Immunzytologie bei Patienten mit Klinisch Isoliertem Syndrom

Aus der Klinik für Neurologie
Direktor: Prof. Dr. Dr.h.c. Wolfgang H. Oertel
des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg
in Zusammenarbeit mit dem
Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH, Standort Marburg
Arbeitsgruppe Klinische Neuroimmunologie
Leiter: PD Dr. Björn Tackenberg
Immunzytologie bei Patienten mit
Klinisch isoliertem Syndrom verdächtig auf
Multiple Sklerose
Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der
gesamten Medizin
Dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von
Johannes Till Elzer
aus Frankfurt am Main
Marburg 2012
Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg
am: 22.02.2012
Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.
Dekan: Prof. Dr. Matthias Rothmund
Referent: PD Dr. Björn Tackenberg
Koreferent: Prof. Dr. Dr. Heverhagen
Inhaltsverzeichnis
Stichwortverzeichnis
vii
Abbildungsverzeichnis
viii
Tabellenverzeichnis
ix
Abkürzungsverzeichnis
x
1. Einleitung
1.1. Epidemiologie und Verlauf der Multiplen Sklerose . . . . .
1.1.1. Epidemiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.2. Verlauf und Prognose der MS . . . . . . . . . . . .
1.1.3. Das klinisch isolierte Syndrom . . . . . . . . . . .
1.2. Apparative Diagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.1. Magnetresonanztomografie . . . . . . . . . . . . .
1.2.2. Liquoranalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3. Immunpathogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.1. Pathologie der MS-Läsion . . . . . . . . . . . . . .
1.3.2. Die zelluläre Immunantwort bei Multipler Sklerose
1.3.3. Immunhomöostase . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.4. Ableitung der Fragestellung . . . . . . . . . . . . . . . . .
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2. Material und Methoden
2.1. Patienten und Probanden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2. Skalen, Definitionen und Material . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.1. Expanded Disability Status Scale Score (EDSS) . . . . .
2.2.2. Die Diagnosekriterien nach McDonald . . . . . . . . . .
2.2.3. Geräte und Verbrauchsmaterialien . . . . . . . . . . . .
2.3. Probenasservierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.1. Gewinnung von mononukleären Zellen aus peripher-venösem Blut . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.2. Kryoasservierung von PBMCs . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.3. Kryoasservierung von Liquor . . . . . . . . . . . . . . .
2.4. Durchflusszytometrie (FACS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.1. Färbung von peripherem Blut . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.2. Färbung von Liquor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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32
Inhaltsverzeichnis
vi
2.4.3. Auswertung im FACS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.5. Magnetresonanztomografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.6. Biostatistische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3. Ergebnisse
3.1. Patientenkollektiv . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2. Färbung I: regulatorische T-Zellen (CD25high ) . . . .
3.3. Färbung II: T-Zell Co-Rezeptor (CD28) . . . . . . .
3.4. Färbung III: B-Zell-Reihe (CD27, CD138) . . . . . .
3.5. Färbung IV: Thymusemigranten (CD45RA, CD62L)
3.6. Färbung V: Monozyten (CD14, CD16) . . . . . . . .
3.7. Zusammenfassung der Ergebnisse . . . . . . . . . . .
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4. Diskussion
4.1. Diskussion des Studienkollektivs und Methodik . . . . . . . . . .
4.2. Diskussion der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.1. Reduzierte Häufigkeit der TREG bei Patienten mit CIS .
4.2.2. Reduzierte MFI für VLA-4 . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.3. Rezeptorverlust und Defekte in Adhäsionsmolekülen . . .
4.2.4. Assoziation der TREG mit der Krankheitsaktivität . . . .
4.2.5. Keine quantitativen Unterschiede für CD28 . . . . . . . .
4.2.6. Erhöhter Anteil von B-Zellen im CSF bei Patienten . . .
4.2.7. Assoziation von Plasmazellen mit dem Läsionsvolumen . .
4.2.8. Keine quantitativen Unterschiede für Thymusemigranten
4.2.9. Quantitative Unterschiede für Monozyten bei CIS . . . .
4.3. Vorschläge für weitergehende Forschungsanstrengung . . . . . . .
4.4. Kritische Würdigung und Grenzen der Studie . . . . . . . . . . .
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5. Zusammenfassung/Summary
87
A. Anhang
91
Literatur
99
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Curriculum Vitae (entfernt)
118
Verzeichnis der akademischen Lehrer
119
Danksagung
120
Ehrenwörtliche Erklärung (entfernt)
122
Stichwortverzeichnis
Clinical isolated syndrome (CIS, klinisch isoliertes Syndrom)
EDSS
Immunhomöostase
Läsionslast im kranialen MRT
Liquorzytologie
Multiple Sklerose
Receiver-Operator-Characteristics (ROC)
Regulatorische T-Zellen (T-REG, CD25)
Very late antigen (VLA-4)
vii
Abbildungsverzeichnis
1.1. Verlaufsformen der MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
1.2. CIS und Konversion zu MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
1.3. T-Zellrezeptor und CD28/B7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.1. Fuchs-Rosenthal Zählkammer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.2. FACS: Hydrodynamische Fokussierung . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.3. FACS: Vollblutprobe im FSC/SSC Dotplot . . . . . . . . . . . . 31
2.4. FACS: Identifikation von CD25high TREG . . . . . . . . . . . . . 33
2.5. FACS: Berechnung des Quotienten QP BL:CSF . . . . . . . . . . . 34
2.6. Übersicht der Färbungen im FACS . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.7. MS-Läsionen in verschiedenen MRT-Wichtungen . . . . . . . . . 36
3.1. Vergleich der Quotienten für CD25high im Boxplot . . . . . . . . 42
3.2. Korrelations- und ROC-Analyse für TREG . . . . . . . . . . . . 44
3.3. MFI für VLA-4 (PBL) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.4. MFI für VLA-4 (CSF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.5. Vergleich der Quotienten für CD28+ im Boxplot . . . . . . . . . 48
3.6. Vergleich der Quotienten für CD19+ im Boxplot . . . . . . . . . 49
3.7. Korrelations- und ROC-Analyse für CD19 . . . . . . . . . . . . . 52
3.8. Vergleich der Quotienten für CD45 im Boxplot . . . . . . . . . . 53
3.9. Vergleich der Quotienten für CD14+/CD16+ im Boxplot . . . . 55
3.10. Korrelations- und ROC-Analyse für CD14 . . . . . . . . . . . . . 57
A.1. EDSS-Dokumentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
viii
Tabellenverzeichnis
1.1. Studien zur prognostischen Wertigkeit des cMRT . . . . . . . . .
7
2.1. Antikörperpanels und untersuchte Zellpopulationen . . . . . . . . 30
3.1. Patientencharakteristik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.2. Patientencharakteristik – Therapie . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.3. Deskriptive Statistik Färbung I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.4. Ergebnisse Färbung I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.5. Ergebnisse VLA-4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.6. Deskriptive Statistik Färbung II . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.7. Ergebnisse Färbung II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.8. Deskriptive Statistik Färbung III . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.9. Ergebnisse Färbung III . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.10. Deskriptive Statistik Färbung IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.11. Ergebnisse Färbung IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.12. Deskriptive Statistik Färbung V . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
3.13. Ergebnisse Färbung V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
4.1. Vergleich des Studienkollektivs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.2. Studienvergleich für CD25 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
4.3. Migrationspfade der Lymphozyten ins ZNS . . . . . . . . . . . . 70
4.4. Subpopulationen humaner regulatorischer T-Zellen . . . . . . . . 84
A.1. Expanded Disability Status Scale . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
A.2. Diagnosekriterien nach McDonald . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
A.3. Verwendetes Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
ix
Abkürzungsverzeichnis
AK
Antikörper
AG
Antigen
APC
antigenpräsentierende Zelle
AUC
area under curve, Fläche unter der Kurve
BCSFS
Blut-CSF-Scharanke
BHS
Blut-Hirn-Schranke
ax.
axial
CAM
cellular adhesion molecule, Adhäsionsmolekül
CDMS
klinisch definitive MS
CI
Konfidenzintervall
CIS
clinical isolated syndrome, klinisch isoliertes Syndrom
CSF
cerebrospinal fluid, Liquor cerebrospinalis
Cut
Cut-off, Grenzwert
EAE
experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis
EDSS
Expanded Eisability Status Scale
FU
Follow-Up
Gd
Kurzform für Gadopentetat-Dimeglumin
Gd-DTPA Gadopentetat-Dimeglumin
HR
hazard ratio, Risikoquotient
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
LHR
likelihood-ratio, Likelihood-Quotient
MBP
Myelin-basische Protein
x
Abkürzungsverzeichnis
xi
MHC
major histocompatibility complex
MS
Multiple Sklerose
MW
Mittelwert
NPV
negativ prädiktiver Wert
NS
Nicht signifikant
cMRT
kraniale Magnetresonanztomografie
OKB
oligoklonale Banden
PBL
peripheral blood leukocytes, Leukozyten aus dem peripheren Blut
PBMCs
peripheral blood momonuclear cells, Mononukleäre Zellen
PD
Protonendichtewichtung
PI
Progressionsindex
PP-MS
primär progrediente MS
PPV
positiv prädiktiver Wert
ROC
receiver operator characteristics
RR-MS
schubförmig remittierende MS
sag.
saggital
SD
Standarddeviation, Standardabweichung
Sens
Sensitivität
SP-MS
sekundär progrediente MS
Spez
Spezifität
TCR
T-Zell-Rezeptor
TREC
T-cell receptor excision circle
T-REGs
regulatorische T-Zellen
VLA-4
very late antigen 4
vs.
versus
1. Einleitung
1.1. Epidemiologie und Verlauf der Multiplen Sklerose
1.1.1. Epidemiologie
Bei der überwiegenden Zahl der Patienten1 manifestiert sich die Multiple Sklerose (MS) im Alter zwischen 20 und 40 Jahren (Goodkin u. a. 1989). Jedoch ist
mittlerweile bekannt, dass auch bei weniger als 10 % die Krankheit schon im
Jugendalter und bei ca. 15 % jenseits des 40. Lebensjahres auftritt und auch
Ausbrüche bis hin zur 80. Lebensdekade dokumentiert wurden (Confavreux,
Vukusic 2006; Renoux u. a. 2008). Bei diesen beiden Extrema der Altersverteilung ist die Geschlechtsprävalenz mit ca. 3:1 deutlich ausgeprägt und in der
Altersgruppe der 20 bis 40 jährigen in Deutschland sind Frauen etwa 2,5-mal
häufiger betroffen als Männer (Flachenecker u. a. 2008).
Die globale Verteilung der MS ist ungleich, aber nicht zufällig. Die Prävalenzraten schwanken zwischen 1:100 000 in Japan und 300:100 000 auf den OrkneyInseln (Sadovnick, Ebers 1993), Schätzungen zufolge sind weltweit mehr als
eine Millionen Menschen betroffen (Compston, Coles 2002). Hein, Hopfenmüller
(2000) fanden auch innerhalb Deutschlands unterschiedliche Prävalenzraten von
50–170 pro 100 000 Einwohner. Insgesamt sind aktuell ca. 120 000 Patienten in
der BRD betroffen (Hein, Hopfenmüller 2000).
1.1.2. Verlauf und Prognose der MS
Der Krankheitsverlauf der Multiplen Sklerose ist variabel und im Einzelfall nur
schwer vorhersagbar. Das Spektrum reicht von einem einzigen Schub (klinisch
isolierte Syndrom) bis zur rasch progredienten chronischen Erkrankung. Allgemein anerkannt sind folgende Verlaufsformen (siehe auch Abbildung 1.1 auf
Seite 2, nach Lublin, Reingold 1996):
1
Aufgrund der besseren Lesbarkeit wird im Folgenden durchgängig die maskuline Form verwendent, beide Geschlechter sind jedoch gemeint
1
1.1. Epidemiologie und Verlauf der Multiplen Sklerose
2
Schubförmiger Verlauf (RRMS), klare Schübe mit vollständiger Re-
mission oder Residuen, keine Progression im Intervall
Sekundär chronischer Verlauf (SP-MS), initial schubförmig, dann
progressive Verschlechterung
Primär chronischer Verlauf (PP-MS), progrediente Verschlechterung
von Beginn an mit Plateaus oder Verbesserungen
Über 90 % der Patienten präsentieren sich
initial mit dem schubförmigen Typ, nur ca.
10 % nehmen einen primär chronischen Verlauf (Thompson u. a. 1997). Allerdings geht
ein Großteil der RRMS-Patienten in sekundäre
Formen über und nach durchschnittlich 10–
15 Jahren beträgt der Anteil der SP-MS Patienten 30–40 %. Nach 20 Jahren Krankheitsdauer sind bis zu 90 % der RRMS Patienten körperlich behindert (Trojano u. a. 2003).
Scalfari u. a. (2010) fanden mediane Schubraten von 0,93 pro Jahr in einer großen gemischten Patientenpopulation unter Therapie. Häufige und prolongierte Schübe mit inkompletter Remission sowie kurze Intervalle
Abbildung 1.1.:
Verlaufsformen der MS, oben:
zwischen erstem und zweitem Schub in den
schubförmiger Verlauf, mitte: se-
ersten zwei Jahren waren im Hinblick auf spä-
kundär chronischer Verlauf, un-
tere Behinderung prognostisch ungünstig (Scal-
ten: primär chronischer Verlauf.
fari u. a. 2010). Der EDSS als Goldstandard
Abbildung: eigene Grafik, modifiziert nach Lublin, Reingold (1996)
der validen Beschreibung eines neurologischen
Defizits weist eine bimodale Häufigkeitsver-
teilung auf: Es finden sich Maxima bei EDSS 1–1,5 und 6–6,5. Nach einer
mittleren Krankheitsdauer von ca. 13 Jahren sind noch etwa 70 % der Patienten uneingeschränkt gehfähig (EDSS ≤ 4,0) und nur 3 % schwer behindert
(Flachenecker u. a. 2008). Eine Studie von Pittock u. a. (2004) an 161 Patienten
konnte eine Progression des EDSS um ca. einen Punkt über zehn Jahre feststellen, die Mehrzahl blieb also stabil. 30 % der Patienten waren nach einer Dekade
auf Hilfsmittel angewiesen. 14 % der Patienten starben im Beobachtungszeitraum (Pittock u. a. 2004).
1.1. Epidemiologie und Verlauf der Multiplen Sklerose
3
1.1.3. Das klinisch isolierte Syndrom
Der Begriff CIS (zu deutsch klinisch isoliertes Syndrom“) ist ein Fachtermi”
nus, der das Auftreten eines ersten fokal-neurologischen Defizits beschreibt und
verdächtig für die Entwicklung einer Multiplen Sklerose ist. Es muss von der
Diagnose MS“ abgegrenzt werden, denn nur“ 45–68 % der Patienten entwi”
”
ckeln in einem Zwei Jahres-Zeitraum nach Diagnosestellung des CIS eine klinisch definitive MS (CDMS) nach Poser (Poser u. a. 1983; Kappos u. a. 2006).
Bei Anwendung der MRT-gestützen McDonald-Kriterien bis zu 85 %. im Jahre
2001 wurden die Poser- von den McDonald-Kriterien abgelöst, der Begriff der
CDMS nach Poser wird jedoch international noch verwendet und beschreibt
das Auftreten von zwei zeitlich getrennten, klinisch fassbaren Schüben oder das
Auftreten von einem klinischen Schub und eine weitere, paraklinische Evidenz.
Retrospektiv weisen 85 % der MS-Patienten eingangs ein akut oder subakutes
neurologisches Ereignis auf, das auf eine einzelne Läsion der weißen Substanz
zurückzuführen ist (Kappos u. a. 2006). Multifokalität, hohe Schubrate, Affektion des efferenten Systems und schnelle EDSS-Progression gehen mit einer
schlechteren Prognose einher (Comi u. a. 2001; Eriksson u. a. 2003; Weinshenker u. a. 1989).
Anhand paraklinischer Befunde wie MRT
oder Liquoranalyse kann das Risiko für den
Übergang in eine MS abgeschätzt werden. Der
positiv prädiktive Wert für die Entwicklung
einer CDMS ist für das MRT mit 53 % am
höchsten, gefolgt von oligoklonalen Banden
(OKB) im Liquor mit 44 % und evozierten
Abbildung 1.2.:
CIS und Konversion zu MS.
30–70 % der Patienten mit CIS entwickeln eine MS, während retro-
Potentialen mit 26–50 % (Filippini u. a. 1994).
Weitere Prädiktoren scheinen u. a. die Genotypen HLA-DR2 oder DRB1∗15 zu sein (Bar-
spektiv ca. 85 % der MS-Patienten
cellos u. a. 2006). Etwa zwei Drittel der Pa-
ein CIS in der Vorgeschichte hat-
tienten mit CIS präsentieren sich initial mit
ten. Abbildung: eigene Grafik
oligoklonalen Banden im Liquor, diese stellen
dabei einen Risikofaktor für die Entwicklung einer MS dar (Rojas u. a. 2010).
Eine neuere Studie konnte allerdings zeigen, dass die Abwesenheit oligoklonaler
Banden allein keinen benigneren Krankheitsverlauf bedeutet (Siritho, Freedman 2009). Zur prognostischen Wertigkeit des MRT siehe Abschnitt 1.2.1 auf
Seite 4.
1.2. Apparative Diagnostik
4
Die Diagnose des CIS/MS wird anhand klinischer, radiologischer und laborchemischer Kriterien gestellt. Es gelten die zweimal revidierten McDonaldKriterien nach Polman. Wesentliche Neuerungen umfassen dabei u. a. die Erfüllung des Kriteriums der zeitlichen Dissemination im cMRT. Dieses ist gegeben bei Nachweis einer neuen Gadolinium-speichernden oder T2 -hyperintensen
Läsion in einem Follow-Up MRT oder beim gleichzeitigen Vorliegen von asymptomatischen Gadolinium-speichernden und nicht-speichernden Läsionen zu einem beliebigen Zeitpunkt (McDonald u. a. 2001; Polman u. a. 2011). Sensitivität
und Spezifität der McDonald-Kriterien im 1-Jahres Follow-Up für die Voraussage eine MS nach drei oder mehr Jahren nach CIS zu entwickeln, lag in verschiedenen Studien bei 74 bis 86 % (Dalton u. a. 2002; Tintoré u. a. 2003).
Viele Patienten erholen sich nach einem CIS bis zur Rekonvaleszenz. Im Optic
Neuritis Treatment Trial (ONTT) konnte für das bestuntersuchte CIS, die Optikusneuritis, eine dreitägige i.v. Prednisolontherapie gefolgt von einer elftägigen
oralen Steroidtherapie für eine schnellstmögliche Besserung des Visus ermittelt
werden (Beck u. a. 1993). Eine langfristige Prognoseverbesserung konnte jedoch
nicht nachgewiesen werden (Beck, Cleary 1993). In besonders schweren Fällen,
vor allem bei Patienten mit hochgradiger Beeinträchtigung durch einzelne strategische Läsionen (im Gegensatz zu erworbener Behinderung durch kumulative
Läsionslast) oder Versagen der Therapie mit Steroiden muß eine Plasmapherese
in Erwägung gezogen werden (Ruprecht u. a. 2004).
1.2. Apparative Diagnostik
1.2.1. Magnetresonanztomografie
Das bildgebende Verfahren der Wahl zum Nachweis der Dissemination im Raum
ist die Magnetresonanztomografie. Sie ist das sensitivste Verfahren für die Detektion demyelinisierender Läsionen im ZNS (Fazekas u. a. 1999).
Hohe T2 - und PD-gewichtete Signalintensität charakterisieren die akute sowie
die chronische MS-Läsion. Topografisch werden als Prädilektionsstellen subkortikale, kortikale, juxtakortikale und periventrikuläre Läsionen unterschieden.
Diese Einteilung findet sich in den sog. Barkhof-Kriterien (Barkhof u. a. 1997)
und ihrer modifizierten Version nach Tintoré (Tintoré u. a. 2003), die Eingang
in die diagnostischen Kriterien nach McDonald gefunden haben. Morphologisch
erscheint die MS Läsion in ihrem Signalverhalten meist homogen, sie weist
eine runde oder ovale Form auf. Abweichungen von Form oder Homogenität
1.2. Apparative Diagnostik
5
können auf das Überlappen mehrerer Läsionen zurückzuführen sein, was u. U.
die Identifikation und numerische Bestimmung erschweren kann. Im akuten Stadium können die Läsionen auch von einem weniger signalintensiven Ring aus
Entzündungszellen und perifokalem Ödem umgeben sein (Fazekas u. a. 1999).
Durch die Applikation des paramagnetischen Kontrastmittels GadopentetatDimeglumin (Gd) kann das MR-Signal verstärkt werden. Beinahe alle neu enstandenen Läsionen speichern initial Kontrastmittel, das pathologische Korrelat dazu ist eine frühe Störung der Blut-Hirn-Schranke (Tortorella u. a. 1999).
Einige Studien untersuchten die prognostische Wertigkeit der Gd-speichernden
Läsionen in Bezug auf Schubrate und Schwere der konsekutiven Schübe und fanden allenfalls eine schwache Korrelation (Albert u. a. 1994; Kappos u. a. 1999).
Während Daten existieren, die eine moderate Korrelation mit dem Grad der
Behinderung im kurzfristigen Krankheitsverlauf suggerieren (Losseff u. a. 2001),
konnte eine andere Studie diese Ergebnisse, gemessen an der kumulativen Gdspeichernden Läsionslast und dem Behinderungsgrad nach acht Jahren für den
Langzeitverlauf nicht bestätigen (Frank u. a. 1994).
Die prognostische Wertigkeit des cMRT
Als Resultat der hohen Sensitivität für die Detektion entzündlicher Läsionen
(s. o.) ist das MRT für Diagnosestellung und als prognostischer Marker in der
initialen Krankheitsphase unverzichtbar. Sowohl als Prädiktor in Bezug auf
Häufigkeit und Schwere konsekutiver Schübe als auch für den späteren Grad
der Behinderung werden magnetresonanztomografische Befunde eingesetzt (Brex u. a. 2002; Kappos u. a. 2006; Tintoré u. a. 2003).
Frühe Studien fanden in T2 -gewichteten cMRT bei CIS eine Prävalenz entzündlicher Läsionen von 50–70 % (Ormerod u. a. 1987). Das Risiko für einen
zweiten Schub ist höher beim Vorliegen einer abnormen MRT (Morrissey u. a.
1993; Minneboo u. a. 2004). Brex u. a. (2002) fanden im Jahre 2002, dass die
Konversionsraten in eine CDMS nach Poser bei Patienten mit CIS und Optikusneuritis bei initial unauffälligem MRT nach 5, 10 und 14 Jahren 6, 11 und 19 %
betrugen. Beim Vorliegen kernspintomografischer Läsionen entwickelten bis zu
72, 83 und 88 % einen zweiten Schub im gleichen Beobachtungszeitraum (Brex
u. a. 2002). Bei Beobachtung desselben Patientenkollektivs über insgesamt 20
Jahre lag die Konversionsrate bei initial normalem Scan bei 21 %, bei pathologischem Scan bei 82 %. Unter diesen behielten 39 % einen benignen Verlauf“
”
bei (EDSS < 3,0), 42 % entwickelten eine SP-MS (Fisniku u. a. 2008).
1.2. Apparative Diagnostik
6
Die Auswertung der Daten der BENEFIT Studie an 468 Patienten mit CIS
zeigte, dass die Barkhof-Kriterien neun T2 gewichtete Läsionen (HR = 1,64)
und drei periventrikuläre Läsionen (HR = 1,66) die stärksten Prädiktoren für
die Konversion zu MS sind, ungeachtet der erhaltenen Therapie (Interferone
vs. Placebo). Ein Follow-Up MRT nach neun Monaten zur Evaluierung der
Dissemination in Zeit bei Patienten ohne CDMS war im Vergleich zu Scans in
kürzeren Intervallen nach Diagnosestellung am Stärksten mit einer Konversion
zu CDMS nach Poser assoziiert (Moraal u. a. 2009).
Jüngere Auswertungen der Daten des Optic Neuritis Treatment Trial (ONTT)
konnten für eines der häufigsten CIS, der Optikusneuritis (ON), ein kumulatives
Risiko von 50 % für die Entwicklung einer MS in den ersten 15 Jahren nach ON
zeigen. Dabei waren Patienten mit mindestens einer Läsion im initialen cMRT
einem vielfach höheren Risiko ausgesetzt als Patienten ohne sichtbare Läsionen
(25 % vs. 72 %) (ONTT 2008).
Rojas u. a. (2010) fanden in einer Kohorte von 40 Patienten mit CIS ein
signifikant erhöhtes Risiko für die Konversion zu definitiver MS nach Poser
in Abhängigkeit vom Liquor- und MRT Befund. Im Vergleich zu Patienten
ohne oder mit nur einem Risikofaktor stellt das Vorliegen positiver OKBs und
abnormer Baseline-MRT in Kombination ein signifikant erhöhtes Risiko dar
(RR = 9,1). Die Zeitspanne bis zur Konversion betrug ca. sieben Monate für
Patienten mit OKB und abnormem Scan und 19 Monate für Patienten mit nur
einem Risikofaktor (Rojas u. a. 2010).
Korrelation von Läsionslast und Behinderungsgrad
Die Daten zur Korrelation von Läsionslast und Grad der Behinderung sind
nicht immer eindeutig und stark vom untersuchten Patientenkollektiv und dem
Beobachtungszeitraum abhängig. Die stärkste Korrelation der Läsionslast mit
dem Behinderungsgrad liefern Longitudinalstudien über fünf Jahre. Sailer u. a.
(1999) bestimmten die Läsionslast im cMRT von 71 Patienten mit CIS zu Beginn und nach einem 5- und 10-Jahres Follow-Up. Von 34 Patienten mit geringer
initialer Läsionslast (≤ 3 cm3 ) entwickelten 78 % eine definitive MS und 18 %
wiesen einen EDSS von sechs und mehr auf. Alle Patienten mit hoher initialer
Läsionslast entwickelten innerhalb von zehn Jahren eine CDMS und 45 % wiesen
einen EDSS von sechs oder mehr auf. Die Quantifikation der Läsionen vorallem
in den ersten fünf Krankheitsjahren korrelierte signifikant mit der Zeitspanne
bis zur Entwicklung einer klinisch definitiven MS nach Poser (Sailer u. a. 1999).
1.2. Apparative Diagnostik
7
Tabelle 1.1.:
Studien zur prognostischen Wertigkeit des cMRT. Dargestellt ist eine Auswahl an
Studien, die die prognostische Wertigkeit der Läsionslast im T2 -gewichteten cMRT in verschiedenen Beobachtungszeiträumen untersucht haben. Auffällig ist eine Heterogenität der
Ergebnisse in Abhängigkeit des gewählten Follow-Ups und der untersuchten Studienpopulation. Es finden sich schwache bis starke Korrelationen der initialen Läsionslast mit
dem EDSS im Follow-Up. K = Korrelation, r = Korrelationskoeffizient, TLV = total lesion
volume (Läsionsvolumen), † Diesen Studien liegt dieselbe Patientenpopulation zugrunde.
Studie
Patienten
Ergebnis (Korrelation)
Filippi
n = 281 (RR, SP, PP)
Schache K. neuer Läsionen mit EDSS Veränderung
2 Jahres-FU
im 2-Jahres FU (r = 0,13)
1995
Schache K. vergrößernder Läsionen mit EDSS
Veränderung im 2-Jahres FU (r = 0,13)
n = 130 (RR, SP,PP)
Schwache K. von TLV mit EDSS (r = 0,3)
Sailer
n = 58 (CIS)
K. TLV mit EDSS im 10-Jahres FU (r = 0,81)
1999
10 Jahres-FU
keine K. von TLV im 5-Jahres FU zum 10-Jahres FU
Filippi†
n = 84 (CIS)
K. TLV mit EDSS nach 5 Jahren
1994
5 Jahres-FU
K. TLV mit Zunahme der TLV nach 5 Jahren
Brex†
n = 79 (CIS)
K. TLV nach 5 Jahren mit EDSS nach 14 Jahren
2001
14 Jahres-FU
(r = 0,60)
Mammi
1996
K. Zunahme des TLV über 5 Jahre mit EDSS nach
14 Jahren
Fisniku†
n = 107 (CIS)
K. TLV mit EDSS nach 20 Jahren (r = 0,48–0,67)
2008
20 Jahres-FU
K. Zunahme des TLV über 5 Jahre mit EDSS nach
20 Jahren
Sormani†
2009
n = 107 (RR, SP)
K. TLV mit EDSS bei Baseline (r = 0,39)
1 Jahre-FU
kein K. des TLV bei Baseline mit EDSS nach 1 Jahr
Zu ähnlichem Ergebnis gelangte eine frühere Studie, im Rahmen derer 84
Patienten mit CIS über fünf Jahre kernspintomografisch untersucht wurden.
Obwohl nur 40 % der Patienten eine definitive MS entwickelten, war die kraniale Läsionslast bei dieser Subgruppe signifikant höher als bei Patienten ohne
zweiten Schub. Weiterhin fanden die Autoren eine Korrelation der initialen
Läsionslast mit dem Zuwachs an Läsionen, sowie dem Grad der klinischen Beeinträchtigung im Follow-Up (Filippi u. a. 1994). Am gleichen Patientenkollektiv führten Brex u. a. (2002) das Follow-Up nach 14 Jahren bei 79 Patienten
und Fisniku u. a. (2008) nach 20 Jahren durch. Es wurde eine zwar schwache,
jedoch signifikante Korrelation der Läsionslast nach fünf Jahren und der Zunah-
1.2. Apparative Diagnostik
8
me der Läsionslast in den ersten fünf Jahren mit dem Grad der Behinderung
beim 14-Jahres-Follow-Up gefunden (Brex u. a. 2002) und im Langzeit-FollowUp bestätigt (Fisniku u. a. 2008).
Für eine tabellarische Zusammenfassung relevanter Studien siehe Tabelle 1.1
auf Seite 7.
1.2.2. Liquoranalyse
In Deutschland wird i. d. R. eine einzelne Liquoruntersuchung wird zur Beginn
des diagnostischen Prozesses durchgeführt, serielle Untersuchungen sind nicht
vorgesehen. Sie dient der Abgrenzung zu anderen, infektiösen Erkrankungen wie
z. B. der Borreliose oder Lues und sollte Zytologie, Albumin- sowie IgG-, IgAund IgM-Bestimmungen nach dem Quotienten-Schema (Reiber-FelgenhauerDiagramm), den Nachweis oligoklonaler IgG- und IgM-Banden im Liquor und
ggf. Antikörper-Synthese-Indizes für neurotrope Viren (Masern, Röteln, Zoster;
sog. MRZ-Reaktion) umfassen (Leitlinien der DGN 2008, http://www.dgn.
org/images/stries/dgn/leitlinien/LL2008/ll08kap_034.pdf). Charakteristisch ist eine leichte lymphozytäre Pleozytose (R. Schmidt 1983). Eine intrathekale IgG-Synthese liegt bei über 90 % vor, in ca. einem Drittel der Fälle wird
sie von einer IgM-Synthese begleitet (Pohl u. a. 2004). Als sensitivste Methode der Wahl zur Detektion von OKB bietet sich in der Klinik die isoelektrische
Fokussierung (IEF) an, mit der bei ca. 95 % aller Patienten unspezifisches oligoklonales IgG im Sinne einer humoralen Entzündung nachgewiesen werden kann
(Andersson u. a. 1994).
Die Beteiligung des zellulären Immunsystems am Fortschritt der Entzündung
im Krankheitsverlauf gab Anlaß zur Hoffnung, mit seriellen Subgruppenanalysen z. B. im FACS das Krankheitsstadium und den Erkrankungstyp definieren
zu können. Besonderes Interesse, sozusagen als Brückenschlag zwischen klinisch
verwertbarer Diagnostik und pathogenetischer Grundlagenforschung“, erlang”
ten Studien, die liquorzytologische Befunddifferenzen mit pathogenetischer Heterogenität zu erklären versuchten. Cepok u. a. (2001) fanden z. B., dass das
Verhältnis von B-Zellen zu Monozyten im Liquor bei bestimmten Patienten intraindividuell stabil bleibt. Es korrelierte mit der Krankheitsprogression, aber
nicht mit Beeinträchtigung gemessen am EDSS. Die Autoren stellten die Theorie auf, dass diese Heterogenität im Liquor einzelner Patienten das pathologische
Korrelat auf histologischer Ebene wiederspiegele (Cepok u. a. 2001). Studien zu
diesem Thema mit Schwerpunkt auf dem CIS finden sich leider im Vergleich zu
Publikationen zur definitiven MS nur sehr spärlich.
1.3. Immunpathogenese
9
1.3. Immunpathogenese
Das gegenwärtige Verständnis von Pathogenese und Immunreaktion bei MS ist
im Laufe der Jahre hauptsächlich aus Tierversuchen heraus entstanden. Myelinspezifische T-Zellen werden außerhalb des ZNS aktiviert und beginnen mit
der Aufregulation von Adhäsionsmolekülen und Chemokinrezeptoren um zur
Adhäsion, rolling“ und schließlich Migration durch das Endothel befähigt zu
”
werden (Engelhardt, Ransohoff 2005). Im perivaskulären Raum werden autoreaktive T-Zellen von lokalen antigenpräsentierenden Zellen, wie z. B. dendritischen Zellen, re-aktiviert und wandern ins ZNS Parenchym ein. Von T-Zellen
und Mikroglia sezernierte proinflammatorische Zytokine führen zu einer weitergehenden Rekrutierung inflammatorischer Zellen und konsekutiver Zerstörung
des Myelins (Greter u. a. 2005).
1.3.1. Pathologie der MS-Läsion
Die MS ist eine Autoimmunerkrankung, bei der autoreaktive T-Zellen einen
Entzündungsprozess gegen Myelinbestandteile des ZNS induzieren (Fletcher
u. a. 2010). Das histopathologische Korrelat dieser im gesamten ZNS zu findenden Entzündung sind fokale, scharf begrenzte Entmarkungsherde mit astrozytärer Gliose und variabler Axondestruktion (McFarland 1999).
Postmortem-Studien an Läsionen in einem frühen Stadium zeigten apoptotische Oligodendrozyten ohne Makrophageninfiltration, strukturellem Myelinschaden oder parenchymalen T-Zellen im Infiltrat. Signifikante Makrophagenund T-Zellrekrutierung als amplifizierende systemische Entzündungsreaktion
wurde erst bei demyelinisiertem, postphagozytotischem Gewebe beobachtet (Barnett u. a. 2009b). T-Zellen werden entweder durch Selbst-Antigen aus dem
Oligodendrozyten/Myelin-Komplex oder durch Fremdantigen aktiviert und führen zu axonaler und neuronaler Degeneration im Bereich demyelinisierender
Läsionen (Barnett, Sutton 2006). Ihr Ausmaß korreliert mit dem Grad der Behinderung (Frischer u. a. 2009).
Aus dem Tiermodell der MS, der EAE, ergaben sich Hinweise, dass neben der
entzündlichen Komponente noch weitere, amplifizierende Faktoren vorhanden
sein müssen um zum typischen Bild der konfluierenden MS-Läsion zu führen.
Schon früh wurde die Rolle gegen Epitope auf der Oberfläche von Myelinscheiden gerichteter demyelinisierender Antikörper erkannt. Eine Studie von 2003
zeigte, dass anti-Myelin AK (vorallem anti-MOG und anti-MBP) bei Patienten
1.3. Immunpathogenese
10
mit CIS einen prognostischen Faktor für kurze Intervalle zwischen einzelnen
Schüben darstellt (Berger u. a. 2003). Eine ähnlich aufgebaute, doppelblinde
Studie vier Jahre später konnte dieses Ergebnis allerdings nicht reproduzieren
(Kuhle u. a. 2007). Eine Analyse der Reaktivität gegen MOG stratifiziert nach
dem klinischen Subtyp zeigte eine stärkere Reaktion bei CIS und RR-MS als
bei gesunden Kontrollen (Lalive u. a. 2006). Diese Ergebnisse sprechen dafür,
dass anti-MOG AK frühe Krankheitsstadien mit Immunantwort gegen intaktes
Myelin repräsentieren.
Histopathologische Studien konnten im Wesentlichen vier Entmarkungstypen in Läsionen bei der MS identifizieren (Lucchinetti u. a. 1996; Lucchinetti
u. a. 2000). Neben einem durch T-Lymphozyten geprägten Bild, welches alle
Läsionstypen aufwiesen, konnten folgende Muster der Myelindestruktion identifiziert werden:
(I) Makrophagen-assoziiert
(II) Makrophagen assoziiert mit Antikörpern und Komplement
(III) Distale Oligodendrogliopathie und Apoptose
(IV) Primäre Oligodendrozyendegeneration
Ergebnisse jüngerer Studien führten dazu, den Erklärungsansatz einer heterogenen histopathologischen Ätiologie zusehends in Frage zu stellen (Breij u. a. 2008;
Barnett u. a. 2009b). So scheint z. B. Probenentnahme aus aktiven Läsionen
zu spezifischen Zeitpunkten und die häufige Übereinanderlagerung aktiver und
chronischer Läsionen im Biopsat eine wahrscheinlichere Erklärung pathogenetischer Heterogenität zu sein anstatt das Vorhandensein einer quadritomen histopathologische Entität (Barnett u. a. 2009a).
1.3.2. Die zelluläre Immunantwort bei Multipler Sklerose
T-Zell Rezeptor und Aktivierung von T-Zellen mittels CD28
T-Zellen erkennen mit ihrem T-Zell-Rezeptor (TCR) ein antigenes Peptid, welches ihnen im Kontext von HLA-Molekülen von Makrophagen, dendritischen
Zellen und Mikrogliazellen in immunogener Form präsentiert wird. Im Gegensatz zu B-Zellen sind sie nicht in der Lage, ein lösliches Antigen zu erkennen (Aloisi u. a. 2000). Der Aktivierungsprozess einer naiven, d. h. noch
nicht Ag-erfahrenen T-Zelle erfordert neben dem direkten Kontakt über den
1.3. Immunpathogenese
11
Abbildung 1.3.:
T-Zellrezeptor und CD28/B7. Links: Die Liganden für CD28, z. B. B7, werden auf
speziellen APC exprimiert. rechts: Aktivierung der T-Zelle durch den CD3/MHC Komplex
sowie durch den 2. Signalweg mit CD28/B7 führt zu einer intrazellulären Signalkaskade,
die in Zytokinsezernierung und Proliferationsmetabolismus resultiert. Abb.: Eigene Grafik,
modifiziert nach Janeway (2008).
TCR zusätzliche ko-stimulatorische Signale. Die erste Signalkaskade ist antigenabhängig und wird über den TCR und peptidgebundenes MHC initiiert.
Der zweite Signalweg wird über Proteinkomplexe, z. B. über die Interaktion
von auf T-Zellen exprimierten CD28/CTLA-4 Molekülen mit Proteinen der
B7-Familie auf APC vermittelt (Bhatia u. a. 2005). Dieser co-stimulatory pa”
thway“ ist nötig zur Produktion von Interleukinen, Rezeptoren wie dem IL-2
Rezeptor (CD25, s. u.) und Zellproliferation. Der alleinige Kontakt des TCR
mit an MHC-Molekülen gebundenen Proteinen allein ist für die Effektorfunktion aktivierter T-Zellen ausreichend, allerdings induziert er Inaktivität und
kann zu Anergie oder programmiertem Zelltod führen. Man geht davon aus,
dass Anergie ein wichtiger Faktor für Immuntoleranz ist und entscheidend dazu
beiträgt, die Aktivierung autoreaktiver T-Zellen in der Peripherie zu verhindern, die nicht im Thymus negativ selektiert wurden (Lovett-Racke u. a. 1998).
Signale, die über CD28 ins Zellinnere weitergeleitet werden, tragen durch Modulation des Zellzyklus zum Überleben von aktivierten Zellen in vitro bei. Somit
spielt CD28 eine wichtige Rolle bei der Verstärkung der Aktivierung von Immunzellen (Reichert u. a. 2001; Kovalev u. a. 2001), siehe auch Abbildung 1.3.
1.3. Immunpathogenese
12
Bei MS wird die Beeinflussung des
co-stimulatory pathway“ mittels an
”
CTLA-4 gekoppelten Immunglobulin für therapeutische Studien benutzt. CTLA4 blockiert die CD28-B7 Interaktion. Viglietta u. a. (2008) konnten eine reduzierte Proliferation von Major-basic-protien (MBP) und Interferon-γ nach
CTLA-4 Ig-Infusion nachweisen (Viglietta u. a. 2008). Daten aus Tierexperimenten der 1990er Jahre (z.B. Miller u. a. 1995) unterstützen die Hypothese,
dass die ersten Schritte im Aktivierungsprozess naiver CD4+ T-Zellen durch
Deprivation des co-stimulatorischen Signals durch CD28/CD80 inhibiert werden können (Podojil, Miller 2009). Klinisch fassbare MS-Schübe gehen mit einer Aktivierung des Immunsystems, wobei die Datenlage über die Rolle kostimulatorischer Signale bei Patienten mit CIS in der Liquoranalyse schlecht
ist. Eine neuere Studie von Fransson u. a. (2009) fand signifikant höhere Anteile CD8+ CD28+ Zellen an allen CD8+ im Blut von Patienten mit RRMS im
Vergleich mit gesunden Kontrollpersonen, unabhängig vom Krankheitsstadium
oder erhaltener Therapie. Trotzdem waren T-Zellen von Patienten in Remission
anergisch, diese konnte durch die Zugabe von anti-CD28 aufgehoben werden.
Patienten im Schub zeigten bessere Proliferationskapazität und die Autoren
schlussfolgerten, dass Anergie bei diesen Patienten durch bislang unbekannte
Faktoren durchbrochen wurde (Fransson u. a. 2009). Widersprüchliche Daten
lieferte eine andere Studie, die sowohl vor, als auch nach i. v. Steroidtherapie
bei RRMS-Patienten keine relevanten oder signifikanten Unterschiede im prozentualen Anteil der CD28+ Zellen im Blut fand (Aristimuño u. a. 2008).
Aufrechterhaltung von Immuntoleranz
Das Immunsystem ist generell tolerant gegenüber Selbst-Antigenen (Ag) und
zentrale und periphere Toleranzmechanismen wirken der Induktion von Autoimmunität entgegen: T-Zellen mit hoher Affinität gegenüber Selbst-Antigen werden durch klonale Deletion im Thymus eliminiert (zentrale Toleranz), während
T-Zellen mit niedriger Affinität in die Zirkulation ausgeschüttet werden. Autoreaktive und myelinspezifische T-Zellen sind sowohl im Blut von MS-Patienten,
sowie auch bei Gesunden vorhanden (Meinl u. a. 1993). Dies ist hinweisend auf
das Vorliegen weiterer protektiver Faktoren um Immuntoleranz beim Gesunden
aufrechterhalten. Zusätzliche Mechanismen neben klonaler Deletion im Thymus, wie z. B. die aktive Suppression durch regulatorische T-Zellen (periphere
Toleranz) scheinen eine wichtige Rolle in der Pathogenese autoimmunogener
Krankheiten zu spielen (Martinez-Forero u. a. 2008).
1.3. Immunpathogenese
13
Humane regulatorische T-Zellen (TREG) beinhalten sowohl natürliche als
auch adaptive TREG. Natürliche (n)TREG exprimieren CD25 (die α-Kette
des IL-2 Rezeptors) auf der Oberfläche und den für die regulatorische Funktion
essentiellen Transkriptionsfaktor FoxP3 (Hori, Sakaguchi 2004). Aufmerksamkeit erlangten die T-Zellen durch ihre Funktion, Autoimmunität durch die Adaptation immunologischer Toleranz gegenüber Selbst-Antigen zu kontrollieren
(Sakaguchi u. a. 1995). Im Tierversuch mit CD4+ CD25+ depletierten Mäusen
konnten schon früh experimentell organspezifische Krankheiten induziert werden (Sakaguchi u. a. 1985), umgekehrt verhinderte der Kotransfer CD4+ CD25+
und CD4+ CD25- (Responder-) Zellen die Entwicklung experimentell induzierter autoimmunologischer Krankheiten (Viglietta u. a. 2004). Die bei unter sterilen Umweltbedingungen gezüchteten Mäusen gefundene CD4+ CD25+ Population lässt sich beim Menschen darüber hinaus in eine CD25high -Population mit
gleichen Suppressorfunktionen und eine CD25med/low (Responder-)Population
unterteilen. Nach Aktivierung über den TCR proliferieren diese Zellen nicht,
sondern inhibieren über direkten Zell-Zell-Kontakt die Proliferation und Zytokinsekretion aktivierter (HLA-II+, CD71+, CD45RA-) CD4+/CD8+ CD25Zellen (Baecher-Allan u. a. 2001). Neben der Phänotypisierung mit CD4 CD25high
und FoxP3 können weitere natürlich vorkommende TREG differenziert werden. Zwei Subgruppen von CD25hi FoxP3+ Zellen werden anhand der Expression des co-stimulierenden Moleküls ICOS unterschieden. Der ICOS+ Phänotyp
sezerniert dabei TGF-β zur Suppression der T-Zell Funktion (Ito u. a. 2008).
Darüberhinaus gibt es Anhaltspunkte für die Existenz CD25- und FoxP3- negativer regulatorischer Zellen, z. b. CD4+/CD8+ HLA-G+ Lymphozyten (Feger
u. a. 2007b).
Weiterhin wird in adaptive und differenzierte TREG unterschieden. Adaptive TREG beinhalten Tr1, Th3 und verschiedene CD8+ TREG und entwickeln
sich in der Peripherie unter dem Einfluss immunsuppressiver Zytokine wie IL-10
und TGF-β (Roncarolo u. a. 2006). Differenzierte nTREG entstehen im Thymus, wenn CD4+ T-Zellen mit großer Affinität für Selbst-Ag durch positive
Selektion expandieren (Liston, Rudensky 2007). Gängige Hypothesen gehen davon aus, dass diese Selbst-Ag spezifischen nTREG eine dominante Rolle in der
Prävention von Autoimmunität spielen und adaptive TREG wahrscheinlich im
Rahmen einer Immunantwort als Reaktion auf Fremdantigen während einer
Infektion entstehen (Review in Lafaille, Lafaille 2009).
Erstmalig finden sich Hinweise für eine gestörte Suppressorfunktion der TREG
bei Patienten mit MS bei Viglietta u. a. (2004). Obwohl gleiche Häufigkeiten der
1.3. Immunpathogenese
14
TREG im Vergleich mit Gesunden gefunden wurden, konnte eine reduzierte
Zytokinsekretion (z. B. IL-10) gezeigt werden. Dabei wurden Populationen aus
verschiedenen Verhältnissen an CD4+ CD25high / CD4+ CD25med/low Zellen mit
unterschiedlichen Konzentrationen von anti-CD3 AK als APC-unabhängiger
Stimulus beschickt. Lagen bei hohen Konzentrationen noch keine Unterschiede
in der Zytokinsekretion vor, zeigte sich in stärkerer Verdünnung eine Abnahme
der sekretorischen Kapazität der CD25high Population. Die Forscher postulierten, dass qualitative Unterschiede in der Stärke des durch den TCR vermittelten
Signals an Responder-Zellen nach antigener Stimulation in vivo (z.B. mikrobiell
vs. autoantigen) für den unterschiedlichen suppressiven Effekt verantwortlich
seien. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass bei MS-Patienten die TREG in
ihrer Effektorfunktion behindert scheinen und nicht umgekehrt eine refraktäre
Empfänglichkeit der Responderpopulation (CD25-) vorliegt, die selbst keine regulatorische Funktion inne hat (Viglietta u. a. 2004). Weiterführende Studien
fanden ebenfalls eine reduzierte Zytokinantwort der TR1-Zellen bei Patienten
mit MS (Martinez-Forero u. a. 2008) und unterstützen die Resultate von Viglietta u. a. (2004) (Venken u. a. 2008a; Frisullo u. a. 2009). Die Reduzierte Effektorfunktion kann ganz oder teilweise durch immunmodulatorische Therapie
wiederhergestellt werden (Korporal u. a. 2008).
Im Gegensatz dazu ist die Datenlage zur Häufigkeit der TREG im peripheren
Blut widersprüchlich. Es finden sich Studien, die einen erniedrigten Anteil wie
auch identische Häufigkeiten bei Patienten mit MS im Vergleich zu gesunden
Kontrollen fanden (Haas u. a. 2005; Feger u. a. 2007a; Venken u. a. 2008a). Eine größere Häufigkeit CD25+ FoxP3+ nTREG wurde im Liquor, aber nicht im
peripheren Blut von MS-Patienten gefunden (Feger u. a. 2007a). Vereinbar mit
der Heterogenität in Pathogenese und Klinik der MS finden sich Studien, die
ein unterschiedliches Verhalten der TREG bei verschiedenen Krankheitsstadien
fanden. Obwohl die Häufigkeit der Zellen im PBL keine signifikanten Unterschiede bei Patienten mit RR-MS und SP-MS aufwies, konnte eine verminderte
Suppressorfunktion nur für erste festgestellt werden. Somit scheint die Funktionsbeeinträchtigung der TREG besonders im frühen Krankheitsverlauf eine
Rolle in der Immunregulation zu spielen (Venken u. a. 2006). Die folgerichtige
Konsequenz ist die Betrachtung der TREG im frühestmöglichen Krankheitsstadium, dem CIS. Erstaunlicherweise finden sich hierzu nur wenige Studien. Eine
ältere Arbeit von Jensen u. a. (2004) untersuchte ebenfalls die Häufigkeit der
TREG im PBL und CSF und stellte diese der Krankheitsaktivität gemessen
an der kranialen Läsionslast gegenüber. Die Autoren fanden signifikant größere
1.3. Immunpathogenese
15
Häufigkeiten CD4+ CD25+ TREG bei Patienten mit CIS im Vergleich zu nichtinflammatorischen neurologischen Krankheiten. CIS Patienten mit abnormem
cMRT wiesen niedrigere Häufigkeiten im PBL und CSF auf als Patienten mit
normalem cMRT (Jensen u. a. 2004).
Emigration und Reifung von T-Zellen
T-Zellen unterlaufen nach ihrer Reifung im Thymus und Kontakt mit ihrem
Antigen eine Reihe von Veränderungen in Bezug auf Rezeptorbesatz, Zytokinsekretionsmuster und Funktionalität. Beim Menschen kann eine Phänotypisierung
anhand der Expressivität für die CD45 Isoformen RA und RO erreicht werden
(Baars u. a. 1995). Naive CD45RA+ T-Zellen haben die Fähigkeit, zu den sekundären lymphatischen Organen zu wandern und dort durch Antigenkontakt
aktiviert zu werden. Memoryzellen stellen ein Repertoire an spezialisierten Effektorzellen dar, die nach Zweitkontakt mit ihrem Antigen für eine schnelle und
effektive Immunantwort sorgen. Bei Patienten mit Autoimmunkranheiten und
chronischer Stimulation des Immunsystems wie bei MS ist eine Verschiebung
des Phänotyps vom naiven zum Memorytyp zu erwarten (Mikulkova u. a. 2010).
Anhand von Oberflächenmolekülen wie CCR7 (ein Zytokinrezeptor für das
Homing in Lymphknoten durch hochendotheliale Venolen) und CD62L (ein LSelektin) konnten mindestens zwei Phänotypen von Memory T-Zellen definiert
werden: schnell reagierende CD45RA+CD62Lhi TEM Effektor-Memoryzellen
und langsamer reagierende CD45RA+/-CD62Llow TCM Central-Memoryzellen
(Seder, Ahmed 2003).
Muraro u. a. (2000) untersuchten die Fragestellung, aus welcher der beiden
Populationen CD4+ naiv vs. Memory sich autoreaktive Zellen bei Patienten mit
RR-MS rekrutieren. In der FACS-Analyse MBP- und Tetanus-Toxoid spezifischer Zellklone aus CD4+ CD45RA+ CD45RO- und CD4+ CD45RA- CD45RO+
Populationen konnte gezeigt werden, dass demyelinisierende T-Zellen de novo
aus dem Pool der naiven CD45RA+ CD45RO- rekrutiert werden und anschließend in doppelt-positive Effektorzellen oder langlebige Memoryzellen differenzieren. In der gleichen Studie wurde eine erhöhte Expressivität von CD62L auf
naiven Zellen im Vergleich zu Memoryzellen gefunden (Muraro u. a. 2000). Naive T-Zellen benötigen für den Übertritt aus dem Blut in Lymphknoten CD62L
um das sog. rolling“ entlang der hochendothelialen Venolen zu ermöglichen
”
(Sallusto u. a. 1999). Mikulkova u. a. (2011) fanden eine negative Korrelation
CD4+ CD8+ CD45RA+ CCR7+ Zellen mit dem Lebensalter bei gesunden Kon-
1.3. Immunpathogenese
16
trollpersonen. Erwartungsgemäß zeigte sich ein Rückgang naiver T-Zellen und
ein Anstieg von Memory T-Zellen mit fortschreitendem Alter. Für MS konnte
diese Beobachtung nicht reproduziert werden (Mikulkova u. a. 2011).
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind keine Studien zu Immunphänotypisierung
mit CD45RA/CD62L bei Patienten mit CIS erschienen.
Die Rolle von B-Zellen und ihre Interaktion mit T-Zellen
Der Vorteil B-Zell depletierender Therapien bei Patienten mit MS zeigt, dass
B-Zellen eine zentrale Rolle in der Pathogenese innehaben (Hauser u. a. 2008).
Nachdem die initiale Entzündungsreaktion zu einer Schädigung der Blut-HirnSchranke (BHS) geführt hat, wandern B-Zellen und Antikörper ins ZNS ein und
partizipieren an der spezifischen Entzündungsreaktion durch verschiedene Mechanismen: Deregulation der Produktion von myelinspezifischen B-Zellen (Pashenkov u. a. 2003), Formierung ektoper lymphoider Strukturen in den Meningen
von MS-Patienten (Serafini u. a. 2004), Differenzierung in Plasmazellen mit Produktion von Autoantikörpern gegen Myelin und Oligodendrozyten-Antigenen
im ZNS (Sellebjerg u. a. 2000) und Antigenpräsentation für T-Zellen (Crawford
u. a. 2006). Die Rolle sezernierter Antikörper bei MS wird durch eine intrathekale Antikörpersynthese von CD138+ Plasmazellen und dem Nachweis von
Ig-Ablagerungen in demyelinisierenden Läsionen im ZNS unterstützt (Owens
u. a. 2007; Lucchinetti u. a. 2000).
CD27 als Marker für Gedächtniszellen findet sich nicht nur auf B-Zellen.
Basierend auf der Analyse dieses Oberflächenmarkers können T-Zellen in eine
größere, aus Memory- und naiven T-Zellen bestehende und in eine Effektorpopulation (CD27-) unterschieden werden. Untersuchungen, die den Rezeptorbesatz der Effektorpopulation als gewebsspezifisch und weniger der Migration in Lymphknoten dienend klassifizierten, unterstützen diese These. Es existiert eine Reihe von weiteren phänotypischen Markern für Gedächtniszellen, wie
z. B. CD45RO und CCR7 (s. o. Giunti u. a. 2003). In-vitro Experimente haben
gezeigt, dass die Aktivierung von T-Zellen mittels dem TCR-CD3-Komplex
eine starke Hochregulierung von CD27 zur Folge hat, vor allem auf naiven
CD45RA+ Zellen, bevor diese zu CD45R0+ Memoryzellen werden. CD27+
T-Zellen sind in der Lage, über Zytokinsekretion B-Zellen zu aktivieren. Interessanterweise verlieren sie ihren Rezeptorbesatz bei Dauerstimulation mit
Antigenen und ändern ihren Phänotyp zu CD27-. Diese Effektorpopulation
unterscheidet sich im Hinblick auf Zytokinsekretion (vorallem IL-4 und 5),
1.3. Immunpathogenese
17
Integrin- und Selektinbesatz wie VLA-4 und VLA-5, einem Verlust an CD28
und einer damit verbundenen Aufregulierung von CD11b (Baars u. a. 1995).
Neuere Studien beleuchten das Zusammenspiel von B- und T-Zellen im Immunsystem (Harp u. a. 2008). Es konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung
von B-Zellen durch T-Zell spezifische Zytokine, nicht aber unspezifische Stimuli
zur Myelin-Ag abhängigen Aktivierung der T-Zellen befähigt. Diese Ativierung
scheint wichtig für die Ausübung der antigenpräsentierenden Funktion der BZelle zu sein. Somit stehen T- und B-Zellen in einem reziproken Verhältnis
zueinander (Harp u. a. 2008). Auch regulatorische T-Zellen werden auf diesem
Weg aktiviert. Die Blockade des co-stimulatorischen CD86 in vitro verstärkte
die Fähigkeit von B-Zellen zur Induktion von TREG (Zhong u. a. 2007).
Nach der klassischen Theorie der klonalen Selektion nach Burnet reagiert das
Immunsystem nach primärer Immunisierung mit der Generierung eines großen
Pools an Memory-B-Zellen, die sich von naiven Zellen in Bezug auf Rezeptorrepertoire, Antigenpräsentation, intrinsische Aktivität, Toleranz und Lebensspanne unterscheiden. Im Rahmen der spezifischen Immunantwort ist es nach
der initialen klonalen Expansion von großer Wichtigkeit, dass aktivierte Zellen
spezifisch auf ihr Antigen reagieren, ohne unbeteiligtes Gewebe ( bystander“)
”
zu schädigen (Burnet 1962).
Das lymphozytenspezifische CD27 aus der TNF-Rezeptorfamilie und sein Ligand CD70 haben eine Schlüsselrolle in der Kontrolle der Differenzierungsund Effektorfunktion aktivierter (B-)Lymphozyten inne. Auf T-Zellen wirkt
die Aktivierung von CD27 ähnlich dem TCR-assoziierten CD28 (s. o.) proliferationsfördernd. CD27 ist zusammen mit Interleukinen an der Weiterdifferenzierung zur CD138+ Plasmazelle beteiligt. CD27+ B-Lymphozyten finden sich
vor allem in Geweben, die reich an Memoryzellen sind (wie z. B. der Marginalzone der Milz) und tragen bereits Mutationen in der variablen Kette des IgD,
was sie von naiven B-Zellen unterscheidet (Lens u. a. 1998).
Corcione u. a. (2004) untersuchten die Differenzierung von B-Zellen bei MS.
Im CSF von MS-Patienten finden sich signifikant mehr Plasmazellen (CD138+)
und Memoryzellen (CD19+/-CD27+) als im PBL. Plasmazellen im Liquor fanden sich auch bei anderen entzündlichen Erkrankungen, jedoch zu einem geringeren Prozentsatz. Dies könnte Ausdruck des chronischen Verlaufs der MS
im Vergleich zu akuten Krankheiten, wie z. B. viraler Meningitis, sein, hervorgerufen durch persistierende antigene Stimulation und Defekte in der Immunantwort. Die Autoren schlussfolgerten, dass eine kompartimentalisierte BZellreaktion im ZNS stattfindet (Corcione u. a. 2004). Im Wesentlichen fehlen B-
1.3. Immunpathogenese
18
Zellen nahezu völlig im Liquor Gesunder, bei Patienten mit MS oder auch akuten Infektionen wurden jedoch Expansionen von bis zu 30 % aller Zellen im CSF
gefunden. Dabei handelt es sich hauptsächlich um CD27+ Gedächtniszellen, die
schon Kontakt mit einem Antigen hatten (Cepok u. a. 2005).
Bei Patienten mit CIS ist die Rolle der B-Zellen weniger gut untersucht.
Kuenz u. a. (2008) konnten eine Akkumulation reifer B-Zellen (CD19+ CD1382)
und Plasmablasten (CD19+ CD138+) im CSF bei CIS und RR-MS, nicht aber
bei SP-MS nachweisen. B-Zellen korrelierten mit entzündlicher Aktivität, gemessen an T2 -hyperintensen und Gd-aufnehmenden Läsionen im cMRT und Liquorparametern (Leukozytenzahl, intrathekale Ig-Synthese) (Kuenz u. a. 2008).
Die Bedeutung von B-Zellen in frühen Krankheitsstadien wird auch duch Studien unterstützt, die das proinflammatorische Zytokinmilieu bei Patienten mit
CIS untersuchten (Sellebjerg u. a. 2009).
Die Rolle von Makrophagen in der Immunpathogenese
Die Präsenz von Makrophagen in demyelinisierenden Läsionen bei MS konnte
schon früh in histopathologischen Studien gezeigt werden (Brück u. a. 1995).
Hämatogene Makrophagen und Mikroglia als ihr Pendant im ZNS haben zahlreiche immunmodulatorische Funktionen. Makrophagen und Mikroglia dienen
als Antigenpräsentation für T-Zellen. MHC-II Moleküle und co-stimulatorische
Moleküle wie B7.1 werden verstärkt bei MS-Patienten exprimiert (Gobin u. a.
2001). Während MHC-II Expression auf Mikroglia im ZNS möglicherweise eine
Dämpfung der Immunantwort durch Aktivierung regulatorischer T-Zellen hat
(Almolda u. a. 2010), konnte der Expression auf perivaskulären Makrophagen
eine proinflammatorische Rolle in der EAE nachgewiesen werden (Hickey, Kimura 1998). Makrophagen im ZNS können Myelinabbauprodukte phagpzytieren und sezernieren eine Vielzahl an pro- und antiinflammatorischen Zytokinen
(Glim u. a. 2010).
Der klassische immunphänotypische Marker für Monozyten ist CD14, der
Pattern-recognition-Rezeptor für Lipopolysaccharide in der äußeren Zellwand
gramnegativer Bakterien. Innerhalb dieser Population exprimieren ca. 10 %
zusätzlich zu CD14 CD16, den niedrig-affinen Fc-γ Rezeptor III. Diese unterscheiden sich in Bezug auf ihr Verhalten bei Immunstimulation von den klassi”
schen“ Monozyten und wurden von einigen Autoren als proinflammatorische“
”
Monozyten bezeichnet (Bergh u. a. 2004).
Obwohl die MS hauptsächlich eine T-Zell-mediierte Autoimmunerkrankung
1.3. Immunpathogenese
19
ist, spielen Monozyten bzw. Makrophagen als Vertreter des angeborenen Immunsystems eine wichtige Rolle in der Pathogenese. Vaknin-Dembinsky u. a.
(2008) konnten bei RR-MS Patienten ein verändertes, von Makrophagen sezerniertes Zytokinprofil im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen feststellen.
Insbesondere in sehr frühen Krankheitsstadien war membrangebundenes IL-15
auf CD14+ Monozyten verstärkt exprimiert, analog dazu wurde eine erhöhte
Anzahl an IL-15 Rezeptoren auf CD4+ T-Zellen bei MS-Patienten gefunden.
Die Autoren schlussfolgern daraus, dass IL-15 und Makrophagen besonders in
der Frühphase (also beim CIS) einen wichtigen Faktor in der Unterhaltung
der T-Zellantwort darstellen und in Zukunft möglicherweise als Therapieansatz
dienen könnten (Vaknin-Dembinsky u. a. 2008). Weitere Studien unterstreichen
neben dem erworbenen Immunsystem immer auch die Rolle des angeborenen
Immunsystems bei der MS. Im Tiermodell wurde die immunmodulatorische
Funktion des CD14-Rezeptors auf Monozyten gezeigt. CD14 defiziente Mäuse
mit EAE präsentierten sich klinisch und histopathologisch mit stärkerer neuronaler Entzündung als die nicht-CD14 kompromittierten Tiere. Somit wurde
CD14 eine protektive Funktion, analog zu regulatorischen T-Zellen (s. o.), zugeschrieben. Weitere Studien sollten allerdings klären, ob die artifizielle Depletion
von CD14 nicht eine überschiessende Antwort des erworbenen Immunsystems
im Tiermodell nach sich zieht und so eine künstliche Verschlechterung im Hinblick auf Entzündung und Beeinträchtigung nach sich zieht (Walter u. a. 2006).
Interessanterweise ist CD14 als glycosyl-phosphatidyl-inositol verankertes Molekül auf die Zusammenarbeit mit dem Co-Rezeptor TLR4 angewiesen, welcher
auch auf regulatorischen T-Zellen gefunden wurde und dem damit ebenso eine
regulatorische Funktion zugeschrieben wird (Pasare, Medzhitov 2004). Bis jetzt
existieren keine Studien über einen möglichen synergistischen Effekt von CD25
und TLR4 bei Autoimmunerkrankungen und das Zusammenspiel von CD14,
CD25 und TLR4 bietet Raum für weitere Forschung in der Zukunft.
Bei MS-Patienten, die mit Interferon-β behandelt wurden, konnte mithilfe
des FACS eine Expansion von CD14+ auf proinflammatorischen Monozyten zu
Lasten von CD16+ nach einem Monat antiinflammatorischer Therapie gefunden werden. Da die proinflammatorischen Monozyten eine Vorstufe im Entwickungszyklus zu dendritischen Zellen darstellen (s. o.), könnte dies ein weiterer Erklärungsansatz für die Wirkungsweise von Interferonen bei MS Patienten
sein, indem das Gleichgewicht der differenzierten Monozyten durch die Therapie
zugunsten der Makrophagen verschoben wird (Bergh u. a. 2004). Eine ähnliche
Wirkung zeigen Monozyten bei MS-Patienten, die mit einer fünftägigen hoch-
1.3. Immunpathogenese
20
dosierten Steroidtherapie behandelt wurden. Es zeigte sich ein Rückgang der
CD14+ CD16+ Monozyten auf teils nicht mehr messbare Werte, während die
Population der klassischen“ Monozyten um fast 50 % expandierte. Allerdings
”
wurden in dieser Studie keine Liquorwerte erhoben, und war mit n = 10 relativ
klein bemessen (Fingerle-Rowson u. a. 1998). Studien zur Immunphänotypisierung bei Patienten mit CIS und CD14/CD16 existieren nicht.
1.3.3. Immunhomöostase
Um ins ZNS einwandern zu können müssen zirkulierende Zellen die zellulären
Barrieren überwinden, die für die Aufrechterhaltung der Immunhomöostase verantwortlich sind. Unspezifischer trans- und parazellulärer Transport vom Blut
ins ZNS Parenchym wird durch die endotheliale Blut-Hirn-Schranke (BHS) verhindert, die als einzigartige morphologische Charakteristika fehlende Fenestration und hocheffiziente tight junctions aufweist (Wolburg u. a. 2003). Eine zweite
Barriere stellt die Blut-CSF-Schranke (BCSFS), bestehend aus spezialisierten
Epithelzellen des Plexus choroideus dar, welche den Liquorraum gegen das periphere Blutkompartiment abschottet und in jüngerer Zeit als mögliche Eintrittspforte für Immunzellen ins ZNS diskutiert wurde (Reboldi u. a. 2009)
Initialer Kontakt der zirkulierenden Zellen wird durch die Interaktion von
Adhäsionsmolekülen der Selektin- oder Ig-Superfamilie und ihrer Liganden auf
dem Gefäßendothel hergestellt. Es folgt das sog. rolling“ mit verminderter
”
Fließgeschwindigkeit und zytokinvermittelter Konformitätsänderung der Adhäsionsmoleküle. Beim Übertritt ins ZNS befinden sich die T-Zellen nun im
Liquor-drainierten perivaskulären Raum, der von der glia limitans gegen das
Hirnparenchym abgegrenzt wird (Engelhardt 2010).
Erste Hinweise, dass T-Zellen beim Gesunden zur Überwindung der BHS
und BCSFS fähig sind lieferten Studien mit radioaktiv markierten enzephalitogenen T-Lymphoblasten. Sechs Stunden nach Injektion der Zellen konnte eine
Anreicherung im perivaskulären Raum bei Ratten nachgewiesen werden (Hickey
1991). Im Rückenmark wurde ein VLA-4/VCAM-I (CD49d) abhängiger Transport aktivierter, antigenspezifischer T-Zellen ins ZNS nachgewiesen (Vajkoczy u. a. 2001). Neure Studien bestätgten diese Hypothesen und mittels intravitaler Mikroskopie (IVM) konnten ovalbumin-spezifische T-Zellen nach ihrer
Diapedese über meningeale Gefäße im Subarachnoidalraum, nicht aber Hirnparenchym beobachtet werden. Die Autoren leiteten daraus ab, dass T-Zellen
die Überwachung des zentralnervösen Immunsytems im Subarachnoidalraum
1.3. Immunpathogenese
21
ausüben, in Abwesenheit spezifischer perivaskulärer Antigene jedoch die nötigen
Signale zur Migration über die glia limitans fehlen (Bartholomäus u. a. 2009).
Das Überwiegen von Memory T-Zellen im CSF gegenüber dem PBL bei Gesunden legt den Schluss nahe, dass Zellen direkt über den Plexus choroidus und
die BCSFS in den Liquor übertreten können (Kivisäkk u. a. 2003). Hinweise
auf die Rolle bestimmter Zytokine wie CCL20 für die Mediation der zellulären
Diapedese über die BCSF sind Gegenstand aktueller Forschung (Reboldi u. a.
2009). Zusammengefasst findet also unter physiologischen Bedingungen eine
strikte Selektion immunkompetenter Zellen beim Übertritt ins ZNS und Aufrechterhaltung einer zellulären Homöostase statt. Ohne antigene Aktivierung
pesistieren die T-Zellen nicht jenseits von BHS und BCSFS und imigrieren
nicht ins Hirnparenchym (Bartholomäus u. a. 2009).
Reaktivierung einer T-Zelle im Subarachnoidalraum führt zu einer Aktivierung der zellulären Schranken, was den weiteren Einstrom immunmodulatorischer Zellen über die entzündete BHS bei MS erleichtert. Initiale Schritte
umfassen das α4-Integrin/VCAM-1 medierte rolling“ in der Frühphase des T”
Zell-Endothel Kontaktes (Battistini u. a. 2003) und Endothelin Interaktionen
nach initialem Kontakt (Bahbouhi u. a. 2009). In vitro Studien konnten zeigen,
dass T-Lymphozyten über LFA-1 und α4-Integrine und ihre endothelialen Liganden ICAM-I und VCAM-I an der entzündeten Gefäßwand haften (Man u. a.
2009) und die interzellulären Adhäsionsmoleküle während EAE auf meningealen und auf Endothelzellen des Plexus choroideus hochreguliert sind (Steffen
u. a. 1996). Der letzte Schritt, die Diapedese über die zelluläre Barriere, ist am
wenigsten gut erforscht. Es gibt allerdings Hinweise auf einen transzellulären
Mechanismus, der LFA-1/ICAM-I und ICAM-2 Interaktionen nahelegt (Greenwood u. a. 2003).
Schlussendlich führt die Produktion von Zytokinen und Metalloproteasen zur
Degradation der glia limitans und Einstrom encephalitogener Zellen ins Hirnparenchym (Agrawal u. a. 2006).
Spezielle Aspekte in der Homöostase der TREG
In der ersten Lebenswoche thymektomierter Mäuse entwickeln eine Autoimmunekrankung ohne Beteiligung des ZNS (Sakaguchi u. a. 1985). Im Mausmodell
der MS, der EAE, konnte gezeigt werden, dass CD4+ CD25+ Lymphozyten
die Entstehung und Progression der Krankheit aufhalten können (Kohm u. a.
2002) und es fand sich eine Akkumulation peripher expandierter TREG im ZNS
1.3. Immunpathogenese
22
(Korn u. a. 2007). Es finden sich Studien, die eine Anreicherung auch im Liquor
von MS Patienten zeigen konnten (Feger u. a. 2007a), auch wenn die Studienlage
hierzu kontrovers diskutiert wird (siehe auch Abschnitt “Aufrechterhaltung von
Immuntoleranz“ auf Seite 12 und Tabelle 4.2 auf Seite 64). Diese Daten legen
die Vermutung nahe, dass TREG beim Menschen aktiv ins entzündliche Milieu rekrutiert werden können. Es existieren Studien zur Korrelation von Schub
und Remission mit der Häufigkeit von regulatorischen T-Zellen (Aristimuño
u. a. 2008). Fletcher u. a. (2010) formulieren die Hypothesen, dass Autoimmunität und konsekutive Entzündung von der Balance zwischen regulatorischer
und inflammatorischer Kapazität auf zellulärer Ebene abhängt. Während die
entzündliche Komponente zu Beginn der Krankheit dominiert, kommt es zur
Expansion der regulatorischen Antwort (im Liquorkompartiment) zugunsten
von regulatorischen Zellen und Zytokinen während der Remission (Fletcher u. a.
2010).
In jüngerer Zeit wurden TREG aufgrund ihres Oberflächenbesatzes an Adhäsionsmolekülen klassifiziert. Diese ermöglichen T-Zellen den Übertritt vom
Lymph- ins Blutkompartiment oder die Diapedese der Blut-Hirn-Schranke oder
sind für die Retention der Zellen im entzündeten Gewebe verantwortlich. SoiluHänninen u. a. (2005) fanden eine erhöhte Expression von CD49d (α-4 Kette des Very Late Activation Antigen, VLA-4) in der Gesamtpopulation der
T-Zellen bei Patienten mit MS im Schub (Soilu-Hänninen u. a. 2005). Eine
neuere Studie zeigte eine signifikant erhöhte Häufigkeit CD49d+ Zellen unter
allen TREG bei Patienten mit RR-MS (nicht aber SP-MS) im Vergleich zu gesunden Kontrollen (Venken u. a. 2008a). Stenner u. a. (2008) untersuchten den
Effekt einer VLA-4 Blockade mit dem monoklonalen Antikörper Natalizumab
auf CD25high FoxP3+ TREG bei Patienten mit RR-MS. Die Autoren konnten zeigen, dass die Bindungskapazität von Natalizumab bei TREG signifikant
schwächer ist und TREG weniger VLA-4 exprimieren als FoxP3- T-Zellen. Diese Ergebnisse fanden sich jedoch sowohl im Blut von RR-MS Patienten, als auch
bei gesunden Kontrollen (Stenner u. a. 2008). Allerdings untersuchte die Studie
kein Liquormaterial und beinhaltete keine Patienten mit CIS. Eine spätere Studie aus der selben Arbeitsgruppe konnte nachweisen, dass TREG konstitutiv
eine höhere Zellmotilität über die BHS in vitro unter nicht-inflammatorischen
Bedingungen aufweisen, als CD4+ FoxP3- Effektorzellen. Es zeigte sich eine Akkumulation der TREG in oder auf einer in vitro kultivierten Endothelschicht,
was hinweisend auf einen Vorteil in der Initiierung der frühen Schritte der Diapedese über die BHS ist. TREG von Patienten mit RR-MS wiesen eine reduzierte
1.4. Ableitung der Fragestellung
23
Fähigkeit zur Diapedese auf verglichen mit gesunden Kontrollen. Die Autoren
schlußfolgerten, dass die gesteigerte Migratonsfähigkeit der TREG unter physiologischen Bedingungen zum Erhalt der Immunhomöostase und eines regulatorischen Equilibriums im ZNS beiträgt. Die beeinträchtige Migrationsfähigkeit bei
Patienten mit MS ist hinweisend auf zusätzliche Aspekte in der Pathophysiologie der TREG neben einer gestörten Effektorfunktion und könnte zur Bildung
früher ZNS-Läsionen beitragen (Schneider-Hohendorf u. a. 2010).
1.4. Ableitung der Fragestellung
Aktuelle Hypothesen zur Immunpathogenese der MS beinhalten als zelluläre
Komponente u. a. die Involvierung von regulatorischen T-Zellen, CD4+/CD8+
T-Zellen, Makrophagen und B-Zellen im ZNS. Autoreaktive T-Zellen aus der
Peripherie wandern ins ZNS ein, treffen dort auf ihr Antigen und sind für
die neuroinflammatorische Reaktion verantwortlich, die über humorale und
zelluläre Immunreaktion zu Myelin- und Axonschaden führt (Bhat, Steinman
2009). Dabei spielt die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase über die
Blut-Hirn-Schranke und die Blut-CSF-Schranke eine entscheidende Rolle (Engelhardt 2010), auch über quantitative Unterschiede einzelner Zellpopulationen
im CSF und PBL wurde bei Patienten mit definitiver MS berichtet (Feger
u. a. 2007a; Venken u. a. 2008a; Lee-Chang u. a. 2011). Das MRT als Surrogatparamter für entzündliche Aktivität erlaubt dabei eine Quantifizierung und
Objektivierung zerebraler Entzündung, gemessen an Läsionslast und Anzahl
T2 -hyperintenser Läsionen (Fisniku u. a. 2008).
Diese Studie geht der Fragestellung nach, ob eine Dysbalance zwischen Blutund Liquorkompartiment bestimmter Immunzelltypen bei Patienten mit CIS im
Vergleich zu gesunden Kontrollen besteht und ob das Ausmaß einer möglichen
Dysbalance mit dem Grad der zentralnervösen Entzündung, gemessen anhand
der Läsionslast im cMRT, korreliert. Die Darstellungsweise der Häufigkeiten
durch Quotienten (PBL/CSF) erlaubt dabei ein relatives (Un)-Gleichgewicht
zwischen dem Blut- und Liquorkompartiment zu erfassen und Hypothesen zur
Immunhomöostase aufzustellen und wurde schon von früheren Forschungsgruppen zur Charakterisierung einer gestörten Zellhomöostase eingesetzt (Kleine
u. a. 1999). Aktualität erlangt das Konzept der Dysbalance und Immunhomöostase durch gegenwärtige erfolgreiche Therapiestrategien, die eine Re-balancierung pro- und antientzündlicher Zellen z. B. durch Transfer regulatorischer
Zellen im Tierversuch (Stephens u. a. 2009) oder Beeinflussung der Diapedese
1.4. Ableitung der Fragestellung
24
von Leukozyten über die Blut-Hirn-Schranke (Horga, Tintoré 2010) erfolgreich
einsetzen.
Wir entschieden uns für eine Auswahl an immunphänotypischen Markern im
FACS für T-, B-, Plasma- und Memoryzellen und Makrophagen wie in Tabelle 2.1 auf Seite 30 beschrieben, weil die kombinierte quantitative Analyse dieser
Zellpopulationen möglicherweise Schlüsse auf ein für das CIS charakteristisches
Immunzellprofil und seine Verteilung über die Kompartimente erlaubt.
2. Material und Methoden
2.1. Patienten und Probanden
Die Studienkohorte setzt sich aus 46 Patienten mit CIS (CIS-I), 18 Patienten
mit MS und 25 gesunden Kontrollpersonen (KONTROLLE-I) zusammen. Die
Indikation zur Lumbalpunktion bei Patienten der Kontrollgruppe bestand aus
unklarem (Kopf)Schmerzsyndrom, Normaldruckhydrozephalus, Pseudotumor
cerebri, Verdacht auf Neuroborreliose und psychiatrischer Indikation. Durchflusszytometrisch wurden von allen Patienten Blut- und Liquorporoben in den
Färbungen I–V untersucht (siehe Tabelle 2.1 auf Seite 30). Nachdem sich in
Zwischenanalysen ein quantitativer Unterschied für CD25+ TREGs abzeichnete, wurde das Antikörperpanel um eine weitere Färbung mit CD25 und CD49d
erweitert. Um genügend Zellmaterial an CD25high CD49d+ Zellen im FACS einsetzen zu können, wurde auf das bisherige Panel der Färbungen I–V in einer
zweiten Kohorte verzichtet. Diese VLA-4 Kohorte setzt sich aus n = 18 (CIS-II)
und n = 18 (KONTROLLE-II) Patienten zusammen, für die nur Färbung VI
vorliegt. Es galten die selben Einschlusskriterien wie für die Kohorten CIS-I,
MS-I und KONTROLLE-I.
Neben kranialer Magnetresonanztomografie nach standardisiertem Protokoll
(T2 Fast-spin-echo, T1 Spin-Echo, FLAIR, Protonendichtewichtung + T2 Fastspin-echo, T1 Spin-echo + Kontrastmittel, siehe Abschnitt 2.5 auf Seite 36),
Liquor- und Venenpunktion wurde von allen Patienten mit CIS bei Diagnosestellung und als Follow-up nach einem Jahr der EDSS-Score von zertifizierten EDSS-Untersuchern (Expanded Disability Status Scale, EDSS, L. Kappos,
CH-4031 Basel, Schweiz, siehe http://www.neurostatus.net/index.php) erhoben.
Die Patientenrekrutierung begann im Jahr 2007 und endete im Jahr 2010.
Retrospektiv wurden alle Patienten eingeschlossen, welche die Einschlusskriterien erfüllten. Somit datieren die stationären Aufenthalte der Patienten aus den
Jahren 2005 bis 2010. Einschlusskriterien für die Kohorte der CIS-Patienten
waren folgende:
25
2.1. Patienten und Probanden
26
Auftreten eines ersten fokal-neurologischen Defizits wie z. B. einer Opti-
kusneuritis, welches nicht durch andere Krankheiten erklärt werden kann
und mindestens für 24 Stunden persistiert
Objektivierbarkeit des Defizits im Krankenhaus, z. B. durch eine klini-
sche Untersuchung mit Erhebung des EDSS-Scores oder Elektrophysiologie (anamnestische Defizite wurden nicht berücksichtigt)
Fehlen einer anderen entzündlichen (chronischen) demyelinisierenden ZNS-
Erkrankung
Keine Einnahme immunmodulatorischer Medikamente, wie z. B. Cortison
oder Interferone
Liquor- und Venenpunktion zum Zeitpunkt der Diagnosestellung
Zeitnahes cMRT nicht später als 90 Tage nach der Punktion in der neu-
roradiologischen Abteilung der Uniklinik Marburg mit MS-Programm“,
”
bestehend aus Protonenwichtung, FLAIR-Sequenz, T1 und T2 -Wichtung.
Einschlusskriterien für die Kohorte der gesunden Kontrollpersonen waren folgende:
Fehlen einer zentral-neurologischen Erkrankung (z. B. Morbus Parkinson,
Schlaganfall, Gehirntumor, Meningitis) oder peripher-entzündlichen Erkrankung
Keine Einnahme einer immunmodulatorischen Therapie, wie z. B. Corti-
son oder Interferone
Liquorpunktion und Venenpunktion zum Zeitpunkt der Diagnosestellung
Alle Patienten wurden aus dem MS-Zentrum der Neurologischen Universitätsklinik Marburg rekrutiert, es wurden keine Daten aus Drittlaboren oder von
niedergelassenen Ärzten verwendet. Die Liquor- und Venenpunktion sowie das
cMRT und auch die klinische Untersuchung mit Erhebung des EDSS waren
regulärer Bestandteil der diagnostischen Routine im Krankenhaus, somit wurden ausschliesslich Restproben im FACS verwertet und die Patienten keiner
zusätzlichen paraklinischen Diagnostik unterzogen.
Die Studie wurde von der Ethikkommission des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg geprüft (positives Ethikvotum vom 23.10.2000, Studie
126/00, liegt vor).
2.2. Skalen, Definitionen und Material
27
2.2. Skalen, Definitionen und Material
2.2.1. Expanded Disability Status Scale Score (EDSS)
Zur Erfassung der körperlichen Beeinträchtigung durch MS wurde eine von
Kappos (L. Kappos, Department of Neurology, University Hospitals, CH-4031
Basel, Version 11/99) leicht modifizierte Version des etablierten EDSS-Scores
(Kurtzke 1983) benutzt. Dieser beruht auf einer standardisierten neurologischen
Untersuchung, mit der sich anhand von Beurteilung in acht Funktionssystemen
ein nominaler Scorewert von eins bis zehn in Schritten von jeweils einem halben
Punktwert ableiten lässt. Es werden die Ergebnisse der neurologischen Untersuchung in den Bereichen Optik, Hirnstamm, Motorik, Cerebellum, Sensibilität,
Blasen- und Mastdarmfunktion, mentaler Status und Gehstrecke berücksichtigt
und in Schweregrade unterteilt. Aus den Graden errechnet sich nach einem standardisierten Verfahren der EDSS-Score. Dabei bedeutet ein EDSS < 4,0 eine
weitgehend uneingeschränkte Gehstrecke, während Patienten mit einem EDSS
> 4,0 abhängig von der Gehstrecke weiter differenziert werden. Ab einem Punktwert von 7,0 ist der Patient auf einen Rollstuhl angewiesen, ab einem Wert von
8,5 überwiegend bettlägerig. Ein Wert von 10 bedeutet den Tod durch MS. Für
eine detailliertere Beschreibung und eine Kopie des in dieser Studie verwendeten Erfassungsbogens siehe Tabelle A.1 auf Seite 91 im Anhang. Ein EDSS
Score von 0–3 nach 10 Jahren weist auf eine langsam progrediente Erkrankung,
hin wie sie bei ca. 20 % der Patienten mit MS nach 10 Jahren Krankheitsdauer
vorliegt (Hawkins, McDonnell 1999).
2.2.2. Die Diagnosekriterien nach McDonald
Die Diagnose MS“ ist eine klinische Diagnose, wobei nach Ausschluß aller an”
deren in Frage kommenden demyelinisierenden Erkrankungen die topische und
zeitliche Dissemination der Entmarkung ausschlaggebend ist. Für die Diagnosestellung der in dieser Studie eingeschlossenen Patienten wurden die im Jahr
2001 von der internationalen Expertenkommission zur MS-Diagnostik erstellten
und 2005 und 2011 von Polman revidierten McDonald-Kriterien berücksichtigt
(McDonald u. a. 2001; Polman u. a. 2005; Polman u. a. 2011). Räumliche Dissemination bei CIS wurde nach Korteweg u. a. (2009) anhand einer klinischen
Untersuchung und eines initialen cMRT diagnostiziert. Für eine detailliertere
Darstellung siehe auch Tabelle A.2 auf Seite 92 im Anhang.
2.3. Probenasservierung
28
2.2.3. Geräte und Verbrauchsmaterialien
Die verwendeten Geräte, Verbrauchsmaterialien und eingesetzten Computerprogramme sind in Tabelle A auf Seite 94 aufgeführt.
2.3. Probenasservierung
2.3.1. Gewinnung von mononukleären Zellen aus peripher-venösem
Blut
Zur Gewinnung mononukleären Zellen (PBMCs, peripheral blood mononuclear cells = T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Makrophagen, Monozyten) wurde
das synthetische Polysaccharid BICOLL® (Eine Separationssolution mit einer Dichte von ρ=1,077 g/ml) verwendet: Peripher-venöses EDTA-Blut wurde im Verhältnis 1:1 mit PBS (phosphate buffer saline, Phosphatgepufferte
NaCl-Lösung) in einer 50 ml Greiner-Tube verdünnt und über 10 ml sterilem BICOLL® mit einer 10 ml Pipette geschichtet. Aufgrund der geringeren
Dichte im Vergleich zum Trennmedium, bzw. der höheren Dichte im Vergleich
zum Serum sammeln sich die PBMCs in einer Zwischenphase (Interphase), getrennt von den restlichen zellulären Blutbestandteilen und dem Serum. Nach
35 minütiger Zentrifugation bei 1500 U/Minute ohne Bremse und maximaler
Auslaufzeit (verhindert die erneute Vermischung der eben getrennten Phasen)
wurde der Überstand abgehoben, der oberhalb des Bicollpaques befindliche
Ring bestehend aus PBMCs abgeschöpft und in ein neues 50 ml Greiner-Tube
überführt. Nach mehrmaligem Waschen (Resuspension mit 30 ml 4°C kaltem
PBS, Zentrifugieren bei 1500 U/Minute für 12 Minuten bei 20°C mit Bremse,
Verwerfen des Überstandes) erfolgte die Resuspension mit 20 ml RPMI (ein natives Kulturmedium). Aufgrund der Zytotoxizität des BICOLL® (es ist mit
über 40 % Zellverlust zu rechnen) wurde darauf geachtet, möglichst wenig in
das neue Röhrchen mit zu überführen. Die Zahl der PBMCs wurde anschliessend mit Hilfe einer Fuchs-Rosenthal Zählkammer (siehe Abb.2.1 auf Seite
29) unter Verwendung von 4 %igem Tryptanblau bestimmt und die bicolysierte
Blutprobe ggf. kryoasserviert. Zunächst wurden hierzu die Zellen im Verhältnis
1:1 mit Tryptanblau versetzt. Durch ansetzen der Pipettenspitze an der Kante
zwischen Deckglas und Kammerboden wurde die Zellsuspension befüllt, durch
Kapillarwirkung füllt sich der Spalt ohne Bildung von Luftblasen. Anschließend
werden alle Quadrate mäanderförmig in Doppelbestimmung (Auszählen beider
Zählnetze mit Bildung des Mittelwerts) ausgezählt und die Zahl der PBMCs
2.3. Probenasservierung
29
Abbildung 2.1.:
Schematische Abbildung einer Fuchs-Rosenthal Zählkammer. Für die Zellzählung
im Liquor wird am häufigsten die Fuchs-Rosenthal Kammer verwendet. Es wird die gesamte Fläche, die 16 x 16 Großquadrate aufweist, ausgezählt. Diese Zählkammer unterscheidet sich von den üblichen Kammern zur Blutzellenzählung nicht nur durch den größeren
Flächeninhalt (16 mm2 ), sondern auch durch die größere Kammertiefe (0,2 mm) und damit
größeren Rauminhalt (3,2 ml). Bildquelle: http://www.zaehlkammer.de/deutsch/fuchs.
rosenthal.html
nach folgender Formel bestimmt:
ausgez. Zellen
= Zellen pro ml Blut
ausgez. Fläche (mm2 ) x Tiefe (mm) x Verdünnung ml Blut
Als Verdünnung durch das Tryptanblau gilt in diesem Fall ein Verhältnis von 1:2.
2.3.2. Kryoasservierung von PBMCs
Zur Asservierung bei -140°C wurden die Zellen zentrifugiert (10 Minuten bei
1200 U/Minute), in 800 µl CTM aufgenommen und bei Kühlung auf Eis in Kryoröhrchen überführt. Anschliessend wurden 800 µl steril filtrierte Einfrierlösung
(20 % DMSO, 80 % FCS) langsam hinzu gegeben. Die Röhrchen wurden anschliessend in speziellen Nalgene®-Einfrierboxen zunächst über Nacht bei -80°C
eingefroren und am darauf folgenden Tag auf -140°C heruntergekühlt.
2.3.3. Kryoasservierung von Liquor
Zur Asservierung der Zellen des Liquor cerebrospinalis wurde die Probe (optimalerweise mindestens 15 ml für eine ausreichende Zellzahl) bei 1200 U/Minute
2.4. Durchflusszytometrie (FACS)
30
für zehn Minuten abzentrifugiert. Nach Abwurf des Überstandes wurde sie mit
500 µl RPMI 1640 und 500 µl Kryomedium (Exothermes Medium, bestehend
aus 50 % FCS, 30 % RPMI und 20 % DMSO) versetzt und in ein 20 ml KryoRöhrchen überführt. In einer Einfrierbox wurde die Probe über Nacht bei -80°C
auf Propanol tiefgefroren und anschliessend bei -140°C gelagert.
2.4. Durchflusszytometrie (FACS)
Tabelle 2.1.:
Antikörperpanels und untersuchte Zellpopulationen. Ein +“ bedeutet die Expri”
mation der jeweiligen Zellpopulation für das CD-Molekül, gegen das der Antikörper gerichtet ist. Für eine tabellarische Darstellung der Klone und Firmen siehe Tabelle A auf
Seite 94
Färbung I
Antikörperpanel
Untersuchte Zellpopulation
CD3 (PerCP), CD4 (FITC), CD8
CD4+ CD25high TREGs
(APC), CD25 (PE)
Färbung II
Färbung III
CD3 (PerCP), CD4 (APC), CD8
CD4+ CD28+ T-Zellen
(FITC), CD28 (PE)
CD8+ CD28+ T-Zellen
CD4 (PerCP), CD19 (APC), CD27
CD19+ B-Zellen
(FITC), CD138 (PE)
CD19- CD138+ Plasmazellen
CD19+ CD27+ Memory B-Zellen
CD4+ CD27+ Memory B-Zellen
CD4+ CD27- Memory B-Zellen
Färbung IV
CD4
(APC),
CD8
(PerCP),
CD45RA (PE), CD62L (FITC)
CD4+ CD45RA+ CD62L+
Thymusemigranten
CD8+ CD45RA +CD62L+
Thymusemigranten
Färbung V
CD3 (PerCP), CD14 (FITC), CD16
CD14+ CD16- Monozyten
(PerCP), CD20 (APC),
CD14- CD16+ Monozyten
CD14+ CD16+ Monozyten
Färbung VI
CD3 (PerCP), CD4 (APC), CD25
CD4+ CD25high CD49d+ TREGs
(FITC), CD49d (PE)
CD4+ CD25med CD49d+ TREGs
CD4+ CD25low CD49d+ TREGs
Im FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting; Durchflusszytometrie) können
Zellen anhand ihrer spezifischen Größe, Struktur, Oberflächenbeschaffenheit
und intrazellulären Struktur unterschieden und gezählt werden. Die Durchflusszytometrie quantifiziert dabei im Vergleich zur Mikroskopie simultan mehrere
optische Eigenschaften (Parameter) kompletter Zellen mit hoher Durchsatzra-
2.4. Durchflusszytometrie (FACS)
31
Abbildung 2.3.:
FACS: Vollblutprobe im FSC/SSC Dotplot.
Im FSC/SSC Dotplot lassen sich folgende ZellpopuAbbildung 2.2.:
Hydrodynamische Fokussierung in der Messküvette. Abb.: BD Bios-
lationen erkennen, wenn man die Zellen nach Granularität und Größe trennt: Granulozyten, Monozyten und Makrophagen, Lymphozyten und Zelldebris. Abb.: Eigene Grafik
ciences
te, indem diese nach Markierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Fluorochrom)
an einem Laserstrahl vorbeigeleitet werden. Passieren die suspendierten Einzelzellen den Laserstrahl, senden sie dabei in Abhängigkeit vom Zelltyp und der
Probenvorbereitung charakteristische Lichtsignale aus, die mittels geeigneter
Detektoren nachgewiesen werden. Dabei entsteht zum einen Streulicht, welches
als Vorwärts- (Forwardscatter, FSC) sowie Seitwärtsstreulicht (Sidewardscatter, SCC) Aussagen über folgende Zellparameter erlaubt:
Ihre relative Größe (im Vorwärtsstreulicht)
Ihre relative Granularität (im Seitwärtsstreulicht)
Ihre spezifische Fluoreszenz (FL1, FL2, FL3, FL4 . . . ) und die entspre-
chende relative Fluoreszenzintensität
Der Einsatz mehrerer verschiedener Fluorochrome erlaubt anhand ihres spezifischen Absorptions- und Emissionsspektrums und der Zuordnung zu oberflächenspezifischen monoklonalen Antikörpern eine Bestimmung verschiedener
Zellcharakteristika (Zellpopulationen, siehe Abbildung 2.3 auf Seite 31). Die relative Fluoreszenzintensität ist dabei direkt proportional zur Menge der über
Antikörper gebundenen Fluorochrommoleküle. Zur Beschleunigung und Erzeugung eines laminaren Stroms aus Zellen erfolgt in der Messküvette eine Reduzierung des Querschnitts (hydrodynamische Fokussierung, siehe Abbildung 2.2
auf Seite 31). Für eine Übersicht der durchgeführten Färbungen, der dabei verwendeten Antikörper und der untersuchten Zellpopulationen siehe Tabelle 2.1
auf Seite 30.
2.4. Durchflusszytometrie (FACS)
32
2.4.1. Färbung von peripherem Blut
Sich an publizierten Methoden orientierend (Tackenberg u. a. 2007), wurde das
peripher-venöse Blut nach Aufbereitung (siehe 2.3.1 auf Seite 28) wie im folgenden dargestellt für die FACS-Analyse bearbeitet: Nach 1:1 Verdünnung mit
PBS wurden jeweils 200 µl EDTA-versetztes Blut pro Well auf eine 96-wellRundboden-Mikrotiterplatte gegeben. Die Platte wurde anschliessend für vier
Minuten bei 1200 U/Minute und 10°C zentrifugiert, der Überstand verworfen
und die Platte z.B. mit Zellstoff getrocknet. Danach erfolgte die Färbung der
im Rundboden verbliebenen Blutzellen mit je 5 µl pro Well des spezifischen
Antikörperpanels. Nach sorgfältiger Resuspension mit einer Mehrkanalpipette wurde die Platte für 25 Minuten auf Eis in Dunkelheit inkubiert. Das Mischungsverhältnis der Antikörper war abhängig vom fluoreszierenden Farbstoff,
mit dem der Antikörper gekoppelt, war und betrug PerCP(1 Teil): APC(1 Teil):
PE(1,5 Teile):FITC(1,5 Teile). Die unter allen Zellen noch verbliebenen Erythrozyten wurden zweimal mit je 180 µl Erythrozytenlyse (PharMingen Lyse; Ammoniumchloridlösung zu Aqua dest. im Verhältnis 1:10) lysiert und im
Anschluß für zehn Minuten im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert. Nach
vierminütiger Zentrifugation bei 1200 U/Minute und Abwurf des Überstandes
wurden die Wells mit einer Waschlösung (4°C kaltes PBS mit 2,5 Fetal Calf
Serum [FCS]) einmal gewaschen und erneut für vier Minuten zentrifugiert. Im
letzten Schritt wurden die jetzt gefärbten Zellen in 200 µl CellWash® Lösung
resuspendiert, in 5 ml Falcon-Röhrchen überführt und am Durchflusszytometer
mittels CellQuest® Software quantifiziert. Weisse Blutzellen können am Zytometer durch die charakteristische Verteilung der Werte für SSC/FSC (Granularitat/Zellgrösse) identifiziert und entsprechend der Verwendung der monoklonalen AK weiter spezifiziert werden. Aus statistischen Gründen bedarf es hierbei
einer Mindestmenge von ca. 5000 Lymphozyten pro Messung (Tackenberg u. a.
2007).
2.4.2. Färbung von Liquor
Die Aufbereitung der Zellen im Liquor für die FACS-Analyse unterscheidet sich
nicht grundlegend von der Aufbereitung der Blutzellen: 15 ml Liquor wurden für
10 Minuten bei 1200 U/Minute abzentrifugiert, der Überstand abgehoben und
das Sediment auf dem Schüttler gelockert. Ohne Verdünnung erhielt jedes Well
der 96-well-Rundboden-Mikrotiterplatte 25 µl der Zellen und je 5 µl des spezifischen Antikörperpanels (Siehe Tabelle 2.1 auf Seite 30), anschliessend gab man
2.4. Durchflusszytometrie (FACS)
33
die Platte im Dunklen für 25 Minuten auf Eis. Nach Ablauf der Zeit wurden
die wells mit je 150 µl Cellwash oder Waschlösung (siehe Abschnitt 2.4.1 auf
Seite 32) beschickt und resuspensiert, für vier Minuten bei 1200 U/Minute abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Dieser Waschvorgang wurde zweibis dreimal wiederholt. Zur Analyse im FACS-Gerät wurden die Zellen abpipettiert und in ein Falcon-Röhrchen überführt.
2.4.3. Auswertung im FACS
Abbildung 2.4.:
Identifikation von CD25high TREG. Links: Es ist deutlich eine CD25high Population
zu erkennen, die sich von einer CD25med und einer CD25low Population unterscheidet.
Rechts: Färbung der TREG mit CD49d und Darstellung der MFI. Ein Marker selektiert
den Peak der VLA-4 Intensität. Abb.: Eigene Grafik
In dieser Arbeit wurden die durch Venenpunktion gewonnen PBMCs und
der Liquor cerebrospinalis aller Probanden durchflusszytometrisch untersucht.
In die statistische Berechnung ging sowohl die Zellzahl einer bestimmten Zellpopulation als Absolutwert, wie auch das Verhältnis der Zellen in Blut und Liquor
(Quotient QP BL:CSF ) ein. Dabei wurde der relative Anteil der speziellen Population an T-Zellen, B-Zellen oder Monozyten für Blut und Liquor getrennt
bestimmt und anschliessend daraus der Quotient gebildet (siehe Abbildung 2.5
auf Seite 34). Somit lässt sich ein bestehendes relatives Ungleichgewicht der
Zellen über die humoralen Kompartimente Blut und Liquor quantifizieren. Für
die Angabe der Prozentwerte bei der Berechnung der Quotienten gilt, dass die
Bezugspopulation für B-Zellen jeweils alle Lymphozyten“, für T-Zellen alle
”
”
CD4+ bzw. CD8+ Lymphozyten“ und für Monozyten und Makrophagen alle
”
2.4. Durchflusszytometrie (FACS)
34
Abbildung 2.5.:
Berechnung des Quotienten QP BL:CSF am Beispiel der Färbung I. Linke Reihe
PBL, rechte Reihe CSF. Im FSC/SSC Dotplot (erste Bildreihe) wurden die Lymphozyten
ausgewählt und hinsichtlich ihrer Exprimierung von CD3 und CD4 weiter differenziert
(zweite Bildreihe). Im letzten Schritt wurden die CD25high positiven Zellen sondiert und
ihr prozentualer Anteil an allen CD4 positiven Zellen errechnet. Aus den beiden Anteilen
in Blut und Liquor berechnet sich anschliessen der Quotient QP BL:CSF .
PBMCs“ ist. Die Angabe 5,6 % CD4+CD25+ Zellen“ liest sich also 5,6 % al”
”
ler CD4+ Zellen waren CD25+“. Die Quotienten errechneten sich immer nach
der Formel
P rozentwertP BL
P rozentwertCSF .
In Färbung I wurden CD4+ CD25high TREG untersucht. Im FSC/SSC Dotplot wurden alle Lymphozyten erfasst, R2 beinhaltete CD3+ CD4+ Zellen. R3
umfasste CD4+ CD25high Lymphozyten. Färbung VI untersuchte die mittlere
Fluoreszenzintensität (MFI) der TREG. R1–R3 war identisch mit Färbung I.
Zusätzlich wurden die TREG mit CD49d gefärbt und die MFI aller Zellen berechnet. Die gleiche Analyse wurde für CD25med mit mittelstarker Expression
von CD25 und CD25low mit schwacher Expression von CD25 durchgeführt (siehe Abbildung 2.4 auf Seite 33). Für eine Übersicht der Färbungen im FACS
siehe Abbildung 2.6 auf Seite 35.
2.4. Durchflusszytometrie (FACS)
35
Abbildung 2.6.:
Übersicht der Lymphozytensubpopulationen im FACS. A1, A2 (CD28): Im
FSC/ SSC Dotplot wurden alle Lymphozyten einbezogen. In R2 wurden CD3+ CD4+ und
CD3+ CD4- ( = CD8+) Zellen identifiziert (A1). Im 3. Gate lassen sich CD28+ Lymphozyten abgrenzen (A2). B1, B2 (Thymusemigranten): Im FSC/SSC Dotplot wurden
alle Lymphozyten erfasst, das zweite Gate wurde auf CD4+ bzw. CD8+ Zellen gelegt.
In R3 lassen sich CD4+ CD45RA+ CD62L+ und CD8+ CD45RA+ CD62L+ Lymphozyten
abgrenzen. C1, C2, C3, C4 (B-Zellreihe): Im FSC/SSC Dotplot wurden alle Lymphozyten erfasst, R2 enthielt alle CD4- CD19+ Zellen (C1). Es sind deutlich Populationen für
CD19 und CD27 zu erkennen (C2). In R3 lassen sich CD19 CD27+ Memory B-Zellen abgrenzen (C3). Für Plasmazellen umfasste R2 alle CD4- CD19- Zellen, in R3 wurden CD138+
Plasmazellen identifiziert (nicht dargestellt). Für T-Zellen lag R2 auf CD19- CD4+ Zellen,
in R3 wurden dann CD27+ Memory-T und CD27- Effektor T-Zellen unterschieden (C4).
D1, D2 (Monozyten): Im FSC/SSC Dotplot wurden alle mononukleären Zellen erfasst.
R2 lag auf CD3- CD20- Non-B-non-T-Zellen (D1). In R3 wurden die verschiedenen Monozytensubpopulationen analysiert (D4). Abb.: Eigene Grafik
2.5. Magnetresonanztomografie
36
2.5. Magnetresonanztomografie
Abbildung 2.7.:
MS-Läsionen in verschiedenen MRT-Wichtungen. Links: Zwei periventrikuläre
Läsionen einer Patientin mit CIS im T1 -gewichteten MRT. Rechts: Volumetrische Bestimmung der Läsionslast in Protonenwichtung bei der selben Patientin. Sämtliche Läsionen
wurden mithilfe eines Werkzeugs in der Workstation für jede Schicht separat manuell umfahren um die kumulative Läsionslast in mm2 zu erhalten (unten rechts). Zur Errechnung
der kumulierten Läsionslast über alle Schichten wurden die EInzelläsionen addiert und mit
dem Faktor 6,6 mm multipliziert. Zu erkennen ist ausserdem das perifokale Ödem. Abbildung: eigene Grafik
Als Meßgerät diente ein Kernspintomograf der Firma General Electrics Healthcare (Signa Horizon) mit 1,5 Tesla Feldstärke. Folgenden Sequenzen und
Parametern wurden bei Patienten mit CIS und MS gemessen:
Sag. T2 Fast-spin-echo (TE 85 ms, TR 3000 ms, FOV 24 cm, Frequenz 320,
Phase 256, Schichtdicke 3 mm, gap 10 %)
Ax. T1 Spin-Echo (TE Min Full, TR 475 ms, FOV 24 cm, Frequenz 320,
Phase 224, Schichtdicke 6 mm, gap 10 %)
Ax. FLAIR (TE 80 ms, TR 10000, FOV 24 cm, Frequenz 256, Phase 192,
Schichtdicke 6 mm, gap 10 %)
Ax. Protonendichtewichtung + T2 Fast-spin-echo (TE 25 ms, TR 3250 ms,
FOV 24 cm, Frequenz 320, Phase 256, Schichtdicke 6 mm, gap 10 %)
Ax. T1 Spin-echo + Kontrastmittel (TE Min Full, TR 475 ms, FOV 24 cm,
Frequenz 320, Phase 224, Schichtdicke 6 mm, gap 10 %)
2.6. Biostatistische Methoden
37
Für die quantitative Analyse wurden in PD und T2 -Wichtung hyperintense Läsionen berücksichtig, wie in der Literatur beschrieben (CHAMPS Study
Group, 2002) . Die FLAIR-Sequenz diente als Suchsequenz für die Läsionen,
die eigentliche Volumetrie wurde in der Protonendichtewichtung (PD) mittels
des integrierten Werkzeuges der Advantage Workstation der Firma GE Healthcare durchgeführt. Die Software erlaubt es dabei, Schichtbilder in PD und
T2 -Wichtung simultan zu befunden um besser zwischen Läsionen und Liquor
diskriminieren zu können. Dabei wurden Läsionen ausgewertet, die sowohl in
der FLAIR, als auch in der PD-Sequenz erkennbar waren und manuell mithilfe
des integrierten Werkzeuges umfahren, um eine zweidimensionale Läsionsfläche
pro Schicht zu erhalten. Zur Quantifizierung der kumulativen Läsionslast wurden die gesamten Läsionsflächen in mm2 aller Läsionen und aller Schichten
in PD-Wichtung addiert und mit dem Faktor 6,6 mm multipliziert, um eine
bestmögliche Näherung für die Läsionslast in mm3 zu erhalten. Der Faktor
setzt sich aus 6mm Schichtdicke und einem nicht vom Scanner erfassten Zwischenraum von 10 % (sog. Gap) zusammen. In Abbildung 2.7 auf Seite 36 sind
exemplarisch zwei Läsionen in T1 -Wichtung und die volumetrische Bestimmung
in PD-Wichtung dargestellt.
In der Protonenwichtung lassen sich Läsionen durch den starken Kontrast der
Graustufen gut volumetrisch bestimmen. Die kumulative zerebrale Läsionslast
dient dabei der Quantifizierung und Objektivierung der entzündlichen Aktivität bei Patienten mit MS und dient als Surrogatmarker für die Evolution der
Krankheit (Brex u. a. 2002; Sormani u. a. 2009).
2.6. Biostatistische Methoden
Zur Überprüfung signifikanter Unterschiede zwischen der CIS, MS und Kontrollkohorte wurde der zweiseitige Mann-Whitney-U Test für unverbundene Stichproben benutzt. Die Korrelationsanalyse der Quotienten mit der Läsionslast erfolgte mittels dem bivariaten Korrelationskoeffizient Spearman´s rho. Die ROCAnalyse der Quotienten beinhaltete die Area under the curve“ als globaler
”
Paramter für die Güte der ROC sowie den p-Wert. Der optimale Cut-off wurde aus dem maximalen Produkt aus Sensitivität und Spezifität aller möglichen
Cutoffs bestimmt und entspricht in der grafischen Auftragung der Sensitivität
(Ordinate) gegen 1-Spezifität (Abszisse) dem Scheitelpunkt der Kurve. Die
ROC wurde nur bei signifikantem Unterschied der Quotienten durchgeführt. Bei
sämtlichen statistischen Vergleichen wurden zweiseitige Tests auf einem 5 %igen
2.6. Biostatistische Methoden
38
Signifikanzniveau durchgeführt, Konfidenzintervalle wurden auf dem 95 % Niveau als signifikant betrachtet. Wenn nötig, wurde die konservative BonferroniKorrektur für multiples Testen angewendet und der p-Wert entsprechend angeglichen. Für sämtliche statistische Auswertungen wurde SPSS®16.0 (Statistical Package for the Social Sciences) benutzt, für die Datenorganisation MS
Excel® 2007 und MS Word® 2007.
3. Ergebnisse
3.1. Patientenkollektiv
Insgesamt wurden 64 therapienaive Patienten mit CIS, 18 Patienten mit definitiver MS und 43 Patienten mit nicht-inflammatorischen neurologischen Krankheiten eingeschlossen und in insgesamt fünf Kohorten eingeteilt (CIS-I, CISII, MS, KONTROLLE-I, KONTROLLE-II). Die MS-Kohorte setzt sich aus 11
Patienten mit RR-MS, 6 mit SP-MS und einem mit PP-MS zusammen. Die
Liquorpunktion wurde im Durchschnitt mit 15 ± 28 Tagen Abstand zum MRT
durchgeführt. Oligoklonale Banden im Liquor fanden sich in 98,8 % der Patienten mit CIS und bei keinem Patient in der Kontrollkohorte.
Die mittlere Läsionslast im T2 -gewichteten cMRT aller CIS-Patienten lag bei
3 188 ± 7 452 mm3 . Insgesamt drei Patienten präsentierten sich mit initial unauffälligem MRT, die mittlere Läsionszahl betrug 17 ± 23. Es bestand kein signifikanter Unterschied zwischen den Kohorten CIS-I und CIS-II im Hinblick
auf Läsionsvolumen oder Anzahl der Läsionen (Daten nicht abgebildet).
Ein initialer EDSS lag von allen eingeschlossenen Patienten mit CIS und MS
vor. Der Median des initialen EDSS bei CIS lag bei 2,0. Der 1-Jahres FollowUp EDSS konnte von 50 (ca. 78 %) der Patienten mit CIS erhoben werden. Von
insgesamt 14 Patienten konnte kein Follow-up erhoben werden (lost to followup) oder ihr Studieneinschluss lag zeitlich zu nah am Studienende, sodass das
1-Jahres Intervall nicht eingehalten werden konnte.
Für eine umfassende Patientencharakteristik siehe Tabelle 3.1 auf Seite 40,
zum therapeutischen Vorgehen im Schub und Intervalltherapie Tabelle 3.2 auf
Seite 41.
39
n
Geschlecht
Alter
Jahre
n (f:m)
MW
CIS-I
46
35:11
MS
18
13:05
Kontrolle-I
25
15:10
VLA-4 Kohorte
CIS-II
18
13:5
Kontrolle-II
18
06:12
Zellen
± SD, MW ± SD,
range
Studienkohorte
CSF
± 9,7
52]
37 ± 11,3
[1856]
49 ± 16,5
[1974]
± 13
66]
10 ± 8
[131]
3±1
[15]
31
15
[2
± 8,8
[1848]
44 ± 13,4
[2266]
OKB
Beginn
n, %
Klinik
FU
MW
PI
ON
S
± SD, range
B
Multifokal
P
O
n, %
n,%
range
[17
35
EDSS
± 16
[373]
3±1
[15]
1
45, 98
± 1,0
6]
2,8 ± 1,4
[16]
± 1,3
6]
1,8 ± 1,0
[03,5]
± 1,1
2]
0,3 ± 1,4
[-3,01,8]
n.a.
n.a.
2,4
[1
17, 94
0, 0
18, 100
0, 0
± 0,81
[14]
2,5
n.a.
1,8
[0
± 0,93
[03]
1,8
n. a.
0,5
14, 30
23, 50
8, 17
9, 20
12, 26
13, 28
4, 22
9, 50
1, 7
2, 11
2, 11
0, 0
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
± 1,9
[-5,00,0]
1, 7
10, 57
6, 33
3, 17
4, 22
3, 17
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
[-3,5
2,5
Tabelle 3.1.:
Patientencharakteristik. Das Patientenkollektiv gliedert sich in die Studienkohorte mit insgesamt n = 89 und die VLA-4 Kohorte mit insgesamt n = 36 Probanden. Für Einzelheiten siehe Abschnitt 3.1 auf Seite 39, zur erhaltenen Therapie siehe Tabelle 3.2 auf Seite 41. Der EDSS Wert wurde bei Krankheitsbeginn
und als 1-Jahres Follow-Up (FU) erhoben. Für Patienten, bei denen kein Follow-Up vorlag oder die innerhalb des letzten Jahres vor Studienende eingeschlossen wurden, wurde der Progressionsindex (PI) berechnet. Es sind Doppelnennung bei Prozentangaben unter Klinik“ möglich. ON = Optikusneuritis,
”
S = Sensibilitätsstörungen, B = Bulbäre Symptome, P = Paresen, O = Andere
3.2. Färbung I: regulatorische T-Zellen (CD25high )
41
Tabelle 3.2.:
Patientencharakteristik
–
Therapie. In der Summe der Prozentwerte sind
Abweichungen von 100 % rundungsbedingt. Plasm = Plasmapherese, IF = Interferone,
Glat = Glatirameracetat, Nata = Natalizumab, Mitox = Mitoxantron
n
Therapie
Im Schub
keine
Intervalltherapie
keine
IF
Glat
Nata
Mitox
n, %
Steroide Plasma
n, %
n, %
n, %
n, %
n, %
n, %
n, %
Studienkohorte
CIS-I
46
7, 15
37, 80
2, 4
23, 50
18, 39
3, 7
2, 4
0, 0
MS
18
4, 22
14, 78
0, 0
9, 50
5, 28
2, 11
0, 0
2, 11
6, 33
12, 66
0, 0
9, 50
6, 33
1, 6
1, 6
0, 0
VLA-4 Kohorte
CIS-II
18
3.2. Färbung I: regulatorische T-Zellen (CD25high )
Es wurden die Häufigkeiten der TREG unter allen CD4+ Lymphozyten im peripheren Blut und Liquor berechnet und zueinander ins Verhältnis gesetzt. Der
für die Kohorten getrennt berechnete Quotient Q wurde untereinander verglichen, die Ergebnisse sind in Abbildung 3.1 auf Seite 42 und Tabelle 3.3 auf Seite 42 dargestellt. Es findet sich ein signifikanter Unterschied der Quotienten im
Vergleich der Kohorten CIS-I und KONTROLLE-I (p ≤ 0,001; Q = 1,6 ± 0,76 vs.
1,0 ± 0,78) mit einem größeren Quotienten in der CIS-Kohorte. Eine schwächere
Signifikanz lag für den Vergleich von MS und KONTROLLE-I vor (p = 0,014;
Q = 1,5 ± 1,02 vs. 1,0 ± 0,78). Diese Ergebnisse sind hinweisend auf ein Ungleichgewicht zwischen Blut- und Liquorkompartiment mit relativem Überwiegen der
TREG im peripheren Blut bei Patienten mit CIS und MS.
In der Korrelationsanalyse nach Spearman ergaben sich signifikante positive
Korrelationen in allen Stratifizierungen (keine, nach geringer Läsionslast und
nach EDSS Verbesserung im 1-Jahres FU). Die beste Korrelation konnte für
die Stratifizierung nach Läsionslast gezeigt werden (r = 0,68; p ≤ 0,001), die anderen Korrelationskoeffizienten waren mit 0,35 (keine Stratifizierung) bzw. 0,37
(EDSS Verbesserung) deutlich schwächer. Besonders für Patienten mit eher
milder zerebraler Läsionslast besteht somit ein positiver Zusammenhang zwischen Quotient und Läsionsvolumen. Je größer das Ungleichgewicht zwischen
3.2. Färbung I: regulatorische T-Zellen (CD25high )
42
Abbildung 3.1.:
Vergleich der Quotienten für CD25high im Boxplot. Signifikante Unterschiede der
Quotienten für den Vergleich der Kohorte CIS-I/MS mit KONTROLLE-I. Die Quotienten für CIS und MS sind erhöht und deuten auf ein relatives Überwiegen der TREG im
peripheren Blut im Vergleich zum Liquorkompartiment bei Patienten mit CIS und MS hin.
Tabelle 3.3.:
Deskriptive Statistik Färbung I. Dargestellt sind die prozentualen Anteile der CD25high
Zellen an allen CD4+ Lymphozyten, getrennt für Blut und Liquor sowie der Quotient
PBL/CSF. Angaben im Format MW
± SD, [range]. p = Vergleich von CIS-I:KONTROLLE-
I, p† = Vergleich von CIS-I:MS, p‡ = Vergleich von MS:KONTROLLE-I.
p
n
% PBL
% CSF
Quotient
p†
p‡
CD4+ CD25high
CIS-I
46
± 3,0
19]
8 ± 3,7
[418]
4 ± 2,0
[110]
6
[1
MS
16
KONTROLLE-I
25
± 1,8
9]
6 ± 3,2
[214]
6 ± 2,8
[111]
4
[0,5
± 0,76
4,3]
1,5 ± 1,02
[0,64,6]
1,0 ± 0,78
[0,24,7]
1,6
≤ .001
[0,4
NS
.014
3.2. Färbung I: regulatorische T-Zellen (CD25high )
43
Tabelle 3.4.:
Ergebnisse Färbung I. Dargestellt ist die Korrelationsanalyse des Quotienten mit der
Läsionslast im cMRT. Es liegt eine positive signifikante Korrelation vor, der größte Korrelationskoeffizient findet sich in der Stratifizierung für geringe Läsionslast (≤ 6 Läsionen,
p = 0,68). in der ROC finden sich für alle Stratifizierungen annähernd identische signifikantsignifikante AUC Werte und Sensitivitäten/spezifitäten. r = Korrelationskoeffizient nach
Spearman, AUC = Area under curve, Cut = errechneter Cut-off.
Stratifizierung
Korrelation
ROC
r
p
AUC
p
Cut Sens
Spez
PPV
NPV
LHR
keine
0,35
.007
0,79
≤ .001
1,1
0,76
0,81
0,70
3,19
≤ 6 Läsionen
0,68
≤ .001
0,77
≤ .001
1,1
0,76
0,76
0,69
0,82
3,19
EDSS
0,37
.016
0,81
≤ .001
1,1
0,79
0,76
0,77
0,78
3,30
CD4+ CD25high
0,76
Blut- und Liquorkompartiment mit relativem Überwiegen der TREG im peripheren Blut ist, desto größer ist die kraniale Läsionslast im initialen cMRT.
In der ROC zeigte sich eine durchgängig gute und signifikante AUC zwischen
0,76 und 0,79, was einer Sensitivität und Spezifität von ca. 0,76 entspricht. Die
Berechnung ergab einen Cut-off von 1,1 für den Quotienten. Werte oberhalb
des Cut-offs sprechen stärker für den positiven Ist-Zustand“, in diesem Fall
”
die Diagnose CIS“. Für die Berechnung wurden deshalb Patienten mit CIS
”
und einem Quotienten größer als 1,1 als richtig positiv“ zur Bemessung der
”
Testgütekriterien betrachtet, gesunde Kontrollpersonen mit einem Quotienten
kleiner 1,1 als richtig negativ“. Ein Quotient für TREG von 1,1 diskriminiert in
”
ca. 75 % der Fälle erfolgreich zwischen den Diagnosen CIS“ und kein CIS“. Bei
”
”
Betrachtung aller Patienten lag bei 81 % der Patienten mit einem Quotienten
größer als 1,1 tatsächlich ein CIS vor (positiv prädiktiver Wert, PPW), während
bei 70 % mit einem Quotienten kleiner als 1,1 tatsächlich kein CIS diagnostiziert
wurde (negativ prädiktiver Wert, NPW). Die Ergebnisse der Korrelationsanalyse und der ROC sind tabellarisch auf Seite 43 und in Abbildung 3.2 auf Seite 44
dargestellt. Die Bonferroni-Korrektur betrug für insgesamt neunfaches Testen
der TREG 0,05/9 = 0,0055. Deshalb wurde α = 0,55 % als signifikant betrachtet.
In CIS-II wurde die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für VLA-4 (CD49d)
in Abhängigkeit der Expression für CD25 untersucht. Sowohl im PBL als auch
im CSF wurde eine absteigende Tendenz der MFI mit steigender Expression von
CD25 beobachtet. Die größte MFI wurde bei CD4+ CD25low , die niedrigste für
CD4+ CD25high TREG gefunden. Insgesamt war die MFI im PBL signifikant
3.2. Färbung I: regulatorische T-Zellen (CD25high )
44
Abbildung 3.2.:
Korrelations- und ROC-Analyse für TREG. Links: Signifikante Korrelation nach
Spearman für CD4+ CD25high TREG, stratifiziert nach Läsionslast (≤ 6 Läsionen).
Je größer das Ungleichgewicht zwischen Blut- und Liquorkompartiment mit relativem
Überwiegen der TREG im peripheren Blut ist, desto größer ist die kraniale Läsionslast
im initialen cMRT. Rechts: Signifikante ROC für die selbe Zellpopulation in gleicher Stratifizierung.
Tabelle 3.5.:
Ergebnisse für VLA-4. Dargestellt sind mittlere Fluoreszenzintensitäten (MFI) für
VLA-4 der Kohorten CIS-II und KONTROLLE-II im PBL und CSF. Es zeigt sich eine
verminderte MFI für alle Expressionsniveaus von CD25 bei Patienten mit CIS. Angaben
im Format MW
± SD, [range]. p = Vergleich von CIS-II und KONTROLLE-II im PBL,
p† = Vergleich von CIS-II und KONTROLLE-II im CSF.
MFI PBL
CIS-II
CD25low
± 98
[48403]
229
KONTROLLE-II
± 65
286]
[65
± 65
286]
[70
CIS-II
.029
543
± 69
379]
.012
422
± 65
396]
.010
244
[130
CD25high
167
MFI CSF
± 139
[167726]
338
CD25med
185
p
232
[140
KONTROLLE-II
± 216
[92988]
715
± 145
678]
539
± 146
650]
489
[106
431
[107
p†
± 235
[3191 193]
.038
± 140
806]
.017
± 111
691]
NS
[281
[303
3.2. Färbung I: regulatorische T-Zellen (CD25high )
45
Abbildung 3.3.:
MFI für VLA-4 im PBL stratifiziert nach Expressionsniveau für CD25. Es finden sich
signifikante Unterschiede zwischen Patienten mit CIS und Kontrollen für CD25med und
CD25high CD4+ T-Zellen mit einem reduzierten Rezeptorbesatz für VLA-4 bei Patienten
mit CIS, CD25low ist knapp nicht signifikant. Transparent hinterlegt: CD4+ CD25low-high
TREG im FACS
.
niedriger als im CSF (Daten nicht gezeigt, p ≤ 0,001), siehe Abbildungen 3.3
und 3.4 auf Seite 45 und 46. Signifikante Unterschiede zwischen Patienten mit
CIS und Kontrollen wurden für CD4+ CD25med und CD4+ CD25high T-Zellen
im PBL gefunden, CD4+ CD25low verpasste Signifikanz knapp (p = 0,029). Im
CSF war das Ergebnis für CD4+ CD25med ebenfalls signifikant, auch hier war
CD4+ CD25low knapp nicht mehr signifikant (p = 0,038). Da die MFI ein indirektes Maß für die Bindungsfähigkeit eines Antikörpers über Rezeptoren auf
der Zelloberfläche darstellt, scheint also der Rezeptorbesatz für VLA-4 bei Patienten mit CIS auf allen CD4+ T-Zellen erniedrigt zu sein. Für eine detaillierte
Übersicht der MFI siehe Tabelle 3.5 auf Seite 44. Angepasst für die Testung von
je zwei Hypothesen für VLA-4 betrug die Bonferroni-Korrektur 0,05/2 = 0,025.
Daher wurde im Folgenden α = 2,5 % als statistisch signifikant betrachtet.
3.3. Färbung II: T-Zell Co-Rezeptor (CD28)
46
Abbildung 3.4.:
MFI für VLA-4 im CSF stratifiziert nach Expressionsniveau für CD25. Es finden sich
signifikante Unterschiede zwischen Patienten mit CIS und Kontrollen für CD4+ CD25med
T-Zellen mit einem reduzierten Rezeptorbesatz für VLA-4 bei Patienten mit CIS,
CD4+ CD25low verpasst knapp Signifikanz. Transparent hinterlegt: CD4+ CD25low-high
TREG im FACS.
3.3. Färbung II: T-Zell Co-Rezeptor (CD28)
Die prozentualen Anteile der CD28+ T-Lymphozyten an allen CD4+ bzw.
CD8+ Zellen wurden errechnet und jeweils der Quotient aus PBL und CSF
gebildet (siehe Tabelle 3.6 auf Seite 47 und Abbildung 3.5 auf Seite 48). Es
ergaben sich keine relevanten und signifikanten Unterschiede der Quotienten im
Vergleich der Kohorten CIS-I (1,0 ± 0,04 für CD4+ und 1,0 ± 0,5 für CD8), MS
(1,0 ± 0,05 für CD4 und 0,9 ± 0,3 für CD8) und KONTROLLE-I (1,0 ± 0,1 für
CD4 und 0,8 ± 0,3 für CD8). Diese Daten sprechen gegen das Vorliegen eines
relativen Ungleichgewichts im Blut- und Liquorkompartiment bei den Patientenkohorten.
In der Korrelationsanalyse nach Spearman ergaben sich keine Hinweise auf
eine Korrelation der Quotienten mit der kranialen Läsionslast in beiden Zellpopulationen und allen Stratifizierungen (siehe Tabelle 3.7 auf Seite 48). Es konnte
kein Zusammenhang zwischen der Verteilung der Zellen im PBL und CSF und
3.3. Färbung II: T-Zell Co-Rezeptor (CD28)
47
Tabelle 3.6.:
Deskriptive Statistik Färbung II. Dargestellt sind die prozentualen Anteile der CD28+
Zellen an allen CD4+ bzw. CD8+ Lymphozyten, getrennt für Blut und Liquor sowie
der Quotient PBL/CSF. Angaben im Format MW
± SD, [range]. p = Vergleich von CIS-
I:KONTROLLE-I, p† = Vergleich von CIS-I:MS, p‡ = Vergleich von MS:KONTROLLE-1.
p
n
% PBL
% CSF
Quotient
p†
p‡
CD4+ CD28+
CIS-I
45
± 3,6
99]
94 ± 4,6
[8298]
91 ± 8,1
[7099]
95
[84
MS
18
KONTROLLE-I
24
CD8+ CD28+
CIS-I
45
MS
18
KONTROLLE-I
24
± 15,3
[1488]
51 ± 12,3
[2769]
49 ± 15,5
[2172]
54
± 2,2
99]
93 ± 4,8
[8499]
89 ± 7,4
[6398]
95
[90
± 11,7
[3086]
56 ± 11,4
[2978]
60 ± 9,2
[4177]
61
± 0,04
1,0]
1,0 ± 0,05
[0,91,1]
1,0 ± 0,1
[0,71,2]
1,0
NS
[0,9
± 0,5
[0,32,7]
0,9 ± 0,3
[0,41,4]
0,8 ± 0,3
[0,31,6]
1,0
NS
NS
NS
NS
NS
der kranialen Läsionslast als Surrogatparameter für die Schwere der Erkrankung gezeigt werden. Auf eine ROC-Analyse wurde aufgrund des fehlenden
Unterschieds der Quotienten verzichtet. Angepasst für die Testung von sechs
Hypothesen pro untersuchter Zellpopulation betrug die Bonferroni-Korrektur
0,05/6 = 0,0083. Daher wurde im folgenden α = 0,83 % als statistisch signifikant
betrachtet.
3.3. Färbung II: T-Zell Co-Rezeptor (CD28)
48
Abbildung 3.5.:
Vergleich der Quotienten für CD28+ im Boxplot. Links: Boxplots für CD4+ CD28+
Zellen. Rechts: Boxplots für CD8+ CD28+ Zellen. Keine relevanten oder signifikanten Unterschiede in den Quotienten im Vergleich der Kohorte CIS-I, MS und gesunden Kontrollen
im zweiseitigen Mann-Whitney-U Test für unverbundene Stichproben. Es liegt kein Ungleichgewicht zwischen dem Blut- und Liquorkompartiment vor.
Tabelle 3.7.:
Ergebnisse Färbung II.Dargestellt ist die Korrelationsanalyse der Quotienten mit der
Läsionslast im cMRT. r = Korrelationskoeffizienten nach Spearman, AUC = Area under curve, Cut = errechnete Cut-off. Keine Korrelation in allen Stratifizierungen. Es konnte kein
Zusammenhang zwischen der Verteilung der Zellen im PBL und CSF und der kranialen
Läsionslast als Surrogatparameter für die Schwere der Erkrankung gefunden werden. Auf
die Durchführung der ROC wurde verzichtet.
Stratifizierung
Korrelation
ROC
r
p
AUC
keine
-0,3
NS
NA
≤ 6 Läsionen
0,1
NS
NA
EDSS
-0,1
NS
NA
keine
-0,2
NS
NA
≤ 6 Läsionen
0,0
NS
NA
EDSS
0,1
NS
NA
CD4+ CD28+
CD8+ CD28+
p
Cut
Sens
Spez
PPV
NPV
LHR
3.4. Färbung III: B-Zell-Reihe (CD27, CD138)
49
3.4. Färbung III: B-Zell-Reihe (CD27, CD138)
Abbildung 3.6.:
Vergleich der Quotienten für CD19+ im Boxplot. Links: Boxplots für reife B-Zellen.
Rechts: Boxplots für Memoryzellen. Signifikante Unterschiede der Quotienten im Vergleich
der Kohorten CIS-I/MS mit gesunden Kontrollen im zweiseitigen Mann-Whitney-U Test
für unverbundene Stichproben. Die erniedrigten Quotienten in den Patientenkohorten resultieren aus einem erhöhten Zellanteil im Liquor.
In Färbung III wurde Blut und Liquor auf reife B-Zellen (CD19+), MemoryB-Zellen (CD19+ CD27+), Plasmazellen (CD19- CD138+), Memory-T-Zellen
(CD4+ CD27+) und Effektor-T-Zellen (CD4+ CD27-) untersucht.
Die Quotienten und Prozentwerte sind in Tabelle 3.8 auf Seite 50 und Abbildung 3.6 auf Seite 49 dargestellt. Nach Bonferroni-Korrektur mit 0,05/6 = 0,0083
für multiples Testen der Quotienten und Korrelationen blieben als statistisch signifikant die p-Werte für reife B-Zellen und Memory B-Zellen (jeweils p ≤ 0,001).
Für reife B-Zellen lag der mittlere Quotient bei 4,9 ± 5,5 (CIS) und 14,4 ± 13,2
(Kontrolle), für Memory B-Zellen bei 1,8 ± 1,8 (CIS) und 6,1 ± 4,2 (Kontrolle). Die kleineren Quotienten in den Patientenkohorten resultieren aus einer
größeren Häufigkeit der Zellen im Liquor. Es fanden sich signifikant mehr CD19+
und CD19+ CD27+ Zellen im CSF von Patienten als in der Kontrollkohorte.Für
reife B-Zellen und Memory B-Zellen wurde im folgenden die ROC Auswertung
durchgeführt und die Bonferroni-Korrektur betrug für dreifach zusätzliche Testung 0,05/9 = 0,0055. Der p-Wert der Quotienten für Plasmazellen wurde nach
Bonferroni-Adjustierung als nicht signifikant betrachtet.
In der ROC für reife und Memory B-Zellen deuten kleinere Werte der Quotienten stärker auf den positiven Ist-Zustand hin, in diesem Fall die Diagnose
CIS. Das bedeutet, dass im folgenden Patienten mit einem Quotient kleiner
oder gleich als der errechnete Cut-off und der Diagnose CIS als richtig positiv“
”
3.4. Färbung III: B-Zell-Reihe (CD27, CD138)
50
Tabelle 3.8.:
Deskriptive Statistik Färbung III. Dargestellt sind Prozentwerte und Quotienten. Angaben im Format MW
± SD, [range]. p = Vergleich von CIS-I:KONTROLLE-I,
p† = Vergleich von CIS-I:MS, p‡ = Vergleich von MS:KONTROLLE-1.
p
n
% PBL
% CSF
Quotient
p†
p‡
CD19+ (reife B-Zellen)
CIS-I
45
MS
16
KONTROLLE-I
23
CD19- CD138+ (Plasmazellen)
CIS-I
45
± 5,0
[535]
12 ± 6,0
[625]
13 ± 4,8
[428]
± 5,6
[0,533]
6 ± 4,7
[0,721]
2 ± 1,5
[0,36]
± 0,4
3]
0,2 ± 0,1
[0,10,5]
0,4 ± 0,7
[03]
± 2,7
16]
1 ± 2,2
[0,19]
2 ± 1,7
[05]
12
0,3
[0
MS
16
KONTROLLE-I
22
CD19+ CD27+ (Memory-B-Zellen)
CIS-I
45
MS
16
KONTROLLE-I
23
± 2,0
[0,811]
3 ± 1,6
[0,17]
4 ± 3,0
[215]
4
CD4+ CD27+ (Memory-T-Zellen)
CIS-I
30
MS
2
KONTROLLE-I
15
± 4,5
97]
92 ± 0,6
[9293]
89 ± 7,1
[7293]
30
2
KONTROLLE-I
15
[0
± 0,1
1,6]
1,0 ± 0,04
[1,01,1]
1,0 ± 0,1
[0,91,4]
± 3,1
14]
10 ± 1,6
[911]
14 ± 5,6
[425]
7,8
[1
≤ .001
NS
≤ .001
.021
[0,0
± 6,6
99]
88 ± 3,1
[8691]
85 ± 5,1
[7490]
[60
± 4,5
19]
8 ± 0,5
[78]
12 ± 7,3
[429]
± 0,5
2,8]
0,7 ± 1,3
[0,15,0]
0,2 ± 0,2
[0,10,7
0,4
± 1,8
[0,39,4]
1,7 ± 1,9
[0,37,4]
6,1 ± 4,2
[0,417,5]
91
8
± 5,5
[0,725,0]
4,3 ± 5,0
[0,921,2]
14,4 ± 13,2
[1,449,5]
4,9
± 5,0
[0,323]
4 ± 4,5
[0,219]
1 ± 1,3
[0,16]
4
[81
[3
MS
1
92
CD4+ CD27- (Effektor-T-Zellen)
CIS-I
5
1,8
1,0
NS
NS
≤ .001
NS
≤.001
NS
[0,9
± 1,1
6,1]
0,7 ± 0,2
[0,60,9]
0,9 ± 0,5
[0,41,8]
1,2
NS
NS
NS
[0,4
NS
NS
3.4. Färbung III: B-Zell-Reihe (CD27, CD138)
51
Tabelle 3.9.:
Ergebnisse Färbung III. Dargestellt ist die Korrelationsanalyse der Quotienten mit
der Läsionslast im cMRT und die ROC-Analyse. Es liegt eine signifikante Korrelation für
Plasmazellen vor. Die ROC wurde für reife B-Zellen und Memory-B-Zellen durchgeführt.
r = Korrelationskoeffizienten nach Spearman, AUC = Area under curve, Cut = errechnete
Cut-off.
Stratifizierung
Korrelation
r
p
ROC
AUC
p
Cut
Sens
Spez
PPV
NPV
LHR
CD19+ (reife B-Zellen)
keine
-0,07
NS
0,85
≤ .001
4,4
0,74
0,92
0,94
0,68
9,44
≤ 6 Läsionen
-0,24
NS
0,87
≤ .001
4,4
0,78
0,92
0,90
0,82
9,78
EDSS
-0,21
NS
0,83
≤ .001
4,4
0,76
0,92
0,93
0,72
9,29
CD19- CD138+ (Plasmazellen)
keine
0,41
.006
NA
≤ 6 Läsionen
0,55
.007
NA
EDSS
0,26
NS
NA
CD19+ CD27+ (Memory-B-Zellen)
keine
-0,20
NS
0,84
≤ .001
2,8
0,84
0,74
0,86
0,71
3,24
≤ 6 Läsionen
-0,35
NS
0,86
≤ .001
2,6
0,83
0,78
0,79
0,82
3,80
EDSS
-0,24
NS
0,83
≤ .001
4,6
0,91
0,65
0,80
0,83
2,63
CD4+ CD27+ (Memory-T-Zellen)
keine
-0,01
NS
NA
≤ 6 Läsionen
0,30
NS
NA
EDSS
0,06
NS
NA
CD4+ CD27- (Effektor-T-Zellen)
keine
-0,02
NS
NA
≤ 6 Läsionen
-0,40
NS
NA
EDSS
-0,12
NS
NA
betrachtet wurden, Patienten mit einem Quotienten kleiner als der Cut-off aber
ohne klinisch-isoliertes Syndrom als falsch positiv“.
”
Für reife B-Zellen erbrachte die ROC für alle Stratifizierungen mit einer Sensitivität von ca. 0,78 und die Spezifität von 0,92 ähnliche Werte. 92 % der
Probanden, bei denen ein Quotient kleiner als der errechnete Cut-off gefunden wurde, wurde tatsächlich die Diagnose CIS“ gestellt (PPV, stratifiziert
”
nach Läsionslast). Bei 82 % der Probanden mit einem Quotienten größer als
der Cut-off konnte die Diagnose CIS“ nicht gestellt werden (NPV). Für Me”
mory B-Zellen ohne Stratifizierung lag die Sensitivität bei 0,84 und Spezifität
bei 0,74. PPV und NPV waren etwas schwächer als bei der Betrachtung aller
3.4. Färbung III: B-Zell-Reihe (CD27, CD138)
52
reifen B-Zellen. Die Quotienten waren damit in der Lage, zwischen Patienten
mit CIS und anderen neurologischen Krankheiten zu diskriminieren.
Die Korrelationsanalyse erbrachte schwache bis keine Korrelationen der Quotienten mit der kranialen Läsionslast (nicht signifikant). Lediglich für Plasmazellen deuten r ≈ 0,5 und p-Werte kleiner als 0,008 auf eine mittelgradige positive
Korrelation des Quotienten mit der kranialen Läsionslast hin (siehe Tabelle 3.9
auf Seite 51 und Abbildung 3.7 auf Seite 52). Dies würde paradoxerweise bedeuten, dass je mehr Plasmazellen im Blut bzw. je weniger im Liquor vorhanden
sind, desto größer die Läsionslast ist.
Abbildung 3.7.:
Korrelations- und ROC-Analyse für CD19. Links: signifikante Korrelationsanalyse
für Plasmazellen. Rechts: ROC für reife B-Zellen (Kreise) und Memory B-Zellen (Kreuze).
Beide ohne Stratifizierung.
3.5. Färbung IV: Thymusemigranten (CD45RA, CD62L)
53
3.5. Färbung IV: Thymusemigranten (CD45RA, CD62L)
Abbildung 3.8.:
Vergleich der Quotienten für CD45 im Boxplot. Links: Boxplots für CD4+ Thymusemigranten. Rechts: Boxplots für CD8+ Thymusemigranten. Keine signifikanten Unterschiede der Quotienten und somit kein Dysäquilibrium für Thymusemigranten in den
Patientenkohorten.
Für eine Übersichtliche Darstellung der Quotienten siehe Tabelle 3.10 auf
Seite 54 und Abbildung 3.8 auf Seite 53. Es ergaben sich keine relevanten und
signifikanten Unterschiede der Quotienten im Vergleich der Kohorten CIS-I, MS
und KONTROLLE-I. Somit liegt kein Dysäquilibrium für Thymusemigranten
bei Patienten mit CIS oder MS vor.
In der Korrelationsanalyse ergaben sich keine Hinweise auf eine Korrelation
der Quotienten mit der Läsionslast für CD8+ Zellen, jedoch eine schwache bis
mittelgradige negative Korrelation für die CD4+ Population ohne Stratifizierung (r = -0,38; p = 0,016, nicht mehr signifikant nach Bonferroni-Korrektur) sowie stratifiziert nach EDSS (r = -0,53; p = 0,004, signifikant), siehe Tabelle 3.11
auf Seite 54. Je häufiger Thymusemigranten im peripheren Blut bzw. je seltener sie im Liquor vorkommen, desto geringer ist die kraniale Läsionslast. Auf
eine ROC-Analyse wurde aufgrund des fehlenden Unterschieds der Quotienten
verzichtet. Angepasst für die Testung von sechs Hypothesen pro untersuchter
Zellpopulation betrug die Bonferroni-Korrektur 0,05/6 = 0,0083. Daher wurde
im folgenden α = 0,83 % als statistisch signifikant betrachtet.
3.5. Färbung IV: Thymusemigranten (CD45RA, CD62L)
54
Tabelle 3.10.:
Deskriptive Statistik Färbung IV. Dargestellt sind Prozentwerte und Quotienten. Angaben im Format MW
± SD, [range]. p = Vergleich von CIS-I:KONTROLLE-I,
p† = Vergleich von CIS-I:MS, p‡ = Vergleich von MS:KONTROLLE-1.
p
n
% PBL
% CSF
Quotient
p†
p‡
CD4+ CD45RA+ CD62L+ (Thymusemigranten)
CIS-I
39
± 16,0
90]
41 ± 10,6
[2757]
43 ± 9,8
[2256]
± 1,9
11]
3,4 ± 1,7
[28]
3,8 ± 3,4
[0,712]
44
2,8
[14
MS
16
KONTROLLE-I
17
[0,6
CD8+ CD45RA+ CD62L+ (Thymusemigranten)
CIS-I
37
MS
17
KONTROLLE-I
17
± 14,0
[654]
25 ± 13,9
[354]
28 ± 14,2
[6,455]
± 8,6
[247]
13 ± 6,0
[529]
15 ± 8,8
[331]
31
12,3
± 8,9
41,3]
14,4 ± 6,6
[4,227,1]
18,7 ± 12,3
[3,651,7]
19,0
NS
[5,3
± 3,8
[0,522,7]
2,3 ± 1,4
[0,15,2]
2,5 ± 2,3
[3,651,7]
3,7
NS
NS
NS
NS
NS
Tabelle 3.11.:
Ergebnisse Färbung IV. Dargestellt ist die Korrelationsanalyse der Quotienten mit der
Läsionslast im cMRT. Schwache bis mittelgradige negative Korrelation für CD4+ Thymusemigranten. Je häufiger Thymusemigranten im peripheren Blut bzw. je seltener sie im Liquor
vorkommen, desto geringer ist die kraniale Läsionslast. Auf eine ROC-Analyse wurde aufgrund des fehlenden Unterschieds der Quotienten verzichtet. r = Korrelationskoeffizienten
nach Spearman, AUC = Area under curve, Cut = errechnete Cut-off.
Stratifizierung
Korrelation
r
p
ROC
AUC
CD4+ CD45RA+ CD62L+
keine
-0,38
.016
NA
≤ 6 Läsionen
-0,3
NS
NA
EDSS
-0,53
.004
NA
CD8+ CD45RA+ CD62L+
keine
0,18
NS
NA
≤ 6 Läsionen
0,21
NS
NA
EDSS
0,15
NS
NA
p
Cut
Sens
Spez
PPV
NPV
LHR
3.6. Färbung V: Monozyten (CD14, CD16)
55
3.6. Färbung V: Monozyten (CD14, CD16)
Abbildung 3.9.:
Vergleich der Quotienten für CD14+/CD16+ im Boxplot. Links: Boxplots für
CD14+ CD16- (linke Boxen, ausgefüllt) und CD14- CD16+ (rechte Boxen, liniert), keine
signifikanten Unterschiede. Rechts: Boxplots für CD14+ CD16+ Zellen. Signifikante Unterschiede der Quotienten für CD14+ CD16+ Zellen im Vergleich von CIS-I:Kontrollen.
Bei Patienten mit CIS liegt somit ein Mißverhältnis für CD14+ CD16+ Monozyten mit
vermindertem Anteil im CSF vor. Zweiseitiger Mann-Whitney-U Test für unverbundene
Stichproben.
Die Quotienten und Prozentwerte sind in Tabelle 3.12 auf Seite 56 und Abbildung 3.9 auf Seite 55 dargestellt. Nach Bonferroni-Korrektur mit 0,05/6 = 0,0083
für multiples Testen der Quotienten und Korrelationen blieben als statistisch signifikant die Werte für CD14+ CD16+ Monozyten (p = 0,002) für den Vergleich
der Quotienten der CIS-I und Kontrollkohorte; mit p = 0,049 war der Vergleich
der Kohorten MS und Kontrolle damit nicht mehr signifikant. Bei Patienten mit
CIS liegt somit ein Mißverhältnis für CD14+ CD16+ Monozyten mit vermindertem Anteil im CSF vor. Für die anderen untersuchten Monozytenpopulationen
fand sich kein signifikanter Unterschied.
Die Korrelationsanalyse ergabe schwache bis keine Korrelationen der kranialen Läsionslast mit den Quotienten für alle Monozytenpopulationen (alle
nicht signifikant). Es ergaben sich somit keine Hinweise darauf, dass die Dysbalance der CD14+ CD16+ Monozyten im Zusammenhang mit der kranialen
Läsionslast steht. Für diese Population wurde die ROC durchgeführt und das Signifikanzniveau nach Bonferroni auf 0,05/9 = 0,0055 und α = 0,55 % angehoben.
Größere Werte der Quotienten deuteten dabei stärker auf den positiven Zustand
(CIS) hin, kleinere Werte sprechen eher gegen das Vorliegen eines CIS. Die beste
Auswertung ergab die Stratifizierung nach Läsionslast (AUC = 0,78; p = 0,002
3.6. Färbung V: Monozyten (CD14, CD16)
56
Sensitivität = 0,74; Spezifität = 0,73). Der Quotient für CD14+ CD16+ Monozyten ist in ca. 75 % der Fälle geeignet um zwischen der Diagnose CIS“ und
”
kein CIS“ zu unterscheiden. Bei der Stratifizierung nach EDSS-Verbesserung
”
war der p-Wert mit 0,008 nach Bonferroni-Korrektur knapp nicht mehr signifikant. Knapp 80 % der Probanden, bei denen ein Quotient größer als der errechnete Cut-off gefunden wurde, wurde tatsächlich die Diagnose CIS“ gestellt
”
(PPV, stratifiziert nach Läsionslast). 67 % der Probanden mit einem Quotienten
kleiner als der Cut-off hatten die Diagnose kein CIS“ (NPV). Für eine kom”
plette Übersicht der Ergebnisse der ROC und Korrelationen siehe Tabelle 3.13
auf Seite 57 und Abbildung 3.10 auf Seite 57.
Tabelle 3.12.:
Deskriptive Statistik Färbung V. Dargestellt sind Prozentwerte an allen CD3- CD20Zellen und Quotienten. Angaben im Format MW
± SD, [range]. p = Vergleich von CIS-
I:KONTROLLE-I, p† = Vergleich von CIS-I:MS, p‡ = Vergleich von MS:KONTROLLE-1.
p
n
% PBL
% CSF
Quotient
p†
p‡
CD14+ CD16- (Monozyten)
CIS-I
40
± 11,2
67]
36 ± 19,2
[276]
36 ± 11,7
[553]
41
[4
MS
15
KONTROLLE-I
22
CD14- CD16+ (Monozyten)
CIS-I
38
MS
15
KONTROLLE-I
18
CD14+ CD16+ (Monozyten)
CIS-I
40
± 11,7
[254]
26 ± 17,9
[176]
33 ± 14,7
[360]
32
± 2,6
13]
7 ± 9,8
[044]
7 ± 3,7
[118]
6
[1
MS
15
KONTROLLE-I
22
± 7,9
32]
9 ± 9,0
[0,937]
16 ± 14,5
[0,850]
± 19,37
47,76]
9,9 ± 11,69
[0,441,2]
7,3 ± 10,52
[0,342,6]
9
14,2
[0,6
[0,25
± 3,7
[013]
4 ± 3,8
[114]
2 ± 2,0
[06]
4
± 6,2
84]
13 ± 18,8
[162]
26 ± 19,0
[164]
11
[1
± 11,47
[0,260,4]
10,9 ± 10,51
[0,533,8]
21 ± 22,4
[1,574,4]
12,8
± 3,60
20,2]
2,3 ± 2,86
[0,18,9]
0,9 ± 1,6
[0,15,5]
2,1
NS
NS
NS
NS
NS
NS
.002
[0,1
NS
.049
3.6. Färbung V: Monozyten (CD14, CD16)
57
Tabelle 3.13.:
Ergebnisse Färbung V. Dargestellt ist die Korrelationsanalyse der Quotienten mit der
Läsionslast im cMRT und die ROC-Analyse. Es liegt keine signifikante Korrelation für
CD14+ CD16+ Monozyten vor. Für die Population stratifiziert nach Läsionslast wurde die
ROC durchgeführt. r = Korrelationskoeffizienten nach Spearman, AUC = Area under curve,
Cut = errechneter Cut-off.
Stratifizierung
Korrelation
r
p
ROC
AUC
p
Cut
Sens
Spez
PPV
NPV
LHR
CD14+ CD16- (Monozyten)
keine
0,09
NS
NA
≤ 6 Läsionen
0,16
NS
NA
EDSS
0,01
NS
NA
CD14- CD16+ (Monozyten)
keine
-0,22
NS
NA
≤ 6 Läsionen
0,03
NS
NA
EDSS
-0,22
NS
NA
CD14+ CD16+ (Monozyten)
keine
-0,01
NS
0,73
.002
0,32
0,77
0,68
0,77
0,68
2,41
≤ 6 Läsionen
0,20
NS
0,78
.002
0,38
0,74
0,73
0,79
0,67
2,72
EDSS
-0,09
NS
0,71
.008
0,38
0,74
0,73
0,79
0,67
2,72
Abbildung 3.10.:
Korrelations- und ROC-Analyse für CD14. Links: Signifikante Korrelationsanalyse
für CD14+ CD16+ Monozyten, stratifiziert nach Läsionslast (≤ 6 Läsionen). Rechts: ROC
für die selbe Zellpopulation in gleicher Stratifizierung mit signifikanter AUC = 0,80.
3.7. Zusammenfassung der Ergebnisse
58
3.7. Zusammenfassung der Ergebnisse
Die Analyse der Quotienten erbrachte nach Bonferroni-Korrektur signifikante Unterschiede und somit einen Hinweis auf eine Dysbalance im Blut- und
Liquorkompartiment bei TREG (CD4+ CD25high ), reifen B-Zellen (CD19+),
Memory B-Zellen (CD19+ CD27+) und Monozyten (CD14+ CD16+). Keine
Unterschiede wurden für CD28 T-Zellen, Plasmazellen (CD138+, nicht signifikant nach Bonferroni-Korrektur), T-Zellen (CD4+ CD27+ und CD4+ CD27-),
Thymusemigranten (CD45RA+ CD62L+) und Monozyten (CD14+ CD16- und
CD14- CD16+) gefunden. Für TREG und Plasmazellen korrelierte der Quotient
positiv mit der kranialen Läsionslast im cMRT, das heisst, je größer die relative
Häufigkeit der Zellen im Blut im Vergleich zum Liquor bei Diagnosestellung
war, desto größer war die initiale kumulative Läsionslast. Für CD4+ Thymusemigranten fand sich stratifiziert nach EDSS eine negative Korrelation mit
inverser Beziehung zwischen Quotient und Läsionslast. Die Analyse der TREG
hinsichtlich des Oberflächenbesatzes für VLA-4 konnte eine signifikant verminderte MFI bei Patienten mit CIS im Vergleich zu Kontrollen zeigen. Expression
für VLA-4 war für CD25high durchschnittlich bei allen Probanden schwächer als
für CD25med und CD25low CD4+ T-Zellen. Diese Ergebnisse deuten auf einen
Veränderten Rezeptorbesatz auf CD4+ T-Zellen für VLA-4 bei Patienten mit
CIS hin.
4. Diskussion
4.1. Diskussion des Studienkollektivs und Methodik
Tabelle 4.1.:
Vergleich des Studienkollektivs (CIS) mit dem Verumarm der BENEFITKohorte (CIS) und dem deutschen MS-Register. Es finden sich annähernd gleiche
demografische und klinische Charaktersitika der Probanden. Flachenecker u. a. (2008) evaluierten MS-Patienten (und nicht CIS-Patienten) in Deutschland, deshalb liegt der initiale
EDSS und der Anteil mit einem EDSS ≤ 4,0 über dem in dieser Studie gefundenen. Auffällig
ist die höhere Läsionslast in der BENEFIT-Kohorte.
n
weibl.
n, %
CIS I+II
64
48, 75
Kappos u. a.
292
207, 71
3 223
?, 72
Alter
EDSS
± SD
32 ± 9,6
30 ± k.A.
MW
T2 MRT
Beginn
≤ 4,0
Läsionen
Vol [mm3 ]
Median
%
Median
Median
2,0
91
6
914
1,5
k.A.
18
1 951
3,5
51
k.A.
k.A.
(2006)
Flachenecker
31
± 10,2
u. a. (2008)
Demografische und klinische Variablen des Studienkollektivs im Vergleich
zum Verumarm der BENEFIT Kohorte (Kappos u. a. 2006) und des MS-Registers
in Deutschland (Flachenecker u. a. 2008) sind in Tabelle 4.1 auf Seite 59 dargestellt. Das mittlere Alter bei Diagnosestellung und die Geschlechtsverteilung
mit ca 70 % weiblichen Probanden in unserem Studienkollektiv spiegeln gut die
demografischen Verhältnisse in Deutschland und im großen Patientenkollektiv der BENEFIT-Studie wider. Die Kohorte der CIS-Patienten ist mit n = 64
groß genug, um statistische Aussagen treffen zu können. Frühere Studien wiesen erheblich kleinere Probandenzahlen auf (Viglietta u. a. 2004; Aristimuño
u. a. 2008). In die MS-Kohorte (n = 18) konnte keine vergleichbare Zahl an Patienten rekrutiert werden, da zur Diagnosestellung MS“ das Kriterium der
”
zeitlichen und örtlichen Dissemination erfüllt sein muss, serielle Liquorpunktionen aber in der Regel nicht duchgeführt werden. Somit musste auf Patienten
gewartet werden, welche aus anderen Gründen eine Liquorpunktion benötigten,
59
4.1. Diskussion des Studienkollektivs und Methodik
60
oder nicht im Stadium “CIS“ erstmalig zur Diagnostik erschienen und gleichzeitig die Einschlusskriterien beachteten. Der Unterschied in der Alters- und
Geschlechtsstruktur der CIS und Kontrollgruppe (31 ± 9,7 vs. 49 ± 16,5 Jahre;
f:m = 35:11 in CIS-I) begründet sich in der Epidemiologie des CIS mit einer
Präferenz für Frauen im jüngeren Lebensalter (Flachenecker u. a. 2008). Die
klinische Präsentation der Patienten ist im Einklang mit dem Beschwerdeprofil
des Verumarms der BENEFIT-Kohorte. Die häufigsten Symptomkombinationen beinhalteten das optische System mit 25 % (BENEFIT: 29 %), den Hirnstamm mit 22 % (22 %) und spinale Symptome (monofokales CIS) mit 35 %
(34 %) (vgl. Kappos u. a. 2006).
Ein initialer EDSS lag von allen eingeschlossenen Patienten mit CIS vor. Der
Median des initialen EDSS lag bei 2,0. Damit liegt er 0,5 Punkte höher als in
der BENEFIT-Kohorte (Kappos u. a. 2006). Eine Abweichung von 0,5 Punkten
liegt allerdings im Rahmen der interrater-Variabilität für den EDSS Score (1,5
Punkte, Goodkin u. a. 1992)). Die mediane Läsionslast der Patienten in dieser Studie lag unter der in der BENEFIT-Kohorte. Diese Abweichung ist am
ehesten zufallsbedingt und durch die Einschlusskriterien der beiden Studien
beeinflusst. Während in dieser Studie keine Anforderungen für den Studieneinschluss an das initiale MRT geknüpft wurden, wurden in der BENEFIT Studie
Bedingungen an Anzahl und Form der Läsionen gestellt, die Patienten mit sehr
niedriger oder keiner Läsionslast ausschließen (mindestens zwei T2 -hyperintense
Läsionen größer als 3 mm, periventrikulär oder infratentoriell, ovoide Form). Der
Einschluss von drei Patienten mit unauffälligem MRT in dieser Studie führt
möglicherweise zu einer Unterschätzung der kranialen Läsionslast. Da die vorliegende Studie das Läsionsvolumen mit den Quotienten linear korreliert und
somit nur Hinweise auf proportionale Verhältnisse liefert, führt eine mögliche
Unterschätzung der Läsionslast im gesamten Patientenkollektiv nicht zu einer
Verfälschung der Ergebnisse. Bei einer Übertragung der Absolutwerte auf die
Grundgesamtheit sollte allerdings eine mögliche Unterschätzung der Läsionslast
berücksichtigt werden.
Zusammengefasst ist das hier beschriebene Patientenkollektiv in der Lage,
charakterisiert durch demografische und klinische Variablen die Epidemiologie
des CIS in Deutschland weitestgehend unverzerrt wiederzuspiegeln und somit
wird davon ausgegangen, dass die erhobenen Ergebnisse repräsentativ für die
Grundgesamtheit der Patienten mit CIS sind.
Die intra- und interrater Variabilität zur Quantifizierung der Läsionen kann
durch den Einsatz von fast FLAIR Sequenzen, wie in dieser Studie, signi-
4.1. Diskussion des Studienkollektivs und Methodik
61
fikant gesenkt werden; ausserdem erbrachte eine Reduzierung von fünf auf
drei Millimeter Schichtdicke keinen zusätzlichen diagnostischen Gewinn (Filippi u. a. 1998). Der Vorteil der FLAIR liegt dabei in der höheren Sensitivität subkortikaler und liquornaher Läsionen aufgrund eines geringeren LiquorPartialvolumeneffekts. Die Verwendung von FLAIR-Sequenzen in der klinischen
Routinediagnostik rechtfertigen Studien in denen gezeigt werden konnte, dass
mit ihr im Gegensatz zu auf Spin-Echo basierenden Sequenzen ca. 30 % mehr
Läsionen detektiert werden konnten (Tubridy u. a. 1998).
Quotienten zur Beschreibung einer zellulären Dysbalance zwischen den Kompartimenten wurden schon früher durchflusszytometrisch in klinischen Studien
bei Patienten mit MS beschrieben. Die Analyse der Quotienten bei CIS sowie die Korrelation mit der Läsionslast ist in der Literatur allerdings nicht
vorbeschrieben. Die Erfassung des Verhältnisses von verbundenen Daten in
Blut und Liquor erlaubt dabei die Beurteilung der Kapazität von BHS und
BCSFS zum Lymphozytentransfer und spiegelt somit die Immunhomöostase
wider (Kleine u. a. 1999; Kleine, Benes 2006). Die kumulative T2 -gewichtete
Läsionslast wurde in der Vergangenheit zur Quantifizierung und Objektivierung der entzündlichen Aktivität bei Patienten mit MS eingesetzt und dient als
Surrogatmarker für die Evolution der Krankheit; zahlreiche Forschungsgruppen haben die volumetrische Bestimmung zerebraler Läsionen zu Beginn und
im Follow-up bei Patienten mit MS benutzt, um Aussagen über Prognose und
Fortschritt der Erkrankung treffen zu können (z.B. Brex u. a. 2002). Verschiedene Studien erbrachten allerdings unterschiedliche Ergebnisse in Bezug auf
Korrelation der Läsionslast mit dem Grad der Behinderung bei MS mit meist
moderaten Korrelationskoeffizienten (Brex u. a. 2002; Fisniku u. a. 2008; Sormani u. a. 2009). Diese Ergebnisse sind wahrscheinlich eine Reflexion der begrenzten Aussagekraft verfügbarer Scores (Willoughby, Paty 1988) sowie der
begrenzten Fähigkeit konventioneller MRT Techniken, entzündliches Gewebe
ausserhalb makroskopisch sichtbarer Läsionen zu quantifizieren und die heterogene Pathogenese der MS zu berücksichtigen (Pirko u. a. 2007). Trotzallem
wird die kumulative Läsionslast in einer Vielzahl an klinischen Studien als Surrogatparameter für die Entwicklung und Aktivität der Krankheit genutzt und
hat sich im Forschungsalltag etabliert.
Aus diesen Aussagen geht hervor, dass die Korrelation des Quotienten mit der
kumulierten Läsionslast eine zulässige Methode darstellt. Wenn die Läsionslast
im MRT als Maß für Entwicklung und Schwere einer MS geeignet ist, liegt
der Schluß nahe, dass auch die Quotienten in Korrelation mit der Läsionslast
4.1. Diskussion des Studienkollektivs und Methodik
62
zur Quantifizierung geeignet sind. Somit stünde erstmalig ein laborchemischer
Parameter zur Erfassung klinischer Beeinträchtigung bei MS zur Verfügung.
Wie hoch allerdings eine mögliche Korrelation sein wird, wenn eine moderate
Korrelation eines Quotienten mit der Läsionslast vorliegt und die Korrelation der Läsionslast mit der Schwere der Erkrankung ebenfalls (nur) moderat
ist, sollte in prospektiven Studien weiter geklärt werden. Nach dem heutigen
Wissensstand ist dies die erste Arbeit, die eine Korrelation der Quotienten mit
MRT-Parametern zur Beschreibung eines proportionalen Verhältnisses einsetzt.
In dieser Studie wurde eine Stratifizierung der CIS-Kohorten in Patienten mit
milder Krankheitsaktivität anhand von initial sechs und weniger Läsionen und
einem verbesserten oder konstanten EDSS im 1-Jahres Follow-Up durchgeführt.
In der vorliegenden Studie wurde die Stratifizierung von sechs und weniger
Läsionen gewählt, da dies der Definition einer großen Läsionslast in den deutschen AWMF-Leitlinien entspricht (siehe http://www.awmf.org/leitlinien/
detail/ll/030-050.html). Im Vorliegenden entspricht ein Grenzwert von sechs
dem Median für die Läsionszahl im Studienkollektiv. Auch Brex u. a. (2002,
s. u.) wählten in ihrer Studie diesen Cut-off. Es gibt Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen Läsionszahl bei Patienten mit CIS, Konversion zu klinisch
definitiver MS und der Wahrscheinlichkeit, milde oder moderate Behinderung
zu entwickeln (Brex u. a. 2002).
ROC Kurven werden benutzt, um die Effektivität eines diagnostischen Markers
(hier die Quotienten) in der Unterscheidung zwischen kranken und gesunden
Individuen zu beurteilen. Meistens werden kontinuierliche Messungen durchgeführt. Die Area under the ROC curve (AUC)“ ist der gängigste Global”
parameter der diagnostischen Präzision. Werte nahe an 1 sind hinweisend auf
eine hohe, während Werte um 0,5 auf eine niedrige diagnostische Genauigkeit
hindeuten (Farcomeni, Ventura 2010). In dieser Studie wurden im Falle von
Signifikanz durchweg gute Werte von 0,71 bis 0,87 gefunden. Dies ist die erste
Studie, die ROC-Kurven für die Evaluation liquorzytologischer Befunde in der
Diagnostik der MS einsetzt.
4.2. Diskussion der Ergebnisse
63
4.2. Diskussion der Ergebnisse
4.2.1. Die Häufigkeit CD4+ CD25high TREG ist im Liquor von
Patienten mit CIS reduziert und könnte als diagnostisches
Hilfsmittel eingesetzt werden
In dieser Studie konnte ein signifikanter Unterschied in der Häufigkeit der
CD25high TREG bei Patienten mit CIS im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen gezeigt werden. Kein signifikanter Unterschied lag im Vergleich von
MS und CIS Patienten vor, was pathophysiologisch auch nicht zu erwarten ist.
Ein größerer Quotient bei Patienten mit CIS spricht für einen größeren Anteil der TREG im peripheren Blut als im Liquor im Vergleich mit Gesunden
oder im Umkehrschluß für eine Verminderung der TREG im Liquor in der
Patientengruppe. Diese Beobachtung einer quantitativen Dysbalance ist vereinbar mit gängigen Hypothesen, die eine physiologisch protektive Funktion
der TREG in Bezug auf Kontrolle und Suppression von entzündlichen Reaktionen postulieren (Venken u. a. 2010). Obwohl autoreaktive T-Zellen bei Gesunden sowie chronisch Kranken gefunden wurden, scheinen sie bei Patienten mit
Autoimmunkrankheiten leichter durch multilaterale Stimuli aktiviert werden
zu können (Lovett-Racke u. a. 1998). Diese Beobachtung veranlasste zahlreiche Forschungsgruppen der Frage nachzugehen, ob dies mit einer reduzierten
Funktion oder gestörten Homöostase regulatorischer Zellen erklärbar sei. Eine aktuelle Literaturrecherche erbrachte relativ eindeutige Ergebnisse in Bezug
auf eine reduzierte Effektorfunktion regulatorischer T-Zellen und somit eine
qualitative Störung bei Patienten mit MS (siehe auch Abschnitt 1.3.2 auf Seite 12 der Einleitung und Viglietta u. a. 2004; Haas u. a. 2005; Venken u. a.
2006), obwohl diese Ergebnisse nicht in allen Studien validiert werden konnten. So fanden Fransson u. a. (2009) z. B. eine normale Suppressionsfähigkeit in
CD25+ T-Zellen von MS-Patienten, wurden diese mit aktivierten Lymphozyten von gesunden Kontrollpersonen inkubiert. Interessanterweise konnte dies für
Patienten mit RR-MS, nicht aber für SP-MS nachgewiesen werden (Fransson
u. a. 2009). Es wird mittlerweile davon ausgegangen, dass sich die Effektorfunktion im späteren Krankheitsstadium rekonstituieren kann, obwohl später
wahrscheinlich eher neurodegenerative als zelluläre Prozesse eine Rolle für die
Progression spielen (Venken u. a. 2008a). Weiterhin korrelierte die Funktionsbeeinträchtigung negativ mit der Krankheitsdauer, nicht jedoch mit dem Alter
der Patienten, was als Hinweis für die Bedeutung der TREG im frühen Krankheitsverlauf gewertet werden kann (Venken u. a. 2006). Haas u. a. (2005) fanden
4.2. Diskussion der Ergebnisse
64
eine identische reduzierte suppressive Kapazität und Häufigkeiten der CD25+
TREG bei Patienten mit RR-MS in Remission sowie im Schub. Auch schien
diese nicht abhängig von der Schubrate und der klinischen Beeinträchtigung zu
sein. Diese Ergebnisse sprechen gegen eine Akkumulation der TREG im ZNS
während eines Schubes und sind in Zusammenschau mit o.g. Studien als Hinwies darauf zu deuten, dass die beeinträchtigte Effektorfunktion weniger von der
kurzfristigen Krankheitsaktivität, sondern eher vom natürlichen Krankheitsverlauf gemessen in Jahren und Jahrzenten abhängig ist (Haas u. a. 2005).
Tabelle 4.2.:
Studienvergleich für CD25. Dargestellt sind Studien, die die Häufigkeit von TREG bei
Patienten mit MS und CIS untersucht haben. Auffällig ist eine Heterogenität der untersuchten Zellpopulation in phänotypischer Hinsicht und der eingeschlossenen Studienpatienten,
was die Vergleichbarkeit erschwert und für die diskrepanten Ergebnisse mitverantwortlich
sein kann. CS = Corticosteroide, GK = gesunde Kontrollpersonen, ANK = andere neurologische Erkrankungen
Studie
Patienten
Material
Aristimuno
MS (n = 20) im
CD4+CD25high im
2008
Schub
GK (n = 18)
Feger
2007
Fransson
2009
Haas
2005
MS (n = 14)
ANK (n = 9)
RR-MS (n = 48)
GK (n = 44)
Schub und fünf Tage
CD4+CD25high
2004
Ma 2009
CD4+CD25+
RR-MS < GK
Foxp3+CD127- PBL
GK (n = 73)
PBL und CSF
MS/EAE (n = 4)
MS (CSF) > MS (PBL)
ANK (PBL) ≈ ANK (CSF)
CD4+CD25high ,
ANK (n = 49)
MS GK post i.v. CS
FoxP3+ PBL u. CSF
RR-MS (n = 73)
CIS (n = 44)
MS > GK bei Baseline
post i.v. CS; PBL
RR-MS ≈ GK (PBL)
RR-MS (PBL) ≈ GK (CSF)
CD25med RR-MS ≈ GK
(CSF n = 15)
Jensen
Ergebnis (Auszug)
CD4+CD25high PBL
CIS (PBL) ≈ GK (PBL)
u. CSF
CIS (CSF) < ANK (CSF)
CD4+CD25high im
MS Im Schub < MS in
GK (n = 4) im
Schub, Remission
Tierversuch
und bei gesunden
Remission
MS in Remission GK
Primatenaffen; PBL
Viglietta
2004
Vudattu
2009
RR-MS (n = 15)
GK (n = 21)
CD4+CD25high ,
RR-MS ≈ GK
PBL
SP-MS (n = 13)
CD4+CD25high und
SP-MS, RR-MS, ANK
RR-MS (n = 9)
Subgruppen, PBL
< GK
ANK (n = 9)
GK (n = 15)
4.2. Diskussion der Ergebnisse
65
Eine reduzierte Häufigkeit der TREG im Liquor von CIS-Patienten, wie in
dieser Studie gefunden, liefert neben dem qualitativen Erklärungsansatz einer gestörten exekutiven Funktion einen zusätzlichen quantitativen Aspekt mit
möglicherweise gestörter Homöostase der TREG und unterstreicht die Rolle
dieser Zellen in der Pathogenese des CIS als Beginn des Paradigmas MS.
Studien, die sich mit der Quantifizierung der Zellen in Blut und Liquor beschäftigten lieferten allerdings z. T. widersprüchliche Ergebnisse. In Tabelle 4.2 auf
Seite 64 ist eine Auswahl an Studien aufgeführt, die sich mit der Häufigkeit der
TREG bei MS beschäftigten. Studien zu anderen Autoimmunerkrankungen wie
z. B. Diabetes Mellitus oder Rheumatoide Arthritis wurden nicht berücksichtigt,
liefern aber z. T. ebenfalls widersprüchliche Ergebnisse (Haas u. a. 2005).
Soweit anhand aktueller Literaturrecherche beurteilbar, ist dies die erste Arbeit, die systematisch Blut- und Liquoruntersuchungen für CD25 bei Patienten
mit CIS durchgeführt hat. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die These,
daß regulatorische T-Zellen nicht ins ZNS emigrieren um lokal eine Dämpfung
der Entzündungsantwort zu initiieren und somit aus dem peripheren Pool depletiert werden; hierfür würde ein kleinerer Quotient bei Patienten mit CIS
sprechen. Vielmehr sind zugrundeliegende pathogenetische Mechanismen, die
eine Erklärung divergierender Forschungsergebnisse darstellen könnten bis heute leider kaum verstanden. Mögliche Ursachen für diese Diskrepanz quantitativer Studien könnten u. U. methodologischer Natur sein, z. b. war die Definition
eines Schubes im Rahmen einer RR-MS in den hier vorgestellten Studien nicht
identisch. Eine andere Fehlerquelle liegt in der immunzytologischen Auswahl
geeigneter Marker für regulatorische Zellen (z. B. Foxp3), welche bis heute noch
nicht zufriedenstellend gelöst ist (siehe auch Abschnitt 4.4 auf Seite 85) und
zwischen den Studien variiert. Andere Theorien, die den Einsatz von CD127 als
zusätzlichen immunphänotypischen Marker favoriseren, kritisieren eine Verunreinigung der TREG durch andere aktivierte T-Zellen aufgrund einer suboptimalen Spezifität existierender Marker wie CD25 und FoxP3 für regulatorische
Zellen (siehe auch Seite 85 und Liu u. a. 2006).
Ein besseres Verständnis der zugrundeliegenden kompromittierten Immunregulation ist wichtig für die Entwicklung einer zukünftigen auf TREG basierenden Therapie. Die Schlüsselfrage wird sein, ob es gelingen wird, die Balance
zwischen TREG und Effektorzellen zur richtigen Zeit und am richtigen Ort
wiederherzustellen. Venken u. a. (2010) sind der Ansicht, dass der günstigste
Ansatz in einer Intervention im frühen Krankheitsbeginn zwecks Wiederherstellung der Funktion und Homöostase der Zellen besteht (Venken u. a. 2010).
4.2. Diskussion der Ergebnisse
66
Um so erstaunlicher scheint es, daß bis dato kaum Forschungsanstrengungen
bei Patienten mit CIS unternommen wurden.
Erste therapeutische Ideen beinhalten die Isolierung von patienteneigenen TREG,
in-vitro Expansion und Refundierung der Zellen (Stephens u. a. 2009). Abgesehen von ethischen und technischen Problemen wirft dieser Ansatz eine Reihe
anderer Fragen auf: Welche phänotypischen Merkmale sollten zur Identifizierung der Zellen benutzt werden? Welche Epitope sind am besten geeigent um
eine Expansion der Zellen zu erreichen? Aber auch die Applikation von etablierten Immunmodulatoren hat signifikante Auswirkung auf TREG. So sind z.B.
Interferone und Glatirameracetat in der Lage, die Häufigkeit der RTE–TREG
bei MS-Patienten zu erhöhen (Venken u. a. 2008b). Zusammengefasst bieten
TREG vielversprechendes Potential in der Therapie der MS, wobei die Meinung vorherrscht, eine effiziente Therapie müsse sowohl die Effektorfunktion,
als auch die Dysbalance über die Kompartimente als Ziel haben.
4.2.2. Reduzierte MFI für VLA-4 bei Patienten mit CIS
Um einen Erklärungsansatz für die quantitativen Unterschiede der TREG bei
CIS und Kontrollprobanden zu liefern, wurde das Expressionsniveau für CD49d
in Abhängigkeit von CD25 untersucht. Auf einem Signifikanzniveau von α = 5 %
fanden sich signifikant erniedrigte MFI für die α-4 Kette von VLA-4 (CD49d)
im PBL für alle CD4+ CD25low-high im Vergleich zu Kontrollen. Im CSF wurde
Signifikanz für CD25low-med erreicht. Insgesamt war die MFI in allen Zellpopulationen schwächer bei Patienten mit CIS im Vergleich zu Kontrollen (durchschnittlich um 28 % im PBL und 19 % im CSF). Es wurde darüberhinaus eine
abnehmende Tendenz der MFI mit zunehmender Expression für CD25 über das
gesamte Patientenkollektiv beobachtet.
Die MFI ist ein indirektes Maß für den Oberflächenrezeptorbesatz auf Zellen.
Obwohl nach Bonferroni-Korrektur und α = 2,5 % knapp keine Signifikanz mehr
für CD25low erreicht wurde (p = 0,029 im PBL und 0,038 im CSF), sind diese Ergebnisse hinweisend auf eine reduzierte Expression von VLA-4 auf CD4+
Lymphozyten bei Patienten mit CIS. Bei eindeutiger Tendenz zu erniedrigten
MFI bei Patienten sowohl im PBL, als auch im CSF für alle Expressionsniveaus
von CD25 ist die Fallzahl von n = 18 möglicherweise nicht groß genug, um dem
nach Bonferroni korrigierten Signifikanzniveau standzuhalten. Da CD25high im
CSF der einzige Wert ist, für den keine Signifikanz bei sonst eindeutigen Ergebnissen erreicht wurde, liegt hier möglicherweise ein zufälliges Ergebnis vor,
ebenfalls mitbedingt durch die Fallzahl. Hier sollte weitere Forschung erfolgen.
4.2. Diskussion der Ergebnisse
67
Besonders die Interaktion zwischen dem Integrin very late antigen (VLA)-4
und dem vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 auf dem Endothel konnte
als essentiell für die Leukozytenadhäsion- und Migration ins ZNS herausgestellt werden (z. B. Vajkoczy u. a. 2001). Dabei sind die beiden Proteine für den
initialen Kontakt und folgende Anheftung der Lymphozyten ans Endothel verantwortlich, die Transmigration wird an andere Stelle veranlasst, z. B. durch die
Interaktion von LFA-1 und ICAM-I (Vajkoczy u. a. 2001). Doerck u. a. (2010)
untersuchten das Migrationsverhalten proinflammatorischer und regulatorischer
T-Zellen bei Ratten mit EAE. Dabei folgte die Expression von VCAM-I dem
klinischen Verlauf von Schub und Remission und die Applikation von blockierenden Antikörpern führte zu einer Aggravation im frühen Krankheitsverlauf
der Tiere und ist hinweisend auf eine wichtige Rolle von VLA-4/VCAM-I Interaktion in der Rekrutierung regulatorischer Zellen ins ZNS (Doerck u. a. 2010).
Bei Patienten mit CIS ist die Rolle von VLA-4 bisher noch nicht untersucht
worden. Es fand sich eine Verminderung von VLA-4 auf TREG des peripheren
Blutes von Patienten mit RR-MS (Stenner u. a. 2008) und eine gestörte Zellmotilität bei RR-MS im Gegensatz zu konstitutiv starkt ausgeprägter Migrationsfähigkeit von TREG unter normalen Bedingungen (Schneider-Hohendorf
u. a. 2010).
In der Zusammenschau der Ergebnisse könnte eine gestörte Homöostase der
TREG beim CIS mit verminderter Häufigkeit im CSF zumindest teilweise durch
eine reduzierte Expression von VLA-4 erklärt werden. Da das absolute Expressionsniveau für VLA-4 auf CD25high TREG im Vergleich zu CD25med+lo niedriger ist (siehe Tabelle 3.5 auf Seite 44), fällt ein Verlust an Rezeptoren bei
TREG stärker ins Gewicht als bei Populationen mit durchschnittlich höherer
Expression des Rezeptors. Obwohl keine Signifikanz nach Bonferroni erreicht
wurde, lässt sich das Signifikanzniveau durch die Untersuchung einer größeren
Fallzahl möglicherweise verbessern. Mitverantwortlich für eine Fehlfunktion der
CD25high Zellen bei Patienten mit CIS/MS könnte somit neben einer gestörten
Effektorfunktion auch eine gestörte Homöostase im Liquorkompartiment sein.
Trotzallem ist auch hier die Datenlage nicht immer eindeutig. Soilu-Hänninen
u. a. (2005) fanden eine erhöhte Expression von CD49d auf allen T-Zellen bei Patienten mit MS im Schub, nicht aber in Remission (Soilu-Hänninen u. a. 2005).
Andere zeigtes eine gesteigerte Häufigkeit CD49d+ Zellen unter allen TREG bei
Patienten mit RR-MS (nicht aber SP-MS) im Vergleich zu gesunden Kontrollen
(Venken u. a. 2008a). Wie diese auf den ersten Blick divergierenden Erkenntnisse in den gesamten Prozeß der TREG Pathophysiologie zu integrieren sind und
4.2. Diskussion der Ergebnisse
68
ob eine Rekonstitution der Zellmotilität im fortschreitenden Krankheitsverlauf
stattfindet, sollte Gegenstand zukünftiger Forschung sein.
4.2.3. Selektiver Rezeptorverlust für IL-2 oder beeinträchtigte
Adhäsionsmoleküle als möglicher zugrundeliegender Defekt
Der hier gefundene Quotient von 1,0 in der Kohorte der Kontrollpersonen deutet auf ein Äquilibrium zwischen dem Blut- und Liquorkompartiment mit weitestgehend ungehindertem Austausch der Zellen über die Blut-Hirn-Schranke
(BHS) hin und ergänzt die Ergebnisse einer älteren Studie, die ebenfalls gleiche Häufigkeiten in Blut und Liquor bei Gesunden fand. Dort wurden allerdings alle aktivierten CD4+ Zellen untersucht (CD4+ CD25+) und die Autoren argumentierten gegen damalige Hypothesen, die eine generelle Aktivierung
von Lymphozyten im ZNS selbst bei Gesunden postulierten (Svenningsson u. a.
1995). Feger u. a. (2007a) fanden ebenfalls ausgeglichene Häufigkeiten in Blut
und Liquor (Feger u. a. 2007a). Da eine Produktion von Lymphozyten im ZNS
ausgeschlossen ist und alle Lymphozyten somit ihren Ursprung im peripheren
Blut haben (Kleine u. a. 1999), könnte eine mögliche Erklärung für den abweichenden Quotienten bei Patienten mit CIS ein Rezeptorverlust für IL-2 (CD25)
beim Übertritt über die BHS der regulatorischen T-Zellen sein.
Flügel u. a. (2001) untersuchten in einer Studie das Migrationsverhalten von
MBP-reaktiven T-Tellen im erweiterten Tiermodell der MS, der (transfer)-EAE.
Dabei wurden retrovirale Gene in die Zielzellen eingebracht, deren Translation zur Expression des green fluorescent protein (GFP) führt. Die transgene
Expression und somit Fluoreszenzintensität des GFP kann dabei in Echtzeit
gemessen werden und ermöglicht die gezielte Identifikation und Isolierung der
Zellpopulation. Nach Injektion der Zellen umfasste ein früher Migrationsweg
die parathymischen Lymphknoten, periphere Blut und Milz und schließlich das
ZNS. Interessanterweise unterliefen die ex vivo aktivierten T-Zellen während
der Transmigration einer Reihe von Veränderungen ihrer Expressionsstruktur
an Aktivierungsmarkern und Rezeptoren, darunter auch für den IL-2 Rezeptor,
CD25. Begleitet wurde dies von der Hochregulation anderer ZNS-spezifischer
Chemokinrezeptoren, die möglicherweise der Chemoattraktion der Zellen ins
ZNS dienen. In einer zweiten Migrationsphase ins ZNS am dritten Tag post
injectionem der Zellen reduzierte sich die Fluoreszenzintensität von ca 90 %
auf 10 % der CD4+ Zellen im ZNS und lag damit etwas über der in der Literatur beschrieben Häufigkeit enzephalitogener Effektor-T-Zellen. Diese Reduktion
scheint hauptsächlich aufgrund apoptotischen Zelltodes stattzufinden. Die Au-
4.2. Diskussion der Ergebnisse
69
toren beschrieben somit einen komplexen Migrationsweg der Lymphozyten von
der Peripherie ins ZNS mit konsekutiver funktioneller Veränderung der Oberflächenbeschaffenheit und Apoptose (Flügel u. a. 2001).
Der größere Quotient in der Kohorte der CIS Patienten in dieser Studie setzt
sich sowohl aus einem höheren Anteil im PBL (6 % vs. 4 %), als auch einem niedrigeren Anteil im CSF im Vergleich zu Gesunden zusammen (4 % vs. 6 %, vgl.
Tabelle 3.3 auf Seite 42). Weitere Untersuchungen zum Thema, ob der Übertritt
der TREG bei Patienten mit CIS mit einem Rezeptorverlust oder vestärkter
Apoptose einhergeht, sind wünschenswert. Beide möglichen Erklärungsansätze
würden eher einen reduzierten Anteil im CSF bei gleichem Anteil im PBL favorisieren.
Die ins Blut ausgeschütteten, aktivierten Lymphozyten rezirkulierenden zwischen der Peripherie und dem ZNS in einem komplizierten Prozess, der das sog.
rolling“, Anhaften der Zellen ans Endothel, Aktivierung, feste Adhäsion und
”
Transmigration beinhaltet (Kleine, Benes 2006). Eine andere Forschungsgruppe
um Kleine u. a. (1999) untersuchte ebenfalls verschiedene Lymphozytensubpopulationen mit Bildung des Quotienten PBL:CSF bei Patienten mit verschiedenen neurologischen Krankheiten. Die Autoren fanden signifikant unterschiedliche Quotienten, sowohl für Zellen, als auch Proteine im inter- sowie im intraindividuellen Vergleich. Eine andere mögliche Erklärung könnte in der Selektivität der BHS bzw. PBL-CSF-Schranke liegen. Die Selektion der Lymphozyten
scheint sich hauptsächlich am Kapillarendothel der BHS und der epithelialen
Blut-CSF-Barriere des Plexus choroideus abzuspielen. Dabei wird sie durch eine
Vielzahl von Transmigrationspfaden entlang der Kapillarwand ermöglicht, bestehend aus Rezeptor-Liganden Interaktionen von Adhäsionsmolekülen der Zelloberfläche und des Epithels (siehe Abschnitt 4.2.2 auf Seite 66). Ein Großteil
der Regulation des Leukozytentransfers könnte dabei über die Rezeptor- und Ligandendichte geschehen, um die differenzierte Diapedese zu ermöglichen (Kleine
u. a. 1999). In der selben Studie wurde z.B. ein größerer Quotient für aktivierte
T-Lymphozyten (CD3+ HLA-DR+) als für nicht-aktivierte (CD3+ HLA-DR-)
gefunden und als Hinweis auf eine erschwerte Transmigration vom Blut- ins Liquorkompartiment gewertet. Dieses Ergebnis zeigte sich am ausgeprägtesten in
der Gruppe der Patienten mit neuroimmunologischen Krankheiten (MS: n = 2;
Borreliose: n = 1) mit abnehmendem Unterschied bei Patienten mit subakuter
Entzündung, bis hin zum einem Quotienten Q ≈ 1 bei Patienten mit Meningitis,
was hinweisend auf ein Äquilibrium der aktivierten T-Lymphozyten mit nahezu komplettem Zusammenbruch der selektiven Funktion der BHS während der
4.2. Diskussion der Ergebnisse
70
hochakuten Entzündungsphase ist. Mit n = 2 Patienten mit MS ist diese Studie
allerdings offensichtlich zu klein bemessen um eine allgemeingültige Aussage
treffen zu können.
Tabelle 4.3.:
Migrationspfade der verschiedenen Lymphozyten ins ZNS über die BHS. Die
Migration der Immunzellen ins Liquorkompartiment gliedert sich in einen frühen und
einen späten Migrationsweg. BZ = B-Zelle, TZ = T-Zelle CAM = Cellular adhesion molecule, Adhäsionsmolekül. Auszug, in Anlehnung an Kleine, Benes (2006).
Expression auf
Endothel des Gehirns
Lymphozyten
B-Zellen
CAMs der späten Lymphozyten-Endothel Interaktion auf kleinen Gehirngefässen
VCAM-1 (CD106)
VLA-4 (CD49d/CD29)
Bp50 (CD40)
CD40L (CD154) auf CD4+ Zellen und auf CD8+ (teilweise)
VLA-4 (CD49d/CD29)
LFA-3 (CD58)
LFA-2 (CD2)
ICAM-2 (CD102)
LFA-1 (CD11a/CD18)
CAMs der frühen Lymphozyten-Endothel Interaktion auf kleinen Gehirngefässen
Sgp90 (CD34)
L-selectin (CD62L) auf naiven und
L-selectin (CD62L) auf
(sLex (CD15s))
teilw. Memory TZ
naiven BZ
Junction adhesion molecules
CD18 (integrin β2 Untereinheit)
(JAMs)
P-Selectin (CD62P)
CD162 (P-selectin Glycoprotein Ligand 1)
E-selectin (CD62E)
CD162 (P-selectin Glycoprotein Ligand 1)
Eine mögliche Erklärung für die reduzierte Häufigkeit der TREG im CSF bei
Patienten mit CIS in dieser Studie könnte ein selektiver Rezeptordefekt der in
die Transmigration involvierter Proteine, z. B. CD49d, sein (Siehe Tabelle 4.3
auf Seite 70).
Es soll hier nicht weiter im Detail auf die molekularbiologischen Mechanismen eingegangen werden, sondern vielmehr die Komplexität dieses Vorgangs
verdeutlicht werden. Die Tabelle beschränkt sich auf einige wenige Transportproteine, außerdem gelten teilweise die gleichen Rezeptoren und Transporter
wie für andere Leukozyten. Bei der Migration vom Liquor ins Hirngewebe über
die Blut-CSF Barriere des Plexus choroideus gelten wiederum andere Mechanismen (Kleine, Benes 2006).Wahrscheinlich sind noch eine Reihe weiterer Proteine involviert und der komplette Mechanismus der Lymphozytenaktivierung
und ihrer Interaktion mit ebefalls aktiviertem Endothel, Lockerung der tight
junctions und anschliessender Diapedese ist im Detail noch wenig verstanden.
4.2. Diskussion der Ergebnisse
71
Eine differenzierte Betrachtung der in der Migration involvierten Proteine auf
T-Zellen ist nötig um einen möglichen Erklärungsansatz für das hier gefundene
Ungleichgewicht der Lymphozytensubpopulationen zu finden.
Aus bisher unbekannten Gründen wäre es darüberhinaus möglich, dass sich
bei einem gewissen Prozentsatz der Patienten die gestörte Homöostase in relativ schneller Zeit selbst reguliert, wie auch anscheinend eine Rekonvaleszenz
der Effektorfunktion im Verlauf des Krankheitskontinuums vom CIS bis zur SPMS stattfindet (Venken u. a. 2006). Obwohl keine signifikanten Unterschiede in
der CIS und MS Kohorte bestanden und die Unterschiede der Quotienten eher
marginal sind (1,6 vs. 1,5), spricht die in dieser Studie gefundene absteigende
Tendenz ebenfalls für eine Dynamik der Verteilung der TREG im fortschreitenden Krankheitsverlauf und eröffnet neue interessante Forschungsansätze für
longitudinale Studien mit Patienten mit CIS und ihrer Transformation zur MS.
4.2.4. Die quantitativen Unterschiede der TREG sind mit der
Krankheitsaktivität assoziiert
Ein besserer Korrelationskoeffizient als bei Betrachtung des gesamten Patientenkollektivs zeigte sich in der Stratifizierung nach geringer Läsionslast mit
weniger als sieben Läsionen im initialen cMRT (r = 0,68 und p ≤ 0,001). Dies
lässt sich durch die Tatsache erklären, dass nicht jede magnettomografisch detektierte Läsion zu einem klinisch erfassbaren Defizit führen muss und z. B.
Läsionen an strategisch weniger wichtigen Punkten vom Patienten unerkannt
bleiben können; grade in frühen Krankheitsstadien ist die Korrelation des Läsionsvolumens mit dem EDSS schwächer als im Verlauf (Brex u. a. 2002). Somit
geht ein höherer Quotient in einem linearen Zusammenhang mit einer größeren
Läsionslast und somit stärkerer Entzündungsaktivität im ZNS einher. Diese
Ergebnisse sind hinweisend auf einen direkten Einfluss einer Dysbalance für
TREG im Liquor. Je geringer die Häufigkeit im CSF ist, desto größerer ist die
Läsionslast im MRT.
Obwohl die Korrelation von kranialer Läsionslast und dem subjektiven Beeinträchtigungsgrad der Patienten mit MS eher moderat ist, sind Anzahl und
Volumen initialer Läsionen bei Patienten mit CIS ein robuster Prediktor konsekutiver Defizite. Studien konnten zeigen, dass das Risiko mit größerer initialer
Läsionslast steigt (Brex u. a. 2002). Eine neuere Studie stratifizierte das Patientengut von 181 RR-MS Patienten nach niedriger Läsionslast (≤ 2,0 cm3 ) und
fand eine signifikante negative Korrelation zu einer EDSS Verschlechterung im
4.2. Diskussion der Ergebnisse
72
fünf-Jahres FU (Vaneckova u. a. 2009). Die klinische Relevanz eines frühzeitigen
MRT bei Patienten mit CIS ist unbestritten und wird in Zukunft im Rahmen
verbesserter Technik und Diagnosekriterien vermutlich noch steigen.
In einer longitudinalen Studie von Rinaldi u. a. (2006) untersuchten die Autoren verschiedene Lymphozytenpopulationen im Blut von 20 Patienten mit CIS
und führten serielle MRT-Scans über einen Zeitraum von einem Jahr durch.
Die Patientenkohorte wurde in Personen mit aktiven und inaktiven Läsionen
im MRT stratifiziert und hinsichtlich Unterschiede in den absoluten und relativen Lymphozytenpopulationen untersucht. Es fand sich zwar kein signifikanter
Unterschied für CD4+ CD25high , jedoch für zwei andere Untergruppen mit regulatorischer Kapazität (CD8+ CD25high und DN αβ T-Zellen) Es wurden allerdings nur Zellen des peripheren Bluts untersucht und die Studie ist mit n = 20
relativ klein. Darüberhinaus liefert diese Studie keine Hinweise auf Kausalzusammenhänge zwischen peripheren Zellen und zentralnervöser Pathophysiologie (Rinaldi u. a. 2006). Jensen u. a. (2004) fanden reduzierte Häufigkeiten an
TREG im CSF bei Patienten mit abnormen MRT im Vergleich zu Probanden
mit normalem Scan (Jensen u. a. 2004).
Zusammengefasst sind die Ergebnisse dieser Studie hinweisend für die Existenz einer Assoziation zwischen systemischer Immunreaktion und Entzündung
des ZNS bei Patienten mit CIS. Erstmals wird die Rolle regulatorischer T-Zellen
in der frühen Pathogenese gezeigt und mögliche Defekte in Molekülen der Diapedese als Ursache dargestellt. Obwohl genaue Ursache-Wirkungsbeziehungen
der verschiedenen Lymphozytenpopulationen mit der Krankheitsaktivität im
Gehirn nach wie vor nur wenig verstanden sind, belegen diese Resultate die
Wichtigkeit subtiler, aber komplexer Anomalien im Immunsystem mit höchster
pathologischer Relevanz.
Der hier untersuchte Quotient scheint darüber hinaus die Krankheitsaktivität
gemessen am cMRT in positiver Korrelation widerzuspiegeln. Hieraus ergibt sich
möglicherweise ein neuer, relativ einfach bestimmbarer Surrogatlaborparameter
für den Kliniker. Patienten mit besonders hohem Quotienten befinden sich in
einem aktiven Krankheitsstadium, oder sind möglicherweise einem hohen Risiko
für entzündliche Aktivität im Gehirn und damit kumulativer Beeinträchtigung
im Krankheistverlauf ausgesetzt.
Vor allem bei Patienten mit initial geringer Läsionslast scheint die Assoziation stärker zu sein. Gerade diese Patienten haben aber bei isolierter Betrachtung der Läsionslast ein eher niedrigeres Risiko, als z. B. Patienten mit hohem
Läsionsvolumen (s. o.). Die kombinierte Betrachtung strategischer Läsionen und
4.2. Diskussion der Ergebnisse
73
der Volumetrie in der Bildgebung zusammen mit liquorzytologischen Befunden
könnte also u. U. eine bessere Sondierung derjeniger Patienten ermöglichen, die
in besonderem Masse einer rascheren Konversion zu MS und klinischer Beeinträchtigung ausgesetzt sind. Somit könnte der hier gemessene Quotient auch
eine Entscheidungshilfe für eine immunmodulatorische Therapie darstellen und
auch solche Patienten selektieren, denen aufgrund geringer magnetresonanztomografischer Befunde von einer Therapie abgeraten wurde. Ob die Bestimmung der Quotienten in der klinischen Routinediagnostik einsetzbar ist und
welches Potential sie als Prediktor für den weiteren Krankheitsverlauf oder eine
Therapieentscheidung haben, sollte weiterhin Gegenstand intensiver Forschung
sein (siehe auch Abschnitt 4.3 auf Seite 82). Longitudinale Studien über z. B.
fünf Jahre könnten klären, ob diese Patienten signifikant öfter Schübe erleiden oder früher in die sekundär-progressive Form der MS konvertieren; schon
heute weiß man, dass die T2 -gewichtete Läsionslast bei SP-MS Patienten am
größten ist (Nijeholt u. a. 1998) und Assoziationen dieser weit fortgeschrittenen
Form der MS mit initialen Liquorbefunden stellen einen weiteren, interessanten
Forschungsansatz dar.
Die ROC-Analyse des Quotienten für TREG bietet einen möglichen
Laborparameter für die Diagnose
In dieser Studie wurde für den Quotienten der TREG gute AUC von 0,79
bis 8,01 gefunden, mit geringfügig besseren Werten bei Patienten stratifiziert
nach EDSS Verbesserung im Follow-Up. Mit Werten für Sensitivität und Spezifität um 0,75 ist der Quotient daher möglicherweise geeignet, einen Laborparameter im Diagnosefindungsprozeß des CIS beizutragen. Stratifizierung nach
eher milder Krankheitsaktivität erbrachten kaum diagnostischen Gewinn (siehe
auch Tabelle 3.4 auf Seite 43). Warum nicht noch bessere Werte für Spezifität
und Sensitivität erreicht wurden, lässt sich möglicherweise durch die Tatsache
erklären, dass TREG nicht nur in der Pathogenese der MS eine Rolle spielen. Experimentelle Studien haben gezeigt, dass die Abwesenheit dieser Zellen
prädisponierend für die Entwicklung auch anderer Autoimmunerkrankungen,
wie z. B. rheumatoide Arthritis, Diabetes Mellitus Typ I, systemischer Lupus
erythematosus, Thyreoiditis Hashimoto und Sjögren Syndrom, sein kann (Ma
u. a. 2009). Desweiteren könnte es noch andere krankhafte Zustände geben, in
denen die Häufigkeit der regulatorischen T-Zellen verändert ist, die aber in
dieser Studie nicht erfasst wurden.
4.2. Diskussion der Ergebnisse
74
4.2.5. Keine quantitativen Unterschiede für die Expression von
CD28 bei Patienten mit CIS
Die Analyse der Quotienten für CD28 ergab keine signifikanten und relevanten
Unterschiede im Kohortenvergleich. Für CD4+ CD28+ Zellen wurden für MS
und CIS Patienten sowie für die Kontrollgruppe Quotienten von ca. 1,0 gefunden. Für keine der teils marginalen Unterschiede bei CD8+ CD28+ im Vergleich
der CIS, MS und Kontrollkohorte wurde Signifikanz im nicht-parametrischen
Test erreicht. Der prozentuale Anteil aller T-Zellen von CD4+ CD28+ war dabei höher als der Anteil der CD8+ CD28+ Zellen (ca. 90 % vs. 55 %). Auf eine
ROC-Analyse wurde wegen fehlender Diskriminationsmöglichkeit verzichtet.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß sich T-Zellen in Bezug auf ihren Rezeptorbesatz mit CD28 bei Patienten mit CIS und Gesunden nicht unterscheiden und dass ein weitestgehend ungehinderter Austausch über die Blut-HirnSchranke dieser Zellen stattfinden kann, bzw. keine Selektion beim Übertritt
ins Liquorkompartiment anhand des Oberflächenbesatzes mit CD28 vollzogen
wird. Sollte ein quantitativer Unterschied in einer Lymphozytenpopulation mit
anderem Phänotyp vorliegen (s. o.), so sprechen diese Ergebnisse dafür, daß
zumindest keine nennenswerten Unterschiede im Expressionsniveau für CD28
besteht. Weiterhin sprechen diese Ergebnisse gegen eine gesonderte Rolle von
CD28 in der Pathogene des CIS, soweit dies mit der hier durchgeführten Immunphänotypisierung erfassbar erscheint, d. h. diese Aussage gilt für quantitative Unterschiede und muss für einen möglichen qualitativen Defekt relativiert
werden. Für eine qualitative Beeinträchtigung ließ sich jedoch auch nach intensiver Literaturrecherche kein Anhaltspunkt finden.
Übereinstimmende Daten lieferte eine Studie, die sowohl vor, als auch nach
i. v. Steroidtherapie bei RR-MS Patienten keine Unterschiede in der Häufigkeit
der CD28+ Zellen im Blut im Vergleich mit gesunden Kontrollpersonen fand
(Aristimuño u. a. 2008). Im Gegensatz dazu fanden Fransson u. a. (2009) in einer
kleinen Studie mit RR-MS eine verminderte Expression für CD28+ im Blut auf
CD4+ und CD8+ Lymphozyten in der Kontrollgruppe (Fransson u. a. 2009). In
dieser Studie wurden zwar auch höhere Anteile in der CIS Kohorte gefunden, die
Unterschiede waren allerdings nicht signifikant und numerisch als unbedeutend
einzustufen (95 % vs. 91 % bei CIS und 54 % vs. 49 % bei Kontrollen).
CD28 als signaltransduzierendes Molekül auf der Oberfläche der meisten TZellen ist ein Marker für die Aktivierungsfähigkeit der Zellen. Es initiiert eine aktivierende Signalkaskade und führt u. a. zu Zellproliferation und Wachs-
4.2. Diskussion der Ergebnisse
75
tum (Reichert u. a. 2001). Auch für CD25high TREG scheint die Interaktion
von CD28-CD80/86 nötig für Entwicklung und Reifung im Thymus zu sein
(Spence, Green 2008). Der genaue Mechanismus ist bis jetzt allerdings noch
unbekannt und die Ergebnisse dieser Studie liefern keinen Anhaltspunkt für
einen pathophysiologisch relevanten Defekt in diesem co-stimulatorischen Pfad
der Signaltransduktion in Bezug auf Funktion der TREG und der Schwere der
Erkrankung, gemessen anhand magnetresonanztomografisch erkennbarer T2 hyperintenser Läsionen.
4.2.6. B-Zellen finden sich verstärkt in Patientenliquor und können
diagnostische Hilfestellung bieten
Sowohl für reife (CD19+) als auch für Memory B-Zellen (CD19+ CD27+) fanden sich signifikant größere Quotienten in der Kontrollgruppe (p ≤ 0,001). Nach
Bonferroni-Korrektur war der geringfügig größere Quotient für Plasmazellen in
CIS-I nicht mehr als signifikant zu betrachten. Die unterschiedlichen Quotienten
resultieren bei annähernd identischen Häufigkeiten im PBL dabei ausschließlich
aus einer höheren Prävalenz der B-Zellen im Liquor bei CIS Patienten, was sich
in einem erniedrigten Quotienten wiederspiegelt.
Insgesamt überwiegen B-Zellen eindeutig im peripheren Blut im Vergleich
zum Liquor bei Patienten mit CIS sowie MS. Svenningsson u. a. (1995) fanden
im PBL von Gesunden einen Anteil von 14 % (hier 13 %) CD19+ Zellen an allen
Lymphozyten, im CSF betrug der Anteil 0,8 % (Svenningsson u. a. 1995, hier
1,5 %). Obwohl die MS als überwiegend T-Zell mediierte Erkrankung angesehen
wird, ist schon seit Jahren die Rolle von B-Zellen in der Pathogenese erkannt
worden und Gegenstand intensiver Forschung. Klonal expandierte B-Zellen akkumulieren im CSF und Läsionen der Patienten (Cepok u. a. 2001; Corcione
u. a. 2004). Corcione u. a. (2004) konnten zeigen, dass offenbar im ZNS von Patienten mit MS eine Rekapitulation der B-Zell-Differenzierung von naiven und
Memoryzellen bis hin zu CD19- Zentroblasten stattfindet. Die Autoren fanden
signifikant erhöhte Level an CD138+ Plasmazellen und CD27+ Memoryzellen
im CSF bei MS-Patienten. Letztere zeigten eine starke Expression der Chemokinrezeptoren CCR1, CCR2, und CCR4 im inflammatorischen Milieu, welche
für die Chemotaxis naiver und Memory B-Zellen ins ZNS verantwortlich sein,
oder der Retention der Zellen im Liquorkompartiement dienen könnten (Corcione u. a. 2004). Die Autoren begründeten darüber hinaus die Akkumulation von
Plasmazellen im Liquor mit der Chronizität der Erkrankung, die im Verlauf zur
4.2. Diskussion der Ergebnisse
76
Enwicklung des 138+ Phänotyps geführt haben könnte. Diese Aussage können
die Ergebnisse der vorliegenden Studie nicht bestätigen, da auch schon bei Patienten mit CIS erhöhte Werte gefunden wurden. Es wäre allerdings möglich,
das Plasmazellen schon vor dem ersten klinisch erfassbaren Defizit im ZNS akkumulieren und dem Ausbruch der Krankehit vorangehen, bzw. dass sich naive
B-Zellen im ZNS in Plasmazellen umwandeln.
In einer anderen kleinen Studie wurden erhöhte Häufigkeiten von CD19+ Zellen
im Liquor von MS Patienten gefunden und gegen niedriegere Häufigkeiten bei
Patienten mit anderen entzündlichen neurologischen Krankheiten abgegrenzt
(Oreja-Guevara u. a. 1998).
Die hier gefundenen Ergebnisse für Patienten mit MS sind im Einklang mit
früheren Forschungsanstrengungen (s. o.) und legen nahe, dass auch beim CIS
ähnliche pathogenetische Mechanismen in Bezug auf Expansion bzw. Rekrutierung von B-Zellen ins Liquorkompartiment verantwortlich sind. Obwohl ihre Rolle bei entzündlichen Nervenerkrankungen bewiesen wurde, ist die Stellung von B-Zellen in der Evolution und Progression der MS noch wenig untersucht. Im Gegensatz zu früher RR-MS scheint die inflammatorische Reaktion
im späteren Krankheitsverlauf bei SP-MS in den Liquor kompartimentalisiert
zu sein (Kutzelnigg u. a. 2005). Dies spiegelt sich in der Bildung von aberrantem
lymphatischem Gewebe im Bindegewebe des ZNS (Hirngewebe, Meningen und
perivaskulär) wieder. Diese ektopen follikulären B-Zell Strukturen entwickeln
sich im fortgeschrittenen Krankheitsverlauf und könnten eine wichtige Rolle in
der Unterhaltung der B-Zellreaktion einnehmen (Serafini u. a. 2004). Die BZellantwort bei Patienten mit MS stellt demzufolge einen dynamischen Prozess
dar und es ist wichtig, den Einfluss der B-Zellen schon in frühestmöglichen
Krankheitsstadien zu untersuchen und Veränderungen in der quantitativen Zusammensetzung der Subpopulationen im gesamten Krankheitsverlauf erfassen
zu können.
Bei einem kleinen Patientenkollektiv mit CIS fand eine Forschungsgruppe
ebenfalls erhöhte Häufigkeiten für reife B-Zellen und Zellen mit Memory-Phänotyp (CD27) im CSF. Weiterhin war α4-Integrin, ein Adhäsionsmolekül für
den Übertritt von Lymphozyten über die BHS, verstärkt exprimiert und korrelierte positiv mit der Krankheitsaktivität. Somit könnte α4-Integrin für die Akkumulation der B-Zellen im Liquor verantwortlich sein (Lee-Chang u. a. 2011).
Die meisten B-Zellen haben den reifen CD19+ Phänotyp. Diese haben die
Fähigkeit, für Jahre im ZNS zu persistieren (Kuenz u. a. 2008). Kuenz u. a.
(2008) fanden bei Patienten mit CIS ebenfalls signifikant erhöhte Häufigkeiten
4.2. Diskussion der Ergebnisse
77
für reife B-Zellen, Plasmazellen und kurzlebigere Plasmablasten (CD19+ CD138+)
im Liquor. Die Mehrheit der B-Zellen trug dabei den CD19+ CD27+ MemoryPhänotyp, gleiche Ergebnisse wurden in der vorliegenden Studie (Daten nicht
gezeigt) und in der Literatur gefunden. Die Minderheit war vom naiven Typ
(CD19+ CD27-). Darüber hinaus fand sich ein Abwärtstrend der Häufigkeiten
im CSF vom CIS über RR-MS zur SP-MS (Kuenz u. a. 2008). Diese Resultate und die Ergebnisse der vorliegenden Studie implizieren, dass die inflammatorische B-Zellreaktion besonders in frühen Krankheitsstadien und akuter
Entzündung eine Rolle spielt und eine veränderte Homöostase von B-Zellen
schon bei Patienten mit CIS vorliegt. Hier konnte kein signifikanter Unterschied
der B-Zellen im Vergleich der Kohorten CIS und MS gefunden werden (12 %
vs. 12 %).
Die ROC-Analyse des Quotienten für B-Zellen stellt einen
möglichen Laborparameter für die Diagnostik dar
In der ROC-Analyse wurden signifikante Werte mit einer guten AUC von ca.
0,85 für reife B-Zellen und Memoryzellen gefunden (p ≤ 0,001). Bei Betrachtung aller reifen B-Zellen fand sich eine Sensitivität von 0,78 und Spezifität von
0,92 bei einem guten Likelhood-ratio von annähernd 10. Für Plasmazellen lagen
die Werte durchschnittlich niedriger bei besserer Sensitivität. Somit stellt die
Bestimmung des Quotienten, besondes für reife B-Zellen, einen möglichen Laborparameter im diagnostischen Prozess dar. Ein Quotient kleiner oder gleich
4,4 für reife B-Zellen diskriminiert mit hoher Spezifität zwischen CIS und gesunden Kontrollen. Ca. neun von zehn Patienten mit einem Quotienten kleiner
oder gleich 4,4 hatten tatsächlich ein CIS. Es zeigt sich auch hier eine – wenn
auch geringfügig – bessere diagnostische Präzision bei Stratifizierung nach einem frühen Krankheitsbeginn. Dies unterstreicht die Rolle von B-Zellen in der
Pathogenese ganz zu Beginn der Krankheit und unterstützt die gegenwärtige
Auffassung, möglichst früh mit einer immunmodulatorischen Therapie zu beginnen. Die bessere Spezifität der B-Zellen als der TREG (0,92 vs. 0,76) liegt
möglicherwiese in der Tatsache begründet, dass sich in klinischen Studien, in
denen B-Zellen bei MS Patienten mit anderen neurologisch-inflammatorischen
Krankheiten (OIND) verglichen wurden, eine Akkumulation der Zellen nur bei
MS fand, nicht jedoch in der OIND Gruppe oder bei gesunden Kontrollen;
für TREG konnte diese Beobachtung teilweise nicht gemacht werden (OrejaGuevara u. a. 1998).
4.2. Diskussion der Ergebnisse
78
4.2.7. Positive Korrelation des Quotienten für Plasmazellen mit der
kranialen Läsionslast
Die Korrelationsanalyse der Quotienten erbrachte eine allenfalls schwach- bis
mittelgradige Assoziation mit der Läsionslast.
In dieser Studie wurde eine reziproke Beziehung zwischen Häufigkeit der Plasmazellen im CSF und Läsionslast gemessen. Dieses Ergebnis erscheint paradox,
denn nach dem gegenwärtigen Verständnis von Plasmazellen in der Pathogenese
der MS wäre eine negative Korrelation des Quotienten mit der Läsionslast zu
erwarten: Je größer die Häufigkeit für Plasmazellen im CSF, desto größer die
kraniale Läsionslast. Das vorliegende Ergebnis ist am ehesten zufallsbedingt.
Hinweise dafür finden sich in divergierender Polarität der Korrelationskoeffizienten für reife B-Zellen und Memory B-Zellen (negativ) und Plasmazellen (positiv). Beiden Zellpopulationen wird eine proinflammatorische Funktion in der
Pathogenese zugesprochen (Corcione u. a. 2004), demzufolge wäre ein gleichsinniger Koeffizient zu erwarten. Weiterhin sind die Ergebnisse mit p = 0,006
(keine Stratifizierung) und p = 0,007 (stratifiziert nach Läsionen) auf dem Signifikanzniveau von α = 0,8 % nach Bonferroni allenfalls knapp signifikant und
stratifiziert nach EDSS nicht signifikant.
Zu einem abweichenden Ergebnis kamen auch Kuenz u. a. (2008), die ebenfalls den Zusammenhang von B-Zellen und Krankheitsaktivität, gemessen am
cMRT, untersuchten. Es fanden sich positive Korrelationen für reife B-Zellen
und Plasmablasten mit hoher Läsionslast (≥ 9 Läsionen) und neu aufgetretenen
Gd-speichernden Läsionen. Für klinische Parameter wie den EDSS fand sich
keine Korrelation der B-Zellen im CSF (Kuenz u. a. 2008). Diese Ergebnisse
sind hinweisend auf eine direkte Beteiligung von Plasmazellen an entzündlichen
ZNS-Läsionen. Auch bieten sie einen Erklärungsansatz für Erkenntnisse, die aus
Therapiestudien mit Natalizumab gewonnen wurden. Es fand sich eine signifikante Reduktion der Häufigkeit von CD19+ B-Zellen und CD138+ Plasmazellen im CSF unter Natalizumab, welche in positivem Zusammenhang mit einer
Reduktion der Schubrate sowie entzündlicher Aktivität im MRT stand (Stüve
u. a. 2006).
Zusammenfassend konnte in dieser Studie kein proportionaler Zusammenhang zwischen einer Dysbalance für B-Zellen und Entzündungsaktivität im ZNS
gezeigt werden.
4.2. Diskussion der Ergebnisse
79
4.2.8. Keine quantitativen Unterschiede der Quotienten für
Thymusemigranten bei Patienten mit CIS
In der Analyse der CD4+/CD8+ Thymusemigranten fand sich kein signifikanter
Unterschied der Quotienten im Kohrtenvergleich. In allen Kohorten überwiegt
der Anteil im peripheren Blut im Vergleich zum Liquor. Für CD8+ Thymusemigranten lag der Quotient deutlich niedriger. Dies ist Resultat sowohl einer
größeren Häufigkeit der CD8+ Zellen im CSF, als auch niedrigerer Prävalenz
im PBL. Für MS zeigte sich ein Trend zu geringfügig niedrigeren Häufigkeiten
der Thymusemigranten im Blut und Liquor. Aufgrund nicht-signifikanter Unterschiede wurde auf eine ROC-Analyse verzichtet.
Es lässt sich somit keine Aussage über eine relevante Akkumulation oder Verminderung der Thymusemigranten bei Patienten mit CIS oder MS treffen.
Auch scheint der Auswurf der naiven Zellen aus dem Thymus keiner signifikanten Veränderung unterworfen zu sein, wie sich an annähernd identischen
Häufigkeiten im peripheren Blut zeigt (41–44 % für CD4+ und 25–31 % für
CD8+). Würden die T-Zellen beim Übertritt über die BHS ihren Phänotyp
zu Ungunsten der Expression von CD45RA verändern, wäre eine Depletion aus
dem peripheren Blutpool bei Patienten mit CIS/MS zu erwarten. Hierfür zeigte
sich weder für CD4+ noch CD8+ eine Tendenz.
CD45RA wird auf naiven, also noch nicht antigen-stimulierten T-Zellen exprimiert. Ein Rückgang der Expression ist im Ag-stimulierten Milieu bei chronischen Autoimmunerkrankungenzu erwarten, während unter denselben Bedingungen eine Augmentation von Memoryzellen folgerichtig erscheint (Mikulkova u. a. 2011). In einer kleineren Studie fand sich ein Trend zur reduzierten Häufigkeit naiver CD4+ T-Zellen im PBL bei Patienten mit RR-MS
und Diabetes Mellitus Typ I. Memoryzellen, durch negative Expression für
CD45RO phänotypisiert, fanden sich signifikant erhöht bei DM Typ I, nicht
aber bei MS (Mikulkova u. a. 2010). Die selbe Arbeitsgruppe erzielte später in
einer ähnlich aufgebauten Studie signifikante Ergebnisse mit einer reduzierten
Häufigkeit CD4+ CD45RA +CCR7+ Zellen bei Patienten mit RR-MS (Mikulkova u. a. 2011). In der neueren Studie wurde allerdings eine zusätzliche Immunphänotypisierung mit dem Zytokinrezeptor CCR7 vorgenommen und die
nicht eindeutig reproduzierbaren Ergebnisse sowie die Resultate der vorliegenden Arbeit können eine veränderte Homöostase für Thymusemigranten bei der
MS nicht sicher bestätigen.
Zusammengefasst unterstreichen diese Daten, sowie auch die hier gefundenen
4.2. Diskussion der Ergebnisse
80
Ergebnisse, die Rolle von Memoryzellen in der Immunpathogenese der MS. Mikulkova u. a. (2011) fanden signifikant reduzierte Häufigkeiten naiver T-Zellen
bei MS, während in der vorliegenden Arbeit und in früheren Studien allenfalls
Trends aufgezeigt werden konnten. Beim CIS als frühstmögliche Manifestation
der Krankheit scheint eine mögliche Transformation der naiven Zellen zugunsten des Memoryphänotyps anscheinend noch nicht stattgefunden zu haben.
Die Bestimmung der CD45RA Expression spielt auch eine Rolle in der Evaluation der TREG in der Pathogenese. TREG aus Nabelschnurblut haben
hauptsächlich einen naiven Phänotyp und ein kleiner Anteil dieser CD45RA+CD45RO- Zellen findet sich immernoch bei gesunden Erwachsenen. Die Zellen zeigen hohe Level an TRECs (T-cell receptor excision circles, ein Marker für den Ausstoß der naiven Zellen aus dem Thymus). Diese recent-thymicemigrants (RTE)–TREG repräsentieren Vorläufer der adulten, AG-spezifischen
CD45RO+ Memory–TREG, welche die Mehrheit der zirkulierenden TREG
ausmachen und ein breites T-Zell Rezeptor Repertoire aufweisen. Aufgrund
physiologischer Immunoseneszenz und Involution des Thymus reduzieren sich
die RTE–T-REgs mit fortschreitendem Alter, während das Gesamtlevel der
TREG annähernd konstant bleibt oder sogar steigt. Möglicherweise findet eine Neubildung der Zellen in der Peripherie aus aktivierten Effektor/Memory
T-Zellen statt (Venken u. a. 2010). Jüngere Untersuchungen legen eine verminderte Häufigkeit der RTE–TREG bei Patienten mit MS nahe und konnten verminderte Level an TRECs aufzeigen, was eine dem Alter unangemesse
niedrige Auswurfleistung des Thymus mit konsekutiver gestörter Homöostase
der Zellen suggeriert. Darüberhinaus ist schon die Effektorfunktion der frisch
emigrierten Zellen gestört und Hypothesen wurden aufgestellt, daß diese für
die beeinträchtigte Funktion unter allen CD25high TREG verantwortlich seien
(Haas u. a. 2007; Venken u. a. 2008b).
Mittelgradige bis schwache negative Korrelationen mit der Läsionslast wurden für CD4+ Thymusemigranten gefunden. Nach Bonferronikorrektur blieb als
statistisch signifikant nur die Stratifizierung nach EDSS Verbesserung (p = 0,004).
Patienten mit einem niedrigen Quotienten und somit größerem relativen Anteil
im Liquor hatten somit eine größere Läsionslast im MRT. Diese Beobachtung
ist vereinbar mit der Tatsache, dass die MS eine T-Zell mediierte Erkrankung ist
und aktivierte CD4+ Memoryzellen mit Krankheitsschüben assoziiert werden
(Okuda u. a. 2005), welche aus dem Pool der naiven T-Zellen hervorgehen und
für Demyelinisierung verantwortlich sind (Muraro u. a. 2000). Somit scheinen
schon naive CD45RA+ T-Zellen Einfluß auf Pathogenese zu spielen.
4.2. Diskussion der Ergebnisse
81
4.2.9. Quantitative Unterschiede für CD14+CD16+ Monozyten bei
Patienten mit CIS
Für CD14+CD16+ Monozyten wurde ein signifikant größerer Quotient bei CIS
im Vergleich zu Kontrollen gefunden. Nach Bonferroni-Korrektur knapp nicht
mehr signifikant war der Vergleich von MS und gesunden Kontrollen (p = 0,049).
Dabei resultieren die größeren Quotienten bei CIS und MS aus einer verminderten Häufigkeit im Liquor bei identischen Häufigkeiten im Blut. Es liegt somit
eine veränderte Homöostase der Monozyten im Patientenliquor vor.
In dieser Studie fanden sich normale Serumhäufigkeiten der Monozyten. Mit
einem Anteil von ca. 14–19 % wurden geringfügig mehr CD14+ CD16+ Zellen gefunden als mit ca. 10 % in der Literatur beschrieben (Bergh u. a. 2004).
Frühere Studien fanden ebenfalls normale relative und absolute Häufigkeiten
aller Monozytenpopulationen im peripheren Blut bei Patienten sowie gesunden
Kontrollen (Bergh u. a. 2004; Kouwenhoven u. a. 2001). Dies die erste Arbeit,
die in der Betrachtung der Monozyten auch die durchflusszytometrische Analyse des Liquors bei Patienten mit CIS berücksichtigt.
Aus oben genannten Ergebnissen wird deutlich, dass die Zahl der CD14+CD16+ Zellen im Patientenliquor vermindert ist. Obwohl ein signifikanter Unterschied nur für den Vergleich der CIS Kohorte mit normalen Kontrollen und
(nach Bonferroni) nicht für die MS Kohorte besteht, unterscheiden sich die beiden Quotienten der Patientenkohorten jedoch kaum voneinander (2,1 vs. 2,3;
p = 0,81; Daten nicht gezeigt). Es ist daher möglich, dass prinzipielle Unterschiede der Häufigkeiten ebenfalls für MS Patienten gelten und kein CIS-spezifisches
Phänomen darstellen.
Obwohl Makrophagen/Monozyten proinflammatorisch in die Pathogenese der
MS eingreifen (Vaknin-Dembinsky u. a. 2008), gibt es jedoch auch Hinweise
auf einen protektiven Effekt. Interleukin-10, ein Zytokin mit immunregulatorischen Eigenschaften im Sinne einer Augmentation der antiinflammatorischen
TH2 -Antwort und Suppression der TH1 assoziierten Zytokine wird von Makrophagen sezerniert und könnte eine begünstigende Rolle bei MS spielen (Ozenci
u. a. 2000). Piccio u. a. (2008) fanden zwar größere Häufigkeiten IL-10 sezernierender Zellen im Liquor von MS-Patienten, allerdings schloss das Studiendesign sowohl RR als auch SP-MS ein und die mittlere Krankheitsdauer der
MS-Patienten betrug 13 Jahre. Es wäre also möglich, dass die hier erniedrigten
CD14+CD16+ Zellen im Liquor über erniedrigte antiinflammatorische Zytokinspiegel eine entzündungsfördernde Wirkung im Liquorkompartiment entfalten.
4.3. Vorschläge für weitergehende Forschungsanstrengung
82
Eine neuere Studie fand erhöhte Spiegel des antiinflammatorischen Rezeptors
sTREM-2 im Liquor, dessen membrangebundene Form auf CD14+CD16+ Makrophagen im Liquor gefunden wurde. Die Autoren schlussfolgerten, dass die
lösliche Form des Rezeptors die antientzündliche Funktion der Monozyten negativ beeinflusst (Piccio u. a. 2008). Die mögliche protektive Rolle der CD14+CD16+ Monozyten und ihre erniedrigte Häufigkeit im Liquor beim CIS sollte
in weiterführenden Studien evaluiert werden.
Neben CD14 und CD16 zeigen Monozyten eine überdurchschnittlich starke
Expression von Klasse II Antigenen auf der Zelloberfläche (Ziegler-Heitbrock
u. a. 1993). Angesichts der wichtigen Rolle von MHC-II bei der Antigenpräsentation könnten diese Zellen eine entscheidende Funktion in der Immunmodulation bei MS einnehmen. Es fand sich darüberhinaus auch eine erhöhte Expression
von Oberflächenmolekülen für die Integrin-assoziierte Zellmigration wie CD11a,
CD11c, CD18 und VLA-4 (Ziegler-Heitbrock u. a. 1993). Der schon in den Abschnitten 4.2.3 und 4.2.2 auf Seite 68 ff diskutierte mögliche Erklärungsansatz
könnte also in ähnlicher Weise auch für Monozyten gelten.
Wie bei den meisten anderen Färbungen erbrachte die ROC stratifiziert nach
Läsionslast die besten Ergebnisse. Mit einer signifikanten guten AUC von 0,78
und Sensitivität und Spezifität um 0,73 kann möglicherweise die durchflusszytometrische Untersuchung der CD14+C16+ Monozyten diagnostisch eingesetzt
werden.
Die Korrelationsanalyse erbrachte für keine der untersuchten Populationen
eine signifikante oder relevante Korrelation des Quotienten mit der Läsionslast.
Die Ausprägung des Quotienten mit veränderter Homöostase scheint also in
keinem direkten Zusammenhang mit der Entzündungsaktivität zu stehen. Vergleichende Studien zur Korrelation von Monozyten mit MRT-Befunden bei Patienten mit CIS oder MS wurden nicht gefunden.
4.3. Vorschläge für weitergehende Forschungsanstrengung
In jüngerer Vergangenheit ist eine Weiterdifferenzierung der regulatorischen TZellen ins Zentrum der Aufmerksamkeit gerückt, da auch aktivierte (CD25med )
und nicht nur regulatorische T-Zellen CD25 in unterschiedlich starker Ausprägung exprimieren können. Obwohl die CD25high -Population relativ homogen zu sein scheint, finden sich aber auch regulatorische Zellen in der CD25med Population (Venken u. a. 2010). Die Messung des intrazellulären Transkriptionsfaktors FoxP3 auf T-Zellen erlaubt z. B. eine akkurate Untersuchung der
4.3. Vorschläge für weitergehende Forschungsanstrengung
83
Häufigkeiten bei Patienten und Gesunden und das für FoxP3 kodierende Gen
konnte als essentiell in der Entwicklung der TREG dargestellt werden. Verminderte Expression von FoxP3 auf zellulärer Ebene korrelierte mit der beschriebenen Dysfunktion regulatorischer Zellen bei Patienten mit RR-MS. Im Gegensatz dazu konnte bei SP-MS Patienten keine verminderte Expression mehr
festgestellt werden; diese Beobachtung unterstützt erneut die Hypothese einer
Rekonvaleszenz der Suppressorfunktion im fortgeschrittenen Krankheitsverlauf
(Venken u. a. 2008a). Eine noch bessere Differenzierung konnte unlängst durch
den Einsatz von anti-CD127 AK erreicht werden. Die niedrige Expression von
CD127 auf CD4+ CD25high Zellen scheint besser zur Definition der TREG geeignet zu sein als die Expression von FoxP3, da dieses als intrazelluläres Protein
der forkhead Familie für die Purifikation der Zellen im Labor aus technischen
Gründen nur bedingt geeignet ist. CD4+ CD25high CD127low zeigen eine hochgradige suppressive Kapazität (Seddiki u. a. 2006).
Folgerichtig sollte die Untersuchung der Liquorzytologie bei Patienten mit CIS
in Zukunft dem aktuellen Stand der Forschung folgen, um Populationen innerhalb der TREG identifizieren zu können, die möglicherweise noch besser als
diagnostisches Hilfsmittel in Bezug auf Sensitivität und Spezifität geeignet sind
als die bloße Charakterisierung durch CD25high .
Desweiteren existiert eine Reihe anderer regulatorischer Zellen, die eine Rolle
in der Pathogenese des CIS oder der MS einnehmen könnten (siehe Tabelle 4.4
auf Seite 84), auf die hier aber nicht weiter eingegangen werden soll. Dennoch
bieten sie Potential für zukünftige Forschungsanstrengungen:
Das Datenmaterial der vorliegenden Studie liefert einen guten Ausgangspunkt
für eine Langzeitbeobachtung der Patienten, um das gesamte Spektrum der
Entwicklung der Liquorzytologie vom CIS bis zur SP-MS erfassen zu können.
Mithilfe serieller MRT-Untersuchungen und möglicherweise Liquorpunktionen
könnten folgende Fragen erörtert werden:
Die Effektorfunktion der TREG scheint sich im natürlich Verlauf zur SP-
MS zu rehabilitieren (s. o.). Eine Arbeitshypothese könnte sein, dass auch
das quantitative Ungleichgewicht der Zellen sich normalisieren kann und
bei Patienten mit CIS am stärksten im Vergleich zu späteren Krankheitsstadien gestört ist. Wie stellt sich der Quotient bei vom CIS zur MS
konvertierten Patienten dar? Unterscheidet sich die Effektorfunktion der
TREG bei Patienten mit CIS im Vergleich zu RR-MS, gemessen am sezernierten Zytokinprofil (s. o.)?
4.3. Vorschläge für weitergehende Forschungsanstrengung
84
Tabelle 4.4.:
Subpopulationen humaner regulatorischer T-Zellen. Wissenschaftliches und medizinisches Interesse an den Mechanismen der Immuntoleranz führte zur Entdeckung zahlreicher
immunregulatorischer Zellen mit jeweils eigenen suppressiven Mechanismen, die Aktivität
autoreaktiver T-Zellen zu supprimieren. NKZ = natürliche Killerzellen, med. = mittelgradig,
TR 1v=vTyp I regulatorische T-Zelle, TH 3 =vT-Helfer 3 Zelle, RTE = recent thymus emigrant. Auszug, in Anlehnung an Venken u. a. (2010).
Regulatorische
Phänotyp
Ursprung
Zellen
TREG
möglicher
Suppressionsmechanismus
CD4+CD25high FoxP3+
Thymus,
Peripherie
Zell-Zell Kontakt, IL-10,
TGF-β, IL-35,
Perforin oder Granzyme
NKZ
CD4/8+, DN,
Thymus
TCR: Vα24Jα18-Vβ11
IL-4, IFN-γ, IL-10 oder
Zytotoxizität
TR 1
CD4+CD25med
Peripherie
IL-10
TH 3
CD4+CD25med
Peripherie
TGF-β
Thymus
??
RTE–TREG
CD4+ CD25high
CD45RA+CD45RO-
Welchen Wert haben die Quotienten im Rahmen einer Therapieentschei-
dung? Lässt sich, eventuell in Kombination mit magnetresonaztomografischen Parametern, ein zuverlässigeres Urteil fällen, welche Patienten von
einer immmunmodulatorischen Therapie profitieren könnten?
Welchen prädiktiven Wert haben die Quotienten in Bezug auf Schubfre-
quenz, Schwere der Schübe, klinische Beeinträchtigung, Entwicklung des
EDSS oder Zunahme der kranialen Läsionslast?
Welche Krankheitsprogression lässt sich bei den in dieser Studie erfassten
Patienten mit CIS feststellen? Stratifiziert nach der Entwicklung von keiner MS, RR-MS und SP-MS, gibt es retrospektiv unterschiede der Quotienten, die möglicherweise prädiktiven Wert für den Konversionszeitraumund Typ darstellen?
Profitieren Patienten mit extremen Ausprägungen der Quotienten, z. B.
für Plasmazellen oder reife B-Zellen in besonderem Masse von einer immunmodulatorischen Therapie (z. B. senkt Natalizumab erwiesenermassen die Häufigkeiten bestimmter B-Zell Subtypen im CSF (Stüve u. a.
2006))?
Jüngere Hypothesen gehen von einer gestörten Effektorfunktion der Zel-
4.4. Kritische Würdigung und Grenzen der Studie
85
len schon in einem sehr frühen Entwicklungsstadium, der RTE–TREG,
aus (siehe Abschnitt 4.2.8 auf Seite 79). Lassen sich Unterschiede der
Häufigkeiten der RTE–TREG bei Patienten mit CIS feststellen, d. h. liegt
dem qualitativen Defekt möglicherweise auch ein quantitativer Defekt zugrunde?
Die vorliegende Studie fand eine Dysbalance CD14+ CD16+ Zellen mit
reduzierten Häufigkeiten im Patientenliquor. Dies ist möglicherweise ein
Hinweis auf eine protektive Rolle dieser Monozytenpopulation, die aufgrund der gestörten Homöostase nur eingeschränkt wahrgenommen werden kann. Hinweise auf mögliche antiinflammatorischen Effekte sind in
der Literatur beschrieben (Piccio u. a. 2008; Ozenci u. a. 2000) und sollten weiterführend erörtert werden.
Desweiteren sollte die Forschung auf dem Gebiet der Adhäsionsmoleküle intensiviert werden (siehe Tabelle 4.3 auf Seite 70), um ein besseres Verständnis
zugrundeliegender pathophysiologischer Mechanismen zu ermöglichen. Wenn es
gelänge, Störungen auf molekularer oder genetischer Ebene zu identifizieren,
könnten gezielte Therapien z. B. in Form monoklonaler Antikörper entwickelt
werden. Protektiven Zellen könnte ein anderer Weg der Diapedese geschaffen
werden und proinflammatorische Zellen am Übertritt gehindert werden, wie es
zum Teil in Form von Natalizumab in der Eskalationstherapie schon angewendet wird (Stüve u. a. 2006). So deuten jüngere Forschungsanstrengungen z. B.
auf einen möglichen SNP (single nucleotide polymorphism) im für die α-Kette
des IL-2 Rezeptors (CD25) kodierenden Gens und anderen Loci hin, die für die
Aktivierung und Homöostase der T- und B-Zellen eine wichtige Rolle spielen
(Hafler u. a. 2007).
4.4. Kritische Würdigung und Grenzen der Studie
Methodologische Probleme ergeben sich möglicherweise aus der Durchführung
mehrerer Färbungen bei relativ geringem Zellmaterial im FACS. Durchschnittlich werden bei Lumbalpunktion ca. 15 ml Liquor entnommen. Technisch bedingt ist dies jedoch nicht immer bei allen Patienten möglich und gerade bei
Materialgewinnung in der Kontrollgruppe mit (definitionsgemäss) weniger als
sechs Zellen pro Mikroliter Liquor kann dies bei Aufteilung auf mehrere wells
zu statistischen Problemem in der Auswertung führen. Je mehr verschiedene
Antikörper bei der Färbung eingesetzt werden und je höher eine spezifische
Zellpopulation differenziert wird, desto weniger Zellen gehen anschliessend in
4.4. Kritische Würdigung und Grenzen der Studie
86
die Berechnung ein. Trotzallem wurde die Durchflusszytometrie in der Vergangenheit erfolgreich für die Liquoranalyse auch mit geringem Zellanteil eingesetzt
(Kleine u. a. 1999). In dieser Studie wurde, wann immer möglich, die Mindestmenge von ca. 5000 Lymphozyten pro Messung für ein statistisch verwertbares
Ergebnis berücksichtigt (Tackenberg u. a. 2007).
Mögliche Strukturungleichheiten der Kohorten CIS und KONTROLLE wurden in dieser Arbeit zugunsten höherer Fallzahlen in Kauf genommen. So wurde
z. B. auf ein Alters- und Geschlechtsmatching verzichtet. Auch bestand unsere
Kontrollkohorte nicht aus völlig gesunden Personen, sondern streng genommen
aus Personen mit anderen neurologischen Krankheiten nicht-inflammatorischer
”
oder zentralnervöser Natur“. Dies liegt in der Gewinnung des Liquors begründet,
da keine Lumbalpunktionen aus rein wissenschaftlicher Indikation an gesunden
Freiwilligen durchgeführt wurden. Dieses Vorgehen findet sich ebenfalls in der
Literatur, so z. B. bei Venken u. a. (2008a) und Jensen u. a. (2004).
Die volumetrische Analyse der kranialen Läsionslast birgt ein gewisses Maß an
Subjektivität, da manuell einzelne Läsionen am Computer eingegrenzt werden
und sich inter- und auch intraindividuelle Schwankungen in Bezug auf die bestimmte (Läsions-)Fläche ergeben können; für diese Arbeit stehen bis jetzt noch
keine automatisierten und standardisierten Programmroutinen zur Verfügung.
Das gleiche trifft prinzipiell auch für die Durchflusszytometrie zu, da hier Lymphozytenpopulationen mit einem gewissen Grad an Willkür gegeneinander grafisch abgegrenzt werden und somit die Interrater-Variabilität dementsprechend
zu erwarten ist. Leider konnten zu diesem Thema keine passenden Studien gefunden werden.
Als TREG vor ein paar Jahren ins Zentrum der Aufmerksamkeit immunologischer Forschung rückten und auch die ersten Patienten für diese Studie
rekrutiert wurden, war die Charakterisierung allein durch die hohe Expression
vom CD25 standard. Heutzutage existieren weitere Marker wie FoxP3 sowie
andere regulatorische Subpopulationen (siehe Abschnit 4.3 auf Seite 82). Daraus ergeben sich möglicherweise Abweichungen zu späteren Studien, die andere
Marker in der zytologischen Färbung verwendet haben. Studien über humane
TREG können ausserdem durch die Tatsache divergieren, dass möglicherweise
nicht nur TREG, sondern auch andere aktivierte Effektor-T-Zellen bei alleiniger Differenzierung mit CD25 und FoxP3 erfasst werden. Aus diesem Grund
wird immer mehr CD127low als zusätzlicher Marker zur Identifikation humaner
TREG genutzt (Liu u. a. 2006). Dies sollte für zukünftige durchflusszytometrische Studien an TREG berücksichtigt werden.
5. Zusammenfassung/Summary
Einleitung Das Klinisch-Isolierte-Syndrom (CIS) bezeichnet das Auftreten
eines ersten fokal-neurologischen Defizits über mindestens 24 Stunden und ist
verdächtig für die Entwicklung einer Multiplen Sklerose (Kappos u. a. 2006).
Neben autoreaktiven, proinflammatorischen T-Zellen (Bhat, Steinman 2009)
spielen auch andere Komponenten des zellulären Immunsystems wie B-Zellen,
Plasmazellen, Monozyten und Makrophagen eine wichtige Rolle in der Pathogenese (Schneider-Hohendorf u. a. 2010; Kuenz u. a. 2008; Walter u. a. 2006).
Insbesondere CD25high regulatorische T-Zellen sind aufgrund einer gestörten
Effektorfunktion bei der MS involviert (Venken u. a. 2010). Darüberhinaus existieren Hinweise auf eine Verminderung von VLA-4, ein Protein für die Diapedese über die Blut-Hirn-Schranke, auf TREG des peripheren Blutes von Patienten mit RR-MS (Stenner u. a. 2008). Somit ist die Aufrechterhaltung einer
Immunhomöostase über die humoralen Kompartimente von großer Wichtigkeit
für Initiierung und Kontrolle der entzündlichen Reaktion im ZNS, dabei wird
die Quantifizierung von Leukozyten im Blut und Liquor bei Patienten mit MS
und CIS zur Charakterisierung einer möglichen Dysbalance eingesetzt (Engelhardt, Ransohoff 2005; Feger u. a. 2007a). Sowohl als Prediktor in Bezug auf
Häufigkeit und Schwere konsekutiver Schübe als auch für den späteren Grad der
Behinderung haben sich magnetresonanztomografische Befunde etabliert (Brex
u. a. 2002; Kappos u. a. 2006). Die vorliegende Arbeit untersucht die Fragestellung, ob eine Dysbalance zwischen Blut- und Liquorkompartiment bestimmter
Immunzelltypen bei Patienten mit CIS besteht und ob das Ausmaß mit dem
Grad der zentralnervösen Entzündung, gemessen anhand der Läsionslast im
cMRT, korreliert. Material Blut- und Liquorproben von 64 unbehandelten
Patienten mit CIS, 18 mit MS und 43 mit anderen, nicht-entzündlichen neurologischen Krankheiten (ANK) wurden mit Antikörpern gegen CD3, CD4, CD8,
CD14, CD16, CD19, CD20, CD25, CD27, CD28, CD45RA, CD49d, CD62L und
CD138 gefärbt und durchflußzytometrisch gemäß publizierter Methoden untersucht (Tackenberg u. a. 2007). Die kumulative T2 -hyperintense Läsionslast wurde von allen Patienten mit CIS in den Wichtungen sag. T2 FS, ax. T1 SE, ax.
FLAIR, ax. PD und T2 , ax. T1 SE + KM bestimmt und mit dem Quotienten der
Häufigkeit bestimmter Leukozytensubpopulationen im Blut- und Liquor korre-
87
5. Zusammenfassung/Summary
88
liert. Weiterhin wurde der EDSS-Score bei Diagnosestellung erhoben und eine
ROC-Analyse bei divergierenden Quotienten der CIS- und Kontrollprobanden
durchgeführt. Bei einer Subgruppe der CIS-Patienten (n = 18) wurde die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für VLA-4 (CD49d) für verschiedene Expressionsniveaus von CD25 auf CD4+ T-Lymphozyten bestimmt. Ergebnisse Signifikante Unterschiede der Quotienten fanden sich für regulatorische T-Zellen,
reife B-Zellen, Memory B-Zellen und CD16+ Monozyten im Vergleich von Patienten mit CIS und ANK. Bei den selben Zellpopulationen ergab die ROCAnalyse der Quotienten signifikante Werte und es konnte ein Grenzwert errechnet werden, um zwischen krank und gesund zu diskriminieren. Eine positive
Korrelation mit der kranialen Läsionslast fand sich für regulatorische T-Zellen
(r = 0,68) und Plasmazellen (r = 0,55), eine negative Korrelation für CD4+ Thymusemigranten (r = -0,53). Die beste Korrelation wurde meist für die Stratifizierung nach sehr frühem CIS erreicht (≤ 6 Läsionen). Die MFI für VLA-4
auf CD4+ CD25low-high Lymphozyten im PBL und CSF war signifikant höher
bei Patienten mit ANK als bei CIS. Diskussion Im Gegensatz zu Kontrollpersonen ist bei CIS Patienten der relative Anteil von regulatorischen CD4+
T-Zellen im Liquorkompartiment im Vergleich zum peripheren Blut signifikant
erniedrigt und bei reifen B-Zellen, Memory B-Zellen und CD16+ Monozyten
erhöht. Neben einer exekutiven Dysfunktion für regulatorische T-Zellen (Venken u. a. 2006) scheint auch ein quantitativer Defekt vorzuliegen, verantwortlich
ist möglicherweise eine reduzierte Expression des Zelladhäsionsmolekül VLA-4
auf Lymphozyten bei Patienten mit CIS. Bei Patienten im frühen Stadium
haben regulatorische Zellen im Liquor möglicherweise einen antiinflammatorischen Effekt und der Quotient kann einen labortechnischen Surrogatparameter
für Diagnosestellung und Entzündungsaktivität darstellen. Die Korrelation des
Quotienten für Plasmazellen mit der Läsionslast ist am ehesten als zufallsbedingt zu werten. Aus der Korrelation für naive Thymusemigranten ergibt
sich eine denkbare Rolle in der frühen Pathogenese des CIS. Zusammenfassend
scheint eine Dysbalance in der Immunhomöostase verschiedener in die Pathogenese involvierter Zellen beim CIS vorzuliegen, die möglicherweise auf Defekte in
Zelladhäsionsmolekülen auf der Oberfläche zurückzuführen ist. Die Ausprägung
des relativen Ungleichgewichts im Blut oder Liquor kann dabei das Ausmaß der
zerebralen Entzündung im kranialen MRT bestimmen und eventuell zur Diagnosestellung benutzt werden.
5. Zusammenfassung/Summary
89
Introduction The term ‘Clinically Isolated Syndrome’ (CIS) describes a
first focal-neurological, demyelinating event lasting for at least 24 hours and
is equivocal for the development of definitive Multiple Sclerosis (MS) (Kappos et al. 2006). Besides peripherically activated autoreactive T-cells, who reencounter their specific antigen within the borders of human CNS and induce
proinflammatory tissue reactions (Bhat, Steinman 2009), other immune cells of
the innate and adaptive immunesystem like B-cells, plasmacells, monocytes and
macrophages play a major role in the pathogenesis of MS (Kuenz et al. 2008;
Schneider-Hohendorf et al. 2010; Walter et al. 2006). In particular, CD25high
regulatory T-cells (TREG) seem to be involved due to a hampered executive
cell function (Venken et al. 2010). In addition, there is mounting evidence
for a decreased cell surface expression of VLA-4 on CD25high TREG in the
blood of patients with RR-MS, a protein responsible for cell diapedesis across
the blood-csf-barriers (Stenner et al. 2008). Maintenance of immunehomeostasis in the humoural compartments peripheral blood (PBL) and cerebrospinal
fluid (CSF) is crucial for initiation and control of inflammatory CNS reactions
and the quantification of leukocytes in peripheral blood and cerebrospinal fluid
in patients with CIS and MS has been used to describe a given dysbalance
(Engelhardt, Ransohoff 2005; Feger et al. 2007a). In the past, MRI findings
have been successfully introduced as a predictor of frequency and gravidity of
subsequent relapses and for the future degree of disability (Brex et al. 2002;
Kappos et al. 2006). The aim of the present study is to investigate if there is
an existing imbalance between leukocytes in PBL and CSF in patients with
CIS compared to controls and if the degree of a given imbalance correlates
with CNS inflammation, measured as T2 -hyperintense total lesion volume load
in cranial MRI. Material Venous peripheral blood and cerebrospinal fluid
samples of 64 untreated patients with CIS, 18 patients with MS and 43 patients with other non-inflammatory neurological deseases (ONID) have been
stained with antibodies against CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19, CD20,
CD25, CD27, CD28, CD45RA, CD49d, CD62L and CD138 and analyzed flowcytometrically according to published methods (Tackenberg et al. 2007). MRI
T2 -hyperintense total lesion volume of each single patient has been calculated in a standardized way (‘MS-programme’, sag. T2 FS, ax. T1 SE, ax.
FLAIR, ax. PD und T2 , ax. T1 SE + CA) and correlated with the PBL/CSF
ratio of specific immunecell subsets. EDSS-score at desease onset has been
taken and a ROC analysis has been performed in cases of diverging ratios.
In a subgroup of CIS patients (n = 18), mean fluorescence intensity (MFI) for
5. Zusammenfassung/Summary
90
VLA-4 (CD49d) has been measured for different expression levels of CD25 in
CD4+ lymphocytes. Results Significant differences in CIS PBL/CSF ratios
have been found for regulatory T-cells, CD19+ B-cells and CD16+ monocytes
compared to ONID. ROC analysis for the same subsets revealed significance
and a specific cut-off has been determined to discriminate between ‘ill’ and
‘healthy’. Positive correlation with cranial total volume lesion load has been
found for regulatory T-cells (r = 0,68) and plasmacells (r = 0,55), a negative
correlation for CD4+ thymic emigrants (r = -0,53). Best correlation coefficients
could be achieved for stratification for early CIS (≤ 6 lesions). VLA-4 MFI on
CD4+ CD25low-high lymphocytes in PBL and CSF was significantly higher in
patients with OIND than in CIS. Discussion In contrast to controls, patients
with CIS seem to have a significantly reduced relative proportion of regulatory
T-cells in cerebrospinal fluid compared with peripheral blood and a significantly
higher relative proportion of CD19 B-cells, memory B-cells and CD16+ monocyte. Apart from a known dysfunction in regard to executive features (Venken
et al. 2006), there seems to be a quantitative disorder in regulatory T-cells,
probably due to a reduced cell surface expression of the cell-adhesion molecule
VLA-4 on CD4+ lymphocytes of patients with CIS. In these patients, especially in an early CIS stage, regulatory T-cells might have an antiinflammatory
effect and the PBL/CSF ratio provides a surrogatemarker für diagnosis and
desease activity. The correlation of plasmacells with the cranial total lesion
load is most probably considered an incidental result. The negative correlation
of naive thymic emigrants is indicating a possible role in early pathogenesis. In
conclusion, there seems to be a given dysequilibrium in immune homeostasis
of certain leukocytes involved in pathogenesis and pathophysiology of early MS
that is probably the result of a disturbed cell surface adhesion molecule expression. The numerical quantity of the relative dysbalances in peripheral blood or
cerebrospinal fluid represents cerebral inflammation measured in cranial MRI
and is probably suited as lab marker for diagnosis of CIS.
A. Anhang
Expanded Disability Status Scale Score (EDSS)
Tabelle A.1.:
Expanded Disability Status Scale (EDSS, nach Kurtzke 1983). Acht Funktionssysteme
FS (Optik, Hirnstamm, Motorik, Cerebellum, Sensibilität, Blasen- und Mastdarmfunktion,
mentaler Status, Gehstrecke) werden untersucht und in Grade unterteilt: Grad 0 = normale
Funktion, Grad 1 =
abnorme Funktion ohne Behinderung, Grad 2 = leichte Behinde-
rung, Grad 3-6 = mittelschwere bis schwere Behinderung. Die Werte der Funktionssysteme
werden integriert und ergeben den EDSS.
EDSS
Behinderung
0,0
alle FS Grad 0
1,0
keine Behinderung, ein FS Grad 1
1,5
keine Behinderung, mehr als ein FS Grad 1
2,0
leichte Behinderung, ein FS Grad 2, andere 0 oder 1
2,5
leichte Behinderung, zwei FS Grad 2, andere 0 oder 1
3,0
mässige Behinderung, ein FS Grad 3, andere 0 oder 1 oder drei oder vier FS Grad
2, Gehfähigkeit uneingeschränkt
3,5
mässige Behinderung, ein FS Grad 3 und ein oder zwei FS Grad 2, Gehfähigkeit
uneingeschränkt
4,0
relativ schwere Behinderung, ein FS Grad 4 und andere FS Grad 0 oder 1, Geh-
4,5
relativ schwere Behinderung, ein FS Grad 4 und andere FS Grad 0 oder 1, Geh-
strecke ohne Hilfe ca 500 m.
strecke ohne Hilfe ca 300 m, voll arbeitsfähig aber evtl. mit geringgradiger Hilfestellung
4,5
relativ schwere Behinderung, ein FS Grad 4 und andere FS Grad 0 oder 1, Gehstrecke ohne Hilfe ca 300 m, voll arbeitsfähig aber evtl. mit geringgradiger Hilfestellung
5,0
starke Behinderung, ein FS Grad 5 und andere FS Grad 0 oder 1, Gehstrecke ca.
200 m
5,5
starke Behinderung, ein FS Grad 5 und andere FS Grad 0 oder 1, Gehstrecke ca.
100 m
6,0
Gehhilfe nötig um 100 m weit zu gehen
6,5
Gehhilfe beidseits nötig, um 20 m ohne Pause zu gehen
7,0
Gehstrecke unter 5 m selbst mit Hilfe, sitzt ca. 12 Stunden pro Tag im Rollstuhl,
Transfer und Fortbewegung im Rollstuhl selbständig
91
A. Anhang
92
Tabelle A.1.: Fortsetzung
EDSS
7,0
Behinderung
Gehstrecke mit Hilfe nur ein paar Schritte, benötigt Hilfe beim Rollstuhltransfer,
fährt selbst
8,0
überwiegend auf Bett beschränkt, Armfunktion zur Körperpflege weitgehend erhalten, kann auch ausserhalb des Bettes sitzen
8,5
überwiegend Bettlägerig, einge Funktionen der Arme erhalten
9,0
bettlägerig und hilflos, essen und kommunizieren möglich
9,5
bettlägerig und vollkommen hilflos, essen und kommunizieren nur schlecht mög-
10,0
Tod durch MS
lich, unfähig zu schlucken
EDSS-Dokumentation
Eine Kopie der in dieser Arbeit benutzten EDSS-Dokumenation nach L. Kappos, Department of Neurology, University Hospitals, CH-4031 Basel, Version
11/99 findet sich auf Seite 97 f.
Quelle: http://www.neurostatus.net/scoring/index.php
Diagnosekriterien nach McDonald
Am Ende des Schemas sollen sich die möglichen Diagnosen MS, keine MS und
mögliche MS formulieren lassen. Die Diagnose kann weiterhin allein aufgrund
objektivierbarer klinischer Befunde gestellt werden, der Nachweis zeitlicher und
topischer Dissemination ist zentraler Bestandteil. Paraklinische Befunde wie
das MRT, die Liquoranalyse sowie Elektrophysiologie gehen ergänzend in die
Diagnoseroutine ein.
Tabelle A.2.:
MS-Diagnosekriterien nach McDonald et al. (McDonald u. a. 2001), in Anlehnung
an R. M. Schmidt (2006)
klinische Befunde
weitere notwendige Befunde
2+ Schübe und klinisch objektivier-
keine
ter Nachweis von 2x Läsionen
2+ Schübe und klinisch objektivier-
durch MRT belegte topische Dissemination
ter Nachweis einer Läsion
oder
A. Anhang
93
Tabelle A.2.: Fortsetzung
klinische Befunde
weitere notwendige Befunde
im MRT 2+ characteristische Läsionen und positiver Liquor
oder
erneuter klinischer Schub mit anderem Läsionsort
Ein Schub und klinisch objektivier-
duch MRT belegte zeitliche Dissemination
ter Nachweis von 2+ Läsionen
oder
zweiter klinische Schub
Ein Schub und klinisch objektivier-
durch MRT belegte topische Dissemination
ter Nachweis einer Läsion (CIS)
oder
2+ charateristische Läsionen im MRT und positiver Liquor
und
durch MRT belegte zeitliche Dissemination
oder
zweiter klinischer Schub
seit Beginn schleichend progredien-
positiver Liquor
te neurologische Ausfälle, verdächtig auf MS
und
topische Dissemination im MRT, belegt durch 9+
T2 Läsionen im Gehirn oder 2+ Läsionen im
Rückenmark oder 4-8 Läsionen im Gehirn und eine Läsin im Rückenmark
oder
pathologischem VEP kombiniert mit 4-8 Läsionen
im Gehirn oder < 4 Läsionen im Gehirn und einer
spinalen Läsion im MRT
durch MRT belegte zeitliche Dissemination oder
anhaltende Progression über ein Jahr
A. Anhang
94
Geräte und Verbrauchsmaterialien
Die verwendeten Geräte, Verbrauchsmaterialien und eingesetzten Computerprogramme sind in untenstehender Tabelle aufgeführt.
Tabelle A.3.: Liste der verwendeten Geräte und Verbrauchsmaterialien
Mikroskope
Axio Scope
Zeiss Germany
Kühlschränke
Gefrierschrank -20°C
Liebherr (Ochsenhausen)
Gefrierschrank -78°C
Heraeus Instruments (Hanau)
Gefrierschrank -136°C
Nunc (Roskilde, Dänemark)
Kühlschrank 4°C
Liebherr (Ochsenhausen)
Zentrifugen
Centrifuge 5415 D
Eppendorf (Wesseling-Berzdorf)
Megafuge 1.0
Heraeus Instruments (Hanau)
Sterilbank (Bench)
Clean Bench Hera Safe
Heraeus Instruments (Hanau)
FACS
FACSCalibur
BD Pharmingen (Heidelberg)
Sonstige Geräte und Verbrauchsmaterialien
50 ml Röhrchen
Greiner Bio-one (Frickhausen)
Deckgläschen
Menzel (Braunschweig)
Einfrierboxen
Nunc (Roskilde, Dänemark)
Einmalpipetten
Greiner Bio-one (Frickhausen)
Einmalspritzen
Greiner Bio-one (Frickhausen)
Erlenmeyerkolben
Kobe (Marburg)
Falcon-Röhrchen
BD Pharmingen (Heidelberg)
Kolbenhubpipetten
Eppendorf (Wesseling-Berzdorf)
Kryoröhrchen
Nunc (Roskilde, Dänemark)
Neubauer-Zählkammer
Superior
-
Paul
Marienfeld
(Lauda-
Königshofen)
Präzisionspipette Accu Jet
Brand (Wertheim)
Präzisionspipette Finnpipette
Thermo Labsystems (Vantaa, Finnland)
A. Anhang
95
Tabelle A.3.: Fortsetzung
Chemikalien
Aqua dest.
Braun (Melsungen)
DMSO (Dimethylsulfoxid)
Sigma (Steinkirchen)
EDTA
Promega (Madison, WI, USA)
FCS (fetal calf serum)
Biochrom (Berlin)
FICOLL
Biochrom (Berlin)
Tryptanblau 4 %
Gibco Invitrogen (Karlsruhe)
Zellkulturmedien
RPMI 1640
Gibco Invitrogen (Karlsruhe)
Puffer und Lösungen
FACSFlow
BD Pharmingen (Heidelberg)
FACSSafe
BD Pharmingen (Heidelberg)
FACSRinse
BD Pharmingen (Heidelberg)
CellWash
BD Pharmingen (Heidelberg)
PBS (phosphate buffered sa-
Gibco Invitrogen (Karlsruhe)
line)
PharMingenLyse
(NH4Cl-
BD Pharmingen (Heidelberg)
Lösung)
TBE-Puffer 1x
Gibco Invitrogen (Karlsruhe)
FACS-Antikörper
anti-CD3 PerCP
Klon SK-7 (BD Pharmingen)
anti-CD4 APC
Klon RPA-T4 (BD Pharmingen)
anti-CD4 FITC
Klon RPA-T4 (BD Pharmingen)
anti-CD4 PerCP
Klon SK-3 (BD Pharmingen)
anti-CD8 APC
Klon RPA-T8 (BD Pharmingen)
anti-CD8 FITC
Klon LT-3 (Immunotools)
anti-CD8 PerCP
Klon SK-1 (BD Pharmingen)
anti-CD14 FITC
Klon 18-D11 (Immunotools)
anti-CD16 PE
Klon 3-G8 (BD Pharmingen)
anti-CD19 APC
Klon HIB-19 (BD Pharmingen)
anti-CD20 APC
Klon LT-20 (Immunotools)
anti-CD25 FITC
Klon M-A251 (BD Pharmingen)
anti-CD25 PE
Klon M-A251 (BD Pharmingen)
A. Anhang
96
Tabelle A.3.: Fortsetzung
anti-CD27 FITC
Klon M-T271 (BD Pharmingen)
anti-CD28 PE
Klon M-A251 (BD Pharmingen)
anti-CD45RA PE
Klon MEM-56 (Immunotools)
anti-CD49d FITC
Klon BU-49 (Immunotools)
anti-CD49d PE
Klon 9F-10 (BD Pharmingen)
anti-CD62L FITC
Klon LT-TD 180 (Immunotools)
anti-CD138 PE
Klon DL-101 (Ebioscience)
Magnetresonanztomografie
Signa Horizon 1,5 Tesla
GE Healthcare (United Kingdom)
Software
CellQuest 4.0.2
Advantage
BD Pharmingen (Heidelberg)
Workstation
GE Healthcare (United Kingdom)
AW4.0 06
SPSS 16.0
SPSS (Chicago, Illinois, USA)
MS Excel 2010
Microsoft
MS Word 2010
Microsoft
LATEX Miktex 2.9
open source
A. Anhang
97
Scoring Sheet for a standardised, quantified neurological examination
and assessment of Kurtzke’s Functional Systems and Expanded
Disability Status Scale in Multiple Sclerosis
SYNOPSIS OF FS SCORES
STUDY NAME
1. Visual 1
5. Sensory
PERSONAL INFORMATION
2. Brainstem
6. Bowel/Bladder 1
Patient
3. Pyramidal
7. Cerebral
4. Cerebellar
1
EDSS Step
Signature
Date of Birth (04-Jun-1980)
-
-
= converted FS Score
Centre Nr/Country
Name of EDSS rater
Date of Examination
- 2 0
-
1. VISUAL ( OPTIC ) FUNCTIONS
OPTIC FUNCTIONS
OD
OS
Scotoma
N
E
M
I
C
E
SP
Visual acuity (corrected)
* Disc pallor
Visual fields
FUNCTIONAL SYSTEM SCORE
1
2. BRAINSTEM FUNCTIONS
CRANIAL NERVE EXAMINATION
Hearing loss
Extraocular movements (EOM) impairment
Dysarthria
Nystagmus
Dysphagia
Trigeminal damage
Other cranial nerve functions
Facial weakness
FUNCTIONAL SYSTEM SCORE
3. PYRAMIDAL FUNCTIONS
REFLEXES
Biceps
Triceps
Brachioradialis
R
><
L
Knee flexors
Knee extensors
Plantar flexion (feet/toes)
Dorsiflexion (feet/toes)
Knee
* Position test UE, pronation
Ankle
* Position test UE, downward drift
Plantar response
* Position test LE, sinking
Cutaneous reflexes
Able to lift only one leg at a time (grade in °)
* Palmomental reflex
* Walking on heels
LIMB STRENGTH
R
L
* Walking on toes
Deltoids
* Hopping on one foot
Biceps
SPASTICITY
Triceps
Arms
Wrist/finger flexors
Legs
Wrist/finger extensors
Gait
Hip flexors
FUNCTIONAL SYSTEM SCORE
* = optional
1 = converted FS Score
°
°
A. Anhang
98
4. CEREBELLAR FUNCTIONS
CEREBELLAR EXAMINATION
Rapid alternating movements UE impairment
Head tremor
Rapid alternating movements LE impairment
Truncal ataxia
Tandem walking
R
L
Gait ataxia
Tremor/dysmetria UE
Romberg test
Tremor/dysmetria LE
Other, e. g. rebound
FUNCTIONAL SYSTEM SCORE
5. SENSORY FUNCTIONS
SENSORY EXAMINATION
R
L
Position sense UE
Superficial sensation UE
Position sense LE
Superficial sensation trunk
* Lhermitte’s sign
Superficial sensation LE
* Paraesthesiae UE
Vibration sense UE
* Paraesthesiae trunk
Vibration sense LE
* Paraesthesiae LE
FUNCTIONAL SYSTEM SCORE
6. BOWEL/ BLADDER FUNCTIONS
N
E
M
I
C
E
SP
Urinary hesitancy/retention
Bowel dysfunction
Urinary urgency/incontinence
* Sexual dysfunction
Bladder catheterisation
FUNCTIONAL SYSTEM SCORE
7. CEREBRAL FUNCTIONS
MENTAL STATUS EXAMINATION
+
Depression
+
Euphoria
Decrease in mentation
+
Fatigue
FUNCTIONAL SYSTEM SCORE
8. AMBULATION
Walking range as reported (without help or sticks )
meters
in min
Distance able to walk without rest or assistance
Requires constant assistance to walk 100 meters
≥ 100 meters, but < 200 meters
Unilateral assistance (in meters)
≥ 200 meters, but < 300 meters
Cane/crutch
≥ 300 meters, but < 500 meters
Other
≥ 500 meters but not unrestricted
Bilateral assistance (in meters)
Unrestricted
Canes/crutches
Actual distance (obligatory up to 500 m if possible)
Other
meters
Assistance by another person (in meters)
* = optional
1 = converted FS Score
+
Because depression, euphoria and fatigue are difficult to
evaluate objectively, in some studies it does not contribute to
the Cerebral FS score or EDSS step. Please adhere to the
study’s specific instructions.
Standardised Neurological Examination and Assessment of Kurtzke’s Functional Systems and Expanded Disability Status Scale
Slightly modified from J.F. Kurtzke, Neurology 1983:33,1444-52
©2009 Ludwig Kappos, MD, Professor and Chair, Neurology, University Hospital Basel, 4031 Basel, Switzerland; Version 09/08
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Curriculum Vitae (entfernt)
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Verzeichnis der akademischen Lehrer
Meine akademischen Lehrerinnen und Lehrer an der Philipps-Universität Marburg waren in alphabetischer Reihenfolge die Damen und Herren:
Adamkiewicz, Basler, Baum, Czubayko, Dabrock, Daut, Feuser, Gerdes, Gress,
Grundmann, Grzeschik, Herrmann-Lingen, Hertl, Hilt, Jungclas, Koolmann,
Krieg, Kutschenreuter, Lang, Leonhardt, Lill, Lohoff, Luers, Maier, Mandrek,
Moll, Mueller, Müller, Mutters, Oertel, Opitz, Plant, Renz, Richter, Riße, Roehm, Röper, Schäfer, Schofer, Schrader, Tackenberg, Tibesku, Vogelmeier, Wagner, Werner, Westermann, Wulf
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich herzlich bei allen Menschen bedanken, die
mich in der Zeit meiner Dissertation mit Wort und Tat unterstützt haben:
Bei PD Dr. Björn Tackenberg, meinem ehemaligen Betreuer und jetzigem
Doktorvater, für die Überlassung des Themas und die exzellente Betreuung
während der Datenerhebung. Auch für die konstruktive Kritik und stetigen
Verbesserungsvorschläge bei der Verschriftlichung bin ich dankbar. Ich habe
dadurch sowie während des praktischen Jahres in der Klinik für Neurologie eine Menge positive Erfahrung im Patientenumgang und in wissenschaftlichem
Arbeiten sammeln können. Genaugenommen kreuzten sich unsere Wege schon
während meines Zivildienstes in Marburg und Herr Tackenberg hat meine Entscheidung zum Medizinstudium damals schon unterstützt und gefördert (-:
Herrn Prof. Dr. Wolfgang H. Oertel, Direktor der Klinik für Neurologie des
Universitätsklinikums Marburg und Gießen, Standort Marburg, danke ich für
die Bereitstellung des Arbeitsplatzes, der Laboreinrichtungen sowie der nötigen
infrastrukturellen Vorraussetzungen.
Meinen Freunden und Komillitonen Axel John und Hannes Kenji Kubo
danke ich für zahlreiche laienpsychologische Gespräche bei Kaffee und Kuchen
und fachmännischen Rat bei der Umsetzung der Verschriftlichung und nicht
zuletzt für eine unvergessliche Zeit während des Studiums. Wer weiss, wieviele
von uns ohne gegenseitige Unterstützung die Flinte ins Korn geworfen hätten...
Meinen Freunden Philipp Rieß und Mirco Schulze danke ich für unzählige
technische Hilfestellungen bei der Erstellung der Verschriftlichung und für den
selbstlosen Einsatz im Copyshop an den Druckmaschinen.
Bei Kerstin Schlegel und Michael Happel möchte ich mich ganz besonders
für die nimmermüde Unterstützung am FACS bedanken. Ohne sie wäre diese
Arbeit niemals in diesem Umfang möglich gewesen.
Allen sonstigen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der AG Neuroimmunologie sei an dieser Stelle für die hervorragende Arbeitsatmosphäre und hilfreichen
Tipps gedankt: Rosi Burmester, Christian Eienbröker, Annette Hehenkamp (gut
Pfad!), Christine Höft, Dr. Michael Pütz, Florian Seitz, und Susanne Stei.
Den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der Poliklinik, ganz besonders Babette von Hagen und Ines Jackel für Rat und Tat bei der Organisation der
Datenerhebung und Patientenuntersuchung.
Ich danke den Patienten für ihre geduldige Mitarbeit und ihre Zeit bei der
Erhebung des EDSS Scores.
Mein größter Dank gilt meiner Familie und meiner Freundin. Ohne ständigen
Zuspruch und Bekräftigungen, das stetige Vertrauen sowie die seelische und
materielle Unterstützung wäre mir dieses Studium und auch diese Arbeit nie
möglich gewesen.
Hamburg, den 17. Februar 2012
Johannes Till Elzer
Ehrenwörtliche Erklärung (entfernt)
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