polyklonale Antikörper

Werbung
9. Vorlesung Immunologie
Nur zum persönlichen
Gebrauch
9. Vorlesung Immunologie
Einführung - Angeborene und erworbene Immunität
Zellen und Organe des Immunsystems
Reifung der Lymphozyten - Apoptose
Antikörper (Ak) - Entstehung der Ak-Variabilität
Herstellung und Nutzung von Antikörpern
T-Zell-Rezeptoren (TcR) und T-Zellen
MHC (major histocompatibility complex) -Moleküle
Regulationsmechanismen (Vermeidung von Reaktionen gegen
"Selbst")
Phylogenese der spezifischen Immunmechanismen
Zusammenfassung: Immunologie I; 8. Vorlesung (1/2)
1. Die Variablität der Antikörper innerhalb eines Individuums
(Mensch oder Maus) entsteht im Laufe der Ontogenese.
2. Folgende Vorgänge sind daran beteiligt:
● Rekombination zwischen multiplen Gensegmenten, die über die
Keimbahn an die Nachkommen weitergegeben werden
(V- (D-) J-Rekombination),
● Ungenauigkeiten bei diesem Rekombinationsprozeß und
Einführung von Nukleotiden in die rekombinierten Regionen,
● Kombination unterschiedlicher leichter und schwerer Ketten,
● somatische Hypermutationen während einer Immunantwort.
3. Während der somatischen Rekombination werden Genbereiche
herausgeschnitten und gehen damit verloren.
Zusammenfassung: Immunologie I; 8. Vorlesung (2/2)
4. Somatische Rekombinationsprozesse spielen auch beim
Wechsel der Immunglobulin-Klassen (isotype switch, class
switch) im Laufe einer Immunantwort eine Rolle.
5. Die Kodierung von Membran-gebundenem bzw. sezerniertem
Immunglobulin erfolgt vom gleichen Gen; die “Entscheidung”
über die jeweilige Expressionsform fällt auf RNA-Ebene über
alternatives Splicing.
Kommerzielle Herstellung von
Antikörpern
Polyklonale Antikörper
von Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten, Hühnern,
Schafen oder Ziegen
ca. 500 € für Serum
plus 200 – 300 € für Ig-Reinigung (nicht Ag-spezifisch)
Monoklonale Antikörper
von Mäusen
ca. 15.000 €
Immunisierung
Wirbeltier
Serum, Eidotter
Immunglobulin
In-vitro-Immunisierung
(Das geht noch nicht richtig!)
B-Lymphozyten
Hybridome
Ak-Gene
Ak-Bibliotheken
Polyklonale
PolyklonaleAk
Ak
Monoklonale
MonoklonaleAk
Ak
Rekombinante
RekombinanteAk
Ak
Synthetische
Ak-Gene
Fig. A.3 Antibodies can be elicited
by small chemical groups called
haptens only when the hapten is
linked to an immunogenic protein
carrier.
notwendige Vorüberlegungen
sind evtl. natürliche Antikörper vorhanden?
(z.B. nach mehreren Schwangerschaften, bei Autoimmunerkrankungen)
Charakter des Antigens?
● Makromolekül: Protein, Kohlenhydrat, Lipid, Nukleinsäure
● Zellen, Zelltrümmer
● Komplexe - Peptid - Hapten
Adjuvans erforderlich?
aus welcher Spezies stammt das Antigen?
welche Spezies soll immunsiert werden?
Maus, Kaninchen, Ziege, Schaf, Pferd, Huhn (Antikörper aus dem Eidotter),
evtl. Mensch (z.B. Anti-HLA-Antikörper, Anti-Blutgruppen-Ak)
monoklonale oder polyklonale Antikörper?
Reinigung von Antikörpern
Gewinnung von Antikörpern gegen definierte Strukturen
Entfernung der unerwünschten Antikörper aus einem
Immunserum  "negative" Affinitätschromatographie"
polyklonale Antikörper
Isolierung der spezifischen Antikörper aus einem
Immunserum  "positive" Affinitätschromatographie
polyklonale Antikörper
Isolierung und Vermehrung der Antikörper-produzierenden
Zellen  Hybridomtechnik
monoklonale Antikörper
Klonierung und Amplifizierung von Antikörpergenen
polyklonale und monoklonale rekombinante
Antikörper
Immunaffinitätschromatographie
Serum
zur Reinigung
von
Antikörpern
Antigen
Matrix
Immunaffinitätschromatographie
zur Reinigung
von
Antikörpern
Immunaffinitätschromatographie
zur Reinigung
von
Antikörpern
saurer pH
Immunaffinitätschromatographie
zur Reinigung
von
Antikörpern
gereinigte Antikörper
2.11 Die Affinitätschromatographie zur Aufreinigung von
Antikörpern oder Antigenen
beruht auf der Antigen:
Antikörper-Bindung.
Janeway & Travers: Immunologie, Spektrum Akad.Verlag 1995
Grundausstattung für die affine Chromatographie
Photometer
Schreiber
Peristaltikpumpe
Säule
Hybridomtechnik zur Gewinnung
monoklonaler Antikörper
Fig. 1.13 Each antibodyproducing cell (B cell) is
programmed to make just
one antibody, which is
placed on its surface as an
antigen receptor. Antigen
binds to only those B cells
with the appriopriate
surface receptor - B cell 2
in this example. In this way
these cells are stimulated
to proliferate and mature
into antibody-producing
cells, and longer-lived
memory cells, all having
the same antibody-binding
specificity.
Roitt, Brostoff, Male: Immunology 5th ed. Mosby 1998
IMMUNE RESPONSE is initiated (a) when an antigen molecule carrying several different
antigenic determinants enters the
body of an animal. The immune
system responds: lines of B
lymphocytes proliferate, each
secreting an immunoglobulin
molecule that fits a single antigenic determinant (or a part of
it). A conventional antiserum
contains a mixture of these
antibodies. Monoclonal antibodies are derived by fusing
Iymphocytes from the spleen
with malignant myeloma cells
(b). Individual hybrid cells are
cloned, and each of the clones
secretes a monoclonal antibody
that specifically fits a single
antigenic determinant on the
antibody molecule.
Cesar Milstein, Monoclonal Antibodies,
Scientific American Oct 1980, p.56
Herstellung von monoklonalen Antikörpern (MoAk)
► Gewinnung von Zellen, die unbegrenzt
Antikörper synthetisieren
► Plasmazellen sind kurzlebig (auch in vivo), darum
 Gewinnung von B-Zellen und Fusion mit
unsterblichen Zellen,
► Herstellung von Hybridomzellen, die die Information
zur Unsterblichkeit von den Myelomzellen und die
Information zur Bildung eines spezifischen Antikörpers
von der fusionierten B-Zelle haben.
MoAk sind einheitlich, da sie ursprünglich von einer BZelle stammen (Klon aus einer Zelle); sie reagieren
einheitlich und sind in beliebiger Menge herstellbar, da die
Produzenten potentiell unsterblich sind.
Produktion monoklonaler Antikörper
Milzzellen
Myelomzellen
Fusion (Sendai, PEG, elektr. Impuls)
HAT-Selektion
Ak-Screening, Klonierung, Massenproduktion, Kryokonservierung
PEG = Polyethyleglykol, Sendai = Sendaivirus, HAT = Hypoxanthin – Aminopterin – Thymidin
Abbas, Lichtman & Pober: Cellular and Molecular Immunology. Saunders 1991
STANDARD PROCEDURE for deriving
monoclonal antibodies begins with the fusion,
mediated by polyethylene glycol, of spleen cells
from an immunized mouse (or rat) with mouse (or
rat) myeloma cells. Hybrids are selected in HAT.
The medium is assayed for antibody secretion,
and a portion of each positive culture is frozen as
a precaution. Positive cultures are cloned and the
clones are assayed. The positive ones are then
frozen, recloned and assayed for the presence of
immunoglobulin variants. The clones finally
selected can be stored frozen. When the samples
are thawed, they can be either grown in culture to
produce the antibody or injected into animals to
induce myelomas that secrete the antibody.
Cesar Milstein, Monoclonal Antibodies, Scientific American Oct 1980, p.56
Antikörpernachweise
- direkter Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktion
- Nachweis durch Markierung eines Reaktionspartners
- Nachweis der biologischen Wirkung
Fig. A.10 Different antibodies bind to distinct epitopes on an antigen molecule.
Beispiele:
sehr klein: Fluorescein (Hapten, 332 Da)
klein: Cytochrom c (12,5 kDa)
mittel: Ovalbumin (43 kDa)
groß: Glucoseoxidase ( 2 x 80 kDa)
Figure 5.2. Diagrammatic representation of complexes formed between a
hypothetical tetravalent antigen and bivalent antibody mixed in different
proportions.
I.Roitt: Essential Immunology 7th ed. Blackwell 1991
Fig. A.9 Antibody can precipitate soluble antigen.
hu-Serum
hu-Albumin
hu-IgG
Ziege-anti-hu-Serum
Immundiffusion nach Ouchterlony
Fig. 11.9 Immunoelectrophoresis reveals the absence of several
distinct immunoglobulin isotypes in serum from a patient with
X-linked agammaglobulinemia (XLA).
Fig. 29.6 The.active haemagglutination test
detects antibodies to red blood-cell
antigens. The antibody is serially diluted in
physiological saline and placed in the wells of
the haemagglutination plate. In this example,
eight different antisera (rows A-H) are being
tested. A suspension of red cells is added to
each well to give a final concentration of about
1% cells. If sufficient antibody is present to
agglutinate the cells, they sink as a mat to the
bottom of the well. If insufficient antibody is
present, the cells roll down the sloping sides of
the plate to form a red pellet at the bottom.
Some antibodies do not agglutinate red cells
very effectively and may be detected in the
indirect agglutination test by the addition of a
second antibody which binds to the non­
agglutinating antibody already bound on the red
cell. By binding different antigens onto the redcell surface, covalently or non­cova-lently, the
test can be extended to detect anti-bodies to
antigens other than those found on red cells
(upper right panel). Chromic chloride, tannic
acid, glutaraldehyde and a number of other
chemicals are used to cross-link the antigen to
the cells.
Roitt, Brostoff, Male: Immunology 5th ed. Mosby 1998
Die am häufigsten in Immuntests eingesetzten
Marker:
- Radioisotope (125I)
- Enzyme, die farbloses Substrat in farbiges oder
fluoreszierendes Produkt umwandeln
(POD, AP, β-Gal)
- fluoreszierende Marker (FITC, TRITC, GFP)
"Enzyme-linked immunosorbent assay. (ELISA) has become
a well established tool in clinical and research laboratories.
The assay fulfills requirements of objectivity, simplicity, and
sensitivity previously accomplished only by
radioimmunoassay (RIA).
In comparison with RIA, the ELISA employs stable reagents,
requires less expensive equipment, and is more suitable for
automation.
Furthermore ELISA is fun: A colorimetric assay gives a
colorgourmet pleasure in daily work;
others may find satisfaction in the ultrasensitivity of a
fluorimetric assay."
E.Engvall & E.Ruoslahti
Principles of ELlSA and Recent Applications to the Study of Molecular
Interactions.
in: Immunoassays in the Clinical Laboratory, Alan R. Liss, 1979, pp. 89-97
Ein Festphasen-Immuntests erfordert:
 eine leicht handhabbare feste Phase
(Mikrotiterplatten, Kügelchen, Röhrchen),
 eine Substanz (Binder = „catcher“), die leicht an der festen Phase
"festgehalten" wird und die dann die nachzuweisende Substanz
(Analyt) spezifisch bindet,
 einen zweiten Binder (= „tracer“), der den nun an der festen Phase
festgehaltenen Analyten "nachweist", d.h. den Analyten möglichst
spezifisch bindet und irgendwie "sichtbar" macht,
 für diese "Sichtbarmachung" einen Marker, der kovalent an den tracer
gekoppelt ist (d.h. bevor dieser im Test eingesetzt wird),
 ein Meßgerät zur einfachen und schnellen quantitativen Erfassung
des Signals,
zwischen den Inkubationsschritten muß gewaschen werden, um
überschüssige Reagenzien zu entfernen!!
ELISA zum Antikörper-Nachweis
(Maus-Anti-HSA)
Antigen,
humanes Albumin
ELISA zum Antikörper-Nachweis
Antigen,
humanes Albumin
Kälberserum
ELISA zum Antikörper-Nachweis
Maus Anti-hu Albumin
Antikörper
Antigen,
humanes Albumin
Serum der
immunisierten Maus
ELISA zum Antikörper-Nachweis
E
Maus Anti-hu Albumin
Antikörper
E
Antigen,
humanes Albumin
E
E
Enzym-markierte
Kaninchen Anti-Maus Ig Antikörper
ELISA zum Antikörper-Nachweis
Maus Anti-hu Albumin
Antikörper
Antigen,
humanes Albumin
Farbloses Substrat
E
Enzym-markierte
Kaninchen Anti-Maus Ig Antikörper
Farbiges Produkt
Roitt, Brostoff, Male: Immunology 5th ed. Mosby 1998
Herunterladen
Explore flashcards