Der Zellzyklus und seine Regulation
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Der Zellzyklus und seine Regulation Das Prinzip Omnis cellula e cellula (Virchow) Saccharomyces Homer sapiens Zellzahl: 1 2 1x1014 Das Problem Störung der Kontrolle → Tumorentstehung Mikroskop Mitose Interphase x Stunden Mitose S-Phase M G2 S G1 Gliederung A. Welche Moleküle steuern den Zellzyklus? Experimentelle Zugänge B. Wo wirken diese Steuermoleküle? C. Wie werden die Steuermoleküle aktiviert/deaktiviert? D. Welche übergeordneten Faktoren kontrollieren den Zellzyklus? Störungen der Zellzykluskontrolle M A. Welche Moleküle steuern den Zellzyklus? G2 S G1 Untersuchungssystem Xenopus Oocyt Ei G2Arrest MArrest Maturation-promoting factor (MPF) Untersuchungssystem Seeigelei Cyclin A Cyclin B Erste Komponente von MPF: zyklisch auftretende Proteine, "Cycline" Nobelpreis 2001 Timothy Hunt Nachweis von Cyclin-Beteiligung am Zellzyklus Ansatz A: RNase-Behandlung des Ei-Extrakts → keine Teilungen Cytoplasma aus Ei Kerne aus Sperma zellfreier Zyklus Ansatz B: RNase-Behandlung des Ei-Extrakts Zugabe von Cyclin-RNA → Teilungen Untersuchungssystem Hefe Vermehrung diploider Zellen Meiose, Sporenbildung Hochtemperatur-Stop Konjugation Vermehrung haploider Zellen Mutanten (temp. sensitiv) Hefe + Mutagen • • • • • • • • • • • • • • • • 25°C • • 35°C • Temparatur-sensitive Mutante Ausgangsverteilung der Zellen im Zellzyklus cdc-Mutante (defekt in Protein für G1-S Übergang) Kompensation mit Hefe-Plasmid-Genbank x y z cdc28 Vermehrung bei hoher Temp. - + Paul Nurse Leland Hartwell Nobelpreise 2001 Zweite Komponente von MPF: Cdc28 ist Cyclin-abhängige Kinase (Cdk) Cyclin P SubstratPhosphorylierung P CdK inaktiv MPF aktiv Übersicht über versch. Cycline u. CDKs, Alberts 4 Sinn der Diversität: a) unterschiedliche Substratspezifitäten b) unterschiedliche Regulierbarkeit Zusammenfassung A:Cyclin-Cdk Komplexe treiben den Zellzyklus M-Cyclin Cdk M G2 S G1-Cyclin G1 Cdk S-Cyclin Cdk B. Wo wirken Cyclin-Cdk Komplexe? M-Cyclin Cdk M G2 Cdk-Substrate ? S Cdk G1-Cyclin G1 Cdk S-Cyclin Wirkung von M-Cyclin-Cdk Abbau der Kernmembran Lamin-Netzwerk unter Kernmembran Wirkung von M-Cyclin-Cdk • Phosphorylierung von Lamin → Depolymerisierung → Abbau der Kernmembran • Phosphorylierung von Condensin-Komponenten → Chromosomen-Kondensation • Phosphorylierung von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen und Motorproteinen → Organisation des Spindelapparats • Phosphorylierung des "Anaphase-Promoting Complex" (APC) → Aktivierung der Anaphase Wirkung von G1-Cyclin-Cdk Aktivierung von Transkriptionsfaktoren → Induktion von Enzymen für DNA-Synthese → Induktion von S-Phase Cdk-Komplexen G1-Cyclin Cdk S-Cyclin Rb aktiv E2F aktiv E2F inaktiv Rb inaktiv Transkription (S-Cyclin, Cdk2 Enzyme) S-Phase Wirkung von S-Cyclin-Cdk Phosphorylierung von Komponenten des DNA-Prä-Initiationskomplexes → DNA-Replikation Alberts4 17-22 S-Cyclin Cdk Zusammenfassung B: unterschiedliche Cyclin-Cdk Komplexe initiieren die entscheidenden Prozesse im Zellzyklus C. Wie werden die Cdks aktiviert/deaktiviert? • Cyclinbindung • Phosphorylierung • Degradation von Cyclin • Bindung von Inhibitoren Aktivierung von M-Cyclin-Cdk Strukturelle Veränderungen bei der Aktivierung von Cdk N lobe PSTAIRE helix Grün: vorher Rot: nach Cyclin Bindung T-loop Grün: vorher Gelb: nach Cyclin Bindung C lobe WieWie C. werden werden diedie Cdks Cdks aktiviert/deaktiviert? aktiviert/deaktiviert? √ • Cyclinbindung √ • Phosphorylierung • Degradation von Cyclin • Bindung von Inhibitoren M-Cyclin Cdk Polyubiquitinierung Prophase Synthese von M-Cyclin Proteasom = E3 Interphase Späte Anaphase Polyubiquit. SCF (E3) +Tome-1 Polyubiquit. Cell 113:101-13, 2003 Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Ayad NG, Rankin S, Murakami M, Jebanathirajah J, Gygi S, Kirschner MW. Nature 428:190-3, 2004. Control of the SCF(Skp2-Cks1) ubiquitin ligase by the APC/C(Cdh1) ubiquitin ligase. Bashir T, Dorrello NV, Amador V, Guardavaccaro D, Pagano M. WieWie C. werden werden diedie Cdks Cdks aktiviert/deaktiviert? aktiviert/deaktiviert? √ • Cyclinbindung √ • Phosphorylierung √ • Degradation von Cyclin • Bindung von Inhibitoren Inhibition des S-Cyclin-Cdk Komplexes in der G1-Phase Inhibitor: Cki SCF (E3) Wirkung von G1-Cyclin-Cdk • Aktivierung von Transkriptionsfaktoren → Induktion von Enzymen für DNA-Synthese → Induktion von S-Phase Cdk-Komplexen • Phosphorylierung von S-Cdk Inhibitor Inhibitor G1-Cyclin Cdk S-Cyclin Rb aktiv E2F aktiv E2F inaktiv Rb inaktiv Transkription (S-Cyclin, Cdk2 Enzyme) S-Phase Zusammenfassung C: Aktivierung - Deaktivierung von Cdks Teilung oder nicht Teilung... das ist hier die Frage! D. Welche Faktoren kontrollieren den Zyklus ? Checkpoints Voraussetzungen für Fortschreiten im Zyklus, generell: vorheriger Prozess abgeschlossen? DNA intakt? M G2 S weitere bestimmende Faktoren unterschiedlich: Eizelle - Embryo: nur Minimalkontrolle (frühe Teilungen) Hefe (Einzeller): ständige Teilungen günstig Zellgröße Nahrungsangebot Paarungssignale Vielzeller: Entwicklung, Differenzierung Zellteilung unter strikter Kontrolle von außen, abhängig von positiven Signalen (Wachstumsfaktoren) aus Umgebung G1 Wachstumsfaktor-Abhängigkeit der Teilung von Säugerzellen rum e S n kei Serum Serum/Wachstumsfaktor-Entzug führt zu Eintritt in G0-Phase • Dauer: Stunden bis Jahre • gekennzeichnet durch Fehlen von Cyclinen und Cdk • Wiedereintritt durch Wachstumsfaktor-Stimulation erfordert Neusynthese Wachstumsfaktor Rezeptor Signaltransduktion Transkription "early-response genes" Cdk, G1-Cyclin E2F Transkriptionsfaktor inaktiv Rb aktiv E2F aktiv E2F inaktiv Rb inaktiv Transkription (S-Cyclin, Cdk2 Enzyme) S-Phase Kontrollmechanismen am G1/S Checkpoint p53 Transkription Cyclin D/Cdk4 p16 (INK) Cyclin E/Cdk2 p21 (Cip/Kip) Rb aktiv P S-Phase E2F inaktiv E2F aktiv P P Rb inaktiv Zellzyklus-Stop nach DNA-Schädigung: Funktion von p53 stabiles aktives p53 p21 Gen p53 p21 RNA p53 Degradation in Proteasomen Ausfall von p53 bei ca. 50 % der Tumore aktiv inaktiv Kontrollmechanismen am G1/S Checkpoint CDT1 Vol. 5 pp1008-15, 2003 Radiation-mediated proteolysis of CDT1 by CUL4-ROC1 and CSN complexes constitutes a new checkpoint. Higa LA, Mihaylov IS, Banks DP, Zheng J, Zhang H. Kontrollmechanismen am G2 Checkpoint ionizing radiation ATM ATR UV x Cyclin B/Cdk1 inhibit. Phosphat Kontrollmechanismen am G2 Checkpoint ionizing radiation UV Rb aktiv Cyclin B/Cdk1 E2F inaktiv E2F aktiv Rb inaktiv Kontrollmechanismen am Mitose-Checkpoint Kontrollmechanismen am Mitose-Checkpoint Mitose Checkpoint = Spindelaufbau-Checkpoint • blockt Anaphase, bis beide Kinetochore eines jeden ChromatidPaares mit Spindel-Mikrotubuli verbunden sind • unverbundenes Kinetochor signalisiert "Warte, Anaphase" (eins reicht!) Exp. 1: Anaphase ca. 20 min nach letzter Kinetochor-Anheftung. Trennung Kinetochor-Mikrotubulus (Mikronadel) verzögert Anaphase (bis ∞) Exp. 2: Zerstörung des letzten freien Kinetochors (Laser) induziert Anaphase in 15 min Kontrollmechanismen am Mitose-Checkpoint Mitose Checkpoint = Spindelaufbau-Checkpoint • blockt Anaphase, bis beide Kinetochore eines jeden ChromatidPaares mit Spindel-Mikrotubuli verbunden sind • unverbundenes Kinetochor signalisiert "Warte, Anaphase" (eins reicht!) Fragen: 1. Wie aktivieren unverbundene Kinetochore den Checkpoint? 2. Wie wirkt der Checkpoint? 3. Wie stellt die Mikrotubulus-Anheftung den Checkpoint ab? Current Biology 22, R966–R980 (2012) The Spindle Assembly Checkpoint Pablo Lara-Gonzalez, Frederick G. Westhorpe and Stephen S. Taylor 1. Mitose Checkpoint Complex Cdc20 MAD2 open MAD2 closed MAD1 Mitose Checkpoint Complex X 3. 1. 2. Zellschädigung Zellzyklus-Arrest Zelltod Reparatur ( Tumorentstehung Teilung) Moody CA, Laimins LA Human papillomavirus oncoproteins: pathways to transformation. Nat Rev Cancer 2010 Gendefekt: Tumor: Gendefekt: Tumor: Cyclin D Adenome, BrustKopfÖsophagusLeberkarzinom p16INK4a p15INK4b Pankreas-, ÖsophagusLungen-Karzinom Sarkom, Melanom Cdk4 Sarkom, Melanom Glioblastom Wachstumsfaktor + neg. Signale - p16INK4a p15INK4b Cki Rb aktiv S-Phase Retinoblastom Gendefekt: Tumor: Rb Retinoblastom, Osteosarkom Weichteilsarkom Blasenkarzinom Brustkarzinom E2F aktiv E2F inaktiv Rb inaktiv Zusammenfassung • Welche Moleküle steuern den Zellzyklus? Cyclin-Cdk Komplexe M G2 S • Wo wirken diese Steuermoleküle? Sie initiieren durch Phosphorylierung den Eintritt in S-phase, Replikation, Mitose-Ereignisse • Wie werden die Steuermoleküle aktiviert/deaktiviert? Durch Bindung von Cyclin, Phosphorylierung (+/-) inhibitorische Proteine, Degradation des Cyclins • Welche übergeordneten Faktoren kontrollieren den Zellzyklus? innere Faktoren (DNA-Integrität), äußere Faktoren (Wachstumsfaktoren) Störungen der Kontrolle (p53, Rb) → Tumoren G1
