polyklonale Antikörper
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9. Vorlesung Immunologie Nur zum persönlichen Gebrauch 9. Vorlesung Immunologie Einführung - Angeborene und erworbene Immunität Zellen und Organe des Immunsystems Reifung der Lymphozyten - Apoptose Antikörper (Ak) - Entstehung der Ak-Variabilität Herstellung und Nutzung von Antikörpern T-Zell-Rezeptoren (TcR) und T-Zellen MHC (major histocompatibility complex) -Moleküle Regulationsmechanismen (Vermeidung von Reaktionen gegen "Selbst") Phylogenese der spezifischen Immunmechanismen Zusammenfassung: Immunologie I; 8. Vorlesung (1/2) 1. Die Variablität der Antikörper innerhalb eines Individuums (Mensch oder Maus) entsteht im Laufe der Ontogenese. 2. Folgende Vorgänge sind daran beteiligt: ● Rekombination zwischen multiplen Gensegmenten, die über die Keimbahn an die Nachkommen weitergegeben werden (V- (D-) J-Rekombination), ● Ungenauigkeiten bei diesem Rekombinationsprozeß und Einführung von Nukleotiden in die rekombinierten Regionen, ● Kombination unterschiedlicher leichter und schwerer Ketten, ● somatische Hypermutationen während einer Immunantwort. 3. Während der somatischen Rekombination werden Genbereiche herausgeschnitten und gehen damit verloren. Zusammenfassung: Immunologie I; 8. Vorlesung (2/2) 4. Somatische Rekombinationsprozesse spielen auch beim Wechsel der Immunglobulin-Klassen (isotype switch, class switch) im Laufe einer Immunantwort eine Rolle. 5. Die Kodierung von Membran-gebundenem bzw. sezerniertem Immunglobulin erfolgt vom gleichen Gen; die “Entscheidung” über die jeweilige Expressionsform fällt auf RNA-Ebene über alternatives Splicing. Kommerzielle Herstellung von Antikörpern Polyklonale Antikörper von Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten, Hühnern, Schafen oder Ziegen ca. 500 € für Serum plus 200 – 300 € für Ig-Reinigung (nicht Ag-spezifisch) Monoklonale Antikörper von Mäusen ca. 15.000 € Immunisierung Wirbeltier Serum, Eidotter Immunglobulin In-vitro-Immunisierung (Das geht noch nicht richtig!) B-Lymphozyten Hybridome Ak-Gene Ak-Bibliotheken Polyklonale PolyklonaleAk Ak Monoklonale MonoklonaleAk Ak Rekombinante RekombinanteAk Ak Synthetische Ak-Gene Fig. A.3 Antibodies can be elicited by small chemical groups called haptens only when the hapten is linked to an immunogenic protein carrier. notwendige Vorüberlegungen sind evtl. natürliche Antikörper vorhanden? (z.B. nach mehreren Schwangerschaften, bei Autoimmunerkrankungen) Charakter des Antigens? ● Makromolekül: Protein, Kohlenhydrat, Lipid, Nukleinsäure ● Zellen, Zelltrümmer ● Komplexe - Peptid - Hapten Adjuvans erforderlich? aus welcher Spezies stammt das Antigen? welche Spezies soll immunsiert werden? Maus, Kaninchen, Ziege, Schaf, Pferd, Huhn (Antikörper aus dem Eidotter), evtl. Mensch (z.B. Anti-HLA-Antikörper, Anti-Blutgruppen-Ak) monoklonale oder polyklonale Antikörper? Reinigung von Antikörpern Gewinnung von Antikörpern gegen definierte Strukturen Entfernung der unerwünschten Antikörper aus einem Immunserum "negative" Affinitätschromatographie" polyklonale Antikörper Isolierung der spezifischen Antikörper aus einem Immunserum "positive" Affinitätschromatographie polyklonale Antikörper Isolierung und Vermehrung der Antikörper-produzierenden Zellen Hybridomtechnik monoklonale Antikörper Klonierung und Amplifizierung von Antikörpergenen polyklonale und monoklonale rekombinante Antikörper Immunaffinitätschromatographie Serum zur Reinigung von Antikörpern Antigen Matrix Immunaffinitätschromatographie zur Reinigung von Antikörpern Immunaffinitätschromatographie zur Reinigung von Antikörpern saurer pH Immunaffinitätschromatographie zur Reinigung von Antikörpern gereinigte Antikörper 2.11 Die Affinitätschromatographie zur Aufreinigung von Antikörpern oder Antigenen beruht auf der Antigen: Antikörper-Bindung. Janeway & Travers: Immunologie, Spektrum Akad.Verlag 1995 Grundausstattung für die affine Chromatographie Photometer Schreiber Peristaltikpumpe Säule Hybridomtechnik zur Gewinnung monoklonaler Antikörper Fig. 1.13 Each antibodyproducing cell (B cell) is programmed to make just one antibody, which is placed on its surface as an antigen receptor. Antigen binds to only those B cells with the appriopriate surface receptor - B cell 2 in this example. In this way these cells are stimulated to proliferate and mature into antibody-producing cells, and longer-lived memory cells, all having the same antibody-binding specificity. Roitt, Brostoff, Male: Immunology 5th ed. Mosby 1998 IMMUNE RESPONSE is initiated (a) when an antigen molecule carrying several different antigenic determinants enters the body of an animal. The immune system responds: lines of B lymphocytes proliferate, each secreting an immunoglobulin molecule that fits a single antigenic determinant (or a part of it). A conventional antiserum contains a mixture of these antibodies. Monoclonal antibodies are derived by fusing Iymphocytes from the spleen with malignant myeloma cells (b). Individual hybrid cells are cloned, and each of the clones secretes a monoclonal antibody that specifically fits a single antigenic determinant on the antibody molecule. Cesar Milstein, Monoclonal Antibodies, Scientific American Oct 1980, p.56 Herstellung von monoklonalen Antikörpern (MoAk) ► Gewinnung von Zellen, die unbegrenzt Antikörper synthetisieren ► Plasmazellen sind kurzlebig (auch in vivo), darum Gewinnung von B-Zellen und Fusion mit unsterblichen Zellen, ► Herstellung von Hybridomzellen, die die Information zur Unsterblichkeit von den Myelomzellen und die Information zur Bildung eines spezifischen Antikörpers von der fusionierten B-Zelle haben. MoAk sind einheitlich, da sie ursprünglich von einer BZelle stammen (Klon aus einer Zelle); sie reagieren einheitlich und sind in beliebiger Menge herstellbar, da die Produzenten potentiell unsterblich sind. Produktion monoklonaler Antikörper Milzzellen Myelomzellen Fusion (Sendai, PEG, elektr. Impuls) HAT-Selektion Ak-Screening, Klonierung, Massenproduktion, Kryokonservierung PEG = Polyethyleglykol, Sendai = Sendaivirus, HAT = Hypoxanthin – Aminopterin – Thymidin Abbas, Lichtman & Pober: Cellular and Molecular Immunology. Saunders 1991 STANDARD PROCEDURE for deriving monoclonal antibodies begins with the fusion, mediated by polyethylene glycol, of spleen cells from an immunized mouse (or rat) with mouse (or rat) myeloma cells. Hybrids are selected in HAT. The medium is assayed for antibody secretion, and a portion of each positive culture is frozen as a precaution. Positive cultures are cloned and the clones are assayed. The positive ones are then frozen, recloned and assayed for the presence of immunoglobulin variants. The clones finally selected can be stored frozen. When the samples are thawed, they can be either grown in culture to produce the antibody or injected into animals to induce myelomas that secrete the antibody. Cesar Milstein, Monoclonal Antibodies, Scientific American Oct 1980, p.56 Antikörpernachweise - direkter Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktion - Nachweis durch Markierung eines Reaktionspartners - Nachweis der biologischen Wirkung Fig. A.10 Different antibodies bind to distinct epitopes on an antigen molecule. Beispiele: sehr klein: Fluorescein (Hapten, 332 Da) klein: Cytochrom c (12,5 kDa) mittel: Ovalbumin (43 kDa) groß: Glucoseoxidase ( 2 x 80 kDa) Figure 5.2. Diagrammatic representation of complexes formed between a hypothetical tetravalent antigen and bivalent antibody mixed in different proportions. I.Roitt: Essential Immunology 7th ed. Blackwell 1991 Fig. A.9 Antibody can precipitate soluble antigen. hu-Serum hu-Albumin hu-IgG Ziege-anti-hu-Serum Immundiffusion nach Ouchterlony Fig. 11.9 Immunoelectrophoresis reveals the absence of several distinct immunoglobulin isotypes in serum from a patient with X-linked agammaglobulinemia (XLA). Fig. 29.6 The.active haemagglutination test detects antibodies to red blood-cell antigens. The antibody is serially diluted in physiological saline and placed in the wells of the haemagglutination plate. In this example, eight different antisera (rows A-H) are being tested. A suspension of red cells is added to each well to give a final concentration of about 1% cells. If sufficient antibody is present to agglutinate the cells, they sink as a mat to the bottom of the well. If insufficient antibody is present, the cells roll down the sloping sides of the plate to form a red pellet at the bottom. Some antibodies do not agglutinate red cells very effectively and may be detected in the indirect agglutination test by the addition of a second antibody which binds to the non­ agglutinating antibody already bound on the red cell. By binding different antigens onto the redcell surface, covalently or non­cova-lently, the test can be extended to detect anti-bodies to antigens other than those found on red cells (upper right panel). Chromic chloride, tannic acid, glutaraldehyde and a number of other chemicals are used to cross-link the antigen to the cells. Roitt, Brostoff, Male: Immunology 5th ed. Mosby 1998 Die am häufigsten in Immuntests eingesetzten Marker: - Radioisotope (125I) - Enzyme, die farbloses Substrat in farbiges oder fluoreszierendes Produkt umwandeln (POD, AP, β-Gal) - fluoreszierende Marker (FITC, TRITC, GFP) "Enzyme-linked immunosorbent assay. (ELISA) has become a well established tool in clinical and research laboratories. The assay fulfills requirements of objectivity, simplicity, and sensitivity previously accomplished only by radioimmunoassay (RIA). In comparison with RIA, the ELISA employs stable reagents, requires less expensive equipment, and is more suitable for automation. Furthermore ELISA is fun: A colorimetric assay gives a colorgourmet pleasure in daily work; others may find satisfaction in the ultrasensitivity of a fluorimetric assay." E.Engvall & E.Ruoslahti Principles of ELlSA and Recent Applications to the Study of Molecular Interactions. in: Immunoassays in the Clinical Laboratory, Alan R. Liss, 1979, pp. 89-97 Ein Festphasen-Immuntests erfordert: eine leicht handhabbare feste Phase (Mikrotiterplatten, Kügelchen, Röhrchen), eine Substanz (Binder = „catcher“), die leicht an der festen Phase "festgehalten" wird und die dann die nachzuweisende Substanz (Analyt) spezifisch bindet, einen zweiten Binder (= „tracer“), der den nun an der festen Phase festgehaltenen Analyten "nachweist", d.h. den Analyten möglichst spezifisch bindet und irgendwie "sichtbar" macht, für diese "Sichtbarmachung" einen Marker, der kovalent an den tracer gekoppelt ist (d.h. bevor dieser im Test eingesetzt wird), ein Meßgerät zur einfachen und schnellen quantitativen Erfassung des Signals, zwischen den Inkubationsschritten muß gewaschen werden, um überschüssige Reagenzien zu entfernen!! ELISA zum Antikörper-Nachweis (Maus-Anti-HSA) Antigen, humanes Albumin ELISA zum Antikörper-Nachweis Antigen, humanes Albumin Kälberserum ELISA zum Antikörper-Nachweis Maus Anti-hu Albumin Antikörper Antigen, humanes Albumin Serum der immunisierten Maus ELISA zum Antikörper-Nachweis E Maus Anti-hu Albumin Antikörper E Antigen, humanes Albumin E E Enzym-markierte Kaninchen Anti-Maus Ig Antikörper ELISA zum Antikörper-Nachweis Maus Anti-hu Albumin Antikörper Antigen, humanes Albumin Farbloses Substrat E Enzym-markierte Kaninchen Anti-Maus Ig Antikörper Farbiges Produkt Roitt, Brostoff, Male: Immunology 5th ed. Mosby 1998
