird in einer 1:3000 Konzentration hergestellt. Hierfür wird 5% Milch und Ak Anit-mouse HRP konjugiert benötigt. Der Sekundärantikörper bindet an den Primärantikörper anti-Cyclin D1. Danach wird erneut dreimal zehn Minuten mit TBST gewaschen, um alle überschüssigen Antikörper zu entfernen. Nun erfolgt die Sichtbarmachung. Bei Enzym-Immunkonjugaten wird durch das Enzym eine Chemolumineszenzreaktion katalysiert. In unserem Fall ist das an dem sekundären Antikörper gekoppelten Enzym die Meerrettichperoxidase (HRP, horseradish peroxidase). HRP überführt Dioxetane in seine oxidierte Form, bei der eine Chemolumineszenz entsteht und auf Röntgenfilmen detektiert werden kann. Es werden je 6ml Super Signal West Pico A und Super Signal West Pico B in eine Schale gegeben. Dies sind hochsensitive Substrate zum Nachweis von HRP auf Immunblots. Die Sensitivität, Intensität und Dauer des Signals erlauben einen leichten Nachweis von HRP durch Bildverfahren. Die Membranen werden einzeln für eine Minute in die Flüssigkeit gelegt und anschließend auf einen alten Film in eine Filmbox gelegt. In der Dunkelkammer werden die Membranen mit einem neuen Film belegt. Nach ungefähr 30 Minuten Wartezeit kann der Film entwickelt und fixiert werden. 34 2.2.3.3. Ladungskontrolle Nun erfolgt die Ladungskontrolle. Der entwickelte Film wird beschriftet und die Membran wird wieder durch Methanol zehn Sekunden lang aktiviert. Danach wird kurz mit TBST gewaschen und die Membran mit 10ml Stripping Puffer für zehn Minuten bedeckt. Erneut wird dreimal zehn Minuten mit TBST gewaschen. Anschließend wird die Membran eine Stunde lang mit 5% Milch bedeckt. Der erste Antikörper α – Actin Santa Cruz SC1616 kann nun hinzugefügt werden. Dieser wird in einer 1:300 Konzentration in 5% Milch hergestellt. Er wird über Nacht auf der Membran belassen und auf der Wippe im Kühlraum inkubiert. Am nachfolgenden Tag kann die Ladungskontrolle fortgesetzt werden. Der Antikörper ist mehrmals verwendbar. Es wird dreimal zehn Minuten mit TBST gewaschen, bevor der zweite Antikörper für eine Stunde hinzugegeben werden kann. Dieser wird in einer 1: 3000 Konzentration mit 5% Milch und Anti-Goat Ak HRP konjugiert hergestellt. Es erfolgt eine weitere dreimalige Waschepisode für je zehn Minuten. Super Signal West Pico A und Super Signal West Pico B werden mit je 6ml in eine Schale gegeben. Die Membranen werden eine Minute lang einzeln inkubiert und anschließend in eine Filmbox gelegt. In der Dunkelkammer kann das Bild in weniger als fünf Sekunden sofort entwickelt werden. Letzten Endes wird das Bild eingescannt und mit Hilfe des Image J Densitometrie Programms ausgewertet. 35 2.2.4. PI-3-Kinase Assay Der Phosphoinositid-3-Kinase Assay (PI-3-Kinase Assay) dient zum Nachweis von den Enzymen PI-3-Kinasen, welche sich in eukaryotischen Zellen befinden und eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion spielen. Probengewinnung Die Petrischalen mit AOSMCs werden wie folgt behandelt: 1. Co 2. PDGF 10ng/ml 3. PDGF 10ng/ml + 120´ Telmisartan 1μM 4. PDGF 10ng/ml + 120´ Telmisartan 10μM Die Petrischalen werden für 2 Stunden mit der entsprechenden TelmisartanKonzentration im Brutschrank vorstimuliert. Danach werden die Petrischalen für 5 Minuten mit PDGF 10ng/ml behandelt. Es wird mit PBS gewaschen. Dann wird je 1ml PBS pro Petrischale zugegeben, in welches die Zellen mit Hilfe eines Zellschabers abgeschabt werden. Die so in PBS gelösten Zellen werden in ein Epi überführt und für 5 Minuten bei 3500rpm zentrifugiert. Das PBS wird abgesaugt und die Epis werden bei -20°C gelagert. PI-3-Kinase Zu Beginn werden die Materialien für den Lysispuffer bereitgestellt und zudem werden 12,5µl Alpha-phosphatydiliositol pro Probe in einem Epi unter den Abzug zum Ausdampfen gestellt. Der Lysispuffer wird frisch hergestellt und auf einem Magnetrührer im Kühlraum kalt gehalten. Die Proben, ebenfalls auf Eis kalt gestellt, erhalten jeweils 500µl Lysispuffer. Nach ausgiebigem Vortexen werden die Proben für mindestens zwanzig Minuten auf Eis lysiert. Danach wird mit 10000rpm bei 4°C für fünf Minuten zentrifugiert. Die Überstande werden in neue Epis überführt. Dann wird die Proteinmessung nach Bradford vorgenommen. Die Bradfordlösung wird in einer 1:5 Konzentration hergestellt. Für jede Probe sind 200µl Bradfordlösung notwendig. 36 Es wird eine Doppelbestimmung in einer 1:200 Verdünnung durchgeführt. In jedes Fach der Cellstar ELISA-Platte wird 200µl Bradfordlösung pipettiert und dann je 1µl Probe hinzugegeben. Mithilfe des Photometers wird bei 630 Wellenlänge gemessen. Die Ergebnisse können im Anschluss mit Hilfe einer Bradford Exel Tabelle berechnet werden. Der niedrigste Wert wird hierbei als Referenzwert genommen, um bei jeder Probe die gleiche Proteinmenge zu erhalten. Hierbei pipettiert man die entsprechende Menge der Probe ab und füllt mit Lysispuffer auf. Des Weiteren werden 20µl A/G Beads pro Probe in ein anderes Epi pipettiert, gut vermischt und nun werden 1000µl Lysispuffer dazugegeben. Es wird kurz bei max. 3000 rpm runterzentrifugiert und bis kurz vor den Beads abgesaugt. 1000µl Lysispuffer werden ein zweites Mal dazupipettiert und zentrifugiert. Nach dem Waschen wird so viel Überstand abgesaugt bis pro Probe 50µl Beatsuspension übrig bleibt. Jede Probe erhält 50µl der Beatsuspension. Die Proben werden dann für 30 min im Kühlraum auf der Rotating Maschine gelagert. Anschließend werden 40µl A/G Beads pro Probe in ein neues Epi pipettiert, gut vermischt und zweimal mit je 1ml Lysispuffer gewaschen. Es wird dann erneut bei 3000rpm zentrifugiert und der Überstand bis 50µl Beatsupension abgesaugt. Dann werden 1,5µl p85 AK pro Probe in die Beatsuspension dazugegeben und gevortext. Daraufhin werden pro Probe 50µl Beat/AK/Suspension in jedes Epi pipettiert und zwei Stunden auf der Rotating Maschine im Kühlraum gelagert. Während dieser Inkubationszeit werden 10ml des 3x Lipid-Kinase Puffers hergestellt. Von diesem wird 1 ml in ein extra Epi gegeben und auf Eis in den Kühlraum gestellt. Der Rest des 3x Lipid Kinase Puffer wird auf 1x Lipid-Kinase Puffer verdünnt. Zu den 9 ml des 3x Lipid-Kinase Puffers werden 18ml H20 gegeben und ebenfalls auf Eis in den Kühlraum gestellt. Nach zwei Stunden auf der Rotating Maschine werden die Proben eine Minute lang bei 3000 rpm abzentrifugiert und anschließend der Überstand abgesaugt. Danach werden die Proben dreimal mit circa 1000µl Lysispuffer gewaschen, über Kopf gemischt und eine Minute lang bei 3000rpm abzentrifugiert. 37 Anschließend erfolgt ein erneutes zweimaliges Waschen mit circa 1000µl 1x LipidKinase Puffer, erneutes Mischen über Kopf und Abzentrifugieren bei 3000rpm für eine Minute. Abschließend wird der Überstand bis auf 25µl abgesaugt. Das Alpha-Phosphatydiliositol wird aus dem Abzug genommen und mit der gleichen Menge Wasser, wie zu Beginn je nach Probenmenge berechnet, resuspendiert. Das Epi wird für zehn Minuten in das Wasserbad zum Sonikaten gestellt. Nun wird der Mastermix frisch hergestellt (pro Probe): 3x Lipid-Kinase –Puffer in Epi (1ml) 22,5µl Wasser 16,5µl Phosphatdiliositol 12,5µl Dieser Schritt findet im Istotopenlabor statt, da radioaktive Substanzen verwendet werden: 32 p – y-ATP <1µl Im Isotopenlabor wird das Wasserbad auf 30°C eingestellt. Die Strahlung am Arbeitsplatz wird kontrolliert. Zum Mastermix werden etwa 14µl 32 p-y-ATP gegeben und vermischt. Zu jeder Probe wird 50µl Mastermix pipettiert, gemischt und im Wasserbad bei 30°C für 30min im Shaker inkubiert. Währenddessen stellt man ein 10ml Methanol- und Chloroform-Gemisch her - in einer 1:1 Konzentration. Nach 30 Minuten werden die Proben runterzentrifugiert und die Reaktion wird mit 150µl 1M HCl je Probe gestoppt. Die Epis werden gevortext und kurz zentrifugiert und anschließend 450µl des Methanol- und Chloroform-Gemischs je Probe hinzupipettiert. Nach 30 Sekunden Vortexen werden die Proben für fünf Minuten bei 13000rpm zentrifugiert. Hierdurch findet eine Phasenbildung statt. Die obere Phase wird abpipettiert und das Epi wird über Nacht unter dem Abzug belassen – zum Evaporieren. 38 Am nächsten Tag wird die TLC-Platte markiert und der TLC-Puffer frisch hergestellt. Im Isotopenlabor wird je 50µl Chloroform zu jeder Probe gegeben, welche dann gevortext und kurz abzentrifugiert werden. Die Proben werden nun auf die TLC-Platte pipettiert. Anschließend füllt man das große Küvettengefäß mit TLC-Puffer und stellt die TLC-Platten hinein. Dies wird für 2,5 Stunden belassen. Daraufhin werden die Platten in eine Plastiktüte gegeben, in eine Kassette eingelegt und der Film aufgelegt. Abends oder am folgenden Morgen kann der Film entwickelt werden. 39 2.2.5. Ki-67 Färbung Das Antigen Ki-67 ist ein Protein, welches einen guten Marker darstellt für die Wachstumsfraktion einer Zellpopulation. Es markiert teilende menschliche Zellen. Es ist zur Zeit der Interphase im Inneren des Zellkerns zu finden und zur Zeit der Mitose auf der Oberfläche des Chromosoms. Daher ist diese immunhistochemische Darstellung eine wichtige Untersuchung in der Diagnostik. Die Chamber Slides werden mit je 500µl Kollagen über Nacht bei 4°C beschichtet. Collagen 3mg/ml wird in 0,5M Essigsäure angelöst: Collagen 50µl 1M NaOH 50µl PBS 9,9ml Die AOSMC in den Kulturflaschen müssen 80% konfluent sein. Dann werden sie mit Trypsin behandelt und gezählt. Es werden 40 000 Zellen pro well ausgesät und zwei Tage zum Wachstum belassen. Anschließend werden die Zellen mit Hilfe des Hungermediums für einen Tag gehungert. Nun findet die Vorstimulierung statt. Es werden zwei wells 120 Minuten lang mit 1µM und 10µM Telmisartan behandelt. 1. Co 2. PDGF 10ng/ml 3. PDGF 10ng/ml + Telmisartan 1µM 4. PDGF 10ng/ml + Telmisartan 10µM Dann wird PDGF hinzugegeben. Nach 24 Stunden kann die Färbung durchgeführt werden. Das Medium wird abgesaugt und die Chamber Slide 6min lang mit Methanol bei 4°C fixiert. Nun wird dreimal mit PBS gespült - mit jeweils 1ml pro well. Der erste Antikörper Ki-67 (human MIB-1 35mg/nl) wird in einer 1:8 Konzentration mit PBS verdünnt. Pro well werden 250µl hinzugefügt und eine Stunde bei 37°C belassen. Erneut wird dreimal mit PBS gespült. 40 Der zweite Antikörper Goat anti-mouse Cy3 wird mit PBS auf eine 1:500 Konzentration verdünnt. Pro Well werden 500µl hinzugefügt und für 30-45min bei 37°C belassen. Es wird dreimal mit PBS gespült und anschließend erfolgt die DAPI-Färbung zur DNA-Anfärbung. Die Stamm Dapi-Lösung 5µg/ml wird in einer 1:50 Konzentration in Methanol verdünnt. Pro well wird 1ml der Dapi-MethanolLösung hinzugegeben und für 10-15min bei 37°C stehen gelassen. Abschließend wird dreimal mit PBS gespült und mit DakoCytomation Fluorescent Mounting Medium eingedeckt. Nach mindestens 1h bei einer Temperatur von 4°C kann die Chamber Slide unter dem Fluoreszensmikroskop betrachtet und beurteilt werden. 2.2.6. Statistik Die Ergebnisse dieser experimentellen Studie wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (mean ± standard error of the mean SEM) dargestellt. Die Unterschiede wurden mittels ONE-WAY ANOVA und nachfolgendem Duncan´s post-hoc-test untersucht. Ein p-Wert < 0,05 wurde als signifikant betrachtet. 41 3. Ergebnisse 3.1. Telmisartan inhibiert konzentrationsabhängig die Expression von Cyclin D1 3.1.1. Vorversuche Um optimale Bedingungen für die Versuche zu schaffen, wurden folgende Vorversuche durchgeführt. 1. Vorversuch: Ermitteln der effektivsten Inkubationszeit von Telmisartan Mit Hilfe der Western Blot Methode wurde die Wirkung von 10µM Telmisartan auf die Cyclin D1 Expression der humanen glatten Gefäßmuskelzellen bei einer Inkubationszeit von 30, 60 und 120 Minuten untersucht. Um eine bessere Signalantwort zu erhalten, wurden die humanen glatten Gefäßmuskelzellen zusätzlich für 5 Minuten mit 10ng/ml PDGF inkubiert. Abb.1: Die Abbildung zeigt die Cyclin D1 Expression in humanen glatten Gefäßmuskelzellen nach einer Stimulierung mit 10ng/ml PDGF (Platelet Derived Growth Factor) für 5 Minuten und einer Vorinkubation mit 10µM Telmisartan für 30, 60 und 120 Minuten. Dies wird neben der Cyclin D1 Expression von unstiumulierten humanen glatten Gefäßmuskelzellen in der Kontrolle (Co) aufgeführt. n = 4 Aus der Abbildung wird ersichtlich, dass die Cyclin D1 Expression bei Inkubation mit 10µM Telmisartan für 120 Minuten am stärksten gehemmt wird. In den folgenden Versuchen wurde aus diesem Grund eine Vorstimulation von 120 Minuten für Telmisartan gewählt. 42 2.Vorversuch: Ermitteln der effektivsten Stimulationszeit von 10ng/ml PDGF Mit Hilfe der Western Blot Methode wurde die Wirkung von 10ng/ml PDGF auf die Cyclin D1 Expression der humanen glatten Gefäßmuskelzellen bei einer Stimulationszeit von 1 Minute, 3, 5, 10 und 15 Minuten untersucht. Abb.2: Die Abbildung zeigt die Cyclin D1 Expression in humanen glatten Gefäßmuskelzellen nach einer Stimulierung mit 10ng/ml PDGF (Platelet Derived Growth Factor) für 1 Minute, 3, 5, 10 und 15 Minuten. Dies wird im Vergleich zur Cyclin D1 Expression von unstiumulierten humanen glatten Gefäßmuskelzellen in der Kontrolle (Co) aufgeführt. n = 5 Aus der Abbildung wird ersichtlich, dass die höchste Cyclin D1 Expression durch Stimulierung mit 10ng/ml PDGF bei einer Stimulationszeit von 1 Minute erreicht wird. Die Stimulationszeit von 1 Minute für 10ng/ml PDGF wurde in den weiterführenden Versuchen übernommen. 43 3.1.2. Versuch Mit Hilfe der Western Blot Methode wurde untersucht, ob der Angiotensin-IIRezeptorantagonist Telmisartan eine hemmende Wirkung auf die Expression von Cyclin D1 in humanen glatten Gefäßmuskelzellen besitzt. Hierfür wurden die glatten Gefäßmuskelzellen zu Beginn für 120 Minuten mit 1µM, 5µM oder 10µM Telmisartan vorstimuliert. Um eine bessere Signalantwort zu erhalten, wurden die Zellen mit je 10ng/ml PDGF für eine Minute stimuliert. Anschließend wurde die Signalstärke und somit die Expression von Cyclin D1 ermittelt. Zur Ladungskontrolle wurde α-Aktin verwendet und in Relation zu der Signalstärke von Cyclin D1 gebracht. Cyclin D1 α-Aktin Co PDGF PDGF + PDGF + PDGF + Telmisartan Telmisartan Telmisartan 1 µM 5 µM 10 µM Abb.3: Die Abbildung zeigt die Cyclin D1 Expression in humanen glatten Gefäßmuskelzellen nach einer 1-minütigen Stimulierung mit 10ng/ml PDGF (Platelet Derived Growth Factor) und einer Vorstimulierung mit 1µM, 5µM und 10µM Telmisartan für 120 Minuten. Dies wird neben der Cyclin D1 Expression von unstiumulierten humanen glatten Gefäßmuskelzellen in der Kontrolle (Co) gezeigt. Zur Ladungskontrolle wurde α-Aktin verwendet und in Relation zu der Signalstärke von Cyclin D1 gebracht. Cyclin D1 / α-Aktin 44 Co PDGF PDGF + Telmisartan 1µM PDGF + Telmisartan 5 µM PDGF + Telmisartan 10 µM Abb.4: Die Abbildung zeigt die Cyclin D1 Expression in Relation zur Ladungskontrolle mit α-Aktin in humanen glatten Gefäßmuskelzellen in der unstimulierten Kontrolluntersuchung (Co), nach einer 1-minütigen Stimulierung mit 10ng/ml PDGF (Platelet Derived Growth Factor) und einer Vorstimulierung mit 1µM, 5µM und 10µM Telmisartan für 120 Minuten. Der Abbildung kann entnommen werden, dass Telmisartan konzentrationsabhängig die Expression von Cyclin D1 in humanen glatten Gefäßmuskelzellen hemmt. (p < 0,01, bezogen auf PDGF stimulierte Zellen, n=4) Das Diagramm zeigt eine konzentrationsabhängige Hemmung der Cyclin D1 Expression in humanen glatten Gefäßmuskelzellen durch Telmisartan. Es zeigt sich eine Hemmung der Cyclin D1 Expression durch Steigerung der Konzentration von 1µM bis hin zu 10µM Telmisartan. Eine Konzentration mit 10µM Telmisartan führt zu einer signifikanten Reduktion der Cyclin D1 Expression. 45 3.2. Inhibition der PDGF induzierten Aktivierung der PI-3-Kinase Anhand des PI-3-Kinase Assay wurde untersucht, ob der Angiotensin-IIRezeptorantagonist Telmisartan eine hemmende Wirkung auf die Aktivität der Phosphoinositid-3-Kinase in humanen glatten Gefäßmuskelzellen besitzt. Hierfür wurden die glatten Gefäßmuskelzellen zuerst für 120 Minuten mit 1µM oder 10µM Telmisartan vorstimuliert. Zur Optimierung der Signalantwort wurde daraufhin mit je 10ng/ml PDGF für fünf Minuten stimuliert. Anschließend wurde die Signalstärke und somit die Aktivität der PI-3-Kinase ermittelt. PIP Co PDGF PDGF + Telmisartan 1µM PDGF + Telmisartan 10µM Abb.5: Die Abbildung zeigt die Phosphoinositid-3-Kinase Aktivität (PIP) in humanen glatten Gefäßmuskelzellen in einer unstimulierten Kontrolluntersuchung (Co), nach einer 5-minütigen Stimulierung mit 10ng/ml PDGF (Platelet Derived Growth Factor) und einer Vorstimulierung mit 1µM und 10µM Telmisartan für 120 Minuten. PI-3-Kinase Aktivität 46 Co PDGF PDGF + Telmisartan 1µM PDGF + Telmisartan 10µM Abb.6: Die Abbildung zeigt die PI-3-Kinase Aktivität in humanen glatten Gefäßmuskelzellen in einer unstimulierten Kontrolluntersuchung (Co), nach einer 5-minütigen Stimulierung mit 10ng/ml PDGF (Platelet Derived Growth Factor) und einer Vorstimulierung mit 1µM und 10µM Telmisartan für 120 Minuten. Telmisartan inhibiert die PI-3-Kinase Aktivität, sowohl bei einer Konzentration von 1µM, wie auch bei einer Konzentration von 10µM, n = 8; * p < 0,01 Der Abbildung kann entnommen werden, dass Telmisartan mit einer Konzentration von 1µM und 10µM die Aktivität der Phosphoinositid-3-Kinase in humanen glatten Gefäßmuskelzellen hemmt. Die stärkste Inhibiton zeigt sich im Mittel bei einer Konzetration von 1µM. Ein signifikantes Ergebnis konnte nur für 1µM gezeigt werden. 47 3.3. Verminderte Expression von Ki-67 in humanen glatten Gefäßmuskelzellen durch Stimulation mit Telmisartan Das Antigen Ki-67 ist ein Protein, welches als guter Marker für die Wachstumsfraktion von Zellpopulationen fungiert. Mit Hilfe der Ki-67 Färbung wurde der Einfluss von Telmisartan auf das Wachstum der humanen glatten Gefäßmuskelzellen untersucht. Hierbei wurden die Zellen mit 1µM oder 10µM Telmisartan vorstimuliert und anschließend mit 10ng/ml PDGF für 24 Stunden stimuliert. Ki-67 DAPI Co PDGF PDGF + Telmisartan 1µM PDGF + Telmisartan 10µM Abb.7: Die Abbildung zeigt die Ki-67 (Kiel-67) Expression in humanen glatten Gefäßmuskelzellen in einer unstimulierten Kontrolluntersuchung (Co), nach einer Vorstimulierung mit 1µM und 10µM Telmisartan für 120 Minuten und einer 24-stündigen Inkubation mit 10ng/ml PDGF (Platelet Derived Growth Factor). Die Expression von Ki-67 zeigt Zellen, die gerade proliferieren. Die DAPI-Färbung (4´,6-Diamino-2-phenylindole-Färbung) dient zur DNA-Anfärbung (Desoxyribonukleinsäure) und somit zum Nachweis von Zellen. Die DAPI-Bilder weisen durch DNA-Anfärbung Zellen nach - in diesem Fall humane glatte Gefäßmuskelzellen. Die Ki-67-Bilder zeigen die Proliferationsrate dieser humanen glatten Gefäßmuskelzellen an. Aus der Abbildung wird ersichtlich, dass Telmisartan mit einer steigenden Konzentration von 1µM bis 10µM die Wachstumsfraktion der humanen glatten Gefäßmuskelzellen verstärkt hemmt. Die Hemmung ist folglich konzentrationsabhängig. 48 Co PDGF PDGF + Telmisartan 1µM PDGF + Telmisartan 10µM Abb.8: Die Abbildung zeigt die Ki-67 (Kiel-67) positive Zellaktivität in humanen glatten Gefäßmuskelzellen in einer unstimulierten Kontrolluntersuchung, nach einer Vorstimulierung mit 1µM und 10µM Telmisartan für 120 Minuten und anschließender 24-stündiger Inkubation mit 10ng/ml PDGF (Platelet Derived Growth Factor). n = 6 ; * p < 0,05 Der Abbildung kann entnommen werden, dass eine 10µM TelmisartanKonzentration die Wachstumsfraktion der humanen glatten Gefäßmuskelzellen stärker hemmt als eine Telmisartan-Konzentration von 1µM. Eine Konzentration von 10µM Telmisartan führt zu einer signifikanten Inhibition der PDGF-induzierten Ki-67 Expression in glatten Gefäßmuskelzellen. 49 3.4. Zusammenfassung aller Ergebnisse a. Vorversuche Die effektivste Vorstimulation mit Telmisartan beträgt 120 Minuten. Die effektivste Stimulationszeit mit 10ng/ml PDGF beträgt 1 Minute. b. Western Blot Telmisartan inhibiert konzentrationsabhängig die Expression von Cyclin D1 in humanen glatten Gefäßmuskelzellen. Eine Konzentration mit 10µM Telmisartan führt zu einer signifikanten Reduktion der Cyclin D1 Expression. c. PI-3-Kinase Telmisartan hemmt mit einer Konzentration von 1µM und 10µM die Aktivität der Phosphoinositid-3-Kinase in humanen glatten Gefäßmuskelzellen. Ein signifikantes Ergebnis konnte nur für 1µM gezeigt werden. d. Ki-67 Färbung Telmisartan hemmt konzentrationsabhängig die PDGF-induzierte Expression von Ki-67 in humanen glatten Gefäßmuskelzellen. Eine Konzentration von 10µM Telmisartan führt zu einer signifikanten Inhibition der Ki-67 Expression. 50 4.Diskussion Die vorliegende Arbeit analysiert die Wirkung des Angiotensin-II- Rezeptorantagonisten Telmisartan auf humane glatte Gefäßmuskelzellen. Die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen ist an der Atherosklerose und ihrer Folgeerscheinungen, wie etwa der Myokardinfarkt oder ischämische Insult, beteiligt. Des Weiteren spielt die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen eine Rolle in der Entstehung von Restenosen. Eine erhöhte Gefahr einer Restenose besteht unter Anderem nach einer Stentimplantation, die als therapeutische Maßnahme eines atherosklerosebedingten Myokardinfarktes vorgenommen wird. Zur Untersuchung der Einflüsse von Telmisartan auf die Proliferationseigenschaften von humanen glatten Gefäßmuskelzellen wurden verschiedene Verfahren und Marker verwendet, wie Cyclin D1, PI-3-Kinase und der Ki-67 Marker, welche in der Zellproliferation und Wachstumsfraktion und demzufolge im Zellzyklus der humanen glatten Gefäßmuskelzellen eine wichtige Rolle spielen. Diese Daten legen nahe, dass Telmisartan die Proliferation der humanen glatten Gefäßmuskelzellen hemmt und damit die Progression der Atherosklerose und deren Folgeerkrankungen beeinflusst. 4.1. Zusammenhang Telmisartan und Atherosklerose 4.1.1. Allgemein In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Telmisartan eine hemmende Wirkung auf die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen hat, was einen wichtigen Prozess in der Atherogenese darstellt. Das Renin-Angiotensin-System, welches durch Telmisartan beeinflusst wird, spielt eine große Rolle in der Pathogenese von Atherosklerose. Klinische Studien haben gezeigt, dass die pharmakologische Blockade des RAS durch Angiotensin-II-Rezeptorantagonisten vom Typ 1 in der Behandlung von Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen wirksam ist und die Anzahl an kardiovaskulären Erkrankungen vermindern kann.[12, 31] 51 Ebenso konnte eine Inhibierung der Atheroskleroseprogression festgestellt werden. Telmisartan konnte in Mäusen die Makrophagenakkumulation und Lipidablagerungen vermindern und den Kollagenanteil in den Plaques erhöhen, was zur Stabilisierung der Plaques führen konnte.[31] Telmisartan hat die Makrophagenanzahl und die Makrophageninfiltration verringert.[12, 113] Die Frequenz von Blutungen innerhalb der Plaques und die Größe der nekrotischen Kerne können durch Telmisartan verringert werden, was folglich die Plaquestabilität zusätzlich unterstützen kann.[12] Zudem konnte in zahlreichen Studien gezeigt werden, dass Telmisartan die aortale Plaqueanzahl sowie –größe reduzieren kann.[40, 74, 113] Telmisartan-behandelte Körpergewicht und ApoE-/-AT1R-/-Mäuse einen höheren haben HDL-Spiegel. ein Dies niedrigeres verringert das kardiovaskuläre Risiko. Telmisartan kann wie Hydralazin oder Losartan den systolischen und diastolischen Blutdruck senken.[31, 41, 74] Telmisartan hat neben ihrer AT1-Blockade eine protektive Wirkung auf die Entwicklung der Atherosklerose sowie eine positive Beeinflussung auf metabolische Störungen.[31] In der Studie von Schlimmer wurde festgestellt, dass Telmisartan und Ramipril in ihrer Effektivität Beschädigungen der Endothelfunktion der Aorta und die Anzahl atheromatöser Plaques reduzieren zu können, gleich sind. Diese vorteilhaften Effekte sind größtenteils blutdruckabhängig und werden assoziiert mit der Reduktion von vaskulärem oxidativen Stress sowie der Expression der eNOS (endotheliale Nitric Oxide Synthase).[89] Die 1-jährige Verwendung von Telmisartan verbessert die linksventrikuläre Hypertrophie, regionale linksventrikuläre Myokardkontraktion und –relaxation sowie karotide Atherosklerose bei Patienten mit Hypertonie. Die Ergebnisse von Mizuguchi zeigen kardio- und arterioprotektive Wirkungen durch eine kontinuierliche langandauernde Monotherapie mit Telmisartan.[72] Die Kombinationstherapien von Amlodipin mit Amilorid/HCT und Amlodipin mit Telmisartan bewirken eine ähnliche und statistisch signifikante Blutdruckreduktion, allerdings hat Amlodipin mit Telmisartan einen besseren Effekt auf die Regression der abnormen Funktion und Struktur großer Arterien, welcher die Progression der Atherosklerose hinauszögern könnte.[94] 52 Die pharmakologische Behandlung mit Telmisartan und Reseratrol senkt die TNFα-induzierte Rekrutierung der Monozyten und Endothelexpression von Adhäsionsmolekülen in Regionen von ungleicher Scherspannung in vitro.[34] Telmisartan verlangsamt die Erkrankungsprogression und verzögert oder beugt tödlichen Ereignissen bei Patienten mit Atherosklerose vor.[24] Telmisartan zeigt einen höheren vaskulär protektiven Effekt als Losartan. Die Progression der Intima- und Mediadicke der A.carotis communis wurde durch Telmisartan signifikant gehemmt.[41] Diese Forschungsergebnisse haben die Frage aufkommen lassen, ob Telmisartan dabei speziell eine Hemmung der Proliferation humaner glatter Gefäßmuskelzellen bewirkt. 4.1.2. Antiinflammatorische Eigenschaften von Telmisartan In neuen Studien wurde ein Zusammenhang zwischen Telmisartan und antiinflammatorischen Eigenschaften hergestellt. Hyaluronan, ein hoch-molekulargewichtiges Polysaccharid und die kleinen leucinreichen Proteoglykane, Decorin und Biglykan, sind in der Atheroprogression involviert. Mechanistisch fördern diese Matrixkomponenten den inflammatorischen Prozess durch Toll-like-RezeptorSignale und scheinen die Lipidretention zu modulieren.[40] Telmisartan kann die Expression von hyaluronan-katabolisierenden Enzymen senken, was potenziell zu einem Anstieg an Hyaluronan in adipozytenhaltigen Gewebe führt. Dieses sei homöostatisch und antiinflammatorisch. Die Resultate bestärken bisherige Erkenntnisse zur antiinflammatorischen Fähigkeit von Telmisartan auf Atherosklerose, sowie auf die Gewebsinflammation von Adipozyten. Dies hebt Telmisartan von anderen Angiotensin-II-Rezeptor- Antagonisten wie Valsartan ab.[40] Telmisartan vermindert die Biglykan-Akkumulation und hemmt somit Atherosklerose unabhängig von der Blutdrucksenkung. Hierdurch wird nicht nur die Matrixzusammensetzung der atherosklerotischen Läsionen, sondern auch die Struktur des Fettgewebes positiv beeinflusst.[40, 74] Telmisartan kann verwendet werden, um die Progression von Atherosklerose aufzuhalten und Plaquestabilität zu vermitteln. Dieses wird sich vermutlich gegenüber Ramipril durchsetzen. Telmisartan bewirkt eine reduzierte Aktivität des proinflammatorischen Faktors NFκB und Egr-1 sowie eine Aktivierung des PPAR-.[12] 53 4.1.3. Sonderfunktion PPAR- Zusätzlich zur Senkung des Blutdrucks haben einige der Angiotensin-IIRezeptorantagonisten vom Typ 1 wie zum Beispiel Telmisartan weitere nützliche Effekte auf Patienten mit Diabetes Typ 2 und Adipositas. Dies wurde hauptsächlich der PPAR--Aktivität zugeschrieben.[40] Neue Studien haben berichtet, dass Telmisartan eine teilweise agonistische Wirkung auf den PPAR- hat. PPAR- spielt in der Regulation des metabolischen Ungleichgewichts sowie in der Atherosklerose eine Rolle.[31] Hypertonie ist ein kardiovaskulärer Risikofaktor, welcher mit Insulinresistenz das metabolische Syndrom fördert. Die Therapie mit Telmisartan verbessert das kardiometabolische Profil bei Patienten mit metabolischem Syndrom. Telmisartan agiert als agonistischer Ligand am Peroxisome-Proliferator-aktivierten Rezeptor PPAR-. PPARs sind intrazelluläre Rezeptoren, welche als Transkriptionsfaktoren die Expression von Genen regulieren können. Telmisartan aktiviert und verstärkt die PPAR--Expression in peripheren und zirkulierenden Monozyten, verbessert signifikant die PPAR- Rezeptoraktivität und erhöht die Plasmaadiponektinkonzentration in Adipozyten. Dadurch können sie die Insulin-Sensitivität erhöhen und Mikroinflammation unterdrücken. Des Weiteren besitzt Telmisartan eine günstige Wirkung auf den Glukosestoffwechsel. Außerdem weist Telmisartan vasoprotektive Effekte auf. Der PPAR- spielt eine bedeutende Rolle in der Monozytenaktivierung, sowie im Rahmen der vaskulären Inflammation und Atherogenese. Die Aktivierung des Rezeptors hat zudem antiinflammatorische Effekte und senkt das Forschung über Atheroskleroserisiko.[7, 10, 32, 56, 60, 68, 103, 108] Diese neuen Erkenntnisse sind Grundlage aktueller antiinflammatorische Eigenschaften von Telmisartan und seine Wirkung auf den PPAR- -Rezeptor. 54 4.2. Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen 4.2.1. Allgemein Frühere Studien haben bereits gezeigt, dass eine gesteigerte und unkontrollierte Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen an der Entstehung von Atherosklerose beteiligt sind. Ein Ungleichgewicht zwischen Proliferation und Apoptose von glatten Gefäßmuskelzellen soll eine entscheidende Rolle in der Pathogenese und Progression der Atherosklerose spielen. Einige Forscher haben aufgezeigt, dass eine Hemmung der Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen dazu beiträgt, Atherosklerose zu vermeiden.[47] Die Differenzierung von glatten Gefäßmuskelzellen ist ein essentieller Prozess der Gefäßentwicklung. Glatte Gefäßmuskelzellen haben biosynthetische, proliferative und kontraktile Aufgaben in der Gefäßwand. Modifikationen in verschiedenen Zuständen der glatten Gefäßmuskelzellen spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Atherosklerose und intimalen Hyperplasie, ebenso in einer Reihe von zahlreichen Erkrankungen, wie etwa Hypertonie, Asthma und Gefäßaneurysmen.[21] Arterielle Hypertonie beruht zu einem Großteil auf dem Verlust von Gefäßelastizität. Die Elastizität eines Gefäßes wird durch den Anteil an extrazellulärer Matrix und an Endothelzellen beeinflusst. Einen weiteren Einfluss haben glatte Gefäßmuskelzellen, welche neue Ansatzpunkte in der Therapie von Hypertonie und Atherosklerose bieten.[92] In der Kontrolle der Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen spielen molekulare Mechanismen, wie beispielsweise der Glukosemetabolismus, eine Rolle. In glatten Gefäßmuskelzellen wurde nach Endothelverletzungen ein erhöhter Spiegel an Glukosetransporter 1 (GLUT1) beobachtet. Dies lässt eine Verbindung zwischen Glukoseaufnahme und Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen vermuten. Im Rahmen der Atherosklerose liegt eine mitochondriale Funktionsstörung als ein gemeinsames Merkmal in glatten Gefäßmuskeln vor. Die mitochondriale Funktion kann durch eine Dysregulation von Mitofusin-2, einer kleinen GTPase, modifiziert werden. 55 Außerdem wurde eine verstärkte Proliferation in glatten Gefäßmuskelzellen von Lungenarterien mit hyperpolarisierten Mitochondrien sowie ein erhöhtes Glykolyse-/ Glukose-Oxydationsverhältnis beobachtet. Mehrere Studien weisen auf die Relevanz des Glukosemetabolismus in der Kontrolle der Proliferation von glatten Muskelzellen hin und bieten somit einen neuen Ansatzpunkt zur Erforschung der Kontrollmöglichkeit bezüglich der Gefäßpathogenese. [21] Glatte Gefäßmuskelzellen spielen eine Schlüsselrolle in der Atherogenese. Als Reaktion auf mehrfache arterielle Wandverletzungen im Rahmen der Hypertonie kommt es zu exzessiver intimaler Proliferation und Migration der glatten Gefäßmuskelzellen. Dieser Vorgang wird durch verschiedene Signaltransduktionswege beeinflusst. So spielt die Transduktion von mitogenen Signalen eine entscheidende Rolle. [46] Diese Transduktion wird zum Beispiel durch Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsreaktionen von Enzymen vermittelt, welche zur Familie der mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPKs), der PI-3-Kinase und Proteinkinase B (Akt) gehören. [46] In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass Telmisartan die Aktivität der PI-3-Kinase signifikant hemmt. Phosphoinositid-3-Kinasen sind Enzyme, deren Aktivitäten in allen eukaryotischen Zelltypen gefunden wurden. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion und sind an einer Vielzahl von zellulären Schlüsselfunktionen, wie Zellwachstum, Zellproliferation, Migration, Differenzierung, Überleben und Zelladhäsion beteiligt. Veränderungen der Aktivität und Regulation der PI-3-Kinase können mit Erkrankungen des Menschen, wie Allergien, Entzündungsprozesse, Herzerkrankungen und Krebs in Zusammenhang gebracht werden. Inhibitoren dieser Enzyme sind Gegenstand von Forschungen mit dem Ziel potentielle therapeutische Medikamente zu entwickeln.[29, 30, 50, 80, 99] Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Aktivität der Phosphoinositid-3Kinase in humanen glatten Gefäßmuskelzellen durch die Telmisartan- Konzentration von 1µM und 10µM gehemmt wurde. Die stärkste Inhibiton zeigt sich im Mittel bei einer Konzetration von 1µM. Ein signifikantes Ergebnis konnte nur für 1µM gezeigt werden. 56 Aufgrund einer niedrigen Versuchsanzahl konnte keine Signifikanz für die Untersuchung mit anderen Telmisartan-Konzentrationen festgestellt werden. Jedoch ließ sich auch hier eine Tendenz zur Senkung der PI-3-Kinase-Aktivität zeigen. Aus diesen Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass Telmsiartan Einfluss auf den Zellzyklus der glatten Gefäßmuskelzellen hat und damit auf die Enstehung der Atherosklerose. Hierdurch kann Telmisartan in Hinsicht auf verschiedene atherosklerose-assoziierte Erkrankungen als therapeutisches Medikament in Betracht gezogen werden. Diesbezüglich sind in der Zukunft noch weitere Forschungen erforderlich. Neben der PI-3-Kinase konnten des Weiteren extrazelluläre signalgeregelte Proteinkinasen (ERKs), die 42 und 44 kDa Isoformen (ERK1/2), Akt und cytosolic phospholipase 2 (cPLA2) mit der mitogenen Zellmaschinerie in Verbindung gebracht werden. Diese werden beispielsweise durch Insulin oder Thrombin beeinflusst, welche Gefäßmuskelzellen wichtige sind. Mediatoren Insulin kann der Hypertrophie von glatten die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen bedeutsam verstärken, jedoch ist die exakte intrazelluläre Signalkaskade noch unbekannt. [46] Auch weitere Signaltransduktionswege, die die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen regulieren, bleiben noch unverstanden. Eine weitere wichtige Proteingruppe in Rahmen des Zellzyklus bilden die Cycline. Diese aktivieren Cyclin-abhängige Kinasen und führen somit zur Phosphorylierung von einer Reihe an zellulären Substraten. Cycline spielen eine entscheidende Rolle in der Steuerung und Progression des Zellzyklus, der Tumorgenese, der Induktion von Zellmigration und –invasion, sowie in einigen anderen Prozessen.[79] Cyclin D ist in schwankender Konzentration während des gesamten Zellzyklus vorhanden. Cyclin D1 ist dabei ein Marker für wachstumskompetente Zellen. So wurde bei mitotischen Zellen eine 12-fache Hochregulierung der Expression von Cyclin D1 festgestellt.[19] In Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expression von Cyclin D1 in humanen glatten Gefäßmuskelzellen konzentrationsabhängig durch Telmisartan gehemmt werden kann. 57 Durch die Steigerung der Konzentration von Telmisartan von 1µM, 5µM bis hin zu 10µM konnte die Cyclin D1 Expression vermehrt gesenkt werden. Eine Konzentration von 10µM Telmisartan führte dabei zu einer signifikanten Reduktion der Cyclin D1 Expression (p < 0,01). Daraus wird ersichtlich, dass Telmisartan mitotische Zellen und damit den Zellumsatz der humanen glatten Gefäßmuskelzellen hemmt. Diese Prolifertationshemmung hat wiederum Einfluss auf die Pathogenese der Atherosklerose und ihrer Folgeerscheinungen. Die Proliferationsrate der humanen glatten Gefäßmuskelzellen kann noch von weiteren Faktoren beeinflusst werden. Hyperglykämie, fortgeschrittene Glykierungsendprodukte, Hyperinsulinämie und Dyslipidämie können in der Entwicklung von Diabetes-assoziierter Atherosklerose und postangioplastischen Restenosen eine Rolle spielen. Ihre Effekte scheinen klinisch synergistisch zu sein. Insulin erhöht die glykierte Serumalbumin-induzierte Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen, welche durch einen reaktiven Oxygenart (ROS)-p38 MAPK Pfad vermittelt werden kann. Der Synergismus von Glykierungsendprodukten und Insulin kann eine schädliche Rolle in der Pathogenese von diabetischer Atherosklerose und postangioplastischen Restenosen spielen.[42] Ein weiterer Faktor der Entwicklung und Progression von Atherosklerose ist die Aggregation von Thrombozyten. Diese kann durch Verletzung von Endothelzellen initiiert werden. Durch Freisetzung von PDGF stimulieren aggregierte Thrombozyten die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen. Wie bereits erläutert, haben diese entscheidenden Einfluss auf die Pathogenese der Atherosklerose. Neben ihrer Funktion als Haupterzeuger der extrazellulären Matrix innerhalb der Gefäßwand, erzeugen glatte Gefäßmuskelzellen viele Zytokine wie PDGF, Wachstumsfaktor-β, etc.. Diese verstärken etwa die inflammatorische Reaktion.[47] Das Maß an Wachstum der glatten Gefäßmuskelzellen gibt Hinweise darauf, inwieweit es zu einem Fortschreiten der Atherosklerosebildung kommt. Um diese Proliferation darstellen zu können, bietet sich unter Anderem der monoklonale Antikörper Ki-67 an. Dieser interagiert mit dem humanen nukleären Protein und Antigen Ki-67 in proliferierenden Zellen. Er markiert dadurch sich teilende Zellen. 58 Der Antikörper kann verwendet werden, um die Wachstumsfraktion einer Zellpopulation zum Beispiel in humanen Tumoren in situ zu bestimmen und ist daher von prognostischer Wichtigkeit. In Zellen, welche sich in der Interphase befinden, reagiert der Antikörper Ki-67 mit dem Proliferationsmarker Ki-67 Antigen, welcher zumeist in den Nukleoli vorhanden ist.[90, 107] Mit Hilfe der Ki-67 Färbung lässt sich somit die Proliferationsrate der humanen glatten Gefäßmuskelzellen demonstrieren. Die Ergebnisse zeigen, dass Telmisartan die PDGF-induzierte Expression von Ki-67 in humanen glatten Gefäßmuskelzellen konzentrationsabhängig hemmt. Eine Konzentration von 10µM Telmisartan führt zu einer signifikanten Inhibition der Ki-67 Expression. Eine Art Kontrollfunktion übernahm die DAPI-Färbung, welche zur DNA-Anfärbung dient. So konnten alle proliferierenden und nicht-proliferierenden Zellen dargestellt werden und in Bezug zur Ki-67 Färbung gesetzt werden. Somit konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Telmisartan die Proliferationsrate der humanen glatten Gefäßmuskelzellen inhibiert. Dies lässt schlussfolgern, dass Telmisartan das Fortschreiten der arteriellen Plaquebildung positiv beeinflusst und somit Auswirkungen auf die Entstehung der Atherosklerose und seine Folgeerkrankungen hat. 4.2.2 Mögliche Hemmstoffe der Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen Neben der in dieser Arbeit untersuchten inhibitorischen Wirkung von Telmisartan auf die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen, gibt es weitere mögliche Hemmstoffe. Diese waren Gegenstand bisheriger Forschungen. Im Folgenden wird ein Überblick über diese gegeben. So wurde etwa Luteolin untersucht. Dabei handelt es sich um eine Art Flavonoid, welches in vielen Pflanzen vorkommt und vorteilhafte Effekte auf kardiovaskuläre Erkrankungen hat. Auch hier konnte gezeigt werden, dass Luteolin die Proliferation und Migration von glatten Gefäßmuskelzellen reduzieren kann.[47] Des Weiteren kann die Hemmung der Arginase die Interleukin-1-β-stimulierte Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen unterdrücken. Der Arginaseinhibitor BEC (S-(2-boronoethyl)-l-cysteine) und die Transfektion Oligonukleotid gegen Arginase I sind Beispiele hierfür. des antisense 59 Die Hemmung der Arginase verstärkt die iNOS-abhängige NO Produktion. Diese unterdrückt über einen cGMP-abhängigen Weg die Il-1-β-induzierte Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen.[112] Die veränderte Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen in arteriellen Wänden ist ein wichtiger pathogener Faktor von Gefäßveränderungen wie diabetischer Atherosklerose. Es wurde eine antiinflammatorische Wirkung eines wässrigen Extraktes von Prunella vulgaris in Gefäßendothelzellen festgestellt. Dieses zeigt hemmende Effekte auf hohe Glukose-stimulierende Proliferation, Migration und Invasion von glatten Gefäßmuskelzellen, welche einen Stopp des G1 Zellzyklus induzieren und eine Runterregulierung von Cyclinen und CDKs und Hochregulierung von CKIs, p21 (waf1/cip1) und p27 (kip1) veranlassen können. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass das wässrige Extrakt der Prunella vulgaris durch die Runterregulierung von ROS/NF-κ B/ERK/p38 MAPK Pfade die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen inhibieren kann. Zudem soll es einen positiven Effekt auf diabetische Atherosklerose haben.[44] Die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen trägt bedeutsam zur intimalen Verdickung in Bezug auf Atherosklerose, Restenose und venöser Bypasserkrankung bei. Angiotensin II wird in der Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen durch die Aktivierung von verschiedenen wachstumsfördernden Signalen mit einbezogen. Obwohl Thiazolidindione die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen hemmen und Angiotensin-II-induzierte Fibrose reduzieren können, bedarf der genaue Mechanismus weiterer Forschung. Rosiglitazon kann die proatherosklerotische Wirkung von Angiotensin II in aortalen glatten Gefäßmuskelzellen von Ratten direkt hemmen. Es schwächt ebenfalls die Angiotensin-II-induzierte EZM-Molekül- und CTGF-Produktion und kann so Fibrose reduzieren. Die PPAR-Aktivierung vermittelt diesen Effekt teilweise durch die mTOR-p70S6K und -4EBP1 Systeme.[53] Eine veränderte Proliferation und Migration von glatten Gefäßmuskelzellen sind wichtige pathogene Mechanismen bei der Atherosklerose und Restenose nach Gefäßverletzungen. In einer Studie von Kim wurde der Effekt von Beta-lapachone (betaL), einer potenten antitumorösen Substanz, welche NAD(P)H stimuliert, untersucht. 60 Die Resultate zeigen, dass betaL die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen über die NQ01 und LKB1-abhängigen Aktivierung von AMPK hemmen kann. Dies lässt annehmen, dass die pharmakologische Stimulation der NQ01 Aktivität einen neuen Therapiesatz zur Behandlung von vaskulären Restenosen und Atherosklerose liefert.[54] Die PTCA ist ein allgemeines Verfahren um Atherosklerose zu behandeln, aber seine Effizienz ist durch das Auftreten von Restenosen innerhalb von 3-6 Monaten nach der Angioplastie limitiert. Restenosen werden durch Remodelling von Gefäßwänden und Akkumulation von Zellen und extrazellulärer Matrix in der Intima induziert. Deshalb kann das Matrix-Metalloproteinase-System ein potenzielles therapeutisches Ziel für die Behandlung von Restenosen und Atherosklerose sein. Cordycepin besitzt wichtige pharmakologische Eigenschaften, wie die Fähigkeit zur immunologischen Stimulierung sowie antitumoröse, antioxidative und antiinflammatorische Fähigkeiten. Eine Studie von Chang et al lässt vermuten, dass Cordycepin die Antiproliferation von glatten Gefäßmuskelzellen in Ratten über die Steuerung des Gefäßwandremodellings induziert. Deshalb kann Cordycepin als weiterer möglicher Ansatz zur Therapie von Restenosen diskutiert werdenn.[20] Unbeschichtete Stents beugen abrupten Arterienverschlüssen erfolgreich vor und reduzieren die Restenoserate im Vergleich zur Ballonangioplastie. Die Effektivität von unbeschichteten Stents wird durch die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen und der dadurch entstehenden neointimalen Hyperplasie, welche für die Restenose nach Stentimplantation verantwortlich gemacht wird, ernsthaft eingeschränkt. Die Entwicklung medikamenten-beschichteter Stents 2002 hat die Kardiologie revolutioniert. Die Medikamentenbeschichtung der Stents nimmt Einfluss auf die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen und kann so zu einer Verminderung der Restenoseanzahl führen. Eine Stentthrombose kann auf diese Weise hinausgezögert Endothelregeneration Gefäßmuskelzellen sowie Wert werden. Es die Reduktion gelegt, um wird der eine insbesondere Proliferation stabile und von auf die glatten erfolgreiche Revaskularisation nach Verwendung medikamenten-beschichteter Stents zu ermöglichen.[25] 61 4.3. Fazit Die Daten in dieser Arbeit zeigen, dass Telmisartan die Proliferation der humanen glatten Gefäßmuskelzellen hemmen kann. Dies konnte in mehreren Versuchsansätzen nachgewiesen werden. Folglich ist eine positive Beeinflussung der Atherosklerose möglich. Dies würde demnach das Restenoserisiko eines gestenteten Blutgefäßes positiv beeinflussen. Diese Erkenntnisse bieten die Grundlage für weitere Forschungen. Um dieses Wissen in therapeutischen Maßnahmen anwenden und umsetzen zu können, sind weitere Versuche zum Mechanismus der Hemmung von Telmisartan auf glatte Gefäßmuskelzellen und damit auf die Atherosklerose und Restenosebildung notwendig. Des Weiteren stellt sich die Frage, ob Telmisartan im Rahmen der Stentimplantation als orale Medikation verabreicht werden kann oder sogar als Beschichtung eines Stents in Frage kommt. Die Anzahl der Patienten mit metabolischen Syndrom und Atherosklerose nimmt in unserer Gesellschaft stark zu. Da kardiovaskuläre Erkrankungen weltweit eine der Haupttodesursachen darstellen, ist eine Erforschung zur Entwicklung von möglichen Sekundär- sowie Tertiärpräventionen unerlässlich. Telmisartan bietet im Hinblick auf seine bisher nachgewiesenen protektiven Eigenschaften einen relevanten und sicherlich Atherosklerose-assoziierten Eigenschaften und vielversprechenden Erkrankungen. Wirkungen von Eine Ansatz zur Behandlung Erforschung Telmisartan, sowie weiterer genauerer Wirkmechanismen, insbesondere über den PPAR--Rezeptor, ist somit äußerst wichtig. Auch eine genauere Untersuchung der antiinflammatorischen Eigenschaft von Telmisartan kann wichtige Informationen liefern, um neue Therapieansätze für verschiedene Erkrankungen, wie zum Beispiel der Atherosklerose, zu entwerfen. 62 5. Zusammenfassung Die Bedeutung der Atherosklerose und der damit assoziierten Erkrankungen nimmt in unserer Gesellschaft stetig zu. Atherosklerose ist eine entzündliche Erkrankung, welche in jedem Lebensalter auftreten kann. Sie wird beschrieben als eine Verhärtung beziehungsweise Verkalkung arterieller Gefäße mit verminderter Elastizität und ist gekennzeichnet durch Lipideinlagerungen und Bildung fibröser Plaques in der Intima mit Übergriff auf die Media. Es können Komplikationen wie hochgradige Verkalkungen der Koronararterien, fokale Rupturen, Thrombosen, Embolien, Hämorrhagien, Organatrophien, Aneurysmen und Dissektionen auftreten. Hierdurch weist die Atherosklerose eine hohe Morbidität und Mortalität auf. Die Proliferation von humanen glatten Gefäßmuskelzellen spielt eine bedeutende Rolle in der Entstehung und Progression der Atherosklerose. Um die Entstehung und Progression der Atherosklerose und deren Folgen beeinflussen zu können, werden Substanzen gesucht, welche die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen hemmen können. In dieser Arbeit wurde die Wirkung des Angiotensin-II-Rezeptorantagonisten Telmisartan, ein bekanntes Antihypertensivum, auf humane glatte Gefäßmuskelzellen untersucht. Das Protein Cyclin D1 spielt eine entscheidende Rolle in der Steuerung und Progression des Zellzyklus und kann daher als Proliferationsmarker genutzt werden. Unter Verwendung von Western Blot Analysen, konnte eine konzentrationsabhängige Hemmung der Platelet Derived Growth Factor (PDGF) -induzierten Expression von Cyclin D1 in humanen glatten Gefäßmuskelzellen durch Telmisartan gezeigt werden. Eine Konzentration von 10µM Telmisartan führte zu einer signifikanten Reduktion der Cyclin D1 Expression. Ein weiteres Schlüsselmolekül bei der Proliferation glatter humaner Gefäßmuskelzellen ist die Phosphoinositid-3-Kinase (PI-3-Kinase) Aktivierung. Es konnte mittels PI-3-Kinase Assay gezeigt werden, dass Telmisartan mit einer Konzentration von 1µM und 10µM die PDGF-induzierte Aktivität der PI-3-Kinase in humanen glatten Gefäßmuskelzellen hemmt. 63 Abschließend konnte mit Hilfe der Kiel-67 (Ki-67) Färbung - bekannt aus der immunhistochemischen Onkologie-Diagnostik - die Proliferationsrate der humanen glatten Gefäßmuskelzellen dargestellt werden. Telmisartan hemmt konzentrationsabhängig die PDGF-induzierte Expression von Ki-67 in humanen glatten Gefäßmuskelzellen. Eine Konzentration von 10µM Telmisartan führt zu einer signifikanten Inhibition der Ki-67 Expression. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Telmisartan die Proliferation der humanen glatten Gefäßmuskelzellen in vitro hemmt. Somit kann Telmisartan als orale Medikation zur Prävention und Behandlung Atherosklerose-assoziierter Erkrankungen in Betracht gezogen werden. Es ist abzuklären, ob Telmisartan im Rahmen der Stentimplantation als Beschichtung des Stents eingesetzt werden kann. Auf diese Weise könnte das Restenoserisiko nach Stentimplantation gesenkt werden. Neben der hier nachgewiesenen antiproliferativen Wirkung von Telmisartan auf humane glatte Gefäßmuskelzellen, sollten mögliche weitere Wirkungen und Eigenschaften von Telmisartan untersucht werden, insbesondere seine Wirkung auf das Migrationsverhalten der humanen glatten Gefäßmuskelzellen. Diese Erkenntnisse stellen die Grundlage für weitere Forschungen dar. 64 6. Literaturverzeichnis 1. Randomised trial of cholesterol lowering in 4444 patients with coronary heart disease: the Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S). Lancet. 1994 Nov 19;344(8934):1383-9. 2. Effects of enalapril on mortality in severe congestive heart failure. Results of the Cooperative North Scandinavian Enalapril Survival Study (CONSENSUS). The CONSENSUS Trial Study Group. N Engl J Med. 1987 Jun 4;316:1429-35. 3. Agostoni P, Vermeersch P, Knaapen M, Verheye S. Stent thrombosis is not always stent thrombosis: de novo atherosclerosis in a stented coronary segment. Int J Cardiol. 2010 Sep 24;144:e19-21. 4. Aktories K, Förstermann U, Hofmann F, Starke K. Angiotensin-II-RezeptorAntagonisten (AT1-Rezeptor-Antagonisten). In: Forth W, Henschler D, Rummel W, editors. Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie. ; 2009. p. 422, 456-458. 5. Alderman CP. Adverse effects of the angiotensin-converting enzyme inhibitors. Ann Pharmacother. 1996 Jan;30:55-61. 6. Aqel NM, Ball RY, Waldmann H, Mitchinson MJ. Identification of macrophages and smooth muscle cells in human atherosclerosis using monoclonal antibodies. J Pathol. 1985 Jul;146:197-204. 7. Bahr IN, Tretter P, Kruger J, Stark RG, Schimkus J, Unger T, et al. High-dose treatment with telmisartan induces monocytic peroxisome proliferator-activated receptor- target genes in patients with the metabolic syndrome. Hypertension. 2011 Oct;58:725-32. 8. Baretton GB, Kirkpatrick CJ. Arteriosklerose. In: Böcker W, Denk H, Heitz PU, Höfler G, Kreipe H, Moch H, editors. Pathologie. ; 2012. p. 398-405. 65 9. Baumgartner HR. [A NEW METHOD FOR THE INDUCTION OF THROMBI BY CONTROLLED OVER-DILATATION OF THE VASCULAR WALL]. Z Gesamte Exp Med. 1963 Sep 12;137:227-47. 10. Benndorf RA, Rudolph T, Appel D, Schwedhelm E, Maas R, Schulze F, et al. Telmisartan improves insulin sensitivity in nondiabetic patients with essential hypertension. Metabolism: Clinical & Experimental. 2006 Sep;55:1159-64. 11. Bjorkerud S. Repair responses and tissue lipid after experimental injury to the artery. Ann N Y Acad Sci. 1976;275:180-98. 12. Blessing E, Preusch M, Kranzhofer R, Kinscherf R, Marx N, Rosenfeld ME, et al. Anti-atherosclerotic properties of telmisartan in advanced atherosclerotic lesions in apolipoprotein E deficient mice. Atherosclerosis. 2008 Aug;199:295-303. 13. Braunwald E. Shattuck lecture--cardiovascular medicine at the turn of the millennium: triumphs, concerns, and opportunities. N Engl J Med. 1997 Nov 6;337:1360-9. 14. Brenner BM, Cooper ME, de Zeeuw D, Keane WF, Mitch WE, Parving HH, et al. Effects of losartan on renal and cardiovascular outcomes in patients with type 2 diabetes and nephropathy. N Engl J Med. 2001 Sep 20;345:861-9. 15. Breslow JL. Cardiovascular disease burden increases, NIH funding decreases. Nat Med. 1997 Jun;3:600-1. 16. Brigelius-Flohé R. Atherosclerosis and Coronary Artery Disease. Edited by V. Fuster, R. Ross and E. J. Topol., Volumes 1 and 2, 1824 pages, numerous figures and tables. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, New York 1996. Price: 316.50 US $. Food / Nahrung. 1996;40:232-3. 17. Brunner HR, Gavras H, Laragh JH, Keenan R. ANGIOTENSIN-II BLOCKADE IN MAN BY SAR1-ALA8-ANGIOTENSIN II FOR UNDERSTANDING AND TREATMENT OF HIGH BLOOD-PRESSURE. The Lancet. 1973 11/10;302:10458. 66 18. Burnier M, Brunner H. Angiotensin II receptor antagonists. The Lancet. 2000 2/19;355:637-45. 19. Burton DG, Sheerin AN, Ostler EL, Smith K, Giles PJ, Lowe J, et al. Cyclin D1 overexpression permits the reproducible detection of senescent human vascular smooth muscle cells. Ann N Y Acad Sci. 2007 Nov;1119:20-31. 20. Chang W, Lim S, Song H, Song BW, Kim HJ, Cha MJ, et al. Cordycepin inhibits vascular smooth muscle cell proliferation. Eur J Pharmacol. 2008 Nov 12;597:64-9. 21. Chiong M, Morales P, Torres G, Gutierrez T, Garcia L, Ibacache M, et al. Influence of glucose metabolism on vascular smooth muscle cell proliferation. Vasa. 2013 Jan;42:8-16. 22. Cice G, Di Benedetto A, D'Isa S, D'Andrea A, Marcelli D, Gatti E, et al. Effects of telmisartan added to Angiotensin-converting enzyme inhibitors on mortality and morbidity in hemodialysis patients with chronic heart failure a double-blind, placebo-controlled trial. J Am Coll Cardiol. 2010 Nov 16;56:1701-8. 23. Cohen MC, Rohtla KM, Lavery CE, Muller JE, Mittleman MA. Meta-analysis of the morning excess of acute myocardial infarction and sudden cardiac death. Am J Cardiol. 1997 Jun 1;79:1512-6. 24. Cohn JN. Does the angiotensin receptor blocker telmisartan prevent morbid atherosclerotic events?. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 2008 Sep;5:526-7. 25. Curcio A, Torella D, Indolfi C. Mechanisms of smooth muscle cell proliferation and endothelial regeneration after vascular injury and stenting: approach to therapy. Circulation Journal. 2011;75:1287-96. 26. Dzau VJ, Bernstein K, Celermajer D, Cohen J, Dahlof B, Deanfield J, et al. Pathophysiologic and therapeutic importance of tissue ACE: a consensus report. Cardiovascular Drugs & Therapy. 2002 Mar;16:149-60. 67 27. Falk E. Plaque rupture with severe pre-existing stenosis precipitating coronary thrombosis. Characteristics of coronary atherosclerotic plaques underlying fatal occlusive thrombi. Br Heart J. 1983 Aug;50:127-34. 28. Freytag F, Schelling A, Meinicke T, Deichsel G, Telmisartan Hypertension Experience in a Randomized European Study Versus Atenolol Study,Group. Comparison of 26-week efficacy and tolerability of telmisartan and atenolol, in combination with hydrochlorothiazide as required, in the treatment of mild to moderate hypertension: a randomized, multicenter study. Clin Ther. 2001 Jan;23:108-23. 29. Fry MJ. Phosphoinositide 3-kinase signalling in breast cancer: how big a role might it play? Breast Cancer Research. 2001;3:304-12. 30. Fry MJ. Structure, regulation and function of phosphoinositide 3-kinases. Biochim Biophys Acta. 1994 Jul 18;1226:237-68. 31. Fukuda D, Enomoto S, Hirata Y, Nagai R, Sata M. The angiotensin receptor blocker, telmisartan, reduces and stabilizes atherosclerosis in ApoE and AT1aR double deficient mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2010 Dec;64:712-7. 32. Furukawa H, Mawatari K, Koyama K, Yasui S, Morizumi R, Shimohata T, et al. Telmisartan increases localization of glucose transporter 4 to the plasma membrane and increases glucose uptake via peroxisome proliferator-activated receptor in 3T3-L1 adipocytes. Eur J Pharmacol. 2011 Jun 25;660:485-91. 33. Galis ZS, Sukhova GK, Lark MW, Libby P. Increased expression of matrix metalloproteinases and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atherosclerotic plaques. J Clin Invest. 1994 Dec;94:2493-503. 34. Garlichs CD, Urschel K, Daniel W, Cicha I. Effects of telmisartan and resveratrol on monocyte adhesion to the endothelium exposed to disturbed flow and inflammation. Journal of the American College of Cardiology.Conference: American College of Cardiology's 59th Annual Scientific Session and i2 Summit: Innovation in Intervention Atlanta, GA United States.Conference Start: 20100314 Conference End: 20100316.Con(TRUNCATED). 2010 09 Mar 2010;55(10 SUPPL 1):A174.E1636. 68 35. Geisterfer AA, Peach MJ, Owens GK. Angiotensin II induces hypertrophy, not hyperplasia, of cultured rat aortic smooth muscle cells. Circ Res. 1988 Apr;62:74956. 36. Geng YJ, Libby P. Evidence for apoptosis in advanced human atheroma. Colocalization with interleukin-1 beta-converting enzyme. Am J Pathol. 1995 Aug;147:251-66. 37. Geng YJ, Wu Q, Muszynski M, Hansson GK, Libby P. Apoptosis of vascular smooth muscle cells induced by in vitro stimulation with interferon-gamma, tumor necrosis factor-alpha, and interleukin-1 beta. Arteriosclerosis, Thrombosis & Vascular Biology. 1996 Jan;16:19-27. 38. Gibbons GH, Pratt RE, Dzau VJ. Vascular smooth muscle cell hypertrophy vs. hyperplasia. Autocrine transforming growth factor-beta 1 expression determines growth response to angiotensin II. J Clin Invest. 1992 Aug;90:456-61. 39. Glagov S, Weisenberg E, Zarins CK, Stankunavicius R, Kolettis GJ. Compensatory enlargement of human atherosclerotic coronary arteries. N Engl J Med. 1987 May 28;316:1371-5. 40. Grandoch M, Nagy N, Fischer JW. Telmisartan reduces adipose tissue inflammation and biglycan accumulation in diabetogenic LDL-receptor knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 0322 Conference Start: 20120319 Conference End: 2012;Conference: Abstracts of the 78th Annual Meeting of the Deutsche Gesellschaft fur Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie e. Dresden Germany:onferene Pubaton: (ar.agngs). 385. 41. Hasegawa H, Takano H, Narumi H, Ohtsuka M, Mizuguchi T, Namiki T, et al. Effects of telmisartan and losartan on cardiovascular protection in Japanese hypertensive patients. Hypertension Research - Clinical & Experimental. 2011 Nov;34:1179-84. 42. He R, Qu AJ, Mao JM, Wang X, Sun W. Synergistic proliferation induced by insulin and glycated serum albumin in rat vascular smooth muscle cells. Sheng Li Hsueh Pao - Acta Physiologica Sinica. 2007 Feb 25;59:1-7. 69 43. Herold G. Koronare Herzerkrankung: Therapie Revaskularisation. In: ; 2011. p. 240-1. 44. Hwang SM, Lee YJ, Lee YP, Yoon JJ, Lee SM, Cha JD, et al. Anti-Proliferative Effect of an Aqueous Extract of Prunella vulgaris in Vascular Smooth Muscle Cells. Evid Based Complement Alternat Med. 2013;2013:936463. 45. Insull W,Jr. The pathology of atherosclerosis: plaque development and plaque responses to medical treatment. Am J Med. 2009 Jan;122:S3-S14. 46. Isenovic ER, Kedees MH, Tepavcevic S, Milosavljevic T, Koricanac G, Trpkovic A, et al. Role of PI3K/AKT, cPLA2 and ERK1/2 signaling pathways in insulin regulation of vascular smooth muscle cells proliferation. Cardiovascular & Hematological Disorders - Drug Targets. 2009 Sep;9:172-80. 47. Jiang D, Li D, Wu W. Inhibitory effects and mechanisms of luteolin on proliferation and migration of vascular smooth muscle cells. Nutrients. 2013 May;5:1648-59. 48. Jonasson L, Holm J, Skalli O, Bondjers G, Hansson GK. Regional accumulations of T cells, macrophages, and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque. Arteriosclerosis. 1986 Mar-Apr;6:131-8. 49. Karow T, Lang-Roth R. Angiotensin-II-Rezeptorantagonisten. In: Karow T, editor. Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie. ; 2008. p. 11921. 50. Katso R, Okkenhaug K, Ahmadi K, White S, Timms J, Waterfield MD. Cellular function of phosphoinositide 3-kinases: implications for development, homeostasis, and cancer. Annual Review of Cell & Developmental Biology. 2001;17:615-75. 51. Keefe DL. Clinical pharmacology of telmisartan:. J Clin Pharmacol. 2000 Dec;40:1311. 52. Kellner U. Erkrankungen der Arterien. In: Krams M, Frahm SO, Kellner U, Mawrin C, editors. Kurzlehrbuch Pathologie. ; 2010. p. 71-3. 70 53. Kim JS, Kim IK, Lee SY, Song BW, Cha MJ, Song H, et al. Anti-proliferative effect of rosiglitazone on angiotensin II-induced vascular smooth muscle cell proliferation is mediated by the mTOR pathway. Cell Biol Int. 2012 Mar 1;36:30510. 54. Kim SY, Jeoung NH, Oh CJ, Choi YK, Lee HJ, Kim HJ, et al. Activation of NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 prevents arterial restenosis by suppressing vascular smooth muscle cell proliferation. Circ Res. 2009 Apr 10;104:842-50. 55. Kranzhofer R, Schmidt J, Pfeiffer CA, Hagl S, Libby P, Kubler W. Angiotensin induces inflammatory activation of human vascular smooth muscle cells. Arteriosclerosis, Thrombosis & Vascular Biology. 1999 Jul;19:1623-9. 56. Kubik M, Chudek J, Adamczak M, Wiecek A. Telmisartan improves cardiometabolic profile in obese patients with arterial hypertension. Kidney Blood Press Res. 2012;35:281-9. 57. Lago A, Geffner D, Tembl J, Landete L, Valero C, Baquero M. Circadian variation in acute ischemic stroke: a hospital-based study. Stroke. 1998 Sep;29:1873-5. 58. Lewis EJ, Hunsicker LG, Bain RP, Rohde RD. The effect of angiotensinconverting-enzyme inhibition on diabetic nephropathy. The Collaborative Study Group. N Engl J Med. 1993 Nov 11;329:1456-62. 59. Lewis EJ, Hunsicker LG, Clarke WR, Berl T, Pohl MA, Lewis JB, et al. Renoprotective effect of the angiotensin-receptor antagonist irbesartan in patients with nephropathy due to type 2 diabetes. N Engl J Med. 2001 Sep 20;345:851-60. 60. Li L, Luo Z, Yu H, Feng X, Wang P, Chen J, et al. Telmisartan improves insulin resistance of skeletal muscle through peroxisome proliferator-activated receptoractivation. Diabetes. 2013 Mar;62:762-74. 61. Libby P. Inflammation in atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis & Vascular Biology. 2012 Sep;32:2045-51. 71 62. Libby P. Molecular bases of the acute coronary syndromes. Circulation. 1995 Jun 1;91:2844-50. 63. Libby P, Geng YJ, Aikawa M, Schoenbeck U, Mach F, Clinton SK, et al. Macrophages and atherosclerotic plaque stability. Curr Opin Lipidol. 1996 Oct;7:330-5. 64. Lipton BA, Parthasarathy S, Ord VA, Clinton SK, Libby P, Rosenfeld ME. Components of the protein fraction of oxidized low density lipoprotein stimulate interleukin-1 alpha production by rabbit arterial macrophage-derived foam cells. J Lipid Res. 1995 Oct;36:2232-42. 65. Lucius R, Gallinat S, Busche S, Rosenstiel P, Unger T. Beyond blood pressure: new roles for angiotensin II. Cellular & Molecular Life Sciences. 1999 Dec;56:1008-19. 66. Mach F, Schonbeck U, Bonnefoy JY, Pober JS, Libby P. Activation of monocyte/macrophage functions related to acute atheroma complication by ligation of CD40: induction of collagenase, stromelysin, and tissue factor. Circulation. 1997 Jul 15;96:396-9. 67. Mackenzie HS, Brenner BM. Current strategies for retarding progression of renal disease. American Journal of Kidney Diseases. 1998 Jan;31:161-70. 68. Marketou ME, Kontaraki JE, Tsakountakis NA, Zacharis EA, Kochiadakis GE, Arfanakis DA, et al. Differential effect of telmisartan and amlodipine on monocyte chemoattractant protein-1 and peroxisome proliferator-activated receptor-gamma gene expression in peripheral monocytes in patients with essential hypertension. Am J Cardiol. 2011 Jan;107:59-63. 69. Marler JR, Price TR, Clark GL, Muller JE, Robertson T, Mohr JP, et al. Morning increase in onset of ischemic stroke. Stroke. 1989 Apr;20:473-6. 70. Massie BM. 15 years of heart-failure trials: what have we learned? Lancet. 1998 Aug;352:S29-33. 71. McClellan KJ, Markham A. Telmisartan. Drugs. 1998 12;56:1039-44. 72 72. Mizuguchi Y, Oishi Y, Miyoshi H, Iuchi A, Nagase N, Oki T. Telmisartan improves morphologic and functional changes in both left ventricular myocardium and carotid arterial wall in patients with hypertension: Assessment by tissue doppler imaging and carotid ultrasonography. Echocardiography. 2010 August 2010;27:864-72. 73. Muller JE, Stone PH, Turi ZG, Rutherford JD, Czeisler CA, Parker C, et al. Circadian variation in the frequency of onset of acute myocardial infarction. N Engl J Med. 1985 Nov 21;313:1315-22. 74. Nagy N, Melchior-Becker A, Fischer JW. Long-term treatment with the AT1receptor antagonist telmisartan inhibits biglycan accumulation in murine atherosclerosis. Basic Res Cardiol. 2010 Jan;105:29-38. 75. Napoli C, D'Armiento FP, Mancini FP, Postiglione A, Witztum JL, Palumbo G, et al. Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 1997 Dec 1;100:2680-90. 76. Neutel JM, Frishman WH, Oparil S, Papademitriou V, Guthrie G. Comparison of telmisartan with lisinopril in patients with mild-to-moderate hypertension. Am J Ther. 1999 May;6:161-6. 77. Paquet JL, Baudouin-Legros M, Brunelle G, Meyer P. Angiotensin II-induced proliferation of aortic myocytes in spontaneously hypertensive rats. J Hypertens. 1990 Jun;8:565-72. 78. Parving HH, Lehnert H, Brochner-Mortensen J, Gomis R, Andersen S, Arner P, et al. The effect of irbesartan on the development of diabetic nephropathy in patients with type 2 diabetes. N Engl J Med. 2001 Sep 20;345:870-8. 79. Pestell RG. New roles of cyclin D1. Am J Pathol. 2013 Jul;183:3-9. 80. Rameh LE, Cantley LC. The role of phosphoinositide 3-kinase lipid products in cell function. J Biol Chem. 1999 Mar 26;274:8347-50. 73 81. Riede U-, Drexler H, Ihling C, Kaiserling E, Müntefering H. Arterien: Metabolische Läsionen. In: Riede U-, Werner M, Schaefer H-, editors. Allgemeine und spezielle Pathologie. 5.th ed. ; 2004. p. 422-8. 82. Riede U-, Freudenberg N. Arterien. In: Riede U-, Werner M, Freudenberg N, editors. Basiswissen Allgemeine und Spezielle Pathologie. ; 2009. p. 203-5. 83. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. 1993 Apr 29;362:801-9. 84. Ross R, Glomset JA. The pathogenesis of atherosclerosis (first of two parts). N Engl J Med. 1976 Aug 12;295:369-77. 85. Ross R, Glomset JA. The pathogenesis of atherosclerosis (second of two parts). N Engl J Med. 1976 Aug 19;295:420-5. 86. Ross R, Glomset JA. Atherosclerosis and the arterial smooth muscle cell: Proliferation of smooth muscle is a key event in the genesis of the lesions of atherosclerosis. Science. 1973 Jun 29;180:1332-9. 87. Ross R. Atherosclerosis — An Inflammatory Disease. N Engl J Med. 1999 01/14; 2013/10;340:115-26. 88. Rysava R, Tesar V, Merta M, Czech Group for the Study of,Glomerulonephritis. Effect of telmisartan on blood pressure control and kidney function in hypertensive, proteinuric patients with chronic kidney disease. Blood Press Monit. 2005 Aug;10:207-13. 89. Schlimmer N, Kratz M, Bohm M, Baumhakel M. Telmisartan, ramipril and their combination improve endothelial function in different tissues in a murine model of cholesterol-induced atherosclerosis. Br J Pharmacol. 2011 Jun;163:804-14. 90. Schluter C, Duchrow M, Wohlenberg C, Becker MH, Key G, Flad HD, et al. The cell proliferation-associated antigen of antibody Ki-67: a very large, ubiquitous nuclear protein with numerous repeated elements, representing a new kind of cell cycle-maintaining proteins. J Cell Biol. 1993 Nov;123:513-22. 74 91. Schonbeck U, Mach F, Sukhova GK, Murphy C, Bonnefoy JY, Fabunmi RP, et al. Regulation of matrix metalloproteinase expression in human vascular smooth muscle cells by T lymphocytes: a role for CD40 signaling in plaque rupture?. Circ Res. 1997 Sep;81:448-54. 92. Sehgel NL, Zhu Y, Sun Z, Trzeciakowski JP, Hong Z, Hunter WC, et al. Increased vascular smooth muscle cell stiffness: A novel mechanism for aortic stiffness in hypertension. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 2013 01 Nov 2013;305:H1281-7. 93. Seishima M. [Treatment for dyslipidemia--a strategy for the prevention of atherosclerosis]. Rinsho Byori - Japanese Journal of Clinical Pathology. 2013 Apr;61:334-41. 94. Shangwen S, Fanghong L, Yingxin Z, Shujian W, Zhendong L. Effects of amlodipine plus amiloride/hydrochlorothiazide versus amlodipine plus telmisartan on carotid atherosclerosis in hypertensive patients. Heart. 2011. October 2011;97:A116. 95. Sleight P. Angiotensin II and trials of cardiovascular outcomes. Am J Cardiol. 2002 1/24;89:11-6. 96. Smith DH, Matzek KM, Kempthorne-Rawson J. Dose response and safety of telmisartan in patients with mild to moderate hypertension. J Clin Pharmacol. 2000 Dec;40:1380-90. 97. Smith RD, Timmermans PB. Human angiotensin receptor subtypes. Current Opinion in Nephrology & Hypertension. 1994 Jan;3:112-22. 98. Stary HC. Natural history and histological classification of atherosclerotic lesions: an update. Arteriosclerosis, Thrombosis & Vascular Biology. 2000 May;20:1177-8. 99. Stein RC, Waterfield MD. PI3-kinase inhibition: a target for drug development? Mol Med Today. 2000 Sep;6:347-57. 75 100. Stoll M, Steckelings UM, Paul M, Bottari SP, Metzger R, Unger T. The angiotensin AT2-receptor mediates inhibition of cell proliferation in coronary endothelial cells. J Clin Invest. 1995 Feb;95:651-7. 101. Thompson SG, Kienast J, Pyke SD, Haverkate F, van de Loo JC. Hemostatic factors and the risk of myocardial infarction or sudden death in patients with angina pectoris. European Concerted Action on Thrombosis and Disabilities Angina Pectoris Study Group. N Engl J Med. 1995 Mar 9;332:635-41. 102. Timmermans PB, Wong PC, Chiu AT, Herblin WF, Benfield P, Carini DJ, et al. Angiotensin II receptors and angiotensin II receptor antagonists. Pharmacol Rev. 1993 Jun;45:205-51. 103. Toba H, Tojo C, Wang J, Noda K, Kobara M, Nakata T. Telmisartan inhibits vascular dysfunction and inflammation via activation of peroxisome proliferatoractivated receptor- in subtotal nephrectomized rat. Eur J Pharmacol. 2012 Jun 15;685:91-8. 104. Unger T, Chung O, Csikos T, Culman J, Gallinat S, Gohlke P, et al. Angiotensin receptors. Journal of Hypertension - Supplement. 1996 Dec;14:S95103. 105. Unger T. The ongoing telmisartan alone and in combination with ramipril global endpoint trial program. Am J Cardiol. 2003 5/22;91:28-34. 106. Unger T. The role of the renin-angiotensin system in the development of cardiovascular disease. Am J Cardiol. 2002 1/24;89:3-9. 107. Verheijen R, Kuijpers HJ, Schlingemann RO, Boehmer AL, van Driel R, Brakenhoff GJ, et al. Ki-67 detects a nuclear matrix-associated proliferationrelated antigen. I. Intracellular localization during interphase. J Cell Sci. 1989 Jan;92(Pt 1):123-30. 108. Weber MA. Telmisartan in High-Risk Cardiovascular Patients. Am J Cardiol. 2010 1/4;105:36A-43A. 76 109. Wienen W, Entzeroth M, van Meel JCA, Stangier J, Busch U, Ebner T, et al. A Review on Telmisartan: A Novel, Long-Acting Angiotensin II-Receptor Antagonist. Cardiovasc Drug Rev. 2000;18:127-54. 110. Willich SN, Goldberg RJ, Maclure M, Perriello L, Muller JE. Increased onset of sudden cardiac death in the first three hours after awakening. Am J Cardiol. 1992 Jul 1;70:65-8. 111. Willich SN, Levy D, Rocco MB, Tofler GH, Stone PH, Muller JE. Circadian variation in the incidence of sudden cardiac death in the Framingham Heart Study population. Am J Cardiol. 1987 Oct 1;60:801-6. 112. Yoon J, Ryoo S. Arginase inhibition reduces interleukin-1beta-stimulated vascular smooth muscle cell proliferation by increasing nitric oxide synthasedependent nitric oxide production. Biochemical & Biophysical Research Communications. 2013 Jun 7;435:428-33. 113. Zhao Y, Zhao S, Kuge Y, Tamaki N. The therapeutic effect of telmisartan on atherosclerosis in apoE-/-mice: An evaluation with 99mTc-annexin A5. Molecular Imaging and Biology. 2012. February 2012;14:S670. 77 Danksagung Herrn Prof. Dr. Daniel Walcher möchte ich ganz herzlich danken, dass ich unter seiner Obhut meine Doktorarbeit im Zentrum für Innere Medizin anfertigen durfte. Insbesondere danke ich ihm für die Bereitstellung dieses interessanten Themas und für seine Unterstützung im Anfertigen meiner Arbeit durch Korrekturlesen und Gabe von Anregungen. Einen herzlichen Dank möchte ich auch meiner Arbeitsgruppe im Labor aussprechen, welche mich stets unterstützt hat und mir bei allen Fragen und Problemen mit Rat und Tat zur Seite stand. Ganz besonders möchte ich mich bei Frau Renate Durst bedanken, welche sich viel Zeit genommen hat und mich auf so liebe und außerordentliche Weise in die Laborarbeit eingewiesen hat. Ich konnte mich immer an sie wenden und hatte sehr schöne Stunden im Labor. Frau Sonja Vogt danke ich ebenfalls von Herzen. Sie hatte stets ein offenes Ohr für mich und unterstützte mich sehr in meiner Arbeit. Es war eine tolle und unvergessliche Zeit mit euch beiden! Vielen lieben Dank für alles, was ihr für mich getan habt! Meiner Familie möchte ich für ihre Unterstützung danken, insbesondere meiner Schwester, die sich immer für mich Zeit genommen hat und so viel Geduld mit mir hatte.
