Zytogenetische und molekularbiologische Untersuchungen an intrakraniellen Meningeomen unter Anwendung der GTG-Bänderung, SKY-Technik, FISH-Analyse und genomweiter SNP-A Karyotypisierung Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von: Kristin Mocker geboren am: 25.01.1988 in Räckelwitz angefertigt an: Universität Leipzig Klinik und Poliklinik für Neurochirurgie Betreuer: Prof. Dr. med. Jürgen Meixensberger PD. Dr. med. Wolfgang Krupp Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 16.07.2013 Bibliographische Beschreibung Mocker, Kristin Zytogenetische und molekularbiologische Untersuchungen an intrakraniellen Meningeomen unter Anwendung der GTG-Bänderung, SKY-Technik, FISH-Analyse und genomweiter SNP-A Karyotypisierung Universität Leipzig, kumulative Dissertation 49 S., 66 Lit., 2 Abb., 5 Anlagen Referat: Meningeome sind Tumore der Hirnhäute und stellen zirka 24-30% aller intrakraniellen Tumore dar. Obwohl sie in den meisten Fällen als solitär, langsam wachsend und benigne (WHO Grad 1) beschrieben werden, ist ihr ausgeprägtes Rezidivverhalten die größte Herausforderung in der Therapie. Bisherige Arbeiten verwendeten zur genetischen Analyse von Meningeomen meist Untersuchungstechniken mit eingeschränkter (molekular-)zytogenetischer Aussagekraft. Mit der Kombination der Methoden GiemsaBandendarstellung Fluoreszenz in (GTG-Bänderung), situ Spektrale Hybridisierungstechniken Karyotypisierung (FISH-Analyse) (SKY-Technik), und molekulare Karyotypisierung unter Verwendung von 100K beziehungsweise 6.0 SNP-Arrays (SNP-A Karyotypisierung) sollte es möglich sein, in effizienterer Form bislang unentdeckte chromosomale Aberrationen zu identifizieren und weiterführende tumormechanistische Hinweise zu erhalten. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein multipel aufgetretenes Meningeom mit zwei Tumoren unterschiedlicher Malignität (1 WHO Grad 1; 1 WHO Grad 2) analysiert, anschließend erfolgte die Untersuchung einer Gruppe von 10 Meningeomen (5 WHO Grad 1; 5 WHO Grad 2). Bisher nicht beschriebene Aberrationen wie ein dizentrisches Chromosomen 4, die parazentrische Inversion im chromosomalen Bereich 1p36 und die balancierte reziproke Translokation t(4;10)(q12;q26) wurden detektiert. Die genomweite SNP-A Karyotypisierung ermöglichte neben der genaueren Betrachtung der zytogenetischen Ergebnisse die simultane Analyse von Blut und TumorDNA der Patienten und lieferte Hinweise auf konstitutionelle Aberrationen. Es zeigte sich eine signifikante Anreicherung von rekurrenten Regionen kopienneutraler Verluste der Heterozygotie als Hinweis auf das Vorliegen potenzieller segmentaler Uniparentaler Disomie (UPD) jeweils in Blut und Tumor der Patienten. Außerdem wurden nur im Tumor befindliche potentielle rekurrente segmentale UPD Regionen detektiert. Die weitere Analyse der konstitutionellen sowie somatischen segmentalen UPD hinsichtlich ihrer Rolle im Rahmen der Tumorgenese ist eine wichtige Aufgabe für die Zukunft. Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Seite 1. Einleitung und Problemstellung 1 2. Veröffentlichungen 12 2.1 Veröffentlichung 1 12 „Multiple meningioma with different grades of malignancy: Case report with genetic analysis applying single-nucleotide polymorphism array and classical cytogenetics“ 2.2 Veröffentlichung 2 „High resolution genomic profiling and classical cytogenetics in a group of benign and atypical meningiomas“ 19 3. Zusammenfassung und Ausblick 29 4. Referenzen 35 5. Anlagen 40 5.1 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 41 5.2 Spezifizierung des eigenen Anteils 42 5.3 Lebenslauf 45 5.4 Wissenschaftliche Tätigkeit 47 5.5 Danksagung 49 Einleitung und Problemstellung „Diese Urzelle des Tumors, wie ich sie im folgenden nennen will, ist nach meiner Hypothese eine Zelle, die infolge eines abnormen Vorgangs einen bestimmten, unrichtig kombinierten Chromosomenbestand besitzt.“ Theodor Boveri, 1914 1. Einleitung und Problemstellung Die Hypothese der Tumorgenese infolge von Störungen genetischer Informationen einer Zelle formulierte Theodor Boveri schon Anfang des zwanzigsten Jahrhunderts und begründete damit das Konzept von Krebs als eine genetische Erkrankung aufgrund somatischer Mutationen (10). Hierbei gehen viele Studien von mehrstufigen Prozessen aus, in denen häufig die Aktivierung von Onkogenen und die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen bedeutend sind. Diese Gene sind als negative oder positive Regulatoren der Zellproliferation, Gewebedifferenzierung und Apoptose Teil des komplexen Netzwerks intrazellulärer Kommunikation. Sie kodieren unter anderem Hormone, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, Zelladhäsionsmoleküle, intrazytoplasmatische Signalmediatoren und intranukleäre Regulatoren von Transkription und Zellzyklus (8,33). Während bei Onkogenen durch deren genetische Dominanz bereits die Veränderung einer Genkopie biologisch relevante Folgen zeigt, ist bei den rezessiven Tumorsuppressorgenen eine Veränderung der Proteinprodukte beider Allele notwendig. Bekannte Aberrationsmechanismen von potenziellen Onkogenen und Tumorsuppressorgenen, die zur Tumorentstehung führen können, sind in Abbildung 1 dargestellt und sollen im Folgenden beispielhaft erläutert werden. 1 Einleitung und Problemstellung Abbildung 1: Überblick über bekannte Aberrationsmechanismen von potenziellen Onkogenen und Tumorsuppressorgenen, die zur Tumorentstehung führen können Quelle: eigene Darstellung, modifiziert nach (8) Eine Punktmutation ist die häufigste Ursache für eine pathologische Aktivierung des RASOnkogens, welches als anhaltendes Proliferationssignal wirkend in zahlreichen Neoplasien detektiert wurde (9). Eine weitere Störung im Rahmen der Onkogenaktivierung ist die Genfusion. Für Tumore des zentralen Nervensystems wurde das Genfusionsprodukt FIG-ROS bei dem Astrozytom beschrieben (13). Translokationen mit Austausch von Regulatorsequenzen können ebenfalls zur Onkogenaktivierung führen: Ähnlich historisch wie das Philadelphia Chromosom als ein Beispiel für Genfusion durch Translokation, lässt sich hier das Beispiel der Translokation t(8;14) bei Burkitt-Lymphomen einordnen (52,60). Solche balancierten Translokationen, die den Austausch von Chromosomenteilen ohne Verluste oder Zugewinne genetischen 2 Einleitung und Problemstellung Materials darstellen, werden als ein kausaler Faktor in der Entstehung verschiedener Tumorentitäten vermutet (47). Genamplifikation resultiert in den meisten Fällen in einer übermäßigen Expression des potenziellen Onkogens und ist mit Tumorprogression assoziiert (11). Im Falle des Neuroblastoms beispielsweise ist die Analyse der N-Myc Amplifikation bereits Teil einer Risiko-Stratifizierung, die die Therapieentscheidung beeinflusst und im Allgemeinem mit einer schlechteren Prognose einhergeht (45). Die „Inaktivierung“ von Tumorsuppressorgenen ist beispielsweise durch Punktmutationen oder gesteigerten Abbau möglich, wie für p53 beschrieben wurde (15,53). Der tumorspezifische Funktionsverlust eines Tumorsuppressorgens durch Deletion wurde zuerst bei Meningeomen nachgewiesen: Zytogenetische Untersuchungen zeigten den gehäuften Verlust von Chromosom 22q, was molekulargenetisch mit der Inaktivierung des Tumorsuppressorgens NF2 assoziiert werden konnte (57). Der Begriff Haploinsuffizienz bezeichnet die kritische Absenkung der Expressionsrate eines Tumorsuppressorgens nach Mutation oder Deletion einer Genkopie. Dies ist für das Tumorsuppressorgen PTEN als Gegenspieler verschiedener Proteinkinasen in vielen sporadischen Tumoren beschrieben und scheint paradoxerweise kanzerogener zu wirken als der komplette Verlust beider Kopien (6). Fehlregulationen der Epigenetik, also jener spezifischen Modifikationen, die die Aktivierung oder Blockade der Transkription und damit des genetischen Informationsflusses einer Zelle bedingen, können ebenfalls grundlegende Bedeutung für die Kanzerogenese haben. Der DNA-Methylierungsstatus von CpG-Inseln in Promotorbereichen von Genen kann bei Hypomethylierung zur Onkogenaktivierung und bei Hypermethylierung zur Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen führen. Prozesse, 3 Einleitung und Problemstellung wie DNA-Hypomethylierungen oder Histonmodifikationen treten häufig auch global im gesamten Genom von Tumoren auf und bedingen zum Beispiel chromosomale Instabilität beim Kolonkarzinom (46). An dieser Stelle sei auf die mögliche Rolle der „segmentalen Uniparentalen Disomie (UPD)“ bei der Tumorgenese hingewiesen. UPD bezeichnet das Vorliegen von Chromosomen(teilen), die beide entweder von der Mutter oder von dem Vater stammen. Normale Wildtypallele gehen verloren und aus Heterozygotie entsteht Homozygotie. Dies kann zu Veränderungen der Genexpression führen, obwohl die Gendosis unverändert ist. Zuerst wurde die UPD im Zusammenhang mit einem Meiosefehler als konstitutionelle Variante beschrieben (20). Folgen können Imprinting-Störungen oder Homozygotie für eine rezessive Mutation sein (64). Imprinting bezeichnet einen epigentisch determinierten und vererbbaren „Aktivitätsstatus“ von Genen. Im Rahmen der Mitose kann eine UPD aber auch in somatischen Zellen auftreten und als somatische UPD (segmental oder vollständig) beschrieben werden. Neben den Entstehungsmechanismen durch Fehler bei der chromosomalen Trennung und/oder Rekombination während der Mitose sind auch Genkonversion oder Fehler bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen zu vermuten. Defekte oder Verluste chromosomalen Materials werden dabei durch Duplikation des anderen, nicht betroffenen Allels, ausgeglichen. In jedem Fall sind Mechanismen denkbar, die eine heterozygote somatische Mutation zu einer homozygoten machen und deshalb Tumorsuppressorgene inaktivieren können oder die Dosis eines Onkogenprodukts verdoppeln, was ungünstigerweise mit einem Proliferationsvorteil einhergeht. Eine segmentale UPD 17p wird beispielsweise als eine Ursache für die Inaktivierung von p53 in Glioblastomen vermutet (66). Bei myeloproliferativen Erkrankungen konnte man im Rahmen einer segmentalen UPD 9p eine zusätzliche JAK2-Aktivierung feststellen (42). Eine weitere pathogene Folge einer 4 Einleitung und Problemstellung segmentalen UPD kann die somatische Duplikation von Genkopien sein, die dem Imprinting unterliegen. Es kann also zu einem „Gain of Imprinting“ (GOI) oder „Loss of Imprinting“ (LOI) der betroffenen Gene kommen. Dies führt zu einer veränderten Genexpression, beispielsweise wie es für den „Insulin-like growth factor“ (IGF) 2 durch LOI bei Kolonkarzinomen belegt ist (23). Der durch segmentale UPD resultierende Verlust der Heterozygotie (LOH) kann weiterhin zu homozygoten Allelen für krankheitsrelevante SNPs (single nucleotide polymorphisms) führen. Diese Einzelnukleotid-Polymorphismen sind Variationen einzelner Basenpaare, die per Definition in über 1% der Population vorkommen und deren Relevanz für die Prädisposition zu verschiedenen Krankheiten derzeit intensiv untersucht wird. Homozygotie für methylierte oder deletierte Gene sowie für Genregulationsfaktoren wie microRNA stellen andere mögliche Folgen der segmentalen UPD dar. Trotz einiger als rekurrent beschriebener (segmentaler) UPD Regionen in verschiedenen Tumorentitäten gibt es noch einen großen Forschungsbedarf hinsichtlich ihrer funktionellen Relevanz und potentiellen Bedeutung bei der Tumorentstehung. Weiterhin bleibt zu klären, inwieweit auch kleinere konstitutionelle (segmentale) UPD-Regionen eine Rolle bei der Prädisposition zu spezifischen Tumorentitäten spielen (44,63). Für die bisher unerwähnten Tumorprädispositionssyndrome ist meist die Keimbahnmutation eines potenziellen Onkogenes, Tumorsuppressorgens oder DNAReparaturgens ursächlich. Den Prototyp für die Entwicklung einer erblich bedingten Krebserkrankung lieferte Knudson mit seinem „two-hit“ Modell für erbliche Retinoblastome (35). In seinen weiterführenden Analysen ging er der Frage nach, welche und wie viele Mutationen vorliegen müssen, damit sich aus unverändertem Gewebe ein Tumor entwickelt (36). 5 Einleitung und Problemstellung Eine biologische Herangehensweise kennzeichnen die „Hallmarks of Cancer“ (27) indem sechs erworbene Fähigkeiten einer Tumorzelle definiert wurden: Unabhängigkeit von Wachstumsfaktoren, Resistenz gegenüber wachstumshemmenden Signalen, Apoptosevermeidung, unbegrenzte Proliferation, Angiogeneseinduktion und invasives Wachstum mit Metastasierung. Kürzlich wurden noch zwei weitere sich herausbildende Fähigkeiten von Tumorzellen ergänzt: Veränderung des zellulären Energiemetabolismus und Umgehung der Immunabwehr. Die Kennzeichen genomische Instabilität und Mutation sowie tumorvermittelte Inflammation wurden noch hinzugefügt und sich daraus ergebende potenzielle therapeutische Angriffspunkte zusammengefasst (Abbildung 2). Abbildung 2: Überblick über die erworbenen Eigenschaften einer Tumorzelle und mögliche therapeutische Angriffspunkte Quelle: modifiziert nach (28) 6 Einleitung und Problemstellung Da es sich um komplexe Regulationsmechanismen handelt, ist nicht jeder Teilschritt mit einer speziellen Mutation assoziierbar. Dennoch ging man zunächst von 4 bis 12 nötigen Mutationen zur Tumorentstehung aus, bevor mit neuen Techniken mittlerweile eine Vielzahl von Mutationen je Tumorentität detektiert werden kann (55,26). Mit der sogenannten Adenom-Karzinom-Sequenz als Modell zur Entstehung des Kolonkarzinoms lässt sich dennoch beispielhaft die Bedeutung der Abfolge bestimmter Gendefekte zur Tumorgenese und –progression beschreiben (22). Die genaue Zahl der nötigen Schlüsselereignisse in einer Tumorentität ist aber nur schwer zu determinieren, da Tumore einerseits eine gesteigerte Mutationsrate und andererseits eine hohe genetische Instabilität aufweisen (7,41). Zur Heterogenität des Tumors trägt auch die Beschaffenheit aus unterschiedlichen Zelltypen wie Endothelzellen, Fibroblasten, Perizyten und Immunzellen neben den spezifischen Tumorzellen bei. Relativ neu ist die Annahme, dass diese „Tumor-Mikroumgebung“ („Microenvironment“) durch das Vorhandensein von Tumorstammzellen beziehungsweise tumorstammzellähnlicher Zellen mit der Fähigkeit sich selbst zu erneuern, stark zu proliferieren und in unterschiedliche Zellpopulationen zu differenzieren, ergänzt wird (28). Die Erforschung des Ausmaßes ihrer Rolle bei der Tumorgenese sowie die Detektion und genetische Charakterisierung solcher Tumorstammzellen in verschiedenen Tumorentitäten steht allerdings noch am Anfang (14). Der vorliegende Beitrag zur Charakterisierung rekurrenter genetischer Veränderungen bei Meningeomen, die möglicherweise essentiell an Tumorgenese und –progression beteiligt sind, bringt additive Informationen und könnte in der Erstellung von umfassenderen genetischen Profilen hilfreich sein. Die Aussicht auf die Identifikation von möglichen Angriffspunkten für verbesserte therapeutische Strategien anhand genetischer Daten stellt eines der wesentlichen Ziele der onkologischen Forschung dar. 7 Einleitung und Problemstellung Intrakranielle Tumore sind wegen ihres vergleichsweise seltenen Vorkommens eine Besonderheit in der systematischen zytogenetischen und molekulargenetischen Analyse. Dennoch lässt sich aus der unverändert schlechten Prognose vieler Patienten die Notwendigkeit verbesserter therapeutischer Ansätze ableiten. Meningeome sind Tumore der Hirnhäute und stellen mit 24-30% aller primären intrakraniellen Tumore eine der häufigsten intrakraniellen Entitäten dar (43). Meningeome werden oft als solitär, langsam wachsend und benigne (WHO Grad 1) klassifiziert und treten mit einem Altersgipfel im sechsten und siebten Lebensjahrzehnt auf. Multiples Auftreten wird in nur 1-8% aller Fälle beschrieben und ist meist mit uniformer Histologie der Tumore verbunden (61). Klinische Symptome ergeben sich aus der Lage des Tumors wobei ein Großteil der Patienten asymptomatisch bleibt oder lediglich Kopfschmerz angibt (56). Deshalb stellen Meningeome auch den zweithäufigsten Befund bei MRT-Screeningstudien dar oder werden häufig erst bei Autopsien entdeckt (49,51). Die in 4,7-7,2% der Fälle autretenden atypischen (WHO Grad 2) und in 1,0-2,8% der Fälle auftretenden anaplastischen (WHO Grad 3) Meningeome fallen durch aggressiveres biologisches Verhalten auf. Dies ist gekennzeichnet durch höhere Proliferationsindexe, dem Auftreten von Nekrosen und invasiven Anteilen (12). Allerdings führt die histologische Heterogenität oftmals zu Problemen bei der Klassifikation, weshalb die Notwendigkeit der Einbeziehung genetischer Daten besteht (62,65). Die komplette chirurgische Resektion (Simpson Grad 1) ist der wichtigste Faktor, um Rezidive zu vermeiden. Dies ist jedoch bei Tumorlokalisationen an der Schädelbasis, zum Beispiel im Bereich des Sinus cavernosus, kaum möglich ohne neurologische Ausfälle zu provozieren (17). Rezidivraten von bis zu 25% bei benignen, bis 52% bei atypischen und bis 94% bei anaplastischen Meningeomen stellen das größte Problem in der Therapie der 8 Einleitung und Problemstellung Meningeome dar (43). In individuellen Therapiekonzepten basierend auf Kenntnissen des genetischen Profils liegen die Zukunftshoffnungen, um rezidivfreies Überleben und Lebensqualität zu verbessern. Diese kann gerade auch bei Patienten unter 55 Jahren trotz zunächst erfolgreicher Operation deutlich eingeschränkt sein (39). Neben dem Auftreten als sporadischer Tumor werden Meningeome bei 50% aller Patienten mit Neurofibromatose Typ 2 diagnostiziert, die eine konstitutionelle Mutation des Tumorsuppressorgens NF2 auf Chromosom 22 aufweisen (3). Auch bei der Entstehung sporadischer Meningeome ließ sich auf eine Beteiligung von NF2 schließen, da partieller oder kompletter Verlust des Chromosom 22 die häufigste zytogenetische Aberration darstellt (5). Da sich nur in einem Teil der Tumore die tatsächliche Mutation oder abnorme Methylierung des NF2 Genes nachweisen lässt, wird die Beteiligung weiterer Gene bei der Tumorgenese vermutet (12). Das Vorliegen eines unveränderten NF2 Gens wurde mit dem meningothelialen Subtyp (WHO Grad1) und der Lokalisation des Meningeoms an der Schädelbasis assoziiert (29,37). Eine Deletion 1p wird mit Tumorprogression assoziiert und als zweithäufigste chromosomale Aberration beschrieben. Mit der weiteren Akkumulation verschiedener Aberrationen (Deletionen auf 6q, 14q, 18q oder Monosomie 10) lassen sich erste genetische Modelle für die Progression von Meningeomen erstellen. Bisher ist die genaue Identifizierung der involvierten Tumorsuppressorgene und Onkogene aber unzureichend (43,54). Im Vergleich zu anderen Gehirntumoren, wie den Gliomen, ist die Anzahl bisher detektierter genetischer Aberrationen zwar überschaubarer, ihre Zusammenhänge und Rollen bei Tumorgenese und –progression aber bis heute nur unvollständig verstanden. Bisherige Arbeiten verwendeten zur Analyse von Meningeomen meist Untersuchungstechniken mit eingeschränkter (molekular-)zytogenetischer Aussagekraft (54). Dies führte zu der Hypothese, dass es mit der Kombination verschiedener 9 Einleitung und Problemstellung Untersuchungstechniken möglich sein sollte, in effizienterer Form bislang unentdeckte chromosomale Aberrationen zu identifizieren und weiterführende tumormechanistische Hinweise zu erhalten. Nicht nur der additive Informationsgewinn, sondern auch eine Steigerung der Validität und Genauigkeit der genetischen Daten durch die Kombination der Methoden Giemsa-Bandendarstellung (GTG-Bänderung), Spektrale Karyotypisierung (SKY-Technik), Fluoreszenz in situ Hybridisierungstechniken (FISH-Analyse) sowie molekulare Karyotyoisierung unter Verwendung von 100K beziehungsweise 6.0 SNPArrays (SNP-A Karyotypisierung) konnte durch die Arbeitsgruppe bereits demonstriert werden (30,31,38). Die Auflösung der detektierbaren Aberrationen erfasst ein Spektrum von >5 Mb bei der GTG-Bänderung bis hin zu deutlich unter 1 Mb mit dem SNP-Array 6.0, dass einen durchschnittlichen Markerabstand von unter 700 Basenpaaren aufweist. Weiterhin bietet die genomweite genetische Analyse mittels SNP-Array den Vorteil, die Veränderung der Kopienzahl zusammen mit LOH (Verlust der Heterozygotie) erfassen zu können. Eine Veränderung der Kopienzahl wird dabei anhand der Größe und der Gleichmäßigkeit des veränderten Hybridisierungssignals (sogenanntes „smooth-signal“) detektiert. Anders als bei klassischen zytogenetischen Verfahren ist mit denselben Parametern die Analyse kopienneutraler Verluste der Heterozygotie möglich, die als potenzielle segmentale UPD Regionen angesehen werden können. Dies beruht auf einer statistischen Analyse, die die gefundene Heterozygotie mit der erwarteten vergleicht. Dabei wird sichergestellt, dass die Kopienzahl in diesem Bereich unverändert zum Normalzustand ist. Das Erfassen möglicher rekurrenter segmentaler UPD Regionen stellt eine neue Dimension in der genetischen Analyse von Tumoren dar und kann zur weiteren Aufklärung spezifischer Ereignisse in der Tumorgenese beitragen. Zusätzlich erlaubt die SNP-Array Technik, Blut und Tumor des Patienten im direkten Vergleich zu untersuchen. Dadurch ist einerseits die Detektion konstitutioneller 10 Einleitung und Problemstellung genetischer Veränderungen und andererseits, in der gepaarten Analyse, das direkte Erkennen von Abweichungen zwischen Blut- und Tumor-DNA eines Patienten möglich. Die Sequenzierungsanalyse zum Mutationsstatus des NF2 Gens erbrachte eine zusätzliche Charakterisierung der Tumore. Alle untersuchten Meningeome wurden in der Universitätsklinik Leipzig, Klinik und Poliklinik für Neurochirurgie, reseziert und mit Einverständnis der Patienten und einem positiven Votum der Ethikkommission kultiviert. In allen Fällen liegt außerdem ein umfangreiches histopathologisches Gutachten der Selbstständigen Abteilung Neuropathologie des Universitätsklinikums Leipzig vor, was eine detaillierte Charakterisierung und Klassifizierung nach WHO-Richtlinien ermöglichte und zusätzliche Erkenntnisse in der Zusammenschau mit den genetischen Ergebnissen erbrachte. Mit den genannten Methoden analysierten wir zunächst einen seltenen Fall eines multipel aufgetretenen Meningeoms mit zwei Tumoren unterschiedlicher Malignität (1 WHO Grad 1; 1 WHO Grad 2), um dann an einer Gruppe von 10 Meningeomen (5 WHO Grad 1; 5 WHO Grad 2) unsere Ergebnisse neu zu bewerten und Informationen dazu zu gewinnen. Unsere vergleichenden genetischen Analysen sollen zur weiteren zytogenetischen und molekulargenetischen Charakterisierung von benignen (WHO Grad 1) und atypischen (WHO Grad 2) Meningeomen beitragen und einen additiven Informationsgewinn ermöglichen. Ziel war es, mit Hilfe unserer Methodenkombination noch nicht beschriebene mögliche tumorrelevante Aberrationen zu detektieren und weitergehend zu analysieren. Die Erfassung möglicher rekurrenter segmentaler Regionen mit Uniparentaler Disomie stellte ein weiteres Ziel dar, um Hinweise auf deren funktionelle Bedeutung zu erhalten. 11 Veröffentlichungen 2. Veröffentlichungen 2.1 Veröffentlichung 1 „Multiple meningioma with different grades of malignancy: Case report with genetic analysis applying single-nucleotide polymorphism array and classical cytogenetics“ (48) Pathology- Research and Practice 207 (2011) 67-72 Seite 13-18 12 Pathology – Research and Practice 207 (2011) 67–72 Contents lists available at ScienceDirect Pathology – Research and Practice journal homepage: www.elsevier.de/prp Teaching cases Multiple meningioma with different grades of malignancy: Case report with genetic analysis applying single-nucleotide polymorphism array and classical cytogenetics Kristin Mocker a,1 , Heidrun Holland b,1 , Peter Ahnert b,c , Ralf Schober d , Manfred Bauer d , Holger Kirsten b,c,e , Ronald Koschny f , Jürgen Meixensberger a , Wolfgang Krupp a,∗ a Department of Neurosurgery, University of Leipzig, Liebigstrasse 20, D-04103 Leipzig, Germany Translational Centre for Regenerative Medicine (TRM), Leipzig, Germany c Institute for Medical Informatics, Statistics and Epidemiology, University of Leipzig, Leipzig, Germany d Division of Neuropathology, University of Leipzig, Leipzig, Germany e Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, Leipzig, Germany f Department of Internal Medicine, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany b a r t i c l e i n f o Article history: Received 1 April 2010 Received in revised form 6 July 2010 Accepted 3 September 2010 Key words: Multiple meningioma Cytogenetics Uniparental disomy a b s t r a c t Multiple meningiomas with synchronous tumor lesions represent only 1–9% of all meningiomas and usually show a uniform histology. The simultaneous occurrence of different grades of malignancy in these nodules is observed in only one third of multiple meningiomas. We report a case of a sporadic multiple meningioma presenting with different histopathological grades (WHO I and II). The tumor genome of both nodules was analyzed by GTG-banding, spectral karyotyping (SKY), locus-specific FISH, and single nucleotide polymorphism array (SNP-A) karyotyping. GTG-banding and SKY revealed 25 structural and 33 numerical aberrations with a slightly increased aberration frequency in the WHO grade II nodule. We could confirm terminal deletions on chromosomes 1p [ish del(1)(p36)(p58-,pter-) 16.5% WHO grade I and 20.9% WHO grade II], partial deletions on 22q, and/or monosomy 22 (monosomy 22 14% WHO grade I and 34% WHO grade II) as the most frequent aberrations in both meningioma nodules. In the meningioma WHO grade II, in addition, a de novo paracentric inversion within chromosomal band 1p36 was detectable. Furthermore, for meningiomas de novo, dicentric chromosomes 4 could be identified in both tumor nodules. We also detected previously published segmental uniparental disomy regions 1p31.1, 6q14.1, 10q21.1, and 14q23.3 in normal control DNA of the patient and in both tumor nodules. Taken together, we describe a very rare case of multiple meningioma with overlapping but also distinct genetic aberration patterns in two nodules of different WHO grades of malignancy. © 2010 Elsevier GmbH. All rights reserved. Introduction Accounting for 13–26% of all primary intracranial neoplasms in adults, meningiomas are histologically classified according to the World Health Organization (WHO) into benign (WHO grade I), atypical (WHO grade II), and anaplastic (WHO grade III) lesions [16]. They commonly occur as slow-growing and benign sporadic solitary tumors [25,26]. Yet, about 8–22% of meningiomas are atypical or anaplastic (WHO grades II or III, respectively) tumors with a more aggressive behavior and high relapse rates [18]. Furthermore, meningiomas are diagnosed in ∼50% of neurofibromatosis type 2 (NF2) patients characterized by loss of ∗ Corresponding author. Tel.: +49 341 9717506; fax: +49 341 9717509. E-mail address: [email protected] (W. Krupp). 1 Contributed equally. 0344-0338/$ – see front matter © 2010 Elsevier GmbH. All rights reserved. doi:10.1016/j.prp.2010.09.001 the NF2 gene on chromosome 22 encoding the merlin tumor suppressor [8]. Multiple meningiomas occur in 1–9% of patients and refer to a condition in which at least two tumors are present at different sites in one patient without neurofibromatosis [7]. They may occur as familial or sporadic tumors [28]. The majority of multiple meningiomas present as benign with uniform histology [22]. In 30% of cases, different grades of malignancy are observed [30]. The simultaneous occurrence of benign and atypical histological grades in sporadic multiple meningiomas is extremely rare. Several authors have described genetic alterations associated with meningioma initiation and progression but existing genetic data do not allow an adequate prediction of rates of tumor growth or of likelihood of tumor recurrence [6,24]. The significance of genetic profiles of tumor nodules for the appearance of multiple meningiomas is not completely understood. 68 K. Mocker et al. / Pathology – Research and Practice 207 (2011) 67–72 The most consistent genetic abnormality in sporadic solitary meningiomas is loss of heterozygosity on chromosome 22, which is present in about 50% of patients. Somatic mutation of the NF2 gene (22q12.2) was found as an early event of tumorigenesis in one third of these cases [5]. In contrast, familial multiple meningiomas do not show loss or mutation of NF2 [28]. Other frequently detected abnormalities in meningiomas, e.g. deletions of 1p, 10, and 14 have been associated with tumor progression and higher grades of malignancy [5,21,29]. As described in previous studies, genomic aberrations can be detected using complementary methods [11,12]. Therefore, we performed comprehensive cytogenetic analysis of the tumor genome of both nodules of a sporadic multiple meningioma applying GTG-banding, spectral karyotyping (SKY), locus-specific FISH, and single nucleotide polymorphism array (SNP-A) karyotyping. Combining these techniques, we could detect overlapping but also distinct genetic aberration patterns in the two nodules of different WHO grades of malignancy. Material and methods Case report A 36-year-old female patient presented with headache and left-sided hypacusis. MRI revealed multiple intracranial supraand infratentorial meningiomas located on both sides. The patient showed neither a family history of meningiomas nor other stigmata of neurofibromatosis type 2 according to the Manchester criteria [2]. In the year of diagnosis, a right petrous bone meningioma was extirpated. Seven months later, a significantly grown bilateral lesion which infiltrated the tentorium and a smaller median meningioma arising from the convexity over cerebellar hemispheres were removed. Eight years later, surgery was indicated due to deterioration of neurological symptoms (developed cerebellar ataxia). Extirpation of two medial meningiomas of the cerebellar convexity and a new grown left petrous bone meningioma was performed. Up to this point, all tumors had been identified histopathologically as fibroblastic and benign, WHO grade I. A progress of visual field defects another two years later, i.e., about 11 years after first tumor diagnosis, was caused by two new rapidly growing left-sided falcine meningiomas in the parietal and the occipital region. Histological examination of the tumor specimens revealed a transitional-psammomatous meningioma WHO grade I and a transitional-atypical meningioma WHO grade II. In the grade I tumor, a MIB proliferation index of 3–5%, and in the grade II tumor, a proliferation index of 15% with diffuse distribution of decorated nuclei was found (Fig. 1). Material from these two tumors was available for genetic analyses (for detailed description of all resected tumors see Table 1). All tumors definitely arose from different locations; there were no local recurrences of the resected tumors. Therefore, according to the current definition of multiple meningiomas and to the best of our knowledge, the two left-sided Fig. 1. Histopathological findings of the two separate meningiomas WHO grade I (above) and WHO grade II (below) that were resected in the same session. (A) Isomorphous tumor with a storifom pattern of elongated tumor cells; HE, ×20. (B) Proliferation index of 3–5%; MIB-1, ×20. (C) Tumor with a similar storifom pattern but with local sheets of larger cells with more prominent nucleoli and with interspersed spandrels of small tumor cells; HE, ×20. (D) Proliferation index of 15%; MIB-1, ×20. Table 1 Clinical and histopathological data of the resected tumors. Year of surgery Number of resected tumors Site of origin Simpson grade WHO grade Histology 1996 1997 One Two 2005 Three 2007 Two Petrous bone, right Tentorium, bilateral Cerebellar convexity, median Petrous bone, left Cerebellar convexity, left Cerebellar convexity, left – far lateral Falx, parietal, left Falx, occipital, left II II I II I I I II I I I I I I II I Fibroblastic Fibroblastic Fibroblastic Fibroblastic Fibroblastic Fibroblastic Transitional-atypical Transitional-psammomatous K. Mocker et al. / Pathology – Research and Practice 207 (2011) 67–72 falcine tumors represent a multiple meningioma. Up to that point of time, the patient had not received any additional treatment, especially no radiotherapy. At present, residual visual field defects and a slight ataxia do not interfere with daily routine activities of the patient. In spite of five complex neurosurgical interventions within a time interval of 11 years and concerns about new tumors, the patient described a general satisfaction with life in recent examinations. Isolation and culturing of primary tumor cells For tumor cell isolation, fresh non-necrotic surgical specimens were washed in PBS and mechanically disaggregated into small pieces which were evenly distributed in a 25 cm2 cell culture flask (Sarstedt #3.1810) coated with AmnioMax medium (Invitrogen) and incubated at 37 ◦ C and 5% CO2 . Tumor attachment was monitored daily. After tumor cell outgrowth, tumor pieces were removed, and cells were covered with AmnioMax. Cells were subcultivated at a confluency of 90%. Chromosome preparation, GTG and FISH studies Chromosome preparation was carried out on primary tumor cell cultures using standard cytogenetic techniques (colcemid treatment, hypotonic treatment, and methanol/acetic acid fixation). GTG-banding, SKY (according to the manufacturer’s instructions – Applied Spectral Imaging), and locus-specific FISH (according to the manufacturer’s instructions – Abbott/VYSIS) were applied for chromosome analysis using chromosome spreads. For karyotyping we analyzed 25 metaphases of the primary cell culture using GTG-banding and 15 metaphases using SKY. FISH analyses were performed on metaphase/interphase cells with probes LSI p58/LSI Telomere 1p; 1p36; spectrum orange/green, LSI TUPLE1/LSI ARSA; 22q11.2/22q13; spectrum orange/green, and CEP 14; spectrum orange (ABBOTT/VYSIS). Molecular karyotyping using SNP-arrays High-resolution genome-wide copy number variation analysis was carried out using the Affymetrix GeneChip Mapping 100K Array Set (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA) in primary tumor cells, as described before [11]. Briefly, after extraction of genomic DNA from primary meningioma cells using the DNeasy Tissue Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany), integrity of genomic DNA was checked by agarose gel electrophoresis. Genotyping experiments were carried out according to standard protocols for the Affymetrix GeneChip Mapping 100K Array Set allowing genotyping of roughly 100,000 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the genomic DNA of a sample, enabling genome wide detection of numerical aberrations with a median intermarker distance of 8.5 kb and a mean intermarker distance of 23.6 kb. Arrays were scanned and genotypes were called using the GeneChip Genotyping Analysis Software (GTYPE) 4.0, which uses an automated genotype-calling algorithm that provides a confidence score for each individual genotype. Copy numbers for each SNP were determined using the GeneChip Chromosome Copy Number Analysis Tool (CNAT), which provides a value for the amount of DNA present at each SNP position, as well as p-values describing the significance of each finding. Analyses were carried out as described [11]. For high resolution at low noise, a 0.5 MB sliding window (GSA) was chosen for analysis. Supported by cytogenetic data for the same sample, p-values for copy number changes appeared to be a good indicator for imbalances. Regions of suspected uniparental disomy were identified by LOH probability >80%, normal copy number values, and normal p-values for copy number changes. 69 Table 2 Chromosomal aberrations of the two tumor nodules as detected by GTG-banding, SKY, and locus specific FISH. Chromosomal aberration WHO grade I nodule (%) WHO grade II nodule (%) ish del(1)(p36)(p58-,pter-) ish del(1)(p36)(p58+,pter-) Inversion within 1p36 dic 4 Monosomy 14 del(22)(q13) Monosomy 22 16.5 10 0 7.5 2.5 16.5 14 20.9 21 18.7 10 6.5 20.9 34 Results Analyzing 25 metaphases by GTG-banding and 15 metaphases using SKY in each tumor nodule, we found structural chromosomal aberrations most frequently localized on chromosomes 1 and 22, with a slightly increased aberration frequency in WHO grade II meningioma. Significant chromosomal aberrations of both nodules are listed in Table 2. We could confirm partial deletions on 22q and/or monosomy 22 as the most frequent aberrations in sporadic meningioma. Using locus-specific FISH analysis, we found monosomy 22 in 14% of tumor cells of the WHO grade I nodule and in 34% of tumor cells of the WHO grade II lesion. Terminal del(22)(q13) was only detectable in the grade II lesion in 10% of neoplastic cells. However, clear evidence for loss along the entire chromosome 22 was visible by SNP-A karyotyping in both tumor nodules. Stringent criteria for loss were fulfilled for 22q11.21, 22q12.1, 22q12.3, and 22q13. Using GTG-banding, SKY, and locus-specific FISH analysis, we could confirm the previously described terminal deletions del(1)(p36) [ish del(1)(p36)(p58-,pter-)]: 16.5% of the interphase cells/metaphases in meningioma grade I, and 20.9% in meningioma grade II (Fig. 2A); ish del(1)(p36)(p58+,pter-): 10% of the interphase cells/metaphases in meningioma grade I, and 21% in meningioma grade II (Fig. 2B) as a frequent aberration in meningioma. In the grade II lesion, we additionally detected a de novo paracentric inversion within chromosomal band 1p36 in 3/16 metaphases analyzed (Fig. 2C). SNP-A karyotyping revealed signs of losses on 1p (Fig. 2D) in both WHO grades. As described here for the first time for meningiomas, dicentric chromosomes 4 could be identified in both tumor nodules by GTGbanding, SKY, and locus-specific FISH analysis (Table 2; Fig. 2E–G). SNP-A karyotyping did not show any chromosomal imbalances at chromosome 4 (data not shown). Monosomy of chromosome 14 was detected in only 2.5% of meningioma WHO grade I cells , and in 6.5% of meningioma WHO grade II cells. SNP-A karyotyping uniquely allows for genome-wide analysis of heterozygosity. Applying SNP-A karyotyping, we detected the previously published segmental uniparental disomy (UPD) regions 1p31.1, 6q14.1, 10q21.1, and 14q23.3 in normal control DNA of the patient and in both tumor nodules [12]. Discussion Multiple meningiomas with synchronous tumor lesions represent only 1–9% of all meningiomas and usually show uniform histology. The simultaneous occurrence of different histological grades in these nodules is observed in only one third of multiple meningiomas [30]. There are only few reports on multiple meningiomas in which atypical and benign histological types were simultaneously observed [4,13,19,30]. To our knowledge, this is the fourth presented case. We report a clinically very interesting case of a multiple meningioma with synchronous tumor lesions of dif- 70 K. Mocker et al. / Pathology – Research and Practice 207 (2011) 67–72 Fig. 2. Comparison of GTG banding, SKY, locus-specific FISH analysis, and SNP-array copy number analysis of two nodules of a sporadic multiple meningioma. Locus-specific FISH analysis showed ish del(1)(p36)(p58-,pter-) (A), ish del(1)(p36)(p58+,pter-) (B), and paracentric inversion within 1p36 (C), here in meningioma WHO grade II. (D): SNP-A karyotyping revealed signs of losses on 1p in DNA of both tumors compared with DNA from blood. Results for the chromosomal regions 1pter→1p31.1 are shown for normal peripheral lymphocytes (blood) and meningioma nodules of WHO grades I and II. SNP-array karyotyping detected segmental partial UPD on chromosomal sequence 1p31.1 (black frames) in all three specimens. Representations of SNP-array copy number data show calculated values for copy number (GSA CN) (I – blue) and logarithm of p-values (GSA pVal) (II – red), separately. LOH indicates measures of loss of heterozygosity (III – green). Genetic aberrations on chromosome 4 were detected by GTG banding (E), SKY (F), and locus-specific FISH analysis (G) showing a dicentric chromosome 4. ferent grades of malignancy and previous occurrence of sporadic meningiomas. Therefore, the aim of this study was to characterize these tumors for typical genetic aberrations which are discussed to be causative for multiple meningiomas. The tumor genome of both nodules was analyzed by single nucleotide polymorphism array (SNP-A) karyotyping and classical cytogenetics. Analysis of genomic changes using classical and molecular cytogenetic methods in combination with high density SNP-A provides more detailed data on genetic aberrations and possible mechanisms of tumor progression. Applying these techniques in the present case, we detected the previously published tumor-associated segmental UPD regions 1p31.1, 6q14.1, 10q21.1, and 14q23.3 [14] in both tumor nodules of the present case of a multiple meningioma. Interestingly, these UPD regions were detected also in normal control DNA of the patient. The same chromosomal regions were identified as UPD regions in tumor tissue of rectal cancer [15]. However, control DNA of normal cells was not investigated in the study of Lips et al. [15]. Uniparental disomy (UPD), in addition to allelic imbalance, is emerging as a genetic mechanism involved in tumorigenesis and progression, often involving de novo mutations in relevant genes [31]. To the best of our knowledge, this is the first presented case of multiple meningioma with partial UPD regions in normal control DNA (blood) and tumor tissues. As we found hereditary UPD regions, it is tentative to speculate about a causal role of these regions for carcinogenesis in general and tumorigenesis of meningioma in particular. Currently, K. Mocker et al. / Pathology – Research and Practice 207 (2011) 67–72 we are investigating these partial UPD regions in a larger group of sporadic meningiomas of WHO grades I and II (manuscript in preparation). The authors believe it is important to further analyze the significance of copy number variations, UPD, and LOH, as well as their interdependencies in order to gain a deeper insight into tumorigenesis and progression. One of the most prominent chromosomal aberrations described in meningiomas (WHO grades I and II) using CGH analysis is loss of all or part of chromosome 22 (24–51% of published cases) [3]. Monosomy 22 may be associated with a higher frequency of meningioma recurrence [23]. We found monosomy 22 in 14% of tumor cells of the WHO grade I lesion, and in 34% of tumor cells of the WHO grade II lesion. Terminal del(22)(q13) was only detectable in meningioma grade II (10% of neoplastic cells), but losses of 22q11.21, 22q12.1, 22q12.3, and 22q13 were identified by SNP-A karyotyping in both tumor nodules. The Cancer Gene Census lists a number of genes and loci known to be involved in various neoplasms. Comparison of the Cancer Gene Census with our SNP-array data identified six concordant meningioma candidate genes within genomic regions affected by these deletions mentioned above: CLTCL1, CLH22, CLTD, MN1, LARGE, and PDGFB [1,9]. Deletions of 1p are the second most frequent chromosomal aberrations (about 22–33% of published cases using CGH analysis) in meningiomas [3,23]. Partial or complete loss of chromosome 1 or 1p has been described to be an important step in progression of meningiomas [3]. Nakane et al. [17] did not detect LOH of 1p in grade I tumors, but in more than 80% of the grade II and III tumors. LOH of 1p and hypermethylation of the candidate gene TP73 (1p36) were detected in meningiomas of WHO grades II and III, but not in the primary benign tumors. In the present case, deletions ish del(1)(p36)(p58-,pter-) and ish del(1)(p36)(p58+,pter-) could be detected in both tumor nodules. In addition to these chromosomal aberrations, we detected a de novo paracentric inversion within chromosomal band 1p36 only in the grade II meningioma lesion. Thus, paracentric inversion within the chromosomal region 1p36 might represent a molecular step at the transition from WHO I to WHO II meningiomas. Gajecka et al. [10] described constitutional paracentric inversion within 1p36, combined with three interstitial cryptic deletions in a patient with deletion 1p36 syndrome. The authors proposed that two of the three interstitial deletions were the primary event, with the inversion as an intermediate step in the rearrangement formation. The third interstitial deletion may have resulted from processes stabilizing the inversion. Using the techniques available to us, we did not detect deletions in metaphases with paracentric inversion 1p36. Here we describe low frequency dicentric chromosome 4 for the first time in meningiomas. Interestingly, this aberration could be identified in both tumor nodules. Dicentric chromosomes may originate from telomeric fusion [20,27]. Dicentric chromosomes originating from telomeric fusion tend to pull apart during mitosis, resulting in deletions and unbalanced chromosomal fragments due to breakage between the two centromeres. Sawyer et al. [27] described telomeric fusion as a mechanism for loss of 1p in meningioma. Taken together, we describe a rare case of multiple meningioma with overlapping but also distinct genetic aberration patterns in two nodules of different WHO grades of malignancy. The significance of de novo partial UPD regions in blood and tumor tissues, as well as the paracentric inversion in the chromosomal region 1p36 and dicentric chromosome 4, has to be verified in a larger group of meningiomas. Acknowledgements The authors thank Helene Hantmann and Rainer Baran-Schmidt for their excellent technical assistance. This study was supported by 71 the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, PtJBio, grant 0313909 to HH and HK and grant 01KN0702 supporting PA). References [1] The Cancer Genome Project, September 14, Available from: URL: http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/, 2009. [2] A.R. Asthagiri, D.M. Parry, J.A. Butman, H.J. Kim, E.T. Tsilou, Z. Zhuang, R.R. 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Veröffentlichungen 2.2 Veröffentlichung 2 „High resolution genomic profiling and classical cytogenetics in a group of benign and atypical meningiomas“ (32) Cancer Genetics 204 (2011) 541-549 Seite 20-28 19 Cancer Genetics 204 (2011) 541e549 High resolution genomic profiling and classical cytogenetics in a group of benign and atypical meningiomas Heidrun Holland a,1, Kristin Mocker b,1, Peter Ahnert a,c,g, Holger Kirsten a,c,f,g, Helene Hantmann a, Ronald Koschny d, Manfred Bauer e, Ralf Schober e, €rgen Meixensberger b, Wolfgang Krupp b,* Markus Scholz c,g, Ju a b Translational Centre for Regenerative Medicine (TRM), University of Leipzig, Leipzig, Germany; Department of Neurosurgery, University of Leipzig, Leipzig, Germany; c Institute for Medical Informatics, Statistics and Epidemiology, University of Leipzig, Leipzig, Germany; d Department of Internal Medicine, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany; e Division of Neuropathology, University of Leipzig, Leipzig, Germany; f Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, Leipzig, Germany; g LIFE Center (Leipzig Interdisciplinary Research Cluster of Genetic Factors, Phenotypes and Environment), University of Leipzig, Leipzig, Germany Meningiomas are classified as benign, atypical, or anaplastic. The majority are sporadic, solitary, and benign tumors with favorable prognoses. However, the prognosis for patients with anaplastic meningiomas remains less favorable. High resolution genomic profiling has the capacity to provide more detailed information. Therefore, we analyzed genomic aberrations of benign and atypical meningiomas using single nucleotide polymorphism (SNP) array, combined with G-banding by trypsin using Giemsa stain (GTG banding), spectral karyotyping, and locus-specific fluorescence in situ hybridization (FISH). We confirmed frequently detected chromosomal aberrations in meningiomas and identified novel genetic events. Applying SNP array, we identified constitutional de novo loss or gain within chromosome 22 in three patients, possibly representing inherited causal events for meningioma formation. We show evidence for somatic segmental uniparental disomy in regions 4p16.1, 7q31.2, 8p23.2, and 9p22.1 not previously described for primary meningioma. GTG-banding and spectral karyotyping detected a novel balanced reciprocal translocation t(4;10)(q12;q26) in one benign meningioma. A paracentric inversion within 1p36, previously described as novel, was detected as a recurrent chromosomal aberration in benign and atypical meningiomas. Analyses of tumors and matched normal tissues with a combination of SNP arrays and complementary techniques will help to further elucidate potentially causal genetic events for tumorigenesis of meningioma. Keywords Meningioma, cytogenetics, single nucleotide polymorphism array, segmental uniparental disomies, paracentric inversion ª 2011 Elsevier Inc. All rights reserved. Accounting for 24e30% of all primary intracranial neoplasms in adults, meningiomas are histologically graded according to the World Health Organization (WHO) as benign (WHO grade I), atypical (WHO grade II), or anaplastic (WHO grade III) Received December 7, 2010; received in revised form October 12, 2011; accepted October 17, 2011. * Corresponding author. E-mail address: [email protected] 1 These authors contributed equally to this study. 2210-7762/$ - see front matter ª 2011 Elsevier Inc. All rights reserved. doi:10.1016/j.cancergen.2011.10.007 meningiomas (1). Mainly, meningiomas occur as sporadic, solitary, slow-growing, and benign tumors (2,3). Atypical and anaplastic meningiomas represent 8e22% of meningiomas. They show a more aggressive biological behavior, a less favorable prognosis (4,5), and high recurrence rates between 38e78% (6,7). Although the grade of malignancy and the completeness of tumor resection are important predictors for tumor recurrence, several genetic aberrations are associated with a more aggressive phenotype (8,9). Meningiomas are among the best-described tumors in terms of tumor genetics. However, our understanding of 542 genetic aberrations associated with aggressive behavior of meningioma is still limited. One of the most prominent chromosomal aberrations detected by comparative genomic hybridization (CGH) in meningiomas is partial or complete loss of chromosome 22, found in 24e51% of published cases (10). Loss of heterozygosity (LOH) of chromosome 22 is observed in 47e72% of meningiomas. In one third of these cases showing LOH of chromosome 22, somatic mutation of the NF2 gene, located on 22q12.2, is described as an early event in tumorigenesis (11). The NF2 gene appears to be less often affected within the meningothelial subtype in comparison with other meningioma subtypes (12). The same holds for skull base localization of meningiomas in comparison with other localizations (13). Alternative NF2-independent pathways of tumor initiation of meningioma still remain unclear despite the identification of several other candidate genes on chromosome 22, such as BAM22, LARGE, SMARCB1, and MN1 (14). The second most common genetic abnormality in meningioma is partial or complete loss of 1p, which simultaneously represents the most frequent progression-associated chromosomal aberration in meningiomas (15). Concentrating on chromosomal loci 1p13, 1p32, and 1p36, several genes, such as TP73, RASSF1A, CASP9, JUN, and TNFRF25, have been focused on as candidates for tumor initiation and/or progression (14,16e18). Further frequently detected abnormalities in meningiomas, such as deletions of 6q, 10, 14q, and 18q and chromosomal gains on 1q, 9q, 12q, 15q, 17q, and 20, have been described to be associated with tumor progression and a higher grade of malignancy (11,14,19). Comprehensive genomic characterization of meningiomas may improve the understanding of meningioma formation and progression. As a possible new mechanism of tumorigenesis, segmental uniparental disomy (UPD) was our focus. Somatic recombination or nondisjunction in mitosis may lead to loss of one allele, and the remaining allele is then reduplicated. Another possibility is chromosomal breakage followed by reduplication to compensate for the loss of a segment (20). These events result in LOH without copy number change. Possible consequences are inactivation of tumor suppressor genes or activation of oncogenes. Our recent analyses of a case of atypical meningioma and a case of multiple meningioma showed segmental UPD regions as potential recurrent genetic events in meningiomas (21,22). The aim of the current study was to assess occurrence of previously described segmental UPD regions in a group of 10 sporadic benign and atypical meningiomas. Furthermore, we sought data on other potentially recurrent segmental UPD events, and we wanted to perform a comprehensive analysis for novel chromosomal aberrations. For this purpose, we combined cytogenetic techniques with molecular cytogenetic methods. GTG-banding, spectral karyotyping (SKY), and locus-specific FISH were complemented by analyses of copy number and heterozygosity using Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0. GTG-banding produces reproducible banding patterns on metaphase chromosomes and allows detection of aberrations on the single chromosome level (resolution 5e10 Mb). SKY is a multicolor FISH technique that allows for detection of cryptic balanced or unbalanced translocations and complex rearrangements in the karyotype. With a resolution as low as 2e3 Mb, SKY allows H. Holland et al. assignment of additional chromosomal material to their chromosomes of origin. Two major limitations of SKY in contrast to GTG-banding are that duplications and deletions are visible only with additional procedures, and intrachromosomal aberrations are not detectable. Applying this combination of techniques, we confirmed frequently detected chromosomal aberrations and identified novel genetic events. Materials and methods Patients Tumor resection was performed in 10 patients with primary sporadic meningiomas at the Department of Neurosurgery, University Hospital of Leipzig. Group 1 comprised five consecutive cases with meningioma of WHO grade I (n Z 3 male, n Z 2 female, mean age at time of surgery 54.8 y). Group 2 consisted of five consecutive cases with meningioma of WHO grade II (n Z 1 male, n Z 4 female, mean age at time of surgery 64.0 y). Time intervals between admissions of patients in group 2 were longer than those in group 1 because of the lower incidence of atypical meningiomas. Informed consent was obtained from all patients. Using magnetic resonance imaging (MRI), tumor lesions were found in the following intracranial regions: olfactory groove (n Z 4), convexity (n Z 3), lateral sphenoid (n Z 1), tuberculum sellae (n Z 1), and falx (n Z 1). Detailed information on age, sex, tumor location, tumor grade, histopathological subtype, proliferation index, and surgical procedure (Simpson grade) is given in Table 1. All patients lacked a family history of brain tumors and underwent neither chemotherapy nor radiotherapy prior to surgery, except patient 8, who received local adjuvant radiotherapy of a rectal carcinoma five years before meningioma diagnosis. The proliferation index was calculated as percentage of cells positive for proliferation marker Ki67 evaluating 10 high power fields (400 magnification). The mean MIB (Ki67) proliferation index was 3.4% for WHO grade I meningiomas and 7.8% for WHO grade II meningiomas. Isolation and culturing of primary tumor cells For each tumor cell isolation, fresh non-necrotic surgical specimens were washed in phosphate-buffered saline (PBS) and mechanically disaggregated into small pieces that were evenly distributed in a 25-cm2 cell culture flask (#83.1810 €mbrecht, Germany) coated with AmnioMax Sarstedt, Nu medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) and incubated at 37 C and 5% CO2. Tumor attachment was monitored daily. After tumor cell outgrowth, tumor pieces were removed and cells were covered with AmnioMax. Cells were sub-cultivated at a confluency of 90%. Chromosome preparation, GTG, and FISH studies Chromosome preparations were performed on primary tumor cell cultures using standard cytogenetic techniques (colcemid treatment, hypotonic treatment, and methanol/acetic acid fixation). GTG-banding, SKY (according to manufacturer’s Cytogenetics of benign and atypical meningiomas 543 Table 1 Clinical, molecular, and histopathological patient data Sample No. Age, y Location (main part) 1 45 2 53 fronto-temporal right fronto-basal right 3 4 5 6 7 50 57 69 42 58 8 9 10 65 76 79 Site of origin Simpson gradea WHO grade Histology MIB (Ki-67) NF2 mutationb lateral spenoid II I Meningothelial <1% - II I Meningothelial 4% - frontal frontal right frontal occipital right frontal tuberculum sellae olfactory groove convexity olfactory groove falx olfactory groove II I II II II I I I II II Meningothelial Microcystic Meningothelial Atypical Atypical 4% 4% 4% 8% 8% temporal left fronto-basal temporal left convexity olfactory groove convexity I II I II II II Chordoid Atypical Atypical 8% 8% 7% g.76466C>T g.43498_43499insA g.43498_43499insA g.74810C>T (Zp.Gln407Stop) g.43498_43499insA a Simpson grade I: complete excision of meningioma, including infiltrated dura and bone. Simpson grade II: complete excision of meningioma, with supposed reliable coagulation of dural attachment. b Positions of NF2 mutations are according to the NCBI (National Center for Biotechnology Information) reference sequence: NG_009057.1. Shown are only variants not observed in dbSNP v132. instructions; Applied Spectral Imaging, Carlsbad, CA), and locus-specific FISH (according to manufacturer’s instructions; Abbott/Vysis, North Chicago, IL) were applied for chromosome analysis using chromosome spreads. For each tumor, we analyzed 25 metaphase cells of the primary cell culture using GTG-banding and 15 metaphase cells using SKY. FISH analyses were performed on metaphase/interphase cells with probes LSI P58/LSI Telomere 1p; 1p36; spectrum orange/ green, and LSI TUPLE1/LSI ARSA; 22q11.2/22q13; spectrum orange/green (Abbott/Vysis). Molecular karyotyping using SNP arrays High resolution genome wide copy number variation analysis and assessment of heterozygosity were performed using the Genome-Wide Human SNP Array 6.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA) in resected tumor tissues. The array contains probes for genotyping and copy number detection for nearly one million SNPs. In addition, it contains close to one million additional probes for detecting copy number in nonpolymorphic regions. Thus, the array allows genome wide detection of chromosomal copy number as well as estimation of heterozygosity at high resolution. Genomic DNA from primary meningioma cells was extracted using the DNeasy Tissue Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany). The integrity of genomic DNA was checked by agarose gel electrophoresis. Array processing was performed as a service by AROS Applied Biotechnology AS (Aarhus, Denmark). Quality control involved several aspects: Inspection of sample histograms (data not shown) did not reveal any hints at technical problems. In principal component analysis (data not shown) of array intensity data, clustering with “scan date” was not observed, suggesting reproducible laboratory procedures. Male samples clustered separately from female samples, as expected. For all patients, blood and tumor samples from the same individual clustered near each other with similar distances between blood and tumor. We observed no clustering with tumor grade (WHO grade I or II). Genotypes were called using the birdseed version 1 algorithm (23) implemented in the Affymetrix Genotyping Console software version 4.0, with standard settings. For blood samples, the overall call rate was greater than 99.2%. For tumor samples, the overall call rate was greater than 98.7%. Copy number analyses and detection of regions with LOH were performed in Partek Genomics Suite version 6.5 (release number 6.10.1020, Partek, St. Louis, MO) according to given workflows with standard settings. Copy number aberrations were detected with genomic segmentation in Partek Genomics Suite. Copy number regions were reported if a minimum size of 1Mb and an average smooth signal of at least 2.4 for gain regions or a maximum smooth signal of 1.6 for loss regions were observed. LOH was determined in Partek Genomics Suite for paired samples to identify somatic changes in tumors versus blood (germline) and unpaired relative to a reference derived from 102 germline samples of the local population to identify overall regions of LOH, including constitutive LOH. Analysis of enrichment of LOH was performed using the software R 2.12.0. The observed percentage of LOH within 1p31.1, 6q14.1, 10q21.1, and 14q23.3 within a certain tissue type was compared with the percentage of LOH within 100,000 randomly drawn genomic regions of similar size of the same tissue type. On this basis, the odds ratio of the percentage of LOH in WHO grade II versus WHO grade I was determined. NF2 gene sequencing All 17 NF2 exons were amplified as described previously (24). Polymerase chain reaction (PCR) products were purified €ttingen, Germany). using a PCR purification kit (Seqlab, Go Sequencing was performed by Seqlab. Sequences were analyzed using FinchTV 1.4 (Geospiza, Seattle, WA) and 544 H. Holland et al. compared with human genome build hg19 and dbSNP build 132. Sequencing the PCR product in the reverse direction validated detected variants not reported in dbSNP. 8 samples: 4 WHO grade I, 4 WHO grade II), and 19 (12/400, 7 samples: 4 WHO grade I, 3 WHO grade II). Results of SNP array analyses and NF2 sequencing Results Results of GT- banding, SKY, and locus-specific FISH In analyzing 25 metaphase cells by GTG-banding and 15 metaphase cells by SKY for each tumor, we found 56 structural chromosomal aberrations most frequently localized on chromosomes 1, 2, 3, 4, 6, 7, and 22 in 10 meningiomas (Table 2). Using these techniques, we identified a novel balanced reciprocal translocation t(4;10)(q12;q26) in 4 of 40 analyzed metaphase cells in a benign meningioma (sample 3, Figure 1A). SNP array analysis also showed no chromosomal imbalance at the chromosomal breakpoint cluster regions 4q12 and 10q26 in this sample (Figure 1B). FISH analysis with locus-specific probes LSI P58/LSI Telomere 1p (primary tumor cells and blood) and LSI TUPLE1/ARSA (22q11.2/22q13) were performed. With the application of probe LSI P58/LSI Telomere 1p, the previously described paracentric inversion within chromosomal region 1p36 (22) was detected as a recurrent chromosomal aberration in 7 of 10 meningiomas (4/5 WHO grade I, 3/5 WHO grade II). Using the locus-specific FISH probe LSI TUPLE1/ ARSA, we confirmed known chromosomal aberrations, such as segmental deletions on 22q (4 samples: 2 WHO grade I, 2 WHO grade II), and/or monosomy 22 (6 samples: 2 WHO grade I, 4 WHO grade II). Numerical chromosomal changes were detected in meningiomas using GTG-banding and SKY, analyzing 25 and 15 metaphase cells, respectively. Of 173 identified numerical chromosomal aberrations, the most frequently found were monosomies of chromosomes 22 (34/400 metaphase cells, 8 samples: 5 WHO grade I, 3 WHO grade II), 18 (12/400, Using Genome-Wide Human SNP Array 6.0, we detected numerous chromosomal aberrations. We confirmed previously described chromosomal imbalances, such as losses of 1p, 2p/q, 3p, 6, 7p/q, 9p, 14, 19p, 14, 19p, and 22q, and gain of 22q. For the first time in primary benign meningiomas, we detected losses of 2p16.2-p11.1, 7p21.2-p15.3, and 7q11.21-q21.11 (Table 3). Further, one chromosomal imbalance not previously described for intracranial primary atypical meningiomas was observed by SNP array analysis: gain of chromosomal material 19p13.12-p12 in the only chordoid subtype of this group of meningiomas (Figure 1C). This gain was adjacent to a loss known to be recurrent in meningiomas (Table 3). Interestingly, losses or gains of 22q were detected not only in primary tumor cells but were also found in the germline DNA of the same patients (1/10 and 2/10 analyzed patients, respectively, Figure 1D). To our knowledge, these aberrations have not been previously reported to be constitutional. The Cancer Gene Census (25) lists a number of genes and loci known to be involved in various neoplasms. Our comparison of the Cancer Gene Census with our SNP array data identified 121 concordant genes within genomic regions affected by gains or deletions (data not shown). Of these affected genes, 56 are described for solid tumors and 10 have been published in connection with brain tumors (Table 3). SNP array analysis uniquely allows genome wide analysis of heterozygosity. For the studied group of benign and atypical meningiomas, somatic LOH without a copy number change was observed in 3 tumor samples on chromosomal regions 4p16.1, 7q31.2, 8p23.2, and 9p22.1, suggesting segmental UPD. LOH without copy number change was frequently found within all samples of both tumor grades as well as in corresponding germline DNA samples from the same individuals (Table 4a). Segmental UPD in regions Table 2 Structural aberrations based on the results of GTG-banding and SKY, (25 and 15 metaphases, respectively). Bold typing indicates chromosomal aberrations detected in more than one metaphase spread of the respective tumor sample Sample No. Gender WHO grade 1 F I 2 3 M M I I 4 5 F M I I del(1)(p36.3p36.1)[2/40], del(1)(p21p12), del(1)(p?), del(2)(p?), del(2)(p21p13), del(7)(q11q21), del(18)(p11.2), del(22)(q13) del(1)(p36)[3/40], del(14)(q32) t(1;7)(?;?), (t(2;?)(q37;?), t(4;7)(?;?), t(4;10)(q12;q26)[4/40], del(5)(q?), del(7)(p13p15) [2/40], del(16)(q24) del(1)(p36)[5/40], del(1)(p21), del(2)(p?), del(3)(p26), del(3)(p21p13) t(5;9)(?;?) 6 7 8 9 10 F M F F F II II II II II del(2)(p16p12), del(3)(p?), dup(6)(p?), del(10)(p12), del(12)(p12), dup(12)(q24.3q23) del(2)(q32), del(2)(p?), del(3)(p25p23)[2/40], del(7)(p15p13) del(1)(p36p31), del(4)(q?)[2/40], del(6)(p22p12)[2/40], t(7;8)(?;?), t(19;20)(?;?); del(22)(q?) dup(20)(q13) tas(13;19)(pter;pter), t(15;19)(q11;q12) Chromomal aberrations Note: Bold typing indicates chromosomal aberrations detected in more than one metaphase spread of the respective tumor sample. Cytogenetics of benign and atypical meningiomas 545 Figure 1 Comparison of GTG-banding, SKY, and SNP array copy number analyses of meningioma. (A) Ideograms with GTG-banding (top), and SKY (bottom) showing the t(4;10)(q12;q26). (B) SNP array copy number analysis showed no significant imbalance within breakpoint-cluster region 4q12 or 10q26 (blue rectangles indicate breakpoint-cluster regions). (C) SNP array copy number analysis (Log2Ratio) revealed de novo gain of chromosomal material 19p13.12-p12 in the only chordoid subtype of this group of meningiomas (top, indicated by the rectangle); hematoxylin and eosin staining showing characteristic chordoid areas (bottom). (D) SNP array copy number analysis (Log2Ratio) revealed de novo loss or gain within chromosomal regions 22q11.22-q11.23 in normal control DNA and primary tumor cells of three patients (green rectangles indicate regions with chromosomal gain, red rectangles indicate the region with chromosomal loss). 546 Table 3 Sample No. 1 4 H. Holland et al. Overview of significant somatic aberrations detected by SNP array Physical position Confirmation WHO grade Cytoband Copy number change I 1p36.33-p22.3 Loss 0.8 86.7 85.9 1p22.1-p21.3 1p13.2-p12 2p22.3-p16.3 2p16.2-p11.1 2q24.3-q37.3 Loss Loss Loss Loss Loss 93.1 113.3 32.3 54.1 169.7 95.3 118.3 47.9 91.1 242.4 2.2 5.0 15.6 37.0 72.7 7p21.2-p15.3 7p14.1-p11.2 7q11.21q21.11 7q22.3-q31.1 1p36.33-p22.2 Loss Loss Loss 15.2 40.2 63.8 19.7 54.7 78.6 4.5 14.5 14.8 Loss Loss 106.4 0.7 111.1 91.4 4.7 90.7 1p21.3-p13.3 3p26.3-q11.2 Loss Loss 94.5 0.0 107.4 95.0 12.9 95.0 I Start (Mb) End (Mb) Length (Mbp) Genesa GTG FISH Litc PAX7, SFPQ, THRAP3, MYCL1, CDKN2C,b JUN Yes Yes Yes No Yes Yes Yes No No No No No No Yes Yes Yes No Yes No No Yes No No No No Yes No No Yes No Yes Yes Yes Yes Yes No No Yes Yes Yes No Yes Yes Yes No Yes Yes Yes Yes No Yes No No No No Yes Yes No No No No No No Yes Yes Yes No No Yes TRIM33, NRAS EML4, MSH2, MSH6 CHN1, CREB1,IDH1,b FEV, PAX3, ACSL3, CMKOR1 PAX7, SFPQ, THRAP3, MYCL1, CDKN2C,b JUN SRGAP3,b VHL, PPARG, RAF1,b MLH1, CTNNB1, SETD2, MITF SRGAP3,b VHL, PPARG, RAF1,b MLH1, CTNNB1, SETD2, MITF 7 II 3p26.3-q11.2 Loss 0.0 95.0 95.0 8 II 7p22.3-q11.21 1p36.33-p13.1 Loss Loss 0.1 0.8 62.8 116.1 62.7 115.3 6p25.3-q27 Loss 9p22.3-p22.2 9p21.3 Loss Loss 0.1 0.0 14.3 20.1 170.8 0.0 18.2 23.4 170.7 0.0 3.9 3.3 9p21.3-p21.1 9p21.1 14q11.1q32.33 19p13.3p13.12 19p13.12-p12 22q11.1q11.21 22q11.21q12.1 22q12.1q13.33 22q11.1q13.33 Loss Loss Loss 25.0 30.0 18.1 29.7 31.5 105.3 4.7 1.5 87.2 Loss 0.0 15.3 15.3 Gain Loss 15.3 14.4 21.0 18.2 5.7 3.8 MECT1 No No No No Yes Yes Gain 19.4 24.6 5.2 BCR,b SMARCB1b No No Yes Loss 24.6 49.6 25.0 No No Yes Loss 14.9 49.6 34.7 MN1,b EWSR1, NF2,b ZNF278, PDGFB, EP300 BCR,b SMARCB1,b MN1,b EWSR1, NF2,b ZNF278, PDGFB, EP300 No No Yes 10 II PAX7, SFPQ,THRAP3, MYCL1, CDKN2C,b JUN, TRIM33, NRAS HMGA1,TFEB, ROS1,b GOPC,b MYB CDKN2A -p16(INK4a), CDKN2A- p14ARF HEI10,KTN1, RAD51L1, TSHR, GOLGA5, AKT1 STK11, SMARCA4 Note: Regarding confirmation, concordance with results from GTG-banding and FISH are shown, as well as previous reporting in the literature (Lit). a Data were obtained from the Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project Web site (25). b Genes, described as aberrant in brain tumors. c Frequent chromosomal sequences by (array) CGH in meningiomas (38). 1p31.1, 6q14.1, 10q21.1, and 14q23.3, was described in meningioma in previous studies (21,22). Within these regions, we found a higher percentage of copy number neutral LOH (Table 4b). Enrichment analysis showed that the detected increased percentage of LOH in WHO grade I cases and further increase in WHO grade II cases were Cytogenetics of benign and atypical meningiomas Table 4 547 Extent of segmental UPD regions suggested by copy neutral loss of heterozygosity (cnLOH) WHO grade I a) Whole genome Average cnLOH size in Mb (%) Minimum cnLOH size in Mb (%) Maximum cnLOH size in Mb (%) b) 6q14.1, 10q21.1, and 14q23.3 only Average cnLOH size in Mb (%) Minimum cnLOH size in Mb (%) Maximum cnLOH size in Mb (%) WHO grade II Tumor tissue Blood Tumor tissue Blood 324 (11.3%) 307.8 (10.7%) 347 (12.1%) 310.9 (10.8%) 287.4 (10%) 334.6 (11.7%) 325.2 (11.3%) 294.4 (10.3%) 346.5 (12.1%) 311.9 (10.9%) 260.2 (9.1%) 350.3 (12.2%) 3.2 (17.1%) 1.1 (5.9%) 4.8 (25.4%) 3.2 (17.2%) 1.1 (5.9%) 4.8 (25.4%) 4.1 (21.5%) 2.2 (11.8%) 5 (26.6%) 4.2 (22.2%) 2.5 (13.3%) 5 (26.6%) Note: Shown is the average cumulative size of cnLOH regions (a) throughout the whole genome from tumor tissues and corresponding germline DNA (blood). The same is shown for (b) selected regions suggested by previous findings (21,22). unlikely to be due to chance (P < 0.05) for both tumor tissue and germline DNA. Mutation analysis of the NF2 gene revealed five mutations in 4 of 10 meningioma cases (1 WHO grade I and 3 WHO grade II). Only one single mutation (g.74810C>T, corresponding to p.Gln407Stop in sample 7) showed evidence for functional impairment of NF2 (Table 1). In addition, five known SNPs were found to be polymorphic in our samples (rs13055076, rs2530664, rs140086, rs5763378, and rs79901896). These SNPs were located in intronic regions of NF2 without evidence for functional implications. Discussion Whereas most meningiomas are sporadic, solitary, benign tumors with a good chance for complete surgical resection and relatively optimistic outcome, the prognosis for patients with atypical and anaplastic meningiomas remains less favorable. Genetics of WHO grade I and II meningiomas has been considered to be among the best studied in human tumors (9,26). Recently, the combination of cytogenetic techniques and genome wide high resolution SNP arrays has made it possible to detect a much broader spectrum of chromosomal aberrations than classical cytogenetic techniques alone. For instance, SNP array techniques uniquely allow for genome wide analysis of heterozygosity. Examples include solid tumors and hematological diseases (27e29). Here we present a study of benign and atypical meningiomas employing GTG-banding, SKY, FISH, SNP array, and NF2 gene sequencing. The occurrence of copy neutral LOH and UPD were previously described for different malignancies (27,29e31), suggesting UPD as a possibly important mechanism in tumorigenesis. Previously, in a case of atypical meningioma and a case of multiple meningiomas, we identified segmental UPD in regions 1p31.1, 6q14.1, 10q21.1, and 14q23.3 (21,22). In this study, copy neutral LOH that suggests UPD was enriched in three of these chromosomal regions in comparison with that of the genome wide average. This was observed for tissue samples from benign and atypical meningiomas and matched germline DNA (blood). The enrichment of LOH was higher in samples of meningioma WHO grade II compared with WHO grade I (Table 4). This enrichment appeared to be due to a higher number of LOH blocks as well as higher minimum and median LOH block sizes. With our previous findings (21,22) and additional evidence for constitutional copy neutral LOH on 14q in meningiomas (24), this enrichment corroborates the notion that constitutional segmental UPD in these regions may play a still unknown role in meningioma development. Evidence for the involvement of constitutional segmental UPD also exists for other tumor entities such as breast, prostate, and head and neck carcinomas (32). In paired analyses of tumor tissue and blood from the same patient, we identified somatic segmental UPD regions 4p16.1, 7q31.2, 8p23.2, and 9p22.1 as newly described events in primary meningioma cells. It remains unclear whether these regions play a mechanistic role in meningioma. Possible consequences of segmental UPD are inactivation of tumor suppressor genes or activation of oncogenes by various genetic and epigenetic mechanisms (20). In our data, the flanking of some UPD regions by regions of chromosomal loss or gain suggests that repair mechanisms provide a likely basis for segmental UPD in meningiomas (data not shown). Further investigations are necessary to elucidate the role of segmental UPD in meningiomas. In this study, SNP array analysis detected previously described aberrations. In addition, we detected novel chromosomal imbalances, such as losses of 2p and 7p/q in benign meningiomas, gain of 19p13.12-p12 in an atypical meningioma, and one loss and two gains within chromosome 22 occurring in blood and tumor tissue simultaneously. Loss of 22q is described as a common event in meningioma in general (12). Therefore, at first sight, it may appear conspicuous that we detected loss of 22q in only two cases of WHO grade II meningiomas, described as chordoid and atypical, respectively. However, statistically, the observed 20% of cases with loss of 22q do not fall outside of what would be expected for the given number of samples. The presence of large deletions of 22q correlates with histopathological subtypes of meningiomas: Hansson et al (12) found losses of 22q in only 39% of menigothelial meningiomas compared with 65% and 86% in transitional and fibroblastic subtypes, respectively. In WHO grade I classification, four of five of our meningiomas were of the meningothelial subtype. WHO grade II meningiomas without losses of 22q showed meningothelial differentiation in two of three of our cases. This may further explain the relatively low number of observations of the loss of 22q. On chromosome 22, NF2 is discussed as the major target in meningioma (11). Mutational analysis of NF2 exons 548 revealed mutations in 4 of 10 cases; 1 in WHO grade I and 3 in WHO grade II (Table 1). This finding is in line with mutation frequencies of 30e60% in sporadic meningiomas found in the literature (14). Only one of the detected mutations showed evidence for potential functional impairment of NF2 in the form of a premature stop codon. Interestingly, a correlation of absence of NF2 mutations with meningothelial subtype was described by Hannsson et al (12) and Evans et al (33). None of our meningothelial meningiomas harbored NF2 mutations. This may corroborate the notion that in the meningothelial subtype, tumor mechanisms other than those involving NF2 may be of relevance. Using GTG-banding and SKY, we detected a novel balanced reciprocal translocation t(4;10)(q12;q26) [4/40 metaphase cells] in a benign meningioma (Figure 1A). This may be of mechanistic relevance because balanced translocations are discussed as possible initiation events in various tumor entities (34). The translocation t(4;10)(q12;p11), similar to the t(4;10)(q12;q26) detected by us, was described in a case of myeloproliferative syndrome with hypereosinophilia as a new cytogenetic variant (35). Generally, balanced translocations may result in the formation of gene fusion products with altered biological function. Cancer genes located within the identified breakpoint regions are REST, RASL11B, PDGFRA (4q12) and ADAM12, BNIP3, DMBT1, FGFR2 (10q26) (25,36). Some of these cancer genes have been described specifically for brain tumors. For instance, Schrock et al (37) implicated the REST locus as an amplification site identified in glioma mapped to chromosome 4q12. Recently, we detected a novel paracentric inversion within chromosomal band 1p36 in a case of multiple meningiomas (22). This chromosomal aberration was seen only in the grade II lesion. This led to the question of whether a paracentric inversion within chromosomal region 1p36 might represent a molecular step in the transition from WHO grade I to WHO grade II meningiomas. In the present group of meningiomas, we found this paracentric inversion as a recurrent chromosomal aberration in seven independent patients with meningiomas of WHO grade I or II. Therefore, it may more likely represent an early chromosomal event in the tumorigenesis of meningiomas. In the chromosomal region of the paracentric inversion, the Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology (36) lists 17 entries: MDS2, PAX7, TNFRSF14, ARID1A, PRDM16, RPL22, SDHB, MIB2, CAMTA1, ERFI1, ENO1, MTHFR, PRDM2, CASP9, TP73, EPB41, and ALPL. Five of these genes are described in meningiomas: ENO1, MTHFR, TP73, EPB41, ALPL (14,38). Of these, TP73, EPB41, and ALPL are discussed as meningioma candidate genes (14). The EPB41 protein, which links cell membrane proteins to the cytoskeleton, showed decreased expression (0e80%) in €ller et al (40) described a decrease in meningiomas (39). Mu expression of ALPL (alkaline phosphatase) of 14% in meningiomas (WHO grade I), 46% in meningiomas (WHO grade II), and 29% in meningiomas (WHO grade III). Further research is needed to clarify the exact role of these cancer genes in meningiomas. Taken together, advances in acquiring SNP array data on an increasing number of tumors and matched germline DNA will help to further elucidate the role of UPD in cancer. Further investigations are necessary for better understanding of the genetics of meningiomas. H. Holland et al. Acknowledgments The authors thank Rainer Baran-Schmidt and Karen Freyberg for excellent technical assistance, James Downs for reading the manuscript, and Stephane Goutagny for the NF2 sequencing protocols and primer sequences. This project was supported by the German Federal Ministry for Education and Research by grants no. PtJ-Bio 0315883 to H.H. and H.K. and research grant no. 01KN0702 to P.A., and by grant no. 927000-040 from the Faculty of Medicine, University of Leipzig, to K.M. H.K., M.S., and P.A. were supported by the Leipzig €t Research Center for Civilization Diseases (LIFE, Universita Leipzig). LIFE is funded by means of the European Union, by the European Regional Development Fund (ERFD), the European Social Fund and by means of the Free State of Saxony within the framework of the excellence initiative. References 1. Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol 2007;114:97e109. 2. Rockhill J, Mrugala M, Chamberlain MC. Intracranial meningiomas: an overview of diagnosis and treatment. Neurosurg Focus 2007;23:E1. 3. Rosenberg LA, Prayson RA, Lee J, et al. Long-term experience with World Health Organization grade III (malignant) meningiomas at a single institution. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2009; 74:427e432. 4. Bruna J, Brell M, Ferrer I, et al. Ki-67 proliferative index predicts clinical outcome in patients with atypical or anaplastic meningioma. Neuropathology 2007;27:114e120. 5. Chamberlain MC, Blumenthal DT. Intracranial meningiomas: diagnosis and treatment. 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Anschließend wurden die Ergebnisse an einer Gruppe von 10 Meningeomen (5 WHO Grad 1; 5 WHO Grad 2) bewertet und hierbei weiterführende Informationen gewonnen. Die kombinierte Anwendung von GTG-Bänderung, SKY-Technik und FISH-Analyse konnte das Auftreten der Monosomie 22 als häufigste numerische Aberration in Meningeomen bestätigen. Im multiplen Meningeom stellte sich Monosomie 22 in 14% aller untersuchten Zellen des WHO Grad 1 Tumor und in 34% der Zellen des WHO Grad 2 Tumor dar. Innerhalb der strukturellen Aberrationen ließen sich mit Hilfe der verwendeten zytogenetischen Methoden die Deletion 22q und Deletion 1p als die häufigsten chromosomalen Aberrationen detektieren. Beide Ergebnisse stehen im Konsens zur bisherigen Literatur (12,40). Allerdings fiel auf, dass die Frequenz der Deletion 22q in der Gruppe der 10 untersuchten Tumore relativ gering ausfiel, was sich im SNP-Array bestätigte (in 2 von 10 Tumoren del22q). In einer weiterführenden Sequenzanalyse untersuchten wir deshalb die Tumore auf eine Mutation des NF2-Gens als potentiell inaktiviertes Tumorsuppressorgen auf dem Chromosom 22 (22q12.2). Es ergaben sich 5 detektierbare Mutationen in 4 Tumoren (1 WHO Grad 1 und 3 WHO Grad 2 Tumore). Eine genauere Betrachtung zeigte, dass die nicht von Deletion 22q oder Mutation NF2 betroffenen Tumore 4 Meningeome WHO Grad 29 Zusammenfassung und Ausblick 1 des Subtyps meningothelial und ein WHO Grad 2 Meningeom mit ebenfalls meningothelialem Differenzierungsmuster darstellten. Hansson et al. (29) detektierte eine NF2 Inaktivierung in nur 18% der meningothelialen Meningeome, verglichen mit 52% NF2 Inaktivierung in fibroblastischen Meningeomen. Die Korrelation eines intakten NF2 mit dem meningothelialen Subtyp formulierte auch schon Evans et al. (21). Zusammengenommen liefert dies einen Hinweis auf einen möglichen anderen Tumorgenesemechanismus im meningothelialen Meningeom als die bisher meistens angenommene Inaktivierung des NF2 Tumorsuppressorgens. Deletionen auf dem kurzen Arm von Chromosom 1, insbesondere 1p36, gelten als die häufigste Aberration im Zusammenhang mit der Tumorprogression. Die Detektion mit GTG-Bänderung, SKY-Technik und der lokusspezifischen FISH-Sonde LSI P58/LSI Telomere 1p ergab in WHO Grad 2 Tumoren eine höhere Frequenz von Deletionen auf 1p als in den benignen Tumoren, was der vermuteten Korrelation mit der Tumorprogression entspricht. In diesem Zusammenhang konnten wir zusätzlich eine noch nicht beschriebene parazentrische Inversion im chromosomalen Bereich 1p36 in 3 von 16 Metaphasen im atypischen multiplen Meningeom nachweisen und vermuteten einen möglichen Transitionsschritt vom Grad 1 zum Grad 2 Tumor. Im Zusammenhang mit dem 1p36 Mikrodeletionssyndrom halten Gajecka et al. (25) das Vorliegen einer konstitutionellen parazentrischen Inversion 1p36 als einen chromosomaler Reorganisationsprozesse mit Zwischenschritt innerhalb vorangegangenen und komplexer folgenden interstitiellen Deletionen für wahrscheinlich. Dies gab uns einen Hinweis auf eine mögliche funktionelle Relevanz der parazentrischen Inversion im chromosomalen Bereich 1p36 als Vorstufe zur Deletion 1p36. In der Untersuchung unserer zweiten Meningeomgruppe konnten wir die parazentrische Inversion im chromosomalen Bereich 1p36 in 7 Meningeomen, davon in 4/5 benignen und 30 Zusammenfassung und Ausblick in 3/5 malignen, erneut detektieren. Dies spricht eher für die Beurteilung der parazentrischen Inversion 1p36 als ein früheres Ereignis in der Meningeomformation. In weiterführenden Studien sollte die Beteiligung von möglichen tumorinitiierenden Genen, wie TP73 (tumor protein p73), EPB41 (erythrocyte membrane protein band 4.1) und ALPL (alkaline phosphatase, liver/bone/kidney) in der betroffenen chromosomalen Region weiter untersucht werden. Die zytogenetische Analyse des multiplen Meningeoms ermöglichte die erstmalige Beschreibung eines dizentrischen Chromosomes 4 im benignen Tumor mit 7,5% der untersuchten Zellen und im atypischen Tumor mit 10%. Dass dizentrische Chromosomen im Rahmen einer chromosomalen Instabilität durch Telomerfusion entstehen und zu Deletionen und unbalancierten Translokationen führen können, beschrieb Sawyer et al. (58) schon für das Chromosom 1 in Meningeomen. Um die Bedeutung dieses Fundes beurteilen zu können, sind weitere Untersuchungen notwendig. Eine bisher nicht beschriebene reziproke Translokation t(4;10)(q12;q26) konnten in 4/40 Metaphasen eines benignen Meningeoms identifiziert werden. Im SNP-Array zeigten sich keine chromosomalen Imbalancen in den Bruchpunktregionen, was auf eine balancierte Translokation hinweist. Die mögliche Konsequenz einer Genfusion als tumorinitiierendes Ereignis wird bei einer Reihe von Tumorentitäten vermutet (47). Eine fast identische Translokation fand sich schon im Rahmen eines Myeloproliferativen Syndroms mit Hypereosinophilie als neue zytogenetische Variante (34). Unter den Genen in den Bruchpunktregionen, die als möglicherweise mit Malignomen assoziiert gelten, wurde beispielsweise der REST Locus (4q12) als amplifiziert in Gliomen beschrieben (1,59). Ein Vorteil der Zytogenetik zeigt sich in der Identifizierbarkeit von chromosomalen Aberrationen, die nur in einem Teil der Tumorzellen klonal vorliegen. Die Betrachtung des Chromosomensatzes auf Einzelzellbasis ist zwar sehr aufwendig, erbringt jedoch wichtige Hinweise auf potentiell tumorrelevante genetische Ereignisse. 31 Zusammenfassung und Ausblick Die molekulargenetische Technik des SNP-Array ermöglicht es, zytogenetische Ergebnisse wie Deletionen zu bestätigen oder, wie im Fall der Translokation, weitere Hinweise auf chromosomale Imbalanzen zu erlangen. Das hohe Auflösungsvermögen erlaubt die Analyse sehr kleiner Bereiche, bei der wir 3 noch nicht bekannte Deletionen in benignen Meningeomen und 1 neuen Locus mit Zugewinn genetischen Materials („Gain“) im atypischen Meningeom identifizierten. Weiterhin konnten wir durch die simultane Analyse von Blut- und Tumor-DNA der Patienten konstitutionelle Aberrationen, wie 2 Gains und 1 Deletion im Bereich 22q, detektieren. Interessanterweise wurden diese Aberrationen für Patienten mit Mikrodeletions/ Duplikationssyndrom 22q11 (assoziiert mit DiGeorge/ velo-cardio-faziales Syndrom) beschrieben. Bedingt durch die unvollständige Penetranz zeigt sich eine klinische Ausprägung des Syndromkomplexes von vollständiger Asymptomatik bis hin zu schweren Entwicklungsstörungen mit Dysmorphien (16,19,24). Dabei ist ein gehäuftes Auftreten von Tumoren wie das B-Zell-Lymphom, Hepatoblastom und Neuroblastom (Xanthoastrozytom) bekannt. im Kürzlich Rahmen wurde des erstmals DiGeorge/ auch ein ZNS velo-cardio-faziales Tumor Syndroms beschrieben (18,50). Obwohl keiner unserer Patienten klinischen Anlass zu einer genetischen Untersuchung hinsichtlich ererbter Krankheiten gab, fiel bei einem Meningeompatienten mit konstitutioneller Mikroduplikation 22q11 eine schwere Intelligenzminderung als Nebendiagnose auf. Aufgrund des Todes des Patienten im Februar 2009 war eine weiterführende humangenetische Analyse jedoch nicht möglich. Ob das Vorliegen einer tumorprädisponierender Mikroduplikation Auswirkung ist, 22q11 oder ein Syndrom vielleicht nur mit einen eventuell benignen Polymorphismus darstellt, ist noch nicht abschließend geklärt (16). Ein Schwerpunkt im Rahmen der Anwendung des SNP-Arrays zur Analyse von Meningeomen unterschiedlicher histologischer Grade lag auf der Identifizierung potentieller rekurrenter segmentaler UPD-Regionen. Unsere Arbeitsgruppe konnte schon 32 Zusammenfassung und Ausblick bei der Charakterisierung eines atypischen Meningeoms mit 100K-SNP-Array auffällige Regionen mit Hinweis auf eine segmentale Uniparentale Disomie beschreiben (38). Auffälligkeiten in vier dieser Regionen (1p31.1, 6q14.1, 10q21.1 und 14q 23.3) konnten im Fall des multiplen Meningioms in Blut- und Tumor-DNA erneut detektiert werden und könnten einen Hinweis auf mögliche Auswirkungen kleiner, konstitutioneller UPDRegionen auf die Tumorgenese darstellen. Mit der Anwendung der 6.0 SNP-Array Analyse standen uns bei der aus 10 Meningeomen bestehenden Gruppe eine verbesserte Auflösung durch eine deutlich höhere Markerdichte (circa 900,000 Marker, verglichen mit 100,000 beim 100K Array) und verbesserte Auswertungsmöglichkeiten der Software (Genotyping Console 4.0 und Partek Genomics Suite 6.5) zur Verfügung. Wir identifizierten kopienneutrale Regionen mit Verlust von Heterozygotie über das gesamte Genom hinweg, die sowohl im Blut als auch im Tumor der Patienten auftraten. Diese Betrachtung von Blut und Tumor eines Patienten entspricht einer ungepaarten Analyse von kopienneutralen LOH-Regionen. Zur Prüfung der Ergebnisse unserer vorherigen Untersuchungen führten wir eine Anreicherungsanalyse durch: Es zeigte sich ein signifikant höherer prozentualer Anteil kopienneutraler Verluste von Heterozygotie (LOH) in drei der vier rekurrenten Regionen im Vergleich zur Häufigkeit von LOH im gesamten Genom in Blut- und Tumor-DNA der Patienten. Dabei fiel ebenfalls ein weiterer Anstieg von kopienneutralen LOH in den ausgewählten Regionen in WHO Grad 2 Tumoren verglichen mit WHO Grad 1 Tumoren auf, während über das gesamte Genom hinweg die Frequenzen der kopienneutralen LOH-Regionen vergleichbar waren. Der Verdacht einer bisher nicht vollständig bekannten Rolle konstitutioneller segmentaler UPD Regionen in der Tumorgenese wird durch die Beschreibung vermehrter konstitutioneller Homozygotie für andere solide Tumorentitäten gestützt (2,4). Auch Makishima et al. (44) vermuten eine mögliche Prädisposition für Neoplasien durch konstitutionelle UPD-Regionen. 33 Zusammenfassung und Ausblick Im Unterschied zur ungepaarten Analyse zeigt die gepaarte Analyse nur Unterschiede in der Tumor-DNA verglichen mit der DNA aus dem Blut des jeweiligen Patienten. Dies ermöglichte die Beschreibung potenzieller somatischer segmentaler UPD für Meningeome in den chromosomalen Regionen 4p16.1, 7q31.2, 8p23.2 und 9p22.1. Die Klärung der Funktion der segmentalen UPD hinsichtlich ihrer Rolle bei Tumorgenese und –progression bleibt eine Herausforderung für die Zukunft und könnte unser Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen wesentlich erweitern. Die vorliegende Arbeit konnte wesentliche Vorteile der Kombination klassischer zytogenetischer Methoden mit dem molekulargenetischen Ansatz des hochauflösenden SNP-Array aufzeigen. Diese vergleichenden Analysen ermöglichten eine detailreiche Beschreibung der untersuchten Meningeome und konnten für diese Tumorentität noch nicht beschriebene chromosomale Veränderungen aufzeigen. Für weiterführende Analysen hinsichtlich der Bedeutung von rekurrenten segmentalen Regionen Uniparentaler zusammengestellt und Disomie der wird derzeit Schwerpunkt um eine größere Meningeomgruppe molekulargenetische Daten zur Genexpressionsanalyse erweitert. Zyto- und molekulargenetische Untersuchungen in weiteren Tumorentitäten, wie Medulloblastomen und Astrozytomen, liefern Informationen zu tumorspezifischen wie auch tumorübergreifenden Aberrationen und sollen die Rolle der Uniparentalen Disomie weiter aufklären. Zusätzlich erfolgt in Kooperation mit der Universität Heidelberg die Analyse TRAIL-induzierter Apoptose in einer größeren Gruppe von Meningeomen, um weiterführende Informationen zu potenziellen neuen Therapieoptionen für diese Tumore zu erhalten. Perspektivisch könnten sich durch vergleichende Untersuchungen zur Tumorgenese und – progression neue Ansatzpunkte für verbesserte therapeutische Strategien und adjuvante Therapiemöglichkeiten mit Einfluss auf das Rezidivverhalten der Meningeome ergeben. 34 Referenzen 4. Referenzen 1. Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology. Verfügbar unter: http://AtlasGeneticsOncology.org Zugriff am: 05.10.2010. 2. Assie G, LaFramboise T, Platzer P, et al. Frequency of germline genomic homozygosity associated with cancer cases. JAMA 2008;299:1437-1445. 3. Asthagiri AR, Parry DM, Butman JA, et al. Neurofibromatosis type 2. Lancet 2009;373:1974-1986. 4. Bacolod MD, Schemmann GS, Giardina SF, et al. Emerging paradigms in cancer genetics: some important findings from high-density single nucleotide polymorphism array studies. Cancer Res 2009;69:723-727. 5. Bayani J, Pandita A, Squire JA. Molecular cytogenetic analysis in the study of brain tumors: findings and applications. 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High-resolution genomic copy number profiling of glioblastoma multiforme by single nucleotide polymorphism DNA microarray. Mol Cancer Res 2009;7:665-677. 39 Anlagen 5. Anlagen 40 Anlagen 5.2 Spezifizierung des eigenen Anteils an der Arbeit Veröffentlichung 1 „Multiple meningioma with different grades of malignancy: Case report with genetic analysis applying single-nucleotide polymorphism array and classical cytogenetics“ Bei der Untersuchung des multiplen Meningeoms lernte ich zunächst alle Arbeitsschritte und Präparationstechniken zur zytogenetischen Analyse eines Tumors kennen. Ich erlernte die Metaphasepräparation, GTG-Bänderungstechnik und FISH-Technik laut den Standardprotokollen und führte alle Präparationsschritte nach kurzer Zeit selbstständig durch. Die Analyse und Auswertung der Ergebnisse verlangt viel Erfahrung, so dass ich hier zunächst unter Aufsicht arbeitete. In den Umgang mit der Auswertung der SNP-Array Daten wurde ich eingewiesen. Nach einer umfassenden Recherche über Meningeome im Allgemeinen und multiple Meningeome im Speziellen konnte ich die Einleitung für die Veröffentlichung schreiben und beschäftigte mich anschließend intensiv mit dem Material- und Methodenteil. Im Besonderen fasste ich die klinischen Patientendaten und die Patientenhistorie in Kooperation mit dem betreuenden Neurochirurgen zusammen. Die Zusammenstellung der Ergebnisse erfolgte gemeinsam mit den Mitgliedern der Arbeitsgruppe und innerhalb der Diskussion beschäftigte ich mich vor allem mit den de novo Befunden der parazentrischen Inversion 1p36 und den segmentalen UPD Regionen. Ich erlernte den Umgang mit Referenzen und konnte diese selbstständig verwalten und einbauen, anschließend führte ich den Einreichungsprozess unter Anleitung durch. Veröffentlichung 2 „High resolution genomic profiling and classical cytogenetics in a group of benign and atypical meningiomas“ In den Arbeiten zur Meningeomgruppe bestehend aus 10 Tumoren stand zunächst die Kultur der Tumorzellen im Vordergrund. Ich begleitete die Anzucht und deren tägliche Kontrolle, sowie den Mediumswechsel und die Umsetzung der Kulturen. Die anschließenden Präparationen konnte ich selbstständig durchführen. Neu erlernte ich die SKY-Technik als weitere Möglichkeit, mittels fluoreszenzmarkierter Sonden Chromosomen 42 Anlagen auf Einzelzellbasis zu analysieren. Die Auswertung der zytogenetischen Untersuchungen führte ich selbstständig aus, es erfolgte eine Überprüfung sowie die genaue Bruchpunktanalyse der Befunde durch meine Mitbetreuerin. Weiterhin asservierte ich in Zusammenarbeit mit der Neurochirurgie die Blutproben der Patienten. Für die Untersuchung mittels SNP-Array extrahierte ich aus allen Blut- und Tumorproben die DNA und bereitete sie für den Versand vor. Die gewonnenen Daten des SNP-Arrays analysierte ich mit der GTYPE 4.0 Software und stellte gemeinsam mit Mitgliedern der Arbeitsgruppe die Ergebnisse zusammen, um diese dann zu diskutieren. Für die Veröffentlichung schrieb ich die Einleitung und stellte in Kooperation mit dem betreuenden Neurochirurgen die Patientendaten zusammen. In der Zusammenstellung der zytogenetischen Resultate arbeitete ich mit meiner Mitbetreuerin gemeinsam am Ergebnisteil und konzentrierte mich bei der Diskussion vor allem auf die konstitutionellen Aberrationen (Chromosom 22) sowie die molekulargenetischen Ergebnisse (segmentale UPD Regionen). Ich formatierte den Text und die Referenzen selbstständig und reichte die Veröffentlichung ein. 43 Anlagen 44 Anlagen 5.3 Lebenslauf Name: Kristin Mocker Anschrift im Heimatort: Schneewittchenweg 6 01936 Königsbrück Anschrift im Studienort: Reichpietschstraße 3 04317 Leipzig Telefon: 0177/7779131 E-mail: [email protected] Geburtsdatum: 25.01.1988 Geburtsort: Räckelwitz Eltern: Stefan Mocker, Diplom-Ingenieur Grit Mocker, geborene Knothe, Diplom-Ingenieurin Bildung: 1994-1998: Juri-Gagarin Grundschule, Königsbrück 1998-2006: Gotthold-EphraimLessinggymnasium, Kamenz Seit Oktober 2006: Medizinstudium Universität Leipzig Oktober 2009- März 2010: Urlaubssemester im Rahmen einer experimentellen Doktorarbeit (Promotionsstipendium) Abschlüsse: Abitur im Juni 2006 (1,3) Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung im August 2008 (1,5) 45 Anlagen Praktika: Sonstiges: 01.-29. September 2006 und 26. Februar-28. März 2007 Krankenpflegedienst im Malteser Krankenhaus St. Johannes in Kamenz 20. August- 21. September 2007 Krankenpflegedienst Universitätsklinikum Leipzig 23. Februar- 30. März 2009 Famulatur Universitätsklinikum Leipzig, Klinik und Poliklinik für Neurochirurgie 20. Juli- 20. August 2009 Famulatur bei Allgemeinmediziner Dr. Engelstädter in Königsbrück 19. Juli-18. August 2010 Famulatur Innere Medizin Gebhardt Wieland in Altenburg 07. Februar-21. Februar 2011 und 14. März-28. März 2011 Famulatur Universitätsklinikum Leipzig, Universitätsfrauenklinik Seit Februar 2009 Stipendiatin der Studienstiftung des deutschen Volkes Leipzig, den 08.02.2012 Kristin Mocker 46 Anlagen 5.4 Wissenschaftliche Tätigkeit Veröffentlichungen V-I Mocker K*, Holland H*, Ahnert A, Schober R, Bauer M, Kirsten H, Koschny R, Meixensberger J, Krupp W (2011): Multiple meningioma with different grades of malignancy: case report with genetic analysis applying single-nucleotide polymorphism array and classical cytogenetics Path Res Prac 207: 67-72 (IF:1,219) * Geteilte Erstautorenschaft V-II Holland H*, Mocker K*, Ahnert P, Koschny R, Bauer M, Schober R, Kirsten H, Meixensberger J, Krupp W (2011): High- resolution genomic profiling and classical cytogenetics in a group of benign and atypical meningiomas Cancer Genet 204: 541-549 (IF:1,537) * Geteilte Erstautorenschaft Vorträge VT-I Holland H, Mocker K, Ahnert P, Schober R, Bauer M, Kirsten H, Koschny R, Meixensberger J, Krupp W (2010) Multiples Meningeom, WHO Grad I+II: Fallbericht mittels SNP-A Karyotypisierung und klassischer Zytogenetik 23. Tumorzytogenetische Arbeitstagung Bergisch-Gladbach, 15.-17. April 2010 VT-II Schober R, Holland H, Ahnert P, Kirsten H, Hoffmann K-T, Mocker K, Krupp W (2010) Correlation of neuropathological, neuroradiological, cytogenetic and SNP–array data in a case of multiple meningiomas with different grades of malignancy Neurowoche Mannheim, 21.-25. September 2010 VT-III Schober R, Holland H, Ahnert P, Mocker K, Hoffmann K-T, Krupp W, Meixensberger J (2011) Correlation of Morphology, Cytogenetics, and High-Resolution Genomic Profiling in a Group of Benign and Atypical Meningiomas Experimental Biology Washington, 09.-13. April 2011 (USA) VT-IV Holland H, Mocker K, Ahnert P, Bauer M, Schober R, Kirsten H, Meixensberger J, Krupp W (2011) High- resolution genomic profiling and classical cytogenetics in a group of benign and atypical meningiomas 24. Tumorzytogenetische Arbeitstagung Bad Ischl, 16.-18. Juni 2011 (Österreich) 47 Anlagen Poster P-I Mocker K*, Holland H*, Ahnert P, Schober R, Bauer M, Kirsten H, Koschny, Meixensberger J, Krupp W (2010) Multiple meningioma with different grades of malignancy: case report with genetic analysis applying single-nucleotide polymorphism array and classical cytogenetics 21. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik Hamburg, 02.- 04. März 2010 * Geteilte Erstautorenschaft P-II Mocker K (2010) Multiple meningioma with different grades of malignancy: case report with genetic analysis applying single-nucleotide polymorphism array and classical cytogenetics 9 th Leipzig Research Festival for Life Sciences 2010 Leipzig, 17. Dezember 2010 P-III Holland H*, Mocker K*, Ahnert P, Koschny R, Bauer M, Schober R, Kirsten H, Meixensberger J, Krupp W (2011) High- resolution genomic profiling and classical cytogenetics in patients with benign or atypical meningiomas 22. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik Regensburg, 16.- 18. März 2011 * Geteilte Erstautorenschaft P-IV Mocker K*, Holland H*, Ahnert P, Koschny R, Bauer M, Schober R, Scholz M, Kirsten H, Meixensberger J, Krupp W (2011) High- resolution genomic profiling and classical cytogenetics in a group of benign and atypical meningiomas Brain Tumor 2011 – Symposium Berlin, 16.-17. Juni 2011 * Geteilte Erstautorenschaft 48 Anlagen 5.5 Danksagung Mein Dank gilt Herrn Professor Meixensberger für die Überlassung des Themas, sein stetes Interesse an dieser Thematik, sowie seine Unterstützung beim Verfassen von Publikationen und der Promotionsschrift. Herrn PD Dr. Krupp danke ich für die neuroonkologische Beratung und Einführung in dieses Fachgebiet sowie seine ausgezeichnete Betreuung. Frau Dr. Holland danke ich für die Einführung in die Zytogenetik und ihre stete Unterstützung sowohl in wissenschaftlicher, technischer als auch in persönlicher Hinsicht. Herrn Dr. Kirsten danke ich für seine Unterstützung in allen analytischen und technischen Fragen, seine große Hilfsbereitschaft und Geduld. Herrn Dr. Ahnert danke ich sehr für seine freundliche Unterstützung und die kompetente Einführung in die Thematik der SNP-A Karyotypisierung. Allen bisher genannten Personen möchte ich für ihre Mitarbeit an den Veröffentlichungen und den konstruktiven Anregungen zur Bewältigung der Promotionsschrift danken. Die neuropathologische Klassifikation und die Bereitstellung der histopathologischen Abbildungen verdanke ich Herrn Prof. Dr. em. Schober und Herrn Dr. Bauer. Ich danke ihnen für die Erläuterungen zu diesem Fachgebiet. Frau Hantmann, Frau Freyberg und Herrn Baran-Schmidt danke ich für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung. Bedanken möchte ich mich bei Frau Burkhardt, Herrn Wilke und Frau Quente für ständige Hilfsbereitschaft bei allen aufkommenden Fragen. Im Besonderen gilt mein Dank der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig, die die Arbeit mit einem Promotionsstipendium unterstützte. Desweiteren bedanke ich mich bei meinen Großeltern, Eltern und Geschwistern sowie vor allem bei Robert für die andauernde Unterstützung, das Vertrauen und die Geduld. 49