Mutagenese-Methoden zur Generierung einer AcrB

Aus der Sektion Klinische Infektiologie
Abteilung Innere Medizin II / Medizinische Universitätsklinik
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Brsg.
Vergleich verschiedener In-Vitro-RandomMutagenese-Methoden zur Generierung einer AcrBMutanten-Bibliothek als Basis für ein Screening auf
Effluxpumpen-Inhibitor-Resistenz
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
vorgelegt 2010
von Christine Biegert
geboren in Lahr
Dekan:
Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hubert Erich Blum
1. Gutachter:
Prof. Dr. Winfried V. Kern
2. Gutachter:
Prof. Dr. Reinhard Berner
Jahr der Promotion:
2011
Meinen Eltern
Die Neugier steht immer an erster Stelle eines Problems, das gelöst werden will.
Galileo Galilei (1564-1642)
Inhaltsverzeichnis
1 Inhaltsverzeichnis
1
Inhaltsverzeichnis ................................................................................................. 1
2
Einleitung ............................................................................................................... 1
2.1
Antibiotikaentwicklung ..................................................................................... 1
2.2
Resistenzmechanismen................................................................................... 3
2.3
Effluxpumpen ................................................................................................... 4
2.4
Efflux durch RND-Transporter ......................................................................... 7
2.4.1
3
Die Effluxpumpe AcrAB-TolC ................................................................... 7
2.5
Escherichia coli und Effluxpumpen ............................................................... 11
2.6
Effluxpumpeninhibitoren ................................................................................ 12
2.7
Zielsetzung ..................................................................................................... 14
Material und Methoden ....................................................................................... 15
3.1
Lösungen und Bakterienstämme................................................................... 15
3.1.1
Puffer, Nährmedien und sonstige Lösungen ......................................... 15
Fortsetzung Tabelle 2 ............................................................................................... 16
3.1.2
3.2
Mikrobiologische Methoden ........................................................................... 18
3.2.1
Kultivierung und Lagerung ..................................................................... 18
3.2.2
Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration ................................. 19
3.3
4
Laborstämme und Plasmide .................................................................. 18
Molekularbiologische Methoden .................................................................... 21
3.3.1
Herstellung elektrokompetenter Zellen .................................................. 21
3.3.2
Transformation der Plasmide ................................................................. 22
3.3.3
Plasmidisolierung ................................................................................... 23
3.3.4
Primer und Oligonukleotide .................................................................... 23
3.3.5
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ........................................................ 24
3.3.6
Fällung von PCR-Produkten .................................................................. 25
3.3.7
Sequenzierung........................................................................................ 26
Ergebnisse ........................................................................................................... 27
4.1
XL1-Red Competent Cells ............................................................................. 27
4.1.1
4.2
Erhaltene Klone mit Phänotyp ............................................................... 31
GeneMorphII EZClone ................................................................................... 34
4.2.1
Methode GeneMorphII EZClone ............................................................ 34
4.2.1.2 EZClone Reaktion: .............................................................................. 38
4.2.1.3 Restriktion: .......................................................................................... 38
4.2.1.4 Transformation in XL10-Gold Zellen: ................................................. 39
4.2.2
Ergebnisse .............................................................................................. 40
4.2.2.1 MHK-Daten ......................................................................................... 41
4.2.2.2 Sequenzierung der Klone ................................................................... 42
4.3
GeneMorph II Random Mutagenesis in Kombination mit Red ®/ET®-
Rekombination .......................................................................................................... 45
4.3.1
GeneMorph II Random Mutagenesis ..................................................... 45
4.3.2
Homologe Rekombination mit dem Red®/ET®-System ......................... 47
4.3.3
Ergebnisse .............................................................................................. 51
4.3.3.1 MHK-Daten ......................................................................................... 51
4.3.3.2 Sequenzierte Klone ............................................................................ 54
Fortsetzung Tabelle 25 ......................................................................................... 55
4.3.4
5
Mutationsspektrum von Mutazym II ....................................................... 55
Diskussion ........................................................................................................... 56
5.1
XL1-Red -Mutatorstamm ............................................................................... 56
5.1.1
Erzieltes Ergebnis................................................................................... 56
5.1.2
Handhabbarkeit und Effizienz ................................................................ 57
5.2
GeneMorphII EZClone .................................................................................. 58
5.2.1
Erzieltes Ergebnis................................................................................... 58
5.2.2
Handhabbarkeit und Effizienz ................................................................ 58
5.3
GeneMorph II Random Mutagenesis in Kombination mit Red ®/ET®-
Rekombination .......................................................................................................... 61
5.3.1
Erzieltes Ergebnis................................................................................... 61
5.3.2
Effizienz und Handhabbarkeit ................................................................ 61
5.4
Mutationsspektrum von Mutazym II .............................................................. 62
5.5
Kostenvergleich.............................................................................................. 63
5.6
Weitere mögliche Methoden .......................................................................... 63
5.7
Zusammenfassung ........................................................................................ 64
5.8
Ausblick .......................................................................................................... 65
Inhaltsverzeichnis
6
Zusammenfassung ............................................................................................. 67
7
Literaturverzeichnis ............................................................................................ 68
8
Danksagung ......................................................................................................... 73
9
Lebenslauf ............................................................................................................ 74
10
10.1
Anhang .............................................................................................................. 76
Abkürzungen .................................................................................................. 76
Einleitung
1
2 Einleitung
Weltweit gesehen sind Infektionskrankheiten noch immer eine der häufigsten
Todesursachen (WHO, 2008). Als Antibiotika vor einem halben Jahrhundert zum
ersten Mal zum Einsatz kamen, wurden sie als ein „Wundermedikament“ im Kampf
gegen Infektionskrankheiten gehandelt. Im letzten Jahrzehnt zeigte sich jedoch, dass
viele Antibiotika, aufgrund einer stetig wachsenden Anzahl von auftretenden
Antibiotikaresistenzen, immer mehr an Wirksamkeit verlieren (Saleem et al., 2010).
Die zunehmende Resistenzproblematik wird dadurch verstärkt, dass es auf dem
Markt kaum neue Substanzen gibt, die dieser Entwicklung entgegenwirken könnten
(Overbye und Barrett, 2005). Aus diesem Grund stellt die Verbesserung und
Neuentwicklung
von Antiinfektiva ein sehr wichtiges Forschungsgebiet dar,
insbesondere vor dem Hintergrund, dass die Entstehung von mehrfachresistenten
Keimen immer weiter zunimmt (Witte und Klare, 1999).
Sogenannte
„Multi-Drug-Resistance“
(MDR)-Effluxpumpen
sind
einer
der
Hauptmechanismen, der für die Mehrfachresistenz vieler Bakterien verantwortlich ist.
Die Hemmung dieser Effluxpumpen ist also ein interessanter Ansatz für die
Entwicklung neuer Medikamente (Li und Nikaido, 2004).
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde durch Etablierung und Vergleich
verschiedener Random-Mutagenese-Methoden der Grundstock zur Erstellung einer
Klonbibliothek
von
Escherichia
coli
und
deren
Effluxpumpe
AcrB
gelegt.
Wirkungsmechanismen und Angriffspunkte sog. Effluxpumpeninhibitoren (EPIs)
sollen mit Hilfe der Klonbibliothek besser verstanden werden. Genauso können
dadurch möglicherweise Kenntnisse über Substratbindestellen von Effluxpumpen
verbessert werden.
2.1 Antibiotikaentwicklung
Mit der Entdeckung von Penicillin aus dem Pilz Penicillium im Jahre 1929 durch
Alexander Flemming begann die rasante Erfolgsgeschichte der Entwicklung
verschiedener Antibiotikaklassen. Es war erstmals die Möglichkeit gegeben,
potentiell tödliche Infektionen zu heilen und den Kampf gegen bakterielle Krankheiten
wie Syphillis und Cholera aufzunehmen (Kumar und Schweizer, 2005). Die meisten
Antibiotikagruppen wurden von Mitte der dreißiger bis Anfang der sechziger Jahre
entdeckt. So folgten dem Penicillin beispielsweise die Sulfonamide (1936),
2
Einleitung
Tetracycline (1449), Chloramphenicol (1949), Aminoglycoside (1950), Makrolide
(1952), Glykopeptide (1958) und Chinolone (1962) (Holzgrabe, 2004). Mitte der
achtziger Jahre begann die Weiterentwicklung bereits bekannter Wirkstoffklassen, in
derem Zuge die Fluorchinolone (Fernandes 2006), so wie die Ketolide (2000), die
durch eine Modifikation der Makrolide entstanden, auf den Markt kamen. Die
einzigen wirklichen Neuentwicklungen waren 2000 das Linezolid, ein Vertreter der
Oxazolidinone,
das
speziell
für
den
Einsatz
gegen
Vancomycin-resistente
Enterokokken (VRE) und Methicillin-resistente Staphylokokken (MRSA) entwickelt
wurde (Alekshun und Levy, 2007), sowie das 2003 erstmals eingesetzte Daptomycin,
bei dem es sich um den einzigen Vertreter der cyclischen Lipopeptide handelt, der
schon in den achtziger Jahren entdeckt, aber für zu toxisch erachtet wurde (Demain,
2009). Aus der Gruppe der Glycylcycline wurde Tigecyclin, erst 2006 in Deutschland
eingeführt und wird verstärkt bei Intensivpatienten, vor allem bei den schwieriger zu
behandelnden Infektionen mit gramnegativen Keimen, eingesetzt (Kresken, 2009).
Die
aufgeführten
Angriffspunkte
in
Zellwandsynthese,
Antibiotikaklassen
und
an
Störung
zeichnen
sich
der
Bakterienzelle
aus,
von
Stoffwechselwegen,
durch
z.B.
unterschiedliche
Hemmung
der
Beeinträchtigung
der
Proteinsynthese und Wechselwirkungen mit der Nukleinsäuresynthese (Tenover,
2006
Abbildung 1 Angriffspunkte der Antibiotika (http://www.zum.de/Faecher/Materialien/beck/13/bs13-7.htm)
Einleitung
3
2.2 Resistenzmechanismen
Eine Bakterienresistenz liegt vor, wenn Bakterien in Anwesenheit therapeutisch
relevanter Konzentrationen eines Antibiotikums ihre Vermehrung nicht einstellen. Sie
sind gegenüber der Wirksubstanz unempfindlich (Hof und Dörries, 2005).
Teilweise unüberlegter und wahlloser Einsatz von Antibiotika in Kliniken, Praxen und
in
der
Nahrungsmittelindustrie
haben
zur
verstärkten
Entwicklung
von
Antibiotikaresistenzen beigetragen (Alanis, 2005). Eines der bekanntesten Beispiele
ist die Staphylokokken-Resistenz gegen Penicillin durch das Enzym Penicillinase
(Alekshun und Levy, 2007), ein Phänomen, das schon kurze Zeit nach dem ersten
Einsatz von Penicillin beschrieben wurde (Hawkey, 2008).
Es können verschiedene Arten von Resistenzmechanismen unterschieden werden.
Die natürliche Resistenz beruht auf einer genetisch bedingten Unempfindlichkeit
einer Bakterienart gegenüber einem Antibiotikum, d.h. die Resistenz wird durch
natürliche Eigenschaften des Mikroorganismus erzeugt (Stock und Wiedemann,
2001). Bei gramnegativen Bakterien wird beispielsweise der Influx von Stoffen
aufgrund der äußeren Membran deutlich verlangsamt (Yu et al., 2003). Tabelle 1
zeigt weitere Beispiele dieser Resistenzmechanismen auf.
Tabelle 1 Resistenzmechanismen modifiziert nach Hof und Dörries, 2005
Mechanismus
Beispiel
Produktion antibiotikaabbauender bzw. -
Betalaktamasen Hydrolysierung des
modifizierender Enzyme
Betalaktamaserings
Aminoglykosidasen  Inaktivierung des
Antibiotikums
Permeabilitätsbarriere
Penizillinresistenz bei gram neg. Bakt.
Ausbildung antibiotikaunempfindlicher
Chinilonresistenz durch Modifikation der
Zielstrukturen
DNA-Gyrase
Penicillinresistenz durch
Penicillinbindeproteine (PBP)
Aktiver Efflux
Tetracyklinresistenz durch aktiven
Transport des Wirkstoffes aus der Zelle
4
Einleitung
Unter erworbener Resistenz versteht man das Auftreten resistenter Varianten in einer
normalerweise empfindlichen Population. Dabei wird nochmals zwischen zwei
Unterformen unterschieden: Eine primäre Resistenz liegt vor, wenn einzelne Keime
einer normalerweise empfindlichen Population, ohne vorherigen Kontakt mit einem
Antibiotikum, eine verringerte Empfindlichkeit entwickeln. Die sekundäre Resistenz
beinhaltet Resistenzen, die durch Selektion und Mutation unter Antibiotikawirkung
auftreten (Stock und Wiedemann, 1998). Diese Resistenzen können durch
Austausch
genetischen
Materials,
durch
Transduktion,
Konjugation
und
Transformation zwischen den Bakterien ausgetauscht werden (Levy und Marshall,
2004).
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit durch Efflux verursachten Resistenzen.
2.3 Effluxpumpen
Effluxpumpen sind Transportproteine, deren physiologische Funktion darin besteht,
intrazellulär anfallende Metabolite und zytotoxische Substanzen zum Schutz der
Zelle zu exportieren. Escherichia coli ist beispielsweise nur durch den Export von
Gallensalzen mittels Effluxpumpen in der Lage im Darm zu überleben (Drew, 2009).
Es konnte gezeigt werden, dass Bakterien, die Effluxpumpen überexprimieren, eine
deutliche Unempfindlichkeit gegenüber Gallensalzen aufweisen (Begley et al., 2005).
Solche Transportproteine sind sowohl in grampositiven und gramnegativen
Bakterien, als auch in eukaryoten Organismen zu finden (van Bambecke et al.,
2000). Effluxpumpen in grampositiven Bakterien müssen ihre Substrate nur durch die
einzige
vorhandene
zytoplasmatische
Membran
befördern,
wohingegen
Effluxpumpen in gramnegativen Bakterien die innere und äußere Membran
überwinden müssen, bzw. die Substrate nur in den periplasmatischen Raum
entlassen (Lomovskaya und Watkins, 2001). Die Effluxpumpen können dabei
spezifisch für ein Substrat oder eine Substratklasse sein, oder ein breites
Substratspektrum besitzen, und können auch nicht verwandte Substrate aus der
Zelle entfernen. Diese Effluxpumpen werden dann als Multi-Drug-Resistance-[MDR]Pumpen bezeichnet und sind von besonderem klinischen Interesse. Die für die
Pumpen kodierenden Gene können sowohl auf dem bakteriellen Chromosom als
auch auf übertragbaren Elementen wie Plasmiden gefunden werden (Piddock,
Einleitung
5
2006a). Antibiotikaresistenz durch Effluxpumpen wurde erstmals im Zusammenhang
mit Tetrazyklinresistez bei Escherichia coli beobachtet (McMurray, 1980).
Derzeit sind fünf Familien beschrieben, denen die bekannten bakteriellen
Effluxpumpen zugeteilt werden: Multidrug and Toxic Compound Extrusion (MATE)
Transporter, Major Facilitator Superfamily (MFS), Small Multidrug Resistance (SMR)
Transporter, ATP-Binding-Cassette (ABC) Transporter und Resistance-NodulationDivision (RND) Transporter.
Abbildung 2 Schematischer Aufbau der verschiedenen Transporterfamilien (Piddock, 2006a)
ABC-Transporter
Die Superfamilie der ATP-Binding-Cassette Transporter umfasst eine große Anzahl
von Mitgliedern, die, wie in Abbildung 2 ersichtlich, als einzige der fünf
Transporterfamilien den Substrattransport durch ATP-Hydrolyse betreiben. Es
handelt sich dabei um Multiproteinkomplexe, bestehend aus einem integralen
Membranprotein mit sechs Transmembrandomänen und zytoplasmatischem Protein
mit ATPase-Aktivität (Kumar und Schweizer, 2005). ABC-Transporter sind in der
Lage, Verbindungen unterschiedlicher Größe und Struktur aufgrund unterschiedlicher
Bindungsstellen zu transportieren (Klaasen und Aleksunes, 2010), wie u.a. Zucker,
Aminosäuren, Medikamente, Polysaccharide und Proteine. Die Substrate werden
sowohl in die Zelle hinein, als auch aus der Zelle heraus transportiert.
6
Einleitung
SMR-Transporter
Die
Small-Multidrug-Resistance-Transporter
bestehen
aus
nur
etwa
110
Aminosäuren und sind in Form eines Tetramers mit je vier α-Helices in der Membran
aufgebaut. Die Energie für den Efflux von Farbstoffen, Medikamenten und Kationen
wird durch H+-Antiport bereitgestellt (Kumar und Schweizer, 2005). Die SMRTransporter wurden erstmals in S. aureus beschrieben, später jedoch auch in
gramnegativen Bakterien (Nikaido, 2009). Die Smr-Pumpe (S. aureus) und der
EmrE-Transporter (E.coli) sind die am besten untersuchten Vertreter dieser Familie.
MATE-Transporter
Die Familie der MATE-Proteine kann in Bakterien, Pilzen und Pflanzen gefunden
werden und benutzt einen Na+-Gradienten als Energiequelle zum Transport. Das
Substratspektrum ist vielfältig und umfasst Substanzen mit unterschiedlichen
chemischen Strukturen. Substrate sind kationische Farbstoffe und verschiedene
Antibiotika wie Fluorchinolone und Norfloxacin (Kuroda, 2009). Die Transporter
besitzen zwölf Transmembrandomänen. NorM von Vibrio parahaemolyticus und
YdhE von E.coli stellen bekannte Vertreter der Familie dar.
MFS-Transporter
Die Major Facilitator Superfamily umfasst über tausend Vertreter und beinhaltet 17
Transporterfamilien, die als Symporter, Uniporter oder Antiporter in Bakterien,
Archaea und Eukaryonten fungieren. Sie transportieren ein weites Spektrum von
Substraten wie Zucker, Medikamente, Metabolite und Anionen. Normalerweise
handelt es sich bei MFS-Transportern um Single-Komponenten-Pumpen wie z.B.
NorA in S. aureus. In einigen gramnegativen Bakterien funktionieren sie allerdings
mit einem Membranfusionsprotein und einem äußeren Membranprotein als
Multikomponentenpumpe (EmrAB-TolC von E.coli) (Kumar und Schweizer, 2005).
RND-Transporter
RND-Transporter kommen in Bakterien, Eukaryonten und Archaea vor, alle bisher
untersuchten Vertreter zählen zu den Multidrug-Transporten. Sie erzeugen Energie
Einleitung
7
durch einen H+-Antiport und spielen eine wichtige Rolle bei der erworbenen und
intrinsischen Resistenz gramnegativer Bakterien. Die am besten untersuchten RNDTransporter sind das MexAB-OprM-System in Pseudomonas aeruginosa und das
AcrAB-TolC-System in Escherichia coli.
2.4 Efflux durch RND-Transporter
Die
äußere
Membran
von
gramnegativen
Bakterien
ist
eine
perfekte
Permeabilitätsbarriere und verstärkt in Zusammenarbeit mit Multidrug-Pumpen die
Antibiotikaresistenz. Dies ist aufgrund des speziellen Aufbaus von RND-Transportern
möglich, der den Transport von Substraten sowohl über die innere cytoplasmatische
Membran, als auch über die äußere Membran ermöglicht. Die RND-Transporter
bestehen aus
dreiteiligen Komplexen, die aus Transporterproteinen in der
cytoplasmatischen Membran, Membranfusionsproteinen (MFP) im Periplasma und
äußeren Membranproteinen (OMP) zusammengesetzt sind.
Für die Regulation der RND-Pumpen sind verschiedene Mechanismen wie lokale
und globale Regulatoren zuständig, außerdem kann die Genexpression durch
Anwesenheit bestimmter Substrate oder Stressbedingungen induziert werden
(Nikaido, 2009). So steht AcrAB unter der Kontrolle des Repressors AcrR, dessen
Hauptaufgabe darin besteht, die Überexprimierung von acrAB zu verhindern. Wird
dieser Repressor infolge einer Mutation inaktiviert, kann sich daraus eine
Überexprimierung des Pumpengens ergeben (Li und Nikaido, 2004). Auch eine
Mutation der globalen Transkriptionsaktivatoren MarA, SoxS und Rob kann zu einer
Überexprimierung des AcrAB-TolC-Systems und damit zu einer gesteigerten
Antibiotikaresistenz führen (Kumar und Schweizer, 2005).
2.4.1 Die Effluxpumpe AcrAB-TolC
Die Effluxpumpe besteht aus dem Transportprotein AcrB, dem porenbildenden
Protein
der
äußeren
Membran
TolC
und
dem
periplasmatischen
Membranfusionsprotein AcrA.
Drei AcrB-Protomeren sind in Form eines Homotrimeres organisiert. Jedes Protomer
ist zusammengesetzt aus einer Transmembranregion, einer porenbildenden PorterDomäne und einem TolC-Verbindungsstück. Die Transmembranregion besteht
jeweils aus 12 transmembranen α-Helices und zwei periplasmatischen Schleifen
8
Einleitung
zwischen der 1. und 2. sowie der 7. und 8. Helix. Vermutlich sind diese
periplasmatischen Schleifen an der Substraterkennung beteiligt (Mao et al., 2002).
Aufgrund von Kristallisations- und Kokristallisationsdaten mit Substraten konnte
sowohl von Murakami et al., als auch von Seeger et al. eine putative Bindetasche im
Bereich der periplasmatischen Schleife definiert werden. Der funktionell wichtige Teil
der Porter-Domäne besteht aus jeweils drei α-Helices jedes Protomers. Die TolCDocking-Domäne bildet in Form eines Trichters das passende Verbindungsstück zu
TolC und ermöglicht so den direkten Kontakt zwischen AcrB und TolC (Murakami et
al., 2006).
Das äußere Membranprotein TolC bildet einen Trimer in Form eines Kanals, dessen
transmembrane
Domäne
nach
außen
hin
geöffnet
ist.
Die
ausgedehnte
periplasmatische Domäne ist in zwei deutliche Abschnitte unterteilt: eine proximale
Subdomäne, in der 12 Helices einen cylinderförmigen Hohlraum bilden, und ein
distaler Abschnitt aus 12 α-Helices, die in Form einer Biegung den Kanal zum
Periplasma hin verschließen (Bravo et al., 2008). Zum Substratdurchtritt kann der
Kanal durch Verdrehen der Helix geöffnet werden (Koronakis et al., 2004).
Das Membranfusionsprotein AcrA verbindet die transmembranen Komplexe durch
Protein-Protein-Interaktion im Periplasma. AcrA ist über das N-terminale Ende in der
inneren Membran verankert. Eine α-Helix Haarnadelstruktur bildet eine TolCVerbindungsdomäne und eine α-β-Barrel-Struktur verbindet AcrA mit AcrB. Somit
stabilisiert und umschließt AcrA den dreiteiligen Komplex der Effluxpumpe AcrABTolC (Ge et al., 2009).
Abbildung 3 Schematische Darstellung der Effluxpumpe AcrAB-TolC (Pos, 2009)
Einleitung
9
Man ging lange davon aus, dass die zentrale Pore in der Porterdomäne von AcrB
hauptsächlich für die Substratausschleusung zuständig sei. Dies wurde jedoch durch
neue Kristallisationsdaten verschiedener unabhängiger Forschergruppen revidiert
(Murakami et al., 2006, Seeger et al., 2006, Sennhauser et al., 2007), nach denen
der Substrattransport in einem dreischrittigen peristaltischen Rotationsmechanismus
abläuft, bei dem die drei Protomere von AcrB jeweils eine andere Konformation
annehmen (Drew et al., 2008). Dieser Vorgang zeigt große Ähnlichkeit mit dem
Mechanismus der ATP-Synthase (Pos, 2009). So befinden sich die Protomere
nacheinander in den Zuständen access (loose), binding (tight) und extrusion (open)
wie in Abbildung 4 und Abbildung 5 ersichtlich. Im access-Zustand bildet sich eine
Öffnung zum Periplasma hin, so dass sich potentielle Substrate anlagern können.
Die Bindungstasche ist jedoch noch nicht entfaltet. Im binding-state wird die
Bindetasche geöffnet und kann so das Substrat aufnehmen. In diesem Zustand ist
der Ausgang zur zentralen Pore noch geschlossen. Im extrusion-state wird die
Öffnung zum Periplasma hin geschlossen und der Ausgang zur zentralen Pore
geöffnet, da die funktionelle Rotation der Monomere mit Bewegung ihrer
Subdomänen auch
Konformationsänderungen in der Porterdomäne zu bewirken
scheint (Seeger et al., 2008). Das Substrat wird vermutlich Richtung TolC
„geschleudert“
(Murakami et al., 2006), das seinen geschlossenen Kanal
möglicherweise ebenfalls durch Konformationsänderungen öffnet, um das Substrat
aus der Zelle transportieren zu können (Eicher et al., 2009).
Abbildung 4 Dargestellt sind die drei AcrB-Untereinheiten, die in einem Rotationsmechanismus die drei
Konformationen „access“,“ binding“ und „extrusion“ durchlaufen. (Murakami et al., 2006)
Weitere Daten zeigen, dass sich die drei Monomere nicht immer in den
unterschiedlichen Stadien „access“ (L), “ binding“ (T) und „extrusion“(O) befinden
müssen. Bei hoher Substratkonzentration können sich alle Monomere im T-Stadium
10
Einleitung
(TTT) befinden und bei niedriger Substratkonzentration sind die Konformationen LLL
bzw. LLT möglich (siehe Abbildung 5) (Pos, 2009).
Der Mechanismus von Substrataufnahme und –transport wird zurzeit von einigen
Gruppen untersucht. So gab es Versuche, bei denen Disulfidbrücken durch
Einbringen von Cysteinen in bewegliche Subdomänen den Efflux von AcrB
verminderten. Diese Ergebnisse unterstützen das Modell des asymmetrischen AcrB
mit dem peristaltischen Rotationsmechanismus (Seeger et al., 2008).
Abbildung 5 Schematische Darstellung der möglichen Konformationen der AcrB-Untereinheiten (Pos,
2009)
Analysen von Kokristallisationen mit Doxorubicin und Minozyklin weisen darauf hin,
dass beide Stoffe mit unterschiedlichen Bereichen der Bindetasche interagieren.
Einleitung
11
Diese Flexibilität könnte erklären, warum AcrAB-TolC in der Lage ist, viele
verschiedene, chemisch nicht verwandte, Stoffe zu transportieren. Für die
Substratbindung scheinen viele hydrophobe Phenylalanine verantwortlich zu sein.
Die Aminosäureposition 610 stellt scheinbar eine besonders wichtige Stelle für die
Aktivität der Effluxpumpe dar (Bohnert, 2008).
2.5 Escherichia coli und Effluxpumpen
E.coli sind gramnegative, stäbchenförmige, peritrich begeißelte Bakterien, die zur
Familie
der
Enterobacteriaceae
gehören.
Sie
kommen
normalerweise
im
menschlichen und tierischen Darm vor und zählen zu den weltweit am besten
untersuchten
Organismen.
Aus
diesem
Grund
werden
sie
häufig
zu
Forschungszwecken verwendet.
Sie stellen den häufigsten Grund nosokomialer
und ambulant erworbener
gramnegativer Infektionen dar. So sind sie die überwiegend verursachenden Erreger
von Infektionen des Urogenitaltraktes, genauso wie sie häufig bei neonatalen
Meningitiden nachgewiesen werden können. Ebenso verursachen enteropathogene
E.coli häufig Enteritiden in der Kindheit und Bakterien assoziierte Reisediarrhöen
(Kaper et al., 2004).
Durch verstärkte Entwicklung von Resistenzmechanismen stellt die Behandlung der
Infektionen durch E.coli ein zunehmendes Problem dar. Neben der Ausbildung von
inaktivierenden Enzymen wie der β-Laktamase und Veränderungen der Zielstruktur
(Fluorchinolonresistenz) spielen auch bereits beschriebene Effluxpumpen eine
wichtige Rolle. Im Genom von E.coli konnten 37 Gene für Effluxpumpen
nachgewiesen
werden,
von
denen
20
sicher
in
der
Lage
sind,
zu
Resistenzentwicklungen beizutragen. Dabei wurden Exemplare aller fünf in Kapitel
2.3 vorgestellten Transporterfamilien dokumentiert, wovon die meisten, mit
Ausnahme von AcrAB-TolC, unter normalen Umständen jedoch nur schwach
exprimiert sind (Nishino, et al., 2009). Ein Beispiel dafür stellen die RND-Transporter
AcrEF, AcrD, YhiUV und MdtAB dar, die alle nur in Kombination mit TolC zum Efflux
fähig sind. Durch Knockout-Experimente mit YhiUV, MdtABC und AcrEF konnte
keine veränderte Medikamentensensibilität beobachtet werden, wodurch bestätigt
wurde, dass ihre Bedeutung bei der Verursachung von Resistenzen eher gering
scheint (Kumar und Schweizer, 2005). Für AcrEF konnte nachgewiesen werden,
dass es in E.coli-Stämmen mit inaktiviertem AcrB unter anderem eine verminderte
12
Einleitung
Empfindlichkeit für Fluorchinolone und Lösungsmittel bewirkt (Jellen-Ritter und Kern,
2001). Bei einer Überexprimierung von YhiUV wird eine Resistenz gegen
Erythromycin, Doxorubicin, Deoxycholat und Kristallviolett ausgelöst (Nishino und
Yamaguchi, 2002). Für AcrD in Kombination mit AcrA und TolC konnte eine
verminderte Sensibilität für Gallesalze, Novobiocin und Aminoglycoside dokumentiert
werden, während MdtABC nur mit der Resistenzverleihung gegen Gallesalze und
Novobiocin in Verbindung gebracht wird (Nagakubo et al., 2002).
2.6 Effluxpumpeninhibitoren
Die Efflux-bedingte, weiter zunehmende Resistenz, vor allem im gramnegativen
Bereich, stellt eine große Herausforderung für die Forschung dar. Sowohl im Bereich
der intrinsischen Resistenz von gramnegativen Bakterien, als auch bei der
erworbenen klinischen Resistenz spielen die MDR-Effluxpumpen eine bedeutende
Rolle (Lomoskaya und Bostian, 2006). Aus diesen Gründen ist es wichtig, Strategien
gegen Efflux-bedingte Resistenzen zu entwickeln. So gibt es die Möglichkeit, bereits
verwendete Antibiotikaklassen so zu modifizieren, dass Efflux-inkompetentere
Derrivate entstehen könnten. Genauso wird die Erforschung therapeutischer Stoffe
forciert, die die Aktivität von Effluxpumpen hemmen und in Kombination mit
Antibiotika verabreicht werden können (Lomovskaya und Watkins, 2001). Die
meisten bisher untersuchten Effluxinhibitoren (EPIs) wurden durch Screening
synthetischer und natürlicher Stoffbibliotheken entdeckt (Lomovskaya, 2007).
Potentielle Effluxpumpeninhibitoren müssen genau definierte Kriterien erfüllen
(Lomovskaya et al., 2001): Bei effluxkompetenten Stämmen soll die Wirksamkeit von
Antiinfektiva verbessert werden, bei effluxdefizienten Stämmen soll jedoch keine
Veränderung der Empfindlichkeit bewirkt werden. Die EPIs sollten eine höhere
intrazelluläre
Konzentration
der
Pumpensubstrate
verursachen,
aber
keine
Auswirkung auf den energieliefernden Protonengradienten haben. Die Aktivität von
Wirkstoffen, die keine Pumpensubstrate darstellen, soll nicht verändert werden und
die EPIs sollten keine Toxizität gegenüber menschlichen Zellen entwickeln.
In den späten 1990er Jahren begann die Suche nach EPIs mit dem Ziel, die Aktivität
von Levofloxacin zu verstärken, um der steigenden Resistenz von Pseudomonas
aeruginosa entgegen wirken zu können. So war der erste potentielle EPI MC270,110 bzw. PAβN (Phenylalanin-arginyl-β-naphtylamid) in der Lage, alle vier
Einleitung
13
klinisch relevanten Effluxpumpen von Pseudomonas aeruginosa, sowie viele
ähnliche RND-Pumpen anderer gramnegativer Bakterien, wie AcrAB-TolC, zu
hemmen (Pages et al., 2005). Allerdings konnten nicht alle Antibiotikaklassen in ihrer
Wirkung
verstärkt
werden.
Nur
Fluorchinolone,
Makrolide,
Oxazolidinone,
Chloramphenicol und Rifampicin wurden durch PAβN unterstützt, bei Betalactamen
und Aminoglycosiden konnte keine Wirkung erzielt werden. Weitere Versuche führten
zu der Erkenntnis, dass PAβN selbst ein Pumpensubstrat darstellt und die
Effluxpumpe möglicherweise kompetitiv hemmt (Lomovskaya und Bostian, 2006).
Außer PAβN wurde im Rahmen dieser Arbeit auch NMP (Naphthyl-methyl-piperazin)
verwendet, dem ebenfalls eine effluxinhibierende Wirkung nachgewiesen werden
konnte. NMP wurde im Rahmen eines Screenings von synthetisch hergestellten
Arylpiperazinen auf effluxinhibierende Wirkung in Kombination mit Levofloxacin bei
acrAB bzw. acrEF überexprimierenden E.coli-Stämmen identifiziert (Bohnert und
Kern, 2005).
Abbildung 6 Strukturformeln der möglichen Effluxumpeninhibitoren Naphthyl-methyl-piperazin (NMP) und
Phenylalanin-arginyl-β-naphthylamid (PAβN).
Bei Testungen der Minimalen Hemmkonzentration (MHK) verschiedener Antiinfektiva
wurde durch Zugabe von NMP bei einigen Antibiotika, wie beispielsweise Tetrazyklin,
Oxacillin, Rifampicin, Makrolide, Linezolid und Clarithromycin, eine Verminderung der
MHK dokumentiert (Kern et al., 2006). Bei anderen Antibiotikaklassen wie den
Ketoliden und Aminoglykosiden konnte keine NMP-Wirkung festgestellt werden.
Vergleichende Studien ergaben, dass NMP nur bei pumpenüberexprimierenden
Stämmen Resistenzverminderungen bewirkte, wohingegen PAβN auch bei AcrB
bzw. AcrEF-Pumpen-defizienten Stämmen teilweise MHK-Veränderungen bewirkte.
Wodurch sich die Vermutung erhärtet, dass PAβN auch einen Effekt auf andere
Pumpen zeigt (Bohnert und Kern, 2005), oder aber die Permeabilität der äußeren
14
Einleitung
Membran beeinflusst. In ähnlichen Studien wurde der Effekt von NMP und PAβN auf
das Vibrio cholerae RND-Efflux-Pumpensystem getestet. Es konnte eine Wirkung auf
die jeweiligen Pumpensubstrate gezeigt werden, wobei die Pumpen je nach Substrat
ganz bzw. teilweise inhibiert werden konnten (Bina et al., 2009). Aufgrund
pharmakologischer und toxikologischer Schwierigkeiten konnten sowohl NMP als
auch PAβN bisher klinisch nicht eingesetzt werden (Lomovskaya und Bostian, 2006).
2.7 Zielsetzung
Das Auftreten multiresistenter Bakterien, vor allem im gramnegativen Bereich, die
nahezu gegen alle derzeit verwendeten Antibiotika Resistenzen aufweisen, wie z.B.
Pseudomonas aeruginosa oder Acinetobacter baumannii, wird in der Klinik immer
häufiger zum Problem. Die Eindämmung dieser Problematik stellt ein sehr wichtiges
und interessantes Forschungsgebiet dar (Nikaido, 2009). Eine der wichtigsten
Ursachen für bakterielle Multiresistenz ist in der Aktivierung von „Multi Drug
Resistance“
(MDR)-Effluxpumpen,
die
chemisch
nicht
verwandte
Stoffe,
einschließlich verschiedener Farbstoffe und Antibiotika, aus der Bakterienzelle
transportieren, zu sehen (Bohnert, 2008). Mögliche Effluxpumpeninhibitoren, die in
Kombination
mit
Antibiotika
verabreicht
werden
könnten,
scheinen
eine
verheißungsvolle Möglichkeit, um bestehende Resistenzen in den Griff zu
bekommen. Um dieses Ziel verwirklichen zu können, ist ein genaues Verständnis für
die Wirkungsweise der Effluxpumpen und der Effluxpumpeninhibitoren notwendig.
Trotz besserer Erkenntnisse über Transportvorgänge der AcrAB-TolC-Pumpe, die
aufgrund von Kristallisationsdaten gewonnen werden konnten (Pos, 2009), sind die
genauen Bindestellen im Bereich der Bindetaschen und die Funktionsweise der
Effluxpumpeninhibitoren noch nicht bekannt.
Durch Etablierung und Vergleich dreier
verschiedener Random-Mutagenese-
Methoden soll eine möglichst praktikable und effiziente Methode gefunden werden,
um eine AcrB-Mutanten-Bibliothek zu erstellen. Diese Bibliothek kann in Zukunft als
Basis für ein Screening der Mutanten dienen, mit dem Ziel, Hinweise auf
Wirkungsweise und Ansatzpunkte von Effluxpumpeninhibitoren zu erlangen. Ebenso
könnten Bindestellen für Substrate in AcrB besser erforscht werden. Um die beste
Methode zur Generierung der gewünschten Klonbibliothek bestimmen zu können,
wurden
die
Zahl
der
erhaltenen
Mutationsspektrum ausgewertet.
Mutanten,
die
Mutationsraten
und
das
Material und Methoden
15
3 Material und Methoden
3.1 Lösungen und Bakterienstämme
3.1.1 Puffer, Nährmedien und sonstige Lösungen
Alle Puffer, Nährmedien und sonstige Lösungen wurden nach der Herstellung
autoklaviert. LB-Agar wurde nach dem Autoklavieren unter sterilen Bedingungen
gegebenenfalls Antibiotika zugesetzt und anschließend in sterile Petrischalen
gegossen.
Tabelle 2 Zusammensetzung der Nährmedien, Puffer und sonstiger Lösungen
Bezeichnung
Bestandteile
Menge/l (H2O) Hersteller
LB-Medium
Trypton
10,0 g
Hefeextrakt
5,0 g
NaCl
10,0 g
Trypton
10,0 g
Hefeextrakt
5,0 g
NaCl
10,0 g
Agar
15,0 g
NaCl
9g
LB-Agarplatten
0,9% NaCl
Roth
Roth
Roth
3 M Na-Acetat-Lsg. (pH = 5,3) Natriumacetat x 3H 2O 408,24 g
Merck
TBE (1x)
Tris-Base
10,8 g
Sigma
Borsäure
5,5 g
Bio-Rad
EDTA
0,93 g
Roth
16
Material und Methoden
Fortsetzung Tabelle 2
Bezeichnung
Bestandteile
Menge/l (H2O) Hersteller
L-Arabinose-Lsg. (10%) L-Arabinose
100 g
Sigma
Glycerol (10%)
Glycerin
100 ml
Roth
TE-Puffer
10 mM Tris-HCL (pH8) 1,576 g
Merck
1 mM EDTA
0,29 g
Roth
1%iges Agarose-Gel
1% Agarose in 1xTBE
10 g (in TBE)
Roth
SOB-Medium
Pepton
20 g
Merck
Hefeextrakt
5g
Difco
NaCl
0,5 g
Roth
KCl
0,186 g
Sigma
SOB-Medium
960 ml
MgSO4 1M
10 ml
Merck
MgCl2 1M
10 ml
Merck
Glucose 20%
20 ml
Fluka
Caseinhydrolysate
10 g
Roth
Hefeextrakt
5g
Difco
NaCl
5g
Roth
MgCl2 1M
2 ml
Merck
MgSo4 1M
2 ml
Merck
Glucose 20%
3,2 ml
Fluka
SOC-Medium
NZY+Broth
Material und Methoden
17
Tabelle 3 Antibiotika- und Farbstofflösungen
Konz. Der
Lösungsmittel
Stammlösung
(T=Teile)
PaβN
10 mg/ml
H2O
Sigma
NMP
10 mg/ml
2 T DMSO, 2 T 0,5 M HCL, 6 T H2O
Chess GmbH
Ethidiumbromid
10 mg/ml
H2O
Merck (Roth)
Azithromycin
10 mg/ml
Ethanol
Pfizer
Ampicillin
50 mg/ml
H2O
Sigma
Chloramphenicol
50 mg/ml
Ethanol
Roth
Clarithromycin
10 mg/ml
H2O
Clindamycin
50 mg/ml
H2O
Sigma
Ciprofloxacin
2 mg/ml
H2O
Bayer
Erythromycin
10 mg/ml
Ethanol
Aldrich
Gentamycin
30 mg/ml
H2O
Sigma
Kanamycin
50 mg/ml
H2O
Sigma
Levofloxacin
Fertige Lösung
Linezolid
2 mg/ml
Minocyclin
1 mg/ml
Sigma
Moxifloxacin
1,5 mg/ml
Bayer
Novobiocin
10 mg/ml
H2O
Sigma
Oxacillin
10 mg/ml
H2O
Sigma
Rifampicin
5 mg/ml
Ethanol
Fluka
Streptomycin
100 mg/dl
H2O
Sigma
Tetracyclin
10 mg/ml
In H2O: EtOH 1:1
USB
Lösung
Hersteller
Roussel Ucl
Zyvoxid-Infusionslösung
Pharmacia
18
Material und Methoden
3.1.2 Laborstämme und Plasmide
In dieser Arbeit wurde ausschließlich mit Laborstämmen der Bakterienspezies
Escherichia coli gearbeitet. Unter anderem wurde DKO (AcrAB/AcrF DoppelKnockout) verwendet. ( siehe Tabelle 4)
Tabelle 4 In der Arbeit verwendete Laborstämme
Name
Beschreibung
Herkunft
KAM 32
ΔacrB, ΔydhE, hsdD5
J. Chen, Japan
DKO
=2-DC14PS mit rpsL-cm in
Stammsammlung Labor AG
AcrF, acrB/acrF-Doppel-
Kern
Knockout
3-AG100acrBΔ615-628
3-AG100 mit rpsL-neo-
Stammsammlung Labor AG
(acrB::rpsL-neo (615-628)
Kassette in AcrB615-628
Kern
(AS)
3-AG100acrB::rpsL-neo
rpsL-neo-Kassette ersetzt
Stammsammlung Labor AG
(Gesamt AcrB) x pSC 101-
Gesamt-AcrB in 3-AG100 mit Kern
BAD-gbaA
pSC 101-BAD-gbaA
(Red/ET-Plasmid)
XL10-Gold
TetR Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-
ultracompetent cells
hsdSMR-mrr)173
Stratagene
endA1 supE44 thi-1 recA1
gyrA96 relA1 lac Hte
[F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10
(TetR) Amy CamR]
3.2 Mikrobiologische Methoden
3.2.1 Kultivierung und Lagerung
Alle verwendeten Stämme wurden in Luria-Bertani(LB)-Medium oder auf LBAgarplatten
angezüchtet,
gegebenenfalls
wurde
Antibiotikum
zugefügt.
Die
Inkubation erfolgte, soweit nicht anders vorgegeben, bei 37°C im Brutschrank (Typ
B5050E, Heraeus), Flüssigkulturen wurden im Schüttelinkubator (Aerotron, Infors HT,
Schweiz) bei 220 rpm bebrütet.
Material und Methoden
19
Das CryobankTM System (MAST Diagnostica GmbH, Reinfeld) wurde zur Lagerung
der Bakterienstämme verwendet. In den Cryoröhrchen
befindet sich
eine
hypertonische Konservierungslösung, in die mehrere Kolonien einer frischen Kultur
eingeimpft wurden. Das verschlossene Röhrchen wurde vorsichtig mehrfach gedreht,
um den Inhalt zu mischen.
Nach ca. einminütiger Inkubationszeit wurde soviel Lösung wie möglich abpipettiert,
im Röhrchen verblieben nur kleine Glasperlen, an deren poröser Oberfläche die
Bakterien binden. Anschließend wurden die Cryoröhrchen bei -80°C eingefroren.
Zur Rekultivierung wurde unter der Sterilbank (HERA safe, Heraeus) ein Kügelchen
mit einer Öse aus dem Röhrchen entnommen und auf einer Agarplatte
ausgestrichen. Um das Auftauen der anderen Kügelchen zu verhindern, wurde das
Röhrchen währenddessen in einem Cryoblock aufbewahrt und möglichst schnell
wieder im -80°C- Kühlschrank verstaut.
3.2.2 Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration
Die MHK wird definiert als die kleinste Konzentration (µg/ml) eines antimikrobiellen
Wirkstoffes (z.B. Antibiotikum), die nach 16-20 Stunden das Keimwachstum im
Kulturansatz
noch
durchgeführt
und
verhindert.
dient
zur
Die
MHK
wurde
Bestimmung
des
als
Reihenverdünnungstest
Resistenzverhaltens
von
Bakterienstämmen gegenüber verschiedener Antibiotika. Die Tests wurden nach den
Richtlinien des „National Committee for Clinical Laboratory Standarts“ (NCCLS) für
Mikrodilutionsverfahren durchgeführt (NCCLS, 2004).
Es wurden industriell hergestellte 96-well Mikrotitrationsplatten (Micronaut-S, Merlin
Diagnostika,
Bornheim-Hersel)
verwendet,
welche
bereits
gefriergetrocknete
Antibiotika enthalten, die durch Zugabe einer Bakteriensuspension wieder gelöst
wurden. Dadurch konnten mehrere Antibiotika gleichzeitig getestet werden. Es
wurden Standardplatten A (siehe Abbildung 7) und B (siehe
Abbildung 8) benutzt, die acht bzw. dreizehn verschiedene Antibiotika enthalten.
20
Material und Methoden
Platte A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Lev
A
0,016
0,031
0,063
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
32
Tet
B
0,063
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
32
64
128
Cha
C
0,063
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
32
64
128
Rif
D
0,063
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
32
64
128
Oxa
E
0,5
1
2
4
8
16
32
64
128
264
512
1024
Strep F
WK
1
2
4
8
16
32
64
128
264
512
1024
Lizo
G
0,5
1
2
4
8
16
32
64
128
264
512
1024
Clari
H
0,5
1
2
4
8
16
32
64
128
264
512
1024
Abbildung 7 Schema der Standard-MHK-Platte A, Konzentration [µg/ml], WK= Wachstumskontrolle
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Ery
Azi
Cli
Nov
Nov
Gen
Mino
Cip
Rif
Strep
Mox
32
2
2
0,25
64
0,25
0,063
0,031
0,016
0,5
0,016
Ery
Azi
Cli
Nov
Nov
Gen
Mino
Cip
Rif
Lizo
Mox
64
4
4
0,5
128
0,5
0,125
0,063
0,031
0,063
0,031
C Ery
Ery
Azi
Cli
Nov
Nov
Gen
Mino
Cip
Rif
Lizo
Mox
0,5
128
8
8
1
256
1
0,25
0,125
0,063
0,125
0,063
D Ery
Ery
Azi
Cli
Nov
Nov
Gen
Mino
Cip
Strep
Lizo
Mox
1
256
16
16
2
512
2
0,5
0,25
0,016
0,25
0,125
Ery
Ery
Azi
Cli
Nov
Spect
Gen
Mino
Cip
Strep
Lizo
Mox
2
512
32
32
4
4
4
1
0,5
0,031
0,5
0,25
Ery
Azi
Azi
Cli
Nov
Spect
Gen
Mino
Cip
Strep
Clari
Mox
4
0,25
64
64
8
8
8
2
1
0,063
0,063
0,5
Azi
Azi
Cli
Nov
Spect
Gen
Mino
Cip
Strep
Clari
Mox
0,5
128
128
16
16
16
4
2
0,125
0,125
1
Azi
Cli
Cli
Nov
Spect
Gen
Mino
WK
Strep
Clari
Mox
1
1
256
32
32
32
8
0,25
0,25
2
A Ery
0,12
B Ery
0,25
E
F
G Ery
8
H Ery
16
Abbildung 8 Schema der Standard-MHK-Platte B, Konzentration [µg/ml], WK= Wachstumskontrolle
Es wurden einige Kolonien einer 18-24 Stunden alten Bakterienkultur mit einer Öse
aufgenommen und in 5 ml 0,9%iger NaCL-Lösung resuspendiert und gemischt.
Danach wurde die Suspension auf den McFarland-Standard 0,5 eingestellt (ATB
1550, api BioMérieux, Nürtingen), was etwa einer Bakterienzahl von 10 6-108Zellen/ml
Material und Methoden
21
entspricht. Zu 13 ml LB-Medium wurde nun 13 µl der McFarland-Suspension
zugegeben und durch mehrmaliges Umdrehen des Röhrchens gemischt.
Teilweise wurden noch Effluxinhibitoren zugegeben, um deren Wirkung auf die MHK
des Bakterienstammes zu testen. Von NMP wurden 130 µl (100 µg/ml) dazu
pipettiert, bzw. 32,5 µl PAβN (25 µg/ml).
Mithilfe einer Mehrkanalpipette (Research pro, Eppendorf, Hamburg) wurden
anschließend jeweils 100 µl der Suspension in die Wells der StandardMikrotitrationsplatten pipettiert. Die Inkubationszeit der verschlossenen Platten betrug
im Brutschrank bei 37°C 18-24 h. Die Beurteilung erfolgte mithilfe eines Spiegels,
wobei die Konzentration des Wells, in dem kein Wachstum mehr sichtbar war, als
MHK definiert wurde.
3.3 Molekularbiologische Methoden
3.3.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen
Elektrokompetente Zellen müssen in der Lage sein, fremde DNA aufzunehmen und
sollten möglichst salzfrei sein, da es bei der anschließenden Transformation
ansonsten zu störenden Strömen kommen kann.
Zur Vorbereitung wurde am Tag zuvor eine Übernachtkultur des gewünschten
Stammes hergestellt. Dazu wurde eine Kolonie in 2 ml LB-Medium eingeimpft und
über Nacht bei 37°C und 220 rpm im Schüttelinkubator bebrütet.
1 ml der Übernachtkultur wurde zu 100 ml LB-Medium gegeben (Verhältnis 1:100)
und weiter im Schüttelinkubator bei 37°C inkubiert bis die Suspension eine optische
Dichte von 0,5 bis 0,7 bei 600nm (Biophotometer, Eppendorf, Hamburg) erreicht
hatte, was einer früh- bis midlogarithmischen Phase entspricht.
Anschließend wurde die Suspension in bereits vorgekühlte 50 ml Röhrchen (greiner
bio-one CELLSTAR) aufgeteilt und bei 2°C und 400 rpm 10 Minuten zentrifugiert
(Eppendorf Centrifuge 5810 R). Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 50
ml eisgekühltem 10%igem Glycerol vorsichtig resuspendiert. Es folgten drei weitere
Waschschritte, wobei die Glycerolmenge jeweils um die Hälfte reduziert und im
2.Schritt zwei Falcons gepoolt wurden.
22
Material und Methoden
Während der gesamten Präparation wurde versucht, die Zellen so kühl wie möglich
(optimal 0°C) zu halten. Zum Schluss wurden die Zellen nochmals in 300 µl 10%igem
Glycerol resuspendiert und anschließend in bei -80°C vorgekühlten 1,5 ml Tubes
(Eppendorf, Hamburg) zu je 50 µl aliquotiert. Die sofortige anschließende Lagerung
erfolgte bei –80°C.
3.3.2 Transformation der Plasmide
Mittels Elektroporation (E.coli Pulser, Bio-Rad, München) wurde die Transformation
der Plasmide in den entsprechenden Stamm durchgeführt.
Zur Vorbereitung mussten sowohl die verwendeten 0,1cm Küvetten (E.coli Pulser
Cuvette, Bio-Rad, München) als auch der Schlitten des E.coli Pulser auf Eis gut
vorgekühlt werden. Anschließend wurden die elektrokompetenten Zellen und die zu
transformierende DNA auf Eis aufgetaut. Der Transformationsansatz bestand aus 50
µl Zellsuspension mit elektrokompetenten Zellen und 1-2 µl DNA. Hierbei sollte sich
auch die DNA in möglichst salzarmem Medium befinden (z.B. Aqua dest.).
Der Ansatz wurde gut gemischt und 30 bis 60 sec auf Eis stehen gelassen. Danach
wurde die Suspension in die vorgekühlten Küvetten pipettiert, im Schlitten des E.coli
Pulser platziert und zwischen die Elektroden geschoben. Es musste darauf geachtet
werden, dass sowohl Küvette als auch Schlitten gut abgetrocknet wurden, da es
sonst zu störenden Strömen kommen kann. Die Transformation erfolgte bei einer
Spannung von 1,8 kV und ~ 5 ms Dauer. Anschließend wurde sofort 1 ml LB- bzw.
SOC-Medium zugegeben, gemischt und in ein 15 ml Röhrchen (BD Falcon)
überführt.
Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde bei 37°C und 225 rpm auf dem Schüttler
wurde der Ansatz auf LB-Platten mit entsprechendem Antibiotikum in der
gewünschten Konzentration ausplattiert.
Material und Methoden
23
3.3.3 Plasmidisolierung
Die Isolierung bzw. Wiedergewinnung der untersuchten Plasmide wurde mithilfe des
QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) durchgeführt. Es wurde das beiliegende
Protokoll befolgt. Die Elution der DNA erfolgte mit 50 µl EB-Puffer.
3.3.4 Primer und Oligonukleotide
Die in dieser Arbeit verwendeten Primer und Oligos sind aus Tabelle 5 ersichtlich.
Die Primer wurden von der Firma Hermann GbR Synthetische Biomoleküle in
Denzlingen hergestellt. Sie wurden in H 2O aufgenommen (100 pmol/µl) und verdünnt
(20 pmol/µl).
Die Oligonukleotide wurden bei der Firma Thermo Fisher Scientific GmbH in Ulm
bestellt. Sie wurden gemäß den Herstellerangaben im entsprechenden Volumen TEPuffer aufgenommen (100pmol/µl) und in H 2O verdünnt (1 µg/ml).
Alle Primer und Oligonukleotide
wurden bei -20°C gelagert. Sie wurden alle
ausschließlich bei Stämmen von E.coli verwendet
Tabelle 5 In der Arbeit verwendete Primer und Oligonukleotide
Name
EC acrB seq
Sequenz
Produkt
größe
Anwendung
ATA ACC AGC AAG CCG CAA G
400bp
Sequenzierung acrb
TGT TCT GCA CCT GAA CCT G
400bp
Sequenzierung acrb
check-fw-1
GTG CAG ATC ACC CTG ACC TT
373bp
Sequenzierung acrb
check-rv-1
CGT TCT GCG CTT TGAT GG
373bp
Sequenzierung acrb
GAA AGA TGC CAT CAG CCG TA
335bp
TCT CAC CAC CCA GCT CAA TC
335bp
1-F
EC acrB seq
1-R
EC acrB seq
3-F
EC acrB seq
3-R
Sequenzierung acrb
Sequenzierung acrb
TGA AGA GTT CGG CAA AAT CC
acrB-S1b-f
233bp
Sequenzierung acrb
24
Material und Methoden
Fortsetzung Tabelle 5
Produkt
Name
Sequenz
acrB-S1-r
AGA CCC GAC GGG AAG AAC
233bp
Sequenzierung acrb
GGC AAT CCG TGC TGA ACT
480bp
Sequenzierung acrb
CCA GTA GAA CCG CCA AAG AA
480bp
Sequenzierung acrb
GTC GGT ATC GCG ATG GTA CT
438bp
Sequenzierung acrb
CTG TGT ACG TTC CTG CGT TG
438bp
Sequenzierung acrb
acrB-S5-f
CCT TCT TGC CAG ATG AGG AC
345bp
Sequenzierung acrb
acrB-S5-r
GCA GTA CCC AGT TCC ACG AT
345bp
Sequenzierung acrb
acrB-S3-f
AAC GTT GAG TCG GTG TTC G
997bp
Sequenzierung acrb
acrB-S3-r
AAC CCA ATG GTT GTG AGC AG
997bp
Sequenzierung acrb
acrB-S4-f
GTC GAT TCC GTT CTC CGT TA
500bp
Sequenzierung acrb
500bp
Sequenzierung acrb
EC acrB seq
5-F
EC acrB seq
5-R
EC acrB seq
6-F
EC acrB seq
6-R
acrB-S4-r
GAG TTG GTG GTT CAA TTA CTC
CTT
AcrB-Rand-fw
GGG TGA TCG CCA TTA TCA TC
AcrB-Rand-rev
TCG ACA GTA TGG CTG TGC TC
upperOligoRand-AcrB
lowOligoRand-AcrB
größe
Anwendung
Error-Prone-PCR
pAcrB
Error-Prone-PCR
pAcrB
TGC TCA GCC TGA ACA GTC CAA
GTC TTA ACT TAA ACA GGA GCC
Error-Prone-PCR acrB
GTT AAG AC
GTT ATG CAT AAA AAA GGC CGC
TTA CGC GGC CTT AGT GAT TAC
Error-Prone-PCR acrB
ACG TTG TA
3.3.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Bei der Polymerase-Kettenreaktion handelt es sich um eine Methode, mit der durch
Primer definierte DNA-Bereiche enzymatisch millionenfach amplifiziert werden
können.
Material und Methoden
25
In der vorliegenden Arbeit wurde die PCR beispielsweise als Vorbereitung für die
Sequenzanalyse
und
zur
Mutagenese
verwendet.
Für
die
Sequenzierungsvorbereitung wurde AcrB mithilfe von neun Primerpaaren in neun
Teilstücke aufgeteilt, um die anschließende Auswertung zu erleichtern (siehe
Abbildung 9).
Alle PCR-Reaktionen wurden im Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg)
durchgeführt. Auf die verwendeten Enzyme, die als Template verwendete DNA und
die Temperaturprofile wird in den jeweiligen Kapiteln näher eingegangen.
Die PCR-Produkte wurden elektrophoretisch mit einem 1,5%igen Agarosegel und
einem geeigneten Marker (1 kB DNA Ladder, New England Biolabs, Ipswich, MA,
USA; peqGold DNA-Sizer III, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen; Genladder
100bp, Genaxxon BioScience, Biberach) untersucht.
Abbildung 9 Vorbereitung zur Sequenzierung
3.3.6 Fällung von PCR-Produkten
Die Fällung von PCR-Produkten wurde durchgeführt, um eine Lösung mit einer
höheren DNA-Konzentration zu erhalten. Dazu wurde zunächst der Inhalt mehrerer
PCR-Tubes in einem Reaktionsgefäß gepoolt. Zu 100 µl PCR-Produkt wurden 10 µl
NaAcetat (3M, pH 5,3) und 300 µl Ethanol (100%) gegeben und durch mehrmaliges
Invertieren gemischt. Das Gemisch wurde anschließend 10 Minuten auf Eis gefällt
und dann zentrifugiert (10 min, 13,2 rpm, 4°C). Der Überstand wurde gut
abgegossen und das Pellet mit 1 ml Ethanol (70%, -20°C) gewaschen. Darauf folgte
nochmaliges Zentrifugieren und Abgießen. Nach dem Trocknen (5-10 min, 37°C) mit
offenem Deckel im Heizblock, wurde das Pellet in 6 µl EB-Puffer (10mM Tris-HCl, pH
26
Material und Methoden
8) aufgenommen. Die DNA-Konzentration wurde mit dem Biophotometer bestimmt
(Eppendorf, Hamburg).
3.3.7 Sequenzierung
Vor der Durchführung der Sequenzanalyse wurden die durch PCR erhaltenen DNAProdukte mithilfe des QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden) aufgereinigt.
Für die Sequenzierung störende Salze und Primer wurden dabei aus dem PCRReaktionsmix entfernt. Die Aufreinigung wurde gemäß den Herstellerangaben
durchgeführt. Die DNA wurde zum Schluss in 50 µl H 2O dest. eluiert.
Für den Sequenzansatz wurde ein Volumen von 20 µl gewählt. In Abhängigkeit von
der Anzahl der Basenpaare des zu untersuchenden DNA-Abschnittes wurden 10-100
ng des aufgereinigten PCR-Produktes mit je 1 µl Sequenzier-Primern (Konzentration
3,2 pmol/µl), H2O und 4 µl Reaktionsmix BigDye 2.0 (Applied Biosystems, Foster
City, CA, USA) versetzt.
Die nachfolgende Sequenzierreaktion erfolgte im Mastercycler Gradient, Eppendorf.
Dabei wurde folgendes Temperaturprofil verwendet: Denaturierung (1 min, 96°C), 25
Zyklen (30 sec, 96°C; 15 sec, 50°C; 4 min, 60°C). Die Proben wurden in der CoreFacility von Dr. M. Hoffmann (Abteilung Klinische Chemie, Medizinische Klinik,
Freiburg) in einem MegaBACETM500 (Amersham Biosciences, Buckimghamshire,
England) aufgetrennt.
Die erhaltenen Sequenzen wurden anschließend mithilfe des Computerprogramms
BioEdit ausgewertet.
Ergebnisse
27
4 Ergebnisse
Gegenstand der vorliegenden Arbeit war das Finden einer Random-MutageneseMethode mit deren Hilfe eine AcrB-Mutanten-Bibliothek generiert werden kann, die
als Grundlage für ein Screening der Mutanten fungiert. Ziel dieses Screenings ist das
Finden des Ansatzpunktes von Effluxpumpeninhibitoren wie Phenylalanin-arginyl-βnaphthylamid (PAβN) und Naphthyl-methyl-piperazin (NMP). Weitere mögliche Ziele
wären das Auffinden von Bindungsstellen für Antibiotika am Teilstück AcrB der
Effluxpumpe AcrAB TolC.
Dazu wurden drei verschiedene Random-Mutagenese Methoden getestet. Es wurde
untersucht, wie viele Klone mit den verschiedenen Methoden generiert werden
konnten und wie hoch die Mutationsraten der jeweiligen Methoden waren.
Bei allen untersuchten Laborstämmen und hergestellten Mutanten wurde die
Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Antibiotika durch Bestimmung der
minimalen Hemmkonzentration (MHK) (vgl. Kapitel 3.2.2) getestet.
Bei phänotypisch auffälligen Stämmen wurde AcrB sequenziert, um Veränderungen
in der Aminosäuresequenz festzustellen.
Im Folgenden werden die drei Random-Mutagenese Methoden beschrieben und im
Anschluss daran die erhaltenen Ergebnisse aufgeführt.
4.1 XL1-Red Competent Cells
Bei XL1-Red handelt es sich um einen Mutatorstamm, der in der Molekularbiologie
und in der Gentechnik zur ungerichteten Mutagenese verwendet wird. Der Stamm
zeigt Defekte in drei wichtigen DNA-Reparaturmechanismen und weist somit eine
5000fache Mutationsrate im Vergleich zum Wildtyp auf. Die Defekte im DNAReparaturmechanismus gehen auf Mutationen in der genomischen DNA zurück. Das
Gen mutS kodiert für ein Protein, das bei der Error Prone Reparatur eine Rolle spielt,
wodurch keine Fehlbasenreparatur nach der Replikation erfolgt. MutD löst einen
Defekt der 3'-5'-Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase III aus. MutT ist für die
Unfähigkeit zur Hydrolyse des Basenanalogons 8-oxodGTP verantwortlich.
Für die Mutagenese musste das gewünschte Gen (acrB) in ein Plasmid kloniert
vorliegen. Freundlicherweise wurde pAcrAB von Elena B. Tikhonova (Department of
Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, Norman, Oklahoma, USA) zur
Verfügung gestellt (Tikhonova et al., 2002). Dieses Plasmid konnte nun den
28
Ergebnisse
mutagenen Bedingungen ausgesetzt werden, indem es in den Mutatorstamm XL1Red transformiert wurde.
Die verwendeten XL1-Red Competent Cells stammen von Stratagene.
Zur Vorbereitung musste SOC-Medium im Wasserbad auf genau 42°C vorgewärmt
werden. 1,4M β-Mercaptoethanol und ein Tube XL1-Red Zellen (200 µl) wurden auf
Eis aufgetaut. Beides wurde vorher bei -80°C gelagert. Die XL1-Red Zellen wurden
vorsichtig durch leichtes Schnippen gemischt, und anschließend wurden je 100 µl in
ein auf Eis vorgekühltes 14 ml Röhrchen (PP-Tube 14 ml greiner bio-one) pipettiert.
Es wurden jeweils 1,7 µl β-Mercaptoethanol dazu gegeben und wieder durch leichtes
Schnippen gemischt, wodurch man eine Endkonzentration von 25 mM erhält. Laut
Hersteller hat es sich gezeigt, dass der Zusatz von β-Mercaptoethanol die Effizienz
der Transformation um das zwei– bis dreifache steigert. Dann wurde der
Reaktionsansatz 10 min auf Eis inkubiert und alle 2 min gemischt. Je Ansatz wurden
nun 50 ng Plasmid zugesetzt und ebenfalls gemischt. Nach 30 min Inkubation auf Eis
wurden die Röhrchen für genau 45 sec bei 42°C ins Wasserbad gestellt und dann
wieder 2 min auf Eis inkubiert. Danach wurde jeweils 0,9 ml auf 42°C vorgewärmtes
SOC-Medium zugegeben und die Ansätze sofort für eine Stunde bei 37°C im
Schüttelinkubator bei ca. 225 rpm bebrütet.
Anschließend wurden jeweils 200 µl des Reaktionsansatzes auf Ampicillin
(Endkonzentration 100 µg/ml) enthaltende LB-Platten (LBAmp100) mit einem
Drigalskispatel ausplattiert. Die Platten wurden bei 37°C für 24-30 Stunden im
Brutschrank kultiviert. Die gewachsenen Kolonien wurden ausgezählt und im Schnitt
ergaben sich aus 2x100µl Ausgangszellen ca. 1000 Kolonien (siehe Tabelle 6).
Mit einem sterilen Zahnstocher wurden möglichst alle Kolonien gepickt und damit 10
ml LB-Amp100 angeimpft und über Nacht bei 37°C bebrütet.
Teilweise wurden 100 µl der ÜN-Kultur in 10 ml LB-Amp100 überführt und nochmals
für 24 h inkubiert, um eine höhere Mutationsrate zu erreichen. Anschließend wurde
genauso verfahren wie bei dem kürzer bebrüteten Ansatz.
Ergebnisse
29
Tabelle 6 Effizienz der Mutagenesen
Mutagenesen
Erhaltene Klone
Klone/µg
Klone/ml Ansatz
Plasmideinsatz
1(doppelter
1101
1,1x 105
5,5x 102
903
9x 104
4,5x 102
837
8x 104
4x102
423
8,5x 104
4,2x 102
Ansatz)
2(doppelter
Ansatz)
3(doppelter
Ansatz)
4(einfacher
Ansatz)
Die Isolierung der Plasmide erfolgte aus 2x5 ml der ÜN-Kultur mithilfe des QIAprep
Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden). Dabei wurde das Protokoll des Herstellers
befolgt. Die DNA wurde jeweils mit 50 µl EB-Puffer eluiert.
Die erhaltene, mutagenisierte DNA (Konzentration ca. 80 ng/µl) wurde nun zur
Transformation in einen Pumpen-Knockout-Stamm verwendet (vgl. Kapitel 3.3.2) und
anschließend für eine Stunde bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert.
Anschließend wurden die Proben auf Platten mit Antibiotikazusatz (Konzentrationen
siehe Tabelle 8) ausplattiert, bei deren Konzentration der verwendete Stamm mit
nicht mutagenisiertem Plasmid normalerweise nicht mehr zum Wachstum fähig ist.
Der komplette Probenansatz wurde in 100 bis 200 µl Portionen auf mehreren Platten
mit teils unterschiedlichem Antibiotikazusatz ausplattiert. Dabei musste darauf
geachtet werden, dass die Flüssigkeit vollständig ausplattiert wurde, da es sonst zu
Keimwachstum auf dem verbliebenen Flüssigkeitsfilm kommen kann.
Als Kontrolle wurde ein Pumpen-Knockout-Stamm (DKO) mitgeführt, der aufgrund
der nicht vorhandenen Pumpe nicht auf den gewählten Antibiotikakonzentrationen
wachsen kann. Wenn doch Keimwachstum stattgefunden hätte, könnte dies ein
Zeichen dafür sein, dass ein Fehler bei der Herstellung der Platten vorliegt, d.h. die
Antibiotikakonzentration zu niedrig wäre. Dazu wurden 20 µl Keimsuspension in 1 ml
LBAmp100 überführt und zusammen mit dem Probenansatz für eine Stunde auf dem
Schüttler bebrütet wurde. Davon wurden nur je 100 µl pro Antibiotikum und
Konzentration ausplattiert.
30
Ergebnisse
Um die Effizienz der Transformation bestimmen zu können, wurde aus LBAmp100 und
dem Probenansatz eine 1:100 Verdünnung hergestellt und 100 ml davon auf
LBAmp100-Platten ausplattiert. Durch die hier erhaltene Anzahl von Klonen kann auf
die Zahl von Klonen pro 1 ml mutagenisiertem Ansatz hochgerechnet werden.
Als Pumpen-Knockout-Stämme, in die mutagenisierte DNA transformiert wurde,
wurden DKO, 3AG100ΔacrB::rpsl-neo und KAM32 ( vgl. Kapitel 3.1.2) verwendet. Mit
den elektrokompetenten Zellen aus KAM32 wurde dabei die höchste Effizienz
erreicht (siehe Tabelle 7). Dabei wurden die gerundeten Mittelwerte aus mindestens
vier Transformationen aufgeführt.
Diese Ergebnisse führten dazu, dass hauptsächlich KAM32 benutzt wurde, auch bei
der folgenden GeneMorphII EZClone Methode.
Tabelle 7 Effizienz der Transformationen
Elektrokompetente Zellen
Theoretisch erhaltene Klone pro
Transformation
DKO
1x 105
3AG100ΔacrB::rpsL-neo
1x 103
KAM32
1x 106
Für diese Methode wurden die Antibiotika Linezolid, Gentamicin, Minocyclin und
Chloramphenicol
in
verschiedenen
Konzentrationen
verwendet.
Die
Antibiotikakonzentrationen wurden ein oder zwei Stufen über der MHK eines Klones
mit nicht mutagenisiertem Plasmid (KAM32xpAcrB) gewählt, um möglicherweise
Mutanten zu finden, die Veränderungen in der Antibiotikabindetasche
der
Effluxpumpe AcrB aufweisen. Im Gegensatz zu Gentamicin handelt es sich bei
Linezolid, Chloramphenicol und Minocyclin um Substrate der Effluxpumpe. Durch
Veränderungen in der Bindetasche könnte es eventuell zu verbessertem Efflux der
bekannten Pumpensubstrate und somit zu einer erhöhten MHK der Mutanten
kommen. Gentamicin wurde verwendet, um zu testen, ob Mutationen dazu führen
könnten, dass auch Antibiotika der Gruppe Aminoglykoside an AcrB gebunden
werden könnten.
Teilweise wurde zusätzlich der Effluxpumpeninhibitor NMP eingesetzt. Bei der
verwendeten Konzentration (100 µg/ml) handelt es sich um eine im Labor getestete
Standardkonzentration.
Auch
in
Kombination
mit
NMP
wurde
die
Ergebnisse
31
Antibiotikakonzentration ein bis zwei Stufen über der MHK von KAM32xpAcrB mit
NMP gewählt. Wenn Veränderungen der Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika in
Kombination mit NMP auftreten, könnte durch Aufsuchen der Mutationen eventuell
auf den für die NMP-Wirkung verantwortlichen Bereich der Pumpe geschlossen
werden.
Tabelle 8 Verwendete Nährmedien
Antibiotikum in LB-Agar
Konzentration in µg/ml
NMP Konzentration
in µg/ml
Linezolid
32
100
Linezolid
64
100
Gentamicin
8
Gentamicin
16
Chloramphenicol
16
Chloramphenicol
32
Minocyclin
2
Minocyclin
4
4.1.1 Erhaltene Klone mit Phänotyp
Bei Klonen, die unter diesen Selektionsbedingungen wachsen konnten ging man
davon aus, dass eine relevante Mutation stattgefunden haben könnte. Um die Klone
genauer auf eine veränderte Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika zu testen, wurden
MHK Bestimmungen durchgeführt. Insgesamt war die Ausbeute an Klonen sehr
gering, da häufig kein Wachstum auf den gewählten Platten zu finden war.
Zwei Klone, die auf Minocyclin (4 µg/ml) gewachsen waren (Mino1 und Mino3), fielen
durch nahezu konstante Erhöhung der MHK im Vergleich zu KAM32xpAcrAB auf. Ab
einer Steigerung von zwei Titerstufen, was einer 4fachen MHK-Erhöhung entspricht,
wurden die Werte in Tabelle 9 fett gedruckt dargestellt. Bei Zugabe von 100 µg/ml
NMP wurde teilweise eine 16-fache Erhöhung der MHK erreicht, wie zum Beispiel bei
Azithromycin plus NMP und Clindamycin plus NMP.
32
Ergebnisse
Tabelle 9 Vergleich der MHK-Werte der erhaltenen Minocyclin-Klone (Mino1 und Mino2) mit dem PumpenKnockout-Stamm und dem nicht-mutierten Vergleichsstamm. Alle Antibiotikakonzentrationen sind in
µg/ml angegeben.
Substanzen
Stämme
KAM32
Levofloxacin
0,016
Levo + 100 NMP
Tetracyclin
0,25
Tet + 100 NMP
Chloramphenicol
0,75
Cha + 100 NMP
Rifampicin
8
Rifa + 100 NMP
Oxacillin
1
Oxa + 100 NMP
Linezolid
8
Lizo + 100 NMP
Clarithromycin
2
Clari + 100 NMP
Erythromycin
0
Ery + 100 NMP
Azithromycin
0
Azi + 100 NMP
Clindamycin
0
Clinda +100 NMP
Novobiocin
0,5
Novo + 100 NMP
Gentamycin
2
Genta + 100 NMP
Minocyclin
0,0625
Mino + 100 NMP
Ciprofloxacin
0
Cipro + 100 NMP
Moxifloxacin
Moxi + 100 NMP
0
KAM32xpAcrAB
Mino1(KAM32x
Mino3(KAM32x
pAcrABmut)
pAcrABmut)
0,13
0,25
0,25
0,03
0,13
0,125
2
8
4
0,25
2
2
8
16
8
0,5
8
4
16
16
16
8
8
8
2048
2048
2048
1024
2048
2048
512
1024
1024
16
128
64
128
512
512
32
128
256
512
1024
1024
128
512
512
32
128
64
2
32
16
256
512
512
16
256
64
256
512
512
64
512
256
2
4
4
8
4
4
2
8
4
0,25
2
1
0,06
0,25
0,25
0,03
0,125
0,063
0,25
0,5
0,5
0,063
0,25
0,125
Ergebnisse
33
Abbildung 10 Signifikante MHK-Erhöhung ohne NMP der Stämme Mino 1 und Mino 2 im Vergleich zu
KAM32xpAcrB.
Abbildung 11 Signifikante MHK-Erhöhung mit NMP der Stämme Mino1 und Mino2 im Vergleich zu
KAM32xpAcrB.
34
Ergebnisse
Um zu überprüfen, ob und welche Mutationen stattgefunden hatten, wurde von
Mino1 und Mino3 im Anschluss pAcrB sequenziert und ausgewertet (vgl.Kapitel 3.3.5
und Kapitel 3.3.7).
Bei der Auswertung stellte sich heraus, dass in keinem der Pumpengene eine
Mutation zu finden war, trotz Veränderungen der Empfindlichkeit im Bezug auf einige
Antibiotika und den Effluxpumpeninhibitor NMP. Auch bei weiteren sequenzierten
Klonen konnte keine Mutation festgestellt werden.
4.2 GeneMorphII EZClone
4.2.1 Methode GeneMorphII EZClone
Die GeneMorphII EZClone-Methode beruht auf dem Prinzip der Error-Prone-PCR,
hier kommt es bei der Vervielfältigung des Zielgens (AcrB) zum absichtlichen
Fehlereinbau. Zur Durchführung wurde das GeneMorphII EZClone Domain
Mutagenesis Kit von Stratagene verwendet. Im Unterschied zu anderen Error-Prone
PCR-Methoden, bei denen die Fehlereinbauten durch eine Taq DNA Polymerase,
Veränderungen im Puffermilieu sowie ungleiche dNTP-Konzentrationen erzeugt
werden, wird hier die Mutazyme II DNA Polymerase verwendet.
Bei Mutazyme II handelt es sich um ein Gemisch aus Mutazyme I und einer neuen
Taq
DNA
Polymerase
Variante,
durch
deren
Einsatz
es
zu
besseren
Mutageneseergebnissen kommt. Mutantenbibliotheken, die mit Mutazyme II DNA
Polymerase hergestellt wurden, brachten ein größeres Mutantenspektrum hervor, als
Bibliotheken, die mit einer anderen Polymerase hergestellt wurden. Dies beruht
darauf, dass Mutazyme II zu einem ausgewogeneren Mutationsspektrum führt (siehe
Tabelle 10). Mutazyme II bewirkt etwa gleich große Mutationsraten im Bereich der
Nukleobasen A und T sowie im Bereich von G`s und C`s. Mutazyme I hingegen neigt
eindeutig zu mehr Mutationen im Bereich der Basen G und C und die Taq DNA
Polymerase bevorzugt A`s und T`s.
Ergebnisse
35
Tabelle 10 Vergleich verschiedener DNA-Polymerasen
Mutationstyp
Mutazyme II DNA
Mutazyme I DNA
Taq DNA
Polymerase
Polymerase
Polymerase
AN, T N
50,7%
25,6%
75,9%
GN, CN
43,8%
72,5%
19,6%
Transitions/
0,9
1,2
0,8
Transversions
Die Mutationsraten können bei der Mutazyme II-Mutagenese durch die Menge der
eingesetzten Ziel-DNA bzw. durch die Anzahl der Amplifikationszyklen reguliert
werden. Dabei können Raten von 1-16 Mutationen pro kb erreicht werden (vgl.
Tabelle 11).
Tabelle 11 Übersicht über DNA-Einsatz und Mutationsraten
Mutationsrate
Mutationsfrequenz
Initiale Ziel-DNA
(Mutation/kb)
Menge (ng)
Niedrig
0-4,5
500-1000
Mittel
4,5-9
100-500
Hoch
9-16
0,1-100
Wird für die PCR eine geringe Menge an Ziel-DNA eingesetzt, durchläuft sie mehr
Verdopplungen, als wenn eine größere Menge verwendet wird. Je öfter das Zielgen
repliziert wird, desto mehr Fehler werden eingebaut.
Daraus folgt: Je geringer die initiale DNA Menge, desto höher liegt die Mutationsrate
und je größer der DNA-Einsatz, desto geringer die Mutationsrate. (siehe Tabelle 11)
Genauso kann die Mutationsrate durch Erniedrigung oder Erhöhung der PCR-Zyklen
reguliert werden.
4.2.1.1.1 Mutagenese (Megaprimersynthese)
Alle verwendeten Komponenten wurden vor Gebrauch vorsichtig gemischt und
anschließend zentrifugiert. Der gesamte Versuch wurde auf Eis durchgeführt. Der
36
Ergebnisse
Reaktionsansatz erfolgte gemäß Tabelle 12, die Templateeinsätze variierten je nach
gewünschter Mutationsrate.
Tabelle 12 Reaktionsansatz der Megaprimersynthese
Reaktionsansatz
Reaktionsvolumen
50 µl
Reaktionsmix
5 µl 10x Mutazyme II reaction buffer
x µl template (Plasmid, 10ng/µl)
1 µl Primer AcrAB RAND forward
1 µl Primer AcrAB RAND rewerse
1 µl 40mM dNTPmix
ad µl ddH 2O
1 µl Mutazyme II DNA Polymerase
(2,5U/µl)
Die Temperaturprofile wurden, wie aus Tabelle 13 ersichtlich, eingestellt.
Tabelle 13 PCR-Bedingungen der Megaprimersynthese
Temperaturprofil
1.Denaturierung
2 min bei 95°C
2. 30 Zyklen(Denaturierung,Annealing, 30 sec bei 95°C
Elongation)
30 sec bei 55°C
3 min 20 sec bei 72°C (1 min/kb)
3. Abschließende Elongation
10 min bei 72°C
Zur Kontrolle, ob die Megaprimersynthese funktioniert hatte, wurden die PCRProdukte elektrophoretisch in einem 1,5%igen Agarose-Gel aufgetrennt, dabei
musste, nach erfolgreicher Durchführung, eine deutliche Bande sichtbar sein.
Die erhaltenen, mutierten PCR-Produkte wurden mit dem QIA quick purification Kit
aufgereinigt und in der anschließenden EZClone Reaktion als Megaprimer
verwendet. Das bei der Megaprimersynthese verwendete Plasmid wurde wieder als
Template verwendet. So war durch Extension der Megaprimer ein mutiertes Plasmid
mit offenen „abgestuften“ Enden („staggered nicks“) entstanden. Da als Templates
nicht mutierte Plasmide eingesetzt wurden, lag nun ein Gemisch aus mutierten und
nicht mutierten Plasmiden vor. (siehe Abbildung 12)
Ergebnisse
Abbildung 12 GeneMorph EZClone modifiziert nach Stratagene
37
38
4.2.1.2
Ergebnisse
EZClone Reaktion:
Tabelle 14 Reaktionsansatz der EZClone Reaktion
Reaktionsansatz
Reaktionsvolumen
50 µl
Reaktionsmix
25 µl EZClone Enzyme mix
50 ng template plasmid
500 ng Megaprimer
3 µl EZClone solution
ad µl ddH 2O
Die Temperaturprofile sind aus Tabelle 15 ersichtlich.
Tabelle 15 PCR-Bedingungen der EZClone Reaktion
Temperaturprofil
Denaturierung
1 min bei 95°C
25 Zyklen ( Denaturierung, Annealing, 50 sec bei 95°C
Elongation)
50 sec bei 60°C
14 min bei 68°C
Um die nicht mutierten Plasmide zu entfernen, wurde Dpn I Restriktionsenzyme zu
Hilfe genommen. Die Dpn I Endonuklease ist spezifisch für methylierte DNA und führt
somit zum Verdau der als Template eingesetzten Plasmide. Die mutierten Plasmide
sind nicht betroffen, da durch PCR hergestellte DNA nicht methyliert ist. Der Erfolg
der Restriktion wurde durch nur eine sichtbare Bande der Probe nach Auftrennung im
1,5%igen Agarose-Gel bestätigt. (siehe Abbildung 13).
4.2.1.3 Restriktion:
1 µl DpnI restriction enzyme (10 U/µl) wird zu dem aus der EZClone Reaktion
erhaltenen PCR-Produkt zugegeben, gemischt und bei 37°C 2 Stunden inkubiert.
Ergebnisse
39
Abbildung 13 Kontrolle der Restriktion
Die übrigen mutierten Plasmide wurden nun in kompetente Zellen transformiert, dort
konnten zelleigene Enzyme die offenen Enden verschließen. Zu Beginn der
Versuche wurden die im Kit enthaltenen XL10-Gold Ultrakompetent Cells verwendet.
Dabei handelt es sich um ein Derivat der hochkompetenten Zelllinie XL2-Blue MRF´
von
Stratagene.
Sie
besitzt
den
Hte
Phenotyp,
wodurch
sich
die
Transformationseffizienz deutlich steigert. Die XL10-Gold Zellen sind sowohl
endonukleasedefizient (endA1) als auch rekombinationsdefizient (recA). Die endA1
Mutation verbessert die Qualität der Plasmid Miniprep DNA und die recA Mutation
hilft, die Stabilität des Inserts zu sichern.
4.2.1.4 Transformation in XL10-Gold Zellen:
Zur Transformation in XL10-Gold Zellen wurde das Prinzip des Hitzeschocks
angewendet.
Zuerst wurden die bei -80°C gelagerten XL10-Gold Zellen auf Eis aufgetaut und
jeweils 45 µl in vorgekühlte 14 ml Falcons aliquotiert. Dann wurden 2 µl βMercaptoethanol zugeführt und durch leichtes Schnippen gegen das Reaktionsgefäß
gemischt. Während der folgenden 10 Minuten wurde der Ansatz auf Eis inkubiert und
alle 2 min vorsichtig gemischt.
Anschließend wurden 1,5 µl der mit DpnI behandelten DNA dazu pipettiert, vorsichtig
gemischt und 10 Minuten auf Eis inkubiert.
Nun wurde das Reaktionsgemisch für 30 sec im 42°C warmen Wasserbad einem
Hitzeschock ausgesetzt. Danach wurden die Falcons wieder 2 min auf Eis inkubiert.
Zum Schluss wurde 0,5 ml, auf 42°C vorgewärmtes, NZY+ broth zugegeben und der
Ansatz wurde für 1 h bei 37°C auf dem Schüttler bebrütet.
40
Ergebnisse
Danach wurden jeweils 100 µl auf LBAmp100-Platten ausplattiert und bei 37°C im
Brutschrank für mehr als 16 Stunden inkubiert. Dabei wurden im Schnitt pro
Transformation 115 Klone erzielt.
Die gewachsenen Klone wurden mit einem sterilen Zahnstocher gepickt und in 10 ml
LBAmp100 angeimpft. Das beimpfte Medium wurde in einen 100 ml Erlenmeyerkolben
überführt und über Nacht bei 37°C im Schüttler bebrütet.
Danach wurden die Plasmide mithilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden)
isoliert.
Die erhaltenen Plasmide wurden nun durch Elektroporation in den kompetent
gemachten Pumpen-Knockout-Stamm KAM32 transformiert und anschließend auf
LB-Platten mit verschiedenen Antibiotika in unterschiedlichen Konzentrationen
ausplattiert. Die Konzentrationen wurden so gewählt, dass Mutanten mit nicht
mutierter Pumpe normalerweise nicht darauf wachsen können. So sollten Klone
gefunden werde, die eine erhöhte Antibiotikaresistenz aufweisen. Allerdings konnten
im Rahmen dieser Versuche keine Klone nachgewiesen werden, die diese Kriterien
erfüllen.
Um die Methode zu vereinfachen und den Zeit- und Materialaufwand zu verringern,
wurde in späteren Versuchen der Schritt der Transformation in XL10-Gold Zellen
ausgelassen – die mutierten Plasmide wurden direkt durch Elektroporation in KAM32
transformiert. Um die direkte Transformation in KAM32 durchführen zu können,
wurden die Plasmide mit dem QIA quick PCR Purification Kit aufgereinigt.
Anschließend wurde der Ansatz auf LB Amp100-Platten ausplattiert. Die dabei
gewachsenen
Klone
wurden
anschließend
direkt
durch
MHK`s
auf
ihre
Resistenzeigenschaften getestet. Da auch diese Variante der Methode erfolgreich
war und Mutanten erzeugt werden konnten, wurden die mutagenisierten Plasmide
weitestgehend direkt in KAM32 transformiert. Es erwies sich auch als praktikabel die
Klone direkt durch MHK`s zu testen, ohne sie zuvor auf Platten mit verschiedenen
Antibiotikakonzentrationen zu selektionieren.
4.2.2 Ergebnisse
Wie in Kapitel 4.2.1 beschrieben, wurden unterschiedliche Mengen an DNA
eingesetzt, um verschiedene Mutationsraten zu erreichen. Wie aus Tabelle 16
ersichtlich, wurden DNA-Mengen eingesetzt, bei denen hohe bzw. mittlere bis
Ergebnisse
41
niedrige Mutationsraten zu erwarten waren. Des Weiteren wird deutlich wie viele
Klone
durchschnittlich
erzielt
wurden,
wenn
Plasmide
der
verschiedenen
Mutagenesen in KAM32 transformiert und auf Amp 100-Platten ausplattiert wurden. So
waren es z.B. bei 522 ng DNA-Einsatz 522 Klone und bei 10 ng Einsatz nur 17
Klone.
Bei der Testung der minimalen Hemmkonzentration zeigte sich, bei welchen Klonen
noch eine funktionstüchtige Pumpe erhalten geblieben war. Wenn zu viele
Mutationen die Funktion der Pumpe zu stark beeinträchtigten, zeigten die Klone die
gleichen MHK-Werte wie ein Knockout-Stamm, d.h. ein Stamm ohne AcrB.
Tabelle 16 Übersicht über eingesetzte DNA-Mengen und erhaltener Klone
Eingesetzte DNA-
Erhaltene Klone
Klone mit
Verhältnis
Menge
pro
funktionierender
erhaltener Klone
Transformation in
Pumpe
zu Klonen mit
KAM32
funkt. Pumpe
4 ng
25
1
25:1
10 ng
17
6
3:1
522 ng
522
61
8:1
4.2.2.1 MHK-Daten
In Tabelle 17 sind exemplarisch die MHK-Werte von drei erhaltenen Klonen im
Vergleich zu dem Pumpen-Knockout-Stamm KAM32 und zu KAM32 mit nichtmutiertem AcrB in Plasmid (KAM32xpAcrB) dargestellt. Bei E2 und E6 handelt es
sich um Klone aus einer Mutagenese mit 10 ng DNA-Einsatz, bei H7 handelt es sich
um den einzigen Klon mit funktionierender Pumpe aus der Mutagenese mit 4 ng
DNA-Einsatz. E6 stellt ein Beispiel dar für die Mutanten, bei denen die Pumpe nicht
mehr funktionstüchtig war (Vergleich Werte KAM32 und E6).
E2 und H7 fielen auf, da die MHK bei einigen Antibiotika im Bereich von KAM32 lag,
bei anderen dagegen im Bereich zwischen KAM32 und KAM32xpAcrAB, wie z.B. bei
Linezolid. Diese Werte sind in Tabelle 17 fett gedruckt dargestellt. Die bei E2 mit
NMP durchgeführten MHK-Testungen zeigen nur in der Gruppe der Makrolide
(Erythromycin, Azithromycin, Clarithromycin) gewisse Besonderheiten, da die
Empfindlichkeit von E2 auf Antibiotikum plus NMP im Bereich von KAM32xpAcrB
42
Ergebnisse
bzw. zwischen den beiden Vergleichskeimen liegt. Die Werte der anderen Antibiotika
plus NMP entsprechen hingegen dem Knockout-Stamm KAM32.
Die bei allen getesteten Stämmen vorliegende hohe Resistenz gegenüber Oxacillin
erklärt sich durch die im Plasmid vorhandene Ampicillin-Resistenz-Kassette.
Tabelle 17 Vergleich der MHK-Werte der erhaltenen Klone mit dem Pumpen-Knockout-Stamm und dem
nicht-mutierten Vergleichsstamm. Alle Konzentrationen sind in µg/ml angegeben.
Substanzen
Stämme
KAM32
KAM32x
E2
H7
E6
pAcrAB
Levofloxacin
0,02
0,13
0,016
Levo +100 NMP
0,02
0,03
0,016
Tetracyclin
0,25
2
0,25
Tetra + 100 NMP
0,19
0,25
0,25
Chloramphenicol
0,75
8
1
Cha + 100 NMP
0,5
0,5
1
Rifampicin
8
16
8
Rifa + 100 NMP
2
8
2
Oxacillin
1
2046
2048
Oxa +100 NMP
0,5
1024
1024
Streptomycin
4
4
4
Strep + 100 NMP
6
8
4
Linezolid
8
512
64
Lizo + 100NMP
6
16
8
Clarithromycin
2
128
2
Clari + 100 NMP
1,5
32
16
Erythromycin
4
512
16
Ery + 100 NMP
6
128
32
Azithromycin
0,5
32
4
Azi +100 NMP
0,25
2
1
Novobiocin
0,5
256
16
1
64
2
Minocyclin
0,06
2
1
Mino +100 NMP
0,06
0,25
0,063
Novo + 100 NMP
0,031
0,016
0,25
0,25
1
0,5
16
16
2048
2048
4
4
256
8
64
2
8
0,5
1
0,063
4.2.2.2 Sequenzierung der Klone
Die Plasmidpumpengene AcrB der Mutanten E2 und H7 wurden, wie in Kapitel 3.3.7
beschrieben, sequenziert und anschließend ausgewertet. Dabei stellte sich heraus,
Ergebnisse
43
dass sich bei beiden Klonen ein Stopcodon in AcrB befand, womit die Vermutung
nahelag, dass es sich um Mischklone handeln musste, da die Pumpen durch das
Stopcodon nicht mehr funktionstüchtig wären. Bei E2 befindet sich das STOP-Codon
an Position 632 und bei H7 direkt am Anfang des Gens auf Position 89, wodurch es
bei der Translation zum Kettenabbruch kommt.
In Tabelle 18 werden die gefundenen Mutationen der Klone E2 und H7 aufgeführt.
Dazu wird ein Ausschnitt von drei Tripletts des Ursprungsgens
über den
entsprechenden Tripletts der Mutanten dargestellt. Das ausgetauschte Nukleotid ist
farbig gekennzeichnet. Die Aminosäurenposition der Mutation ist vor dem
Genausschnitt angegeben.
Tabelle 18 Übersicht der sequenzierten Klone und deren Mutationen
Klon
AS-Position
E2
30
DNA-Ausschnitt
aaa ctg ccg
Art der Mutation
stille Mutation
aaa cta ccg
ccg gca gta
E2
42
E2
262
E2
436
E2
524
E2
538
E2
623
cag aat acc
cag aaa acc
E2
628
gcg ttc gtt
gcg atc gtt
E2
632
ttg aag gac
ttg tag gac
E2
795
gct gat ggt
gct aat ggt
E2
798
cag atg gtg
cag aag gtg
ccg gct gta
ctg ctg cgt
ctg ccg cgt
atg ggg cag
atg gtg cag
agc acg cac
agc tcg cac
agt acg ggg
agt aca ggg
stille Mutation
Austausch von Leucin gegen Prolin
Austausch von Glycin gegen Valin
Austausch von Threonin gegen Serin
stille Mutation
Austausch von Asparaginsäure
gegen Lysin
Austausch von Phenylalanin gegen
Isoleucin
Austausch von Lysin gegen ein
STOP-Codon
Austausch von Asparagin gegen
Asparaginsäure
Austausch von Methionin gegen
Lysin
44
Ergebnisse
Fortsetzung Tabelle 18
Klon
AS-Position
DNA-Ausschnitt
E2
962
att gaa gcg
att gta gcg
H7
89
gtg cag atc
gtg tag atc
H7
132
H7
200
aaa tca tcc
aaa tct tcc
acg ccg gtt
acg tcg gtt
H7
297
acc ggt gca
acc ggc tca
H7
418
H7
775
H7
780
H7
786
gag cgt gtt
gag cga gtt
atg tca gaa
atg tct gaa
tac cgt atg
tac cgg atg
gat atc ggc
gat att ggc
H7
788
ggc gac tgg
ggc aac tgg
H7
804
gcg ttc tcc
gcg tcc tcc
H7
811
gag tac ggt
gag ttc ggt
H7
815
ccg cgt ctg
ccg ctt ctg
H7
820
tac aac ggc
tac tac ggc
H7
875
cct tca ctg
cct tct ctg
H7
904
ctg gtc gtt
ctg gac gtt
Art der Mutation
Austausch von Glutaminsäure gegen
Valin
Austausch von Glutamin gegen ein
STOP-Codon
stille Mutation
Austausch von Prolin gegen Serin
stille Mutation und Austausch von
Alanin gegen Serin
stille Mutation
stille Mutation
stille Mutation
stille Mutation
Austausch von Asparagin gegen
Asparaginsäure
Austausch von Phenylalanin gegen
Serin
Austausch von Tyrosin gegen
Phenylalanin
Austausch von Arginin gegen Leucin
Austausch von Asparaginsäure
gegen Tyrosin
stille Mutation
Austausch von Valin gegen
Asparagin
Da es sich bei den sequenzierten Mutanten um Mischklone mit teilweise
funktionierenden und teilweise unbrauchbaren AcrB-Effluxpumpen handelt, kann
keine Aussage darüber gemacht werden, ob die Auffälligkeiten bei den MHKBestimmungen eine Folge der dargestellten Mutationen sind.
Ergebnisse
45
4.3 GeneMorph II Random Mutagenesis in Kombination mit
Red®/ET®-Rekombination
4.3.1 GeneMorph II Random Mutagenesis
Bei dieser Methode wurde das Zielgen AcrB wie in der vorigen Methode durch die
Mutazyme II Polymerase mutagenisiert, jedoch anschließend durch das Red/ETSystem über Homologe Rekombination direkt ins Genom eingebracht. So befindet
sich die Mutation nicht wie zuvor auf Plasmid, sondern direkt im Genom.
Als Template wurde kein Plasmid mit AcrB benutzt, sondern es wurde ein PCRProdukt des AcrB-Gens verwendet. Als Template eingesetztes Plasmid könnte bei
dieser Methode stören, da die Homologe Rekombination am Plasmid und nicht, wie
gewünscht, im Genom stattfinden könnte. Zur Herstellung des verwendeten PCRProduktes wurde Wildtyp-pAcrAB eingesetzt. Der Reaktionsansatz erfolgte gemäß
Tabelle 19.
Tabelle 19 Reaktionsansatz zur Herstellung des Templates
Reaktionsansatz
Reaktionsvolumen
50 µl
Reaktionsmix
ad µl H 2O
5 µl 10x Puffer
1 µl dNTPmix
1 µl upperOligo-Rand-AcrB
1 µl lowOligo-Rand-AcrB
0,5 µl Taq-Polymerase
2 ng pAcrAB
46
Ergebnisse
Tabelle 20 PCR-Bedingungen zur Herstellung des Templates
Temperaturprofil
1. Denaturierung
2 min bei 96°C
2. 30 Zyklen (Denaturierung,
30 sec bei 94°C
Annealing, Elongation)
30 sec bei 60°C
4 min bei 72°C (1 min/kb)
3. Abschließende Elongation
8 min bei 72°C
Zur Durchführung wurde das Kit GeneMorphII Random Mutagenesis Kit von
Stratagene benutzt. Alle verwendeten Komponenten wurden vor Gebrauch vorsichtig
gemischt und anschließend zentrifugiert. Der gesamte Versuch wurde auf Eis
durchgeführt. Der Reaktionsansatz erfolgte gemäß Tabelle 21.
Die Templateeinsätze variierten je nach gewünschter Mutationsrate.
Tabelle 21 Reaktionsansatz der Mutagenese
Reaktionsansatz
Reaktionsvolumen
50 µl
Reaktionsmix
ad µl H 2O
5 µl 10x Mutazyme II reaction buffer
1 µl 40mM dNTPmix
0,5 µl upper Oligo
0,5 µl low Oligo
1 ml Mutazyme II DNA polymerase (2,5
U/µl)
X µl Template
Ergebnisse
47
Die Temperaturprofile wurden, wie aus Tabelle 22 ersichtlich, eingestellt.
Tabelle 22 PCR-Bedingungen der Mutagenese
Temperaturprofil
1. Denaturierung
2 min bei 95°C
2. 30 Zyklen (Denaturierung,
30 sec bei 95°C
Annealing, Elongation)
30 sec bei 55°C
4 min bei 72°C (1 min/kb)
3. Abschließende Elongation
10 min bei 72°C
Anschließend wurde das PCR-Produkt gefällt (vgl. Kapitel 3.3.6) und der DNA-Gehalt
mittels photometrischer Messung bestimmt (Biophotometer, Eppendorf, Hamburg).
4.3.2 Homologe Rekombination mit dem Red ®/ET®-System
Danach erfolgte die Homologe Rekombination mit dem Red/ET-System (siehe
Abbildung 16).
Unter Homologer Rekombination versteht man den spezifischen Austausch
genetischer Informationen innerhalb homologer DNA-Regionen. Die Sequenz der
homologen Regionen kann dabei frei ausgewählt werden. (Zangh et al., 2000).
Zur Durchführung der homologen Rekombination wurde das Counter-Selection BAC
Modification Kit (Gene Bridges, Heidelberg) verwendet.
Dieses
Kit
stützt
sich
auf
das
λ-Phagen-basierte
tet
temperatursensitive Red/ET-Plasmid pSC101-BAD-gba
Red/ET-System.
Das
(vgl. Abbildung 14) trägt
dabei zum einen das redγβα-Operon, welches unter der Kontrolle eines mit LArabinose induzierbaren pBAD Promotors steht (Guzman et al., 1995), und vermittelt
zudem auch eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Tetrazyklin. Das redγβαOperon ist ein polycistronisches Operon, welches die Gene red α, β und γ des λPhagen sowie das recA-Gen enthält. Die Expression der λ-Phagen-Proteine (5`3`Exonuklease und DNA Annealing Proteine) des Plasmids ermöglicht die homologe
Rekombination und den Schutz der linearen DNA vor Denaturierung.
Da das ebenfalls auf dem Plasmid codierte RepA-Protein temperatursensibel ist,
müssen die Zellen bei 30°C kultiviert werden, um das Plasmid zu erhalten.
48
Ergebnisse
Tet
Abbildung 14 Plasmidkarte des Red/ET-Plasmids pSC101-BAD-gbaA
(Manual Counter Selection Bac
Modification Kit, Gene Bridges)
Es existierte bereits ein Laborstamm (3AG 100::rpsL-neo x Red/ET-Plasmid, vgl.
Tabelle 3), welcher sowohl das Red/ET-Plasmid als auch die notwendige rpsL-neoKassette im Bereich von AcrB enthielt, die nun gegen das mutagenisierte PCRProdukt getauscht werden sollte. Dies ist nur möglich, da die bei der Mutagenese
verwendeten Oligonukleotide die zur rpsL-neoKassette passenden Homologiearme
besitzen. Die rpsL-neo-Kassette vermittelt eine Neomycin/Kanamycin-Resistenz
(siehe Abbildung 15) sowie eine Streptomycin-Sensitivität. Um den erfolgreichen
Austausch der Kassette nachweisen zu können, müssen die Ausgangsstämme eine
Streptomycin-Resistenz aufweisen. Die Bakterienstämme können nach erfolgtem
Austausch wieder auf streptomycinhaltigen Agarplatten wachsen.
Abbildung 15 Die rpsL-neo Kassette (Manual Counter Selection Bac Modification Kit, Gene Bridges)
Ergebnisse
49
Vor Beginn der Homologen Rekombination musste eine Übernachtkultur des
Stammes hergestellt werden. Dazu wurden 10 Kolonien in 500 ml Tetrazyklin
(Endkonzentration 3 µg/ml) enthaltendes LB-Medium (LBTet3) inokuliert und über
Nacht bei 30°C und 1000 rpm im Schüttler inkubiert.
Die Gegenwart von Tetrazyklin und die Temperatur von 30°C sollten dabei vor dem
Verlust des Red/ET-Plasmids schützen.
Am folgenden Tag wurden jeweils 30 µl der frischen Übernachtkultur in 4 Ansätze mit
1,4 ml LBTet3 gegeben und bei 30°C und 1100 rpm auf dem Schüttler für zwei
Stunden bis zu einer OD600 von 0,2 inkubiert. Anschließend wurde durch Zusatz von
20 µl 10%iger L-Arabinose und einem Temperaturshift auf 37°C die Expression der
auf dem Red/ET-Plasmid kodierten Proteine induziert. Daraufhin wurde der
Reaktionsansatz für eine Stunde bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert.
Im nächsten Schritt erfolgte das Waschen der Zellen als Vorbereitung für die
Elektroporation. Dazu wurden sie bei 1100 rpm und 2°C für 30 sec zentrifugiert und
der Überstand abpipettiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit eiskaltem,
seit dem Vortag gekühlten, Wasser gewaschen, wobei jeweils zwei der Ansätze
gepoolt wurden. Zu 20-30 µl, die vom Überstand belassen wurden, wurde 1 µl des
mutagenisierten PCR-Produktes zugegeben. Nach vorsichtigem Mischen wurde das
Gemisch in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette überführt und bei 1350V
transformiert (vgl. Kapitel 3.3.2). Nach sofortiger Zugabe von jeweils 1 ml LB-Medium
wurden die Tubes 70 min bei 37°C im Schüttler inkubiert. Währenddessen konnte die
homologe Rekombination stattfinden.
Anschließend wurden je 100 µl auf Agarplatten mit Streptomycin (50 µg/ml) bzw.
Linezolid (16 µg/ml) ausplattiert und bei 37°C über Nacht kultiviert.
50
Ergebnisse
Abbildung 16 Mechanismus der Red/ET- Rekombination (Manual Counter Selection Bac Modification Kit,
Gene Bridges)
Bei der Selektion mit Streptomycin gibt es aufgrund der möglichen intermediären
genetischen Situation häufig falsch positive Klone. Daher wurden erhaltene Klone
ebenfalls auf Agarplatten mit Kanamycin getestet, worauf bei stattgefundenem
Austausch kein Wachstum mehr stattfinden durfte, da die Kanamycinresistenz von
der rpsL-neo-Kassette stammte.
Ergebnisse
51
Ein Teil des Ansatzes wurde auch auf Linezolid ausplattiert, das ein gesichertes
Pumpensubstrat darstellt. Die Konzentration wurde so gewählt, dass sie ein bis zwei
Stufen höher lag, als die Empfindlichkeit des Knockout-Stammes (mit rpsL-neoKassette).
Bei Klonen, die auf Linezolid-Platten wuchsen und Klonen von Streptomycinplatten,
die auf Kanamycin kein Wachstum mehr zeigten, wurde weiter getestet, ob
Auffälligkeiten bei den MHK`s verschiedener Antibiotika bestanden.
4.3.3 Ergebnisse
Tabelle 23 zeigt eine Übersicht der für die Mutagenese eingesetzten DNA-Mengen
und die Anzahl der Mutanten, die bei der anschließenden Transformation jeweils
kultiviert werden konnten. Es fällt auf, dass im mittleren Mutationsbereich (546 ng
DNA-Einsatz) etwa die Hälfte der erzeugten Mutanten eine funktionierende Pumpe
besitzt, wohingegen bei Klonen, die durch Mutagenesen mit wenig DNA-Zugabe
hergestellt wurden, nur etwa einer von 30 noch eine funktionsfähige Pumpe aufweist.
Tabelle 23 Übersicht eingesetzter DNA-Mengen und erhaltener Klone
Eingesetzte
Erhaltene
Erfolgreiche
Klone mit
Erfolgreiche
DNA-Menge
Klone pro
Rekombination
fkt. Pumpe
Rekomb. zu
Transformation
Klonen mit fkt.
Pumpe
10 ng
63
9
2
4,5:1
546 ng
107
82
50
1,6:1
4.3.3.1 MHK-Daten
Vier der durch homologe Rekombination erhaltenen Klone, die Auffälligkeiten in der
MHK-Testung zeigten, werden in Tabelle 24 exemplarisch im Vergleich mit dem
Pumpen-Knockout-Stamm 3AG100 aufgeführt. Alle vier Klone stammen aus
Mutagenesen mit 546 ng DNA-Einsatz. Signifikante MHK-Änderungen von ≥4fach
relativ zu 3AG100 werden fett gedruckt hervorgehoben. Eine 8-fache Reduktion der
MHK ist die größte Veränderung, die festgestellt werden konnte. Bei HR2 wurde die
52
Ergebnisse
MHK von Novobiocin um das 8-fache reduziert, bei IR22 Levofloxacin und bei JR25
Levofloxacin und Azithromycin (vgl. Abbildung 17 )
Insgesamt fällt auf, dass die MHKs für Antibiotika der Gruppe Fluorchinolone am
häufigsten verändert sind. So findet sich eine Reduktion der MHK bei Levofloxacin
und Novobiocin bei allen vier Mutanten und bei Moxifloxacin und Ciprofloxacin bei
drei der vier Klone. Ebenfalls recht häufig sind Veränderungen der MHK-Werte der
Makrolide Clarithromycin, Erythromycin und Azithromycin.
Abbildung 17 MHK-Reduktion der Stämme HR2, HR4, IR33 und JR25 im Vergleich zu 3AG100
Ergebnisse
53
Tabelle 24 Vergleich der MHK-Werte der erhaltenen Mutanten mit dem Pumpen-Knockout-Stamm 3AG100.
Alle Konzentrationen sind in µg/ml angegeben.
Substanzen
Stämme
3AG100
HR2
HR4
IR33
JR25
2
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0,125
0,125
0,063
0,125
Tetracyclin
4
32
2
1
32
Tet + 100 NMP
1
8
0,5
1
1
Chloramphenicol
8
8
8
2
6
Cha + 100 NMP
2
1
1
1
1
Rifampicin
16
16
8
16
16
Rifa + 100 NMP
8
4
4
4
4
Oxacillin
512
64
256
96
128
Oxa + 100 NMP
64
16
16
32
32
Clindamycin
512
256
256
512
256
Clinda + 100 NMP
64
1024
256
256
512
Levofloxacin
Levo + 100 NMP
Linezolid
1024
Lizo + 100 NMP
32
Clarithromycin
256
64
128
256
64
Clari + 100 NMP
128
64
64
64
64
Erythromycin
1024
256
512
1024
256
Ery + 100 NMP
512
Azithromycin
64
16
16
64
8
Azi + 100 NMP
16
128
256
256
256
0,5
0,5
0,5
0,5
0,25
0,5
0,25
0,25
2
1
1
2
Novobiocin
1024
Novo + 100 NMP
128
Moxifloxacin
Moxi + 100 NMP
Ciprofloxacin
Cipro + 100 NMP
Minocyclin
Mino + 100 NMP
2
0,38
1
0,25
4
0,5
54
Ergebnisse
4.3.3.2 Sequenzierte Klone
AcrB der vier beschriebenen Mutanten, HR2, HR4, IR33 und JR25 wurde
sequenziert und ausgewertet. Die Darstellung erfolgt wie in Kapitel 4.2.2.2
beschrieben.
Die
Klone
zeigen
im
Schnitt
zwei
bis
vier
Mutationen,
die
einen
Aminosäurenaustausch zur Folge haben. Weitere Mutationen, die keine Auswirkung
auf die Aminosäurenfolge haben, werden als stille Mutationen bezeichnet.
Tabelle 25 Übersicht der sequenzierten Klone und deren Mutationen
Klon
AS-Position
DNA-Ausschnitt
Art der Mutation
HR2
297
atc gca gag
atc aca gag
Austausch von Alanin gegen
HR2
753
gct gca tgg
gct gaa tgg
Austausch von Alanin gegen
HR4
170
HR4
186
HR4
395
HR4
780
HR4
894
IR33
545
IR33
559
IR33
608
IR33
639
IR33
768
acg tcg ggc
acg tca ggc
cgt atc tgg
cgt gtc tgg
Threonin
Glutaminsäure
stille Mutation
Austausch von Isoleucin gegen Valin
aca atg ttc
Austausch von Methionin gegen
aca acg ttc
Threonin
tac cgt atg
tac cgc atg
gag agc tgg
gag agt tgg
ctg tat ctg
ctg tac ctg
stille Mutation
stille Mutation
stille Mutation
ctg ctg cca
Austausch von Leucin gegen
ctg cag cca
Glutamin
gag tcg gtg
gag ccg gtg
ccg ggc gaa
ccg agc gaa
cgt gtg aag
cgt gta aag
Austausch von Serin gegen Prolin
Austausch von Glycin gegen Serin
stille Mutation
Ergebnisse
55
Fortsetzung Tabelle 25
Klon
AS-Position
IR33
794
JR25
252
JR25
418
JR25
492
JR25
560
JR25
713
JR25
743
JR25
834
DNA-Ausschnitt
gct gct gat
gct cct gat
Art der Mutation
Austausch von Alanin gegen Prolin
ctg aaa gtg
Austausch von Lysin gegen
ctg gaa gtg
Glutaminsäure
gag cgt gtt
Austausch von Arginin gegen
gag tgt gtt
Cystein
gct ctt tgt
gct cat tgt
ctg cca agc
ctg ccg agc
atg ttg acc
atg tta acc
tct atc aac
tct att acc
ccg ggt aaa
ccg cgt aaa
Austausch von Leucin gegen Histidin
stille Mutation
stille Mutation
stille Mutation
Austausch von Glycin gegen Arginin
4.3.4 Mutationsspektrum von Mutazym II
Da beide Error-Prone-PCR-Mutagenese-Methoden mit Hilfe der MutazymeII-DNAPolymerase durchgeführt wurden, wird das erhaltene Mutationsspektrum beider
Methoden zusammen aufgeführt. Nach Auswertung aller sequenzierten Klone ergab
sich ein Verhältnis von 52% Transitionen zu 48% Transversionen und somit eine
Ts/Tv Ratio von 1,1. Austausche von AN und TN gab es zu 57% und von G N
und C  N zu 43%.
56
Diskussion
5 Diskussion
Das Problem der bakteriellen Antibiotikaresistenz, beispielsweise durch Efflux, stellt
in der Klinik ein zunehmendes Problem dar. Um diese Schwierigkeit zu beheben,
besteht die theoretische Möglichkeit der Erforschung und Entwicklung kliniktauglicher
Effluxpumpeninhibitoren, mit deren Hilfe die Wirkung verschiedener Antibiotika
verstärkt werden könnte. Allerdings ist noch sehr wenig über Wirkungsweisen und
Angriffspunkte von Effluxpumpeninhibitoren bekannt. Aus diesem Grund wurden im
Rahmen dieser Arbeit drei Mutagenese-Methoden für die Erstellung einer AcrBMutanten-Bibliothek getestet, die als Grundlage für ein Screening der Klone im
Hinblick auf veränderte Antibiotikaresistenz dienen soll. Die Untersuchung dieser
Phänotypveränderungen, die aufgrund von Mutationen in AcrB entstanden sind, soll
Aufschluss über die mögliche Interaktion von AcrB und Effluxpumpeninhibitoren
geben.
5.1 XL1-Red -Mutatorstamm
5.1.1 Erzieltes Ergebnis
Für die Mutagenese mit XL1-Red-Zellen, musste das Zielgen (AcrB) auf Plasmid
kloniert vorliegen und wurde durch Transformation in den XL1-Red-Mutatorstamm,
der defekte DNA-Reparatursysteme besitzt, mutagenen Bedingungen ausgesetzt.
Anschließend wurde das mutagenisierte Plasmid isoliert, in einen Knockout-Stamm
transformiert und auf Selektionsmedien ausplattiert. Das angestrebte Ziel, Klone mit
Mutationen in AcrB zu erhalten, die zu einem veränderten Phänotyp bezüglich der
Antibiotikaresistenz führen, konnte im Rahmen dieser Methode nicht erreicht werden.
In den durchgeführten Versuchen konnte kein Klon erzeugt werden, bei dem durch
Sequenzanalyse eine Mutation in AcrB festgestellt werden konnte. Obwohl
beispielsweise die Klone Mino 1 und Mino 2 deutliche Veränderungen in ihrem
Resistenzverhalten zeigten, war keine Mutation in AcrB zu finden. Eine Erklärung für
die gesteigerte Antibiotikaresistenz der Klone könnte in
einer
eventuellen
Hochregulierung der AcrB-Expression und/oder einer Erhöhung der Kopienzahl des
Plasmides liegen (Nikaido, 2009). Durch diese Mechanismen steht den Klonen eine
höhere Anzahl von Effluxpumpen zur Verfügung, wodurch sie dem Selektionsdruck
höherer Antibiotikakonzentrationen standhalten können.
Diskussion
57
Andere Arbeiten, die Random-Mutagenese mit dem XL1-Red-Mutatorstamm
beschreiben, erzielten bessere Ergebnisse. So konnten Mutanten mit drei
unabhängigen Mutationen im Bereich des pro B Gens von Listeria monocytogenes
hergestellt werden, was zu einer Überproduktion von Prolin führte (Sleator et al.,
2001).
Ebenso wurden durch Mutagenese mit XL1-Red Erfolge bei der Modifikation der
Beta-Glucuronidase-Aktivität von Lactobacillus gasseri erzielt. So zeigt das BetaGlucuronidasegen gusA maximale Aktivität bei pH5 und nur limitierte Aktivität im pHBereich von 6-7. Durch die Mutagenese konnte gusA3 erzeugt werden, das auch in
neutralen pH-Bereichen eine deutlich gesteigerte Aktivität aufweist. Durch die
Sequenzanalyse
konnte
bewiesen
werden,
dass
ein
Singlebasenaustausch
stattgefunden hatte (Callan et al., 2007).
5.1.2 Handhabbarkeit und Effizienz
Bei der Mutagenese mit XL1-Red-Zellen handelt es sich um eine einfach und schnell
durchzuführende Methode, die aus diesem Grund als erste Methode getestet wurde.
Mithilfe der durchgeführten Effizienzkontrolle konnte gezeigt werden, dass pro
Transformation mutagenisierter Plasmide (ca. 80 ng) in den Knockout-Stamm,
theoretisch ca. 106 Klone erhalten werden könnten. Dieses Ergebnis wäre prinzipiell
zufriedenstellend. Da aber auf den Selektionsmedien oft keine oder nur sehr wenige
Klone zu finden waren, müsste der Versuch sehr häufig durchgeführt werden, um
eventuell gewünschte Klone zu erhalten. Diese Methode ist somit durch einen
enormen Arbeits- und Zeitaufwand gekennzeichnet, wenn das Ziel, Klone mit
veränderter Antibiotikaresistenz zu erhalten, erreicht werden soll.
Der Hauptnachteil dieser Methode liegt in der geringen Mutationsrate und deren
schlechten Regulationsmöglichkeiten. Nach der Literatur soll pro 2000 Nukleotide
eine Mutation entstehen (Greener et al., 1997). Das AcrB-Gen liegt mit einer Länge
von 3,1 kb zwar über der Mindestlänge für eine Mutation, jedoch konnte wie in
Kapitel 5.1.1 erwähnt kein Klon mit Mutationen gefunden werden. Durch eine
Verlängerung der Kultivierungszeit, in der sich AcrB im Mutatorstamm XL1-Red
befindet, kann die Mutationsrate leicht gesteigert werden (Greener et al., 1997). Mit
dieser Anpassung kann die Mutationsrate jedoch nur sehr ungenau beeinflusst
werden.
58
Das
Diskussion
vorliegende Ergebnis
der geringen
Mutationsrate mit
dem
XL1-Red-
Mutatorstamm, wurde von Rasilia et al. bestätigt. Die Arbeitsgruppe erzielte nur 0 bis
1 Mutation pro 500 bp, obwohl der Verbleib des Plasmides im Mutatorstamm bis zu
10-mal wiederholt wurde. Daraus kann geschlossen werden, dass der XL1-RedMutatorstamm geeigneter ist, wenn sehr niedrige Mutationsraten gewünscht sind und
es sich eventuell um ein langes Ziel-DNA-Segment handelt (Rasilia et al., 2009).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die Methode der Mutagenese mithilfe
des Mutatorstammes XL1-Red zwar durch eine einfache und schnelle Handhabung
auszeichnet, die Mutationsrate allerdings für die Herstellung einer Klonbibliothek viel
zu gering ausfällt, da bei keinem sequenzierten Klon eine Mutation in AcrB gefunden
werden konnte. Ein Problem der Selektion besteht darin, dass auch Klone ohne
Mutation in AcrB eine gesteigerte Antibiotikaresistenz aufweisen konnten, was, wie
beschrieben, durch die Hochregulierung der AcrB-Expression bedingt sein könnte.
Somit ist diese Mutagenese-Methode für die praktikable Generierung einer
Mutantenbibliothek als ungeeignet anzusehen.
5.2 GeneMorphII EZClone
5.2.1 Erzieltes Ergebnis
Die GeneMorphII EZClone Methode wurde angewandt, da im Vergleich zur XL1-RedMethode mit einer deutlich höheren Mutationsrate zu rechnen war und diese
außerdem sehr gut reguliert werden kann. AcrB wurde durch Error-Prone-PCR mit
Hilfe der DNA Polymerase Mutazyme II mutagenisiert und die Produkte anschließend
als Megaprimer zu Plasmidsynthese verwendet. Dieses Plasmid mit mutagenisiertem
AcrB konnte daraufhin in einen Knockout-Stamm transformiert werden. In darauf
folgenden
Resistenztestungen
wurde
überprüft,
ob
die
Mutagenese
zu
Veränderungen im Phänotyp geführt hatte.
Im Rahmen dieser Methode entstanden Klone mit veränderter Antibiotikaresistenz.
Durch Sequenzierung konnten Mutationen in pAcrB nachgewiesen werden.
5.2.2 Handhabbarkeit und Effizienz
Es wurden zwei unterschiedliche Versionen der GeneMorphII EZClone Methode
durchgeführt; in Bezug auf Effizienz und Handhabbarkeit werden sie getrennt
voneinander beurteilt.
Diskussion
59
Die von Stratagene vorgegebene, ursprüngliche Methode sieht vor, dass das
mutierte pAcrB zuerst per Hitzeschock in XL10-Gold-Zellen transformiert und nach
24 h Kultivierungszeit wieder isoliert wird, um dann in einen für die ScreeningZwecke geeigneten Stamm transformiert werden zu können. In diesem Fall handelt
es sich um einen AcrB-Knockoutstamm. Die Mutanten werden anschließend auf
verschiedenen Selektionsplatten auf verbesserten Efflux gescreent. Hier zeigte sich
ebenfalls das Problem, dass Klone möglicherweise durch eine Hochregulierung der
AcrB-Expression
resistenter
erschienen.
So
hatten
Klone,
die
auf
einem
Selektionsmedium gewachsen waren bei anschließenden MHK-Testungen ihre
scheinbare Resistenz wieder verloren.
Da bei dieser Variante zwei Transformationsschritte notwendig sind, ist sie etwas
zeitaufwändiger.
Bei der modifizierten Version wird pAcrB nach der Mutagenese durch Elektroporation
direkt in den Knockout-Stamm KAM32 transformiert und auf LB Amp100-Platten
ausplattiert, worauf
auch Klone mit funktionsloser oder vermindert aktiver
Effluxpumpe wachsen können. Die erhaltenen Klone werden durch MHK`s auf ihre
Resistenzeigenschaften getestet. Die Möglichkeit auch Klone mit verringerten
Resistenzeigenschaften auf Mutationen zu untersuchen, kann ebenfalls Erkenntnisse
über Substratbindestellen für Antibiotika oder Effluxpumpeninhibitoren bieten. Somit
erweitern sich die Untersuchungen, die mit der angestrebten Klonbibliothek
durchgeführt werden können. Diese Variation betrifft allerdings die Selektion und
hätte auch bei der Methode mit dem XL1-Red-Mutatorstamm durchgeführt werden
können.
Durch das Auslassen der Transformation in XL10-Gold-Zellen kann die Dauer der
Durchführung um mindestens einen Tag verkürzt werden. Außerdem war die
Transformationseffizienz in die XL10-Gold-Zellen nicht zufriedenstellend. Dadurch
wurden bei der ursprünglichen Version der Methode wesentlich weniger Klone
erhalten, die hinsichtlich ihrer Resistenzeigenschaften getestet werden konnten.
Ein weiterer Punkt, der das Ergebnis der Methode beeinflusst, ist die Menge der ZielDNA, die als Template für die Mutagenese eingesetzt wird. Die Mutationsrate kann
durch Veränderung der initialen DNA-Menge oder Variation der Amplifikationszyklen
kontrolliert werden (Cline et al., 2000; Stratagene, 2007). Es wurden 4 ng, 10 ng und
522 ng eingesetzt. Bei 4 ng und 10 ng liegt die erwartete Mutationsrate bei 9-16
60
Diskussion
Mutationen/kb und bei 522 ng im unteren Mutationsbereich bei 0-4,5 Mutationen/kb
Ziel-DNA. Bei der Mutagenese mit 4 ng DNA-Einsatz konnten 25 Klone kultiviert
werden, wovon jedoch nur ein Klon noch eine funktionsfähige Pumpe besaß. Dies
deutet darauf hin, dass die Mutationsrate eventuell zu hoch und AcrB aufgrund zu
vieler Mutationen defekt war. Der einzige erhaltene Klon mit funktionierendem Efflux
(H7) wurde sequenziert, das Ergebnis zeigte 16 Mutationen in AcrB. Die Mutagenese
mit 10 ng Ziel-DNA-Einsatz erbrachte 17 Mutanten, von
denen noch 6
effluxkompetent waren (Verhältnis 3:1). Davon wurde exemplarisch ein Klon
sequenziert (E2), der 12 Mutationen in AcrB aufwies. Bei der Mutagenese im
niedrigen Mutationsbereich (522 ng DNA-Einsatz) konnten 522 Mutanten erzielt
werden, von denen 62 zum Efflux fähig waren. Aus dieser Mutagenese wurde im
Rahmen dieser Arbeit kein Klon sequenziert.
Wie in der Literatur beschrieben, sollte, um Struktur-Funktions-Beziehungen
aufzuklären, der Austausch einer Aminosäure pro Gen angestrebt werden (Vartarian
et
al.,
1999).
Für
Directed-Evolution-Experimente
werden
gewöhnlich
1-4
Aminosäuren pro Gen ausgetauscht (Wan et al., 1998; Cherry et al., 1999). Dies
spricht dafür, dass eine niedrige bis mittlere Mutationsrate (wie z.B. mit 522 ng DNAEinsatz) angesteuert werden sollte. Die Mutagenesen mit 4 ng und 10 ng DNAEinsatz liegen mit 16 bzw. 12 Mutationen in AcrB deutlich zu hoch.
Die Arbeitsgruppe um Ee Lui Ang erzielten mit einem DNA-Einsatz von 700 ng einen
Austausch von ~2,7 Nukleotiden pro Gen (1,3 kb) (Ang et al., 2008), bei dem
Versuch die Aktivität der Anilin Oxygenase aus Acinetobacter sp. zu verbessern. Wie
sich bei niedrigem DNA-Einsatz (4 ng) zeigte, besteht bei hohen Mutationsraten die
Gefahr, dass AcrB aufgrund zu vieler Mutationen nicht mehr funktionsfähig ist. Auch
kann eine gegenseitige Beeinflussung mehrerer vorhandener Mutationen nicht
ausgeschlossen werden.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Methode prinzipiell eine gute
Möglichkeit darstellt, um die angestrebte Mutanten-Bibliothek zu erstellen, allerdings
sollte die Effizienz noch deutlich gesteigert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte
nur eine kleine Anzahl von Versuchen durchgeführt werden. Eine optimale
Einstellung der Mutationsrate könnte die erhaltene Anzahl von Klonen
Wahrscheinlichkeit,
Klone
mit
interessantem
Phänotyp
in
und die
Bezug
auf
Antibiotikaresistenz und Effluxpumpen-Inhibitor-Resistenz zu erhalten, noch deutlich
Diskussion
61
steigern. Allerdings besteht das Problem der erhöhten AcrB-Expression durch
Erhöhung der Plasmid-Kopien-Anzahl.
5.3 GeneMorph II Random Mutagenesis in Kombination mit
Red®/ET®-Rekombination
5.3.1 Erzieltes Ergebnis
Im Rahmen dieser Methode wurde AcrB ebenfalls mithilfe der DNA-Polymerase
Mutazyme II durch Error-Prone PCR mutagenisiert. Anschließend wurde das
mutagenisierte AcrB-Produkt durch Homologe Rekombination ins Genom eines
AcrB-Knockout-Stammes eingebracht. Durch darauf folgendes Ausplattieren auf
Selektionsmedien konnte überprüft werden, ob die Homologe Rekombination
stattgefunden hatte. Die Klone mit erfolgreicher Rekombination wurden anschließend
mit MHK`s auf ihre Resistenzeigenschaften getestet. Diese Methode wurde
ausgewählt, da die Mutationsrate gut regulierbar ist und sich das mutierte AcrB im
Genom, statt auf Plasmid befindet. Dadurch wird verhindert, dass es zu einer
Veränderung des Phänotyps kommt, die alleine durch Erhöhung der Plasmid-KopienAnzahl und nicht durch Mutationen in AcrB bedingt ist.
Das Ziel, Klone mit verändertem Phänotyp durch Mutationen in AcrB zu erhalten,
wurde mit dieser Methode ebenfalls erreicht.
5.3.2 Effizienz und Handhabbarkeit
Im Verlauf dieser Versuche wurden Mutagenesen mit ähnlichem DNA-Einsatz (10 ng
und 546 ng) wie bei der vorigen Methode durchgeführt. Bei der Mutagenese mit
niedrigem DNA-Einsatz wurden deutlich weniger Klone erzielt, als bei höherem DNAEinsatz. Die Rate an erfolgreichen Homologen Rekombinationen war bei niedrigem
DNA-Einsatz
ebenfalls
wesentlich
schlechter.
Dies
bestätigt,
dass
hohe
Mutationsraten die Homologe Rekombination in negativer Weise beeinflussen. Das
schlechtere Verhältnis von erfolgreichen Rekombinationen zu funktionierenden
Pumpen bei 10 ng DNA-Einsatz dürfte durch die höhere Mutationsrate bedingt sein,
da durch viele Mutationen die Gefahr steigt, dass die Funktion von AcrB
beeinträchtigt wird.
62
Diskussion
AcrB von vier Mutanten aus einer Mutagenese mit 546 ng DNA-Einsatz wurde
sequenziert und auf Mutationen untersucht. Dabei wurden zwei bis sieben
Mutationen pro Klon entdeckt. Auffällig war, dass bei allen vier Klonen (HR2, HR4,
IR33, JR25) eine veränderte Empfindlichkeit im Bereich der Chinolone zu finden war.
Die Mutanten HR2 und JR25 zeigten eine verstärkte Sensibilität gegenüber den
Makroliden Clarithromycin, Erythromycin und Azithromycin. In der Publikation von
Tikhonova et al. wird angenommen, dass der Aminosäurenbereich zwischen 612 und
849 in AcrB für das Substratbindungsverhalten von Makroliden von Bedeutung sein
könnte (Tikhonova et al., 2002). Bei HR2 und JR25 konnte innerhalb dieses
Abschnittes ebenfalls je eine Mutation gefunden werden. HR2 zeigt an Position 753
einen Austausch von Alanin gegen Glutaminsäure und JR25 an Position 834 einen
Austausch von Glycin gegen Arginin.
Die Kombination von Error-Prone-PCR mit Red/ET-Rekombination zur Generierung
von Mutanten mit verändertem Phänotyp wurde auch schon von einer anderen
Arbeitsgruppe erfolgreich eingesetzt. De Lay und Cronan ist es erstmals gelungen,
drei temperatursensitive Mutanten durch Mutationen im Acyl Carrier Protein der
Fettsäuresynthese zu isolieren (De Lay und Cronan, 2005).
Diese Methode zeigt sich als gut geeignet zur Erstellung der gewünschten
Klonbibliothek. Eine unerwünschte Hochregulierung der AcrB-Expression durch eine
erhöhte Plasmid-Kopienzahl kann vermieden werden, da sich AcrB im Genom
befindet. Die Mutationsrate lässt sich, mit zwei bis sieben Mutationen pro AcrB, in
den gewünschten Bereich steuern. Um schnell eine umfassende Mutantenbibliothek
erstellen zu können, muss die Effizienz der Methode allerdings noch deutlich
gesteigert
werden.
Durch
eine
weitere
Optimierung
könnten
pro
Rekombinationsrunde wesentlich mehr Klone erzeugt werden.
5.4 Mutationsspektrum von Mutazym II
Wie auch schon im Ergebnisteil wird das Mutationsspektrum der beiden Error-PronePCR-Methoden mit der Mutazyme II DNA Polymerase gemeinsam betrachtet. Mit
53% Transitionen und 46% Transversionen handelt es sich um ein relativ
ausgeglichenes Mutationsspektrum. Die Transitionen sind mit A:T  G:C 23% und
G:C A:T 30% in sich ebenfalls ausgeglichen, wohingegen im Fall der
Transversionen A:T  T:A Austausche mit 34% deutlich überwiegen (A:T C:G 2%,
Diskussion
63
G:C  T:A 6%, G:C C:G 4%). Dieses Ergebnis liegt allerdings im Rahmen des von
Stratagene beschriebenen Mutationsspektrums (Stratagene, 2007). Auch Wang et al.
beschreibt beim Einsatz von Mutazyme II, mit der GeneMorphII EZClone Methode
zur Veränderung der Substratspezifität von Mandelamid-Hydrolase, ein sehr
ausgewogenes Verhältnis zwischen Transversionen und Transitionen (Wang et
al.2009).
Laut Wong et al. sind die wichtigsten Kriterien für Random-Mutagenese-Methoden
ausgeglichene Mutationsspektren und kontrollierbare Mutationsraten (Wong et al.,
2007) – somit
sind die wichtigsten Vorgaben für optimale Random-Mutagenese
Methoden erfüllt.
5.5 Kostenvergleich
Zur Entscheidung über die praktikabelste Methode, sollten auch die Kostenpunkte,
die durch den Erwerb der verschiedenen Kits entstehen, miteinbezogen werden.
Desweiteren muss beachtet werden, wie viele Mutagenesen mit den erworbenen Kits
durchgeführt werden und wie viele Klone damit erzeugt werden können.
Aufgrund der sehr niedrigen Mutationsrate der XL1-Red Competent Cells ist es kaum
möglich, genügend Klone zu erhalten bzw. müssten dafür extrem viel Mutagenesen
durchgeführt
werden.
Die
damit
verbundenen
erhöhten
Kosten
sprechen
gleichermaßen gegen diese Methode. Die Mutationsraten der GeneMorphII EZCloneund der GeneMorphII Random Mutagenese-Methode sind auf die gleiche Weise
steuerbar, das GeneMorphII Random Mutagenesis Kit zeigt allerdings ein besseres
Verhältnis von Preis zu durchführbaren Mutagenesen.
Schlussfolgernd erweist sich die GeneMorphII Random Mutagenesis in Kombination
mit Red/ET-Rekombination als die kostengünstigste Variante.
5.6 Weitere mögliche Methoden
Eine andere Methode, die zur Random-Mutagenese verwendet werden kann, stellt
die chemische Mutagenese dar, die durch DNA-modifizierende Reagenzien direkt
Mutationen
induziert.
Für
In-Vitro
Mutagenesen
kann
beispielsweise
Hydroxylaminhydrochlorid (NH2OH-HCL) verwendet werden (Kaur und Sharma,
2006). Die Zahl der generierten Mutationen wird durch die Expositionszeit gesteuert,
64
Diskussion
liegt aber in einem sehr niedrigen Bereich und ist daher am besten geeignet, wenn
einzelne Aminosäuren ausgetauscht werden sollen. Außerdem zeigt sich im
Mutationsspektrum eine Häufung von Transitionen (G:C A:T) (Rasila et al., 2009).
Somit ist diese Form der Mutagenese nicht optimal für unsere Zwecke geeignet, da
die Mutationsrate zu niedrig und das Mutationsspektrum sehr unausgeglichen ist.
Error-Prone-PCR mit der Taq-DNA-Polymerase ist eine weitere MutageneseVariante, die häufig angewendet wird. Hier kann die Mutageneserate durch
verschiedene Variablen beeinflusst werden, wie ungleiche Nukleotidkonzentrationen,
Zugabe von MnCl2 zum Puffer (Cadwell und Joyce, 1992) und Einführen von
Nukleotidanaloga (8-oxodGTP, dPTP) in die Reaktion (Zaccolo et al., 1999). Bei
dieser Methode ist die Rate von zu erwartenden Mutationen sehr hoch. Je nach
Einsatz der Mutageneserate-bestimmenden Variablen können bis zu 80 Mutationen
pro 1000 bp erreicht werden (Rasila et al., 2009). Das erreichte Mutationsspektrum
variiert. Beim Einsatz von Nukleotidanaloga dominieren eindeutig Transitionen mit
93% (hauptsächlich A:T G:C), ansonsten überwiegen Transitionen immer noch mit
60% (Rasila et al., 2009). Aufgrund des einseitigen Mutationsspektrums ist auch
diese Methode nicht optimal geeignet.
5.7 Zusammenfassung
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass beide Mutagenese-Methoden, die auf
Error-prone-PCR mit Mutazyme II basieren, eine Möglichkeiten darstellen, die
gewünschte
AcrB-Mutantenbibliothek
zum
Screening
auf
veränderte
Effluxpumpeninhibitorempfindlichkeit zu generieren. Durch die Möglichkeit, die
Mutationsrate durch unterschiedliche Mengen an Template-Einsätzen zu steuern und
das recht ausgeglichene Mutationsspektrum, sind die wichtigsten Kriterien für
Random-Mutagenese-Methoden erfüllt. Allerdings zeigt die GeneMorph II Random
Mutagenese in Kombination mit Homologer Rekombination den Vorteil, dass sich
AcrB im Genom und nicht im Plasmid befindet. So ist es ausgeschlossen, dass
scheinbare Resistenzen durch Erhöhung der Kopienzahl des Plasmids entstehen.
Bei beiden Methoden müssten die erreichte Effizienz
Mutationsrate optimiert werden.
verbessert und die
Diskussion
65
Der XL1-Red-Mutatorstamm zeigt sich als nicht geeignet, da im Rahmen dieser
Arbeit keine Mutationen erzeugt werden konnten und die Mutationsrate somit
eindeutig zu niedrig ist.
Da sich auch die weiteren beschriebenen Methoden (chemische Mutagenese und
Error-prone-PCR mit Taq-Polymerase) nicht als besser geeignet darstellen, ist das
Fazit zu ziehen, dass die Mutazyme II-Methode in Kombination mit Homologer
Rekombination favorisiert werden sollte.
5.8 Ausblick
Um die Wirkungsweise von Effluxpumpeninhibitoren mit Hilfe der getesteten ErrorProne-Mutagenese-Methoden zu erforschen, sollte die Effizienz der Methoden noch
gesteigert werden, da die Klonbibliothek möglichst umfangreich sein sollte. Diese
muss möglichst einfach auf Klone mit verändertem Phänotyp gescreent werden
können. Um gleichzeitig das Resistenzverhalten vieler Klone zu testen, könnten
beispielsweise mehrere Klone gleichzeitig mit Hilfe eines Bakterienstempels auf
Agarplatten
mit
verschiedenen
Antibiotika
in
Kombination
mit
Effluxpumpeninhibitoren übertragen werden.
Des Weiteren muss überlegt werden, ob die Bibliothek nur Klone mit Antibiotika- oder
Effluxpumpeninhibitorresistenz
beinhalten
soll
oder
ob
auch
Mutanten
mit
vermindertem Resistenzverhalten untersucht werden sollen. Sind nur resistente
Klone erwünscht, kann der Versuchsansatz direkt auf Selektionsmedien ausplattiert
werden. Sollen auch Mutationen untersucht werden, die eine verstärkte Sensibilität
bewirken, muss der Mutageneseansatz auf einem Medium ausplattiert werden, auf
dem alle Klone wachsen können. Anschließend muss das Resistenzverhalten der
Klone getestet werden. Sicher stellt auch die Erforschung von Mutationen, die einen
sensibleren
Phänotyp
bewirken,
eine
Möglichkeit
dar,
Hinweise
auf
die
Wirkungsweise der Effluxpumpeninhibitoren zu erlangen. Genauso könnte mit Hilfe
der Klonbibliothek die Substratbindetasche von AcrB für Antibiotika näher untersucht
werden.
Häufungen von Mutationen in bestimmten AcrB-Bereichen bei mehreren Mutanten
mit ähnlichem Phänotyp könnten Hinweise auf mögliche Bindestellen liefern. Da die
Mutanten meist mehrere Mutationen aufweisen, müssten diese einzeln in das Genom
66
Diskussion
eines AcrAB-Wildtypes eingeführt werden, um ihre alleinige Auswirkung zu
überprüfen.
Eine Limitation der Methode liegt darin, dass nur AcrB nicht aber AcrA und TolC
untersucht werden, die möglicherweise aber auch wichtige Angriffspunkte für EPIs
besitzen könnten. So muss in Zukunft die Untersuchung eventuell auf TolC und AcrA
erweitert werden.
Zusammenfassung
67
6 Zusammenfassung
Die
zunehmende
Resistenz
von
Bakterien
gegenüber
verschiedener
Antibiotikaklassen ist in der Klinik zunehmend als ernstes Problem zu werten. Eine
wichtige Rolle bei der Resistenzbildung spielt der aktive Transport aus der Zelle, der
sogenannte Efflux. Aus diesem Grund ist AcrAB-TolC, eine Multidrug Resistance
(MDR)-Effluxpumpe, Forschungsgegenstand vorliegender Arbeit. Aufgrund fehlender
Neuentwicklungen
von
wirksamen
Antibiotika
stellt
die
Suche
nach
Effluxpumpeninhibitoren ein interessantes und aktuelles Untersuchungsgebiet dar.
Mit Hilfe einer AcrB-Mutantenbibliothek, die als Basis für ein Screening auf
Effluxpumpen-Inhibitor-Resistenz
dient,
sollen
die
Grundlagen
der
Effluxpumpenhemmung erforscht werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei Mutagenesemethoden, zur Herstellung einer
Klonbibliothek, getestet. Bei der ersten, sehr einfach durchzuführenden Methode
(XL1-Red Competent Cells), wurde der Mutatorstamm XL1-Red zur Mutagenese von
AcrB in Plasmid verwendet. Da die Mutationsrate dieser Methode jedoch eindeutig
zu niedrig war, konnten keine Klone mit Mutationen in AcrB nachgewiesen werden.
Trotzdem zeigten einige Klone eine scheinbare Resistenz. Dieses Phänomen beruht
eventuell auf einer Erhöhung der Plasmidzahl und einer somit gesteigerten
Effluxaktivität.
Die GeneMorphII EZClone Mutagenese empfiehlt sich durch eine gut steuerbare
Mutationsrate und beruht auf dem Prinzip der Error-Prone-PCR, bei der AcrB mit
Hilfe der DNA Polymerase Mutazyme II mutagenisiert wurde. Mutagenisiertes AcrB
wurde als Megaprimer zur Plasmidsynthese verwendet. Klone mit verändertem
Phänotyp und Mutationen in AcrB wurden erzeugt. Allerdings zeigte sich auch bei
dieser Methode, dass einige Mutanten, möglicherweise durch Erhöhung der PlasmidKopienzahl, eine verstärkte Resistenz aufwiesen.
Im Rahmen der GeneMorphII Random Mutagenese in Kombination mit Homologer
Rekombination wurde AcrB ebenfalls mittels Mutazyme II Polymerase mutagenisiert.
Die Mutagenese-Produkte wurden durch Homologe Rekombination ins Genom
eingebracht, wodurch eine Steigerung der Effluxaktivität durch Erhöhung der
Plasmidzahl verhindert wird. Mutationsrate und –spektrum zeigten sich wie
erwünscht. Somit ist diese Methode am besten geeignet zur Herstellung einer AcrBMutanten-Bibliothek.
68
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12, S. 1314–1317..
Danksagung
73
8 Danksagung
Ich möchte mich herzlich bei allen bedanken, die mir die Fertigstellung meiner Arbeit
ermöglicht und mich dabei unterstützt haben.
Meinem Doktorvater Prof. Winfried Kern danke ich für die Überlassung des
interessanten Themas, sowie die gute Betreuung und die hilfreichen Tipps beim
Schreiben.
Herrn Prof. Reinhard Berner danke ich für die freundliche Übernahme des
Zweitgutachtens.
Ganz herzlich bedanken möchte ich mich bei dem Laborteam und der gesamten
Arbeitsgruppe für die freundliche Aufnahme und die gute Atmosphäre, bei der das
Arbeiten im Labor immer Spaß gemacht hat.
Bei Eva Fähnrich möchte ich mich besonders für die nette und ausführliche
Einarbeitung zu Beginn meiner Laborzeit bedanken.
Mein herzlichster Dank geht an Sabine Schuster für die sehr gute Betreuung meiner
Arbeit, sowohl wärend der experimentellen Phase, als auch beim Schreiben. Ohne
ihre Hilfe wäre die Fertigstellung dieser Arbeit nicht möglich gewesen.
Darüber hinaus danke ich meiner Freundin Uli für das Korrekturlesen meiner Arbeit
und ihre vielen hilfreichen Vorschläge.
Meinen Eltern danke ich für ihre nichtendende Unterstützung und Hilfe bei allen
Problemen und ihren Glauben an mich.
Nicht zuletzt danke ich meinem Freund Markus für seine Hilfe bei allen
„Computerschwierigkeiten“ und seine moralische Unterstützung in Zeiten von
Motivationstiefs.
74
Lebenslauf
9 Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name:
Christine Biegert
Geburtsdatum:
3.10.1980
Geburtsort:
Lahr
Ausbildung:
Schule:
1987-1991
Ludwig-Frank Grundschule, Schwanau
1991-2000
Scheffelgymnasium, Lahr
2000
Abitur
Ausbildung:
2001-2004
Ausbildung zur MTA, Karlsruhe
Studium:
2004-2006
Medizinstudium an der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg, vorklinischer Studienabschnitt
09/2006
Abschluss des vorklinischen Studienabschnitts mit der
Ärztlichen Vorprüfung/Physikum
2006-2010
Medizinstudium an der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg, klinischer Studienabschnitt
ab 02/2010
Praktisches Jahr (Diakonie Krankenhaus, Freiburg und
Canterbury (England))
Praktika und Famulaturen:
10/2000
6-monatiges Pflegepraktikum, Klinikum Lahr
10/2007
Famulatur, Chirurgie, Klinikum Lahr
09/2008
Praxisfamulatur, Offenburg
10/2008
Famulatur, Infektiologie, Uniklinikum Freiburg
03/2009
Famulatur, Gynäkologie, Penang, Malaysia
Lebenslauf
12/2009
75
Famulatur, Anästhesie, Diakoniekrankenhaus, Freiburg
Promotion:
Ab 12/2007
Doktorarbeit in der Abteilung für Infektiologie des
Universitätsklinikums Freiburg unter der Leitung von Herrn
Prof. Dr. W.V. Kern
76
Anhang
10 Anhang
10.1 Abkürzungen
3-AG100
Drittschrittmutante von AG100
3-AG100acrBΔ615-628
3-AG100 mit rpsL-neo-Kassette in AcrB 615-628
3-AG100acrB::rpsL-neo
rpsL-neo-Kassette in Gesamt-AcrB in 3-AG100
ABC
ATP-binding-cassette (Name einer Transporterfamilie)
AcrA
Membranfusionsprotein (E.coli)
AcrB
RND-Transporter (E.coli))
AS
Aminosäure
ATP
Adenosintriphosphat
Azi
Azithromycin
bp
Basenpaare
bzw.
beziehungsweise
ca.
circa
Cipro
Ciprofloxacin
Cha
Chloramphenicol
Clari
Clarithromycin
Clinda
Clindamycin
DKO
Mutante von E.coli (AcrAB-AcrF-Doppelknockout)
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Nukleotidmix aus dATP, dCTP, dGTP, dTTP
EPI
Effluxpumpeninhibitor
Ery
Erythromycin
Genta
Gentamycin
H2O
Wasser
Anhang
77
KAM32
AcrB/YdhE-Doppelknockout
Kan
Kanamycin
LB
Nährmedium nach Luria-Bertani
Lev
Levofloxacin
Lizo
Linezolid
MATE
Multidrug and Toxic Compound Extrusion (Name einer
Transporterfamilie)
MDR
Multidrug Resistance ( multiple Antibiotikaresistenz)
MexB
RND-Transporter (Pseudomonas aeruginosa)
MFP
Membrane fusion protein ( Membranfusionsprotein)
MFS
Major
facilitator
Superfamily
(Name
einer
Transporterfamilie)
MHK
Minimale Hemmkonzentration
Mino
Minocyclin
Moxi
Moxifloxacin
NaCl
Natriumchlorid (Kochsalz)
NMP
Naphthyl-methyl-piperazin
Novo
Novobiocin
OD600
Optische Dichte bei 600nm
OMP
Outer membrane protein (Kanalbildendes Protein der
äußeren Membran)
Oxa
Oxacillin
PAβN
Phenylalanin-arginyl-β-naphthylamid
PBS
Phosphate
buffered
saline
(Phosphat
gepufferte
Kochsalzlösung)
PCR
Polymerase
Kettenreaktion)
chain
reaction
(Polymerase-
78
pH
Anhang
Maß für die Stärke der sauren bzw. basischen Wirkung
einer wässrigen Lösung
Rif
Rifampicin
RND
Resistance-Nodulation-Cell
Division
(Name
einer
Transporterfamilie)
rpm
Rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
RT
Raumtemperatur
SOB-Medium
Super Optimal Broth-Medium
SOC-Medium
Derivat des SOB-Mediums
Strep
Streptomycin
Taq-Polymerase
DANN-Polymerase des Bakteriums Thermus aquaticus
TBE
Tris-Borat-EDTA-Puffer
TE
Tris-EDTA
Tet
Tetrazyklin
TolC
Kanalbildendes Protein der äußeren Membran (E.coli)
WHO
World Health Organisation
WK
Wachstumskontrolle
z.B.
Zum Beispiel