Volltext

Zytogenetische und molekularbiologische Untersuchungen an
intrakraniellen Meningeomen unter Anwendung der GTG-Bänderung,
SKY-Technik, FISH-Analyse und genomweiter SNP-A Karyotypisierung
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. med.
an der Medizinischen Fakultät
der Universität Leipzig
eingereicht von:
Kristin Mocker
geboren am: 25.01.1988 in Räckelwitz
angefertigt an:
Universität Leipzig
Klinik und Poliklinik für Neurochirurgie
Betreuer:
Prof. Dr. med. Jürgen Meixensberger
PD. Dr. med. Wolfgang Krupp
Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 16.07.2013
Bibliographische Beschreibung
Mocker, Kristin
Zytogenetische
und
molekularbiologische
Untersuchungen
an
intrakraniellen
Meningeomen unter Anwendung der GTG-Bänderung, SKY-Technik, FISH-Analyse und
genomweiter SNP-A Karyotypisierung
Universität Leipzig, kumulative Dissertation
49 S., 66 Lit., 2 Abb., 5 Anlagen
Referat:
Meningeome sind Tumore der Hirnhäute und stellen zirka 24-30% aller intrakraniellen
Tumore dar. Obwohl sie in den meisten Fällen als solitär, langsam wachsend und benigne
(WHO Grad 1) beschrieben werden, ist ihr ausgeprägtes Rezidivverhalten die größte
Herausforderung in der Therapie. Bisherige Arbeiten verwendeten zur genetischen
Analyse
von
Meningeomen
meist
Untersuchungstechniken
mit
eingeschränkter
(molekular-)zytogenetischer Aussagekraft. Mit der Kombination der Methoden GiemsaBandendarstellung
Fluoreszenz
in
(GTG-Bänderung),
situ
Spektrale
Hybridisierungstechniken
Karyotypisierung
(FISH-Analyse)
(SKY-Technik),
und
molekulare
Karyotypisierung unter Verwendung von 100K beziehungsweise 6.0 SNP-Arrays (SNP-A
Karyotypisierung) sollte es möglich sein, in effizienterer Form bislang unentdeckte
chromosomale Aberrationen zu identifizieren und weiterführende tumormechanistische
Hinweise zu erhalten. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein multipel
aufgetretenes Meningeom mit zwei Tumoren unterschiedlicher Malignität (1 WHO Grad 1;
1 WHO Grad 2) analysiert, anschließend erfolgte die Untersuchung einer Gruppe von 10
Meningeomen (5 WHO Grad 1; 5 WHO Grad 2). Bisher nicht beschriebene Aberrationen
wie ein dizentrisches Chromosomen 4, die parazentrische Inversion im chromosomalen
Bereich 1p36 und die balancierte reziproke Translokation t(4;10)(q12;q26) wurden
detektiert. Die genomweite SNP-A Karyotypisierung ermöglichte neben der genaueren
Betrachtung der zytogenetischen Ergebnisse die simultane Analyse von Blut und TumorDNA der Patienten und lieferte Hinweise auf konstitutionelle Aberrationen. Es zeigte sich
eine signifikante Anreicherung von rekurrenten Regionen kopienneutraler Verluste der
Heterozygotie als Hinweis auf das Vorliegen potenzieller segmentaler Uniparentaler
Disomie (UPD) jeweils in Blut und Tumor der Patienten. Außerdem wurden nur im Tumor
befindliche potentielle rekurrente segmentale UPD Regionen detektiert. Die weitere
Analyse der konstitutionellen sowie somatischen segmentalen UPD hinsichtlich ihrer Rolle
im Rahmen der Tumorgenese ist eine wichtige Aufgabe für die Zukunft.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Seite
1.
Einleitung und Problemstellung
1
2.
Veröffentlichungen
12
2.1
Veröffentlichung 1
12
„Multiple meningioma with different grades of malignancy: Case report
with genetic analysis applying single-nucleotide polymorphism array
and classical cytogenetics“
2.2
Veröffentlichung 2
„High resolution genomic profiling and classical cytogenetics in a
group of benign and atypical meningiomas“
19
3.
Zusammenfassung und Ausblick
29
4.
Referenzen
35
5.
Anlagen
40
5.1
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
41
5.2
Spezifizierung des eigenen Anteils
42
5.3
Lebenslauf
45
5.4
Wissenschaftliche Tätigkeit
47
5.5
Danksagung
49
Einleitung und Problemstellung
„Diese Urzelle des Tumors, wie ich sie im folgenden nennen will, ist nach meiner Hypothese eine
Zelle, die infolge eines abnormen Vorgangs einen bestimmten, unrichtig kombinierten
Chromosomenbestand besitzt.“
Theodor Boveri, 1914
1. Einleitung und Problemstellung
Die Hypothese der Tumorgenese infolge von Störungen genetischer Informationen einer
Zelle formulierte Theodor Boveri schon Anfang des zwanzigsten Jahrhunderts und
begründete damit das Konzept von Krebs als eine genetische Erkrankung aufgrund
somatischer Mutationen (10).
Hierbei gehen viele Studien von mehrstufigen Prozessen aus, in denen häufig die
Aktivierung von Onkogenen und die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen bedeutend
sind. Diese Gene sind als negative oder positive Regulatoren der Zellproliferation,
Gewebedifferenzierung und Apoptose Teil des komplexen Netzwerks intrazellulärer
Kommunikation. Sie kodieren unter anderem Hormone, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren,
Zelladhäsionsmoleküle,
intrazytoplasmatische
Signalmediatoren
und
intranukleäre
Regulatoren von Transkription und Zellzyklus (8,33).
Während bei Onkogenen durch deren genetische Dominanz bereits die Veränderung einer
Genkopie
biologisch
relevante
Folgen
zeigt,
ist
bei
den
rezessiven
Tumorsuppressorgenen eine Veränderung der Proteinprodukte beider Allele notwendig.
Bekannte
Aberrationsmechanismen
von
potenziellen
Onkogenen
und
Tumorsuppressorgenen, die zur Tumorentstehung führen können, sind in Abbildung 1
dargestellt und sollen im Folgenden beispielhaft erläutert werden.
1
Einleitung und Problemstellung
Abbildung 1: Überblick über bekannte Aberrationsmechanismen von potenziellen Onkogenen und
Tumorsuppressorgenen, die zur Tumorentstehung führen können
Quelle: eigene Darstellung, modifiziert nach (8)
Eine Punktmutation ist die häufigste Ursache für eine pathologische Aktivierung des RASOnkogens,
welches
als
anhaltendes
Proliferationssignal
wirkend
in
zahlreichen
Neoplasien detektiert wurde (9).
Eine weitere Störung im Rahmen der Onkogenaktivierung ist die Genfusion. Für Tumore
des zentralen Nervensystems wurde das Genfusionsprodukt FIG-ROS bei dem
Astrozytom beschrieben (13).
Translokationen
mit
Austausch
von
Regulatorsequenzen
können
ebenfalls
zur
Onkogenaktivierung führen: Ähnlich historisch wie das Philadelphia Chromosom als ein
Beispiel für Genfusion durch Translokation, lässt sich hier das Beispiel der Translokation
t(8;14) bei Burkitt-Lymphomen einordnen (52,60). Solche balancierten Translokationen,
die den Austausch von Chromosomenteilen ohne Verluste oder Zugewinne genetischen
2
Einleitung und Problemstellung
Materials darstellen, werden als ein kausaler Faktor in der Entstehung verschiedener
Tumorentitäten vermutet (47).
Genamplifikation resultiert in den meisten Fällen in einer übermäßigen Expression des
potenziellen Onkogens und ist mit Tumorprogression assoziiert (11). Im Falle des
Neuroblastoms beispielsweise ist die Analyse der N-Myc Amplifikation bereits Teil einer
Risiko-Stratifizierung, die die Therapieentscheidung beeinflusst und im Allgemeinem mit
einer schlechteren Prognose einhergeht (45).
Die „Inaktivierung“ von Tumorsuppressorgenen ist beispielsweise durch Punktmutationen
oder gesteigerten Abbau möglich, wie für p53 beschrieben wurde (15,53).
Der tumorspezifische Funktionsverlust eines Tumorsuppressorgens durch Deletion wurde
zuerst bei Meningeomen nachgewiesen: Zytogenetische Untersuchungen zeigten den
gehäuften Verlust von Chromosom 22q, was molekulargenetisch mit der Inaktivierung des
Tumorsuppressorgens NF2 assoziiert werden konnte (57).
Der Begriff Haploinsuffizienz bezeichnet die kritische Absenkung der Expressionsrate
eines Tumorsuppressorgens nach Mutation oder Deletion einer Genkopie. Dies ist für das
Tumorsuppressorgen PTEN als Gegenspieler verschiedener Proteinkinasen in vielen
sporadischen Tumoren beschrieben und scheint paradoxerweise kanzerogener zu wirken
als der komplette Verlust beider Kopien (6).
Fehlregulationen der Epigenetik, also jener spezifischen Modifikationen, die die
Aktivierung
oder
Blockade
der
Transkription
und
damit
des
genetischen
Informationsflusses einer Zelle bedingen, können ebenfalls grundlegende Bedeutung für
die
Kanzerogenese
haben.
Der
DNA-Methylierungsstatus
von
CpG-Inseln
in
Promotorbereichen von Genen kann bei Hypomethylierung zur Onkogenaktivierung und
bei Hypermethylierung zur Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen führen. Prozesse,
3
Einleitung und Problemstellung
wie DNA-Hypomethylierungen oder Histonmodifikationen treten häufig auch global im
gesamten Genom von Tumoren auf und bedingen zum Beispiel chromosomale Instabilität
beim Kolonkarzinom (46).
An dieser Stelle sei auf die mögliche Rolle der „segmentalen Uniparentalen Disomie
(UPD)“ bei der Tumorgenese hingewiesen. UPD bezeichnet das Vorliegen von
Chromosomen(teilen), die beide entweder von der Mutter oder von dem Vater stammen.
Normale Wildtypallele gehen verloren und aus Heterozygotie entsteht Homozygotie. Dies
kann zu Veränderungen der Genexpression führen, obwohl die Gendosis unverändert ist.
Zuerst wurde die UPD im Zusammenhang mit einem Meiosefehler als konstitutionelle
Variante beschrieben (20). Folgen können Imprinting-Störungen oder Homozygotie für
eine rezessive Mutation sein (64). Imprinting bezeichnet einen epigentisch determinierten
und vererbbaren „Aktivitätsstatus“ von Genen.
Im Rahmen der Mitose kann eine UPD aber auch in somatischen Zellen auftreten und als
somatische UPD (segmental oder vollständig) beschrieben werden. Neben den
Entstehungsmechanismen durch Fehler bei der chromosomalen Trennung und/oder
Rekombination während der Mitose sind auch Genkonversion oder Fehler bei der
Reparatur von Doppelstrangbrüchen zu vermuten. Defekte oder Verluste chromosomalen
Materials werden dabei durch Duplikation des anderen, nicht betroffenen Allels,
ausgeglichen. In jedem Fall sind Mechanismen denkbar, die eine heterozygote somatische
Mutation zu einer homozygoten machen und deshalb Tumorsuppressorgene inaktivieren
können oder die Dosis eines Onkogenprodukts verdoppeln, was ungünstigerweise mit
einem Proliferationsvorteil einhergeht. Eine segmentale UPD 17p wird beispielsweise als
eine Ursache für die Inaktivierung von p53 in Glioblastomen vermutet (66). Bei
myeloproliferativen Erkrankungen konnte man im Rahmen einer segmentalen UPD 9p
eine zusätzliche JAK2-Aktivierung feststellen (42). Eine weitere pathogene Folge einer
4
Einleitung und Problemstellung
segmentalen UPD kann die somatische Duplikation von Genkopien sein, die dem
Imprinting unterliegen. Es kann also zu einem „Gain of Imprinting“ (GOI) oder „Loss of
Imprinting“ (LOI) der betroffenen Gene kommen. Dies führt zu einer veränderten
Genexpression, beispielsweise wie es für den „Insulin-like growth factor“ (IGF) 2 durch LOI
bei Kolonkarzinomen belegt ist (23). Der durch segmentale UPD resultierende Verlust der
Heterozygotie (LOH) kann weiterhin zu homozygoten Allelen für krankheitsrelevante SNPs
(single nucleotide polymorphisms) führen. Diese Einzelnukleotid-Polymorphismen sind
Variationen einzelner Basenpaare, die per Definition in über 1% der Population
vorkommen und deren Relevanz für die Prädisposition zu verschiedenen Krankheiten
derzeit intensiv untersucht wird. Homozygotie für methylierte oder deletierte Gene sowie
für
Genregulationsfaktoren
wie
microRNA
stellen
andere
mögliche
Folgen
der
segmentalen UPD dar.
Trotz einiger als rekurrent beschriebener (segmentaler) UPD Regionen in verschiedenen
Tumorentitäten
gibt
es
noch
einen
großen
Forschungsbedarf
hinsichtlich
ihrer
funktionellen Relevanz und potentiellen Bedeutung bei der Tumorentstehung. Weiterhin
bleibt zu klären, inwieweit auch kleinere konstitutionelle (segmentale) UPD-Regionen eine
Rolle bei der Prädisposition zu spezifischen Tumorentitäten spielen (44,63).
Für
die
bisher
unerwähnten
Tumorprädispositionssyndrome
ist
meist
die
Keimbahnmutation eines potenziellen Onkogenes, Tumorsuppressorgens oder DNAReparaturgens ursächlich. Den Prototyp für die Entwicklung einer erblich bedingten
Krebserkrankung lieferte Knudson mit seinem „two-hit“ Modell für erbliche Retinoblastome
(35). In seinen weiterführenden Analysen ging er der Frage nach, welche und wie viele
Mutationen vorliegen müssen, damit sich aus unverändertem Gewebe ein Tumor
entwickelt (36).
5
Einleitung und Problemstellung
Eine biologische Herangehensweise kennzeichnen die „Hallmarks of Cancer“ (27) indem
sechs erworbene Fähigkeiten einer Tumorzelle definiert wurden: Unabhängigkeit von
Wachstumsfaktoren,
Resistenz
gegenüber
wachstumshemmenden
Signalen,
Apoptosevermeidung, unbegrenzte Proliferation, Angiogeneseinduktion und invasives
Wachstum mit Metastasierung. Kürzlich wurden noch zwei weitere sich herausbildende
Fähigkeiten von Tumorzellen ergänzt: Veränderung des zellulären Energiemetabolismus
und Umgehung der Immunabwehr. Die Kennzeichen genomische Instabilität und Mutation
sowie tumorvermittelte Inflammation wurden noch hinzugefügt und sich daraus ergebende
potenzielle therapeutische Angriffspunkte zusammengefasst (Abbildung 2).
Abbildung 2: Überblick über die erworbenen Eigenschaften einer Tumorzelle und mögliche therapeutische
Angriffspunkte
Quelle: modifiziert nach (28)
6
Einleitung und Problemstellung
Da es sich um komplexe Regulationsmechanismen handelt, ist nicht jeder Teilschritt mit
einer speziellen Mutation assoziierbar. Dennoch ging man zunächst von 4 bis 12 nötigen
Mutationen zur Tumorentstehung aus, bevor mit neuen Techniken mittlerweile eine
Vielzahl von Mutationen je Tumorentität detektiert werden kann (55,26). Mit der
sogenannten Adenom-Karzinom-Sequenz als Modell zur Entstehung des Kolonkarzinoms
lässt sich dennoch beispielhaft die Bedeutung der Abfolge bestimmter Gendefekte zur
Tumorgenese und –progression beschreiben (22). Die genaue Zahl der nötigen
Schlüsselereignisse in einer Tumorentität ist aber nur schwer zu determinieren, da Tumore
einerseits eine gesteigerte Mutationsrate und andererseits eine hohe genetische
Instabilität aufweisen (7,41). Zur Heterogenität des Tumors trägt auch die Beschaffenheit
aus unterschiedlichen Zelltypen wie Endothelzellen, Fibroblasten, Perizyten und
Immunzellen neben den spezifischen Tumorzellen bei. Relativ neu ist die Annahme, dass
diese „Tumor-Mikroumgebung“ („Microenvironment“) durch das Vorhandensein von
Tumorstammzellen beziehungsweise tumorstammzellähnlicher Zellen mit der Fähigkeit
sich selbst zu erneuern, stark zu proliferieren und in unterschiedliche Zellpopulationen zu
differenzieren, ergänzt wird (28). Die Erforschung des Ausmaßes ihrer Rolle bei der
Tumorgenese
sowie
die
Detektion
und
genetische
Charakterisierung
solcher
Tumorstammzellen in verschiedenen Tumorentitäten steht allerdings noch am Anfang
(14).
Der vorliegende Beitrag zur Charakterisierung rekurrenter genetischer Veränderungen bei
Meningeomen, die möglicherweise essentiell an Tumorgenese und –progression beteiligt
sind, bringt additive Informationen und könnte in der Erstellung von umfassenderen
genetischen Profilen hilfreich sein. Die Aussicht auf die Identifikation von möglichen
Angriffspunkten für verbesserte therapeutische Strategien anhand genetischer Daten stellt
eines der wesentlichen Ziele der onkologischen Forschung dar.
7
Einleitung und Problemstellung
Intrakranielle Tumore sind wegen ihres vergleichsweise seltenen Vorkommens eine
Besonderheit in der systematischen zytogenetischen und molekulargenetischen Analyse.
Dennoch lässt sich aus der unverändert schlechten Prognose vieler Patienten die
Notwendigkeit verbesserter therapeutischer Ansätze ableiten.
Meningeome sind Tumore der Hirnhäute und stellen mit 24-30% aller primären
intrakraniellen Tumore eine der häufigsten intrakraniellen Entitäten dar (43). Meningeome
werden oft als solitär, langsam wachsend und benigne (WHO Grad 1) klassifiziert und
treten mit einem Altersgipfel im sechsten und siebten Lebensjahrzehnt auf. Multiples
Auftreten wird in nur 1-8% aller Fälle beschrieben und ist meist mit uniformer Histologie
der Tumore verbunden (61).
Klinische Symptome ergeben sich aus der Lage des Tumors wobei ein Großteil der
Patienten asymptomatisch bleibt oder lediglich Kopfschmerz angibt (56). Deshalb stellen
Meningeome auch den zweithäufigsten Befund bei MRT-Screeningstudien dar oder
werden häufig erst bei Autopsien entdeckt (49,51).
Die in 4,7-7,2% der Fälle autretenden atypischen (WHO Grad 2) und in 1,0-2,8% der Fälle
auftretenden anaplastischen (WHO Grad 3) Meningeome fallen durch aggressiveres
biologisches Verhalten auf. Dies ist gekennzeichnet durch höhere Proliferationsindexe,
dem Auftreten von Nekrosen und invasiven Anteilen (12). Allerdings führt die histologische
Heterogenität oftmals zu Problemen bei der Klassifikation, weshalb die Notwendigkeit der
Einbeziehung genetischer Daten besteht (62,65).
Die komplette chirurgische Resektion (Simpson Grad 1) ist der wichtigste Faktor, um
Rezidive zu vermeiden. Dies ist jedoch bei Tumorlokalisationen an der Schädelbasis, zum
Beispiel im Bereich des Sinus cavernosus, kaum möglich ohne neurologische Ausfälle zu
provozieren (17). Rezidivraten von bis zu 25% bei benignen, bis 52% bei atypischen und
bis 94% bei anaplastischen Meningeomen stellen das größte Problem in der Therapie der
8
Einleitung und Problemstellung
Meningeome dar (43). In individuellen Therapiekonzepten basierend auf Kenntnissen des
genetischen Profils liegen die Zukunftshoffnungen, um rezidivfreies Überleben und
Lebensqualität zu verbessern. Diese kann gerade auch bei Patienten unter 55 Jahren trotz
zunächst erfolgreicher Operation deutlich eingeschränkt sein (39).
Neben dem Auftreten als sporadischer Tumor werden Meningeome bei 50% aller
Patienten mit Neurofibromatose Typ 2 diagnostiziert, die eine konstitutionelle Mutation des
Tumorsuppressorgens NF2 auf Chromosom 22 aufweisen (3). Auch bei der Entstehung
sporadischer Meningeome ließ sich auf eine Beteiligung von NF2 schließen, da partieller
oder kompletter Verlust des Chromosom 22 die häufigste zytogenetische Aberration
darstellt (5). Da sich nur in einem Teil der Tumore die tatsächliche Mutation oder abnorme
Methylierung des NF2 Genes nachweisen lässt, wird die Beteiligung weiterer Gene bei der
Tumorgenese vermutet (12). Das Vorliegen eines unveränderten NF2 Gens wurde mit
dem meningothelialen Subtyp (WHO Grad1) und der Lokalisation des Meningeoms an der
Schädelbasis assoziiert (29,37).
Eine Deletion 1p wird mit Tumorprogression assoziiert und als zweithäufigste
chromosomale Aberration beschrieben. Mit der weiteren Akkumulation verschiedener
Aberrationen (Deletionen auf 6q, 14q, 18q oder Monosomie 10) lassen sich erste
genetische Modelle für die Progression von Meningeomen erstellen. Bisher ist die genaue
Identifizierung der involvierten Tumorsuppressorgene und Onkogene aber unzureichend
(43,54). Im Vergleich zu anderen Gehirntumoren, wie den Gliomen, ist die Anzahl bisher
detektierter genetischer Aberrationen zwar überschaubarer, ihre Zusammenhänge und
Rollen bei Tumorgenese und –progression aber bis heute nur unvollständig verstanden.
Bisherige
Arbeiten
verwendeten
zur
Analyse
von
Meningeomen
meist
Untersuchungstechniken mit eingeschränkter (molekular-)zytogenetischer Aussagekraft
(54). Dies führte zu der Hypothese, dass es mit der Kombination verschiedener
9
Einleitung und Problemstellung
Untersuchungstechniken möglich sein sollte, in effizienterer Form bislang unentdeckte
chromosomale Aberrationen zu identifizieren und weiterführende tumormechanistische
Hinweise zu erhalten. Nicht nur der additive Informationsgewinn, sondern auch eine
Steigerung der Validität und Genauigkeit der genetischen Daten durch die Kombination
der Methoden Giemsa-Bandendarstellung (GTG-Bänderung), Spektrale Karyotypisierung
(SKY-Technik), Fluoreszenz in situ Hybridisierungstechniken (FISH-Analyse) sowie
molekulare Karyotyoisierung unter Verwendung von 100K beziehungsweise 6.0 SNPArrays (SNP-A Karyotypisierung) konnte durch die Arbeitsgruppe bereits demonstriert
werden (30,31,38). Die Auflösung der detektierbaren Aberrationen erfasst ein Spektrum
von >5 Mb bei der GTG-Bänderung bis hin zu deutlich unter 1 Mb mit dem SNP-Array 6.0,
dass einen durchschnittlichen Markerabstand von unter 700 Basenpaaren aufweist.
Weiterhin bietet die genomweite genetische Analyse mittels SNP-Array den Vorteil, die
Veränderung der Kopienzahl zusammen mit LOH (Verlust der Heterozygotie) erfassen zu
können. Eine Veränderung der Kopienzahl wird dabei anhand der Größe und der
Gleichmäßigkeit des veränderten Hybridisierungssignals (sogenanntes „smooth-signal“)
detektiert. Anders als bei klassischen zytogenetischen Verfahren ist mit denselben
Parametern die Analyse kopienneutraler Verluste der Heterozygotie möglich, die als
potenzielle segmentale UPD Regionen angesehen werden können. Dies beruht auf einer
statistischen Analyse, die die gefundene Heterozygotie mit der erwarteten vergleicht.
Dabei wird sichergestellt, dass die Kopienzahl in diesem Bereich unverändert zum
Normalzustand ist. Das Erfassen möglicher rekurrenter segmentaler UPD Regionen stellt
eine neue Dimension in der genetischen Analyse von Tumoren dar und kann zur weiteren
Aufklärung spezifischer Ereignisse in der Tumorgenese beitragen.
Zusätzlich erlaubt die SNP-Array Technik, Blut und Tumor des Patienten im direkten
Vergleich zu untersuchen. Dadurch ist einerseits die Detektion konstitutioneller
10
Einleitung und Problemstellung
genetischer Veränderungen und andererseits, in der gepaarten Analyse, das direkte
Erkennen von Abweichungen zwischen Blut- und Tumor-DNA eines Patienten möglich.
Die Sequenzierungsanalyse zum Mutationsstatus des NF2 Gens erbrachte eine
zusätzliche Charakterisierung der Tumore.
Alle untersuchten Meningeome wurden in der Universitätsklinik Leipzig, Klinik und
Poliklinik für Neurochirurgie, reseziert und mit Einverständnis der Patienten und einem
positiven Votum der Ethikkommission kultiviert.
In allen Fällen liegt außerdem ein umfangreiches histopathologisches Gutachten der
Selbstständigen Abteilung Neuropathologie des Universitätsklinikums Leipzig vor, was
eine detaillierte Charakterisierung und Klassifizierung nach WHO-Richtlinien ermöglichte
und zusätzliche Erkenntnisse in der Zusammenschau mit den genetischen Ergebnissen
erbrachte.
Mit den genannten Methoden analysierten wir zunächst einen seltenen Fall eines multipel
aufgetretenen Meningeoms mit zwei Tumoren unterschiedlicher Malignität (1 WHO Grad
1; 1 WHO Grad 2), um dann an einer Gruppe von 10 Meningeomen (5 WHO Grad 1; 5
WHO Grad 2) unsere Ergebnisse neu zu bewerten und Informationen dazu zu gewinnen.
Unsere vergleichenden genetischen Analysen sollen zur weiteren zytogenetischen und
molekulargenetischen Charakterisierung von benignen (WHO Grad 1) und atypischen
(WHO Grad 2) Meningeomen beitragen und einen additiven Informationsgewinn
ermöglichen.
Ziel war es, mit Hilfe unserer Methodenkombination noch nicht beschriebene mögliche
tumorrelevante Aberrationen zu detektieren und weitergehend zu analysieren. Die
Erfassung möglicher rekurrenter segmentaler Regionen mit Uniparentaler Disomie stellte
ein weiteres Ziel dar, um Hinweise auf deren funktionelle Bedeutung zu erhalten. 11
Veröffentlichungen
2. Veröffentlichungen
2.1 Veröffentlichung 1
„Multiple meningioma with different grades of malignancy: Case report with genetic
analysis applying single-nucleotide polymorphism array and classical cytogenetics“
(48)
Pathology- Research and Practice 207 (2011) 67-72
Seite 13-18
12
Pathology – Research and Practice 207 (2011) 67–72
Contents lists available at ScienceDirect
Pathology – Research and Practice
journal homepage: www.elsevier.de/prp
Teaching cases
Multiple meningioma with different grades of malignancy: Case report with
genetic analysis applying single-nucleotide polymorphism array and classical
cytogenetics
Kristin Mocker a,1 , Heidrun Holland b,1 , Peter Ahnert b,c , Ralf Schober d , Manfred Bauer d ,
Holger Kirsten b,c,e , Ronald Koschny f , Jürgen Meixensberger a , Wolfgang Krupp a,∗
a
Department of Neurosurgery, University of Leipzig, Liebigstrasse 20, D-04103 Leipzig, Germany
Translational Centre for Regenerative Medicine (TRM), Leipzig, Germany
c
Institute for Medical Informatics, Statistics and Epidemiology, University of Leipzig, Leipzig, Germany
d
Division of Neuropathology, University of Leipzig, Leipzig, Germany
e
Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, Leipzig, Germany
f
Department of Internal Medicine, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany
b
a r t i c l e
i n f o
Article history:
Received 1 April 2010
Received in revised form 6 July 2010
Accepted 3 September 2010
Key words:
Multiple meningioma
Cytogenetics
Uniparental disomy
a b s t r a c t
Multiple meningiomas with synchronous tumor lesions represent only 1–9% of all meningiomas and
usually show a uniform histology. The simultaneous occurrence of different grades of malignancy in these
nodules is observed in only one third of multiple meningiomas. We report a case of a sporadic multiple
meningioma presenting with different histopathological grades (WHO I and II). The tumor genome of
both nodules was analyzed by GTG-banding, spectral karyotyping (SKY), locus-specific FISH, and single
nucleotide polymorphism array (SNP-A) karyotyping. GTG-banding and SKY revealed 25 structural and
33 numerical aberrations with a slightly increased aberration frequency in the WHO grade II nodule.
We could confirm terminal deletions on chromosomes 1p [ish del(1)(p36)(p58-,pter-) 16.5% WHO grade
I and 20.9% WHO grade II], partial deletions on 22q, and/or monosomy 22 (monosomy 22 14% WHO
grade I and 34% WHO grade II) as the most frequent aberrations in both meningioma nodules. In the
meningioma WHO grade II, in addition, a de novo paracentric inversion within chromosomal band 1p36
was detectable. Furthermore, for meningiomas de novo, dicentric chromosomes 4 could be identified
in both tumor nodules. We also detected previously published segmental uniparental disomy regions
1p31.1, 6q14.1, 10q21.1, and 14q23.3 in normal control DNA of the patient and in both tumor nodules.
Taken together, we describe a very rare case of multiple meningioma with overlapping but also distinct
genetic aberration patterns in two nodules of different WHO grades of malignancy.
© 2010 Elsevier GmbH. All rights reserved.
Introduction
Accounting for 13–26% of all primary intracranial neoplasms
in adults, meningiomas are histologically classified according to
the World Health Organization (WHO) into benign (WHO grade
I), atypical (WHO grade II), and anaplastic (WHO grade III) lesions
[16]. They commonly occur as slow-growing and benign sporadic solitary tumors [25,26]. Yet, about 8–22% of meningiomas
are atypical or anaplastic (WHO grades II or III, respectively)
tumors with a more aggressive behavior and high relapse rates
[18]. Furthermore, meningiomas are diagnosed in ∼50% of neurofibromatosis type 2 (NF2) patients characterized by loss of
∗ Corresponding author. Tel.: +49 341 9717506; fax: +49 341 9717509.
E-mail address: [email protected] (W. Krupp).
1
Contributed equally.
0344-0338/$ – see front matter © 2010 Elsevier GmbH. All rights reserved.
doi:10.1016/j.prp.2010.09.001
the NF2 gene on chromosome 22 encoding the merlin tumor
suppressor [8].
Multiple meningiomas occur in 1–9% of patients and refer
to a condition in which at least two tumors are present at different sites in one patient without neurofibromatosis [7]. They
may occur as familial or sporadic tumors [28]. The majority of
multiple meningiomas present as benign with uniform histology
[22]. In 30% of cases, different grades of malignancy are observed
[30]. The simultaneous occurrence of benign and atypical histological grades in sporadic multiple meningiomas is extremely
rare.
Several authors have described genetic alterations associated
with meningioma initiation and progression but existing genetic
data do not allow an adequate prediction of rates of tumor growth
or of likelihood of tumor recurrence [6,24]. The significance of
genetic profiles of tumor nodules for the appearance of multiple
meningiomas is not completely understood.
68
K. Mocker et al. / Pathology – Research and Practice 207 (2011) 67–72
The most consistent genetic abnormality in sporadic solitary
meningiomas is loss of heterozygosity on chromosome 22, which
is present in about 50% of patients. Somatic mutation of the NF2
gene (22q12.2) was found as an early event of tumorigenesis in
one third of these cases [5]. In contrast, familial multiple meningiomas do not show loss or mutation of NF2 [28]. Other frequently
detected abnormalities in meningiomas, e.g. deletions of 1p, 10, and
14 have been associated with tumor progression and higher grades
of malignancy [5,21,29].
As described in previous studies, genomic aberrations can
be detected using complementary methods [11,12]. Therefore,
we performed comprehensive cytogenetic analysis of the tumor
genome of both nodules of a sporadic multiple meningioma applying GTG-banding, spectral karyotyping (SKY), locus-specific FISH,
and single nucleotide polymorphism array (SNP-A) karyotyping.
Combining these techniques, we could detect overlapping but also
distinct genetic aberration patterns in the two nodules of different
WHO grades of malignancy.
Material and methods
Case report
A 36-year-old female patient presented with headache and
left-sided hypacusis. MRI revealed multiple intracranial supraand infratentorial meningiomas located on both sides. The patient
showed neither a family history of meningiomas nor other stigmata
of neurofibromatosis type 2 according to the Manchester criteria
[2].
In the year of diagnosis, a right petrous bone meningioma
was extirpated. Seven months later, a significantly grown bilateral
lesion which infiltrated the tentorium and a smaller median meningioma arising from the convexity over cerebellar hemispheres were
removed.
Eight years later, surgery was indicated due to deterioration of
neurological symptoms (developed cerebellar ataxia). Extirpation
of two medial meningiomas of the cerebellar convexity and a new
grown left petrous bone meningioma was performed.
Up to this point, all tumors had been identified histopathologically as fibroblastic and benign, WHO grade I.
A progress of visual field defects another two years later, i.e.,
about 11 years after first tumor diagnosis, was caused by two new
rapidly growing left-sided falcine meningiomas in the parietal and
the occipital region. Histological examination of the tumor specimens revealed a transitional-psammomatous meningioma WHO
grade I and a transitional-atypical meningioma WHO grade II. In
the grade I tumor, a MIB proliferation index of 3–5%, and in the
grade II tumor, a proliferation index of 15% with diffuse distribution of decorated nuclei was found (Fig. 1). Material from these two
tumors was available for genetic analyses (for detailed description
of all resected tumors see Table 1). All tumors definitely arose from
different locations; there were no local recurrences of the resected
tumors. Therefore, according to the current definition of multiple
meningiomas and to the best of our knowledge, the two left-sided
Fig. 1. Histopathological findings of the two separate meningiomas WHO grade I (above) and WHO grade II (below) that were resected in the same session. (A) Isomorphous
tumor with a storifom pattern of elongated tumor cells; HE, ×20. (B) Proliferation index of 3–5%; MIB-1, ×20. (C) Tumor with a similar storifom pattern but with local sheets
of larger cells with more prominent nucleoli and with interspersed spandrels of small tumor cells; HE, ×20. (D) Proliferation index of 15%; MIB-1, ×20.
Table 1
Clinical and histopathological data of the resected tumors.
Year of surgery
Number of resected tumors
Site of origin
Simpson grade
WHO grade
Histology
1996
1997
One
Two
2005
Three
2007
Two
Petrous bone, right
Tentorium, bilateral
Cerebellar convexity, median
Petrous bone, left
Cerebellar convexity, left
Cerebellar convexity, left – far lateral
Falx, parietal, left
Falx, occipital, left
II
II
I
II
I
I
I
II
I
I
I
I
I
I
II
I
Fibroblastic
Fibroblastic
Fibroblastic
Fibroblastic
Fibroblastic
Fibroblastic
Transitional-atypical
Transitional-psammomatous
K. Mocker et al. / Pathology – Research and Practice 207 (2011) 67–72
falcine tumors represent a multiple meningioma. Up to that point
of time, the patient had not received any additional treatment,
especially no radiotherapy.
At present, residual visual field defects and a slight ataxia do
not interfere with daily routine activities of the patient. In spite of
five complex neurosurgical interventions within a time interval of
11 years and concerns about new tumors, the patient described a
general satisfaction with life in recent examinations.
Isolation and culturing of primary tumor cells
For tumor cell isolation, fresh non-necrotic surgical specimens
were washed in PBS and mechanically disaggregated into small
pieces which were evenly distributed in a 25 cm2 cell culture
flask (Sarstedt #3.1810) coated with AmnioMax medium (Invitrogen) and incubated at 37 ◦ C and 5% CO2 . Tumor attachment was
monitored daily. After tumor cell outgrowth, tumor pieces were
removed, and cells were covered with AmnioMax. Cells were subcultivated at a confluency of 90%.
Chromosome preparation, GTG and FISH studies
Chromosome preparation was carried out on primary tumor cell
cultures using standard cytogenetic techniques (colcemid treatment, hypotonic treatment, and methanol/acetic acid fixation).
GTG-banding, SKY (according to the manufacturer’s instructions
– Applied Spectral Imaging), and locus-specific FISH (according to
the manufacturer’s instructions – Abbott/VYSIS) were applied for
chromosome analysis using chromosome spreads. For karyotyping we analyzed 25 metaphases of the primary cell culture using
GTG-banding and 15 metaphases using SKY. FISH analyses were
performed on metaphase/interphase cells with probes LSI p58/LSI
Telomere 1p; 1p36; spectrum orange/green, LSI TUPLE1/LSI ARSA;
22q11.2/22q13; spectrum orange/green, and CEP 14; spectrum
orange (ABBOTT/VYSIS).
Molecular karyotyping using SNP-arrays
High-resolution genome-wide copy number variation analysis was carried out using the Affymetrix GeneChip Mapping 100K
Array Set (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA) in primary tumor
cells, as described before [11]. Briefly, after extraction of genomic
DNA from primary meningioma cells using the DNeasy Tissue Kit
(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany), integrity of genomic DNA was
checked by agarose gel electrophoresis. Genotyping experiments
were carried out according to standard protocols for the Affymetrix
GeneChip Mapping 100K Array Set allowing genotyping of roughly
100,000 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the genomic
DNA of a sample, enabling genome wide detection of numerical
aberrations with a median intermarker distance of 8.5 kb and a
mean intermarker distance of 23.6 kb. Arrays were scanned and
genotypes were called using the GeneChip Genotyping Analysis
Software (GTYPE) 4.0, which uses an automated genotype-calling
algorithm that provides a confidence score for each individual
genotype. Copy numbers for each SNP were determined using the
GeneChip Chromosome Copy Number Analysis Tool (CNAT), which
provides a value for the amount of DNA present at each SNP position, as well as p-values describing the significance of each finding.
Analyses were carried out as described [11]. For high resolution at
low noise, a 0.5 MB sliding window (GSA) was chosen for analysis.
Supported by cytogenetic data for the same sample, p-values for
copy number changes appeared to be a good indicator for imbalances. Regions of suspected uniparental disomy were identified
by LOH probability >80%, normal copy number values, and normal
p-values for copy number changes.
69
Table 2
Chromosomal aberrations of the two tumor nodules as detected by GTG-banding,
SKY, and locus specific FISH.
Chromosomal aberration
WHO grade I
nodule (%)
WHO grade II
nodule (%)
ish del(1)(p36)(p58-,pter-)
ish del(1)(p36)(p58+,pter-)
Inversion within 1p36
dic 4
Monosomy 14
del(22)(q13)
Monosomy 22
16.5
10
0
7.5
2.5
16.5
14
20.9
21
18.7
10
6.5
20.9
34
Results
Analyzing 25 metaphases by GTG-banding and 15 metaphases
using SKY in each tumor nodule, we found structural chromosomal aberrations most frequently localized on chromosomes 1 and
22, with a slightly increased aberration frequency in WHO grade II
meningioma. Significant chromosomal aberrations of both nodules
are listed in Table 2.
We could confirm partial deletions on 22q and/or monosomy 22
as the most frequent aberrations in sporadic meningioma. Using
locus-specific FISH analysis, we found monosomy 22 in 14% of
tumor cells of the WHO grade I nodule and in 34% of tumor cells of
the WHO grade II lesion. Terminal del(22)(q13) was only detectable
in the grade II lesion in 10% of neoplastic cells. However, clear evidence for loss along the entire chromosome 22 was visible by SNP-A
karyotyping in both tumor nodules. Stringent criteria for loss were
fulfilled for 22q11.21, 22q12.1, 22q12.3, and 22q13.
Using GTG-banding, SKY, and locus-specific FISH analysis,
we could confirm the previously described terminal deletions
del(1)(p36) [ish del(1)(p36)(p58-,pter-)]: 16.5% of the interphase
cells/metaphases in meningioma grade I, and 20.9% in meningioma
grade II (Fig. 2A); ish del(1)(p36)(p58+,pter-): 10% of the interphase
cells/metaphases in meningioma grade I, and 21% in meningioma
grade II (Fig. 2B) as a frequent aberration in meningioma. In the
grade II lesion, we additionally detected a de novo paracentric inversion within chromosomal band 1p36 in 3/16 metaphases analyzed
(Fig. 2C). SNP-A karyotyping revealed signs of losses on 1p (Fig. 2D)
in both WHO grades.
As described here for the first time for meningiomas, dicentric
chromosomes 4 could be identified in both tumor nodules by GTGbanding, SKY, and locus-specific FISH analysis (Table 2; Fig. 2E–G).
SNP-A karyotyping did not show any chromosomal imbalances at
chromosome 4 (data not shown).
Monosomy of chromosome 14 was detected in only 2.5% of
meningioma WHO grade I cells , and in 6.5% of meningioma WHO
grade II cells.
SNP-A karyotyping uniquely allows for genome-wide analysis
of heterozygosity. Applying SNP-A karyotyping, we detected the
previously published segmental uniparental disomy (UPD) regions
1p31.1, 6q14.1, 10q21.1, and 14q23.3 in normal control DNA of the
patient and in both tumor nodules [12].
Discussion
Multiple meningiomas with synchronous tumor lesions represent only 1–9% of all meningiomas and usually show uniform
histology. The simultaneous occurrence of different histological
grades in these nodules is observed in only one third of multiple meningiomas [30]. There are only few reports on multiple
meningiomas in which atypical and benign histological types were
simultaneously observed [4,13,19,30]. To our knowledge, this is the
fourth presented case. We report a clinically very interesting case
of a multiple meningioma with synchronous tumor lesions of dif-
70
K. Mocker et al. / Pathology – Research and Practice 207 (2011) 67–72
Fig. 2. Comparison of GTG banding, SKY, locus-specific FISH analysis, and SNP-array copy number analysis of two nodules of a sporadic multiple meningioma. Locus-specific
FISH analysis showed ish del(1)(p36)(p58-,pter-) (A), ish del(1)(p36)(p58+,pter-) (B), and paracentric inversion within 1p36 (C), here in meningioma WHO grade II. (D):
SNP-A karyotyping revealed signs of losses on 1p in DNA of both tumors compared with DNA from blood. Results for the chromosomal regions 1pter→1p31.1 are shown for
normal peripheral lymphocytes (blood) and meningioma nodules of WHO grades I and II. SNP-array karyotyping detected segmental partial UPD on chromosomal sequence
1p31.1 (black frames) in all three specimens. Representations of SNP-array copy number data show calculated values for copy number (GSA CN) (I – blue) and logarithm of
p-values (GSA pVal) (II – red), separately. LOH indicates measures of loss of heterozygosity (III – green). Genetic aberrations on chromosome 4 were detected by GTG banding
(E), SKY (F), and locus-specific FISH analysis (G) showing a dicentric chromosome 4.
ferent grades of malignancy and previous occurrence of sporadic
meningiomas. Therefore, the aim of this study was to characterize
these tumors for typical genetic aberrations which are discussed to
be causative for multiple meningiomas.
The tumor genome of both nodules was analyzed by single
nucleotide polymorphism array (SNP-A) karyotyping and classical cytogenetics. Analysis of genomic changes using classical and
molecular cytogenetic methods in combination with high density
SNP-A provides more detailed data on genetic aberrations and possible mechanisms of tumor progression.
Applying these techniques in the present case, we detected
the previously published tumor-associated segmental UPD regions
1p31.1, 6q14.1, 10q21.1, and 14q23.3 [14] in both tumor nodules of
the present case of a multiple meningioma. Interestingly, these UPD
regions were detected also in normal control DNA of the patient.
The same chromosomal regions were identified as UPD regions in
tumor tissue of rectal cancer [15]. However, control DNA of normal
cells was not investigated in the study of Lips et al. [15]. Uniparental disomy (UPD), in addition to allelic imbalance, is emerging
as a genetic mechanism involved in tumorigenesis and progression,
often involving de novo mutations in relevant genes [31]. To the best
of our knowledge, this is the first presented case of multiple meningioma with partial UPD regions in normal control DNA (blood) and
tumor tissues. As we found hereditary UPD regions, it is tentative to
speculate about a causal role of these regions for carcinogenesis in
general and tumorigenesis of meningioma in particular. Currently,
K. Mocker et al. / Pathology – Research and Practice 207 (2011) 67–72
we are investigating these partial UPD regions in a larger group
of sporadic meningiomas of WHO grades I and II (manuscript in
preparation). The authors believe it is important to further analyze
the significance of copy number variations, UPD, and LOH, as well
as their interdependencies in order to gain a deeper insight into
tumorigenesis and progression.
One of the most prominent chromosomal aberrations described
in meningiomas (WHO grades I and II) using CGH analysis is loss
of all or part of chromosome 22 (24–51% of published cases) [3].
Monosomy 22 may be associated with a higher frequency of meningioma recurrence [23]. We found monosomy 22 in 14% of tumor
cells of the WHO grade I lesion, and in 34% of tumor cells of the
WHO grade II lesion. Terminal del(22)(q13) was only detectable
in meningioma grade II (10% of neoplastic cells), but losses of
22q11.21, 22q12.1, 22q12.3, and 22q13 were identified by SNP-A
karyotyping in both tumor nodules. The Cancer Gene Census lists
a number of genes and loci known to be involved in various neoplasms. Comparison of the Cancer Gene Census with our SNP-array
data identified six concordant meningioma candidate genes within
genomic regions affected by these deletions mentioned above:
CLTCL1, CLH22, CLTD, MN1, LARGE, and PDGFB [1,9].
Deletions of 1p are the second most frequent chromosomal
aberrations (about 22–33% of published cases using CGH analysis)
in meningiomas [3,23]. Partial or complete loss of chromosome 1
or 1p has been described to be an important step in progression
of meningiomas [3]. Nakane et al. [17] did not detect LOH of 1p in
grade I tumors, but in more than 80% of the grade II and III tumors.
LOH of 1p and hypermethylation of the candidate gene TP73 (1p36)
were detected in meningiomas of WHO grades II and III, but not
in the primary benign tumors. In the present case, deletions ish
del(1)(p36)(p58-,pter-) and ish del(1)(p36)(p58+,pter-) could be
detected in both tumor nodules. In addition to these chromosomal
aberrations, we detected a de novo paracentric inversion within
chromosomal band 1p36 only in the grade II meningioma lesion.
Thus, paracentric inversion within the chromosomal region 1p36
might represent a molecular step at the transition from WHO I to
WHO II meningiomas. Gajecka et al. [10] described constitutional
paracentric inversion within 1p36, combined with three interstitial cryptic deletions in a patient with deletion 1p36 syndrome. The
authors proposed that two of the three interstitial deletions were
the primary event, with the inversion as an intermediate step in the
rearrangement formation. The third interstitial deletion may have
resulted from processes stabilizing the inversion. Using the techniques available to us, we did not detect deletions in metaphases
with paracentric inversion 1p36.
Here we describe low frequency dicentric chromosome 4 for
the first time in meningiomas. Interestingly, this aberration could
be identified in both tumor nodules. Dicentric chromosomes may
originate from telomeric fusion [20,27]. Dicentric chromosomes
originating from telomeric fusion tend to pull apart during mitosis,
resulting in deletions and unbalanced chromosomal fragments
due to breakage between the two centromeres. Sawyer et al.
[27] described telomeric fusion as a mechanism for loss of 1p in
meningioma.
Taken together, we describe a rare case of multiple meningioma
with overlapping but also distinct genetic aberration patterns in
two nodules of different WHO grades of malignancy. The significance of de novo partial UPD regions in blood and tumor tissues, as
well as the paracentric inversion in the chromosomal region 1p36
and dicentric chromosome 4, has to be verified in a larger group of
meningiomas.
Acknowledgements
The authors thank Helene Hantmann and Rainer Baran-Schmidt
for their excellent technical assistance. This study was supported by
71
the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, PtJBio, grant 0313909 to HH and HK and grant 01KN0702 supporting
PA).
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„High resolution genomic profiling and classical cytogenetics in a group of benign and
atypical meningiomas“
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Cancer Genetics 204 (2011) 541-549
Seite 20-28
19
Cancer Genetics 204 (2011) 541e549
High resolution genomic profiling and classical
cytogenetics in a group of benign
and atypical meningiomas
Heidrun Holland a,1, Kristin Mocker b,1, Peter Ahnert a,c,g, Holger Kirsten a,c,f,g,
Helene Hantmann a, Ronald Koschny d, Manfred Bauer e, Ralf Schober e,
€rgen Meixensberger b, Wolfgang Krupp b,*
Markus Scholz c,g, Ju
a
b
Translational Centre for Regenerative Medicine (TRM), University of Leipzig, Leipzig, Germany; Department of
Neurosurgery, University of Leipzig, Leipzig, Germany; c Institute for Medical Informatics, Statistics and Epidemiology,
University of Leipzig, Leipzig, Germany; d Department of Internal Medicine, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany;
e
Division of Neuropathology, University of Leipzig, Leipzig, Germany; f Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology,
Leipzig, Germany; g LIFE Center (Leipzig Interdisciplinary Research Cluster of Genetic Factors, Phenotypes and
Environment), University of Leipzig, Leipzig, Germany
Meningiomas are classified as benign, atypical, or anaplastic. The majority are sporadic, solitary,
and benign tumors with favorable prognoses. However, the prognosis for patients with anaplastic
meningiomas remains less favorable. High resolution genomic profiling has the capacity to provide
more detailed information. Therefore, we analyzed genomic aberrations of benign and atypical
meningiomas using single nucleotide polymorphism (SNP) array, combined with G-banding by
trypsin using Giemsa stain (GTG banding), spectral karyotyping, and locus-specific fluorescence
in situ hybridization (FISH). We confirmed frequently detected chromosomal aberrations in meningiomas and identified novel genetic events. Applying SNP array, we identified constitutional
de novo loss or gain within chromosome 22 in three patients, possibly representing inherited
causal events for meningioma formation. We show evidence for somatic segmental uniparental
disomy in regions 4p16.1, 7q31.2, 8p23.2, and 9p22.1 not previously described for primary meningioma. GTG-banding and spectral karyotyping detected a novel balanced reciprocal translocation
t(4;10)(q12;q26) in one benign meningioma. A paracentric inversion within 1p36, previously
described as novel, was detected as a recurrent chromosomal aberration in benign and atypical
meningiomas. Analyses of tumors and matched normal tissues with a combination of SNP arrays
and complementary techniques will help to further elucidate potentially causal genetic events for
tumorigenesis of meningioma.
Keywords Meningioma, cytogenetics, single nucleotide polymorphism array, segmental
uniparental disomies, paracentric inversion
ª 2011 Elsevier Inc. All rights reserved.
Accounting for 24e30% of all primary intracranial neoplasms in
adults, meningiomas are histologically graded according to the
World Health Organization (WHO) as benign (WHO grade I),
atypical (WHO grade II), or anaplastic (WHO grade III)
Received December 7, 2010; received in revised form October
12, 2011; accepted October 17, 2011.
* Corresponding author.
E-mail address: [email protected]
1
These authors contributed equally to this study.
2210-7762/$ - see front matter ª 2011 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.cancergen.2011.10.007
meningiomas (1). Mainly, meningiomas occur as sporadic,
solitary, slow-growing, and benign tumors (2,3).
Atypical and anaplastic meningiomas represent 8e22% of
meningiomas. They show a more aggressive biological
behavior, a less favorable prognosis (4,5), and high recurrence rates between 38e78% (6,7). Although the grade of
malignancy and the completeness of tumor resection are
important predictors for tumor recurrence, several genetic
aberrations are associated with a more aggressive phenotype
(8,9). Meningiomas are among the best-described tumors in
terms of tumor genetics. However, our understanding of
542
genetic aberrations associated with aggressive behavior of
meningioma is still limited.
One of the most prominent chromosomal aberrations
detected by comparative genomic hybridization (CGH) in
meningiomas is partial or complete loss of chromosome 22,
found in 24e51% of published cases (10). Loss of heterozygosity (LOH) of chromosome 22 is observed in 47e72% of
meningiomas. In one third of these cases showing LOH of
chromosome 22, somatic mutation of the NF2 gene, located
on 22q12.2, is described as an early event in tumorigenesis
(11). The NF2 gene appears to be less often affected within
the meningothelial subtype in comparison with other meningioma subtypes (12). The same holds for skull base localization of meningiomas in comparison with other localizations
(13). Alternative NF2-independent pathways of tumor initiation of meningioma still remain unclear despite the identification of several other candidate genes on chromosome 22,
such as BAM22, LARGE, SMARCB1, and MN1 (14).
The second most common genetic abnormality in meningioma is partial or complete loss of 1p, which simultaneously
represents the most frequent progression-associated chromosomal aberration in meningiomas (15). Concentrating on
chromosomal loci 1p13, 1p32, and 1p36, several genes, such
as TP73, RASSF1A, CASP9, JUN, and TNFRF25, have been
focused on as candidates for tumor initiation and/or progression (14,16e18). Further frequently detected abnormalities in
meningiomas, such as deletions of 6q, 10, 14q, and 18q and
chromosomal gains on 1q, 9q, 12q, 15q, 17q, and 20, have
been described to be associated with tumor progression and
a higher grade of malignancy (11,14,19). Comprehensive
genomic characterization of meningiomas may improve the
understanding of meningioma formation and progression.
As a possible new mechanism of tumorigenesis,
segmental uniparental disomy (UPD) was our focus. Somatic
recombination or nondisjunction in mitosis may lead to loss of
one allele, and the remaining allele is then reduplicated.
Another possibility is chromosomal breakage followed by
reduplication to compensate for the loss of a segment (20).
These events result in LOH without copy number change.
Possible consequences are inactivation of tumor suppressor
genes or activation of oncogenes.
Our recent analyses of a case of atypical meningioma and
a case of multiple meningioma showed segmental UPD
regions as potential recurrent genetic events in meningiomas
(21,22).
The aim of the current study was to assess occurrence of
previously described segmental UPD regions in a group of 10
sporadic benign and atypical meningiomas. Furthermore, we
sought data on other potentially recurrent segmental UPD
events, and we wanted to perform a comprehensive analysis
for novel chromosomal aberrations. For this purpose, we
combined cytogenetic techniques with molecular cytogenetic
methods. GTG-banding, spectral karyotyping (SKY), and
locus-specific FISH were complemented by analyses of copy
number and heterozygosity using Affymetrix Genome-Wide
Human SNP Array 6.0. GTG-banding produces reproducible
banding patterns on metaphase chromosomes and allows
detection of aberrations on the single chromosome level
(resolution 5e10 Mb). SKY is a multicolor FISH technique
that allows for detection of cryptic balanced or unbalanced
translocations and complex rearrangements in the karyotype. With a resolution as low as 2e3 Mb, SKY allows
H. Holland et al.
assignment of additional chromosomal material to their
chromosomes of origin. Two major limitations of SKY in
contrast to GTG-banding are that duplications and deletions
are visible only with additional procedures, and intrachromosomal aberrations are not detectable.
Applying this combination of techniques, we confirmed
frequently detected chromosomal aberrations and identified
novel genetic events.
Materials and methods
Patients
Tumor resection was performed in 10 patients with primary
sporadic meningiomas at the Department of Neurosurgery,
University Hospital of Leipzig. Group 1 comprised five
consecutive cases with meningioma of WHO grade I (n Z 3
male, n Z 2 female, mean age at time of surgery 54.8 y).
Group 2 consisted of five consecutive cases with meningioma
of WHO grade II (n Z 1 male, n Z 4 female, mean age at time
of surgery 64.0 y). Time intervals between admissions of
patients in group 2 were longer than those in group 1 because
of the lower incidence of atypical meningiomas. Informed
consent was obtained from all patients.
Using magnetic resonance imaging (MRI), tumor lesions
were found in the following intracranial regions: olfactory
groove (n Z 4), convexity (n Z 3), lateral sphenoid (n Z 1),
tuberculum sellae (n Z 1), and falx (n Z 1). Detailed information on age, sex, tumor location, tumor grade, histopathological subtype, proliferation index, and surgical procedure
(Simpson grade) is given in Table 1.
All patients lacked a family history of brain tumors and
underwent neither chemotherapy nor radiotherapy prior to
surgery, except patient 8, who received local adjuvant radiotherapy of a rectal carcinoma five years before meningioma
diagnosis. The proliferation index was calculated as
percentage of cells positive for proliferation marker Ki67
evaluating 10 high power fields (400 magnification). The
mean MIB (Ki67) proliferation index was 3.4% for WHO grade
I meningiomas and 7.8% for WHO grade II meningiomas.
Isolation and culturing of primary tumor cells
For each tumor cell isolation, fresh non-necrotic surgical
specimens were washed in phosphate-buffered saline (PBS)
and mechanically disaggregated into small pieces that were
evenly distributed in a 25-cm2 cell culture flask (#83.1810
€mbrecht, Germany) coated with AmnioMax
Sarstedt, Nu
medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) and incubated at 37 C
and 5% CO2. Tumor attachment was monitored daily. After
tumor cell outgrowth, tumor pieces were removed and cells
were covered with AmnioMax. Cells were sub-cultivated at
a confluency of 90%.
Chromosome preparation, GTG, and FISH studies
Chromosome preparations were performed on primary tumor
cell cultures using standard cytogenetic techniques (colcemid
treatment, hypotonic treatment, and methanol/acetic acid
fixation). GTG-banding, SKY (according to manufacturer’s
Cytogenetics of benign and atypical meningiomas
543
Table 1
Clinical, molecular, and histopathological patient data
Sample
No.
Age,
y
Location
(main part)
1
45
2
53
fronto-temporal
right
fronto-basal right
3
4
5
6
7
50
57
69
42
58
8
9
10
65
76
79
Site of origin
Simpson
gradea
WHO
grade
Histology
MIB
(Ki-67)
NF2 mutationb
lateral spenoid
II
I
Meningothelial
<1%
-
II
I
Meningothelial
4%
-
frontal
frontal right
frontal
occipital right
frontal
tuberculum
sellae
olfactory groove
convexity
olfactory groove
falx
olfactory groove
II
I
II
II
II
I
I
I
II
II
Meningothelial
Microcystic
Meningothelial
Atypical
Atypical
4%
4%
4%
8%
8%
temporal left
fronto-basal
temporal left
convexity
olfactory groove
convexity
I
II
I
II
II
II
Chordoid
Atypical
Atypical
8%
8%
7%
g.76466C>T
g.43498_43499insA
g.43498_43499insA
g.74810C>T
(Zp.Gln407Stop)
g.43498_43499insA
a
Simpson grade I: complete excision of meningioma, including infiltrated dura and bone.
Simpson grade II: complete excision of meningioma, with supposed reliable coagulation of dural attachment.
b
Positions of NF2 mutations are according to the NCBI (National Center for Biotechnology Information) reference sequence: NG_009057.1.
Shown are only variants not observed in dbSNP v132.
instructions; Applied Spectral Imaging, Carlsbad, CA), and
locus-specific FISH (according to manufacturer’s instructions;
Abbott/Vysis, North Chicago, IL) were applied for chromosome analysis using chromosome spreads. For each tumor,
we analyzed 25 metaphase cells of the primary cell culture
using GTG-banding and 15 metaphase cells using SKY. FISH
analyses were performed on metaphase/interphase cells with
probes LSI P58/LSI Telomere 1p; 1p36; spectrum orange/
green, and LSI TUPLE1/LSI ARSA; 22q11.2/22q13; spectrum
orange/green (Abbott/Vysis).
Molecular karyotyping using SNP arrays
High resolution genome wide copy number variation analysis
and assessment of heterozygosity were performed using the
Genome-Wide Human SNP Array 6.0 (Affymetrix, Santa
Clara, CA) in resected tumor tissues. The array contains
probes for genotyping and copy number detection for nearly
one million SNPs. In addition, it contains close to one million
additional probes for detecting copy number in nonpolymorphic regions. Thus, the array allows genome wide
detection of chromosomal copy number as well as estimation
of heterozygosity at high resolution.
Genomic DNA from primary meningioma cells was
extracted using the DNeasy Tissue Kit (QIAGEN GmbH,
Hilden, Germany). The integrity of genomic DNA was
checked by agarose gel electrophoresis. Array processing
was performed as a service by AROS Applied Biotechnology
AS (Aarhus, Denmark). Quality control involved several
aspects: Inspection of sample histograms (data not shown)
did not reveal any hints at technical problems. In principal
component analysis (data not shown) of array intensity data,
clustering with “scan date” was not observed, suggesting
reproducible laboratory procedures. Male samples clustered
separately from female samples, as expected. For all
patients, blood and tumor samples from the same individual
clustered near each other with similar distances between
blood and tumor. We observed no clustering with tumor grade
(WHO grade I or II).
Genotypes were called using the birdseed version 1
algorithm (23) implemented in the Affymetrix Genotyping
Console software version 4.0, with standard settings. For
blood samples, the overall call rate was greater than 99.2%.
For tumor samples, the overall call rate was greater than
98.7%. Copy number analyses and detection of regions with
LOH were performed in Partek Genomics Suite version 6.5
(release number 6.10.1020, Partek, St. Louis, MO) according
to given workflows with standard settings.
Copy number aberrations were detected with genomic
segmentation in Partek Genomics Suite. Copy number
regions were reported if a minimum size of 1Mb and an
average smooth signal of at least 2.4 for gain regions or
a maximum smooth signal of 1.6 for loss regions were
observed. LOH was determined in Partek Genomics Suite for
paired samples to identify somatic changes in tumors versus
blood (germline) and unpaired relative to a reference derived
from 102 germline samples of the local population to identify
overall regions of LOH, including constitutive LOH.
Analysis of enrichment of LOH was performed using the
software R 2.12.0. The observed percentage of LOH within
1p31.1, 6q14.1, 10q21.1, and 14q23.3 within a certain tissue
type was compared with the percentage of LOH within
100,000 randomly drawn genomic regions of similar size of
the same tissue type. On this basis, the odds ratio of the
percentage of LOH in WHO grade II versus WHO grade I
was determined.
NF2 gene sequencing
All 17 NF2 exons were amplified as described previously (24).
Polymerase chain reaction (PCR) products were purified
€ttingen, Germany).
using a PCR purification kit (Seqlab, Go
Sequencing was performed by Seqlab. Sequences were
analyzed using FinchTV 1.4 (Geospiza, Seattle, WA) and
544
H. Holland et al.
compared with human genome build hg19 and dbSNP build
132. Sequencing the PCR product in the reverse direction
validated detected variants not reported in dbSNP.
8 samples: 4 WHO grade I, 4 WHO grade II), and 19 (12/400, 7
samples: 4 WHO grade I, 3 WHO grade II).
Results of SNP array analyses and NF2
sequencing
Results
Results of GT- banding, SKY, and locus-specific
FISH
In analyzing 25 metaphase cells by GTG-banding and 15
metaphase cells by SKY for each tumor, we found 56
structural chromosomal aberrations most frequently localized
on chromosomes 1, 2, 3, 4, 6, 7, and 22 in 10 meningiomas
(Table 2).
Using these techniques, we identified a novel balanced
reciprocal translocation t(4;10)(q12;q26) in 4 of 40 analyzed
metaphase cells in a benign meningioma (sample 3,
Figure 1A). SNP array analysis also showed no chromosomal
imbalance at the chromosomal breakpoint cluster regions
4q12 and 10q26 in this sample (Figure 1B).
FISH analysis with locus-specific probes LSI P58/LSI
Telomere 1p (primary tumor cells and blood) and LSI
TUPLE1/ARSA (22q11.2/22q13) were performed. With the
application of probe LSI P58/LSI Telomere 1p, the previously
described paracentric inversion within chromosomal region
1p36 (22) was detected as a recurrent chromosomal aberration in 7 of 10 meningiomas (4/5 WHO grade I, 3/5 WHO
grade II). Using the locus-specific FISH probe LSI TUPLE1/
ARSA, we confirmed known chromosomal aberrations, such
as segmental deletions on 22q (4 samples: 2 WHO grade I, 2
WHO grade II), and/or monosomy 22 (6 samples: 2 WHO
grade I, 4 WHO grade II).
Numerical chromosomal changes were detected in
meningiomas using GTG-banding and SKY, analyzing 25 and
15 metaphase cells, respectively. Of 173 identified numerical
chromosomal aberrations, the most frequently found were
monosomies of chromosomes 22 (34/400 metaphase cells,
8 samples: 5 WHO grade I, 3 WHO grade II), 18 (12/400,
Using Genome-Wide Human SNP Array 6.0, we detected
numerous chromosomal aberrations. We confirmed previously described chromosomal imbalances, such as losses of
1p, 2p/q, 3p, 6, 7p/q, 9p, 14, 19p, 14, 19p, and 22q, and gain
of 22q. For the first time in primary benign meningiomas,
we detected losses of 2p16.2-p11.1, 7p21.2-p15.3, and
7q11.21-q21.11 (Table 3).
Further, one chromosomal imbalance not previously
described for intracranial primary atypical meningiomas was
observed by SNP array analysis: gain of chromosomal
material 19p13.12-p12 in the only chordoid subtype of this
group of meningiomas (Figure 1C). This gain was adjacent to
a loss known to be recurrent in meningiomas (Table 3).
Interestingly, losses or gains of 22q were detected not only in
primary tumor cells but were also found in the germline DNA
of the same patients (1/10 and 2/10 analyzed patients,
respectively, Figure 1D). To our knowledge, these aberrations have not been previously reported to be constitutional.
The Cancer Gene Census (25) lists a number of genes and
loci known to be involved in various neoplasms. Our
comparison of the Cancer Gene Census with our SNP array
data identified 121 concordant genes within genomic regions
affected by gains or deletions (data not shown). Of these
affected genes, 56 are described for solid tumors and 10 have
been published in connection with brain tumors (Table 3).
SNP array analysis uniquely allows genome wide analysis
of heterozygosity. For the studied group of benign and
atypical meningiomas, somatic LOH without a copy number
change was observed in 3 tumor samples on chromosomal
regions 4p16.1, 7q31.2, 8p23.2, and 9p22.1, suggesting
segmental UPD. LOH without copy number change was
frequently found within all samples of both tumor grades as
well as in corresponding germline DNA samples from the
same individuals (Table 4a). Segmental UPD in regions
Table 2 Structural aberrations based on the results of GTG-banding and SKY, (25 and 15 metaphases, respectively). Bold typing
indicates chromosomal aberrations detected in more than one metaphase spread of the respective tumor sample
Sample
No.
Gender
WHO
grade
1
F
I
2
3
M
M
I
I
4
5
F
M
I
I
del(1)(p36.3p36.1)[2/40], del(1)(p21p12), del(1)(p?), del(2)(p?), del(2)(p21p13),
del(7)(q11q21), del(18)(p11.2), del(22)(q13)
del(1)(p36)[3/40], del(14)(q32)
t(1;7)(?;?), (t(2;?)(q37;?), t(4;7)(?;?), t(4;10)(q12;q26)[4/40], del(5)(q?),
del(7)(p13p15) [2/40], del(16)(q24)
del(1)(p36)[5/40], del(1)(p21), del(2)(p?), del(3)(p26), del(3)(p21p13)
t(5;9)(?;?)
6
7
8
9
10
F
M
F
F
F
II
II
II
II
II
del(2)(p16p12), del(3)(p?), dup(6)(p?), del(10)(p12), del(12)(p12), dup(12)(q24.3q23)
del(2)(q32), del(2)(p?), del(3)(p25p23)[2/40], del(7)(p15p13)
del(1)(p36p31), del(4)(q?)[2/40], del(6)(p22p12)[2/40], t(7;8)(?;?), t(19;20)(?;?); del(22)(q?)
dup(20)(q13)
tas(13;19)(pter;pter), t(15;19)(q11;q12)
Chromomal aberrations
Note: Bold typing indicates chromosomal aberrations detected in more than one metaphase spread of the respective tumor sample.
Cytogenetics of benign and atypical meningiomas
545
Figure 1 Comparison of GTG-banding, SKY, and SNP array copy number analyses of meningioma. (A) Ideograms with GTG-banding
(top), and SKY (bottom) showing the t(4;10)(q12;q26). (B) SNP array copy number analysis showed no significant imbalance within
breakpoint-cluster region 4q12 or 10q26 (blue rectangles indicate breakpoint-cluster regions). (C) SNP array copy number analysis
(Log2Ratio) revealed de novo gain of chromosomal material 19p13.12-p12 in the only chordoid subtype of this group of meningiomas
(top, indicated by the rectangle); hematoxylin and eosin staining showing characteristic chordoid areas (bottom). (D) SNP array copy
number analysis (Log2Ratio) revealed de novo loss or gain within chromosomal regions 22q11.22-q11.23 in normal control DNA and
primary tumor cells of three patients (green rectangles indicate regions with chromosomal gain, red rectangles indicate the region with
chromosomal loss).
546
Table 3
Sample
No.
1
4
H. Holland et al.
Overview of significant somatic aberrations detected by SNP array
Physical
position
Confirmation
WHO
grade
Cytoband
Copy
number
change
I
1p36.33-p22.3
Loss
0.8
86.7
85.9
1p22.1-p21.3
1p13.2-p12
2p22.3-p16.3
2p16.2-p11.1
2q24.3-q37.3
Loss
Loss
Loss
Loss
Loss
93.1
113.3
32.3
54.1
169.7
95.3
118.3
47.9
91.1
242.4
2.2
5.0
15.6
37.0
72.7
7p21.2-p15.3
7p14.1-p11.2
7q11.21q21.11
7q22.3-q31.1
1p36.33-p22.2
Loss
Loss
Loss
15.2
40.2
63.8
19.7
54.7
78.6
4.5
14.5
14.8
Loss
Loss
106.4
0.7
111.1
91.4
4.7
90.7
1p21.3-p13.3
3p26.3-q11.2
Loss
Loss
94.5
0.0
107.4
95.0
12.9
95.0
I
Start
(Mb)
End
(Mb)
Length
(Mbp)
Genesa
GTG
FISH
Litc
PAX7, SFPQ, THRAP3,
MYCL1, CDKN2C,b JUN
Yes
Yes
Yes
No
Yes
Yes
Yes
No
No
No
No
No
No
Yes
Yes
Yes
No
Yes
No
No
Yes
No
No
No
No
Yes
No
No
Yes
No
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
No
No
Yes
Yes
Yes
No
Yes
Yes
Yes
No
Yes
Yes
Yes
Yes
No
Yes
No
No
No
No
Yes
Yes
No
No
No
No
No
No
Yes
Yes
Yes
No
No
Yes
TRIM33, NRAS
EML4, MSH2, MSH6
CHN1, CREB1,IDH1,b FEV,
PAX3, ACSL3, CMKOR1
PAX7, SFPQ, THRAP3,
MYCL1, CDKN2C,b JUN
SRGAP3,b VHL, PPARG,
RAF1,b MLH1, CTNNB1,
SETD2, MITF
SRGAP3,b VHL, PPARG,
RAF1,b MLH1, CTNNB1,
SETD2, MITF
7
II
3p26.3-q11.2
Loss
0.0
95.0
95.0
8
II
7p22.3-q11.21
1p36.33-p13.1
Loss
Loss
0.1
0.8
62.8
116.1
62.7
115.3
6p25.3-q27
Loss
9p22.3-p22.2
9p21.3
Loss
Loss
0.1
0.0
14.3
20.1
170.8
0.0
18.2
23.4
170.7
0.0
3.9
3.3
9p21.3-p21.1
9p21.1
14q11.1q32.33
19p13.3p13.12
19p13.12-p12
22q11.1q11.21
22q11.21q12.1
22q12.1q13.33
22q11.1q13.33
Loss
Loss
Loss
25.0
30.0
18.1
29.7
31.5
105.3
4.7
1.5
87.2
Loss
0.0
15.3
15.3
Gain
Loss
15.3
14.4
21.0
18.2
5.7
3.8
MECT1
No
No
No
No
Yes
Yes
Gain
19.4
24.6
5.2
BCR,b SMARCB1b
No
No
Yes
Loss
24.6
49.6
25.0
No
No
Yes
Loss
14.9
49.6
34.7
MN1,b EWSR1, NF2,b
ZNF278, PDGFB, EP300
BCR,b SMARCB1,b MN1,b
EWSR1, NF2,b ZNF278,
PDGFB, EP300
No
No
Yes
10
II
PAX7, SFPQ,THRAP3,
MYCL1, CDKN2C,b JUN,
TRIM33, NRAS
HMGA1,TFEB,
ROS1,b GOPC,b MYB
CDKN2A -p16(INK4a),
CDKN2A- p14ARF
HEI10,KTN1, RAD51L1,
TSHR, GOLGA5, AKT1
STK11, SMARCA4
Note: Regarding confirmation, concordance with results from GTG-banding and FISH are shown, as well as previous reporting in the
literature (Lit).
a
Data were obtained from the Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project Web site (25).
b
Genes, described as aberrant in brain tumors.
c
Frequent chromosomal sequences by (array) CGH in meningiomas (38).
1p31.1, 6q14.1, 10q21.1, and 14q23.3, was described in
meningioma in previous studies (21,22). Within these
regions, we found a higher percentage of copy number
neutral LOH (Table 4b). Enrichment analysis showed that the
detected increased percentage of LOH in WHO grade I
cases and further increase in WHO grade II cases were
Cytogenetics of benign and atypical meningiomas
Table 4
547
Extent of segmental UPD regions suggested by copy neutral loss of heterozygosity (cnLOH)
WHO grade I
a) Whole genome
Average cnLOH size in Mb (%)
Minimum cnLOH size in Mb (%)
Maximum cnLOH size in Mb (%)
b) 6q14.1, 10q21.1, and 14q23.3 only
Average cnLOH size in Mb (%)
Minimum cnLOH size in Mb (%)
Maximum cnLOH size in Mb (%)
WHO grade II
Tumor tissue
Blood
Tumor tissue
Blood
324 (11.3%)
307.8 (10.7%)
347 (12.1%)
310.9 (10.8%)
287.4 (10%)
334.6 (11.7%)
325.2 (11.3%)
294.4 (10.3%)
346.5 (12.1%)
311.9 (10.9%)
260.2 (9.1%)
350.3 (12.2%)
3.2 (17.1%)
1.1 (5.9%)
4.8 (25.4%)
3.2 (17.2%)
1.1 (5.9%)
4.8 (25.4%)
4.1 (21.5%)
2.2 (11.8%)
5 (26.6%)
4.2 (22.2%)
2.5 (13.3%)
5 (26.6%)
Note: Shown is the average cumulative size of cnLOH regions (a) throughout the whole genome from tumor tissues and corresponding
germline DNA (blood). The same is shown for (b) selected regions suggested by previous findings (21,22).
unlikely to be due to chance (P < 0.05) for both tumor tissue
and germline DNA.
Mutation analysis of the NF2 gene revealed five mutations
in 4 of 10 meningioma cases (1 WHO grade I and 3 WHO
grade II). Only one single mutation (g.74810C>T, corresponding to p.Gln407Stop in sample 7) showed evidence
for functional impairment of NF2 (Table 1). In addition, five
known SNPs were found to be polymorphic in our samples
(rs13055076, rs2530664, rs140086, rs5763378, and
rs79901896). These SNPs were located in intronic regions of
NF2 without evidence for functional implications.
Discussion
Whereas most meningiomas are sporadic, solitary, benign
tumors with a good chance for complete surgical resection
and relatively optimistic outcome, the prognosis for patients
with atypical and anaplastic meningiomas remains less
favorable. Genetics of WHO grade I and II meningiomas has
been considered to be among the best studied in human
tumors (9,26). Recently, the combination of cytogenetic
techniques and genome wide high resolution SNP arrays has
made it possible to detect a much broader spectrum of
chromosomal aberrations than classical cytogenetic techniques alone. For instance, SNP array techniques uniquely
allow for genome wide analysis of heterozygosity. Examples
include solid tumors and hematological diseases (27e29).
Here we present a study of benign and atypical meningiomas
employing GTG-banding, SKY, FISH, SNP array, and NF2
gene sequencing.
The occurrence of copy neutral LOH and UPD were
previously described for different malignancies (27,29e31),
suggesting UPD as a possibly important mechanism in
tumorigenesis. Previously, in a case of atypical meningioma
and a case of multiple meningiomas, we identified segmental
UPD in regions 1p31.1, 6q14.1, 10q21.1, and 14q23.3
(21,22). In this study, copy neutral LOH that suggests UPD
was enriched in three of these chromosomal regions in
comparison with that of the genome wide average. This was
observed for tissue samples from benign and atypical
meningiomas and matched germline DNA (blood). The
enrichment of LOH was higher in samples of meningioma
WHO grade II compared with WHO grade I (Table 4). This
enrichment appeared to be due to a higher number of LOH
blocks as well as higher minimum and median LOH block
sizes. With our previous findings (21,22) and additional
evidence for constitutional copy neutral LOH on 14q in
meningiomas (24), this enrichment corroborates the notion
that constitutional segmental UPD in these regions may play
a still unknown role in meningioma development. Evidence for
the involvement of constitutional segmental UPD also exists
for other tumor entities such as breast, prostate, and head and
neck carcinomas (32). In paired analyses of tumor tissue and
blood from the same patient, we identified somatic segmental
UPD regions 4p16.1, 7q31.2, 8p23.2, and 9p22.1 as newly
described events in primary meningioma cells. It remains
unclear whether these regions play a mechanistic role in
meningioma.
Possible consequences of segmental UPD are inactivation of tumor suppressor genes or activation of oncogenes by
various genetic and epigenetic mechanisms (20). In our data,
the flanking of some UPD regions by regions of chromosomal loss or gain suggests that repair mechanisms provide
a likely basis for segmental UPD in meningiomas (data not
shown). Further investigations are necessary to elucidate the
role of segmental UPD in meningiomas.
In this study, SNP array analysis detected previously
described aberrations. In addition, we detected novel chromosomal imbalances, such as losses of 2p and 7p/q in
benign meningiomas, gain of 19p13.12-p12 in an atypical
meningioma, and one loss and two gains within chromosome
22 occurring in blood and tumor tissue simultaneously.
Loss of 22q is described as a common event in meningioma in general (12). Therefore, at first sight, it may appear
conspicuous that we detected loss of 22q in only two cases of
WHO grade II meningiomas, described as chordoid and
atypical, respectively. However, statistically, the observed
20% of cases with loss of 22q do not fall outside of what would
be expected for the given number of samples. The presence
of large deletions of 22q correlates with histopathological
subtypes of meningiomas: Hansson et al (12) found losses of
22q in only 39% of menigothelial meningiomas compared with
65% and 86% in transitional and fibroblastic subtypes,
respectively. In WHO grade I classification, four of five of our
meningiomas were of the meningothelial subtype. WHO
grade II meningiomas without losses of 22q showed meningothelial differentiation in two of three of our cases. This may
further explain the relatively low number of observations of the
loss of 22q.
On chromosome 22, NF2 is discussed as the major target
in meningioma (11). Mutational analysis of NF2 exons
548
revealed mutations in 4 of 10 cases; 1 in WHO grade I and 3
in WHO grade II (Table 1). This finding is in line with mutation
frequencies of 30e60% in sporadic meningiomas found in
the literature (14). Only one of the detected mutations
showed evidence for potential functional impairment of NF2
in the form of a premature stop codon. Interestingly,
a correlation of absence of NF2 mutations with meningothelial subtype was described by Hannsson et al (12) and
Evans et al (33). None of our meningothelial meningiomas
harbored NF2 mutations. This may corroborate the notion
that in the meningothelial subtype, tumor mechanisms other
than those involving NF2 may be of relevance.
Using GTG-banding and SKY, we detected a novel
balanced reciprocal translocation t(4;10)(q12;q26) [4/40
metaphase cells] in a benign meningioma (Figure 1A). This
may be of mechanistic relevance because balanced translocations are discussed as possible initiation events in various
tumor entities (34). The translocation t(4;10)(q12;p11), similar
to the t(4;10)(q12;q26) detected by us, was described in
a case of myeloproliferative syndrome with hypereosinophilia
as a new cytogenetic variant (35). Generally, balanced
translocations may result in the formation of gene fusion
products with altered biological function. Cancer genes
located within the identified breakpoint regions are REST,
RASL11B, PDGFRA (4q12) and ADAM12, BNIP3, DMBT1,
FGFR2 (10q26) (25,36). Some of these cancer genes have
been described specifically for brain tumors. For instance,
Schrock et al (37) implicated the REST locus as an amplification site identified in glioma mapped to chromosome 4q12.
Recently, we detected a novel paracentric inversion within
chromosomal band 1p36 in a case of multiple meningiomas
(22). This chromosomal aberration was seen only in the
grade II lesion. This led to the question of whether a paracentric inversion within chromosomal region 1p36 might
represent a molecular step in the transition from WHO grade
I to WHO grade II meningiomas. In the present group
of meningiomas, we found this paracentric inversion as
a recurrent chromosomal aberration in seven independent
patients with meningiomas of WHO grade I or II. Therefore, it
may more likely represent an early chromosomal event in
the tumorigenesis of meningiomas. In the chromosomal
region of the paracentric inversion, the Atlas of Genetics and
Cytogenetics in Oncology and Haematology (36) lists 17
entries: MDS2, PAX7, TNFRSF14, ARID1A, PRDM16,
RPL22, SDHB, MIB2, CAMTA1, ERFI1, ENO1, MTHFR,
PRDM2, CASP9, TP73, EPB41, and ALPL. Five of these
genes are described in meningiomas: ENO1, MTHFR, TP73,
EPB41, ALPL (14,38). Of these, TP73, EPB41, and ALPL
are discussed as meningioma candidate genes (14). The
EPB41 protein, which links cell membrane proteins to the
cytoskeleton, showed decreased expression (0e80%) in
€ller et al (40) described a decrease in
meningiomas (39). Mu
expression of ALPL (alkaline phosphatase) of 14% in
meningiomas (WHO grade I), 46% in meningiomas (WHO
grade II), and 29% in meningiomas (WHO grade III). Further
research is needed to clarify the exact role of these cancer
genes in meningiomas.
Taken together, advances in acquiring SNP array data on
an increasing number of tumors and matched germline DNA
will help to further elucidate the role of UPD in cancer.
Further investigations are necessary for better understanding
of the genetics of meningiomas.
H. Holland et al.
Acknowledgments
The authors thank Rainer Baran-Schmidt and Karen Freyberg
for excellent technical assistance, James Downs for reading
the manuscript, and Stephane Goutagny for the NF2
sequencing protocols and primer sequences.
This project was supported by the German Federal
Ministry for Education and Research by grants no. PtJ-Bio
0315883 to H.H. and H.K. and research grant no. 01KN0702
to P.A., and by grant no. 927000-040 from the Faculty of
Medicine, University of Leipzig, to K.M.
H.K., M.S., and P.A. were supported by the Leipzig
€t
Research Center for Civilization Diseases (LIFE, Universita
Leipzig). LIFE is funded by means of the European Union, by
the European Regional Development Fund (ERFD), the
European Social Fund and by means of the Free State of
Saxony within the framework of the excellence initiative.
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Zusammenfassung und Ausblick
3. Zusammenfassung und Ausblick
Mit Hilfe der Kombination klassischer zytogenetischer Methoden (GTG-Bänderung, SKYTechnik und FISH-Analyse) und der neueren molekulargenetischen Technik des SNPArray wurde zunächst ein multipel aufgetretenes Meningeom mit zwei Tumoren
unterschiedlicher Malignität (1 WHO Grad 1;1 WHO Grad 2) detailliert charakterisiert und
vergleichend analysiert. Anschließend wurden die Ergebnisse an einer Gruppe von 10
Meningeomen (5 WHO Grad 1; 5 WHO Grad 2) bewertet und hierbei weiterführende
Informationen gewonnen.
Die kombinierte Anwendung von GTG-Bänderung, SKY-Technik und FISH-Analyse konnte
das Auftreten der Monosomie 22 als häufigste numerische Aberration in Meningeomen
bestätigen. Im multiplen Meningeom stellte sich Monosomie 22 in 14% aller untersuchten
Zellen des WHO Grad 1 Tumor und in 34% der Zellen des WHO Grad 2 Tumor dar.
Innerhalb der strukturellen Aberrationen ließen sich mit Hilfe der verwendeten
zytogenetischen Methoden die Deletion 22q und Deletion 1p als die häufigsten
chromosomalen Aberrationen detektieren. Beide Ergebnisse stehen im Konsens zur
bisherigen Literatur (12,40).
Allerdings fiel auf, dass die Frequenz der Deletion 22q in der Gruppe der 10 untersuchten
Tumore relativ gering ausfiel, was sich im SNP-Array bestätigte (in 2 von 10 Tumoren
del22q). In einer weiterführenden Sequenzanalyse untersuchten wir deshalb die Tumore
auf eine Mutation des NF2-Gens als potentiell inaktiviertes Tumorsuppressorgen auf dem
Chromosom 22 (22q12.2). Es ergaben sich 5 detektierbare Mutationen in 4 Tumoren (1
WHO Grad 1 und 3 WHO Grad 2 Tumore). Eine genauere Betrachtung zeigte, dass die
nicht von Deletion 22q oder Mutation NF2 betroffenen Tumore 4 Meningeome WHO Grad
29
Zusammenfassung und Ausblick
1 des Subtyps meningothelial und ein WHO Grad 2 Meningeom mit ebenfalls
meningothelialem Differenzierungsmuster darstellten. Hansson et al. (29) detektierte eine
NF2 Inaktivierung in nur 18% der meningothelialen Meningeome, verglichen mit 52% NF2
Inaktivierung in fibroblastischen Meningeomen. Die Korrelation eines intakten NF2 mit
dem
meningothelialen
Subtyp
formulierte
auch
schon
Evans
et
al.
(21).
Zusammengenommen liefert dies einen Hinweis auf einen möglichen anderen
Tumorgenesemechanismus im meningothelialen Meningeom als die bisher meistens
angenommene Inaktivierung des NF2 Tumorsuppressorgens.
Deletionen auf dem kurzen Arm von Chromosom 1, insbesondere 1p36, gelten als die
häufigste Aberration im Zusammenhang mit der Tumorprogression. Die Detektion mit
GTG-Bänderung, SKY-Technik und der lokusspezifischen FISH-Sonde LSI P58/LSI
Telomere 1p ergab in WHO Grad 2 Tumoren eine höhere Frequenz von Deletionen auf 1p
als in den benignen Tumoren, was der vermuteten Korrelation mit der Tumorprogression
entspricht.
In diesem Zusammenhang konnten wir zusätzlich eine noch nicht beschriebene
parazentrische Inversion im chromosomalen Bereich 1p36 in 3 von 16 Metaphasen im
atypischen
multiplen
Meningeom
nachweisen
und
vermuteten
einen
möglichen
Transitionsschritt vom Grad 1 zum Grad 2 Tumor. Im Zusammenhang mit dem 1p36
Mikrodeletionssyndrom halten Gajecka et al. (25) das Vorliegen einer konstitutionellen
parazentrischen
Inversion
1p36
als
einen
chromosomaler
Reorganisationsprozesse
mit
Zwischenschritt
innerhalb
vorangegangenen
und
komplexer
folgenden
interstitiellen Deletionen für wahrscheinlich. Dies gab uns einen Hinweis auf eine mögliche
funktionelle Relevanz der parazentrischen Inversion im chromosomalen Bereich 1p36 als
Vorstufe zur Deletion 1p36.
In der Untersuchung unserer zweiten Meningeomgruppe konnten wir die parazentrische
Inversion im chromosomalen Bereich 1p36 in 7 Meningeomen, davon in 4/5 benignen und
30
Zusammenfassung und Ausblick
in 3/5 malignen, erneut detektieren. Dies spricht eher für die Beurteilung der
parazentrischen Inversion 1p36 als ein früheres Ereignis in der Meningeomformation. In
weiterführenden Studien sollte die Beteiligung von möglichen tumorinitiierenden Genen,
wie TP73 (tumor protein p73), EPB41 (erythrocyte membrane protein band 4.1) und ALPL
(alkaline phosphatase, liver/bone/kidney) in der betroffenen chromosomalen Region weiter
untersucht werden.
Die zytogenetische Analyse des multiplen Meningeoms ermöglichte die erstmalige
Beschreibung eines dizentrischen Chromosomes 4 im benignen Tumor mit 7,5% der
untersuchten Zellen und im atypischen Tumor mit 10%. Dass dizentrische Chromosomen
im Rahmen einer chromosomalen Instabilität durch Telomerfusion entstehen und zu
Deletionen und unbalancierten Translokationen führen können, beschrieb Sawyer et al.
(58) schon für das Chromosom 1 in Meningeomen. Um die Bedeutung dieses Fundes
beurteilen zu können, sind weitere Untersuchungen notwendig.
Eine bisher nicht beschriebene reziproke Translokation t(4;10)(q12;q26) konnten in 4/40
Metaphasen eines benignen Meningeoms identifiziert werden. Im SNP-Array zeigten sich
keine chromosomalen Imbalancen in den Bruchpunktregionen, was auf eine balancierte
Translokation hinweist. Die mögliche Konsequenz einer Genfusion als tumorinitiierendes
Ereignis wird bei einer Reihe von Tumorentitäten vermutet (47). Eine fast identische
Translokation fand sich schon im Rahmen eines Myeloproliferativen Syndroms mit
Hypereosinophilie als neue zytogenetische Variante (34). Unter den Genen in den
Bruchpunktregionen, die als möglicherweise mit Malignomen assoziiert gelten, wurde
beispielsweise der REST Locus (4q12) als amplifiziert in Gliomen beschrieben (1,59).
Ein Vorteil der Zytogenetik zeigt sich in der Identifizierbarkeit von chromosomalen
Aberrationen, die nur in einem Teil der Tumorzellen klonal vorliegen. Die Betrachtung des
Chromosomensatzes auf Einzelzellbasis ist zwar sehr aufwendig, erbringt jedoch wichtige
Hinweise auf potentiell tumorrelevante genetische Ereignisse.
31
Zusammenfassung und Ausblick
Die molekulargenetische Technik des SNP-Array ermöglicht es, zytogenetische
Ergebnisse wie Deletionen zu bestätigen oder, wie im Fall der Translokation, weitere
Hinweise auf chromosomale Imbalanzen zu erlangen. Das hohe Auflösungsvermögen
erlaubt die Analyse sehr kleiner Bereiche, bei der wir 3 noch nicht bekannte Deletionen in
benignen Meningeomen und 1 neuen Locus mit Zugewinn genetischen Materials („Gain“)
im atypischen Meningeom identifizierten. Weiterhin konnten wir durch die simultane
Analyse von Blut- und Tumor-DNA der Patienten konstitutionelle Aberrationen, wie 2
Gains und 1 Deletion im Bereich 22q, detektieren. Interessanterweise wurden diese
Aberrationen für Patienten mit Mikrodeletions/ Duplikationssyndrom 22q11 (assoziiert mit
DiGeorge/ velo-cardio-faziales Syndrom) beschrieben. Bedingt durch die unvollständige
Penetranz zeigt sich eine klinische Ausprägung des Syndromkomplexes von vollständiger
Asymptomatik bis hin zu schweren Entwicklungsstörungen mit Dysmorphien (16,19,24).
Dabei ist ein gehäuftes Auftreten von Tumoren wie das B-Zell-Lymphom, Hepatoblastom
und
Neuroblastom
(Xanthoastrozytom)
bekannt.
im
Kürzlich
Rahmen
wurde
des
erstmals
DiGeorge/
auch
ein
ZNS
velo-cardio-faziales
Tumor
Syndroms
beschrieben (18,50). Obwohl keiner unserer Patienten klinischen Anlass zu einer
genetischen Untersuchung hinsichtlich ererbter Krankheiten gab, fiel bei einem
Meningeompatienten
mit
konstitutioneller
Mikroduplikation
22q11
eine
schwere
Intelligenzminderung als Nebendiagnose auf. Aufgrund des Todes des Patienten im
Februar 2009 war eine weiterführende humangenetische Analyse jedoch nicht möglich.
Ob
das
Vorliegen
einer
tumorprädisponierender
Mikroduplikation
Auswirkung
ist,
22q11
oder
ein
Syndrom
vielleicht
nur
mit
einen
eventuell
benignen
Polymorphismus darstellt, ist noch nicht abschließend geklärt (16).
Ein Schwerpunkt im Rahmen der Anwendung des SNP-Arrays zur Analyse von
Meningeomen unterschiedlicher histologischer Grade lag auf der Identifizierung
potentieller rekurrenter segmentaler UPD-Regionen. Unsere Arbeitsgruppe konnte schon
32
Zusammenfassung und Ausblick
bei der Charakterisierung eines atypischen Meningeoms mit 100K-SNP-Array auffällige
Regionen mit Hinweis auf eine segmentale Uniparentale Disomie beschreiben (38).
Auffälligkeiten in vier dieser Regionen (1p31.1, 6q14.1, 10q21.1 und 14q 23.3) konnten im
Fall des multiplen Meningioms in Blut- und Tumor-DNA erneut detektiert werden und
könnten einen Hinweis auf mögliche Auswirkungen kleiner, konstitutioneller UPDRegionen auf die Tumorgenese darstellen.
Mit der Anwendung der 6.0 SNP-Array Analyse standen uns bei der aus 10 Meningeomen
bestehenden Gruppe eine verbesserte Auflösung durch eine deutlich höhere Markerdichte
(circa 900,000 Marker, verglichen mit 100,000 beim 100K Array) und verbesserte
Auswertungsmöglichkeiten der Software (Genotyping Console 4.0 und Partek Genomics
Suite 6.5) zur Verfügung. Wir identifizierten kopienneutrale Regionen mit Verlust von
Heterozygotie über das gesamte Genom hinweg, die sowohl im Blut als auch im Tumor
der Patienten auftraten. Diese Betrachtung von Blut und Tumor eines Patienten entspricht
einer ungepaarten Analyse von kopienneutralen LOH-Regionen. Zur Prüfung der
Ergebnisse unserer vorherigen Untersuchungen führten wir eine Anreicherungsanalyse
durch: Es zeigte sich ein signifikant höherer prozentualer Anteil kopienneutraler Verluste
von Heterozygotie (LOH) in drei der vier rekurrenten Regionen im Vergleich zur Häufigkeit
von LOH im gesamten Genom in Blut- und Tumor-DNA der Patienten. Dabei fiel ebenfalls
ein weiterer Anstieg von kopienneutralen LOH in den ausgewählten Regionen in WHO
Grad 2 Tumoren verglichen mit WHO Grad 1 Tumoren auf, während über das gesamte
Genom hinweg die Frequenzen der kopienneutralen LOH-Regionen vergleichbar waren.
Der Verdacht einer bisher nicht vollständig bekannten Rolle konstitutioneller segmentaler
UPD Regionen in der Tumorgenese wird durch die Beschreibung vermehrter
konstitutioneller Homozygotie für andere solide Tumorentitäten gestützt (2,4). Auch
Makishima et al. (44) vermuten eine mögliche Prädisposition für Neoplasien durch
konstitutionelle UPD-Regionen.
33
Zusammenfassung und Ausblick
Im Unterschied zur ungepaarten Analyse zeigt die gepaarte Analyse nur Unterschiede in
der Tumor-DNA verglichen mit der DNA aus dem Blut des jeweiligen Patienten. Dies
ermöglichte die Beschreibung potenzieller somatischer segmentaler UPD für Meningeome
in den chromosomalen Regionen 4p16.1, 7q31.2, 8p23.2 und 9p22.1. Die Klärung der
Funktion der segmentalen UPD hinsichtlich ihrer Rolle bei Tumorgenese und –progression
bleibt eine Herausforderung für die Zukunft und könnte unser Verständnis der
zugrundeliegenden Mechanismen wesentlich erweitern.
Die vorliegende Arbeit konnte wesentliche Vorteile der Kombination klassischer
zytogenetischer Methoden mit dem molekulargenetischen Ansatz des hochauflösenden
SNP-Array aufzeigen. Diese vergleichenden Analysen ermöglichten eine detailreiche
Beschreibung der untersuchten Meningeome und konnten für diese Tumorentität noch
nicht beschriebene chromosomale Veränderungen aufzeigen.
Für weiterführende Analysen hinsichtlich der Bedeutung von rekurrenten segmentalen
Regionen
Uniparentaler
zusammengestellt
und
Disomie
der
wird
derzeit
Schwerpunkt
um
eine
größere
Meningeomgruppe
molekulargenetische
Daten
zur
Genexpressionsanalyse erweitert. Zyto- und molekulargenetische Untersuchungen in
weiteren Tumorentitäten, wie Medulloblastomen und Astrozytomen, liefern Informationen
zu tumorspezifischen wie auch tumorübergreifenden Aberrationen und sollen die Rolle der
Uniparentalen Disomie weiter aufklären. Zusätzlich erfolgt in Kooperation mit der
Universität Heidelberg die Analyse TRAIL-induzierter Apoptose in einer größeren Gruppe
von
Meningeomen,
um
weiterführende
Informationen
zu
potenziellen
neuen
Therapieoptionen für diese Tumore zu erhalten.
Perspektivisch könnten sich durch vergleichende Untersuchungen zur Tumorgenese und –
progression neue Ansatzpunkte für verbesserte therapeutische Strategien und adjuvante
Therapiemöglichkeiten mit Einfluss auf das Rezidivverhalten der Meningeome ergeben.
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39
Anlagen
5. Anlagen
40
Anlagen
5.2 Spezifizierung des eigenen Anteils an der Arbeit
Veröffentlichung 1 „Multiple meningioma with different grades of malignancy: Case
report with genetic analysis applying single-nucleotide polymorphism array and
classical cytogenetics“
Bei der Untersuchung des multiplen Meningeoms lernte ich zunächst alle Arbeitsschritte
und Präparationstechniken zur zytogenetischen Analyse eines Tumors kennen. Ich
erlernte die Metaphasepräparation, GTG-Bänderungstechnik und FISH-Technik laut den
Standardprotokollen und führte alle Präparationsschritte nach kurzer Zeit selbstständig
durch. Die Analyse und Auswertung der Ergebnisse verlangt viel Erfahrung, so dass ich
hier zunächst unter Aufsicht arbeitete.
In den Umgang mit der Auswertung der SNP-Array Daten wurde ich eingewiesen.
Nach einer umfassenden Recherche über Meningeome im Allgemeinen und multiple
Meningeome im Speziellen konnte ich die Einleitung für die Veröffentlichung schreiben
und beschäftigte mich anschließend intensiv mit dem Material- und Methodenteil. Im
Besonderen fasste ich die klinischen Patientendaten und die Patientenhistorie in
Kooperation mit dem betreuenden Neurochirurgen zusammen.
Die Zusammenstellung der Ergebnisse erfolgte gemeinsam mit den Mitgliedern der
Arbeitsgruppe und innerhalb der Diskussion beschäftigte ich mich vor allem mit den de
novo Befunden der parazentrischen Inversion 1p36 und den segmentalen UPD Regionen.
Ich erlernte den Umgang mit Referenzen und konnte diese selbstständig verwalten und
einbauen, anschließend führte ich den Einreichungsprozess unter Anleitung durch.
Veröffentlichung 2 „High resolution genomic profiling and classical cytogenetics in
a group of benign and atypical meningiomas“
In den Arbeiten zur Meningeomgruppe bestehend aus 10 Tumoren stand zunächst die
Kultur der Tumorzellen im Vordergrund. Ich begleitete die Anzucht und deren tägliche
Kontrolle,
sowie
den
Mediumswechsel
und
die
Umsetzung
der
Kulturen.
Die
anschließenden Präparationen konnte ich selbstständig durchführen. Neu erlernte ich die
SKY-Technik als weitere Möglichkeit, mittels fluoreszenzmarkierter Sonden Chromosomen
42
Anlagen
auf Einzelzellbasis zu analysieren. Die Auswertung der zytogenetischen Untersuchungen
führte ich selbstständig aus, es erfolgte eine Überprüfung sowie die genaue
Bruchpunktanalyse der Befunde durch meine Mitbetreuerin.
Weiterhin asservierte ich in Zusammenarbeit mit der Neurochirurgie die Blutproben der
Patienten. Für die Untersuchung mittels SNP-Array extrahierte ich aus allen Blut- und
Tumorproben die DNA und bereitete sie für den Versand vor. Die gewonnenen Daten des
SNP-Arrays analysierte ich mit der GTYPE 4.0 Software und stellte gemeinsam mit
Mitgliedern der Arbeitsgruppe die Ergebnisse zusammen, um diese dann zu diskutieren.
Für die Veröffentlichung schrieb ich die Einleitung und stellte in Kooperation mit dem
betreuenden Neurochirurgen die Patientendaten zusammen. In der Zusammenstellung der
zytogenetischen Resultate arbeitete ich mit meiner Mitbetreuerin gemeinsam am
Ergebnisteil und konzentrierte mich bei der Diskussion vor allem auf die konstitutionellen
Aberrationen (Chromosom 22) sowie die molekulargenetischen Ergebnisse (segmentale
UPD Regionen). Ich formatierte den Text und die Referenzen selbstständig und reichte die
Veröffentlichung ein.
43
Anlagen
44
Anlagen 5.3 Lebenslauf
Name:
Kristin Mocker
Anschrift im
Heimatort:
Schneewittchenweg 6
01936 Königsbrück
Anschrift im
Studienort:
Reichpietschstraße 3
04317 Leipzig
Telefon:
0177/7779131
E-mail:
[email protected]
Geburtsdatum:
25.01.1988
Geburtsort:
Räckelwitz
Eltern:
Stefan Mocker, Diplom-Ingenieur
Grit Mocker, geborene Knothe, Diplom-Ingenieurin
Bildung:
1994-1998:
Juri-Gagarin Grundschule,
Königsbrück
1998-2006:
Gotthold-EphraimLessinggymnasium, Kamenz
Seit Oktober 2006:
Medizinstudium Universität Leipzig
Oktober 2009- März 2010:
Urlaubssemester im Rahmen einer
experimentellen Doktorarbeit
(Promotionsstipendium)
Abschlüsse:
Abitur im Juni 2006 (1,3)
Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung im August 2008 (1,5)
45
Anlagen Praktika:
Sonstiges:
01.-29. September 2006 und
26. Februar-28. März 2007
Krankenpflegedienst im Malteser
Krankenhaus St. Johannes in
Kamenz
20. August- 21. September
2007
Krankenpflegedienst
Universitätsklinikum Leipzig
23. Februar- 30. März 2009
Famulatur Universitätsklinikum
Leipzig, Klinik und Poliklinik für
Neurochirurgie
20. Juli- 20. August 2009
Famulatur bei Allgemeinmediziner
Dr. Engelstädter in Königsbrück
19. Juli-18. August 2010
Famulatur Innere Medizin
Gebhardt Wieland in Altenburg
07. Februar-21. Februar 2011
und 14. März-28. März 2011
Famulatur Universitätsklinikum
Leipzig, Universitätsfrauenklinik
Seit Februar 2009
Stipendiatin der Studienstiftung
des deutschen Volkes
Leipzig, den 08.02.2012
Kristin Mocker
46
Anlagen
5.4 Wissenschaftliche Tätigkeit
Veröffentlichungen
V-I
Mocker K*, Holland H*, Ahnert A, Schober R, Bauer M, Kirsten H, Koschny R,
Meixensberger J, Krupp W (2011):
Multiple meningioma with different grades of malignancy: case report with
genetic analysis applying single-nucleotide polymorphism array and classical
cytogenetics
Path Res Prac 207: 67-72 (IF:1,219)
* Geteilte Erstautorenschaft
V-II
Holland H*, Mocker K*, Ahnert P, Koschny R, Bauer M, Schober R, Kirsten H,
Meixensberger J, Krupp W (2011):
High- resolution genomic profiling and classical cytogenetics in a group of
benign and atypical meningiomas
Cancer Genet 204: 541-549 (IF:1,537)
* Geteilte Erstautorenschaft
Vorträge
VT-I
Holland H, Mocker K, Ahnert P, Schober R, Bauer M, Kirsten H, Koschny R,
Meixensberger J, Krupp W (2010)
Multiples Meningeom, WHO Grad I+II: Fallbericht mittels SNP-A
Karyotypisierung und klassischer Zytogenetik
23. Tumorzytogenetische Arbeitstagung
Bergisch-Gladbach, 15.-17. April 2010
VT-II
Schober R, Holland H, Ahnert P, Kirsten H, Hoffmann K-T, Mocker K, Krupp W
(2010)
Correlation of neuropathological, neuroradiological, cytogenetic and SNP–array
data in a case of multiple meningiomas with different grades of malignancy
Neurowoche
Mannheim, 21.-25. September 2010
VT-III
Schober R, Holland H, Ahnert P, Mocker K, Hoffmann K-T, Krupp W,
Meixensberger J (2011)
Correlation of Morphology, Cytogenetics, and High-Resolution Genomic
Profiling in a Group of Benign and Atypical Meningiomas
Experimental Biology
Washington, 09.-13. April 2011 (USA)
VT-IV
Holland H, Mocker K, Ahnert P, Bauer M, Schober R, Kirsten H, Meixensberger
J, Krupp W (2011)
High- resolution genomic profiling and classical cytogenetics in a group of
benign and atypical meningiomas
24. Tumorzytogenetische Arbeitstagung
Bad Ischl, 16.-18. Juni 2011 (Österreich)
47
Anlagen
Poster
P-I
Mocker K*, Holland H*, Ahnert P, Schober R, Bauer M, Kirsten H, Koschny,
Meixensberger J, Krupp W (2010)
Multiple meningioma with different grades of malignancy: case report with
genetic analysis applying single-nucleotide polymorphism array and classical
cytogenetics
21. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik
Hamburg, 02.- 04. März 2010
* Geteilte Erstautorenschaft
P-II
Mocker K (2010)
Multiple meningioma with different grades of
malignancy: case report with genetic analysis applying
single-nucleotide polymorphism array and classical
cytogenetics
9 th Leipzig Research Festival for Life Sciences 2010
Leipzig, 17. Dezember 2010
P-III
Holland H*, Mocker K*, Ahnert P, Koschny R, Bauer M, Schober R, Kirsten H,
Meixensberger J, Krupp W (2011)
High- resolution genomic profiling and classical cytogenetics in patients with
benign or atypical meningiomas
22. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik
Regensburg, 16.- 18. März 2011
* Geteilte Erstautorenschaft
P-IV
Mocker K*, Holland H*, Ahnert P, Koschny R, Bauer M, Schober R, Scholz M,
Kirsten H, Meixensberger J, Krupp W (2011)
High- resolution genomic profiling and classical cytogenetics in a group of
benign and atypical meningiomas
Brain Tumor 2011 – Symposium
Berlin, 16.-17. Juni 2011
* Geteilte Erstautorenschaft
48
Anlagen
5.5 Danksagung
Mein Dank gilt Herrn Professor Meixensberger für die Überlassung des Themas, sein
stetes Interesse an dieser Thematik, sowie seine Unterstützung beim Verfassen von
Publikationen und der Promotionsschrift.
Herrn PD Dr. Krupp danke ich für die neuroonkologische Beratung und Einführung in
dieses Fachgebiet sowie seine ausgezeichnete Betreuung.
Frau Dr. Holland danke ich für die Einführung in die Zytogenetik und ihre stete
Unterstützung sowohl in wissenschaftlicher, technischer als auch in persönlicher Hinsicht.
Herrn Dr. Kirsten danke ich für seine Unterstützung in allen analytischen und technischen
Fragen, seine große Hilfsbereitschaft und Geduld.
Herrn Dr. Ahnert danke ich sehr für seine freundliche Unterstützung und die kompetente
Einführung in die Thematik der SNP-A Karyotypisierung.
Allen bisher genannten Personen möchte ich für ihre Mitarbeit an den Veröffentlichungen
und den konstruktiven Anregungen zur Bewältigung der Promotionsschrift danken.
Die neuropathologische Klassifikation und die Bereitstellung der histopathologischen
Abbildungen verdanke ich Herrn Prof. Dr. em. Schober und Herrn Dr. Bauer. Ich danke
ihnen für die Erläuterungen zu diesem Fachgebiet.
Frau Hantmann, Frau Freyberg und Herrn Baran-Schmidt danke ich für ihre
ausgezeichnete technische Unterstützung.
Bedanken möchte ich mich bei Frau Burkhardt, Herrn Wilke und Frau Quente für ständige
Hilfsbereitschaft bei allen aufkommenden Fragen.
Im Besonderen gilt mein Dank der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig, die die
Arbeit mit einem Promotionsstipendium unterstützte.
Desweiteren bedanke ich mich bei meinen Großeltern, Eltern und Geschwistern sowie vor
allem bei Robert für die andauernde Unterstützung, das Vertrauen und die Geduld.
49