Produktion von IL-17 in naiven und Memory Th17
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Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital Bochum -Universitätsklinikder Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. Hamelmann Produktion von IL-17 in naiven und Memory Th17-Zellen unter dem Einfluss von RSV Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Sadia Rehman aus Lünen 2013 Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla Referent: Prof. Dr. med. U. Schauer Korreferent: Prof. Dr. med. A. Bufe Tag der Mündlichen Prüfung: 19.11.2013 Abstract Rehman Sadia Produktion von IL-17 in naiven und Memory Th17-Zellen unter dem Einfluss von RSV Problem: Das Respiratory Syncytial Virus ist die häufigste Ursache respiratorischer Erkrankungen in jedem Lebensalter. Betroffen sind insbesondere Kinder im Säuglings- und Kleinkindalter. Besonders schwere Verläufe, die bis hin zum Tod führen können, treten bei Frühgeborenen mit bronchopulmonalen Dysplasien und bei Kindern mit Herzfehlern und Immundefekten auf. Das von Th17-Zellen produzierte IL-17 wurde bereits als proinflammatorisches und autoimmunologisches Zytokin beschrieben. Es stellt sich die Frage, ob und was für eine Rolle das IL17 bei einer RSV Erkrankung spielt. Dazu wurde in dieser Arbeit in vitro die IL-17 Produktion an naiven und Gedächtnis T-Zellen, die mit RSV infizierten dendritischen Zellen in Kontakt kamen, gemessen. Methode: Aus Nabelschnurblut wurden naive T-Zellen und CD34-positive hämatopoetische Stammzellen gewonnen. Letztere wurden zu dendritischen Zellen ausgereift. Insgesamt wurden 6 Kulturen mit TZellen und mit RSV (MOI 20) infizierten dendritischen Zellen angesetzt, ebenso viele nicht infizierte Kontrollkulturen. Zur Stimulation der Zytokinproduktion erfolgte die Zugabe von TSST; wobei die Vorexperimente zeigten, dass eine Zugabe von 0,1ng/ml TSST ausreicht, um eine effektive Stimulation zu erreichen. Mittels Durchflusszytometrie wurde die intrazelluläre Konzentration von IL-17 und IFN-γ in den Vβ2positiven T–Zellen an Tag 3, 7, 15 und 21 der Kulturreihe gemessen. Ergebnis: Unsere Ergebnisse zeigen eine unterschiedliche IL-17-Produktion bei naiven und Gedächtnis T-Zellen unter dem Einfluss von RSV-infizierten dendritischen Zellen: bei den naiven T-Zellen wird die IL-17 Produktion gehemmt, die Gedächtniszellen hingegen werden in ihrer IL-17 Produktion nicht beeinflusst. Diskussion: Die naiven T-Zellen repräsentieren modellhaft die mit ausgeprägteren Symptomen einhergehende Primärinfektion mit RSV, während die milder verlaufende Reinfektion in unserer Arbeit beispielhaft durch Untersuchungen an Gedächtnis Th17-Zellen dargestellt wird. Die heftig ausfallende Primärinfektion von RSV und die gehemmte IL-17 Produktion in unseren Ergebnissen bei den naiven T-Zellen stehen folglich auf dem ersten Blick im Widerspruch. Eine völlig fehlende IL-17 Produktion ist jedoch ebenfalls schädlich: In der Literatur am Beispiel des Hyper-IgE Syndroms erforscht. Diese Patienten weisen eine Mutation im Gen des Transkriptionsfaktors STAT3 auf, haben keine funktionstüchtigen Th17-Zellen und sind anfällig insbesondere für Pilzerkrankungen. Ebenso konnte kürzlich eine niederländische Arbeitsgruppe zeigen, dass bei RSV-Infektionen eine erniedrigte IL-17 Konzentration mit einem schweren Krankheitsverlauf einhergeht, und demnach IL17 einen protektiven Effekt bei RSV-Infektionen hat; weitere Arbeiten sind nötig, um diese Mechanismen zu erforschen. INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 5 1.1 Respiratory Syncytial Virus 5 1.2 Dendritische Zellen 7 1.3 Naive und Gedächtnis T-Zellen 9 1.4 Th17-Zellen 11 1.5 Molekulare Charakterisierung von IL-17 14 1.6 Molekulare Charakterisierung von Interferon-γ 14 1.7 In vitro Modell der Immunantwort unter dem Einfluss von RSV 15 2 FRAGESTELLUNG 17 3 MATERIAL UND METHODEN 18 3.1 ISOLIERUNG VON MONONUKLEÄREN ZELLEN 18 3.2 Isolierung von CD34-positiven Zellen 19 3.3 Auftauen und Restimulation der dendritischen Zellen 20 3.4 Gewinnung von naiven T-Zellen 20 3.5 Virusanzucht und Infektion der dendritischen Zellen 21 3.6 Zeitlicher Ablauf der Kokultur 21 3.7 Fixierung, Permeabilisierung und Färbung der T-Zellen 24 3.8 Messung von intrazellulärem IFN-γ und IL-17 in Vβ2-positiven T-Zellen 24 3.8.1 Aufbau eines Durchflußzytometers 3.8.2 Messung der Lichtstreuung 3.8.3 Messung der Fluoreszenz 3.8.4 Typisches Beispiel einer Messung 25 26 26 27 3.9 Statistik 27 3.10 Auflistung der verwendeten Materialien 28 1 4 ERGEBNISSE 30 4.1 Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen der Konzentration des Superantigens TSST und der Zytokinproduktion 30 4.2 Messung der IL-17- und IFN-γ-Expression von naiven und Gedächtniszellen 32 4.3 Unterschiedliche Zytokinexpression von naiven und Gedächtniszellen unter dem Einfluss von RSV 34 5 DISKUSSION 37 5.1 Unterschiedliche Antworten naiver und Gedächtnis Th1-Zellen auf mit RSV-infizierten dendritischen Zellen 38 5.2 Mögliche Mechanismen für die Hemmung der IL-17-Produktion 38 5.3 Möglich Rolle von IL-17 bei RSV-Infektionen 41 5.4 Einschränkungen des in vitro Systems 42 5.4.1 T-Zellabhängige Stimulation mit Hilfe eines Superantigens 5.4.2 IL-17 wird durch eine Vielzahl von Zelltypen freigesetzt 42 43 6 ZUSAMMENFASSUNG 44 7 LITERATUR 46 DANKSAGUNG LEBENSLAUF 2 Abkürzungsverzeichnis µl Mikroliter Abb. Abbildung APC Antigen-präsentierende Zelle APECED autoimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal dystrophy BCR B-Zell-Rezeptor C Celsius CD Cluster of differentiation CMCD Mukokutane Kandidiasis Erkrankung CPAP Continuous Positive Airway Pressure CTL zytotoxische T-Zelle DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FCS Fetal calf serum (fötales Kälberserum) FITC Fluoreszein-Isothiocyanat g Gravitationskonstante h Stunde(n) Hep-2 human epithelial cell Hepes 2-(N-Hydroxyethylpiperazin)-2´-Ethansulfonsäure GM-CSF Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierender Faktor HLA Human Leukocyte Antigen IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin IL-17R Interleukin-17 Rezeptor IU International Unit kDa Kilodalton LPS Lipopolysaccharid MACS magnetisch aktivierte Zellsortierung MHC Major Histocompatibility Complex 3 min Minuten ml Milliliter MOI Modus of Infection NF-κB nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated Bcells ng Nanogramm NK-Zellen Natürliche Killerzellen nm Nanometer ns nicht signifikant (nur in den Ergebnisgrafiken verwendet) PE Phycoerythrin PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PGE2 Prostaglandin E2 PMA Phorbol-Myristate-Acetat RNA Ribonukleinsäure ROR retinoid-related orphan receptor RPMI Roswell Park Memorial Institute – Zellkultur Medium RSV Respiratory Syncytial Virus STAT Signal Transducers and Activators of Transcription, TCR T-Zell-Rezeptor TGF Transforming Growth Factor Th T-Helferzelle TLR Toll-like Rezeptor TNF Tumornekrosefaktor TSST Toxic Shock Syndrom Toxin µl Mikroliter µm Mikrometer 4 1 Einleitung 1.1 Respiratory Syncytial Virus Das Respiratory Syncytial Virus wurde 1956 zum ersten Mal bei einem Laboraffen isoliert, der an typischen Symptomen einer Erkältungskrankheit litt (Morris et al., 1956). Wenig später wurde es erstmals bei einem Kind mit einer Pneumonie gefunden. Das Respiratory Syncytial Virus ist eine häufige Ursache respiratorischer Erkrankungen in jedem Lebensalter. Betroffen sind insbesondere Kinder im Säuglings- und Kleinkindalter. Besonders schwere Verläufe, die bis hin zum Tod führen können, treten bei Frühgeborenen mit bronchopulmonalen Dysplasien, Herzfehlern und Immundefekten auf (Simoes, 1999; Kristjansson et al., 2005). Die Durchseuchungsrate am Ende des zweiten Lebensjahres beträgt nahezu 100%. Bei Kindern ist es die Ursache für 50-90 % der Bronchiolitiden, 5-40 % der Pneumonien und 10-30 % der Tracheobronchitiden, die im Krankenhaus behandelt werden müssen (Hall, 2001). Es handelt sich hierbei um ein von einer Lipidhülle umgebenes RNA-Virus, welches zur Familie der Paramyxoviridae gehört und durch Schmier- und Tröpfcheninfektion übertragen wird. Die Kontagiösität ist hoch. Die Infizierung mit dem RS-Virus findet über den oberen Respirationstrakt und die Augen statt, mit einer Inkubationszeit von 3-5 Tagen (Simoes et al., 1999). Nach der Infektion erfolgt die Vermehrung des Virus auf den Schleimhäuten der Atemwege. Als Folge der Synzytialbildung (daher der Name RSV) und der ausgelösten lokalen Immunantwort kommt es zur Zerstörung der zilientragenden Epithelzellen, mit konsekutiver Schleimhautentzündung und Ödembildung der peribronchialen Region. Die entstehenden Epithelzellnekrosen, intraluminalen Pfröpfe und zelluläre Gewebstrümmer verursachen eine Ventil-Obstruktion der Atemwege, die zu einer Überblähung der distalen Atemwege und Alveoli führt (Simoes, 1999). 5 Klinisch manifestiert sich die Erkrankung als Rhinitis, Pharyngitis, Tracheobronchitis und Broncheolitis. In der klinischen Untersuchung weisen die an Bronchiolitis erkrankten Kinder hypersonoren Einziehungen Klopfschall, auf. Die feinblasige obstruktive Rasselgeräusche Bronchitis geht mit und interkostale Fieber, Husten, Tachydyspnoe, verlängertem Exspirium, Giemen und Pfeifen einher; wegen der erniedrigten Sauerstoffsättigung tritt eine Zyanose auf (Simoes, 1999). Für diagnostische Zwecke werden routinemäßig Nasenrachenspülwasser auf RSVAntigene (mittels Immunfluoreszenz oder ELISA) oder RSV RNA (PCR) untersucht (Simoes, 1999). Eine wirksame kausale Behandlung der RSV-Infektion existiert nicht. Die Therapie erfolgt in erster Linie symptomatisch mit ausreichender Flüssigkeitszufuhr zur Sekretmobilisation, Sauerstoffgabe bei Sättigungsabfall unter 94 %, ggf. Atemunterstützung mit CPAP-Maske oder Intubation und Beatmung. Adrenerge Betamimetika oder inhalatives Adrenalin lindern die Atemnot, wirken aber nicht bei allen Kindern gleich stark. Steroide (inhalativ oder systemisch) sind unwirksam. Bei Verdacht auf eine Superinfektion kommen auch Antibiotika zum Einsatz (Simoes, 1999). Kinder, die bereits einmal an einer RSV-Infektion litten, haben ein erhöhtes Risiko, Asthma und rezidivierendes Giemen zu entwickeln (Pala et al., 2002). Die auf eine RSV-Primärinfektion folgende Immunität ist weder vollständig noch lange anhaltend, hinterlässt aber einen gewissen Schutz gegen schwere Reinfektionen (Hall, 2001). Für Säuglinge und Kinder mit hohem Risiko besteht die Möglichkeit einer passiven Immunisierung mit Palivizumab – einem RSV neutralisierenden monoklonalen Antikörper. Der Schutz hält nur wenige Wochen an und muss deshalb während der RSV-Saison (Oktober/November und März/April) in monatlichen Abständen als passiver Impfstoff intramuskulär verabreicht werden (Robert Koch Institut). 6 1.2 Dendritische Zellen Dendritische Zellen wurden erstmals 1973 von Steinmann und Cohn in der Milz von Mäusen beschrieben und nach ihrem charakteristischen mikroskopischen Erscheinungsbild mit zahlreichen astförmigen Ausläufern (griechisch: dendros – der Baum) benannt (Steinman and Cohn, 1973). Dendritische Zellen sind die potentesten Antigen präsentierenden Zellen des Immunsystems. Sie bilden in nahezu allen Geweben des Körpers ein dichtes Netzwerk von Wächterzellen, die extrazelluläre Bestandteile durch Phagozytose aufnehmen und somit ihre Umgebung analysieren. Aufgenommene Proteine werden intrazellulär zu Peptiden zerlegt und an MHC-Moleküle gebunden an die Zelloberfläche transportiert. Die dendritischen Zellen verlassen das periphere Gewebe und wandern mit der drainierten Lymphflüssigkeit in einen regionalen Lymphknoten. Sie ändern ihren Phänotyp, verlieren die Rezeptoren, die es ihnen ermöglichen zu den entzündeten Gebieten der Peripherie zu gelangen und exprimieren auf der Oberfläche unter anderem Major-Histocompatibility-Complex Klasse I Moleküle (MHC Klasse I) und MHC Klasse- II-Moleküle zur Präsentation von Antigenen, sowie Adhäsionsmoleküle. Außerdem setzen sie Chemokine zur Anlockung der naiven T-Zellen frei (Germain, 1994; König, 2006). Abbauprodukte intrazellulärer Pathogene werden an MHC-Klasse-I-Moleküle gebunden und an die Zelloberfläche transportiert, sodass es den T-Zellen präsentiert werden kann, was eine Differenzierung der naiven T-Zellen zu zytotoxischen T-Zellen zur Folge hat. Ihre Aufgabe besteht darin, die infizierten körpereigenen Zellen zu eliminieren. Phagozytierte Erreger, die sich in Vesikeln befinden, werden als Peptidantigene an MHC-Klasse-II-Moleküle gebunden an die Zelloberfläche transportiert. Ihre Präsentation bewirkt eine Differenzierung der naiven T-Lymphozyten in entweder Interferon-γ produzierende Th1 oder Interleukin-4 produzierende TH2-Zellen. Neben dem MHC-Komplex bedarf es zur Aktivierung der T-Zelle noch einer Reihe costimulierender Oberflächenmoleküle, die die dendritischen Zellen exprimieren. Aktivierte T-Zellen wiederum können durch den in ihrer Zellmembran integrierten CD40-Liganden dendritische Zellen stimulieren. 7 Die Aktivierung dieser verschiedenen Rezeptoren induziert deren Reifung. Dabei geht die Fähigkeit der dendritischen Zelle zur Phagozytose verloren und die an MHC-Moleküle gebundene Peptide werden in höherer Dichte und mit größerer Stabilität präsentiert (Moller, 1995; König, 2006). Dendritische Zellen induzieren auf diese Weise eine primäre T-Zell-Immunantwort und viele Viren greifen in diesen Mechanismus ein, um einer Immunantwort zu entgehen (Klagge and Schneider-Schaulies, 1999). Die entstandenen zytotoxischen bzw. T-Helferzellen, die so genannten Effektorzellen, gehen größtenteils nach Elimination des Antigens zu Grunde, nur ein Teil bleibt als Gedächtniszellen zurück. So entstehen im Rahmen der primären Immunantwort Effektorzellen und ein immunologisches Gedächtnis. Auf ein erneutes Auftreten des gleichen Antigens kann der Organismus nun, durch Aktivierung der vorhandenen Gedächtniszellen, mit einer Sekundärantwort reagieren (von Andrian and Mackay, 2000). Die myeloide dendritische Zelle entwickelt sich aus hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks, wobei verschiedene Entwicklungswege beschritten werden können. Zum einen reifen die Stammzellen zu CD14 tragenden Monozyten heran, die dann unter dem Einfluss von GM-CSF und IL-4 zu dendritische Zellen ausdifferenzieren (Sallusto and Lanzavecchia, 1994). Andererseits können in vitro aus CD34-positiven hämatopoetischen Vorläuferzellen (aus Knochenmark oder Nabelschnurblut) (Santiago-Schwarz et al., 1992) direkt myeloide dendritische Zellen angezüchtet werden, wie sie in den Experimenten der vorliegenden Arbeit verwendet wurden. In Abhängigkeit von den externen Stimuli können sich die Stammzellen entweder zu dendritischen Zellen oder zu Makrophagen entwickeln. Diese Polarisation kann in vitro durch die Zugabe von Zytokinen erreicht werden (Bartz und Büning-Pfaue, 2002). Unreife dendritische Zellen weisen eine hohe Endozytoseaktivität, aber eine schlechte T-Zell-Stimulationsaktivität auf. Die Zellen sind für die Antigenaufnahme und deren Prozessierung kompetent (Zhou and Tedder, 1996). Die so generierten Zellen können durch die Zugabe bestimmter Stimuli, wie TNF-α, IL-1 oder LPS, vollständig ausreifen (Sallusto and Lanzavecchia, 1994). 8 1.3 Naive und Gedächtnis T-Zellen T-Zellvorläufer wandern früh in der Entwicklung vom Knochenmark in den Thymus ein. Während ihrer Reifung exprimieren T-Zellen den T-Zellrezeptor (TCR). Der TCR ist ein Ergebnis somatischer Genmutationen während der Reifung. Die Gene, die diese Rezeptoren kodieren, werden aus verschiedenen variablen und konstanten Fragmenten zusammengesetzt. Die somatische Mutation und die Rekombination führen zu einem breit gefächerten Repertoire an TCR-Spezifitäten. Im Gegensatz zum BCR kann der TCR nur Antigene erkennen, die von einer APC über einen PeptidMHC-Komplex präsentiert werden (Chaudhuri, 2004). Nach ihrer Ausreifung im Thymus können T-Zellen Antigene erkennen und werden dann als naive bzw. reife T-Zellen bezeichnet. Naive T-Zellen zirkulieren im Körper und wandern in besonderen, in Lymphknoten vorkommenden Venolen (high endothelial venules) aus, wo sie in Kontakt mit Antigen-präsentierenden Zellen kommen. Über die Lymphflüssigkeit gelangen sie wieder zurück in den Blutkreislauf. Die Dauer einer kompletten Zirkulation wird auf 12 bis 18 h geschätzt (Sprent, 1973). Naive T-Zellen sind klein (zirka 10 µm Durchmesser) und an verschiedenen Oberflächenmarkern erkennbar, die u.a. für das sogenannte Lymphknoten-Homing verantwortlich sind. Treffen naive T-Zellen in der Peripherie auf ihr spezifisches Antigen, werden sie aktiviert und beginnen Effektorfunktionen auszuüben. Anhand der Membranglykoproteine CD4 und CD8 können T-Zellen in zwei Klassen unterteilt werden. CD8 positive T-Zellen erkennen Antigene als Peptid-MHC Klasse I-Komplexe, die von mit intrazellulären Pathogenen befallenen Zellen präsentiert werden. Nach Aktivierung setzen sie zytotoxische Moleküle wie Perforin und Granzym B frei und lysieren ihre Zielzellen direkt, weshalb sie auch zytotoxische T-Zellen (CTL) genannt werden. CD4-positive T-Zellen erkennen Antigene im Zusammenhang mit MHC Klasse II Molekülen und spielen sowohl bei der humoralen als auch bei der zellulären Immunantwort eine zentrale Rolle (Moller 1995; Villadangos, 2001). Erkennt eine CD4-positive T-Zelle einen Peptid-MHC Klasse II Komplex, wird sie aktiviert und sezerniert Zytokine, die wiederum andere Immunzellen wie zum Beispiel B-Zellen, CD8-positive T-Zellen oder Makrophagen aktivieren. Deshalb 9 werden CD4-positive T-Zellen auch Helfer-T-Zellen (Th) genannt. Dabei entscheidet das lokale Zytokin-Milieu, ob die Zellen zu Th1, Th2, Th17 oder T-Regulatorzellen differenzieren. Bereits 1986 wurde von Mosmann et al. die Differenzierung von CD4-positiven TZellen zu Th1- und Th2-Zellen beschrieben (Mosmann et al., 1986). Mossman zeigte, dass Th1-Zellen Interferon (IFN)-γ, TNF-β und IL-2 produzieren, und somit sowohl BZellen zur Produktion von Antikörpern anregen, als auch Makrophagen aktivieren können. Th2-Zellen produzieren IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 sowie IL-13 und liefern so optimale Hilfestellung für die Entwicklung einer humoralen Immunantwort (Reiner and Locksley, 1993; Mosmann and Coffman, 1989). 2003 zeigte sich, dass naive CD4-positive T-Zellen unter Einfluss von IL-23 zu einem weiteren Th-Zelltyp differenzieren können, der das inflammatorische Zytokin IL-17 produziert (Aggarwal et al., 2003). Seitdem wurden in zahlreichen Studien Differenzierungsmechanismen für diesen neuen Zelltyp vorgeschlagen. Wenn das Pathogen eliminiert ist, sterben zirka 95 % der spezifischen T-Zellen in einem Prozess, der AICD (aktivierungsinduzierter Zelltod) genannt wird. Der Zellabbau findet dabei größtenteils in der Leber und auch in der Milz statt (Huang et al., 1994; Sprent, 1976). Zum dauerhaften Schutz des Organismus entwickeln sich Gedächtnis T-Zellen. Diese überlebenden Zellen zirkulieren nun vor allem durch die peripheren Organe, d.h. Leber, Lunge, Nieren und Darm, aber auch Thymus und Knochenmark, wo sie das sogenannte T-Zellgedächtnis bildet. Dennoch ist auch weiterhin ein kleiner Teil der spezifischen Zellen in den lymphatischen Organen zu finden. Ein erneuter Kontakt mit dem gleichen Pathogen führt zu einer verstärkten Immunantwort, die eine Infektion meist verhindert oder zumindest den klinischen Verlauf mildert. 10 1.4 Th17-Zellen Th1, Th2 und Th17-Zellen können aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle, der naiven T-Zelle, entstehen. Damit sich aus der naiven T-Zelle eine Th17-Zelle entwickelt, bedarf es der Einwirkung von TGF-ß zusammen mit IL-16, sowie IL-21, IL-1, IL-6 und IL-23 (Miossec et al., 2009; Bettelli et al., 2006). IL-23 unterstützt die Aktivität der Th17-Zellen (Chen et al., 2006). Die Transkriptionsfaktoren STAT3, STAT4 und ROR-γT (retinoid-related orphan receptor) sind wichtig für die IL-17 Expression und Th17-Differenzierung. (Ivanov et al., 2006, Mathur et al., 2007). Sowohl das Zytokin IL-21 wie auch IL-16 aktivieren STAT3 und sind somit als wichtige Mittler bei der Th17-Differenzierung involviert. Eine Anzahl von Faktoren wurde nachgewiesen, die die Th17-Entwicklung in Mäusen potentiell inhibieren: dazu gehören die Zytokine IL-2 (Laurence et al., 2007) und IL-4 (Mondal et al., 2010), sowie die Transduktionsfaktoren T-bet (Mathur et al., 2006) und STAT5 (Laurence et al., 2007). Die Th17-Zelle ist charakterisiert durch die Produktion von IL-17 (-A und –F), IL-21, IL-22, IL-26. IL-17 ist ein proinflammatorisches Zytokin und wirkt am IL-17 Rezeptor (IL-17R) an Epithelzellen, Fibroblasten, glatten Muskelzellen, Neutrophilen (Lindén et al. 2000), Eosinophilen und Lymphozyten (Park et al., 2005) und induziert dort die Sekretion von proinflammatorischen Faktoren wie IL-6, IL-8, G-CSF und Prostaglandin E2. IL-17 spielt in einer Anzahl von Immun- und Entzündungsprozessen als primärer proinflammatorischer Regulator eine Rolle, indem es die Expression von verschiedenen inflammatorischen Mediatoren wie Adhäsionsmoleküle und Wachstumsfaktoren induziert. 11 Zytokine, Chemokine, Abbildung 1: Schemazeichnung Th17 Th17-Zellen sind nicht die einzigen Zellen, die im Stande sind, IL-17A zu produzieren: auch andere Zellpopulationen, wie CD8-positive T-Zellen, γδT-Zellen und natürliche Killerzellen sind zur IL-17A Produktion in der Lage. Doch im Gegensatz zu diesen Zellen kann die Th17-Zelle auch noch IL-17F und IL-22 produzieren, welche sehr potente Mediatoren bei der Entzündungsreaktion sind (Dong, 2008). Die Differenzierung der Th17-Zellen unterliegt einer starken Regulation. Dies ist von großer Bedeutung, da bei gestörter Regulation Th17 bei Autoimmunprozessen eine Rolle spielt (Dubin and Kolls, 2008). Das erste Pathogen, gegen das eine Th17 Antwort beschrieben wurde, ist Borellia burgdorferi. B. burgdorferi induziert neben IL-17 die Freisetzung von TNF-α, GMCSF, und IFN-γ (Infante-Duarte et al., 2000; Dubin and Kolls, 2008). Viele Arbeiten haben gezeigt, dass IL-17 bei einer Reihe von Erkrankungen eine wesentliche Rolle spielen: So zum Beispiel bei Atemwegsinfekten. Bei Infektionen mit Klebsiella pneumoniae, Mycoplasma pulmonis, Pseudomonas aeruginosa und 12 Mycobakterium tuberkulosis sind Th17-Zellen an der Immunantwort beteiligt (Wu et al., 2007). Auch bei gastrointestinalen Erkrankungen wurden Th17-Zellen nachgewiesen. So konnte gezeigt werden, dass IL-17A eine zentrale Rolle bei Helicobacter pylori Infektion spielt (Caruso et al., 2007) wie auch bei Bacteroides fragilis induzierter Peritonitis, Salmonella typhimurium und Candida albicans Sepsis, so wie bei Aspergillus fumigatus und Candida albicans Infektionen (Chung et al., 2003; AcostaRodriguez et al., 2007; Huang et al., 2004; Zelante et al., 2007). Während IL-17 im Rahmen von Infekten eher einen protektiven Effekt hat, kommt ihm im Rahman von Autoimmunerkrankungen eine proinflammatorische destruierende Wirkung zu. Th17-Zellen kommen auch im arthritischen Gelenk in großer Zahl vor (Chabaud et al., 1999; Arroyo-Villa et al., 2012). Eine erhöhte IL-17 Konzentration führt dort zu einer Entzündung und somit zu ausgeprägten klinischen Symptomen. Die Neutralisation von IL-17 zeigte in Mausmodellen eine deutliche Minderung der Krankheitsschwere bei ausgebildeter Arthritis. IL-17 hat einen direkten Einfluss auf den Proteoglycan-Abbau und dadurch auf die Zerstörung der Gelenke (Koshy et al., 2002). Es konnte gezeigt werden, dass die Th17-Zellen die autoimmune Entzündungsreaktion in Tiermodellen der Multiplen Sklerose fördern können (Langrish et al., 2005; van Roon et al., 2006). Bei Patienten mit Multipler Sklerose konnte eine erhöhte Anzahl von IL-17-mRNA-exprimierenden Zellen im Liquor gefunden werden (Romagnani, 2008). Weiterhin konnten verschiedene Studien hohe IL-17-Serumkonzentrationen bei anderen Autoimmunerkrankungen wie dem systemischen Lupus erythematodes, dem Morbus Crohn (McGovern et al., 2009) und der Psoriasis nachweisen (Romagnani, 2008). 13 1.5 Molekulare Charakterisierung von IL-17 Die IL-17 Familie der Zytokine besteht aus fünf strukturell verwandten Isoformen: IL-17A, IL-17F, IL-17B, IL-17C und IL-17D (Starnes et al., 2002; Kolls and Linden, 2004). Vor Kurzem wurde ein sechstes Mitglied der IL-17 Familie reklassifiziert und neu benannt als IL-25, da es keine signifikante Homologie und Funktionsgemeinsamkeiten mit den anderen IL-17 Mitgliedern aufweist (Hurst et al., 2002; Lee et al., 2001). IL-17A und IL-17F weisen eine Homologie von 55% zueinander auf; beide sind als Homodimere aktiv. Wegen ihren strukturellen und funktionellen Gemeinsamkeiten und der Tatsache, dass sie beide von Th17-Zellen produziert werden, wurden IL-17A und IL-17F sehr gründlich untersucht und charakterisiert (Liang et al., 2007; Wright et al., 2007). 1.6 Molekulare Charakterisierung von Interferon-γ Interferon-Gamma (IFN-γ; „Immun-Interferon“) ist ein Glykoprotein aus 143 Aminosäuren, mit einer Molekularmasse von 20 bis 25 kDa und liegt in aktiver Form als Heterodimer vor. Es werden drei verschiedene Interferontypen unterschieden: IFN-α und IFN-β, die von Leukozyten und Fibroblasten synthetisiert werden, greifen beide am gleichen Rezeptor an. IFN-γ hingegen ist ein Zytokin, das durch CD4-Th1-Effektorzellen, CD8T-Zellen und NK-Zellen produziert wird. Seine Hauptfunktion ist die Aktivierung von Makrophagen: Es bewirkt in Makrophagen eine gesteigerte Leistung bei der Zerstörung von Tumorzellen und intrazellulären Erregern. Antiviral wirkt IFN-γ durch die Hemmung der intrazellulären Virusreplikation (Schroder et al., 2004; Janeway, 2009). 14 1.7 In vitro Modell der Immunantwort unter dem Einfluss von RSV Rothoeft et al. konnten anhand eines in vitro Modells der primären und sekundären Immunantwort zeigen, dass die naiven T-Zellen (an Tag 3) in ihrer IFN-γ Produktion deutlich gehemmt werden; die Gedächtnis Th1-Zellen (an Tag 21-24) hingegen nicht (Rothoeft et al., 2007). In seiner Arbeit wurden aus Nabelschnurblut naive T-Zellen und CD34-positive hämatopoetische Stammzellen gewonnen. Letztere wurden zu dendritischen Zellen ausgereift. Es wurden Kulturen mit T-Zellen und mit RSV (MOI 20) infizierten dendritischen Zellen angesetzt, ebenso viele nicht infizierte Kontrollkulturen. Mittels Durchflusszytometrie wurde die intrazelluläre Konzentration von IL-2, TNFα, IFN-γ, IL-10, IL-4 und IL-13 der T-Zellen an verschiedenen Tagen der Kulturreihe gemessen. In seinem in vitro Modell benutzte Rothoeft das Toxic-Shock-Syndrom Toxin als verstärkendes Agenz, da sich antigenspezifische naive T-Zellen im Nabelschnurblut mit so geringer Frequenz befinden, dass eine direkte Untersuchung in-vitro nicht möglich ist. Das Toxic-Shock-Syndrom Toxin (TSST) gehört zur Klasse der Superantigene. Es hat ein Molekulargewicht von 22 bis 24 kDa (Todd, 1988). Im Unterschied zu gewöhnlichen Antigenen werden Superantigene von T-Zellen direkt erkannt, ohne dass sie zu Peptiden verarbeitet und durch MHC-Moleküle an der Antigenbindungsstelle präsentiert werden. Vielmehr binden Superantigene direkt an MHC-II-Moleküle und spezifische Regionen des T-Zell-Rezeptors außerhalb der Antigenbindungsstelle. Diese Bindungsstellen auf dem T-Zell-Rezeptor liegen für die verschiedenen Superantigene auf verschiedenen Teilen des variablen Teils der β-Kette (Vβ). TSST bindet ausschließlich an Vβ2 (Choi et al., 1990). Durch ihre nicht antigenspezifische, sondern TCR-Vβ-Subtyp-spezifische Bindung können 10-20% der gesamten T-Zellen eines Individuums erreicht werden. Die massive T-ZellStimulation resultiert in-vitro in einer enormen Freisetzung von T-zellulären Mediatoren (Herman et al., 1991; White et al., 1989) wie IFN-γ und IL-17. 15 Messungen von Zytokinkonzentrationen wurden in der vorliegenden Studie ausschließlich an Vβ2-positiven T-Lymphozyten vorgenommen. Hierzu gehören etwa 10% der naiven T-Zellen. So wurde sichergestellt, dass das Toxin an die TZellen bindet und eine ausreichende und effektive Zytokinproduktion hervorruft, die durchflusszytometrisch gemessen wurde – ähnlich wie in der Arbeit von Rothoeft et al. 16 2 Fragestellung Die Th17-Zellen spielen bei einer ganzen Reihe von entzündlichen Erkrankungen mit Viren, Bakterien und Pilzen eine Rolle. Die primäre Immunantwort bei Säuglingen bzw. Kleinkindern unterscheidet sich von der Gedächtnisantwort der Erwachsenen. In Vorarbeiten wurde bereits nachgewiesen, dass die IFN-γ Produktion von naiven T-Zellen unter dem Einfluss von RSV infizierten dendritischen Zellen inhibiert wurde, während die Gedächtnis Th1-Zellen kaum gehemmt wurden (Rothoeft et al., 2007). Bisher gibt es jedoch kaum Arbeiten, die sich mit der Reaktion von Th17-Zellen bei einer RSV-Infektion beschäftigt haben. Uns interessiert, welchen Einfluss eine RSVInfektion auf die primäre und Gedächtnis- Th17-Zellantwort hat. Daraus ergibt sich folgende Fragestellung: Gibt es einen unterschiedlichen Einfluss von RSV auf die Produktion von IL-17 bei naiven und Gedächtnis Th17-Zellen? 17 3 Material und Methoden 3.1 Isolierung von mononukleären Zellen Das benötigte Nabelschnurblut wurde aus den Abteilungen Gynäkologie und Geburtshilfe (Augusta-Kranken-Anstalt Bochum und St. Elisabeth-Hospital Bochum) von den Hebammen nach der Geburt in 50 ml Röhrchen abgenommen. Die Eltern haben der Verwendung des Nabelschnurbluts für Forschungszwecke zugestimmt. Das Röhrchen enthielt bereits 7 ml einer antibiotischen und antithrombogenen Pufferlösung, bestehend aus 94% Citrat-Phosphat-Dextrose Lösung, 2% HepesPuffer und je 2% Kanamycin und Partricin. Verwendet wurde nur Nabelschnurblut, das nicht älter als max. 24 Stunden war und keine Koagel enthielt. Im Labor wurde das Nabelschnurblut in 6-7 ml Portionen aufgeteilt, mit PBS-CPD auf 35 ml aufgefüllt, geschwenkt und mit 15 ml Ficoll Seperation Solution vorsichtig unterschichtet. Anschließend wurde zur Trennung der mononukleären Zellen bei 350 g 30 Minuten lang zentrifugiert. Aufgrund der höheren Dichte setzen sich die Erythrozyten und die polymorphkernigen Leukozyten am Boden des Röhrchens ab, darüber befindet sich das Ficoll. Die mononukleären Zellen reichern sich genau in der Übergangsphase zwischen dem Ficoll und dem Plasma an. Die Interphase wurde vorsichtig abgesaugt, je zwei Interphasen in ein neues 50 ml Röhrchen pipettiert und 10 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet aufgeschüttelt. Zur Elimination der Thrombozyten wurden diese Zellen in ein Röhrchen gegeben, mit PBS-CPD auf 50 ml aufgefüllt und 15 Minuten lang bei 180 g zentrifugiert. Das Pellet wurde erneut resuspendiert und mit einem Nylon-Zellsieb von Zelltrümmern und Nabelschnurbestandteilen getrennt. Zur Zählung der Zellen wurden die Zellen mit Türkscher Lösung angefärbt in einer Neubauer Kammer unter dem Mikroskop gezählt. 18 3.2 Isolierung von CD34-positiven Zellen Pro 1×108 mononukleäre Nabelschnurblutzellen wurde zuerst 100 µl Fc-Blocking Reagenz und danach 100 µl CD34-Mikrobeads eingesetzt, mit Puffer auf ein Volumen von 500 µl verdünnt und im Kühlschrank bei 30 Minuten lang inkubiert. Das Fc-Blocking Reagenz bindet an den Fc-Rezeptor der Monozyten und blockiert ihn, um unspezifische Bindungen zu verhindern. Nach der Inkubation wurden die überschüssigen Antikörper ausgewaschen. Die CD34-Mikrobeads sind an paramagnetische Partikel gekoppelte Antikörper. Das Zellgemisch wurde dann über eine MiniMACS-Sortiersäule gegeben, die sich in einem magnetischen Feld befand. Die an die Antikörper beladenen Zellen banden an der magnetisierten Stahlwolle in der Säule, während nicht gebundene Zellen ausgewaschen wurden. Die Zellen im Durchlauf enthielten naive T-Zellen, die für die weiteren Experimente im Einfriermedium zunächst 24h lang bei –85°C heruntergekühlt und anschließend im flüssigen Stickstoff bei -196°C gelagert wurden. Die an die Stahlwolle gebundenen Zellen wurden nach Entfernen der Säule aus dem Magnetfeld ausgewaschen. Um eine 99,9 prozentige Reinheit zu erhalten, wurde der Reinigungsvorgang wiederholt. Die CD34-positiven Zellen wurden mit Stammzellfaktor, GM-CSF (100 ng/ml) und TNF-α (2,5, ng/ml) in Kulturmedium bei 37°C für 7 Tage inkubiert. Die Zellen wurden täglich im Umkehrmikroskop inspiziert und in Abhängigkeit von der zunehmenden Zellzahl auf weitere Kulturgefäße verteilt, um eine optimale Konzentration zu erhalten. Am 7. Tag wurden die ausdifferenzierten Vorläuferzellen geerntet und bis zur Weiterverwendung zunächst für 24h lang im Einfriermedium bei –85° und dann im flüssigen Stickstoff bei -196°C gelagert. Zur weiteren Ausreifung der dendritischen Zellen wurden Tag 7 DC-Vorläufer aufgetaut und restimuliert. 19 3.3 Auftauen und Restimulation der dendritischen Zellen Zum Auftauen wurden die dendritischen Zellen in 37°C Wasserbad angetaut, in 40ml PBS überführt und dreimal jeweils 10 Minuten bei 300 × g gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in 10 ml Kulturmedium resuspendiert (RPMI, 10% FCS, 1% Kanamycin, Kulturzusätze) und mit Türckslösung angefärbt in der Neubauerkammer unter dem Mikroskop gezählt. Aufgetaute und gewaschene Zellen wurden auf eine Konzentration von 4 x 105 / ml in Kulturmedium eingestellt. Pro 4 x 105 Zellen erfolgte die Stimulation mit 125 IU / ml IL-4, 2,5 ng / ml TNF-α und 100 ng / ml GM-CSF. Die Zellen reiften weiter aus bis Tag 12, und wurden bis dahin nicht mehr geteilt. An Tag 12 wurden die dendritischen Zellen dann mit RSV infiziert und 24h später in der Kokultur eingesetzt. 3.4 Gewinnung von naiven T-Zellen Der von CD34-positiven Stammzellen depletierte Durchlauf wurde als Quelle von autologen naiven T-Zellen genutzt. Die eingeforenen Zellen wurden aufgetaut, dreimal gewaschen und vor dem 3. Waschen in der Neubauerkammer gezählt. Nach dem 3. Waschen wurde das Pellet in einem Kleinstvolumen (ca. 100 µl) resuspendiert. Um alle Leukozyten bis auf die naiven T-Zellen und die Normoblasten aus der Suspension entfernen zu können, wurden pro 107 Zellen jeweils 20µl von folgenden Beads zugegeben: CD14, CD56, CD16 (10 µl / 107 Zellen), HLA-DR, CD45R0 und Glycophorin A. Nach der Zugabe der Beads wurden die Zellen 15 Minuten im Kühlschrank inkubiert und anschließend nochmals gewaschen und im AUTOMACS-Geräts über das Programm depleteS entfernt. In der Negativfraktion befanden sich dann die „untouched“ naiven T – Zellen. Diese wurden in 1ml Kulturmedium aufgenommen und in der Neubauerkammer gezählt. 20 3.5 Virusanzucht und Infektion der dendritischen Zellen Zur Anzucht der RS-Viren wurden kultivierte HeP2 Zellen mit RS-Viren (Long-Strain) in niedriger Konzentration (Multiplicity of infection 0,1) inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von ca. 60 h bei 37°C wurden die noch nicht abgelösten Zellen mittels eines Zellschabers abgelöst. Mit Hilfe eines Utraschallgerätes wurden die Zellen aufgeschlossen, um eine möglichst hohe Zahl freier Viruspartikel zu erlangen. Zelluläre Partikel wurden durch eine Zentrifugation bei 900 g abgetrennt und die virushaltige Zellsuspension bei -85°C gelagert. Der Grad der Infektiösität wurde durch eine Austritration auf HeP2-Zellen bestimmt. Nach 48 Stunden wurden die Kulturen inspiziert. Der Virustiter mit einer Multiplicity of Infection (MOI) von 1 entsprach der Verdünnungsstufe, bei der gerade noch ein zytopathischer Effekt beobachtet werden konnte. Die Zelllinien und Viruspräparationen wurden in einer PCR mit einem kommerziellen Mykoplasmen-Detektions-Kit (Venor GeM®) - wie in der Arbeitsanleitung des Herstellers beschrieben (Minerva Biolabs, Berlin, Deutschland) - auf Mykoplasemeninfektion untersucht. Um die dendritischen Zellen mit RSV zu infizieren, wurden 5 x 105 dendritische Zellen in 200µl für 2 Stunden mit 1 ml Virussuspension (MOI 20) in serumfreiem RPMI 1640 inkubiert. Der virushaltige Überstand wurde entfernt und durch Kulturmedium mit 10% FCS ersetzt. Die Kokulturen von dendritischen Zellen und T-Zellen wurden 24h nach Infektion angesetzt. Vorexperimente haben gezeigt, dass zu diesem Zeitpunkt 85% der dendritischen Zellen weiter lebensfähig waren. 3.6 Zeitlicher Ablauf der Kokultur Die folgenden Messungen wurden an 23 aufeinander folgenden Tagen durchgeführt, wobei als Tag 0 der Tag bestimmt wurde, an dem die Kokultur angelegt werden konnte. Da zur Vorbereitung der dendritischen Zellen ein Tag verwendet wurde, begann die Versuchsreihe am Tag -1 mit dem Auftauen und Infizieren; über Tag 0: kokultivieren von naiven T-Zellen mit dendritischen Zellen 21 desselben Spenders; Tag 3, 7, 15, 21 Messung von intrazellulärem IL-17 und IFN-γ in Vβ2-positiven T-Zellen; Tag 6, 13, 19 Auftauen einer Portion dendritische Zellen und vorbereiten, damit an Tag 7, 14, 20 die Restimulation der Kokulturen erfolgen konnte. An Tag -1 wurden die dendritischen Zellen nach 12 Tagen geerntet und bei 300 g 10min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und die Zellen in 3 ml DMEM – Medium ohne Zusätze resuspendiert. Anschließend erfolgte die Zellzählung in der Neubauerkammer, sodass eine Zellkonzentration von 5×104 pro 300 µl mit DMEM eingestellt werden konnte. Angelegt wurden 8 Wells nicht infizierte Kontrollansätze und 8 Wells infiziert mit RSV longstrain (MOI 20). Beide Kulturen wurden für 3 Stunden bei 37°C im Brutschrank bebrütet, dann wurden 200µl Medium bzw. virushaltiger Überstand vorsichtig abpipettiert und 500 µl Kulturmedium (RPMI, 10% FCS, Kulturmedium) zugegeben. Anschließend erfolgte die Inkubation im Brutschrank über Nacht. Alle Zellen, die am Tag –1 nicht eingesetzt wurden, wurden auf 3 gleich große Portionen aufgeteilt und eingefroren (benötigt für die Restimulation der Kokultur an Tag 7, 14, 20). An Tag 0 wurden die Kokulturen angelegt: Die aus dem Nabeldurchlauf gewonnenen naiven T-Zellen (s.o.) wurden auf eine Konzentration von 5x105 / 500µl eingestellt und zu den am Tag -1 vorbereiteten dendritischen Zellen (nicht infizierte u. infizierte) zugegeben. Zur Stimulation erfolgte die Zugabe von 0,1 ng / ml TSST. An Tag 3 wurden 4 nicht infizierte und 4 infizierte Wells mit 20 ng/ml PMA und 100 ng/ml Ionomycin 3h lang stimuliert. Dann erfolgte die Zugabe von 10 µg/ml Brefeldin A als Proteintransporthemmer für weitere 2h. Der Effekt ist folgender: die gebildeten Zytokine werden im Golgiapparat gespeichert und können die Zelle nicht mehr verlassen. Dadurch sammelt sich so viel Zytokin im Golgiapparat an, dass es intracellulär angefärbt und im Durchflusszytometer (FACS) gemessen werden kann (s.o.). 22 Die Kulturen wurden wieder in den Brutschrank bei 37°C bebrütet. Die Ansätze, die nicht mit PMA u. Ionomycin stimuliert wurden, wurden weiterkultiviert wie bisher. An Tag 6 wurde in alle Wells 50 IU / ml IL-2 zugeben. Eine Portion dendritische Zellen wurde aufgetaut, 3x gewaschen, gezählt und die Zellkonzentration auf 1x105 in 300 µl DMEM eingestellt. Angelegt wurden ein Well mit longstrain RSV (MOI 20) und ein Well mit uninfizierten dendritischen Zellen. Nach 3h bei 37°C im Brutschrank wurde das Medium bzw. der virushaltige Überstand abpipettiert, 1ml Kulturmedium (RPMI, 10% FCS, Zellkulturzusätze) zugegeben und über Nacht bei 37°C wieder in den Brutschrank gelegt. An Tag 7 wurde je ein nicht infiziertes und ein infiziertes Well (von Tag 3) mit PMA, Ionomycin stimuliert (siehe Tag 3). Nach 5h fixieren und permeabilisieren erfolgte die intrazelluläre Messung von IL-17 und IFN-γ auf Vβ2-positiven T-Zellen. Zur Restimulation der Kokultur mit dendritischen Zellen wurden die an Tag 6 vorbereiteten dendritische Zellen für 10 min. auf Eis gestellt. Das Zellwachstum wurde in der Kokultur mikroskopisch beurteilt. Die Zellen hatten sich in der Regel stark vermehrt, daher wurden die Kokulturen gründlich mit der Eppendorfpipette gemischt und je 500 µl verworfen. Dann wurden 500 µl dendritische Zellen pro Well zugegeben und es folgte die Zugabe von 0,1 ng / ml TSST (wie an Tag 0). An Tag 10 wurde in alle Wells IL-2, 50 IU / ml zugegeben. An Tag 13 und 14 erfolgte eine erneute Restimulation, und an Tag 15 die Stimulation mit PMA, Ionomycin, sodass nach 5h Fixieren und Permeabilisieren die intrazelluläre Messung von IFN-γ und IL-17 auf Vβ2-positiven T-Zellen erfolgte. Danach wurde weiter inkubiert und verfahren, wie oben beschrieben. Analog erfolgten eine zweite Restimulation und eine Auswertung am Tag 20. Und an Tag 21 erfolgte zum letzten Mal nach 5h fixieren und permeabilisieren die intrazelluläre Messung von IL-17 und IFN-γ. 23 3.7 Fixierung, Permeabilisierung und Färbung der T-Zellen Zum intrazellulären Nachweis der Zytokine IL-17 und IFN-γ in Effektorzellen wurden die Zellen mit 20ng/ml Phorbolester und 100ng/ml Ionomycin für 5 Stunden stimuliert und die intrazellulären Transportprozesse durch Zugabe von 10µg/ml Brefeldin A während der letzten 2 Stunden der Inkubationszeit unterbrochen. Dies führte zu einer Akkumulation der Zytokine im Golgi-Apparat und damit zu einem durchflusszytometrisch messbaren Signal auf Einzelzellniveau. Die Zellen wurden für diese Messung mit 4% Paraformaldehyd für 10 min fixiert, und anschließend gewaschen. Die Inkubation mit den spezifischen Antikörpern erfolgte für 15Min bei 4°C. Es folgte ein Auswaschen der nichtgebundenen Antikörper (mit 1000µl PBSPuffer) für 10 Min bei 300g. Das Pellet wurde in 250µl frischem Puffer für die Messung aufgenommen. Die Fixierung, Permeabilisierung und Färbung der T-Zellen erfolgte in gleicher Art und Weise an Tag 3, 7, 15, 21. 3.8 Messung von intrazellulärem IFN-γ und IL-17 in Vβ2positiven T-Zellen Die fluoreszenzaktivierte Zellanalyse (FACS-Analyse) ist ein Verfahren zur quantitativen Proteinen. Bestimmung Grundlage ist von die Oberflächenmolekülen und intrazellulären Antigen-Antikörper-Reaktion, die mit Fluoreszenzfarbstoff-markierten Antikörpern durchgeführt wird. Die Zellen werden durch eine Kapillare gedrückt, sodass ein Strom einzelner Zellen entsteht, der dann von einem Laserstrahl erfasst wird. Bei Anregung der Elektronen des Fluoreszenzfarbstoffes durch den monochromatischen Laserstrahl werden diese auf ein höheres Energieniveau gehoben. Nach dem Laserimpuls fallen die Elektronen unter Abgabe von Energie (in Form von Photonen) auf ihr Ursprungsniveau zurück. Die Intensität des emittierten Lichts, die durch einen Photodetektor registriert wird, verhält sich proportional zur Menge an gebundenen Antikörpern pro Zelle. Zusätzlich werden durch die Lichtbeugung und -streuung Informationen über die 24 Zellgröße und die Binnenstruktur (Granularität des Zytoplasmas, Größe des Zellkerns usw.) der Zellen gewonnen. (Janeway, 2009) 3.8.1 Aufbau eines Durchflusszytometers Ein FACScan Durchflusszytometer, das mit Filtern für FITC und PE ausgerüstet war, wurde zur Messung verwendet. Zur Analyse wurde die in einem Reagenzröhrchen vorgegebene Zellsuspension in einer Konzentration von 2 x 105/200µl über eine Stahlkapillare durch Überdruck in die aus Quarzglas bestehende Meßküvette eingeführt. Die Zellen passierten, von einem Hüllstrom umgeben, den Analysepunkt. Der Hüllstrom diente dazu, den Probestrom im Zentrum der Meßküvette zu stabilisieren und so zu verengen, dass die Zellen hintereinander, einzeln, zum Analysepunkt gelangten (Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung) (siehe Abb.2) Zur Messung wurden 50.000 Ereignisse im List Mode aufgenommen und mit der CellQuest Software ausgewertet. Abbildung 2: Hydrodynamische Fokussierung im Durchflusszytometer Becton Dickinson GmbH, 1987) 25 3.8.2 Messung der Lichtstreuung Aufgrund der Lichtstreuung wird nur die Richtung, nicht die Wellenlänge des Lichtes verändert. Zur Lichtstreuung tragen folgende Zelleigenschaften bei: - Zellgröße - Zellmembran - Zellkern - intrazelluläre granuläre Bestandteile Der größte Anteil, der in die Vorwärtsrichtung fällt (d.h. entlang des einfallenden Lichtstrahls) ist hauptsächlich ein Maß für die Zellgröße (Vorwärtsstreulicht). Das im rechten Winkel zum einfallenden Lichtstrahl gestreute Licht hängt von der Zelldichte und der Granularität, jedoch nur zum geringen Teil von der Zellgröße ab (Rechtwinkelstreulicht). Anhand der Lichtstreuung wurden Lymphozyten mit starker Vorwärts- aber geringer Seitwärtsstreuung in die Analyse aufgenommen (Abb. 3A). 3.8.3 Messung der Fluoreszenz Die Fluoreszenzfarbstoffe für die Durchflusszytometrie waren an monoklonale Antikörper gekoppelt, die sich spezifisch gegen die zu untersuchenden Antigene richten. Die zytokinspezifischen Antikörper gegen IL-17 und IFN-γ waren mit Phycoerythrin (PE) mit einem Emissionsmaximum bei 585 nm markiert. Der für den T-Zellrezeptor spezifische Antikörper gegen Vβ2 war mit Fluoreszeinisothiocanat (FITC) mit einem Emissionsmaximum Vergleichsansatz wurde eine bei 530 nm markiert. In einem phycoerythrinmarkierte IgG1-Isotypkontrolle gegengefärbt mit Vβ2 FITC mitgeführt. Die zuvor anhand der Lichtstreuung gegateten mononukleären Zellen (s.o.) wurden anhand der Färbung im FITC Kanal in Vβ2-positive und -negative Zellen unterschieden (Abb. 3B). 26 3.8.4 Typisches Beispiel einer Messung Abbildung 3: Durchflusszytometrische Messung der Zytokin-produzierenden T-Zellen (A) Alle peripheren mononukleären Blutzellen wurden anhand der Vorwärts- und Seitwärtsstreuung gegated. (B) In der Region R3 werden die Vß2-negativen und in R2 die Vß2-positiven T-Zellen voneinander abgegrenzt. Die weitere Analyse erfolgt nur mit Vß2-positiven T-Zellen. (C) Anhand der mit einem IgG1-PE Kontrollantikörper gegengefärbten Kontrolle wird der Marker M1 gesetzt. (D) Der Prozentsatz der IL-17 produzierenden in der Fraktion der Vß2-positiven T-Zellen wird innerhalb der zuvor festgelegten Region M1 gemessen. 3.9 Statistik In der Regel wurde jedes Experiment sechsmal wiederholt. Die statistischen Berechnungen wurden mit Hilfe des Programms GraphPad Prism 4.0 für Windows (GraphPad Software, San Diego California USA) durchgeführt. Es wurde der Kruskal-Wallis Test mit einem DunnsPost-Test durchgeführt. 27 3.10 Auflistung der verwendeten Materialien Anti-CD14: Miltenyi-Biotec, Bergisch-Gladbach 130-050-201 Anti- CD16: Miltenyi-Biotec, Bergisch-Gladbach 130-045-701 Anti-CD34 MicroBead Kit human: (enthält Microbeads und Fc-Rezeptor Blocking Reagent) Miltenyi Biotec; Best.-Nr.130-046-702 Anti-CD45R0 : Miltenyi-Biotec, Bergisch-Gladbach 130-046-001 Anti-CD56 : Miltenyi-Biotec, Bergisch-Gladbach 130-050-401 Anti-HLA-DR: Miltenyi-Biotec, Bergisch-Gladbach 130-046-101 Brefeldin A: Sigma, Deisenhofen, 91K4025 Citrat-Phosphat-Dextrose-Lösung: Sigma; Deisenhofen; Best.-Nr. 6-7165 Cryo Tubes, 1 ml Nalge Nunc International; Dänemark; Best.-Nr. 363401 Durchflusszytometer FACS: Becton Dickinson,Heidelberg DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Biochrom KG; Berlin Einfriermedium: 45% FCS 44% RPMI 10% DMSO (Dimethylsulfoxid): Sigma 200-664-3 1% Kanamycin FcR-Blocking Reagenz: Miltenyi-Biotec, Bergisch-Gladbach 130-059-901 FCS (Fetales Calf Serum): Biochrom KG; Berlin; Best.-Nr. S 0115 Ficoll separating solution: Biochrom KG; Berlin; Best.-Nr. L 6115 Fuchs-Rosenthal-Zählkammer Glycophorin A : Miltenyi-Biotec Bergisch-Gladbach 130-050-501 GM-CSF: Heidelberg; Best.-Nr. 35 2096 HEPES Puffer 1M: Biochrom KG; Berlin; Best.-Nr. L 1613 IL-2; IL-4 und IL-5: Pepro-tech/tebu GmbH, Offenbach Ionomcin: Sigma, Taufkirchen, Germany Kanamycin: Biochrom AG; Best.-Nr. A 2512 Kulturmedium ( RPMI, 10% FCS, 1% Kanamycin, Kulturzusätze) Kulturzusätze: nährstoffreiche und keimhemmende Lösung: 1,0 % L-Glutamin 200mM; Biochrom KG; Berlin; Best.-Nr. K0282 28 1,0 % Natrium-Pyruvat 100mM; Biochrom KG; Berlin; Best.-Nr. L0473 1,0 % nicht essentielle Aminosäuren; Biochrom KG; Berlin; Best.-Nr. K 0293 MACS Seperation Columns: Miltenyi Multiwell-Platte mit Flachboden, 24 wells: Falcon/ Becton Dickinson; Heidelberg; Best.-Nr. 35 3047 Neubauer Zählkammer Paraformaldehyd: Riedel-de-Haen; Germany; Best.-Nr.16005 Partricin: Biochrom AG; Best.-Nr. A 2812 PBS-Dulbecco: Biochrom KG; Berlin; Best.-Nr. L 1825 Phorbolester (PMA): Sigma, Taufkirchen, Germany Reagenzröhrchen mit Schraubverschluss, 15,0 ml: Falcon/ Becton Dickinson; Reagenzröhrchen mit Schraubverschluss, 50,0 ml Falcon/ Becton Dickinson; Heidelberg; Best.-Nr. 35 2070 RPMI 1640 Medium: Biochrom KG; Berlin; Best.-Nr. F 1415 RSV: long strain; ATCC Sandoz/ Essex Pharma; Deutschland Saponin: 16109, Riedel de Haen, Seelze Stammzellfaktor: Pepro-Tech TEBU; Frankfurt am Main; Best.-Nr.300-07; TNF-α: Genzyme; Deutschland; TSST: Sigma, Best.Nr. T5662 Türksche Lösung: Fluca; Steinheim; Best.-Nr. 93770 Varifuge K: Heraeus Christ Zellsieb, 40 μm: Falcon/ Becton Dickinson; Heidelberg; Best.-Nr. 35 2340 29 4 Ergebnisse 4.1 Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen der Konzentration des Superantigens TSST und der Zytokinproduktion Im ersten Schritt sollte die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen der Konzentration von TSST und der Zytokinproduktion untersucht werden. Dazu wurden dendritische Zellen aus Stammzellen des Nabelschnurbluts unter Zusatz von GM-CSF und TNF-α über 7 Tage und dann zusätzlich mit Interleukin-4 für weitere 5 Tage angezüchtet. Lymphozyten aus der gleichen Nabelschnurblutprobe wurden während der Anzüchtung der dendritischen Zellen in flüssigem Stickstoff gelagert. Sie dienten als Ausgangsmaterial zur Isolation von naiven T-Zellen, die im Verhältnis von 10:1 mit den dendritischen Zellen kokultiviert wurden. Zu diesen Kokulturen wurden jeweils 0,1 ng, 1 ng oder 10 ng TSST gegeben. Nach 3 Tagen wurde dann durchflusszytometrisch in Vβ2 exprimierenden T-Zellen der Prozentsatz von IL-17 und Interferon-γ produzierenden Zellen bestimmt. Insgesamt wurden jeweils sechs unabhängige Kulturansätze untersucht. Abbildung 5 zeigt die IL-17 Produktion. Bereits die niedrigste Konzentration von 0,1 ng TSST bewirkt eine hoch signifikante Zunahme im Vergleich zum Kontrollansatz ohne TSST. Mit weiter steigender Konzentration des TSST fallen die gemessenen Prozentzahlen an IL-17 produzierenden Zellen tendenziell sogar wieder ab. Parallel zur IL-17 Produktion wurde die IFN-γ Produktion gemessen (Abb.6). Auch hier führte bereits 0,1 ng TSST zu einer deutlichen Stimulation. Eine weitere Dosissteigerung führte tendenziell eher zu einer weiteren Zunahme, die aber im Vergleich zu den Werten, die mit 0,1 ng TSST gemessen wurden, nicht signifikant war. Für die weiteren Experimente wurden deshalb 0,1 ng TSST zur Stimulation verwendet. 30 P < 0.05 100 ns P < 0.001 Expression [%] 75 ns ns 50 ns 25 0 ohne 0.1 1 10 TSST [ng] Abbildung 5: IL-17-Produktion an Tag 3 in Vβ2-positiven T-Zellen, die mit unterschiedlichen TSST-Konzentrationen in Anwesenheit von dendritischen Zellen kostimuliert wurden. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standardabweichung aus 6 Experimenten. ns steht für nicht signifikant 31 P < 0.05 P < 0.05 60 P < 0.05 Expression [%] 50 40 ns ns 30 ns 20 10 0 ohne 0.1 1 10 TSST [ng] Abbildung 6: IFN-γ-Produktion an Tag 3 in Vβ2-positiven T-Zellen, die mit unterschiedlichen TSST-Konzentrationen in Anwesenheit von dendritischen Zellen kostimuliert wurden. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standardabweichung aus 6 Experimenten. 4.2 Messung der IL-17- und IFN-γ-Expression von naiven und Gedächtniszellen Wie in den vorbeschriebenen Experimenten wurden dendritische Zellen angezüchtet. Ein Teil dieser Zellen wurde zu Beginn der Kulturreihe mit naiven TZellen kokultiviert und mit 0,1 ng TSST stimuliert. Ein weiterer Teil der angezüchteten dendritischen Zellen wurde in flüssigem Stickstoff gelagert und zur Restimulation an späteren Zeitpunkten verwendet. Die erste Messung der intrazellulären Zytokinproduktion Vβ2 exprimierender TZellen erfolgte dann nach 3 Tagen Kulturdauer. Nach 7 Tagen wurde erneut gemessen und die verbliebenen T-Zellen wurden mit frisch aufgetauten dendritischen Zellen restimuliert. Analog erfolgten am 15. Tag eine erneute 32 Messung von Interferon-γ und IL-17 und eine Restimulation der verbliebenen TZellen. Die letzte Messung erfolgte dann am Tag 21. Abbildung 7 zeigt den zeitlichen Verlauf der IL-17 Produktion, die bereits nach sieben Tagen bei bis zu 68 % der Vβ2-tragenden T-Zellen nachweisbar war. Die IFN-γ Produktion zeigte ihr Maximum ebenfalls am 7. Tag, um dann geringfügig, aber nicht signifikant abzufallen (Abbildung 8). P < 0.01 P < 0.05 80 P < 0.05 70 Expression [%] 60 ns 50 ns 40 ns 30 20 10 0 Tag 3 Tag 7 Tag 15 Tag 21 Abbildung 7: IL-17-Produktion an Tag 3, 7, 15 und 21 in Vβ2-positiven T-Zellen, die mit 0,1 ng TSST in Anwesenheit von dendritischen Zellen kostimuliert wurden. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standardabweichung aus 6 Experimenten. 33 P < 0.05 P < 0.05 100 P < 0.05 Expression [%] 75 ns ns 50 ns 25 0 Tag 3 Tag 7 Tag 15 Tag 21 Abbildung 8: IFN-γ-Produktion an Tag 3, 7, 15 und 21 in Vβ2-positiven T-Zellen, die mit 0,1 ng TSST in Anwesenheit von dendritischen Zellen kostimuliert wurden. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standardabweichung aus 6 Experimenten. 4.3 Unterschiedliche Zytokinexpression von naiven und Gedächtniszellen unter dem Einfluss von RSV Um den Einfluss einer RSV-Infektion auf die IL-17 Produktion zu untersuchen, wurde ein Teil der dendritischen Zellen einen Tag vor Zugabe zu den T-Zellen mit RSV infiziert. Außerdem wurden Kokulturen mit RSV-infizierten bzw. nicht-infizierten dendritischen Zellen und mit naiven T-Zellen angelegt. Da die Frage geklärt werden sollte, ob Unterschiede zwischen der Primärantwort und der Sekundärantwort bestehen, wurden Ansätze am 3. Tag der Kultur und nach mehrfacher Restimulation zu einem Zeitpunkt der konsolidierten Memory-Antwort am Tag 21 miteinander verglichen. Dabei zeigte sich eine signifikante Reduktion der IL-17 Produktion in RSV-infizierten Kulturen in der Primärreaktion – an Tag 3 (Abbildung 9). In der Sekundärreaktion kam es dagegen tendenziell eher zu einer Zunahme der IL-17 Produktion in RSV infizierten Kulturen. Insgesamt lag die 34 Sekundärreaktion im Vergleich zur Primärreaktion auf einem deutlich höheren Niveau (72 % versus 51 %). Die Interferon-γ Produktion (Abbildung 10) zeigt vergleichbare Unterschiede: In der Primärantwort eine Hemmung der Zytokinproduktion durch RSV und in der Sekundärantwort insgesamt ein höheres Niveau unabhängig von einer RSV-Infektion (Abbildung 9). P < 0.01 100 P < 0.05 Expression [%] 75 ns 50 P < 0.01 25 or y y m em or em m I2 0 O M SV R oh ne I2 0 R SV O M SV R oh ne R SV na iv na iv 0 Abbildung 9: IL-17-Produktion in Vβ2-positiven naiven (Tag 3) und Memory (Tag 21) T-Zellen, die mit 0,1 ng TSST in Anwesenheit von RSV infizierten und nicht infizierten dendritischen Zellen kostimuliert wurden. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standardabweichung aus 6 Experimenten. 35 P < 0.01 100 P < 0.05 90 Expression [%] 80 ns 70 60 50 P < 0.01 40 30 20 10 or y m em or y em m I2 0 O M SV R oh ne I2 0 R SV O M SV R oh ne R SV na iv na iv 0 Abbildung 10: IFN-γ-Produktion in Vβ2-positiven naiven (Tag 3) und Memory (Tag 21) T-Zellen,, die mit 0,1 ng TSST in Anwesenheit von RSV indizierten und nicht infizierten dendritischen Zellen kostimuliert wurden. Dargestellt ist der Mittelwert ± Standardabweichung aus 6 Experimenten. 36 5 Diskussion IL-17 spielt bei einer Vielzahl von Immun- und Entzündungsprozessen als primärer proinflammatorischer Regulator eine Rolle, in dem es die Expression von verschiedenen inflammatorischen Mediatoren induziert. Bisher haben sich nur wenige Arbeiten mit der Rolle von IL-17 bei viralen Erkrankungen befasst. In dieser Arbeit ist das RS-Virus von Interesse, da es im Kindesalter zu schweren Bronchiolitiden und im Laufe des Lebens zu symptomatischen Reinfektionen kommt (Henderson et al., 1979; Hall et al., 1991; Scott et al., 2006) und eine effektive Impfung bislang nicht existiert (Piedra, 2003). RSV interagiert mit dendritischen Zellen und beeinflusst somit direkt die primäre TZellantwort (Gill et al., 2005; Bartz et al., 2003; Schauer et al., 2004; Krishnan et al., 2004), in der auch Th17-Zellen eine Rolle spielen. In der vorliegenden Arbeit wurde die IL-17-Produktion unter dem Einfluss von mit RSV-infizierten dendritischen Zellen bei naiven und Gedächtnis T-Zellen untersucht. Dabei repräsentiert die Reaktion der naiven T-Zellen modellhaft die mit viel ausgeprägteren Symptomen einhergehende Primärinfektion mit RSV, während die milder verlaufende Reinfektion in unserer Arbeit beispielhaft durch Untersuchungen an Gedächtnis Th17-Zellen dargestellt wird. Unsere Ergebnisse zeigen eine differierende IL-17-Produktion bei naiven und Gedächtnis Th17-Zellen unter dem Einfluss von mit RSV-infizierten dendritischen Zellen: bei den naiven T-Zellen wird die IL-17 Produktion gehemmt, die Gedächtniszellen hingegen werden in ihrer IL-17 Produktion nicht beeinflusst. 37 5.1 Unterschiedliche Antworten naiver und Gedächtnis Th1Zellen auf mit RSV-infizierten dendritischen Zellen In der Literatur ist die Hemmung von IFN-γ bei der primären Immunantwort im Vergleich zur sekundären Immunantwort beschrieben. Rothoeft konnte in einem vergleichbaren Kultursystem zeigen, dass naive T-Zellen (an Tag 1) in ihrer IFN-γ Produktion deutlich gehemmt werden, die Gedächtnis Th1-Zellen (an Tag 21-24) hingegen nicht signifikant. Außerdem zeigte sich an Tag 7, dass die RSV-infizierten Kulturen vermehrt IL-4 produzieren (Rothoeft et al., 2007). Diese Erkenntnisse decken sich mit vorliegender Arbeit, bei der vergleichbare Ergebnisse für die IFN-γ Produktion zu finden waren. Die Hemmung von IFN-γ bei der primären Immunantwort wurde auch in klinischen Arbeiten bewiesen: die frühe Phase der Immunantwort ist charakterisiert durch die RSV-induzierte Hemmung der IFN-γ Produktion und korrespondiert mit klinischen Untersuchungen von an Bronchiolitis erkrankten Kindern (Aberle et al., 2004). Somit kommen die in vitro Experimente der in vivo Situation nahe. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit auch die IL-17 Produktion der naiven und Gedächtnis Th17-Zellen gemessen, die bisher noch nicht untersucht wurde. 5.2 Mögliche Mechanismen für die Hemmung der IL-17Produktion Eine mögliche Erklärung für die unterschiedliche Induktion von IL-17 in naiven und Gedächtnis T-Zellen unter dem Einfluss von RSV ist die Tatsache, dass naive T-Zellen keine Rezeptoren für IL-23 besitzen (Mangan et al., 2006). Th17 werden in ihrer IL17-Produktion durch IL-23 gesteigert. Das von dendritischen Zellen produzierte IL23 sorgt bei den Gedächtnis Th17-Zellen für eine Steigerung der IL-17 Produktion, während es auf die naiven T-Zellen keine Wirkung hat. Ob und inwiefern IL-23 hier eine Rolle spielt, muss in weiteren Arbeiten geklärt werden. 38 Darüber hinaus spielen sicherlich auch die Mechanismen eine Rolle, die für die herabgesetzte Bildung von IFN-γ durch naive T-Zellen in RSV-infizierten Kulturen diskutiert werden. Da die Aktivierung von Gedächtnis T-Zellen weniger abhängig von starken Stimulationssignalen ist, könnte ein Erklärungsversuch für die unterschiedlichen Antworten der Gedächtnis- und naiven T-Zellen auf RSV die schwache Aktivierung der dendritischen Zellen durch RSV sein – wie es in Arbeiten von Rothoeft und Bartz an dendritischen Zellen aus Nabelschnurblut beschrieben wurde. (Rothoeft et al., 2007; Bartz et al., 2003) Eine RSV-Infektion führt dazu, dass dendritische Zellen kostimulierende Moleküle und T-Zellen im Sinne einer primären Immunantwort aktivieren (Bartz et al., 2002; Beyer et al. 2004). Voraussetzung dafür, dass die T-Zelle das Antigen erkennt, ist, dass die dendritische Zelle das phagozytierte Material im Zellinneren prozessiert und es in Form eines Peptid: MHC-Komplexes den T-Lymphozyten präsentiert. Befindet sich der Erreger in intrazellulären Vesikeln, so werden die Peptidantigene an MHC-Klasse-II-Molekülen gebunden und an die Zelloberfläche transportiert. Ihre Präsentation bewirkt eine Differenzierung der naiven T-Lymphozyten in entweder IFN-γ produzierende Th1-, IL-4 produzierende Th2-Zellen oder IL-17 produzierende Th17-Zellen. RSV scheint die aus Monozyten entstammenden dendritischen Zellen vollständig zu aktivieren, was ebenfalls die T-Zellfunktion inhibiert. De Graaff et al. postulieren, dass inhibierende Aktivitäten durch lösliche Faktoren im Überstand von mit RSVinfizierten dendritischen Zellen übertragen werden könnten (de Graaff et al., 2005). Diese Hypothese wird auch durch die Arbeit von Bartz (Bartz et al., 2002) unterstützt, in der erhöhte Konzentrationen an Prostaglandin E2 (PGE2) und IL-11 im Überstand von mit RSV-infizierten dendritischen Zellen gefunden wurden. Sowohl PGE2 als auch IL-11 sind inflammatorische Mediatoren mit bekannten immunmodulatorischen Aktivitäten. Schlender et al. haben einen anderen möglichen Mechanismus der durch RSV verursachten Inhibition beschrieben (Schlender et al., 2002): der Kontakt mit RSV39 infizierten Zellen inhibiert die Proliferation von T-Zellen. Wobei speziell das FProtein des RS-Virus – ein transmembranöses Glykoprotein, das für die Fusion der viralen und zellulären Membran notwendig ist (Harris, 2003) – die Lymphozytenaktivierung hemmt. Auch Rothoeft et al. (Rothoeft et al., 2007) waren in der Lage diese Ergebnisse zu reproduzieren; es zeigte sich, dass die Gedächtnis-T-Zellen weniger sensitiv auf die Kontaktinhibition durch HEp2 Zellen waren, als die naiven T-Zellen. Ein weiterer Mechanismus für die Hemmung der IL-17-Produktion durch RSV ist die Beeinflussung des „Spreadings“, einer durch das Zytoskelett bestimmten Ausbreitung von Zellausläufern, die einen entscheidenden Schritt der Zellaktivierung darstellt. Mikroskopische Beobachtungen von aktivierten Lymphozyten zeigten eine starke RSV-vermittelte Inhibition ihres Spreadings, wobei RSV das Spreading bei naiven mehr als bei Gedächtniszellen hemmt (Rothoeft et al., 2007). Inhibition des TCR-vermittelten Spreading wurde auch beim Masernvirus beobachtet (Müller et al., 2006), das genetische und funktionelle Gemeinsamkeiten mit dem RS-Virus aufweist (Klagge et al., 2004; Schlender et al., 1996). Eine stabile immunologische Synapse blieb aus (Müller et al., 2006). Außerdem konnte gezeigt werden, dass der Kontakt mit Masernviren die Phosphatidyl-inositol-3-kinase beeinträchtigt. (Avota et al., 2006). Interessanterweise kommt mehr Phosphatidylinositol-3-kinase in naiven als bei Gedächtnis T-Zellen vor, wenn eine Stimulation des TCR stattfindet (Hall et al., 1999). Demnach ist es denkbar, dass vergleichbare Mechanismen bei der RSV vermittelten Immunmodulation eine Rolle spielen (Rothoeft, 2007). 40 5.3 Möglich Rolle von IL-17 bei RSV-Infektionen Das Zytokin IL-17 ist in einer Vielzahl von Arbeiten als proinflammatorisch beschrieben worden. Demnach laufen dort, wo IL-17 nachweisbar ist (z.B. in Gelenkflüssigkeiten bei Arthritis, im Liquor bei Multipler Sklerose etc.) Entzündungskaskaden ab, die das Gewebe destruieren. Eine herabgesetzte IL-17 Produktion in dem hier zugrundeliegenden in-vitro Modell für die Primärreaktion gegen RSV steht also auf dem ersten Blick im Widerspruch zur klinischen Beobachtung, dass gerade die Primärreaktion schwerer verläuft als die Sekundärreaktion gegen RSV. Kürzlich konnte eine niederländische Arbeitsgruppe jedoch zeigen, dass bei RSVInfektionen eine erniedrigte IL-17 Konzentration mit einem schweren Krankheitsverlauf einhergeht. Im Verlauf einer RSV-Bronchiolitis blieb die IL-17 Konzentration im Nasensekret bei den schwer erkrankten beatmeten Kindern niedrig, bei den leichter betroffenen, nicht beatmeten Kindern zeigte sich ein deutlicher signifikanter Anstieg der IL-17 Konzentration (Faber et al., 2012). Dagegen korrelierte die Konzentration der anderen proinflammatorischen Zytokine mit der Krankheitsaktivität. Die Autoren interpretieren die Ergebnisse als Hinweis auf einen protektiven Effekt von IL-17 bei RSV-Infektionen. Ryzhakov et al. konnten zeigen, dass IL-17 antivirale NF-κB abhängige Mechanismen in Fibroblasten aktiviert (Ryzhakov et al.,2011). Eine protektive Rolle von IL-17 konnte darüber hinaus sowohl für Pilzinfektionen als auch bakterielle Infektionen gezeigt werden (Huppler et al., 2012). Dies ist am Beispiel des Hyper-IgE Syndroms beschrieben worden. Patienten mit einem HyperIgE Syndrom weisen eine Mutation im Gen des Transkriptionsfaktors STAT3 auf. Diese Patienten haben keine Th17-Zellen. In vitro-Experimente zeigen, dass die naiven T-Zellen von Patienten mit Hyper-IgE Syndrom sich nicht in IL-17 produzierende Th17-Zellen ausdifferenzieren können (Milner et al., 2008). Patienten mit der Mutation im STAT3-Gen sind anfälliger für bestimmte Erkrankungen, insbesondere für Infektionen mit Staphylococcus aureus und Candida albicans (Milner et al., 2008). 41 Die Mukokutane Kandidiasis (CMCD) kommt in zwei Formen vor: dem autosomal rezessiv vererbten Defekt im IL-17RA und dem autosomal dominante Defekt im IL17F (Huppler et al., 2012; Ma et al.,2008). Diese Patienten leiden unter rezidivierenden oder persistenten Kandidainfektionen (Puel et al. 2011). Patienten mit APECED (autoimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal dystrophy) produzieren Antikörper gegen IL-17A, IL-17F und IL-22. (Glocker and Grimbacher, 2011). 5.4 Einschränkungen des in vitro Systems Obwohl die dargestellten Ergebnisse neue Einblicke in die Rolle von IL-17 bei RSVInfektionen erlauben, unterliegen die Untersuchungen Einschränkungen und spiegeln nur einen Teil der klinischen Situation wider. 5.4.1 T-Zellabhängige Stimulation mit Hilfe eines Superantigens Antigenspezifische naive T-Zellen finden sich im Nabelschnurblut mit so geringer Frequenz, dass eine direkte Untersuchung in-vitro nicht möglich ist. Um dennoch modulierende Einflüsse von RSV auf die Primärreaktion untersuchen zu können, wurde TSST als Superantigen eingesetzt. TSST führt zu einer Bindung von MHC-II Molekülen der dendritischen Zelle und dem Vβ2 Abschnitt des T-Zellrezeptors, der von etwa 10% der naiven T-Zellen exprimiert wird. Diese Stimulation kommt zwar der physiologischen Stimulation der Zellen nahe, allerdings bindet das Superantigen direkt an die MHC-II Molekül (Viola et al., 1996). Dagegen wird ein konventionelles Antigen jedoch aufgenommen und prozessiert. Diese Schritte können somit im gewählten Modell nicht untersucht werden. Darüber hinaus werden gerade intrazytoplasmatisch gebildete Virusantigene durch MHC-I Moleküle präsentiert, die bevorzugt CD8 Zellen stimulieren. Über die Induktion der kürzlich beschriebenen 42 CD8 tragenden zytotoxische Tc17 Zellen (Tsai et al., 2012) kann also mit Hilfe des genutzten in-vitro Systems keine Aussage gemacht werden. 5.4.2 IL-17 wird durch eine Vielzahl von Zelltypen freigesetzt Nicht nur zytotoxische T-Zellen sondern auch eine Reihe weiterer im Rahmen von RSV-Infektionen aktivierter Zelltypen setzen IL-17 frei. An der Immunantwort gegen RSV sind das Atemwegsepithel sowie Neutrophile, Makrophagen, Eosinophile und Natural-Killerzellen und γδ-T-Zellen beteiligt (Openshaw and Tregoning, 2005; Laan et al., 1999). Epithelzelllinien setzen in vitro unter dem Einfluss von RSV vermehrt IL-17 frei (Ishioka et al., 2011) und stimulieren andererseits auch die Ausreifung von Th17Zellen (Qin et al., 2011). Im Epithel selbst wird bei RSV-Infektionen im Maussystem unter dem Einfluss von IL-17 vermehrt Schleim gebildet (Hashimoto et al., 2004). Außerdem bewirken IL-17 und RSV synergistisch eine Chemotaxis von Neutrophilen durch das Alveolarepithel (Sugama et al., 2012). Obwohl in anderem Zusammenhang auch Neutrophile als Quelle von IL-17 beschrieben wurden (Andreasen et al., 2009), konnten bei RSV-Infektionen im Maussystem monozytäre Zellen als Hauptquelle von IL-17 nachgewiesen werden (Bera et al,. 2011). Ob γδ-T-Zellen (Korn and Petermann, 2012), NKT-Zellen (Milpied et al., 2011) oder NK-Zellen (Passos et al., 2010), die ebenfalls als IL-17 produzierende Zellen identifiziert werden konnten, bei der IL-17 Produktion im Rahmen von RSVInfektionen eine Rolle spielen, bleibt noch offen. 43 6 Zusammenfassung Das Respiratory Syncytial Virus ist die häufigste Ursache respiratorischer Erkrankungen in jedem Lebensalter. Betroffen sind insbesondere Kinder im Säuglings- und Kleinkindalter. Besonders schwere Verläufe, die bis hin zum Tod führen können, treten bei Frühgeborenen mit bronchopulmonalen Dysplasien, Herzfehlern und Immundefekten auf. Das kürzlich entdeckte IL-17 wird in vielen Arbeiten als proinflammatorisches Zytokin beschrieben. Es stellt sich die Frage, ob und welche Rolle das IL-17 bei einer RSV Erkrankung spielt. Dazu wurde in dieser Arbeit an naiven und Gedächtnis Th17Zellen, die mit RSV-infizierten dendritischen Zellen in Kontakt kamen, in vitro die IFN-γ und IL-17 Produktion gemessen. Aus Nabelschnurblut wurden naive T-Zellen und CD34-positive hämatopoetische Stammzellen gewonnen, aus denen dendritische Zellen angezüchtet wurden. Insgesamt wurden jeweils 6 Kulturen untersucht. Zur Stimulation der Zytokinproduktion erfolgte die Zugabe von TSST; wobei erste Untersuchungen zeigten, dass eine Zugabe von 0,1ng/ml TSST ausreicht, um eine effektive Stimulation zu erreichen. Mittels Durchflusszytometer wurde die intrazelluläre Konzentration von IL-17 und IFN-γ in den Vβ2-positiven T–Zellen an Tag 3, 7, 15 und 21 der Kulturreihe gemessen. Unsere Ergebnisse zeigen eine differierende IL-17-Produktion bei naiven und Gedächtnis Th17-Zellen unter dem Einfluss von RSV infizierten dendritischen Zellen: bei den naive T-Zellen wird die IL-17 Produktion gehemmt, die Gedächtniszellen hingegen werden in ihrer IL-17 Produktion nicht beeinflusst. Die naiven T-Zellen repräsentieren modellhaft die mit viel ausgeprägteren Symptomen einhergehende Primärinfektion mit RSV, während die milder verlaufende Reinfektion in unserer Arbeit beispielhaft durch Untersuchungen an Gedächtnis Th17-Zellen dargestellt wird. In vivo bewirken IL-17 und RSV synergistisch ein Chemotaxis von Neutrophilen durch das Alveolarepithel. 44 Die heftig ausfallende Primärinfektion von RSV und die gehemmte IL-17 Produktion in unseren Ergebnissen bei den naiven T-Zellen stehen also auf dem ersten Blick im Widerspruch. Eine völlig fehlende IL-17 Produktion ist jedoch ebenfalls schädlich: in der Literatur am Beispiel des Hyper-IgE Syndroms erforscht. Diese Patienten weisen eine Mutation im Gen (funktionstüchtigen) des Transkriptionsfaktors Th17-Zellen und sind STAT3 anfällig auf, haben insbesondere keine für Pilzerkrankungen. IL-17 führt auf der einen Seite zu Entzündungs- und Autoimmunprozessen, bedingt aber andererseits auch eine Protektion gegen spezifische Pathogene. In einer kürzlich veröffentlichten Arbeit konnte eine niederländische Arbeitsgruppe zeigen, dass eine erniedrigte IL-17 Konzentration mit einem schweren Krankheitsverlauf einhergeht: Im Verlauf einer RSV-Bronchiolitis blieb die IL-17 Konzentration bei den schwer erkrankten beatmeten Kindern niedrig, bei den leichter betroffenen, nicht beatmeten Kindern zeigte sich ein signifikanter Anstieg der IL-17 Konzentration (Faber et al., 2012). Dagegen korrelierte die Konzentration der anderen proinflammatorischen Zytokine mit der Krankheitsaktivität. Diese Ergebnisse decken sich mit unseren in vitro Ergebnissen und unterstützen unsere Hypothese, dass IL-17 bei der RSV-Infektion einen protektiven Effekt hat. 45 7 Literatur Aberle, J. H., Aberle, S. W., Rebhandl, W., Pracher, E., Kundi, M., Popow- Kraupp, T. (2004). Decreased interferon-gamma response in respiratory syncytial virus compared to other respiratory viral infections in infants. Clin Exp Immunol 137, 146–50 Acosta-Rodriguez, E. V., Rivino, L., Geginat, J., Jarrossay, D., Gattorno, M., Lanzavecchia, A. (2007). Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nat Immunol 8, 639–646 Aggarwal, S., Ghilardi, N., Xie, M. H., de Sauvage, F. J., Gurney, A. L. (2003). Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17. J Biol Chem 278, 1910-1914 Andreasen, C., Powell, D. A., Carbonetti, N. H. (2009). 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Schauer danke ich für die Überlassung des Themas und die engagierte Betreuung meiner Arbeit - besonders für seine ständige Unterstützung in sehr zeitintensiven Gesprächen. Ich danke Frau Veronika Baumeister und Frau Angelika Michel herzlich für die Einführung in labortechnische Arbeitsweisen und die geduldige Unterstützung während der Laborarbeit. Ich danke meinen Eltern und meinen beiden Schwestern. LEBENSLAUF Persönliche Daten: Name: Rehman, Sadia Geburtsdatum: 30.8.1988 Geburtsort: Lünen Familienstand: ledig Schulbildung Aug 1994-Sept 1997 0kt 1997- Nov 1998 Dez 1998-Sept 1999 Sep 1999-2005 25.06.05 Hochschulbildung: 2005-2011 2007 2011 seit Dez. 2011 Privatschule Lahore (Pakistan) Grundschule in Herdecke Privatschule Lahore (Pakistan) Friedrich-Harkort-Gymnasium Herdecke allgemeine Hochschulreife (Note: 1,7) Studium der Humanmedizin an der RuhrUniversität Bochum 1. Abschnitt der ärztlichen Prüfung 2. Abschnitt der ärztlichen Prüfung Assistenzärztin in der Gynäkologie und Geburtshilfe Gemeinschaftskrankenhaus Herdecke
