Rekrutierung von adulten neuronalen Stammzellen aus

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Aus dem Zentrum für Neuropathologie und Prionforschung der LudwigMaximilians-Universität München
Leitung: Prof. Dr, Armin Giese
Rekrutierung von adulten neuronalen Stammzellen aus
zirkumventrikulären Organen nach Gehirninfarkt
Dissertation
zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin
an der Medizinischen Fakultät der
Ludwigs-Maximilians-Universität zu München
vorgelegt von Veronika Sanin
Bozen
2014
1
Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät
der Universität München
Berichterstatter: Priv. Doz. Dr. Ulrich Schüller
Mitberichterstatter: Prof. Dr. Rainer Glaß, Priv. Doz. Dr. Siegfried Kösel
Mitbetreuung durch den
promovierten Mitarbeiter:
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. M. Reiser, FACR, FRCR
Tag der mündlichen Prüfung: 15.05.2014
2
Meinen Eltern in Dankbarkeit!
3
Wesentliche Teile dieser Arbeit wurden publiziert unter:
Sanin V., Heeß C. Kretzschmar H., Schüller U.
Recruitment of neural precursor cells from circumventricular organs of
patients with cerebral ischemia.
Neuropathol Appl Neurobiol, August 2013
4
Inhaltsverzeichnis ............................................................................................... 5
1
Einleitung: Neuronale Stammzellen................................................................. 8
1.1
Die Entdeckung von adulten neuronalen Stammzellen (NSZ) ..................... 8
1.2
Bekannte Regionen adulter Neurogenese ................................................... 9
1.3
Funktionen adulter Neurogenese ............................................................... 10
1.4
Adulte neuronale Stammzellen................................................................... 12
1.5
Neuronale Stammzellen in zirkumventrikulären Organen .......................... 13
1.6
Die zirkumventrikulären Organe: ................................................................ 14
1.6.1
Area postrema..................................................................................... 16
1.6.2
Eminentia mediana ............................................................................. 17
1.6.3
Epiphyse ............................................................................................. 18
1.6.4
Neurohypophyse ................................................................................. 19
1.6.5
Organum vasculosum der Lamina terminalis (OVLT) ......................... 19
1.6.6
Organum subcommissurale ................................................................ 20
1.6.7
Organum subfornicale ......................................................................... 20
1.7
Pathologie und Neurogenese nach Gehirninfarkt ....................................... 21
2
Erläuterung der Fragestellung ....................................................................... 23
3
Methodik: ......................................................................................................... 24
3.1
Patientenkollektiv ....................................................................................... 24
3.2
Angewendete Schnittführung bei der Sektion ............................................ 25
3.3
Asservierung von Gewebe ......................................................................... 26
5
3.4
Immunhistochemie ..................................................................................... 26
3.4.1
Allgemeines......................................................................................... 26
3.4.2
Beschreibung der verwendeten Primärantikörper ............................... 27
3.4.3
Erläuterung des verwendeten Verfahrens der Einzelfärbung mittels
3,3’- Diaminobenzidin (DAB)- Markierung ........................................... 31
3.4.4
Erläuterung des verwendeten Verfahrens der Doppelfärbung mittels
Fluoreszenzmarkierung ....................................................................... 34
3.5
4
Quantifikation und Statistik ......................................................................... 36
Ergebnisse: Vergleich Gesund versus Infarkt .............................................. 37
4.1
Einzelfärbungen ......................................................................................... 37
4.1.1
Area postrema..................................................................................... 38
4.1.2
Eminentia mediana ............................................................................. 44
4.1.3
Epiphyse ............................................................................................. 51
4.1.4
Neurohypophyse ................................................................................. 57
4.2
Doppelfärbungen ........................................................................................ 64
4.3
Area postrema ............................................................................................ 65
4.3.1
Eminentia mediana ............................................................................. 66
4.3.2
Epiphyse ............................................................................................. 67
4.3.3
Neurohypophyse ................................................................................. 68
4.4
5
5.1
Statistische Auswertung ............................................................................. 69
Diskussion ....................................................................................................... 73
Diskussion der Methoden ........................................................................... 73
6
5.2
Diskussion der Ergebnisse ......................................................................... 74
5.3
Zusammenfassung ..................................................................................... 80
6
Anhang ............................................................................................................. 81
7
Literaturverzeichnis ........................................................................................ 85
8
Danksagung ..................................................................................................... 91
7
1
Einleitung: Neuronale Stammzellen
1.1 Die Entdeckung von adulten neuronalen Stammzellen (NSZ)
Lange Zeit nahm man an, dass im adulten Gehirn keine neuen Neuronen entstehen
können und somit Neuronen nicht kontinuierlich ersetzt werden. Das menschliche
Gehirn galt als nicht regeneratives Organ.
Die Forschungsergebnisse der letzten Jahre haben jedoch gezeigt, dass auch im
adulten Gehirn Stammzellen existieren, die proliferieren und sich in Neuronen und
Gliazellen differenzieren können. Die Entdeckung der adulten Neurogenese, die
Neubildung von Nervenzellen im erwachsenen Gehirn, überholt ein jahrhunderte altes Dogma und zeigt neue Perspektiven der zerebralen Plastizität auf.
Die Erstbeschreibung potentieller Stammzellen erfolgte 1965 durch Joseph Altman,
indem er mit radioaktiv markiertem Thymidin sich teilende Zellen im Gyrus dentatus
des Hippocampus nachwies.[1] Diese Entdeckung widerlegte alle bis zu diesem
Zeitpunkt bekannten Auffassungen. Demnach ist das menschliche Gehirn keine rein
statische Struktur. Es generiert lebenslang neue Neuronen und Gliazellen. [1-4]
15 Jahre später wurde Altmans Pionierarbeit von Kaplan bestätigt. Mittels neuer
elektronenmikroskopischer Techniken konnte Kaplan die radioaktiv markierten Zellen
durch ultrastrukturell-morphologische Eigenschaften als Neuronen identifizieren. [5]
Die funktionelle Integration von neugebildeten Neuronen ins zentrale Nervensystem
(ZNS) wurde erstmals von Paton und Nottebohm an Singvögeln gezeigt. [6]
Eine weitere fundamentale Veränderung im Hinblick auf die Regenerationsfähigkeit
des Gehirns erfolgte, als die adulte Neurogenese in den frühen 1990er Jahren durch
die Einführung der Bromdesoxyuridin (BrdU)-Kennzeichnung wiederentdeckt wurde.
Damit konnten markierte Zellen immunhistochemisch typisiert werden. Mittels BrdUInjektionen gelang Errikson et al. 1998 der Nachweis von proliferierenden Zellen im
adulten humanen Hippocampus [7]. Seither gilt die immunhistochemische Detektion
von BrdU- positiven Zellen als Nachweis für zelluläre Proliferation.
8
Zahlreiche Studien konnten im Laufe der kommenden Jahre mehrere proliferative
Zonen im ZNS identifizieren. Amygdala [8], Neocortex [9, 10] oder Striatum [11]
werden als mögliche Stammzellnischen diskutiert. Dennoch handelt es sich bei der
subventrikulären Zone (SVZ) des lateralen Ventrikels und der Subgranularzone
(SGZ) des Gyrus dentatus im Hippocampus um die zwei prominentesten und meist
erforschten germinalen Zonen. [12]
Die Erforschung und Entdeckung von adulten neuronalen Stammzellen im humanen
zentralen Nervensystem, veränderte die bisherige Auffassung über zerebrale
Plastizität und bildet heute die Grundlage für die Erforschung neuer regenerativer
Therapieverfahren.
1.2 Bekannte Regionen adulter Neurogenese
Die Selbsterneuerung von Stammzellen oder die Differenzierung von Vorläuferzellen
wird durch eine charakteristische Mikroumgebung oder Nische reguliert. Diese
Nischen zeichnen sich durch spezielle lösliche Faktoren, membrangebundene
Proteine und extrazelluläre Matrix aus. [13] Stamm- oder Vorläuferzellen besitzen
zwar das Potential, sich in Neurone oder Gliazellen zu differenzieren, zur Umsetzung
bedarf es allerdings Signale aus der zellulären Umgebung. Stammzellnischen
beherbergen Vorläuferzellen, steuern ihre Differenzierung und werden durch
zahlreiche Triggerfaktoren beeinflusst.
Heterotope Transplantationsexperimente implizieren, dass die neurogene Aktivität
von adulten Stammzellen weitgehend von ihrer extrazellulären Umgebung abhängt.
[14] Im adulten humanen Gehirn wurden insbesondere zwei Nischen erforscht und
als neurogene Stammzellnischen identifiziert: die Subventrikularzone des lateralen
Ventrikels (SVZ) und die Subgranularzone des Gyrus dentatus im Hippocampus
(SGZ). In diesen zwei neurogenen Regionen werden von lokalen Stammzellen
physiologischerweise neue Neuronen gebildet.
9
Die neu generierten Neuroblasten wandern von der SVZ des lateralen Ventrikels
oder der SGZ des Gyrus dentatus über die rostrale Migrationszone (rostral migratory
Stream, RMS) in den Bulbus olfaktorius, wo sie als Interneurone das olfaktorische
Netzwerk komplettieren. [15, 16] Zudem fügen sich Neurone aus der SGZ in die
Körnerzellschicht des Gyrus dentatus im Hippocampus ein und tragen zum Erhalt
von Gedächtnisleistung und Lernfähigkeit bei. [2, 16]
Durch endogene Neurogenese werden bestimmte Zellgruppen zeitlebens ersetzt.
Dadurch
wird
die
Aufrechterhaltung
eines
funktionell
gesunden
Gehirns
gewährleistet.
1.3 Funktionen adulter Neurogenese
Adulte Neurogenese ist ein lebenslanger Prozess, bei dem funktionelle Neuronen
aus adulten Vorläuferzellen generiert werden.[17]
Es handelt sich um einen mehrstufigen Prozess, der sich in Proliferation,
Differenzierung, Migration, Bestimmung des Zielortes und Synapsenausbildung
gliedert und mit der Formation eines postmitotischen, funktionell integrierten Neurons
endet. [18]
Adulte
Neurogenese
beschreibt
einen
dynamischen
Prozess,
der
durch
physiologische, pathologische und pharmakologische Stimuli gesteuert wird. So wird
z. B. in der SVZ die Zellproliferation durch physische Aktivität gesteigert. [19] Im
Kontrast dazu lässt sich im Alter eine deutliche Reduzierung neuronaler
Teilungsaktivität nachweisen. [20]
10
Neuronale Stammzellen befinden sich in spezialisierten germinalen Zellschichten, wo
sie mit anderen Zelltypen über zytochemische Signalwege interagieren und somit die
Neuro- und Gliogenese steuern. Klassische Entwicklungssignale wie Notch, BMPs
(Bone Morphogenetic Protein), Eph/ephrins, Noggin und Shh (Sonic hedgehog)
scheinen eine wesentliche Rolle in der Aufrechterhaltung neurogener Nischen zu
spielen. [13] Neurogene Nischen werden von einem dichten Gefäßnetz durchzogen,
wodurch Signale wie Zytokine oder Wachstumsfaktoren aus dem Blutstrom die
Vorläuferzellen erreichen können.
Die gute Vaskularisierung ermöglicht, beispielsweise nach einem Hirninfarkt, die
Migration von neugebildeten Neuronen in das Striatum. [21] Zudem formen
Astrozyten einen strukturellen Teil der neurogenen Nischen und exprimieren
Moleküle, die wesentlich für die adulte Neurogenese in vivo sind. [22]
Bisher beschränkte sich die Erforschung von adulter Neurogenese auf die zwei
bekannten Vorderhirnregionen: die SVZ im lateralen Ventrikel und die SGZ im
Hippocampus. In anderen Hirnregionen erscheint sie unter physiologischen
Bedingungen limitiert, kann aber durch Pathologien, wie beispielsweise ein
Infarktgeschehen, induziert werden. [3] Fokale oder globale Ischämien gelten als
potente Induktoren der Neuro-und Gliogenese. [23]
Jede einzelne Phase der Neurogenese kann über externe und interne Stimuli
reguliert werden. Jeder Stimulus verfolgt ein spezielles Ziel und wird wiederum von
anderen Faktoren beeinflusst. Das komplexe Wechselspiel verschiedenster Faktoren
beeinflusst
die
neurogene
Aktivität
und
letztendlich
das
Ausmaß
adulter
Neurogenese. Durch weitere spezielle molekulare Studien ließe sich die funktionelle
Neurogenese entschlüsseln und möglicherweise für regenerative Therapieverfahren
nutzbar machen.
11
1.4 Adulte neuronale Stammzellen
Eine Stammzelle ist noch nicht darauf festgelegt, sich in einen spezifischen Zelltyp
mit genau definierter Funktion zu entwickeln. Stammzellen teilen sich kontinuierlich
und produzieren dabei entweder zwei neue Stammzellen (symmetrische Teilung)
oder aber eine Tochterzelle (asymmetrische Teilung), die sich in verschiedenste
Zelltypen differenzieren kann. Eine neuronale Stammzelle wird als multipotent
bezeichnet, da aus einer einzigen Stammzelle viele verschiedene Zellpopulationen
hervorgehen können.
Stammzellen definieren sich funktionell über zwei spezifische Charakteristika: die
Fähigkeit zur Selbsterneuerung und die Fähigkeit, sich zu neuen spezialisierten
Zelltypen zu differenzieren.
Neuronale Stammzellen sind multipotent und bilden das Fundament menschlicher
Gehirnentwicklung. Multipotent bedeutet in diesem Zusammenhang die Fähigkeit,
Neurone, Astrozyten und Oligodendrozyten hervorbringen zu können. Eine
Vorläuferzelle bezeichnet jenen Zelltyp, der aus einer multipotenten Stammzelle
hervorgegangen ist. Vorläuferzellen sind unipotent, aber dennoch teilungsfähig und
werden häufig als Blasten bezeichnet. Durch zahlreiche Studien konnte gezeigt
werden, dass auch postnatal neuronale Stammzellen in speziellen Nischen
persistieren und das Potential zur Selbsterneuerung beibehalten. Radiale Gliazellen
des Gyrus dentatus und Subpopulationen von Astrogliazellen der SVZ im lateralen
Ventrikel wurden als multipotente Stammzellen identifiziert. [24-27]
Bei den erforschten adulten neuronalen Stammzellen handelt es sich um eine
heterogene Gruppe. So generieren radiale Gliazellen aus der SVZ, abhängig von
ihrer rostrokaudalen Lokalisation, verschiedene Subtypen von Interneuronen, die für
den Bulbus olfaktorius bestimmt sind. [28] Jedoch gibt es auch andere Hirnregionen
mit proliferierenden Vorläuferzellen, die sich zu Oligodendrozyten oder Astrozyten
differenzieren. [29]
12
Die Forschungsergebnisse der letzten Jahre zeigen, dass radiale Gliazellen als
Vorläufer für Neuronen fungieren und strukturelle sowie funktionelle Eigenschaften
von Astrozyten aufweisen, wodurch sie auch als germinale Astrozyten bezeichnet
werden. [30] Diese Zellen zeichnen sich immunhistochemisch durch die Expression
von speziellen Intermediärfilamenten wie z. B. Nestin, GFAP, Vimentin und nukleären
Faktoren wie Ki67, OLIG2 oder PSA-NCAM aus.
Die Heterogenität und das Fehlen von validen Stammzellmarkern erschwert ihre
Detektion und sollte bei der kritischen Beurteilung von Forschungsergebnissen mit
berücksichtigt werden.
1.5 Neuronale Stammzellen in zirkumventrikulären Organen
2009 wurden in den zirkumventrikulären Organen von erwachsenen Nagetieren
Zellen identifiziert, die Eigenschaften von neuronalen Stammzellen aufweisen. Ein
direkter Vergleich mit Zellen aus der SVZ bestätigte, dass auch in den ZVO
potentielle Vorläuferzellen vorhanden sind. Zudem wurde mittels in vitro Studien an
Zellkulturen gezeigt, dass die soeben genannten Zellen proliferatives Potential
besitzen und sich in Neuronen und Gliazellen differenzieren können. [31]
2010
wurden
am
Mausmodell
potentielle
neuronale
Stammzellen
aus
zirkumventrikulären Organen entnommen und in die SVZ transplantiert. Die
entnommenen Zellen entwickelten sich in vivo zu Zellen mit neuronalem Phänotyp
und migrierten mit SVZ-Zellen in den Bulbus olfaktorius. Bei den isolierten Zellen
handelte es sich in situ um Astrozyten. Sobald diese in eine neurogene Nische
platziert wurden, fungierten sie als Vorläuferzellen und begannen, neuronale
Zelltypen zu generieren. [32] Damit wurden erstmals potentielle neuronale
Stammzellen aus ZVO von adulten Mäusen isoliert und identifiziert.
13
1.6 Die zirkumventrikulären Organe:
Abbildung 1: Lokalisation der ZVO [34]
1: Organum subfornicale; 2: Organum vasculosum der Lamina terminalis; 3: Eminentia mediana +
Neurohypophyse; 4: Epiphyse; 5: Organum subcommissurale; 6: Area postrema
Zu den zirkumventrikulären Organen zählen: Organum subfornicale, Organum
vasculosum der Lamina terminalis, Eminentia mediana, Neurohypophyse, Organum
subcomissurale, Area postrema und Plexus choroideus.
Zirkumventrikuläre Organe (ZVO) sind spezialisierte Hirnstrukturen, welche in der
zerebralen Medianebene um den dritten und vierten Ventrikel lokalisiert sind.
Sie unterscheiden sich vom restlichen Hirnparenchym durch eine besonders starke
Vaskularisierung, die keine Blut-Hirnschranke aufweist, und werden deshalb als
„Fenster des Gehirns“ bezeichnet. [35]
14
Neurone und Gliazellen der ZVO besitzen spezielle Rezeptoren und Ionenkanäle,
wodurch sie chemische Signale aus dem Blutfluss erhalten und durch Interaktionen
mit
Hypothalamus
und
Hirnstamm
Prozesse
wie
Natrium-Wasserhaushalt,
kardiovaskuläre-Regulationsmechanismen, Energiehaushalt und Immunmodulation
steuern.
Auf potentiell toxische oder hirnschädigende Stimuli antworten die ZVO mit Fieber
oder Erbrechen. [36, 37] Strukturell werden die ZVO in zwei Gruppen eingeteilt:
paraependymale (Epiphyse, Neurohypophyse, Organum subfornicale, Organum
vasculosum der Lamina terminalis, Area postrema) und ependymale
(Plexus
choroideus, Organum subcomissurale) ZVO. Die paraependymalen ZVO werden
weiter durch sekretorische (Epiphyse, Neurohypophyse) und sensorische (Organum
subfornicale, Organum vasculosum der Lamina terminalis, Area postrema)
Eigenschaften charakterisiert. Sensorische zirkumventrikuläre Organe erhalten
chemische Signale aus dem Blutstrom und stellen wichtige Kommunikationspunkte
zwischen Blut, Hirnparenchym und Liquor cerebrospinalis dar. [38]
Allen gemein ist eine einzigartige neuronale und vaskuläre Architektur. Sie werden
von einem dichten Kapillarnetz durchzogen, das sich durch fenestrierte Endothelien
und weite perivaskuläre Zwischenräumen auszeichnet. Dadurch gelangen periphere
Signale in Form von Peptiden und polaren Substanzen ins Gehirn. Das Ependym der
ZVO besteht aus Ependymozyten und Tanyzyten. Die abgeflachten Ependymozyten
sind über tight junktions verbunden und bilden eine Barriere zwischen Blut und
Liquor aus. Die Tanyzyten kennzeichnen sich durch zahlreiche Mikrovilli oder Zilien,
die in Kontakt mit dem Liquor cerebrospinalis stehen und einen möglichen Einfluss
auf dessen Zusammensetzung haben. [38]
15
1.6.1 Area postrema
a
1
b
1
c
1
2
2
3
3
Abbildung 2: Area Postrema; HE Färbung; a: Horizontaler Schnitt durch medulla oblongata; 1=
Area postrema; 2 = Lemniscus medialis; 3= Nukleus olivarius inferior; b: Maßstabskala = 1 mm; c:
Maßstabskala = 100 µm
Die Area postrema befindet sich bilateral angelegt in der dorsomedialen Medulla
oblongata und imponiert als konvexe Prominenz am kaudalen Ende des vierten
Ventrikels. Sie befindet sich in unmittelbarer Nähe zum Nucleus tractus solitarius.
[39]
Morphologisch handelt es sich um ein gut vaskularisiertes Organ mit einem dichten
neuroglialen Netzwerk. Durch die hohe Dichte an serotonergen 5-HT3 Rezeptoren gilt
die Area postrema als Chemorezeptor-Triggerzone für Übelkeit und Erbrechen. [40]
Die Blockade dieser Rezeptoren ist Angriffspunkt verschiedener Antiemetika und
wird in der Tumorchemotherapie ausgenutzt. Weiter wird ihr als Bestandteil des
dorsalen vagalen motorischen Komplexes eine Beteiligung an der Regulierung des
Kreislaufs und Wasserhaushaltes [41] sowie des Sättigungs- bzw. Hungergefühls
zugewiesen [42, 43].
16
1.6.2 Eminentia mediana
a
b
c
2
1
1
3
Abbildung 3: Eminentia mediana; HE Färbung; a: 1 = Eminentia mediana; 2 = Chiasma
opticum, 3 = Corpus mamillare; b: Maßstabskala = 1 mm; c: Maßstabskala= 100 µm
Die Eminentia mediana bildet an der Basis des Hypothalamus einen proximalen Teil
des Infundibulums und gilt als wichtigste Verbindungsstelle zwischen Nerven- und
Hormonsystem. Sie liegt unmittelbar kaudal des Chiasma opticums und rostral der
Corpora mamillaria. Es handelt sich um eine gefäßreiche Region, die sich aus
Ependymzellen, den Tanyzyten und Axonen, die zur Neurohypophyse verlaufen,
zusammensetzt.
Die
Eminentia
mediana
enthält
Axone
aus
Hypothalamuskerngebieten, die Hormone wie Oxytocin und Vasopressin zur
Neurohypophyse transportieren und die von dort ins periphere Blut sezerniert
werden. Des Weiteren wird sie von hypophysiotropen Nervenfasern durchzogen.
Diese geben über das Portalvenensystem Hormone wie GHRH, TRH, Somatostatin
etc. in die Blutbahn ab.
Mit Hilfe von genetischen Zellschicksalsuntersuchungen an adulten Mäusen wurden
in den letzten Jahren neugebildete Neurone in der Eminentia mediana detektiert. [44]
17
1.6.3 Epiphyse
a
b
c
Abbildung 4: Epiphyse; HE Färbung; a: Epiphyse im Querschnitt; b: Maßstabskala = 1 mm; c:
Maßstabskala = 100 µm
Die erbsengroße Epiphyse liegt an der Hinterwand des dritten Ventrikels oberhalb
der Vierhügelplatte und ist über zwei Zügel (Habenulae) mit dem Thalamus
verbunden. Umhüllt von der Pia mater (Kapsel) gliedert sich das Parenchym der
Drüse in Septen und Lobuli. Zum größten Teil besteht die Epiphyse aus sekretorisch
aktiven Pinealozyten und Neurogliazellen. Pinealozyten sind große, blasse Zellen mit
ovalem Kern, prominentem Nukleolus und langen Fortsätzen. [39] Sie stammen
phylogenetisch von Photorezeptorzellen ab und produzieren bzw. speichern
abhängig vom hell-dunkel-Zyklus das Schlafhormon Melatonin. Durch die neuronale
Verschaltung mit
Netzhaut und Hypothalamus reguliert die Epiphyse über
Melatoninfreisetzung den Schlaf-Wach-Rhythmus und somit die „innere biologische
Uhr“.
Mit zunehmendem Alter lassen sich vermehrt kalkartige, röntgendichte Konkremente
(acervoli) nachweisen.
18
1.6.4 Neurohypophyse
a
b
c
1
2
Abbildung 5: Neurohypophyse; HE Färbung; a: 1 = Adenohypophyse; 2 = Neurohypophyse;
b: Maßstabskala = 1 mm; c: Maßstabskala
Die Neurohypophyse bildet den dorsalen Anteil der Hypophyse, welche sich in der
Sella turcica des Os sphenoidale befindet. Im Gegensatz zur ventral gelegenen
Adenohypophyse, bei der es sich um eine endokrine Drüse handelt, entspricht die
Neurohypophyse einer neuroepithelialen Ausstülpung des Diencephalons und dient
als Speicher- und Freisetzungsort für die Hormone Oxytocin und Vasopressin. Sie
besteht aus besonderen Gliazellen, den Pituizyten, Kapillaren, Fibrozyten, aber
hauptsächlich aus marklosen Axonen, die von Perikarien im Nucleus supraopticus
und paraventricularis des Hypothalamus stammen. Lichtmikroskopisch imponieren
eosinophile Flecken als Herring- Körper (Anhäufungen von Hormongranula).
1.6.5 Organum vasculosum der Lamina terminalis (OVLT)
Das Organum vasculosum der Lamina terminalis hat seine größte Ausdehnung auf
halber Höhe zwischen Commissura anterior und Chiasma opticum und ist Teil der
Lamina terminalis.
Mikroskopisch dominiert ein dichter Kapillarplexus mit sinusoidalen Gefäßen und
zahlreichen Gliazellen, die dem Ependym anliegen.
19
Das OVLT ist an der Entstehung und Regulation von Fieber beteiligt [45]. Zudem
regulieren Neurone, die als Osmorezeptoren fungieren, über Mediatoren wie AT-II,
Vasopressin,
Somatostatin
und
Atriales
natriuretisches
Peptid
(ANP)
den
Flüssigkeitshaushalt, Blutdruck und Osmolarität. [39, 46]
1.6.6 Organum subcommissurale
Das Organum subcommissurale befindet sich im Dach des dritten Ventrikels, wo es
die Comissura posterior überzieht. Im menschlichen Gehirn ist es nur im Fötus und
bei Neugeborenen bis zum 2. Lebensjahr nachweisbar. Bis zum Erwachsenenalter
hat es sich vollständig zurückgebildet.
Die Ependymzellen des SCO sezernieren ein Glykoprotein (SCO-Spondin) in den
Liquor cerebrospinalis, das auch als Reissner-Substanz bekannt ist und sich zum
Reissner-Faden zusammenlagert, der beim erwachsenen Menschen nicht mehr
vorhanden ist. [47]
In der Embryonalentwicklung scheint das SCO eine Rolle bei der Entstehung eines
Hydrozephalus zu spielen. [48, 49]
1.6.7 Organum subfornicale
Das Organum subfornicale liegt am Dach des dritten Ventrikels unterhalb des Fornix
und wird vom Plexus choroideus verdeckt. Es besteht aus einem lockeren Netzwerk
von Neuronen und Gliazellen. Neben Oligodendrozyten und Mikroglia finden sich
besonders zahlreiche Astrozyten bevorzugt in der Nähe von Blutgefäßen.
Das Organum subfornicale beteiligt sich an der Regulation des Wasser- und
Salzhaushaltes und ist damit besonders sensibel für das Hormon Angiotensin II.
20
1.7 Pathologie und Neurogenese nach Gehirninfarkt
Bei einer zerebralen Ischämie, Hirninfarkt oder Schlaganfall, handelt es sich um eine
Form der zerebralen Durchblutungsstörung. Durch Okklusion einer Hirnarterie kommt
es zu einer Minderperfusion des betroffenen Hirnareals. Je nach Ausmaß der
hierdurch bedingten Gewebsläsion können neurologische Ausfälle resultieren, die
entweder transitorisch oder permanent sind. [50]
Bei länger als etwa 60 Minuten dauernden Energiemangelzuständen sind Nervenund Gliazellen irreversibel geschädigt. Die resultierende Kolliquationsnekrose wird
durch eine Proliferation von Astrozyten und Kapillaren ausgebessert. [51]
Histopathologisch kann man den Gehirninfarkt in drei Stadien einteilen. Das
Infarktstadium I (akuter Hirninfarkt) ist gekennzeichnet durch den Untergang von
Nervenzellen mit deutlich ödematöser Auflockerung und Abblassung der Matrix
sowie einer scharfen Demarkation zum gesunden Gewebe. Das Stadium II
(subakuter Hirninfarkt) zeichnet sich durch eine dichte Makrophageninfiltration,
Mikrogliaaktivierung und reaktive Kapillarinduktion aus. Das Stadium III (alter
Hirninfarkt) entspricht dem Endzustand eines Hirninfarktes. Hierbei kommt es zu
einer Narbenbildung mit pseudozystischer Umwandlung des geschädigten Gewebes.
Typisch ist ein Substanzdefekt und eine Glianarbe.
Die Inzidenz der zerebrovaskulären Erkrankungen beträgt in den meisten
Industrieländern
150-200/100000
Einwohner.
Die
Prävalenz
wird
auf
700-
800/100000 Einwohner geschätzt. Zerebrale Durchblutungsstörungen liegen hinter
den
kardiovaskulären
und
tumorösen
Erkrankungen
an
dritter
Stelle
der
Mortalitätsstatistik westlicher Länder.[52]
Die häufigsten Ursachen einer Ischämie sind eine Blockade der arteriellen Blutzufuhr
durch arteriosklerotische Gefäßstenosen (Makro-Mikroangiopathie) oder embolische
Ereignisse (arterio-arterielle sowie kardiogene Embolien). [50]
21
Zentralnervöse ischämische Infarkte führen zu einem permanenten Neuronenverlust
und sind eine wichtige Todesursache in modernen Industrieländern. Die funktionelle
Restitution nach einem Gehirninfarkt ist limitiert. Zahlreiche Studien demonstrieren
das reparative Potential des ZNS in Form einer Aktivierung der endogenen
Neurogenese nach einem ischämischen Insult. [3, 9, 14, 37, 53-55] Insbesondere die
ependymalen Zellen der Ventrikel gelten als wesentliches Stammzellreservoir, das
nach Infarkt rekrutiert wird. [54, 56]. Zudem zeigen zahlreiche weitere Studien zu
globalen und fokalen cerebralen Ischämien an Mausmodellen einen signifikanten
Anstieg von Vorläuferzellen im adulten Gehirn. [57-59] Eine Studie demonstriert an
Mäusen, dass SVZ-Zellen nach Okklusion der mittleren Gehirnarterie in das
ischämische Hirnareal migrieren. [21]
22
2 Erläuterung der Fragestellung
Bereits im Vorfeld wurden innerhalb der ZVO Zellen mit Eigenschaften von
neuronalen Progenitor- bzw. Stammzellen identifiziert. Die vorliegende Arbeit
beschäftigt sich nun in einem zweiten Schritt mit einem Vergleich zwischen Gehirnen
ohne neuropathologischen Befund und Infarktgehirnen.
Als erstes Ziel sollen bisherige Ergebnisse reproduziert werden, um die Anwesenheit
von möglichen neuronalen Stammzellen (NSZ) in ZVO zu bestätigen.
Als zweites Ziel werden gesunde Gehirne und Infarktgehirne miteinander verglichen,
um einen Anstieg und somit eine mögliche Rekrutierung von NSZ nach
pathologischem Ereignis zu detektieren.
Die Arbeit umfasst die Untersuchung von jeweils 16 Gewebeproben ohne
neuropathologischen Befund und 16 Gewebeproben nach ischämischen Insult.
In Anlehnung an die Arbeit von Bennett et al. [31], die NSZ in ZVO erwachsener
Nagetieren nachwies, sollen nun erstmals NSZ in humanen ZVOs erforscht werden.
Mit Hilfe von immunhistochemischen Färbungen werden entsprechende Zellen
identifiziert und quantifiziert. Da bis dato keine eindeutig validen Antikörper für
Stammzellen existieren, soll mittels einer Zusammenschau mehrerer Einzel- und
Doppelfärbung der Nachweis potentieller NSZ erhärtet werden.
Diese Arbeit soll zum Verständnis adulter Neurogenese beitragen und als Grundlage
für weitere Forschungen an Tiermodellen dienen.
23
3 Methodik:
3.1 Patientenkollektiv
Insgesamt wurden während der neuropathologischen Untersuchung Gehirne von 32
Leichnamen untersucht. Davon wurden die ZVO von 16 Gehirnen nach akutem
Gehirninfarkt
und
16
Gehirnen
mit
altersentsprechendem
entnommen. Die Altersverteilung erstreckt sich
(Durchschnittsalter
=
71,95
Jahre).
Normalbefund
von 41,6 bis 92,7 Jahre
Zwischen
den
beiden
untersuchten
Patientengruppen gibt es keinen signifikanten Altersunterschied.
Abbildung
6:
Altersverteilung
aller
untersuchten
Patienten
in
Jahren.
Mittelwert:
71,95;
Standardabweichung: 10,29; Standardfehler: 1.82;
Eine genaue Auflistung der Patientendaten ist aus Tabelle 1 im Anhang zu
entnehmen. Nicht bei jedem Patienten konnten alle zu untersuchenden ZVO
entnommen werden, da es bereits bei Entnahme des Gehirnes aus der
Schädelgrube zu Gewebeschädigung kommen kann.
Alle Patienten haben vor ihrem Tod der Gewebeverwendung zu wissenschaftlichen
Forschungszwecken zugestimmt.
24
3.2 Angewendete Schnittführung bei der Sektion
Die ZVO sind in der sagittalen Mittellinie des Gehirns lokalisiert, wodurch sich eine
Schnittführung in sagittaler Richtung anbot, um optimalen Zugang zu den gesuchten
Organen zu erhalten.
Zuerst wurden die Gehirne auf äußere pathologische Auffälligkeiten inspiziert. Als
nächstes wurden die arteriellen und venösen hirnversorgenden Gefäße abpräpariert
und auf makroskopische Verkalkungen untersucht, um bereits erste Hinweise auf ein
mögliches Infarktgeschehen zu erhalten. Dann wurde der Hirnstamm auf Höhe der
Crura cerebri abgesetzt und in axiale Scheiben lamelliert. Dabei wurde die Area
postrema auf Ebene des Rautengrubenbodens entnommen und konserviert.
Ausgehend von einem mediosagittalen Schnitt entlang der Fissura longitudinalis,
welcher die beiden Gehirnhälften voneinander trennt, wurde das Gehirn in 1 cm dicke
Scheiben in sagittaler Ausrichtung lamelliert.
Im Idealfall konnte nun von den medialen Scheiben ein Gewebeblock entnommen
werden, in dem Epiphyse und die Eminentia mediana enthalten waren.
Die Hypophyse wurde aufgrund ihrer Lage innerhalb der Fossa hypophysialis des Os
sphenoidale bereits während der Gehirnentnahme aus der Schädelgrube separat
aufbewahrt.
Zudem gehörten zur neuropathologische Allgemeinuntersuchung Beschreibung,
Dokumentation und Interpretation von makroskopisch sichtbaren Gewebe- bzw.
Organveränderungen sowie die Entnahme repräsentativer Gewebeproben für die
mikroskopische Untersuchung.
25
3.3 Asservierung von Gewebe
Das entnommene Gehirngewebe wurde durch Fixation mit 4%iger Formalinlösung
asserviert. Zur Einbettung wurde das Gewebe in einer aufsteigenden Alkoholreihe
entwässert, in Xylol von Alkohol befreit, mit verflüssigtem Paraffin durchtränkt und
anschließend in einen Paraffinwachsblock eingegossen, der nach Erkaltung
aushärtet. Mit einem Mikrotoms wurden 5 µm dicke Gewebeschnitte hergestellt, die
anschließend im Wasserbad auf Objektträger aufgezogen wurden.
3.4 Immunhistochemie
3.4.1 Allgemeines
Die Immunhistochemie ist eine Methode, mit der Proteine mit Hilfe von Antikörpern
sichtbar gemacht werden können. Damit kann bestimmt werden, ob das Protein im
untersuchten Gewebe vorhanden ist und in welchem Kompartiment der Zelle es
lokalisiert ist.
Im Wesentlichen unterscheidet man eine direkte Methode von einer indirekten
Methode. Bei der direkten Methode reagiert ein enzymmarkierter Primärantikörper
mit dem Gewebeantigen. Diese Methode ist rasch durchführbar. Da an der Reaktion
nur ein markierter Antikörper beteiligt ist, kommt es nur zu einer geringen
Signalverstärkung.
Die indirekte Methode ist deutlich sensitiver. Dabei bindet zuerst ein unkonjugierter
Primärantikörper an das Antigen, anschließend wird ein zweiter enzymmarkierter
Sekundärantikörper aufgetragen, der gegen den Primärantikörper gerichtet ist. Zur
Visualisierung des Primärantikörpers folgt eine Substrat- Chromogenreaktion. Dabei
bildet das Enzym Peroxidase in Anwesenheit eines Elektronendonors (Chromogene
wie z. B. 3, 3’- Diaminobenzidin, DAB) ein Enzym-Substratkomplex. DAB wird vom
Enzym Peroxidase oxidiert und bildet ein braunes Endprodukt, das den verwendeten
Primärantikörper und damit das gesuchte Protein innerhalb der Zelle markiert.
26
3.4.2 Beschreibung der verwendeten Primärantikörper
Anti- Ki67
Das Ki67 Antigen ist ein nukleärer Proliferationsmarker und wird ausschließlich
während der Interphase (umfasst alle aktiven Phasen der Zellteilung, mit Ausnahme
der Kernteilungsphase) hauptsächlich in den Kernkörperchen (Nukleoli; Orte der
rRNA-Transkription) exprimiert. Während der Kernteilungsphase (Mitose) ist Ki-67
dagegen auf der Oberfläche der kondensierten Chromosomen nachweisbar.
Während der Zellzyklusphasen wird es in der G1-, in der S-, in der G2- und in der MPhase exprimiert. In ruhenden Zellen, also Zellen, die sich in der G0-Phase befinden,
ist das Ki67-Antigen nicht vorhanden. [60, 61]
Die immunohistochemische Färbung mit Ki67-Antikörpern, findet vor allem in der
Tumordiagnostik
Verwendung,
da
sie
Aufschluss
über
die
Wachstumsgeschwindigkeit und damit dem Malignitätsgrad der Neoplasie gibt. [62]
Anti- OLIG2
OLIG2 steht für „Oligodendrocyte lineage transcription factor 2“ und wird fast
ausschließlich im ZNS, von glialen Vorläuferzellen und unreifen Astrozyten
exprimiert. Dieser Transkriptionsfaktor ist essentiell für die Differenzierung von
subventrikulären Vorläuferzellen zu reifen Oligo- und Astrozyten. [63, 64]
Insbesondere in NG2 Gliazellen, die als Vorläuferzellen der Oligodendro- und
Neurogenese gelten, und eine bedeutende Rolle in Reparationsprozessen nach
Hirnschädigung spielen, ist OLIG2 in hohem Maße nachweisbar. [65]
In
der
neuropathologischen
Praxis
dient
OLIG2
der
Identifikation
von
oligodendroglialen Tumoren und deren Abgrenzung von Tumoren anderen
Ursprunges. [66]
27
Anti- PSA-NCAM
PSA-NCAM steht für “Poly Sialated Neural Adhesion Molecule” und wird vor allem
während der Gehirnentwicklung auf der Oberfäche von Vorläuferzellen und von
neuronalen Stammzellen exprimiert. [18] Im adulten Gehirn ist PSA-NCAM ein
wesentlicher Regulator der Migration, der Entwicklung und des Überlebens von neu
generierten Neuronen im Rahmen von adulter Neurogenese. [18, 67] Zudem spielt
es eine wichtige Rolle in verschiedenen Formen der Neuroplastizität, sowie bei
zerebralen Reparationsprozessen. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass PSA-NCAM
positive neuronale Vorläuferzellen in Tumorgewebe akkumullieren. [68] PSA-NCAM
steuert über Zellinteraktionen Prozesse wie Synaptognese, axonales Wachstum oder
Zellmigration und trägt somit wesentlich zu funktioneller Plastizität bei. [69, 70]
Anti- GFAP
GFAP steht für „Glial fibrillary acidic protein”. Es handelt sich um ein
zytoplasmatisches Protein, das zur Gruppe der Intermediärfilmente der Klasse III
(Desmine) gehört.
GFAP gilt im menschlichen Gehirn als Marker für reife Astrozyten. [18] Im Kontext
adulter
Neurogenese
stammen
neu
gebildete
Neuronen
von
astrozytären
Vorläuferzellen ab, die GFAP exprimieren. [71, 72]
GFAP wird zudem als Tumormarker bei der Diagnostik von Hirntumoren bestimmt.
Es findet sich typischerweise in Gliomen, z. B. in Astrozytomen, Glioblastomen,
Oligodendrogliomen und Ependymomen.
28
Anti- Nestin
1990
wurde
Vorläuferzellen
Nestin als
entdeckt.
Intermediärfilament
der Klasse XI
in
neuronalen
[73] Während der Gehirnentwicklung wird
Nestin
insbesondere von Astrozyten und radialen Gliazellen exprimiert und gilt als Marker
für multipotente Stammzellen. Während der Embryogenese ist Nestin vorwiegend in
proliferierenden und migrierenden Zellen nachweisbar. Im adulten Gehirn findet sich
das zytoplasmatische Intermediärfilament besonders in Regenerationsarealen. [74]
Insbesondere in den frühen Phasen adulter Neurogenese exprimieren neuronale
Vorläuferzellen Nestin und GFAP. [75] Mit zunehmender Differenzierung wird Nestin
herunterreguliert und durch andere Intermediärfilamente ersetzt. Interessanterweise
kommt es während pathologischer Veränderungen, wie Verletzungen oder Infarkten,
zu einer erneut induzierten Expression von Nestin. [76]
Anti- Vimentin
Vimentin zählt genauso wie GFAP zu den Intermediärfilamenten der Klasse III und
kommt im Zytoplasma aller Zellen mit mesodermaler Herkunft vor.
Generell ist Vimentin als zytoskelettales Protein für die Erhaltung der Zellintegrität
verantwortlich. [77] Während der frühen Gehirnentwicklung wird Vimentin von
radialen Gliazellen und unreifen Astrozyten exprimiert und nach der Gestation
zunehmend durch GFAP ersetzt. Nach Gehirnschädigung lässt sich ein Anstieg von
Vimentin- und GFAP-positiven Zellen verzeichnen. [78] Untersuchungen an
Mausmodellen zeigen eine vermehrte Expression von Vimentin und Nestin in der
ipsilateralen Subventrikularzone sowie im Striatum und im Kortex ungefähr etwa drei
bis sieben Tage nach Mediainfarkt. Diese reaktive Astrozytose scheint neuronale
Differenzierung von astrozytären Vorläuferzellen zu induzieren. [78]
In der pathologischen Diagnostik wird Vimentin als Marker für Weichgewebstumoren
eingesetzt.
29
Anti- CD68
CD68 steht für „Cluster of Differentiation 68“. Es handelt sich um ein TransmebranAntigen, das hauptsächlich in Lysosomen lokalisiert ist. CD68 gehört zur Familie der
Glykoproteine und ist am lysosomalen Transport bzw. der Endozytose beteiligt. Eine
intrazelluläre Expression von CD68 findet sich bei Makrophagen, Monozyten,
Mikroglia, Langerhanszellen und dendritischen Zellen. Eine geringgradige Reaktivität
wird auch bei einer Subpopulation von B- Lymphozyten und aktivierten TLymphozyten beobachtet.
Der Antikörper wurde in der vorliegenden Forschungsarbeit als Doppelfärbung mit
Ki67 eingesetzt, um auszuschließen, dass es sich bei den proliferierenden Zellen
(Ki67 positive Zellen) ausschließlich um Makrophagen oder Mikroglia handelt.
30
3.4.3 Erläuterung des verwendeten Verfahrens der Einzelfärbung mittels 3,3’Diaminobenzidin (DAB)- Markierung
Das Verfahren der Einzelfärbung mittels 3,3’- Diaminobenzidin ist ein Beispiel für die
indirekte
Methode,
bei
der
das
Enzym
Peroxidase
den
Farbstoff
3,3’-
Diaminobenzidin oxidiert und somit das gesuchte Protein als braunes Endprodukt
innerhalb der Zelle markiert.
Die immunhistologische Einzelfärbung lässt sich in fünf Schritte gliedern:
1. Entparaffinierung
2. Demaskierung der Antigene
3. Behandlung mit einem Primärantikörper gegen das gesuchte Antigen
4. Behandlung mit einem Sekundärantikörper gegen den Primärantikörper
5. Sichtbarmachen des Primär- Sekundärantikörper- Komplexes mit einem
Chromogen
1. Entparaffinierung :
Die Entparaffinierung erfolgt durch eine absteigende Alkoholreihe. Hierzu werden
die Objektträger mit
Xylol (20 Minuten),
100% Ethanol (2 x 5 Minuten),
96% Ethanol (5 Minuten),
70% Ethanol (5 Minuten)
und destilliertem Wasser
behandelt.
31
2. Demaskierung der Antigene
Durch
die
Formalinfixierung
entstehen
Methylenbrücken,
welche
durch
Quervernetzung zu Strukturveränderungen von Proteinen führen können. Dadurch
kann es passieren, dass ein Antikörper das gesuchte Antigen nicht erkennt. Um dies
zu vermeiden, werden die Schnitte in Citratpuffer (pH 6) mehrmals in der Mikrowelle
bei 600 Watt aufgekocht. Dieser Reaktionsschritt dient der Antigendemaskierung
sowie dem Aufbrechen von gesuchten Epitopen.
3. Behandlung mit einem Primärantikörper gegen das gesuchte Antigen
Zur Vorbehandlung werden die Objektträger in verschiedene Lösungen getaucht, um
die gesuchten Proteine für den Primärantikörper zugänglich zu machen:
Lösungsgemisch aus 1 Teil H2O2 und 5 Teilen Methanol (15-20
Minuten)
Leitungswasser (5 Minuten)
destilliertes Wasser (eingetaucht)
PBS-Puffer (= Phosphate Buffered Saline) und Brij (= nichtionisches
Tensid) (5 Minuten)
Blocking-Lösung aus 2% FCS im PBS (5 Minuten)
32
Anschließend werden die Schnitte mit dem Primärantikörper in der entsprechenden
Konzentration über Nacht im Kühlschrank bei 4° Celsius inkubiert.
Primärantikörper:
Antikörper
Spezies
Firma
Verdünnung
Anti Ki67
Monoklonal Maus
Dako
1:400
Anti Ki67
Polyklonal
Abcam
1:25
Polyklonal
Millipore- Life
1:100
Kaninchen
Science
Polyklonal
Millipore
1:200
Kaninchen
Anti OLIG2
Anti Nestin
Kaninchen
Anti Vimentin
Monoklonal Maus
Dako
1:400
Anti GFAP
Monoklonal Maus
Dako
1:200
Anti CD68
Monoklonal Maus
Dako
1:50
Anti PSA-NCAM
Monoklonal Maus
Millipore
1:100
4. Behandlung mit einem Sekundärantikörper gegen den Primärantikörper
Um Kontrast und Intensität der Färbung zu optimieren, wird am darauf folgenden Tag
ein Reagenz, bestehend aus Superenhancer und PBS (Mischverhältnis1:1),
aufgetragen.
Dann folgt ein weiterer Waschgang mit PBS für 5 Minuten.
Nun werden die Schnitte mit einem Reagenz aus Poly-HRP (= Horseradish
peroxidase) und PBS im Verhältnis von 1:1 für 30 Minuten behandelt. Dabei bindet
die dem Sekundärantikörper angelagerte Peroxidase an die Fc- Region des
Primärantikörpers.
33
5. Sichtbarmachen des Primär- Sekundärantikörper- Komplexes mit einem
Chromogen
Nach einem erneuten Waschgang mit PBS (5 Minuten) werden im nächsten Schritt
38 µl DAB-Lösung vermischt mit 1 ml Substratpuffer aufgetropft. Durch die Reaktion
der Peroxidase mit dem in der DAB-Lösung befindlichen H2O2, kommt es zur
Farbentwicklung.
Es folgt ein Waschgang in destilliertem Wasser (2 mal 2 Minuten).
Nun werden die Schnitte zur Gegenfärbung der Zellkerne für 30 Sekunden in
Hämalaun eingetaucht und in Leitungswasser gebläut.
Zum Abschluss der Färbung werden die Objektträger einer aufsteigenden
Alkoholreihe nach folgendem Schema zugeführt:
70% Alkohol (eingetaucht)
96% Alkohol (eingetaucht)
100% Alkohol (5 Minuten)
100% Alkohol (5 Minuten)
Xylol (5 Minuten)
Xylol (5 Minuten)
Anschließend werden die Schnitte eingedeckelt und unter einem Olympus BX50
Lichtmikroskop mit 40x/(0,75) Objektiv untersucht. Digitale Bilder werden mit einer
Olympus U-TV1Y Kamera angefertigt.
3.4.4 Erläuterung des verwendeten Verfahrens der Doppelfärbung mittels
Fluoreszenzmarkierung
Das
Prinzip
der
Immunfluoreszenz
(IF)-
Färbung
beruht,
wie
das
der
immunhistochemischen Verfahren, auf der Markierung des gesuchten Antigens mit
einem Antigen- Antikörper- Komplex.
34
Im
Unterschied
zur
Immunhistochemie,
bei
der
durch
Präzipitation
eines
Farbkomplexes der Antigen- Antikörper- Komplex sichtbar gemacht wird, erfolgt
diese
Reaktion
bei
der
Immunfluoreszenz
durch
Lumineszenz
des
Sekundärantikörpers.
Die beiden Marker fluoreszieren bei unterschiedlicher Wellenlänge, wodurch jede
einzelne Zelle auf zwei Merkmale untersucht werden kann. Dabei gilt zu beachten,
dass die zwei Primärantikörper aus einer unterschiedlichen Spezies stammen, z. B.
ein Antikörper aus der Maus und einer aus dem Kaninchen, da ansonsten die
Farbstoffe nicht einem bestimmten Primärantikörper zuzuordnen wären.
Dementsprechend ergeben sich folgende Antikörperkombinationen:
Ki67 und Nestin
Ki67 und OLIG2
Ki67 und PSA-Ncam
Ki67 und CD68
Fluorochrom beladene Sekundärantikörper:
Antikörper
Spezies
Farbe
Verdünnung
Alexa Flour 488
Ziege-anti-
Rot
1:200
Grün
1:200
Kaninchen
Alexa Flour 546
Ziege-anti-Maus
Die vorbereitenden Maßnahmen (Entparaffinieren, Aufkochen etc.) entsprechen
denen der Einzelfärbung.
35
Dann werden die Schnitte über Nacht im Kühlschrank bei 4° Celsius mit den beiden
Primärantikörpern in geeigneter Verdünnung inkubiert.
Am darauf folgenden Tag werden die Schnitte zunächst zwei bis dreimal für fünf
Minuten mit PBS-Puffer gespült, wonach dann der fluorochrom- beladene
Sekundärantikörper aufgetragen wird und für maximal 45 Minuten in feuchter
Kammer im Dunkeln inkubiert.
Nach erneutem Spülen mit PBS-Puffer erfolgt die Kernfärbung mit 4’6- Diamidin-2phenylindol (DAPI). Anders als bei der DAB- Färbung erfolgt keine aufsteigende
Alkoholreihe.
Die
Schnitte
werden
mit
wasserlöslichem
Eindeckmittel
für
Fluoreszenzpräparate eingedeckelt und unter einem Olympus LUCPlan FLN mit
40x/(0,60) Fluoreszenzmikroskop mit 40x/(0,60) PhZ Objektiv untersucht.
3.5 Quantifikation und Statistik
Ki67 und OLIG2 positive Zellen wurden mittels ImageJ software (U.S National
Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) in repräsentativen Schnitten der Area
postrema, Eminentia mediana, Neurohypophyse und Epiphyse manuell ausgezählt.
Für jedes Organ wurden mindestens 1100 Zellen ausgezählt. Der Anteil positiver
Zellen wurde als Fraktion positiver Zellen zur totalen Zellzahl in Prozent angegeben.
Um die statistische Signifikanz zu ermitteln, wurden die zwei untersuchten Gruppen
(Infarktpatienten versus Normalbefund) mit Hilfe des Mann-Whitney U Tests in
GraphPad Prism Software, Version 5.04, verglichen.
36
4 Ergebnisse: Vergleich Gesund versus Infarkt
Bereits im Vorfeld wurden in den ZVO erwachsener Mäuse Zellen mit
Stammzellcharakteristiken detektiert. [31] Um die Übertragbarkeit bestehender
Forschungsergebnisse auf humane ZVO zu prüfen, wurden immunhistochemische
Einzel- und Doppelfärbungen zunächst an gesunden und anschließend an
Infarktgehirnen angefertigt. Um das Potential und die Funktion potentieller
Stammzellen im Kontext eines Infarktgeschehens zu analysieren, wurde ein
quantitativer Vergleich zwischen den beiden untersuchten Gruppen gezogen.
Die
Ergebnisse
werden
an
jeweils
zwei
repräsentativen
Beispielbildern
veranschaulicht.
4.1 Einzelfärbungen
Nachdem zunächst eine Hämatoxylin-Eosin Färbung zur anatomischen Orientierung
angefertigt wurde, gelang es, alle vier zu untersuchenden ZVO mit den jeweiligen
Antikörpern (Ki67, OLIG2, PSA-NCAM, GFAP, Nestin, Vimentin) zu färben.
Positive Zellen erscheinen unter dem Lichtmikroskop braun. Negative Zellen
erscheinen durch die Gegenfärbung blau.
37
4.1.1 Area postrema
Die folgenden Abbildungen zeigen jeweils zwei Ausschnittsvergrößerungen der Area
postrema aus Gehirnen mit altersentsprechendem Normalbefund und zwei
Ausschnitte von Hirngewebe nach ischämischem Infarkt. Es handelt sich um DABEinzelfärbungen mit den Antikörpern Anti-Ki67, Anti-OLIG2, Anti-PSA-NCAM, AntiGFAP, Anti-Nestin.
Die positiven Zellen wurden mit Pfeilen markiert. Die Maßstabskala beträgt 50 µm.
Anti- Ki67
Gesund
Patient 5
Ki67
Patient 7
Ki67
Infarkt
Patient 21
Ki67
Patient 25
Ki67
38
Anti- OLIG2
Gesund
Infarkt
Patient 7
Patient 32
OLIG2
OLIG2
Patient 14
Patient 21
OLIG2
OLIG2
39
Anti- PSA-NCAM
Gesund
Infarkt
Patient 11
Patient 35
PSA-NCAM
PSA-NCAM
Patient 15
PSA-NCAM
Patient 22
PSA-NCAM
40
Anti- GFAP
Gesund
Patient 13
GFAP
Infarkt
Patient 25
GFAP
Patient 2
Patient 31
GFAP
GFAP
41
Anti- Nestin
Gesund
Patient 8
Nestin
Patient 3
Nestin
Infarkt
Patient 25
Nestin
Patient 26
Nestin
42
Anti- Vimentin
Gesund
Patient 5
Vimentin
Patient 7
Vimentin
Infarkt
Patient 28
Vimentin
Patient 26
Vimentin
43
4.1.2 Eminentia mediana
Die folgenden Abbildungen zeigen jeweils zwei Ausschnittsvergrößerungen
der
Eminentia mediana aus Gehirnen mit altersentsprechenden Normalbefund und zwei
Ausschnitte von Hirngewebe nach ischämischen Infarkt. Es handelt sich um DABEinzelfärbungen mit den Antikörpern Anti-Ki67, Anti-OLIG2, Anti-PSA-NCAM, AntiGFAP, Anti-Nestin.
Die positiven Zellen wurden mit Pfeilen markiert. Die Maßstabskala beträgt 50 µm.
Anti- Ki67
Gesund
Infarkt
44
Patient 1
Patient 19
Ki67
Ki67
Patient 32
Patient 16
Ki67
Ki67
Anti- OLIG2
Gesund
Infarkt
45
Patient 1
Patient 32
OLIG2
OLIG2
Patient 2
Patient 21
OLIG2
OLIG2
46
Anti- PSA-NCAM
Gesund
Patient 15
PSA-NCAM
Patient 6
PSA-NCAM
Infarkt
Patient 32
PSA-NCAM
Patient 29
PSA-NCAM
47
Anti- GFAP
Gesund
Patient 1
Infarkt
Patient 25
GFAP
GFAP
Patient 2
Patient 31
GFAP
GFAP
48
Anti- Nestin
Gesund
Patient 12
Infarkt
Patient 29
Nestin
Nestin
Patient 1
Patient 32
Nestin
Nestin
49
Anti- Vimentin
Gesund
Infarkt
Patient 15
Patient 21
Vimentin
Vimentin
Patient 2
Patient 31
Vimentin
Vimentin
50
4.1.3 Epiphyse
Die folgenden Abbildungen zeigen jeweils zwei Ausschnittsvergrößerungen von
Epiphysen aus Gehirnen mit altersentsprechendem Normalbefund und zwei
Ausschnitte von Hirngewebe nach ischämischem Infarkt. Es handelt sich um DABEinzelfärbungen mit den Antikörpern Anti-Ki67, Anti-OLIG2, Anti-PSA-NCAM, AntiGFAP und Anti-Nestin.
Die positiven Zellen wurden mit Pfeilen markiert.
Anti- Ki67
Gesund
Patient 6
Infarkt
Patient 21
Ki67
Patient 12
Ki67
Patient 17
Ki67
51
Anti- OLIG2
Gesund
Infarkt
Patient 3
Patient 26
OLIG2
OLIG2
Patient 6
Patient 21
OLIG2
OLIG2
52
Anti- PSA-NCAM
Gesund
Infarkt
Patient 16
Patient 32
PSA-NCAM
PSA-NCAM
Patient 10
Patient 29
PSA-NCAM
PSA-NCAM
53
Anti- GFAP
Gesund
Patient 6
Infarkt
Patient 30
GFAP
GFAP
Patient 12
Patient 20
GFAP
GFAP
54
Anti- Nestin
Gesund
Infarkt
Patient 3
Patient 32
Nestin
Nestin
Patient 6
Patient 23
Nestin
Nestin
55
Anti- Vimentin
Gesund
Patient 6
Infarkt
Patient 22
Vimentin
Vimentin
Patient 3
Patient 21
Vimentin
Vimentin
56
4.1.4 Neurohypophyse
Die
folgenden
Abbildungen
zeigen
jeweils
zwei
Ausschnittsvergrößerungen
Epiphysen aus Gehirnen mit altersentsprechendem Normalbefund und zwei
Ausschnitte von Hirngewebe nach ischämischem Infarkt. Es handelt sich um DABEinzelfärbungen mit den Antikörpern Anti-Ki67, Anti-OLIG2, Anti-PSA-NCAM, AntiFAP und Anti-Nestin.
Die positiven Zellen wurden mit Pfeilen markiert.
Anti- Ki67
Gesund
Infarkt
57
Patient 7
Patient 19
Ki67
Patient 9
Patient 21
Ki67
Ki67
Anti- OLIG2
Gesund
Infarkt
58
Patient 7
OLIG2
Patient 21
OLIG2
Patient 11
Patient 24
OLIG2
OLIG2
59
Anti- PSA-NCAM
Gesund
Infarkt
Patient 4
Patient 30
PSA-NCAM
PSA-NCAM
Patient 7
Patient 22
PSA-NCAM
PSA-NCAM
60
Anti- GFAP
Gesund
Patient 7
GFAP
Infarkt
Patient 20
GFAP
Patient 16
Patient 31
GFAP
GFAP
61
Anti- Nestin
Gesund
Infarkt
Patient 7
Patient 24
Nestin
Nestin
Patient 16
Nestin
Patient 21
Nestin
62
Anti- Vimentin
Gesund
Infarkt
Patient 11
Patient 19
Vimentin
Vimentin
Patient 7
Patient 21
Vimentin
Vimentin
63
4.2 Doppelfärbungen
In Hinblick darauf, dass Marker wie Nestin, OLIG2 und PSA-NCAM nicht
ausschließlich von neuronalen Stammzellen exprimiert werden, wurden nun
Doppelfärbungen mit Ki67 durchgeführt. Denn Ki67, ein Proliferationsmarker, wird
bekanntermaßen nicht von differenzierten Glia- oder Nervenzellen exprimiert. Die
Tatsache, dass es innerhalb der ZVO proliferierende Zellen gibt, die charakteristische
Stammzellmarker exprimieren, erhärtet den Verdacht, dass es sich bei den
entsprechenden Zellen um NSZ handelt.
Um auszuschließen, dass es sich bei dem deutlich höheren Anteil von
proliferierenden Zellen in Infarktgehirnen lediglich um Mikroglia oder Makrophagen
handelt, wurden Doppelfärbungen mit Antikörpern gegen CD68 angefertigt. Die
meisten Ki67 positiven Zellen co-exprimieren jedoch kein CD68, wodurch eine reine
Entzündungsreaktion
nicht
für
das
Vorhandensein
proliferierender
Zellen
verantwortlich sein kann.
64
4.3 Area postrema
Die folgenden Abbildungen zeigen Ausschnittsvergrößerungen der Area postrema in
Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen.
Ki67/NESTIN
Ki67/OLIG2
Ki67/PSA-NCAM
Ki67/CD68
65
4.3.1 Eminentia mediana
Die folgenden Abbildungen zeigen Ausschnittsvergrößerungen
der Eminentia
mediana in Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen.
Ki67/NESTIN
Ki67/PSA-NCAM
Ki67/OLIG2
Ki67/CD68
66
4.3.2 Epiphyse
Die folgenden Abbildungen zeigen Ausschnittsvergrößerungen
der Epiphyse in
Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen.
Ki67/NESTIN
Ki67/PSA-NCAM
Ki67/OLIG2
Ki67/CD68
67
4.3.3 Neurohypophyse
Die folgenden Abbildungen zeigen Ausschnittsvergrößerungen der Neurohypophyse
in Immunfluoreszenz- Doppelfärbungen.
Ki67/NESTIN
Ki67/PSA-NCAM
Ki67/OLIG2
Ki67/CD68
68
4.4 Statistische Auswertung
Um Unterschiede zwischen Gehirnen mit Gehirninfarkt und Gehirnen mit
altersentsprechendem Normalbefund zu ermitteln, wurden Ki67 und OLIG2 positive
Zellen mittels ImageJ software in repräsentativen histologischen Schnitten der Area
postrema, Eminentia mediana, Neurohypophyse und Epiphyse manuell ausgezählt.
Für jedes Organ wurden mindestens 1100 Zellen ausgezählt. Das Ergebnis wurde
als Fraktion von positiven Zellen zur totalen Zellzahl in Prozent angegeben. Um die
statistische Signifikanz der Ergebnisse zu prüfen, wurden die zwei untersuchten
Gruppen (Infarktpatienten versus Normalbefund) mit Hilfe des Mann-Whitney U Tests
in GraphPad Prism Software verglichen.
Die Abbildung 6 zeigt die quantitative Analyse von Ki67 (A-L) und OLIG2 (M-X) –
positiven Zellen in ZVO von gesunden Gehirnen (linke Spalte) im Vergleich zu
Infarktgehirnen (rechte Spalte). Die Maßstabskala beträgt 50 µm.
69
Abbildung 6: Quantitative- und statistische Auswertung von gesunden - versus Infarktgehirne
70
Kontrolle
B
8
6
4
2
0
D
Ki67
Eminentia
mediana
C
F
Neurohypophyse
Epiphyse
E
G
Anzahl positiver Zellen in [%]
Area
Postrema
A
Infarkt
p=0,0159
Kontrolle Infarkt
p=0,0159
8
6
4
2
0
Kontrolle Infarkt
8
6
4
2
0
ns
Kontrolle Infarkt
8
6
4
2
0
H
p=0,0294
Kontrolle Infarkt
p=0,0286
J
20
15
10
5
0
Area
Postrema
I
M
N
Neurohypophyse
O
P
p=0,0159
Anzahl positiver Zellen in [%]
Eminentia
mediana
L
Epiphyse
OLIG2
K
Kontrolle Infarkt
20
15
10
5
0
20
15
10
5
0
20
15
10
5
0
Kontrolle Infarkt
p=0,0380
Kontrolle Infarkt
p=0,0291
Kontrolle Infarkt
Aus Tabelle 2 sind die genauen Zellzahlen der untersuchten Gehirne (n) und der
prozentuale Anteil von Ki67 und OLIG2-positiven Zellen zu entnehmen.
71
Tabelle 2:
AK
ZVO
Area postrema
Eminentia
Ki67
OLIG2
Kontrolle
Infarkt
Kontrolle
Infarkt
n=4
n=5
n=4
n=4
14/1587
37/1557
34/1683
149/1191
0,89%
2,38%
2,02%
12,51%
n=4
n=5
n=4
n=5
40/3819
91/2159
35/3592
150/1783
1,05%
4,21%
0,97%
8,41%
n=4
n=5
n=4
n=4
32/6000
42/4779
46/4000
83/2955
0,53%
0,88%
1,15%
2,80%
n=4
n=4
n=4
n=4
53/3756
109/2412
24/3683
21/1642
1,41%
4,52%
0,65%
1,29%
mediana
Epiphyse
Neurohypophyse
72
5 Diskussion
5.1 Diskussion der Methoden
Für die Studie wurden insgesamt 32 Gehirne wie im Methodenteil beschrieben
prozessiert und neuropathologisch untersucht . Dabei wurde versucht, Area
postrema, Eminentia mediana, Epiphyse und Neurohypophyse zu entnehmen. Nicht
bei jedem Gehirn gelang die vollständige Entnahme aller vier ZVO. Für die
statistische Auswertung wurden dennoch pro Organ mindestens vier verschiedene
Gehirne untersucht.
Um die Stammzellmarker Nestin, GFAP, OLIG2, PSA-NCAM und Vimentin in Zellen
innerhalb der
ZVO nachzuweisen, wurden immunhistochemische Einzel- und
Doppelfärbungen angefertigt. Dabei ist zu erwähnen, dass die Qualität der Färbung
von der unterschiedlich langen Postmortem-Zeit und der sorgfältigen Konservierung
des Hirngewebes abhängt. Aufgrund der zum Teil schlechten Gewebequalität des
Autopsiematerials
konnten
nicht
in
allen
Gewebeschnitten
auswertbare
Antikörperfärbungen durchgeführt werden. Für den Erhalt von repräsentablen
Ergebnissen wurden für jeden Antikörper Positivkontrollen hinzugezogen und
negative Gewebeproben aus der Analyse entfernt.
Nicht in jedem Gehirn konnten in den entsprechenden ZVO positive Zellen
nachgewiesen werden. Dies kann verschiedenste Ursachen haben. Meist war die
schlechte Gewebequalität für die unzureichende Färbung verantwortlich. In einigen
Gehirnen waren dennoch keine positiven Zellen zu finden. Dabei gilt es zu beachten,
dass es sich um Gewebeschnitte von maximal 5 µm Dicke handelt und eine Zelle
einen Durchmesser von 4-20 µm hat. Diese Tatsache erklärt, dass nicht in allen ZVO
positive Zellen identifiziert werden konnten, da je nach Serienschnitt zufällig
unterschiedlich viele Zellen angeschnitten wurden.
Bisher gibt es keinen spezifischen Antikörper, um neuronale Stammzellen
nachzuweisen. Deshalb wurden mehrere Antikörper ausgewählt und kombiniert.
73
Um die Häufigkeit von potentiellen Vorläuferzellen innerhalb der ZVO zu bestimmen,
wurden Ki67- und OLIG2- positive Zellen quantifiziert. Da es sich bei den zwei
genannten Antikörpern um nukleäre Marker handelt, konnten positive Zellen
zuverlässig und valide ausgezählt werden. Wie in den Ergebnissen ersichtlich,
erlauben andere Antikörper wie beispielsweise Nestin oder GFAP keine eindeutige
Quantifizierung. Die Anzahl der ausgezählten Zellen reichte von 1032 bis ca. 6000
Zellen. Die breite Differenz zwischen den Zellzahlen lässt sich durch die
anatomischen und morphologischen Unterschiede zwischen den einzelnen ZVO
erklären. Zudem konnte es bei Entnahme, im Anschnitt oder während des
histologischen
Prozessierens
zu
erheblichen
Größenunterschieden
kommen.
Dennoch konnten durch die hohe Mindest-Gesamtzellzahl (1000) und durch das
Auszählen von mindestens vier verschiedenen Fällen valide Ergebnisse erzielt
werden.
Außerdem wurden einige Stichproben ausgewählt und von einer unabhängigen
Person verblindet ausgewertet. Die Ergebnisse korrespondierten in allen Fällen.
5.2 Diskussion der Ergebnisse
Zirkumventrikuläre Organe besitzen Zellen, die charakteristische Stammzellmarker
exprimieren und proliferieren können.
Hierfür wurden 16 Gehirne mit altersentsprechendem Normalbefund untersucht.
Dabei wurden in den vier ausgewählten ZVO Zellen detektiert, die positiv für
Stammzellmarker wie GFAP, Nestin, Vimentin, PSA-NCAM, OLIG2 waren. Um ihre
Proliferationsfähigkeit zu ermitteln, wurden immunhistochemische Färbungen mit
Anti-Ki67 durchgeführt. In allen untersuchten ZVO wurde eine geringe Anzahl von
teilungsfähigen Zellen nachgewiesen. Um auszuschließen, dass es sich bei den
gefundenen
Zellen
um
Mikroglia
oder
Makrophagen
handelt,
wurden
Doppelfärbungen mit Ki67 und CD68 durchgeführt. Die Mehrheit Ki-67 positiver
Zellen exprimierte jedoch kein CD68..
74
In Hinblick darauf, dass Nestin, OLIG2 und PSA-NCAM nicht nur von neuronalen
Stammzellen exprimiert werden, wurde eine Co-Lokalisation der genannten Marker
mit Ki67 untersucht. In den untersuchten ZVO wurden Zellen detektiert, die Ki67
positiv waren und gleichzeitig Nestin, OLIG2 oder PSA-NACAM exprimierten. Die
Zusammenfassung der imunhistochemischen Einzel- und Doppelfärbungen erhärten
den Verdacht, dass es sich bei den entdeckten Zellen um potentielle neuronale
Stammzellen handelt.
Ein
Gehirninfarkt
induziert
Rekrutierung
und
Proliferation
von
Zellen,
die
Stammzellmarker exprimieren.
Um die Frage zu klären, welche NSZ in humanen ZVO das Potential besitzen, auf
pathologische Ereignisse zu reagieren und adulte Neurogenese zu induzieren,
wurden weitere 16 Gehirne mit Gehirninfarkt untersucht. Im Einzelnen wurden dabei
Zellen gesucht, die positiv für die Markerproteine Ki67 oder OLIG2 waren.
Anschließend wurde die Anzahl positiv markierter Zellen quantifiziert und mit den
gesunden Kontrollgehirnen verglichen (siehe Quantifikation und Statistik). Mit
Ausnahme der Epiphyse zeigten alle untersuchten ZVO von Infarktgehirnen einen
signifikanten
Anstieg
von
Ki67
-
positiven
Zellen
im
Vergleich
zu
den
Kontrollgehirnen. Ähnlich verhielt es sich mit der Anzahl von OLIG2- positiven Zellen.
In allen ZVO von Infarktgehirnen wurde ein signifikanter Anstieg verzeichnet.
Detaillierte Ergebnisangaben sind aus Tabelle 2 zu entnehmen. Zudem wurden auch
in den ZVO von Infarktgehirnen Ki67-positive Zellen gefunden, die gleichzeitig
Nestin, OLIG2 oder PSA-NCAM exprimierten und negativ für CD68 waren.
Schlussfolgernd scheint ein Gehirninfarkt mit einem signifikanten Anstieg von Zellen,
die Stammzellmarker exprimieren, einherzugehen.
75
Die Ergebnisse suggerieren, dass es in der Area postrema, Eminentia mediana,
Epiphyse
und
Neurohypophyse
NSZ
gibt,
die
sich
nach
pathologischem
Infarktgeschehen aktiv teilen, um möglicherweise Zellverluste auszugleichen und
Reparationsvorgänge einzuleiten. Die Ergebnisse dieser Studie korrespondieren mit
jenen der Forschungsgruppe Benett et al. [31], die bereits 2009 neuronale
Stammzellen mit einem ähnlichen Markerprofil in den ZVO von gesunden adulten
Nagetieren nachgewiesen hat. Zudem stellt diese Arbeit eine Erweiterung von
früheren Studien dar, die ihr Augenmerk auf einzelne ZVO in Nagetieren legten.
Beispielsweise wurden Nestin- und GFAP- positive Zellen in der Eminentia mediana
sowie in der Area postrema von Mäusen nachgewiesen. [79] Eine andere Studie
entdeckte in der Neurohypophyse von Nagetieren eine Gruppe von Zellen, die
Transkriptionsfaktoren exprimierten, welche mit Stammzelleigenschaften assoziiert
sind. [80]
Ob es in adulten humanen ZVO neuronale Vorläuferzellen gibt und welche davon auf
pathologische Veränderungen reagieren, wurde bis dato in keiner anderen
vorherigen Studie erforscht.
Seit Beginn der Erforschung adulter Neurogenese stellte sich zunehmend die Frage,
ob das menschliche Gehirn auf pathologische Stimuli mit einer Rekrutierung von NSZ
reagiert. Im Tiermodell wurden bereits evidente Hinweise auf eine beschleunigte
Neurogenese nach induziertem Gehirninfarkt gefunden. [9] Obwohl die funktionelle
Regeneration nach Gehirninfarkt limitiert ist, haben zahlreiche Studien gezeigt, dass
das menschliche Gehirn durchaus ein reparatives Potential besitzt und durch die
Aktivierung der endogenen Neurogenese auf Schädigungen im Rahmen einer
zerebralen Ischämie antwortet. [9, 37, 57]
In dieser Forschungsarbeit zeigte sich ein signifikanter Anstieg von Ki67- und OLIG2positiven Zellen in ZVO von adulten humanen Infarktgehirnen. Die Mehrheit von
Ki67-positiven Zellen wies keine Co- Expression mit CD68 auf. Deshalb kann eine
vermehrte
Existenz
Infarktgeschehens
von
nicht
als
Mikroglia
oder
hinreichende
Markrophagen
Erklärung
für
den
infolge
Anstieg
eines
von
proliferierenden Zellen herangezogen werden.
76
Es erscheint naheliegend, dass die Zunahme der Anzahl von neuronalen
Vorläuferzellen, welches bereits ein bekanntes Phänomen der SVZ und SGZ in
Gehirnen nach ischämischem Infarkt darstellt [9, 53], ebenso in den ZVO erfolgt.
Als Reaktion auf einen ischämischen Gehirnschaden kommt es zu einer vermehrten
Ausbildung von neuen Kapillaren und Blutgefäßen. [81] Dieser Prozess ist
maßgeblich für Neovaskularisierung, Regeneration und Neurogenese nach einem
Gehirninfarkt. Dabei scheinen die neu entstandenen Blutgefäße als Leitstruktur für
die Migration von neuronalen Vorläuferzellen zu fungieren. [21, 81]
Auch in dieser Arbeit wurden Zellen, die Stammzellmarker exprimieren, vermehrt in
unmittelbarer Nähe zu Blutgefäßen gefunden. (siehe unter 4.1.1.1 Anti Ki67, Patient
5 und Patient 21 sowie unter 4.1.3.1 Anti Ki67 Patient 17) Dieser Befund entspricht
jenem, wie er bereits in der SVZ von Ratten festgestellt wurde. In der SVZ wurden
NSZ in Nachbarschaft zu Blutgefäßen gefunden. Diese bilden eine vaskuläre Nische
und erhalten somit die proliferative Aktivität von NSZ. [82, 83] Gleichwohl induziert
ein Gehirninfarkt die endogene Neurogenese in der SVZ von adulten Nagetieren und
führt zudem zu einer Migration der NSZ ins geschädigte Striatum. [84-86] Die Frage,
ob Zellen aus ZVO möglicherweise zum Ort des Infarktgeschehens migrieren, um vor
Ort den Zellverlust zu ersetzen, sollte durch weitere Studien, die Tiermodelle mit
einschließen, geklärt werden. Dennoch erscheinen die ZVO durch ihre besonders
gute Vaskularisierung und das Fehlen einer Blut-Hirnschranke geradezu ideal für
Interaktionen zwischen Vorläuferzellen, Blutgefäßen und Signalen aus dem
Körperkreislauf.
Es gibt außer dem ischämischen Hirninfarkt viele weitere Situationen, in denen
adulte Neurogenese der SVZ und SGZ beschrieben wurde. In autoptischem
Hirngewebe von Patienten mit Gehirninfarkt, Hirnblutung oder Multipler Sklerose
wurden evidente Hinweise für proliferative Reaktionen von neuronalen Zellen im
Rahmen der endogenen Neurogenese gefunden. [87, 88] So haben mechanische
Traumen oder Epileptische Krampfleiden einen steigernden Effekt auf adulte
Neurogenese. [89] Der Effekt auf die Demenz vom Alzheimertyp scheint jedoch
weiter ungeklärt. [4] Einige Studien beobachteten einen Abfall im Langzeit-Überleben
von Mäusegehirnen, die an Alzheimer erkrankt waren [90], die meisten Forschungen
zeigten jedoch eine deutliche Steigerung der Neurogenese in der SGZ. [91, 92]
77
Man vermutet, dass eine überschießende Neurogenese, wie sie auf einen
pathologischen
Reiz
hin
erfolgen
kann,
zu
verschiedenen
neurologischen
Erkrankungen beitragen kann. Dazu gehören Epilepsie, Gliome, Depression und
Demenzen. [93]
Eine bislang nicht bewiesene Hypothese besagt, dass es sich bei der sogenannten
reaktiven Gliose, der Narbenbildung, um eine Antwort auf Stammzellebene handelt.
Die daran beteiligten Astrozyten gehören zu den Gliazellen und reagieren auf
ischämische Veränderungen mit Zellhypertrophie und einer Hochregulierung von
GFAP und Vimentin. [94, 95] Es gibt einige Thesen, die nahe legen, dass es sich bei
reaktiven Astrozyten um Stammzellen handelt. Dafür spricht, dass beispielsweise im
Hippocampus aus astrozytenartigen Zellen neue Neurone generiert werden. [25]
Zudem exprimieren reaktive Astrozyten charakteristische Stammzellmarker wie
Nestin oder Vimentin. [95]
Es ist noch nicht vollständig geklärt, ob es sich bei den Vorläuferzellen tatsächlich um
reaktive Astrozyten handelt. Reife Astrozyten sind normalerweise nicht teilungsfähig.
Eine Forschungsarbeit [94] zeigte durch genetisches fate mapping, dass Astrozyten
infolge einer zerebralen Verletzung aktiv proliferierten und reaktive Gliose
induzierten. Diese erste fate-mapping Analyse von Astrozyten im zerebralen Kortex
von adulten Mäusen zeigte, dass einige Astrozyten Stammzelleigenschaften
erlangen und Reparationsprozesse nach Gehirnverletzung einleiten. [94] Zudem
agieren proliferierende Astrozyten in bestimmten Hirnregionen als adulte neuronale
Stammzellen. [24, 25]
In Experimenten am Mausmodell [57] wurde durch Okklusion der mittleren Hirnarterie
ein Gehirninfarkt induziert. Bei der Untersuchung des Infarktareals wurden zahlreiche
reaktive Astrozyten nachgewiesen. Interessanterweise befanden sich diese an denselben Stellen wie Nestin- positive Zellen. Die Forscher beobachteten, dass Nestinpositive Zellen kontinuierlich durch reaktive Astrozyten ersetzt wurden.[96]
Astrozyten besitzen Endfüße, die mit der Basalmembran von Blutgefäßen in Kontakt
stehen. Dieser Kontakt fungiert als Sensor für eine Gehirnschädigung, indem er alle
Programme zur reaktiven Gliose aktiviert.[97]
78
Nach ischämischem Gehirninfarkt erlangen oder reaktivieren Gliazellen, die sich
außerhalb der bekannten Stammzellnischen befinden, im Rahmen einer reaktiven
Gliose Stammzelleigenschaften und proliferieren. [95]
Astrozyten besitzen das Potential, funktionelle Neurone zu generieren. Eine
Arbeitsgruppe isolierte postnatale Astrozyten aus zerebralen Mauscortices. Durch
Einschleusung von neurogenen Transkriptionsfaktoren (z. B. Neurog2) gelang die
Konversion isolierter Astrozyten zu funktionellen Neuronen. [98]
Neuerdings wurden erstmals neuroprotektive Effekte von Astrozyten im Rahmen von
Zelltherapieversuchen nachgewiesen. Dabei wurde eine spezielle Subpopulation von
Astrogliazellen (OLIG2- positive Vorläuferastrozyten) in ischämisches Hirngewebe
eingebracht. Die eingebrachten Zellen zeigten neuroregeneratives Potential und
könnten in zukünftigen therapeutischen Interventionen nach Hirnschädigung, von
Nutzen sein. [99]
Die bestehenden Forschungsergebnisse rechtfertigen die Annahme, dass es
Stammzellen mit astrozytären Eigenschaften gibt, die Vorläuferpopulationen
hervorbringen, die ihrerseits neue Neuronen produzieren. [93] Radiale Gliazellen
stellen eine Subpopulation von Astrozyten dar. Während der Embryogenese nehmen
radiale Gliazellen eine Schlüsselfunktion für die Migration von unreifen Neuronen ein.
Im erwachsenen Gehirn kleiden radiale Gliazellen die Ventrikelwände aus und
wurden als potentielle Stammzellen identifiziert. [95] Interessanterweise gleichen
NSZ morphologisch gesehen den radialen Gliazellen oder Tanyzyten. [95] Tanyzyten
sind charakteristische Zellen der ZVO. Dieser Befund spricht wiederum für das
Vorkommen potentieller NSZ in ZVO.
Das therapeutische Wissen zur Nutzung von Stammzellen als Grundlage zukünftiger
neurologischer
Therapien
stammt
zurzeit
noch
nahezu
ausschließlich
aus
Tierversuchen. [100, 101] Im Sinne einer zukünftig gezielten und effizienten
therapeutischen Anwendung von neuronalen Stammzellen, sollten weitere noch
ausstehende Fragen in Bezug auf Funktion, Potential und Lokalisation geklärt
werden.
79
5.3 Zusammenfassung
Das Phänomen der adulten Neurogenese wurde in den letzten Jahrzehnten in der
subventrikulären Zone des lateralen Ventrikels und in der subgranulären Zone des
Gyrus
dentatus
nachgewiesen.
im
Hippocampus
Aktuelle
erforscht
und
Forschungsergebnisse
mehrmals
zeigen,
dass
reproduzierbar
auch
andere
Hirnregionen das Potential besitzen, neue Neuronen zu generieren und als Reaktion
auf pathologische Veränderungen, wie beispielsweise einen Gehirninfarkt, adulte
Neurogenese induzieren können.
Bereits 2009 wurden in den zirkumventrikulären Organen von adulten Nagetieren,
Zellen mit Stammzelleigenschaften nachgewiesen. [31] Um die Übertragbarkeit
dieser Forschungsergebnisse auf das menschliche Gehirn zu prüfen, wurden Area
postrema, Eminentia mediana, Epiphyse und Neurohypophyse von insgesamt 32
Gehirnen entnommen und auf potentielle neuronale Stammzellen untersucht. Dabei
entsprachen
16
Gehirne
einem
altersentsprechenden
Normalbefund
ohne
pathologische Veränderungen, und 16 Gehirne zeigten einen akuten Gehirninfarkt.
Mittels immunhistochemischer Einzel- und Doppelfärbungen konnten Zellen, die
charakteristische Stammzellzellmarker wie GFAP, Nestin, Vimentin, OLIG2 und PSANCAM exprimierten, in humanen ZVO identifiziert werden. Zudem wurde in
Infarktgehirnen ein bis zu fünffacher Anstieg von proliferierenden Zellen mittels Ki67
nachgewiesen.
Dieser Vergleich zeigt, dass das menschliche Gehirn keineswegs ein rein statisches
postmitotisches Gebilde darstellt, sondern möglicherweise auf pathologische
Einflüsse durch Rekrutierung von Vorläuferzellen reagiert.
Die Untersuchungen von humanen ZVO und der Vergleich von gesundem versus
Infarktgewebe
geben
evidente
Hinweise
darauf,
dass
ZVO
eine
weitere
Stammzellnische darstellen und somit einen wesentlichen Beitrag zur Erhaltung und
Rekrutierung adulter neuronaler Stammzellen liefern.
80
6 Anhang
Patient
Geschlecht Alter
Todesursache
[Jahre]
Patient 1
M
54,4
V.a. fulminante
Gehirngewicht Neuropathologische
[Gramm]
Diagnose(n)
1140
Gehirn mit
Lungenembolie mit
altersentsprechendem
konsekutivem
Normalbefund.
Multiorganversagen.
Patient 2
M
77,1
Kardiale Dekompensation mit
1260
Lungenödem.
Gehirn mit
altersentsprechendem
Normalbefund.
Patient 3
M
77,7
Kardiogener Schock
1250
Gehirn mit
altersentsprechendem
Normalbefund.
Patient 4
W
69,9
Septisches Kreislaufversagen
1220
Gehirn mit
altersentsprechendem
Normalbefund
Patient 5
M
64,3
V.a. akutes Koronarsyndrom
1560
Gehirn mit
altersentsprechendem
Normalbefund.
Patient 6
M
70,3
Unstillbare Blutung
1550
Gehirn mit
altersentsprechendem
Normalbefund
Patient 7
M
77,3
Aspiration nach Erbrechen als
1270
Folge eines Ulcus ventriculi.
Gehirn mit
altersentsprechendem
Normalbefund.
Patient 8
M
56,4
Kardiales Pumpversagen.
1190
Gehirn mit
altersentsprechendem
Normalbefund.
Patient 9
M
71
Keine Angabe.
1400
Gehirn mit
altersentsprechendem
Normalbefund.
81
Patient 10
Patient 11
Patient 12
M
M
M
73,2
70,8
55,7
Multiorganversagen bei
1320
Gehirn mit
fortgeschrittenem
altersentsprechendem
Tumorleiden.
Normalbefund.
Tracheo-Ösophageale Fistel
1380
Gehirn mit
als Folge von
altersentsprechendem
Ösophaguskarzinom.
Normalbefund.
V.a.Herzinfarkt oder
1290
Lungenembolie
Gehirn mit makroskopisch
altersentsprechendem
Normalbefund.
Patient 13
Patient 14
M
W
69,8
73,8
Multiorganversagen als Folge
1380
Gehirn mit
von respiratorischer
altersentsprechendem
Globalinsuffizienz.
Normalbefund.
Rechtsherzversagen.
1130
Gehirn mit
altersentsprechendem
Normalbefund.
Patient 15
M
64,7
Sepsis bei V. a. Pneumonie.
1270
Gehirn mit
altersentsprechendem
Normalbefund.
Patient 16
Patient 17
M
W
61
77,1
Prolongiertes
1400
Gehirn mit
Kreislaufversagen im
altersentsprechendem
septischen Schock.
Normalbefund
Basilaristhrombose
1250
unbekannter Ätiologie.
Frische Infarkte (Stadium
I) im Versorgungsgebiet
beider
Patient 18
M
79
Kardiales Pumpversagen.
1040
Frische Infarkte frontal
und parietal rechts im sich
überlappenden
Versorgungsgebiet von A.
cerebri anterior und A.
cerebri media (Stadium II)
Patient 19
M
55,7
Septischer Schock mit
Multiorganversagen.
1600
Frischer Infarkt von 1,5
cm Größe (Stadium 1)
rechts occipital, .
82
Patient 20
W
80,6
Multiorganversagen
1200
Gehirninfarkt (Stadium II,
insulär links, 6 x 2 x 2
cm).
Patient 21
M
92,7
Sepsis, Akutes Abdomen
1050
Mehrere Gehirninfarkte im
Satdium 2 im
Versorgungsgebiet der li
A. cerebri media
Patient 22
Patient 23
W
W
58,9
73,5
Septisches
Keine Angaben
Gehirninfarkt (temporal
Multiorganversagen in Folge
rechts bis 4,5 x 2,5 x 2
von thyreotoxischer Krise.
cm, Stadium III),
V. a.
1190
Lungenarterienthrombembolie.
Gehirninfarkt Stadium II
im Bereich des occipitalen
Pols rechts von ca. 0,7
cm Durchmesser.
Patient 24
M
73,9
Respiratorische
1165
Dekompensation.
Patient 25
M
75,7
Multiorganversagen.
Lakunäre Infarkte in den
Basalganglien beidseits.
1350
Multiple, frische
Gehirninfarkte,frontal,
Basalganglien,
Hippocampus sowie
okzipital beiderseits
Patient 26
W
74,8
Pneumonie
1260
Multiple Infarkte Stadium
III, rechts, frontal,
Basalganglien, okzipital
Patient 27
M
72,9
Hypoxischer Hirnschaden
1460
Zwei kleine, frische
nach Asystolie bei dilatativer
Infarkte (Stadium I) von je
Kardiomyopathie.
0,2 cm Durchmesser im
Stromgebiet der Arteria
cerebri anterior.
Patient 28
M
41,6
Maligner Mediainfarkt.
1570
Frischer Gehirninfarkt
beidseits in den
Stromgebieten der Arteriae
cerebri mediae und Zeichen
des Hirndrucks
83
Patient 29
M
75,9
Rezividierter Myokardinfarkt
1380
Gehirninfarkt Stadium II,
Basalgangilen links,
Status lacunaris
Patient 30
M
60
Hirneinklemmung
1680
mehrere Infarkte,
Hirnschwellung
Patient 31
W
80
Hirnödem
1260
Mediainfarkt links
Patient 32
M
60
Multiorganversagen.
1250
Multiple frische Infarkte
(im Ammonshorn rechts,
Kleinhirn rechts, im
Bereich des Nucleus
dentatus, im temporalen
Cortex rechts, im
occipitalen Cortex links
und im okzipitalen Cortex
rechts).
84
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8 Danksagung
Ich möchte mich für die Überlassung des Themas und die außergewöhnliche
Betreuung und Unterstützung bei meinem Doktorvater und Betreuer Herrn PD Dr.
med. Ulrich Schüller herzlichst bedanken.
Ferner bedanke ich mich bei Herrn Prof. Dr. med. Dr. h. c. H. Kretzschmar.
Danke Frau Angelika Henn, Frau Brigitte Kraft, Herr Michael Schmidt, Herr Johannes
Lettenbauer für die tatkräftige technische Unterstützung und eure allseitige
Hilfsbereitschaft.
Ein Dankeschön für die nette und herzliche Hilfe geht an Christoph Heeß, Dr. med.
Dorostkar Mario und Frau Annegreth Dagtekin.
Danke Georg für deine Motivation und deine unerschöpfliche Geduld. Ein besonderer
Dank gilt meiner Familie, insbesondere meiner Schwester Dagmar und meiner
Romy. Danke, dass ihr immer für mich da seid.
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