Transiente Mikrokompartimentierung des

Transiente Mikrokompartimentierung des
pflanzlichen Primärstoffwechsels am
Zytoskelett
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
des Fachbereiches Biologie/Chemie an der
Universität Osnabrück
vorgelegt von
Anke Scholz, geb. Thilo,
aus Berlin
Berlin, 2004
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis............................................................................................. I
1
Einleitung ................................................................................................... 1
1.1
Mikrokompartimentierung und Channeling ....................................................... 1
1.2
Die Glykolyse ............................................................................................................ 3
1.2.1
1.2.2
1.3
Interaktionen glykolytischer Enzyme......................................................................... 6
Das Enzym Aldolase.................................................................................................... 8
Das pflanzliche Cytoskelett .................................................................................... 11
1.3.1
1.3.2
1.4
2
Mikrotubuli ................................................................................................................12
Mikrofilamente...........................................................................................................12
Fragestellung .......................................................................................................... 15
Material und Methoden........................................................................... 16
2.1
Chemikalien und Materialien ................................................................................ 16
2.2
Pflanzenmaterial: Anzucht und Ernte................................................................... 19
2.3
Molekularbiologische Methoden............................................................................ 19
2.3.1
2.3.2
2.3.3
Bakterien- und Hefestämme ......................................................................................19
Plasmide .....................................................................................................................20
Arbeiten mit Nukleinsäuren ......................................................................................21
2.3.3.1
RNA-Isolierung aus Pflanzenmaterial.................................................................................21
2.3.3.2
Denaturierendes Formaldehyd/Agarose-Gel (RNA-Gel) .....................................................22
2.3.3.3
RNA-Quantifizierung..........................................................................................................23
2.3.3.4
DNA-Quantifizierung..........................................................................................................23
2.3.3.5
Oligonukleotide ...................................................................................................................23
2.3.3.6
Synthese von cDNA.............................................................................................................25
2.3.3.7
DNA-Amplifikation .............................................................................................................25
2.3.3.7.1 Polymerase-Kettenreaktion ..............................................................................................25
2.3.3.7.2 Reverse Transkriptase-PCR .............................................................................................26
2.3.3.8
Reinigung von DNA-Fragmenten .......................................................................................27
2.3.3.9
DNA-Fällung ......................................................................................................................27
2.3.3.10 DNA-Restriktion..................................................................................................................27
2.3.3.11 DNA-Ligation......................................................................................................................28
2.3.3.12 Vektordephosphorylierung ..................................................................................................29
2.3.3.13 Anhängen eines Adenin-Überhangs an ein PCR-Fragment................................................29
2.3.3.14 DNA-Sequenzanalyse ..........................................................................................................29
2.3.3.15 Agarose-Gelelektrophorese und Gelextraktion ....................................................................30
2.3.3.16 Klonierungen ......................................................................................................................31
2.3.3.16.1
Klonierung von ALD_pET-16b...................................................................................31
2.3.3.16.2
Klonierung von ALD_pGBKT7 ..................................................................................32
2.3.3.16.3
Klonierung von ALD_pASK-IBA3 .............................................................................32
2.3.3.16.4
Klonierung von VDAC_pRSET A...............................................................................33
2.3.3.16.5
Klonierung von VDAC_pGBKT7 ...............................................................................34
2.3.3.16.6
Klonierung von Aktin_pGBKT7..................................................................................34
2.3.4
2.3.4.1
Arbeiten mit Bakterien ..............................................................................................35
Bakterienkulturen ...............................................................................................................35
Inhaltsverzeichnis
2.3.4.2
2.3.4.3
2.3.4.4
2.3.4.5
2.3.5
II
Herstellung kompetenter E. coli-Zellen ...............................................................................36
Transformation von E. coli-Zellen ......................................................................................38
Blau-Weiß-Selektion ...........................................................................................................40
Plasmidisolierung aus E. coli ..............................................................................................40
Arbeiten mit Hefen.....................................................................................................40
2.3.5.1
Anzucht von S. cerevisiae ....................................................................................................41
2.3.5.2
Herstellung kompetenter Hefezellen und Transformation von Hefen..................................43
2.3.5.3
Plasmidisolierung aus S. cerevisiae .....................................................................................45
2.3.5.4
Herstellung einer cDNA-Bank für das Hefe-2-Hybrid-System ............................................46
2.3.5.4.1 Amplifizierung doppelsträngiger cDNA durch „long distance-PCR“ ................................49
2.3.5.4.2 Reinigung der doppelsträngigen cDNA ............................................................................50
2.3.5.4.3 In vivo-Rekombination.....................................................................................................50
2.3.5.4.4 Ernte der Transformanden................................................................................................51
2.3.5.4.5 Überprüfung der cDNA-Bank-Größe ...............................................................................51
2.3.5.4.6 Test des Fusionsproteinkonstrukts ALD_pGBKT7 auf transkriptionelle Aktivität in S.
cerevisiae ........................................................................................................................52
2.3.5.4.7 Toxizitätstest für das Fusionsproteinkonstrukt ALD_pGBKT7 .........................................52
2.3.5.5
Paarung der Hefestämme und Selektion diploider Zellen....................................................53
2.3.5.6
Kontrollen für das Hefe-2-Hybrid-System ...........................................................................55
2.3.6
Biochemische Methoden ............................................................................................57
2.3.6.1
Proteinbestimmung nach BRADFORD...................................................................................57
2.3.6.2
SDS-Gelelektrophorese .......................................................................................................58
2.3.6.3
Western-Blot-Analyse und Immundekoration .....................................................................60
2.3.6.3.1 Färbung geblotteter Proteine mit Ponceau S .....................................................................60
2.3.6.3.2 Immunologischer Nachweis durch Peroxidasereaktion .....................................................61
2.3.6.3.3 Immunologischer Nachweis durch Alkalische-Phosphatase-Reaktion ...............................62
2.3.6.3.4 Immunologischer Nachweis durch Chemolumineszenz.....................................................62
2.3.6.4
Dot-Blot eine Variante des Western-Blots.....................................................................63
2.3.6.5
Far-Western-Blot .............................................................................................................63
2.3.6.6
Heterologe Expression von Proteinen in E. coli BL21(DE3)pLysS......................................63
2.3.6.7
Reinigung der rekombinanten Proteine...............................................................................65
2.3.6.7.1 His-tag-Affinitätschromatographie...................................................................................65
2.3.6.7.2 Reinigung von rekombinantem Protein aus „inclusion bodies“..........................................67
2.3.6.7.3 Reinigung von rekombinantem Protein mit Strep-tag .......................................................68
2.3.6.8
Aldolase-VDAC-Bindeversuch (Affinitätschromatographie) ...............................................69
2.3.7
2.3.8
2.3.9
2.3.10
2.3.11
2.3.12
2.3.13
3
Entsalzen über Dialyse und NAP-5 Säulen................................................................70
Herstellung eines polyklonalen Antiserums ..............................................................70
Copolymerisationsversuche .......................................................................................71
Stöchiometrie der Aldolase-Aktin-Bindung ..............................................................73
Messung der Aldolaseaktivität...................................................................................74
Faktor-Xa -Verdau..................................................................................................76
Bioinformatische Analysen ........................................................................................76
Ergebnisse ................................................................................................ 77
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.1.5
3.1.6
3.1.7
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
Vorarbeiten............................................................................................................. 77
Klonierung des Expressionskonstrukts ALD_pET-16b............................................77
Heterologe Expression und Reinigung von Aldolase (Z. mays) mit His-tag..............78
Faktor-Xa-Verdau .....................................................................................................80
Herstellung eines polyklonalen Antiserums zur Immundetektion von Aldolase......81
Klonierung des Expressionskonstruktes ALD_pASK-IBA3.....................................82
Heterologe Expression und Reinigung von Aldolase (Z. mays) mit Strep-tag ..........83
Katalytische Eigenschaften rekombinanter Aldolase ...............................................85
Copolymerisationsversuche ................................................................................... 87
Einfluss von FBP, F-6P und F-2,6BP auf die Aldolase-Aktin-Bindung....................88
Einfluss des Redox-Milieus auf die Aldolase-Aktin-Bindung ...................................91
Stöchiometrie der Aldolase-Aktin-Bindung ..............................................................94
Inhaltsverzeichnis
3.3
III
Ergebnisse der Hefe-2-Hybrid-Analysen............................................................... 96
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.3.4
3.3.5
3.3.6
3.3.7
3.3.8
3.3.9
Klonierung von Aldolase in den Vektor pGBKT7 ....................................................96
Herstellung einer cDNA-Bank ...................................................................................96
Test auf transkriptionale Aktivität des Fusionsproteinkonstruktes und
Toxizitätstest ..............................................................................................................97
Analyse der Kontrollen zu den Hefe-2-Hybrid-Versuchen.......................................99
Hefe-2-Hybrid-Analyse der cDNA-Bank mit dem Fusionskonstrukt
ALD_pGBKT7 .........................................................................................................101
Analyse der pGADT7-cDNA-Bank-Konstrukte aus den blauen Hefekolonien......102
Klonierung des Expressionskonstruktes VDAC_pRSET A....................................104
Klonierung von VDAC in den Vektor pGBKT7 .....................................................105
Klonierung von Aktin in den Vektor pGBKT7.......................................................106
3.4
Heterologe Expression und Reinigung von VDAC (Z. mays) mit His-tag .......... 107
3.5
Far-Western-Blot.................................................................................................. 109
3.6
Aldolase-VDAC-Bindeversuch (Affinitätschromatographie) ............................. 110
4
Diskussion .............................................................................................. 114
4.1
Sequenzen der Expressionskonstrukte von Aldolase und VDAC....................... 114
4.2
Katalytische Eigenschaften rekombinanter Aldolasen ....................................... 116
4.3
Immunologischer Nachweis von Aldolase ........................................................... 116
4.4
Copolymerisationsversuche ................................................................................. 117
4.4.1
4.4.2
4.5
Einfluss von FBP, F-6P und F-2,6BP auf die Aldolase-Aktin-Bindung..................117
Einfluss des Redox-Milieus auf die Aldolase-Aktin-Bindung .................................119
Protein-Protein-Interaktionen im Hefe-2-Hybrid-System.................................. 121
4.5.1
4.5.2
4.5.3
4.5.4
4.6
Aldolase-Aldolase-Interaktion .................................................................................121
VDAC-Aldolase-Interaktion ....................................................................................121
Interaktionen mit mRNA-Sequenzen unbekannter Funktion und einem
Translationsinitiationsfaktor ...................................................................................123
Vermutlich falsch positive Interaktionen ................................................................123
Überprüfung der Protein-Protein-Interaktionen ................................................ 125
5
Zusammenfassung ................................................................................. 127
6
Literatur................................................................................................. 129
7
Danksagung............................................................................................ 154
8
Anhang ................................................................................................... 155
8.1
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ 155
8.2
Ermittelte Sequenzdaten der Expressionskonstrukte ......................................... 158
8.2.1
Nukleinsäuresequenz des Expressionskonstruktes ALD_pET-16b........................158
Inhaltsverzeichnis
8.2.2
8.2.3
8.2.4
8.2.5
8.2.6
8.2.7
8.2.8
IV
Abgeleitete Aminosäuresequenz des Expressionskonstruktes ALD_pET-16b......158
Nukleinsäuresequenz des Expressionskonstruktes ALD_pASK-IBA3 ..................159
Abgeleitete Aminosäuresequenz des Konstruktes ALD_pASK-IBA3....................159
Schematische Dartsellung der Aldolase-Expressionskonstrukte ............................160
Nukleinsäuresequenz des Expressionskonstruktes VDAC_pRSET A....................160
Abgeleitete Aminosäuresequenz des Konstruktes VDAC_pRSET A .....................160
Sequenzvergleiche der Expressionskonstrukte .......................................................161
8.3
Sequenzen der pGADT7-cDNA-Bank-Konstrukte ............................................. 166
8.4
Tabelle zur statistischen Auswertung .................................................................. 173
Lebenslauf..................................................................................................... 174
Eidesstattliche Versicherung ....................................................................... 175
Einleitung
1
1 Einleitung
Unter dem Begriff Primärstoffwechsel werden die Biosynthesewege zusammengefasst, deren
Produkte für das Überleben der Zellen notwendig sind. Charakteristisch für den pflanzlichen
Primärstoffwechsel ist die Umwandlung von Sonnenenergie in chemische Energie durch die
Photosynthese und die Synthese hochmolekularer Kohlenhydrate. Auch der Abbau
biologischer Moleküle und die Einspeisung von Produkten in den Energiestoffwechsel,
hauptsächlich in die Glykolyse und den Citratzyklus, gehören zum Primärstoffwechsel.
Dagegen versteht man unter Sekundärstoffwechsel Prozesse, die nur in ganz bestimmten
Geweben oder Organen und in ganz bestimmten Entwicklungsstadien erfolgen und nicht der
einzelnen Zelle, sondern dem Organismus als Ganzem dienen. Die Grenze zwischen Primärund Sekundärstoffwechsel ist jedoch nicht immer eindeutig zu ziehen.
1.1 Mikrokompartimentierung und Channeling
Wie jede eukaryotische Zelle weist auch die Pflanzenzelle eine interne räumliche Struktur auf,
die der Abgrenzung einzelner Reaktionsräume oder Kompartimente dient. Durch die
Kompartimente einer Zelle, z. B. Organellen wie Mitochondrien und Chloroplasten, ist eine
Organisation für bestimmte Stoffwechselwege gegeben. Sie ist jedoch auch für die im Cytosol
ablaufenden Prozesse von großer Wichtigkeit. Freie Diffusion, ohne eine spezifische
Anordnung von Enzymen, würde zu einem ineffizienten Stoffwechsel führen (SRERE, 1967).
Die stattfindende Diffusion wird durch die Mikroumwelt innerhalb des Cytosols beeinflusst.
So erfolgt bei der Diffusion von Makromolekülen auf Grund der Partikelgröße und der
sterischen Hinderung durch das cytoskelettale Netzwerk innerhalb der Zellen ein
Größenausschluss, ähnlich wie durch ein Sieb (LUBY-PHELBS, 1994). Viele Enzyme sind
durch die Bildung von Komplexen oder die Assoziation an strukturelle Bestandteile der Zelle
sowie die Multifunktionalität dieser Enzyme selbst organisiert. Solche Interaktionen führen zu
einer Mikrokompartimentierung von Enzymen. Einige dieser Komplexe sind sehr stabil und
gut zu isolieren, wogegen jedoch die Interaktionen in dynamischen Enzymkomplexen wie der
Glykolyse oder dem Citratzyklus recht schwach und transient sind (WELCH, 1977). Die
Komplexbildung kann mit dem Stoffwechselstatus der Zelle variieren, und eine reversible und
dynamische Bindung von Enzymen an Membranen kann zu kinetisch unabhängigen
Teilmengen
des
Enzymassoziationen
Enzyms
führen
(OVÁDI & SRERE, 1996).
können
konkurrierende
Stoffwechselwege,
Durch
die
spezifische
im
gleichen
Kompartiment der Zelle stattfinden, reguliert werden (PLAXTON, 1996), wie z. B. die
Einleitung
2
Glykolyse und Gluconeogenese. URETA stellte 1978 die Hypothese auf, dass gemeinsame
Zwischenprodukte konkurrierender Stoffwechselwege durch die Beteiligung von Isoenzymen
voneinander getrennt werden. 1988 ging OVÁDI von einer dynamischen Interaktion zwischen
zwei Enzymen durch die Affinität beider Enzyme zu einem gemeinsamen Zwischenprodukt
aus. Der Begriff Metabolon wurde ein Jahr zuvor von SRERE (1987) für einen Komplex
aufeinanderfolgender Enzyme geprägt, die leicht oder vorübergehend assoziiert sind. Ein
Metabolon ist außerdem eine dicht strukturierte Ansammlung von Aktivitäten, wodurch sich
die Möglichkeit ergibt, komplexe Stoffwechselwege zu kanalisieren („channeling“). Darunter
wird ein bevorzugter Transfer eines Zwischenprodukts von einem Enzym an ein physikalisch
angrenzendes Enzym mit eingeschränkter Diffusion in das umgebende Milieu verstanden
(SRIVASTAVA & BERNHARD,
1986;
SRERE, 1987).
So
können
z. B.
instabile
Zwischenprodukte durch die Bindung an ein Protein geschützt werden. „Channeling“
ermöglicht außerdem die Aufrechterhaltung eines Konzentrationsgradienten und verschafft
einem Stoffwechselweg Vorteile durch die daraus folgende hohe lokale Konzentration eines
Substrates (MATHEWS & SINHA, 1982; OVÁDI & SRERE, 1996). Durch die Konzentrierung
von Substraten in definierten Zellbereichen behalten andere Bereiche des Cytosols, in denen
die Konzentration gelöster Stoffe geringer ist, die Fähigkeit weitere Stoffe oder Substrate
aufzunehmen (FULTON, 1982; SRERE, 1987; MATHEWS, 1993). Durch „Channeling“ wird
auch eine schnelle Anpassung der Zelle an geänderte Umweltbedingungen ermöglicht. Die
Regulation eines Stoffwechselwegs kann dabei durch die Regulation eines einzigen Enzyms
innerhalb des Stoffwechselwegs erfolgen. Von einer Steigerung der Durchflussrate ist
aufgrund der schnellen individuellen Reaktionen der Enzyme jedoch nicht auszugehen
(MATHEWS, 1993). Die Assoziation von Enzymen kann jedoch auch ausschließlich der
Regulation dienen, ohne dass es zum „channeling“ zwischen den aktiven Zentren der
beteiligten Enzyme kommt, z. B. indem die katalytische Aktivität eines beteiligten Enzyms
reduziert wird, wie es in der Zusammenfassung von WINKEL (2004) für den CysteinSynthase-Komplex beschrieben wurde. Ebenso beteiligen sich z. B. im Calvin-Zyklus kleine,
nicht katalytische Proteine (CP12) an der Assoziation eines Multienzymkomplexes bestehend
aus Phosphoribulose-Kinase und Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)
(SCHEIBE et al., 2002).
Einleitung
3
1.2 Die Glykolyse
Bei dem seit 1940 vollständig aufgeklärten Stoffwechselweg der Glykolyse handelt es sich
um eine Reaktionsfolge zum Abbau von Glukose. Glukose wird dabei in Pyruvat
umgewandelt und es entstehen eine geringe Menge Energie in Form von ATP und
Reduktionsäquivalente (NADH). Neben der Energiebereitstellung ist es eine wichtige
Funktion der Glykolyse, Kohlenstoffgerüste für Biosynthesen zur Verfügung zu stellen. Eine
Übersicht über die Reaktionen der Glykolyse sowie einige Verknüpfungen mit anderen
Zellkompartimenten und Stoffwechselwegen ist in Abbildung 1.1 dargestellt.
Die Reaktionsfolge der Glykolyse findet im Cytosol der Zellen statt und wird von zehn
Enzymen katalysiert. In drei Reaktionen wird dabei aus Glucose zunächst Fructose-1,6bisphosphat (FBP) hergestellt. Der erste und der dritte dieser drei Schritte sind irreversibel.
Glucose wird als erstes in Glucose-6-phosphat umgewandelt. Diese Reaktion wird durch die
Hexokinase katalysiert. Glucose-6-phosphat wird anschließend in Fructose-6-phosphat
umgewandelt. Im dritten Schritt dieser Reaktionsfolge entsteht, katalysiert von der
Phosphofructokinase, FBP. Dabei handelt es sich um eine Reaktion, die entscheidend die
Geschwindigkeit der Glykolyse beeinflusst. Die Aktivität der Phosphofructokinase wird durch
die ATP-Konzentration, den pH-Wert und die Menge an Citrat in der Zelle reguliert.
Der nächste Schritt der Glykolyse führt zur Spaltung des FBP in zwei Produkte mit je drei
Kohlenstoffatomen,
Dihydroxyacetonphosphat
und
Glycerinaldehyd-3-phosphat.
Diese
Spaltung wird durch das Enzym Aldolase katalysiert. Die energiegewinnenden Schritte, die
sich anschließen, beginnen mit der von der GAPDH katalysierten Umwandlung des
Glycerinaldehyd-3-phosphats in 1,3-Bisphosphoglycerat. Nach drei weiteren Reaktionen, in
denen zwei Moleküle ATP gewonnen werden, erfolgt die abschließende Bildung von Pyruvat.
Diese Reaktion, katalysiert von der Pyruvat-Kinase, führt ebenfalls zum Energiegewinn in
Form von zwei Molekülen ATP und ist irreversibel.
Neben der Reaktion der Phosphofructokinase haben auch die beiden anderen irreversiblen
Reaktionen eine regulierende Rolle innerhalb der Glykolyse. Die Hexokinase, die den ersten
Schritt der Glykolyse katalysiert, wird von ihrem Produkt, Glucose-6-phosphat, gehemmt.
Wird die Phosphofructokinase gehemmt, steigt der Fructose-6-phosphat-Spiegel an, und
damit auch der Glucose-6-phosphat-Spiegel. Eine Hemmung der Hexokinase erfolgt also
auch, wenn die Phosphofructokinase gehemmt ist. Die Menge an Endprodukt der Glykolyse
wird kontrolliert durch die Pyruvat-Kinase. Sie wird u. a. reguliert durch die Konzentration an
FBP und ATP.
Einleitung
4
Unter aeroben Bedingungen folgen der Glykolyse der Citratzyklus und die Atmungskette,
durch die das Pyruvat vollständig zu CO2 und H2O oxidiert wird. Bei dieser vollständigen
Oxidation der Glucose entstehen insgesamt 30 Moleküle ATP. Unter anaeroben Bedingungen
wird das Pyruvat durch Gärung in Lactat oder Ethanol umgewandelt, wobei die
Energieausbeute jedoch nur 2 ATP beträgt (STRYER, 1999).
Die Regulation der Glykolyse spielt in der Anpassung eines Organismus eine entscheidende
Rolle. Der Kohlenstofffluss muß den Bedarf der Pflanze decken, damit diese alle benötigten
Komponenten für ihr Wachstum und Überleben synthetisieren kann (DENNIS et al., 1997).
Neben der Funktion der Bereitstellung von Zwischenprodukten für die Biosynthese ist die
Energiebereitstellung vor allem im Dunkeln und unter anaeroben Bedingungen wichtig.
Gerade bei Sauerstoffmangel, der z. B. durch Überflutung im Wurzelraum auftreten kann,
muss eine schnelle Anpassung an die veränderte Situation erfolgen. Die Weiterverarbeitung
des Pyruvats mit Hilfe der Gärung ermöglicht unter diesen Bedingungen die Regenerierung
des NAD+ zur Aufrechterhaltung der Glykolyse. Würde das NAD+ nicht regeneriert, könnte
die Umwandlung des Glycerinaldehyd-3-phosphats durch die GAPDH nicht erfolgen und
damit die Glykolyse nicht weiter fortschreiten. Durch die Aufrechterhaltung der Glykolyse
kann jedoch zumindest eine geringe Energiemenge bereitgestellt werden, die dem Organismus
das Überleben sichern kann.
In Maiskeimlingen konnte nachgewiesen werden, dass kurze Zeit nach Anaerobiose die
Synthese von ~20 spezifischen Polypeptiden, die am Kohlenstoffstoffwechsel beteiligt sind,
erfolgt (SACHS et al., 1980). Dazu gehören unter anderem zwei Isoenzyme der AlkoholDehydrogenase (SACHS & FREELING, 1978), Glucosephosphat-Isomerase (KELLEY &
FREELING, 1984a), Aldolase (KELLEY & FREELING, 1984b), Pyruvat-Decarboxylase (LASZLO
& ST. LAWRENCE, 1983) und Saccharose-Synthase (SPRINGER et al., 1986; MCCARTY et al.,
1986).
Einleitung
5
Stärke
Glucose
ATP
Hexokinase
ADP
Glucose-6-phosphat
Cellulose
GlucosephosphatIsomerase
Plastid
•
•
Fructose-6-phosphat
ATP
Phosphofructokinase
Cytosol
Glykolyse
FettsäureSynthese
u.a. Biosynthesewege
•
ADP
Fructose-1,6-bisphosphat
Aldolase
Glycerinaldehyd3-phosphat
Nucleinsäuren
Aminosäuren
Lipide
Glycerinaldedhyd3-phosphat
Dehydrogenase
TPI
NAD+ + Pi
Dihydroxyacetonphosphat
NADH + H+
1,3-Bisphosphoglycerat
ADP
PhosphoglyceratKinase
Plastid
ATP
s.o.
3-Phosphoglycerat
Vakuole
PhosphoglyceratMutase
2-Phosphoglycerat
Enolase
PEP
Phosphoenolpyruvat
PyruvatKinase
Pyruvat
Oxalacetat
ADP
Malat
ATP
Pyruvat
Respiration
Pyruvat
Aminosäuren
Malat
Biosynthese
Mitochondrion
Abb. 1.1: Schema des Stoffwechselwegs der Glykolyse mit Verknüpfungen zu weiteren Biosynthesewegen in
der Pflanze (in Anlehnung an PLAXTON, 1996). Die Abbildung erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit.
Abkürzungen sind wie im Text oder wie folgt: TPI: Triosephosphat-Isomerase, PEP: Phosphoenolpyruvat.
Einleitung
6
1.2.1 Interaktionen glykolytischer Enzyme
Interaktionen von Enzymen der Glykolyse untereinander oder mit anderen Komponenten der
Zelle, wie z. B. Organellen oder dem Cytoskelett, wurden vor allem in tierischen Systemen
entdeckt und charakterisiert. In letzter Zeit gibt es jedoch auch immer mehr Untersuchungen
in pflanzlichen Systemen.
Die meisten Enzyme kommen in einer löslichen und einer gebundenen Form in der Zelle vor
(PAGLIARO & TAYLOR, 1988;
KELETI & OVÁDI, 1988).
Durch
diese
spezifischen
Assoziationen werden die Enzymstruktur, die Kinetik und die thermodynamischen
Eigenschaften der beteiligten Enzyme beeinflusst (ARNOLD & PETTE, 1970; WALSH et
al. 1977, OVÁDI et al., 1986, OVÁDI & SRERE, 1996). MOWBRAY und MOSES zeigten 1976,
dass glykolytische Enzyme aus Escherichia coli (E. coli) aggregieren können. In zahlreichen
anderen Organismen und Zelltypen - wie z. B. der Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae),
Muskelzellen und Fibroblasten - wurden Interaktionen glykolytischer Enzyme nachgewiesen
(TOMPA et al., 1986; OVÁDI & KELETI, 1978; OVÁDI, 1988; MINASCHEK et al., 1992).
Die Assoziation glykolytischer Enzyme an strukturelle Proteine wurde als erstes in
Muskelzellen beobachtet (ARNOLD & PETTE, 1969), wobei zunächst eine Interaktion der
Phosphofructokinase (PFK) mit F-Aktin entdeckt wurde. Diese Interaktion kann durch die
Phosphorylierung der PFK verstärkt werden (LUTHER & LEE, 1986). 1970 konnte die Bindung
von Aldolase (ALD) an F-Aktin nachgewiesen werden (ARNOLD & PETTE, 1970). Es folgten
viele Arbeiten zur näheren Charakterisierung dieser Assoziation, auf die im Einzelnen im
nächsten Kapitel eingegangen wird. Der Einfluss von Proteinkonzentration und Ionendichte
auf die Assoziation aller zehn an der Glykolyse beteiligten Enzyme auf ihre Bindung an FAktin wurde für Muskelgewebe von CLARKE und MASTERS 1975 untersucht. Neben vielen
anderen Interaktionen wurde die der GAPDH mit dem Cytoskelett in Neuronen beschrieben
(CLARKE & MORTON, 1982; KNULL et al., 1980) sowie ihre Bindung an F- und G-Aktin, was
die katalytische Aktivität beeinflusste (OUPOROV et al., 2001).
Ein Modell für die Interaktionen glykolytischer Enzyme und deren Assoziation an F-Aktin in
Säugetierzellen wurde von MASTERS und Kollegen 1987 entwickelt. Dabei wird von einer
Segmentierung der Glykolyse in Abschnitte mit bis zu vier Enzymen ausgegangen, die auch
unabhängig voneinander unter verschiedenen zellulären Bedingungen agieren können. In
Abb. 1.2 ist das zweite Segment mit den interagierenden Proteinen ALD, GAPDH
Triosephosphat-Isomerase (TPI) und Phosphoglycerat-Kinase (PGK) dargestellt. Neben der
Bindung der Enzyme untereinander erfolgt eine Bindung von ALD, GAPDH und PFK (dem
letzten Enzym des ersten glykolytischen Segments) an Aktinfilamente.
Einleitung
7
Abb. 1.2: Schematische Darstellung interagierender Proteine der Glykolyse an einem Aktin
enthaltenden Filament mit der Möglichkeit des „Channelings“ von Metaboliten (aus MASTERS et al.,
1987). Abkürzungen wie im Text oder wie folgt: F6P Fructose-6-phosphat; FDP Fructose-1,6bisphosphat; G3P Glycerinaldehyd-3-phosphat, DHAP Dihydroxyacetonphosphat; DPGA 1,3Bisphosphoglycerat, 3PGA 3-Phosphoglycerat.
Neben der Assoziation der Enzyme sowohl untereinander als auch an Aktin-enthaltende
Filamente wurden weitere Membranbindungen und Bindungen an Mikrotubuli (z. B.
DURRIEU et al., 1987; WALSH et al., 1989; HARRIS &WINZOR, 1990; UYEDA, 1992; LOW et
al., 1993; GITLITS et al., 2000), Bindungen an Ribosomen (RYAZANOV et al., 1988) und
Mitochondrien (z. B. WILSON, 1980; XIE & WILSON, 1990; TAYLOR et al., 2003; GIEGÉ et
al., 2003) nachgewiesen. Die korrekte Lokalisation der Enzyme innerhalb der Zelle spielt für
die Funktion komplexer Prozesse eine entscheidende Rolle (SRERE & KNULL, 1998).
MOORHEAD und PLAXTON konnten 1988 für pflanzliches Gewebe eine Assoziation
glykolytischer Enzyme an die subzelluläre, Partikel enthaltende Fraktion nachweisen. Bei der
Suche nach Aldolase-Bindeproteinen fanden sie 1992 Interaktionen zwischen Aldolase und
PFK. 1995 wurden Enzym-Enzym-Interaktionen von GAPDH, TPI und Aldolase in
Chloroplasten nachgewiesen (ANDERSON et al., 1995). In der Cytoskelettfraktion von
Maisendosperm konnten Enzyme des Kohlenhydratstoffwechsels wie Aldolase, GAPDH und
Saccharose-Synthase nachgewiesen werden (AZAMA et al., 2003). Sieben der zehn
glykolytischen Enzyme wurden in Arabidopsis-Zellen an der äußeren Mitochondrienmembran
identifiziert (GIEGÉ et al., 2003). An den isolierten Mitochondrien konnte die Glykolyse
vollständig ablaufen, was darauf hinweist, dass auch die drei nicht identifizierten Enzyme an
den Mitochondrien lokalisiert sind. Von pflanzlicher Hexokinase ist die Bindung an
Einleitung
8
Membranen z. B. von Chloroplasten und Mitochondrien bekannt (WIESE et al., 1999, GALINA
et al., 1999;
DA-SILVA
et al., 2001). Durch solche Komplexe glykolytischer Enzyme wäre es
möglich, das gebildete Pyruvat direkt in die Mitochondrien zu leiten, wo es als Substrat für
die Respiration dient. Nicht nur durch Mikrokompartimentierung, sondern auch durch das
Vorkommen mehrerer Enzyme, die eine Reaktion katalysieren können, sowie durch das
Vorhandensein der glykolytischen Enzyme in zwei Kompartimenten der Zelle, dem Cytosol
und den Plastiden (DENNIS et al., 1997) erreicht der pflanzliche Stoffwechsel eine hohe
Flexibilität.
1.2.2 Das Enzym Aldolase
Bei der Aldolase handelt es sich um ein glykolytisches Enzym, das an vielen der
nachgewiesenen Interaktionen beteiligt ist. Es gibt Klasse-I- und Klasse-II-Aldolasen
(Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolasen,
E.C. 4.1.2.13),
die
wegen
der
fehlenden
Sequenzhomologie konvergent entstanden sein müssen (MARSH & LEBHERZ, 1992). Klasse-IAldolasen sind typisch für alle Tiere und höheren Pflanzen, Bakterien und Pilze haben
dagegen meist Klasse-II-Aldolasen. Es gibt jedoch auch einige Eukaryoten, die beide
Aldolase-Typen enthalten (PELZER-REITH et al., 1994). Bei den cytosolischen und
chloroplastidären Isoformen höherer Pflanzen handelt es sich um Klasse-I-Aldolasen, deren
Homologie auf dem Niveau der Aminosäuresequenz bei 54% liegt (PELZER-REITH et al.,
1993). Sie unterscheiden sich durch den Mechanismus der katalysierten Synthese oder
Spaltung von Fructose-1,6-bisphosphat von den Klasse-II-Aldolasen. Während Klasse-IIAldolasen Zn2+ oder Fe2+ als elektrophile Gruppe nutzen, zeichnen sich Klasse-I-Aldolasen
durch die Bildung einer Schiff´schen Base zwischen einer -Amino-Gruppe von Lysin im
katalytischen Zentrum und der Dihydroxyaceton-Einheit des Substrates aus. Das Enzym ist
ein Homo-Oligomer, das aus vier Untereinheiten besteht.
Im Chloroplasten ist Aldolase aktiv am Calvin-Zyklus beteiligt und katalysiert die
Aldolkondensation von Triosephosphaten zu Fructose-1,6-bisphosphat. Dagegen katalysiert
sie im Cytosol die Umkehrreaktion, durch die Fructose-1,6-bisphosphat in zwei
Triosephosphate (Dihydroxyacetonphosphat und Glycerinaldehyd-3-phosphat) gespalten wird
(s. Abb. 1.1). Wird die katalytische Aktivität einer Untereinheit des Aldolase-Tetramers
inhibiert, geht die gesamte Aktivität des Tetramers verloren. Dies weist auf die Existenz einer
Kommunikation zwischen den Untereinheiten hin (SYGUCH & BEAUDRY, 1997).
Die Aminosäuresequenz der anaerob induzierten Aldolase aus Mais wurde 1986 von KELLEY
und TOLAN veröffentlicht. Das aktive Zentrum von Kaninchen-Aldolase A liegt in einem
Einleitung
9
hochkonservierten Bereich des Proteins, das die Aminosäure Lys-229 einschließt, welche die
Schiff´sche Base mit dem Substrat bildet. In cytosolischer Mais-Aldolase befindet sich diese
Lysingruppe an Position 225. Auch die Aminosäuren, die mit den Phosphatgruppen des
Substrates an Position C-1 und C-6 interagieren, sind identifiziert worden und befinden sich
in einem hochkonservierten Bereich des Proteins.
Im Aldolase-Gen zeigt eine Sequenz aus 6 Basenpaaren, die sich an Position –70 in Bezug
zum Transkriptionsstart befindet, Homologie zu einer Unterregion des „anaerob induzierten
Steuerelements“ („anaerobic regulatory element“, ARE) des Alkohol-Dehydrogenase-Gens 1
(Adh1) aus Mais (DENNIS et al., 1988). Dieses ARE ist wichtig für die Induktion der Adh1mRNA (WALKER et al., 1987) und ist in einem weiteren anaerob exprimierten Gen, der
Saccharose-Synthase, zu finden (SPRINGER et al., 1986). Die Expression der Aldolase erfolgt
unter aeroben Bedingungen in geringem Maße und nimmt unter anaeroben Bedingungen zu
(KELLEY & FREELING, 1984a).
An vielen der im letzten Kapitel (s. Kap. 1.2.1) beschriebenen Protein-Protein-Interaktionen,
von denen die meisten für tierische Systeme beschrieben wurden, ist auch die Aldolase
beteiligt. Eine Interaktion zwischen den beiden glykolytischen Enzymen Aldolase und
GAPDH verhindert die Aldehyd-Diol-Umwandlung des Glycerinaldehyd-3-phosphats und
durch „channeling“ wird das Substrat von der Aldolase an GAPDH direkt weitergeleitet
(OVÁDI & KELETI, 1978). Durch die Interaktion zwischen Aldolase und Phosphofructokinase
und die Bildung eines Heterokomplexes wird die Kinase vor Inaktivierung geschützt (R
S
et
al., 2000).
Aldolase kommt, wie die meisten Enzyme, in löslicher und gebundener Form in Zellen vor
(PAGLIARO & TAYLOR, 1988). Von ARNOLD und PETTE wurde 1970 die Aktinbindung der
Aldolase beschrieben, die z. B. durch 1 mM FBP vollständig unterdrückt wird. Neben FBP
inhibieren u. a. auch anorganisches Phosphat, ATP, ADP, Glucose-1,6-bisphosphat, Fructose1-phosphat, Dihydroxyacetonphosphat sowie erhöhte Ionenstärke die Bindung. Keinen
Einfluss auf die Bindung tierischer Aldolase an Aktin zeigten Fructose-6-phosphat, Fructose2,6-bisphosphat, Ribose-5-phosphat und Glycerinaldehyd-3-phosphat (ARNOLD & PETTE,
1970; WANG et al., 1996).
Im Jahr 1976 zeigten CLARKE und MORTON, dass Aldolase mit F-Aktin und F-AktinTropomyosin identische Aggregate bildet, die eine Quervernetzung aufweisen. Die Strukturen
scheinen durch die Vernetzung nebeneinander liegender Filamente aufgetreten zu sein, was
auf mehrere Bindestellen der Aldolase für strukturelle Proteine hinweist. Von WANG et al.
(1996) wurde eine Stöchiometrie der Bindung von einem Aldolasemonomer an 25
Einleitung
10
Aktinmonomere beschrieben. Die Aktinbindung wird jedoch durch die vorhandene
Konzentration der Aldolase beeinflusst. So kommt es bei geringen Konzentrationen (1 µM)
zur Quervernetzung der Aktinfilamente, was in einem hoch vernetzten F-Aktin-AldolaseNetzwerk resultiert. Dagegen entstehen bei höheren Konzentrationen (3 µM) F-Aktinbündel
mit gebundener Aldolase höherer Dichte, die jedoch keine Quervernetzung zu einem dichten
Netzwerk aufweisen. Durch Inkubation der Aldolase mit Diethylpyrocarbonat, welches mit
den Histidinen des Enzyms reagiert, geht dem Enzym die Fähigkeit verloren, FBP zu binden.
Mit dem dadurch hervorgerufenen Verlust der Enzymaktivität geht auch die Bindekapazität
der Aldolase an Aktin verloren (DON & MASTERS, 1988). In Anwesenheit des Substrates FBP
kommt es zu einer Kompetition zwischen der Substrat- und Aktinbindung. Deshalb wird von
einer
Bündelung
der
aktinbindenden
Reste
um
das
katalytische
Zentrum
des
Aldolasemoleküls oder einer partiellen Überlappung der Bindestellen ausgegangen (WANG et
al., 1996; PAGLIARO & TAYLOR, 1988; KNULL & WALSH, 1992; O`REILLY & CLARKE, 1993).
Die Binderegion der Aldolase konnte mit Hilfe eines synthetischen Peptids identifiziert
werden. Sie weist eine Sequenzhomologie mit dem C-Terminus von Aktin sowie mit
identifizierten Aktinbinderegionen anderer Aktinbindeproteine, wie Gelsolin und Severin, auf
(O´REILLY & CLARKE, 1993). Auch pflanzliche Aldolasen weisen diese Sequenz auf (WINTER
& HUBER, 2000), die pro Aldolasemonomer einmal in der Sequenz auftritt. In Abb. 1.3 ist ein
Sequenzvergleich von 10 Aminosäuren des C-Terminus von cytoplasmatischem Aktin ( Aktin), der Aktinbinderegion von Kaninchen-Aldolase A (Muskel-Typ) und zwei Sequenzen
pflanzlicher cytosolischer Aldolasen (Arabidopsis thaliana und Zea mays) dargestellt.
-Aktin
Aldolase Kaninchen
Aldolase A. thaliana
Aldolase Z. mays
AS-Rest
363
34
30
30
D
D
D
D
E
E
E
E
S
S
S
S
Sequenz
G P S
T G S
T E T
T G T
I
I
I
I
V
A
G
G
H
K
K
K
R
R
R
R
Abb. 1.3: Sequenzvergleich der Aktin-Bindestelle tierischer und pflanzlicher Aldolase mit -Aktin. Dick
gedruckte Buchstaben zeigen identische Aminosäuren im Vergleich zur Aktin-Sequenz. Bei der Aldolase aus
Kaninchen handelt es sich um den Muskel-Typ. Abkürzung: AS = Aminosäure.
Bei der Untersuchung menschlicher Aldolase-Isoenzyme zeigte sich eine Gewebespezifität
der Aktinbindung (KUSAKABE et al., 1997). Diese deutet auf die Signifikanz der Bindung und
die große Bedeutung der Glykolyse hin. Die spezifische Assoziation der Aldolase am
Cytoskelett kann eine strukturelle Rolle im Cytoplasma spielen, den Stoffwechsel
Einleitung
11
kompartimentieren und/oder die Zellbewegung beeinflussen. Dies zeigt den wahrscheinlich
weit verbreiteten funktionalen Dualismus cytosolischer Enzyme (PAGLIARO & TAYLOR, 1992;
WANG et al., 1997; JEFFERY, 1999). Neben der Bindung an Aktin wurde auch eine Bindung an
ein weiteres Protein des Cytoskeletts, Tubulin, nachgewiesen (KARKHOFF-SCHWEIZER &
KNULL, 1987). Tubulin inhibiert die Aktivität der Aldolase (VOLKER & KNULL, 1993). Der
mit Aldolase interagierende Bereich befindet sich am C-Terminus von -Untereinheiten von
Tubulin und besteht aus 43 Aminosäuren (VOLKER & KNULL, 1997). Die Bindung an
Mikrotubuli scheint einen Kontrollmechanismus für die Enzymaktivität darzustellen (SRERE
& KNULL, 1998; VÉRTESSY et al., 1997).
1.3 Das pflanzliche Cytoskelett
Das Cytosol pflanzlicher und tierischer Zellen wird durch ein dreidimensionales Netzwerk
von filamentösen Proteinen, dem Cytoskelett, durchzogen. Es bietet eine räumliche
Organisation für Organellen, ein Gerüst für die Wanderung von Organellen und spielt eine
wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Zellform und der Zelldifferenzierung (TAIZ &
ZEIGER, 1999). Mit seiner großen Oberfläche und der Verknüpfung fast aller zellulären
Strukturen können Proteine oder andere cytoplasmatische Bestandteile daran binden, und
dadurch wird die Immobilisierung von cytoplasmatischen Komponenten möglich (JANMEY,
1998).
Das Cytoskelett von Pflanzenzellen setzt sich aus verschiedenen Komponenten zusammen:
Mikrotubuli,
Mikrofilamenten
und
Intermediärfilamenten.
Mikrotubuli
bestehen
aus
Polymeren des Proteins Tubulin, das sich aus Heterodimeren, dem -Tubulin und dem Tubulin zusammensetzt. Mikrofilamente bestehen aus globulärem Aktin (G-Aktin), einem
Protein, das man auch aus Muskelzellen kennt. Ein Mikrofilament besteht aus zwei Ketten
von
polymerisierten
Aktinmolekülen,
die
sich
helikal
umeinander
winden.
Intermediärfilamente setzen sich aus verschiedenen Proteinen zusammen. Zu den beteiligten
Proteinen gehört z. B. das Keratin, das in Blättern des Chinakohls gefunden wurde (YANG et
al., 1995). Intermediärfilamente sind weniger dynamisch als Mikrotubuli und Mikrofilamente
und
stellen
einen
Puffer
gegen
eine
mögliche
Deformierung
der
Zelle
dar
(CAROTHERS CARRAWAY, 2000). Auf Intermediärfilamente wird im Folgenden nicht weiter
eingegangen.
Für die Polymerisation von Mikrofilamenten wird ATP, für die von Mikrotubuli GTP
benötigt. Interaktionen zwischen Aktin und Mikrotubuli wurden in der Nähe der
Plasmamembran oder direkt daran beschrieben (LUNA & HITT, 1992; COLLINGS et al., 1998).
Einleitung
12
Die intrazelluläre Bewegung von Mitochondrien beruht in Pflanzen auf der Kontrolle durch
F-Aktin, ihre Positionierung im Cytoplasma auf F-Aktin und Mikrotubuli (VAN GESTEL et al.,
2002). Das Cytoskelett spielt auch eine Rolle in der Translation, durch die Positionierung von
Polysomen in der Zelle (DAVIES et al., 1991; ITO et al., 1994). Neben diesen Funktionen
erfüllt das Cytoskelett in Pflanzenzellen noch eine Vielzahl von Aufgaben in der
Wahrnehmung und Reaktion auf Signale wie Licht, Schwerkraft, Berührung, Pathogene und
Wundheilung (TAKAGI, 2000; BALU
KA
& HASENSTEIN, 1997; SEDBROOK et al., 1999;
FOISSNER et al., 1996). Bei der Cytokinese pflanzlicher und tierischer Zellen spielt das
Cytoskelett eine entscheidende Rolle. Das Präprophaseband sowie der Spindelapparat werden
aufgebaut. Ein Phragmoplast aus Mikrotubuli und Aktinfilamenten bildet sich in der
Äquatorialebene postmitotischer Pflanzenzellen und dehnt sich zentrifugal bis zur Zellwand
aus (BOWERMAN & SEVERSON, 1999).
1.3.1 Mikrotubuli
Die Organisation der pflanzlichen Mikrotubuli erfolgt nicht wie in tierischen Zellen mit Hilfe
von Centriolen, sondern über funktionell analoge „Mikrotubuli-organisierende Zentren“, die
viele Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAPs) enthalten, welche die kritische Konzentration
für die Polymerisation von Mikrotubuli herabsetzen.
Mikrotubuli bestehen aus Tubulin, dessen Molekülmasse 55 kDa beträgt. Kinesin und Dynein
können sich, in Abhängigkeit von der Polarität der Mikrotubuli, an diesem entlang bewegen
und sind am Gleiten der Mikrotubuli und dem Transport von Proteinen entlang den
Mikrotubuli beteiligt (NICK, 1999). Durch die Zellwand werden Mikrotubuli stabilisiert, was
auf die Existenz von Transmembranproteinen, die eine Verknüpfung zwischen Zellwand und
Mikrotubuli herstellen, hinweist. Die Verbindung zwischen Aktinfilamenten und der
Plasmamembran beruht auf der Anwesenheit und Organisation von corticalen Mikrotubuli
(COLLINGS et al., 1998).
1.3.2 Mikrofilamente
Bei Mikrofilamenten handelt es sich um Polymere des Proteins Aktin. Dieses kommt in einer
monomeren Form, dem G-Aktin, und als filamentöses Aktin, F-Aktin, vor. G-Aktin ist
benannt nach seiner globulären Form und hat ein Molekulargewicht von 42 kDa und einen
Durchmesser von 4 nm. Jede Aktin-Untereinheit (G-Aktin) ist in der Lage, ATP oder ADP zu
binden. Die Bindestelle dafür befindet sich im Verbindungsstück zwischen den zwei
Domänen des G-Aktins, der größeren C-terminalen und der kleineren N-terminalen Domäne.
Einleitung
13
Der hochkonservierte C-terminale Bereich von Aktin spielt bei der Schaffung des engen
Kontakts zwischen benachbarten Untereinheiten eine wichtige Rolle (DREWES & FAULSTICH,
1993). Aktin-Monomere verknüpfen sich unter physiologischen Bedingungen zu Filamenten,
die einen Durchmesser von 7 nm und eine helikale Struktur von 13-14 Untereinheiten pro
halber Drehung aufweisen. Bei der Aggregation von G- zu F-Aktin wird ATP gespalten; das
entstehende ADP bleibt am F-Aktin gebunden. Die Enden der Aktinfilamente unterscheiden
sich. Es gibt ein schnell wachsendes Plusende oder auch „barbed end“, an dem die
Polymerisation überwiegend erfolgt, und ein langsam wachsendes Minusende bzw. „pointed
end“. Die kritische Konzentration (CC) beschreibt die minimale Konzentration an G-Aktin,
die für die Zusammenlagerung zu F-Aktin notwendig ist. Für die beiden Enden des Filaments
bestehen unterschiedliche kritische Konzentrationen. Bei Maispollen beträgt die CC für die
Aktinpolymerisation in vitro 0,6 µM (REN et al., 1997), während nicht-pflanzliches Aktin eine
CC von 0,1 µM für das „barbed end“ und 0,5 µM für das „pointed end“ aufweist (HATANO,
1994). In Zellen erfolgt die Polymerisation des Aktin an besonderen Nukleationspunkten, die
mit Aktin-Bindeproteinen (ABPs) besetzt sind. Verändert sich die Filamentlänge durch
gleichzeitiges Binden von Aktinmonomeren am „barbed end“ und Dissoziieren am „pointed
end“ nicht, spricht man von „treadmilling“ (WEGNER, 1982).
Anders als in gestreiften Muskelzellen, in denen Aktin, Myosin und die assoziierten Proteine
in einer festen, parakristallinen Form arrangiert sind, ist die räumliche Organisation in den
meisten Nicht-Muskelzellen hoch variabel und flexibel (SCHLIWA, 1981). Die Änderungen
der auf Aktin basierenden Netzwerke erfolgen in Bruchteilen einer Sekunde und erlauben die
schnelle Anpassung an intrazelluläre und interzelluläre Reize. Eine wichtige Rolle in diesem
dynamischen Verhalten des Aktin-Cytoskeletts spielen ABPs, die neben der Fähigkeit, an
Aktin zu binden, auch Bindekapazität für verschiedene andere Moleküle besitzen. So
kontrollieren ABPs die Größe und Aktivität des G-Aktin-Pools, die subzellulären Orte der
Nukleation, die Rate des Filamentumsatzes und die Organisation der Mikrofilamente in höher
geordnete Strukturen (DE RUIJTER & EMONS, 1999; STAIGER, 2000; COOPER & SCHAFER,
2000). Eine Gruppierung der ABPs ist aufgrund ihrer Aktivitäten möglich. Die
Polymerisation und Depolymerisation der Aktinfilamente regulieren monomerbindende
Proteine (z. B. Profilin und Cofilin), indem sie G-Aktin binden und es so dem Aktinpool für
die Polymerisation entziehen. Einfluss auf den Filamentumsatz zeigt auch der „AktinDepolymerisations-Faktor“ (ADF), der bevorzugt an die ADP-Form von Aktin bindet und
damit die Dissoziation am „pointed end“ und Assoziation am „barbed end“ fördert (CARLIER
& PANTALONI, 1997; CHEN et al., 2000). Die Stabilisierung von Filamenten, die Bildung von
Einleitung
14
Netzwerken („crosslinking“) und die Bündelung von Aktinfilamenten zu parallelen Strukturen
erfolgen mit Hilfe von Proteinen, die an den Seiten der Aktinfilamente binden („side-binding
proteins“). In Pflanzen sind die „side-binding“-Proteine Fimbrin, Villin und EF-1 bekannt.
Die Möglichkeit, Untereinheiten am Filamentende zu binden oder zu lösen, sowie die
Spaltung von Aktinfilamenten kontrollieren „capping“- und „severing“-Proteine. Durch die
schon erwähnten Nukleations-Faktoren wird ein Kern von Aktin-Untereinheiten gebildet, der
die Polymerisation katalysiert. Motorproteine, wie das Myosin, ermöglichen Bewegungen
entlang der Filamente und nehmen Einfluss auf die Bewegung des Aktins.
Monomer-Bindeprotein
„capping“-Protein
„severing“-Protein
„side-binding“-Protein
Motor-Protein
„side-binding“-Protein
(„crosslinking“)
Abb. 1.4: Schematische Darstellung einiger Aktin-Bindeproteine.
Aktin-Bindeproteine können als Sensor dienen und stellen eine Verknüpfung zwischen
Signalen und der Umorganisation der cytoplasmatischen Architektur dar. An die
Plasmamembran assoziierte Aktin-Isoformen sind an der Signalübertragung beteiligt, die auf
dem Phosphoinositolweg basiert (TAN & BOSS, 1992). Mehrere Arbeiten zeigen einen
Einfluss des Aktin-Cytoskeletts auf die Proteinbiosynthese und die Verteilung von
Speicherproteinen (CLORE et al., 1996; WU et al., 1998; MUENCH et al., 1998; KLYACHKO et
al., 2000; AZAMA et al., 2003). Für Spitzenwachstum (PIERSON & CRESTI, 1992; BALU
KA
et
al., 2000), Wundheilung (FOISSNER et al., 1996) und intrazelluläre Bewegungen
(LICHTSCHEIDL & URL, 1990) ist das Aktin-Cytoskelett essentiell. Grundlage für das
cytoplasmatische Strömen, den Transport von Organellen wie Dictyosomen, Mitochondrien
und Vesikel, ist ein ausgedehntes F-Aktin-Netzwerk (WILLIAMSON, 1993; VOLKMANN &
BALU
KA,
1999).
Einleitung
15
1.4 Fragestellung
Für
die
Regulation
des
Stoffwechsels
eines
Organismus
bietet
sich
die
Mikrokompartimentierung an, durch die konkurrierende Stoffwechselwege in der Zelle
getrennt und Substrate durch „channeling“ effektiv weitergeleitet werden können. In
tierischen Muskelzellen ist dies ein bekanntes Phänomen. Unter anaeroben Bedingungen
erfolgt dort die Assoziation glykolytischer Enzyme an das Aktin-Cytoskelett zur gezielten
Energiebereitstellung für die Muskelkontraktion.
Pflanzen benötigen einen flexiblen Stoffwechsel zur Anpassung an Änderungen von
Umweltbedingungen (z. B. Lichtintensität, Sauerstoffmangel, Nährstoffangebot) und zur
optimalen
Nutzung
von
Nährstoffen,
um
überleben
zu
können.
Durch
Mikrokompartimentierung und Organisation von Enzymen an zellulären Strukturen könnte
eine gezielte Versorgung von zellulären Subkompartimenten mit der benötigten Energie
erfolgen.
Da die Aminosäure-Sequenz pflanzlicher Aldolase Homologie mit dem C-Terminus von
Aktin und bekannten Binderegionen anderer Aktin-Bindeproteine aufweist, sollte eine
mögliche Bindung der Aldolase an Aktin in vitro analysiert werden. Außerdem sollten mit
Hilfe eines Hefe-2-Hybrid-Systems bislang in Pflanzen unbekannte Protein-ProteinInteraktionen von Enzymen der Glykolyse untereinander sowie mit Bestandteilen des
Cytoskeletts gefunden werden. Als Vorausetzung dafür sollte im Rahmen dieser Arbeit ein
Hefe-2-Hybrid-System etabliert werden. Da eine Organisation der Glykolyse besonders unter
anaeroben Bedingungen an Bedeutung gewinnt, um die benötigte Energie bereitzustellen,
wurde die Suche nach interagierenden Enzymen auf Bedingungen unter Sauerstoffmangel
fokussiert.
Material und Methoden
16
2 Material und Methoden
2.1 Chemikalien und Materialien
Vertreiber, Firmensitz
Produkt(e)
Amersham Bioscience, Freiburg
ECL™ Western Blotting Detection Reagent
AppliChem, Darmstadt
Acrylamid/Bis-Acrylamid, ATP,
Coomassie-Brilliantblau G-250,
Coomassie-Brilliantblau R-250, DTTred,
EDTA, Essigsäure, Formamid, D(+)Glucose, Glycin, GSH, GSSG, Harnstoff,
H2O2, Imidazol, KCl, MgCl2, MOPS,
NAD+, NADPH, NaCl, NaOH,
Paraformaldehyd, D(+)-Saccharose,
TEMED, Trichloressigsäure, Tris,
Tween-20
Biometra, Göttingen
Whatman Chromatographie-Papier
Biomol, Hamburg
Homidiniumbromid
BioRad, München
SDS-PAGE-Standards, Ziege-AntiKaninchen IgG (H + L)-MeerrettichPeroxidase-Konjugat, Ziege-AntiKaninchen IgG (H + L)-AlkalischePhosphatase-Konjugat
Boehringer, Mannheim
Enzyme (GDH, TPI, Aldolase)
Clontech, Heidelberg
CHROMA SPIN+TE-400 Säulen,
MATCHMAKER Library Construction &
Screening Kit, Plasmid pGADT7-Rec,
Plasmid pGBKT7, Plasmid pGBKT7-Lam,
Plasmid pGBKT7-53, X- GAL
Cytoskeleton, Denver, CO, USA
Aktin
Diagonal, Münster
Ethanol, Petrischalen
Duchefa, Harlem, NL
Chloramphenicol
Fluka, Buchs, CH
Bromphenolblau, Essigsäure, HefeStickstoffbasis ohne Aminosäuren,
Methanol
Material und Methoden
17
Vertreiber, Firmensitz
Produkt(e)
GibcoBRL Life Technologies, Karlsruhe
Agar, Oligo-dT-Primer, Select Peptone,
SuperScript II Reverse Transkriptase, PfxPolymerase
IBA, Göttingen
Plasmid pASK-IBA3, Strep-TactinSepharose, Anhydrotetracyclin,
Hydrochlorid, Desthiobiotin
ICN Biomedical Inc., Aurora, OH, USA
Ammoniumpersulfat, SDS, Triton X-100
Invitrogen, Karlsruhe
Elektroporationsküvetten, Phalloidin,
Plasmid pRSET A
MBI Fermentas, St. Leon-Rot
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat
(BCIP), dNTPs, λ DNA/PstI, IPTG, 6 ×
Loading Dye Solution, DNA-Marker,
Nitro blau tetrazolium (NBT), Prestained
Protein Ladder ~10-180 kDa,
Restriktionsendonukleasen, Taq-DNAPolymerase, T4-DNA-Ligase, X-Gal
Merck-Schuchardt, Hohenbrunn
Merck-Wasser
Millipore/Waters, Erkrath
Centricon Konzentrierungsröhrchen,
MilliQ plus
New England Biolabs, Beverly, MA, Calf Intestinal Alkaline Phosphatase
USA
(CIAP), Protein Marker
Novagen, Madison, WI, USA
E. coli BL21(DE3)pLysS, Factor-Xa Kit,
Plasmid pET-16b
PE Biosystems, Foster City, CA, USA
ABI Prism®BigDyeTMTerminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit
Pharmacia, Uppsala, S
Chelating Sepharose , NAP-Säulen
Qiagen, Hilden
MinElute Gel Extraktion Kit, Plasmid
pDrive, QIAprep-spin-Kit, QIAquick PCRPurification Kit, QIAquick Gel Extraktion
Kit, RNeasy Plant Mini Kit,
Strep-tag Antikörper, Strep-Tactin
Superflow Resin Suspension
Material und Methoden
18
Vertreiber, Firmensitz
Produkt(e)
Riedel-de Haën, Seelze
CaCl2, Ethanol, HCl, H2O2, Isopropanol,
Kaliumacetat, Kaliumhexacyanoferrat (III),
KH2PO4, MgSO4, Natriumacetat,
Natriumcarbonat, NaH2PO4, NaOH,
Natriumthiosulfat, o-Phosphorsäure
Roth, Karlsruhe
Agar, Agarose NEEO für die
Elektrophorese, -Mercaptoethanol, BSA,
Dimethylformamid, Glycerin, Hefeextrakt,
Lithiumacetat, Pefabloc,
Phenol/Chlorophorm/Isoamylalkohol
(25:24:1), Roti-Mark 10-150, Trypton
Schleicher & Schuell, Dassel
Nitrocellulosemembranen, Sterilfilter
Serva, Frankfurt
Kanamycin, Tetrazyklin
Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Adeninhemisulfat, Aminosäuren, 4-Chloro-
Taufkirchen
1-Naphtol, D-Desthiobiotin, DEPC,
DMSO, DTTox, FBP, Fixierer, Glasperlen,
4-Hydroxy-Azo-Benzyl-2-Carboxylsäure,
Imidazol, Kodak BioMax MS-1 Film,
Kodak professionel HC 110 Entwickler,
Hühner-Eiweiß-Lysozym,
ß-Mercaptoethanol, MnCl2, NiSO4,
p-Nitrophenylphosphat, Oligonukleotide,
PMSF, Ponceau-S, Protease Inhibitor
Cocktail for Plants, PVPP,
Rubidiumchlorid, Silbernitrat
Stratagene, Heidelberg
E. coli XL1blue, Plasmid pBSK
USB, Cleveland, OH, USA
Ampicillin
Material und Methoden
19
2.2 Pflanzenmaterial: Anzucht und Ernte
Das in dieser Arbeit verwendete Pflanzenmaterial (Z. mays L., var. Caramba, Bundesanstalt
und Forschungszentrum für Landwirtschaft, Wien) lag allen Arbeiten zugrunde. Zur
Isolierung von RNA dienten in Klimakammern angezogene etiolierte, 8-10 Tage alte
Keimlinge, von denen die Wurzeln und der Spross geerntet und sofort in flüssigem Stickstoff
schockgefroren wurden. Vor der Aussaat wurden die Samen eine Nacht bei 4°C in Wasser
gequollen. Die Anzucht erfolgte in Schalen, die mit wasserdurchtränktem Zellstoff ausgelegt
waren, im Dunkeln bei 20°C. Um hypoxisches Gewebe herzustellen, wurden die Keimlinge
24 h vor der Ernte mit Flutungspuffer vollständig bedeckt.
Flutungspuffer:
5 mM Tris
pH 7,5 (HCl)
2.3 Molekularbiologische Methoden
2.3.1 Bakterien- und Hefestämme
Der folgenden Tabelle sind die in dieser Arbeit verwendeten Bakterien- und Hefestämme zu
entnehmen.
Tab. 2.1: Liste der verwendeten Stämme von Escherichia coli (E. coli) und Saccharomyces cerevisiae
(S. cerevisiae).
Stamm
Verwendung und genetische
Vertreiber
Referenz
Klonierungen
Stratagene,
BULLOCK
RecA1, endA1, gyrA96, thi-1,
Heidelberg
et al., 1987
Charakteristika
E. coli XL1blue
hsrdR17, supE44, relA1, lac,
[F’proAB, laclqZ∆M15Tn10
(tetr)]
E. coli
Heterologe Expression
Novagen,
STUDIER
BL21(DE3)pLysS
F-, ompT, hsdSB(rB-mB-) gal dcm
Madison, WI,
et al., 1990
(DE3) pLysS, Clmr
USA
Material und Methoden
Stamm
20
Verwendung und genetische
Vertreiber
Referenz
Clontech,
JAMES
Heidelberg
et al., 1996
“Bait“-Plasmid
Clontech,
HARPER
Hefe-2-Hybrid-System
Heidelberg
et al., 1993
Charakteristika
S. cerevisiae AH109
Prey -Plasmid
Hefe-2-Hybrid-System
MATa, trp1-901, leu2-3, 112,
ura3-52, his3-200, gal4∆,
gal80∆, LYS2::GAL1UASGAL1TATA-HIS3, GAL2UASGAL2TATA-ADE2,
URA3::MEL1UAS-MEL1TATAlacZ, MEL1
S. cerevisiae Y187
MATα, ura3-52, his3-200,
ade2-101, trp1-901, leu2-3,
112, gal4∆, met-, gal80∆,
URA3::GAL1UAS-GAL1TATAlacZ, MEL1
2.3.2 Plasmide
Als Vektoren wurden verschiedene Plasmide eingesetzt, die für die jeweilige Anwendung
unterschiedliche
Eigenschaften
besitzen.
Alle
verwendeten
Vektoren
und
ihre
charakteristischen Eigenschaften sind in Tab. 2.2 aufgelistet.
Tab. 2.2: Liste der verwendeten Plasmide.
Plasmid
Charakteristika
Firma
pBSK
Klonierungsvektor
Stratagene, Heidelberg
r
Amp , lacZ
pDrive
Klonierungsvektor
Qiagen, Hilden
Ampr, Kanr, lacZ, T7-Promotor
pET-16b
Proteinexpressionsvektor
r
Amp , T7-Promotor, lacI,
N-terminaler His-tag, Factor-Xa,
IPTG-Induktion, ~5,7 kb
Novagen, Madison, WI,
USA
Material und Methoden
21
Plasmid
Charakteristika
Firma
pRSET A
Proteinexpressionsvektor
Invitrogen, Karlsruhe
r
N-terminaler His-tag, Amp ,
Enterokinase-Schnittstelle,
T7-Promotor, IPTG-Induktion,
~ 2,9 kb
pASK-IBA3
IBA, Göttingen
Proteinexpressionsvektor
r
C-terminaler Strep-tag II, Amp ,
Tet-Promotor, ~ 3,3 kb
pGADT7-Rec
Hefe-Proteinexpressionsvektor
Clontech, Heidelberg
HA, LEU2, Ampr, GAL4AD,
~ 8,0 kb
pGBKT7
Hefe-Proteinexpressionsvektor
Clontech, Heidelberg
r
c-Myc, TRP1, Kan , Gal4(1147)DNA-BD,
pGADT7-RecT
~ 7,3 kb
Hefe-Proteinexpressionsvektor
Clontech, Heidelberg
SV40 Large T-antigen, HA,
LEU2, Ampr, ~ 8,0 kb
pGBKT7-53
Hefe-Proteinexpressionsvektor
Clontech, Heidelberg
Murein p53, c-Myc, TRP1,
Kanr, ~ 8,3 kb
pGBKT7-Lam
Hefe-Proteinexpressionsvektor
Clontech, Heidelberg
menschliches Lamin C, c-Myc,
TRP1, Kanr, ~ 7,9 kb
2.3.3 Arbeiten mit Nukleinsäuren
2.3.3.1 RNA-Isolierung aus Pflanzenmaterial
Die Isolierung von Gesamt-RNA aus Z. mays (L. var. Caramba) erfolgte mit dem „RNeasy
Plant Mini Kit“ der Firma Qiagen (Hilden) nach Herstellerangaben.
Die Lagerung der RNA erfolgte bei –20°C.
Material und Methoden
22
2.3.3.2 Denaturierendes Formaldehyd/Agarose-Gel (RNA-Gel)
Um isolierte RNA auf Verunreinigungen mit DNA zu untersuchen, wurde ein Aliquot der
RNA-Probe auf ein denaturierendes Formaldehyd/Agarose-Gel aufgetragen. Alle benötigten
Geräte wurden vor dem Gebrauch mit 3% H2O2 und anschließend mit Diethyl-PyrocarbonatWasser (DEPC-Wasser) gespült. Für das Gel wurden 1,5 g Agarose mit 72 ml DEPC-Wasser
und 10 ml 10 × MOPS/EDTA-Puffer aufgekocht. Nach dem Abkühlen wurden 18 ml
37%iges Formaldehyd zugegeben. Das Gel wurde nach dem Aushärten 5-10 min bei 4°C
inkubiert.
10 × MOPS/EDTA-Puffer:
200 mM MOPS
pH 7,0 (NaOH)
50 mM Natriumacetat
10 mM EDTA
mit DEPC-Wasser angesetzt und autoklaviert.
DEPC-Wasser:
0,1% Diethyl-Pyrocarbonat (DEPC) in H2Obidest gelöst und nach 1416 h Inkubation autoklaviert.
Die Denaturierung der RNA-Proben erfolgte nach Zugabe von
4 µl 10 × MOPS/EDTA-Puffer
7 µl 37% (v/v) Formaldehyd
20 µl Formamid
1 µl Homidiniumbromid (1 mg/ml)
zu 9 µl RNA-Probe (3-8 µg) durch Inkubation der Proben für 10 min bei 56°C. Vor und nach
der Inkubation wurden die Proben auf Eis gekühlt. Jede Probe wurde vor der
elektrophoretischen Auftrennung mit 4 µl RNA-Gelladepuffer gemischt. Nachdem die Proben
auf das Gel auftragen worden waren, wurden die Elektrophoresen bei 70 V in
1 × MOPS/EDTA-Puffer durchgeführt. Alle 30 min wurde der Puffer umgerührt, nach der
halben Laufstrecke wurde er erneuert.
RNA-Gelladepuffer: 50% (w/v) Glycerin
0,25% Bromphenolblau
1 mM EDTA, pH 8,0 (NaOH)
Material und Methoden
23
2.3.3.3 RNA-Quantifizierung
Die Bestimmung der RNA-Konzentration und ihrer Reinheit erfolgte photometrisch am
Uvikon 810 (Kontron Instruments, Mailand, Italien) bei zwei Wellenlängen (260 nm und
280 nm). Von der RNA-Lösung wurden hierfür 2 µl mit 998 µl DEPC-Wasser gemischt und
bei beiden Wellenlängen gemessen. Als Nullwert diente DEPC-Wasser. Mit folgenden
Formeln wurden Konzentration und Reinheit der Probe ermittelt:
•
RNA-Konzentration [CRNA(µg/µl)]:
CRNA =
E260 nm (Probe) × Verdünnungsfaktor × 40
1000
40 ist der RNA-Faktor (SAMBROOK et al., 1989).
•
Reinheit der Probe:
Reinheit =
E260 nm (Probe)
E280 nm (Probe) - E280 nm (H2Obidest )
Die Probe wird als rein bezeichnet, wenn der errechnete Wert zwischen 1,7 und 2,0 liegt.
Niedrigere Werte weisen auf eine Verunreinigung der RNA mit Proteinen und aromatischen
Substanzen (z. B. Phenol) hin.
2.3.3.4 DNA-Quantifizierung
Konzentrationen von DNA wurden ebenfalls photometrisch bei 260 nm gemessen. Es wurden
hierfür 3 µl DNA-Lösung zu 597 µl H2Obidest gegeben und gut gemischt. Der Nullabgleich
erfolgte mit 600 µl H2Obidest. Die Messungen wurden in Quarzküvetten durchgeführt, und die
DNA-Konzentration konnte mit folgender Formel berechnet werden:
•
DNA-Konzentration [CDNA(µg/µl)]
E260 nm (Probe) × Verdünnungsfaktor × 50
1000
50 ist der DNA-Faktor.
CDNA =
2.3.3.5 Oligonukleotide
Zur
Amplifikation
von
DNA-Fragmenten
durch
Polymerase-Kettenreaktion
werden
Oligonukleotide als Primer eingesetzt. Es handelt sich dabei entweder um kommerziell
erhältliche Standardprimer (z. B. T7-Promotor-Primer, Sp6-Promotor-Primer), die nahe der
multiplen Klonierungsstelle (MCS: multiple cloning site ) auf vielen Vektoren binden und
Material und Methoden
24
für Sequenzierungsreaktionen eingesetzt werden, oder um genspezifische Primer, die für diese
Arbeit konstruiert wurden und an einer definierten Stelle der zu amplifizierenden Sequenz
binden. Um gute Ergebnisse erzielen zu können, sollten Primer 15-30 Nukleotide lang sein.
Besitzt der Primer am 3’-Ende ein Guanin (G) oder Cytosin (C), bindet er durch die zwischen
diesen Nukleotiden sich ausbildenden drei Wasserstoffbrückenbindungen fester an die DNAVorlage („template ), als es bei einem Adenin (A) oder Thymin (T) der Fall ist. Der GCGehalt sollte bei 40-60% und die Schmelztemperatur (Tm) nach Möglichkeit zwischen 55 und
60°C liegen. Die Berechnung der Schmelztemperatur erfolgt nach der Wallace-Regel:
Tm = (A + T) × 2°C + (G + C) × 4°C
Eine Erhöhung der Spezifität der Primer kann erreicht werden, wenn Tripletts verwendet
werden, die für seltene Aminosäuren codieren und nur durch ein oder zwei Codons kodiert
werden können. Für eine Klonierung können den Primern Erkennungssequenzen für
Restriktionsendonukleasen angehängt werden. Weiterhin muss darauf geachtet werden, dass
sich keine Primer-Dimere zwischen den in der PCR eingesetzten Primern und keine Schleifen
(„loops , hairpins ) innerhalb der Primer ausbilden können.
Die in dieser Arbeit verwendeten Primer sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
Tab. 2.3: Liste der verwendeten Primer mit den zugehörigen Schmelztemperaturen. Schnittstellen für
Restriktionsendonukleasen sind durch Unterstreichung markiert. Die Abkürzung ALF steht hier für
Aldolase.
Name
Sequenz (5
3)
Schmelztemperatur
ALF8_Sense
GGG AAT TCC ATA TGT CGG CCT ACT GCG GAA AG
66°C
ALF_Antisense
NNN GGA TCC TCA GTA CTT GTA GTC CTT GAC GTG
70°C
AD_Insert-fife
GAT GAA GAT ACC CCA CCA AAC CC
70°C
AD-Insert3-antisense
AGA TGG TGC ACG ATG CAC AG
62°C
vdac sense2_Hyb
GGG AAT TCC ATA TGG TCG GGC CAG GCC TC
62°C
vdacpRSET-For
CGC GGA TCC ATG GTC GGG CCA GGC CTC
62°C
vdacpREST-Rev
CCG GAA TTC TCA GGG CTT GAG GGC CAC
60°C
Fw-seq-pASK-IBA
AGA GTT ATT TTA CCA CTC CCT
58°C
Rev-seq-pASK-IBA
GAC GCA GTA GCG GTA AAC G
60°C
T7-Promotor Primer
TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG
56°C
T7-Terminator
GCT AGT TCA TTG CTC AGC GG
62°C
Aktin_sense
CGC GGA TCC ATG GCT GAC GAG GAT ATC CAG C
68°C
Aktin_antisense
AAC TGC AGT TAG AAG CAC TTC ATG TGG ACA TTG
70°C
Material und Methoden
Name
25
Sequenz (5
3)
Schmelztemperatur
ALFStrepsense
ATG GTA CGT CTC AAA TGT CGG CCT ACT GCG GAA
76°C
AGT ACA
ALFStrepantisense
ATG GTA CGT CTC AGC GCT GTA CTT GTA GTC CTT
68°C
GAC GTG GA
Oligo-dT-Primer
Oligo T(35)-A
(PFL 007-009)
Oligo T(35)-C
-
OligoT(35)-G
SP6 Promotor Primer
CAT ACG ATT TAG GTG ACA CTA TAG
66°C
2.3.3.6 Synthese von cDNA
Bei dieser Methode wird mRNA in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Das dafür
notwendige Enzym, die Reverse Transkriptase, wurde von der Firma GibcoBRL
(„Superscript II Rnase H- Reverse Transcriptase“,
Karlsruhe)
bezogen.
Oligo-dT-Primer
(GibcoBRL, Karlsruhe) können an den Poly-A-Schwanz der mRNA binden. Mit Hilfe des
Enzyms entsteht ein erster Strang cDNA („first-strand cDNA“). Die Durchführung erfolgte
nach Herstellerangaben.
2.3.3.7 DNA-Amplifikation
2.3.3.7.1
Polymerase-Kettenreaktion
Ein bestimmter DNA-Bereich, der durch zwei begrenzende Oligonukleotide (Primer) definiert
ist, kann mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, „polymerase chain reaction )
vervielfältigt (amplifiziert) werden. Eine PCR-Reaktion läuft ab wie folgt: die Denaturierung
der DNA in ihre Einzelstränge, die anschließende Anlagerung der spezifischen Primer
(„Annealing ) und eine Verlängerungsphase („Extension ), bei der mit Hilfe einer
hitzestabilen DNA-Polymerase (z. B. Taq-DNA-Polymerase [Thermus aquaticus]), vom
Primer ausgehend, ein dem Matrizenstrang komplementärer DNA-Strang synthetisiert wird.
Durch Wiederholung der drei Schritte wird eine exponentielle Zunahme der gewünschten
DNA-Sequenz erreicht.
Material und Methoden
26
Ein Standard-PCR-Ansatz enthielt in einem Gesamtvolumen von 50 µl :
5 µl 10 × PCR Puffer
3 µl MgCl2 (25 mM)
1 µl dNTP (10 mM)
0,25 µl Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl)
10-50 pmol Sense-Primer
10-50 pmol Antisense-Primer
X µl DNA-„template (ca.10-400 ng)
Die PCR-Reaktionen wurden entweder in einem TRIO-Thermoblock TB 1 (Biometra,
Göttingen) oder im Mastercycler für PCR (Eppendorf, Hamburg) durchgeführt.
Für einige Amplifikationen von DNA-Fragmenten wurde aufgrund ihrer „proof-reading“Aktivität Pfx-DNA-Polymerase (GibcoBRL, Karlsruhe) nach Herstellerangaben genutzt, da
diese eine geringere Fehlerquote für den Einbau falscher Nukleinsäuren besitzt. Sie stammt
aus Pyrococcus sp. und ist vor allem bei DNA-Fragmenten von einer Länge über 1500 bp der
Taq-DNA-Polymerase vorzuziehen.
2.3.3.7.2
Reverse Transkriptase-PCR
Es besteht auch die Möglichkeit, die Synthese der „first-strand cDNA“ und die PCR in einem
Reaktionsansatz durchzuführen. Diese Reaktion nennt sich Reverse Transkriptase PCR (RTPCR) und ermöglicht Zeit- und Materialersparnis. Dabei wird eine PCR mit mRNA als
Matrize durchgeführt, jedoch nicht mit Primern, die an den Poly-A-Schwanz der mRNA
binden, sondern mit genspezifischen Primern. Die Primer binden sowohl bei der reversen
Transkription als auch in der nachfolgenden Amplifikation spezifisch an derselben Stelle der
RNA bzw. cDNA. Die RT-PCR-Reaktion muss in diesem Fall dem eingesetzten
Enzymgemisch aus Reverser Transkriptase und Taq-Polymerase angepasst werden und setzt
sich aus einem Zyklus zur cDNA-Synthese und der anschließenden PCR-Amplifikation
zusammen. Alle RT-PCR Reaktionen wurden mit dem „SuperScript One-Step RT-PCR
System“ von GibcoBRL (Karlsruhe) durchgeführt.
Material und Methoden
27
2.3.3.8 Reinigung von DNA-Fragmenten
Die Reinigung einer Probe von kleineren DNA-Bruchstücken (z. B. Primern) und Enzymen
(Polymerasen, Restriktionsendonukleasen) nach einer PCR oder einem Restriktionsverdau
erfolgte mit Hilfe des „QIAquick PCR-Purification Kit“ (Qiagen, Hilden). Die Reinigung
wurde analog zum Herstellerprotokoll durchgeführt. Eine Lagerung der gereinigten DNA ist
bei –20°C möglich.
2.3.3.9 DNA-Fällung
Um DNA-Lösungen umzupuffern, zu reinigen oder die Konzentration der Lösung zu erhöhen,
wurde DNA gefällt. Dabei wird durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 4,8)
und 3 Volumina 100%igem Ethanol die DNA gefällt und durch Zentrifugation (15 min,
15800 × g, 4°C) pelletiert. Das Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen und nach
erneuter Zentrifugation an der Luft getrocknet. Anschließend konnte es im gewünschten
Volumen H2Obidest oder Puffer (TE-Puffer, Qiagen, Hilden) gelöst werden.
2.3.3.10 DNA-Restriktion
Doppelsträngige
DNA kann mit
Hilfe
von spezifischen Restriktionsendonukleasen
(Restriktionsenzymen) geschnitten werden. Gemeinsame Eigenschaft der Restriktionsenzyme
ist die Erkennung einer spezifischen DNA-Sequenz und das Schneiden der DNA. Hierbei
können sogenannte „klebrige“ Enden („sticky ends“) oder „glatte“ Enden („blunt ends“) durch
das Enzym erzeugt werden. Durch die DNA-Restriktion wurden DNA-Fragmente und
Vektoren für eine Ligation vorbereitet und Klonierungen analysiert. Das Schneiden linearer
oder ringförmiger DNA wurde nach dem Protokoll des Herstellers des Restriktionsenzyms
(MBI Fermentas, St. Leon-Rot) durchgeführt.
Standardansatz:
1 µg DNA
2/5 µl 10 × Restriktionspuffer
1-5 U Restriktionsendonuklease
auf 20/50 µl mit H2Obidest auffüllen und mindestens 1 h bei 37°C
inkubieren. Die Inaktivierung der Restriktionsenzyme erfolgte durch Hitzebehandlung, bei der
sich Temperatur und Zeit nach den Herstellerangaben für das eingesetzte Restriktionsenzym
richteten.
Material und Methoden
28
Tab. 2.4: Liste der verwendeten Restriktionsendonukleasen.
Restriktionsendonuklease
Erkennungssequenz
Bam HI
G’GA TCC
BsmB I
C’GT CTC N
Eco RI
G’AA TTC
Eco 31I
G’GT CTC N
Hind III
A’AG CTT
Nde I
CA’T ATG
Pst I
CTG CA’G
Xba I
T’CT AGA
Alle Restriktionsendonukleasen stammten von der Firma MBI Fermentas, St. Leon-Rot. Der Strich in der
Erkennungssequenz kennzeichnet die Stelle, an der die DNA durch das Enzym durchtrennt wird.
2.3.3.11 DNA-Ligation
Durch die Ligation mit Hilfe des Enzyms T4-DNA-Ligase werden doppelsträngige DNAFragmente miteinander verknüpft. Dabei werden „glatte“, oder „klebrige“ Enden von DNAFragmenten, die mit demselben Restriktionsenzym geschnitten wurden, durch die Bildung
einer Phosphodiesterbindung zwischen einem 3`-OH-Ende und dem passenden 5`Phosphatende ligiert. So ist es möglich, in ein Plasmid ein DNA-„Insert (z. B. eine für ein
Gen kodierende Nukleotidsequenz) zu integrieren. Durch ein molares Verhältnis zwischen
Vektor- und DNA-„Insert -Molekülen von eins zu drei wird eine optimale Insertion erreicht,
wenn beide Moleküle etwa gleich groß sind. Die Ligation wurde mit T4-DNA-Ligase (MBI
Fermentas, St. Leon-Rot) nach Herstellerangaben durchgeführt.
20 µl-Ansatz:
X
µl geschnittener Vektor
X
µl „Insert
1,5 µl T4-DNA-Ligase ( 5 U/µl, MBI Fermentas, St. Leon-Rot)
2
µl 10 × Puffer (MBI Fermentas, St. Leon-Rot)
X
µl H2Obidest
Durch die Inaktivierung der Ligase bei 65°C für 10 min wurde die Ligasereaktion beendet.
•
Formel zur Berechnung der einzusetzenden Vektor- und „Insert -Mengen für eine
Ligation:
ng Vektor × kb " Insert" 3
× = g " Insert"
kb Vektor
1
Material und Methoden
29
2.3.3.12 Vektordephosphorylierung
Um bei einer Ligation die Religation eines geschnittenen Vektors zu verhindern, wurde die
geschnittene, gereinigte Vektor-DNA durch Alkalische-Phosphatase (CIAP, New England
Biolabs (NEB), Beverly, MA, USA) dephosphoryliert.
50 µl Ansatz: 30-50 ng Vektor-DNA
5 µl 1 × NEB-Puffer (New England Biolabs, Beverly, MA, USA)
0,015-0,025 U Alkalische-Phosphatase
X µl H2Obidest
Der Ansatz wurde 1 h bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde anschließend durch
20 minütige Erhitzung auf 65°C gestoppt.
2.3.3.13 Anhängen eines Adenin-Überhangs an ein PCR-Fragment
Soll ein PCR-Fragment in den Vektor pDrive (Qiagen, Hilden) kloniert werden, wird am
amplifizierten Fragment ein Adenin-Überhang (A-Überhang) benötigt. Dieser kann dann an
den
Uracil-Überhang
(U-Überhang)
des
linearisierten
Vektors
binden.
Taq-DNA-
Polymerasen hängen durch ihre terminale Transferase-Aktivität automatisch ein Adenin an
das 3´-Ende von glatten, doppelsträngigen PCR-Fragmenten. Mit Pfx-DNA-Polymerase
amplifizierten Fragmenten fehlt jedoch dieser A-Überhang und muss in einer zusätzlichen
Reaktion angehängt werden.
100 µl Ansatz:
1 µg DNA-Fragment
1 µl dATP (20 mM)
2,5 U Taq-DNA-Polymerase
10 µl 10 × PCR-Puffer
auf 100 µl mit H2Obidest auffüllen
Der gut gemischte Reaktionsansatz wurde 30 min bei 72°C inkubiert.
2.3.3.14 DNA-Sequenzanalyse
Sequenzanalysen zur Identifizierung von cDNA-Klonen und zur Kontrolle von Klonierungen
wurden mit der Didesoxy-Kettenabbruch-Methode (SANGER et al., 1977) durchgeführt.
Während einer speziellen PCR mit standardisierten Oligonukleotid-Primern (z. B. T7- oder
Sp6-Promotor-Primer, T7-Terminator) oder individuell hergestellten Primern wurden
fluoreszierende Didesoxynukleotide, die einen Kettenabbruch hervorrufen, eingesetzt. Die
Sequenzierungs-PCR erfolgte mit dem „ABI Prism®BigDyeTMTerminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kit“ (PE Biosystems, Foster City, CA, USA).
Material und Methoden
Sequenzierungs-PCR-Ansatz:
30
4 µl „Ready Reaction Mix
10 pmol Primer
0,4-0,8 µg DNA-„template
der PCR-Ansatz wurde mit Merck-Wasser auf 15 oder 20 µl Endvolumen aufgefüllt und
dunkel gehalten.
Sequenzierungs-PCR-Programm:
96°C 1 min
96°C 30 s
50°C 15 s
30 Zyklen
60°C 4 min
60°C 5 min
10°C
Deckelheizung 105°C
Durch eine Fällung wurde die amplifizierte DNA von nicht eingebauten Nukleotiden
gereinigt.
Die
Auswertung
der
Sequenzen
erfolgte
mit
dem
ABI Prism®
Sequenzierungsautomaten (PE Biosystems, Foster City, USA) durch Ulrike Coja in der
Abteilung Spezielle Botanik der Universität Osnabrück. Dabei werden die Produkte der
Sequenzierungs-PCR über ein Gel elektrophoretisch aufgetrennt und mit einem Laser
abgetastet. Die daraus ermittelte Nukleotidsequenz wurde mit dem Computerprogramm
Chromas (Version 1.43) aufgearbeitet.
2.3.3.15 Agarose-Gelelektrophorese und Gelextraktion
Zur Auftrennung, Identifizierung und Reinigung von DNA-Molekülen dient die AgaroseGelelektrophorese, die in horizontalen Gelen (10 × 10 × 1 cm) mit 0,5 × TBE als Laufpuffer
durchgeführt wurde (SAMBROOK et al., 1989). Die gewählte Agarose-Konzentration richtete
sich hierbei nach der Größe der aufzutrennenden Nukleotidfragmente. Als Größenstandard
wurde z. B. PstI-geschnittene Lambda-DNA (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) verwendet.
Zur Extraktion von DNA-Fragmenten aus dem Agarosegel wurde das „QIAquick Gel
Extraction Kit“ oder „Min Elute Gel Extraction Kit“ (Qiagen, Hilden) genutzt.
Material und Methoden
31
2.3.3.16 Klonierungen
2.3.3.16.1
Klonierung von ALD_pET-16b
Für die heterologe Expression rekombinanter Mais-Aldolase (GenBank Acc. Nr.: M16220.1)
wurde mit den Primern ALF8_sense und ALF_Antisense eine RT-PCR angesetzt.
Reaktionsansatz:
25 µl 2 × „Reaction Mix“ (GibcoBRL, Karlsruhe)
1 µg RNA
10 µM ALF8_Sense
10 µM ALF_Antisense
1 µl RT-Taq Polymerase
X µl H2Obidest
Das Reaktionsvolumen betrug 50 µl.
PCR-Programm:
50°C 30 min
94°C 2 min
94°C 15 s
61°C 30 s
40 Zyklen
72°C 2 min
72°C 10 min
4°C
Das PCR-Produkt wurde über ein Agarosegel aufgereinigt, mit den Restriktionsenzymen
Nde I und Bam HI geschnitten und mit dem „PCR Purification Kit“ (Qiagen, Hilden) von
Nukleotiden gereinigt. Der Vektor pET-16b wurde ebenfalls mit den Restriktionsenzymen
Nde I und Bam HI geschnitten und über ein Agarosegel gereinigt.
Nach der Ligation des geöffneten Vektors mit dem geschnittenen PCR-Produkt („Insert )
wurden chemisch kompetente Zellen (E. coli XL1blue) mit der Hälfte des 1:5 mit H2Obidest
verdünnten Ligationsansatzes transformiert. Von einigen der gewachsenen Kolonien wurden
Übernachtkulturen angesetzt, um Plasmidisolierungen durchzuführen. Mit Hilfe von
Restriktionsverdau der Plasmide wurden Plasmide mit einem „Insert in der passenden Größe
identifiziert. Von einem positiven Klon wurde eine Glycerinkultur angelegt und zur
genaueren Identifizierung eine Sequenzierung durchgeführt. Dieser Klon wurde zur
heterologen Expression in E. coli BL21(DE3)pLysS transformiert.
Material und Methoden
2.3.3.16.2
32
Klonierung von ALD_pGBKT7
Der ALD_pET-16b Klon diente als Ausgangsmaterial für die Klonierung der Aldolase in den
Vektor pGBKT7. Da die Schnittstellen so gewählt waren, dass mit ihnen in beide Vektoren
kloniert werden konnte, wurde das „Insert
aus dem pET-16b Plasmid mit den
Restriktionsenzymen Nde I und Bam HI herausgeschnitten, über ein Agarosegel gereinigt und
in den ebenfalls mit Nde I und Bam HI geöffneten und gereinigten Vektor pGBKT7 ligiert.
Nach der Transformation in E. coli XL1blue wurden auch hier die Plasmide isoliert,
geschnitten und mit Hilfe eines Agarosegels analysiert. Positive Klone wurden anschließend
ansequenziert.
2.3.3.16.3
Klonierung von ALD_pASK-IBA3
Für die Klonierung der Mais-Aldolase in den Vektor pASK-IBA3 wurde mit Pfx-Polymerase
eine PCR mit dem Plasmid ALD_pET-16b angesetzt.
Reaktionsansatz (50 µl):
5 µl 10 × Pfx-PCR Puffer
1,5 µl dNTP-Mix (10 mM)
1 µl MgSO4 (50 mM)
50 pmol Primer ALFStrepsense
50 pmol Primer ALFStrepantisense
1 µl „template“ (Plasmid)
1,5 µl Pfx-Polymerase (2,5 U/µl)
0 µl/ 5 µl/ 10 µl Enhancer Solution
X µl H2Obidest
PCR-Programm:
94°C 2 min
94°C 15 s
68°C 30 s
35 Zyklen
72°C 1 min
72°C 8 min
10°C
Die PCR-Produkte wurden gereinigt und für die Ligation in pDrive mit einem A-Überhang
versehen (s. Kap. 2.3.3.13). Nach einer weiteren Reinigung wurde das PCR-Fragment in
pDrive ligiert und in E. coli XL1blue transformiert. Mit Hilfe der Blau-Weiß-Selektion
wurden von vermutlich positiven Kolonien Übernachtkulturen (s. Kap. 2.3.4.1) angesetzt und
nach Plasmidisolation durch einen Restriktionsverdau mit der Restriktionsendonuklease
Eco RI analysiert. Ein positiver Klon wurde sequenziert. Das nach einem Restriktionsverdau
Material und Methoden
33
mit dem Enzym Bsm BI ausgeschnittene „Insert
wurde in den mit Eco 31I und Pst I
geschnittenen Vektor pASK-IBA3 ligiert und in E. coli XL1blue transformiert. Positive
Klone wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert und mit den Primern Fw-seq-pASKIBA und Rev-seq-pASK-IBA sequenziert.
2.3.3.16.4
Klonierung von VDAC_pRSET A
Für die Klonierung von VDAC aus Mais (Z. mays L., Acc. Nr.: AF178950.1) wurde mit den
Oligonukleotiden vdac_pRSET-For und vdac_pRSET-Rev eine PCR mit cDNA als
„template angesetzt. Das 830 bp lange Produkt dieser PCR wurde in pDrive kloniert, durch
Restriktionsverdau mit Bam HI und Eco RI analysiert und für die Klonierung in den Vektor
pRSET A
vorbereitet.
Der
Vektor
wurde
ebenfalls
mit
diesen
beiden
Restriktionsendonukleasen geschnitten und dephosphoryliert, um eine Religation zu
verhindern. Die gereinigten DNA-Fragmente wurden in den Vektor ligiert. Nach der
Transformation in E. coli XL1blue konnten wieder durch Restriktionsanalysen positive Klone
identifiziert werden. Davon wurden Glycerinkulturen angelegt. Durch Sequenzanalysen
wurden die Konstrukte überprüft.
PCR-Programm:
94°C 2 min
94°C 15 s
75°C 30 s
35 Zyklen
72°C 1 min
72°C 8 min
10°C
Für
Überexpressionsversuche
wurde
E. coli BL21(DE3)pLysS transformiert.
das
Konstrukt
VDAC_pRSET A
in
Material und Methoden
2.3.3.16.5
34
Klonierung von VDAC_pGBKT7
Mit den Primern vdac sense2_Hyb und vdacpRSET-Rev wurde eine PCR mit cDNA als
„template“ angesetzt. Die PCR entsprach einer Standard-PCR, wobei jedoch die Primer in
einer Konzentration von 100 pmol eingesetzt wurden. Die Temperatur der PCR wurde auf
55°C optimiert.
PCR-Programm:
94°C 2 min
94°C 15 s
55°C 30 min
35 Zyklen
72°C 5 min
10°C
Das über ein Agarosegel gereinigte PCR-Produkt wurde zunächst in pDrive kloniert und in
E. coli XL1blue transformiert. Ein Klon mit einem Plasmid mit „Insert
in der
entsprechenden Größe wurde sequenziert. Das „Insert wurde mit den Restriktionsenzymen
Nde I und Eco RI herausgeschnitten und in den ebenfalls mit diesen Enzymen geöffneten,
dephosphorylierten
Vektor
pGBKT7
ligiert.
Nach
erfolgter
Transformation
in
E. coli XL1blue und Plasmidisolierung erfolgte die Identifizierung positiver Klone über
Restriktionsanalysen und eine Ansequenzierung.
2.3.3.16.6
Klonierung von Aktin_pGBKT7
Bei den PCRs zur Amplifizierung von Aktin aus Mais (Z. mays L., Acc. Nr.: J01238) wurde
versucht, durch Optimierung der MgCl2-Konzentration ausreichende Mengen an PCRProdukt zu erhalten. Da trotz der Optimierungsversuche die amplifizierten DNA-Mengen sehr
gering blieben, wurden 15 Standard-PCR-Reaktionen mit den Primern Aktin_sense und
Aktin_antisense (je 10 pmol) angesetzt. Die Produkte dieser PCR-Reaktionen wurden
vereinigt und mit Hilfe des „MinElute Gel Extraktion Kit“ (Qiagen, Hilden) gereinigt. Von
dieser Probe wurde die maximal mögliche Menge (13,5 µl) in einen 20 µl Ligationsansatz mit
pDrive eingesetzt. Mit Hilfe der Blau-Weiss-Selektion wurde nach der Transformation in
E. coli XL1blue nach positiven Transformanden gesucht. Die nach Restriktionsanalyse
identifizierten drei positiven Klone wurden als Glycerinkulturen angelegt und ansequenziert.
Material und Methoden
35
Mit den Enzymen Pst I und Bam HI wurde dann ein Restriktionsverdau mit dem Vektor
pGBKT7 und den pDrive-Plasmiden mit „Insert
angesetzt. Die Reinigung der DNA nach
dem Restriktionsverdau wurde mit dem „MinElute Gel Extraction Kit“ (Qiagen, Hilden)
durchgeführt. Nach Ligation und Transformation in E. coli XL1blue wurden durch
Restriktionsanalysen und Sequenzierungen positive Klone gesucht.
PCR-Programm:
94°C 2 min
94°C 15 s
61°C 30 min
35 Zyklen
72°C 5 min
10°C
2.3.4 Arbeiten mit Bakterien
2.3.4.1 Bakterienkulturen
Die
für
molekularbiologische
und
biochemische
Untersuchungen
verwendeten
Bakterienstämme wurden auf verschiedene Art und Weise kultiviert. Übernachtkulturen
dienten zur Plasmidisolierung aus Bakterien sowie als Vorkultur für die Herstellung größerer
Mengen von Flüssigkulturen. Zum Vereinzeln von Bakterienkulturen sowie zur Vermehrung
aus Glycerinkulturen wurden Bakterien auf Agarplatten kultiviert. Glycerinkulturen dienten
der Lagerung.
Übernachtkultur:
In
einem
Reagenzglas
wurden
3-5 ml
YT-Flüssigmedium
mit
dem
gewünschten
Bakterienstamm inokuliert. Die Bakterien konnten von einer Einzelkolonie auf einer
Plattenkultur oder aber aus einer Glycerinkultur stammen und wurden mit Hilfe eines sterilen
Zahnstochers übertragen. Bei 37°C erfolgte die Anzucht unter aeroben Bedingungen
(Schüttler, ca. 200 Upm) für 16-18 h.
Plattenkultur:
Die Zellen wurden hierfür mit einer Impföse oder einem Drygalski-Spatel auf einer Platte mit
YT-Festmedium
ausgestrichen.
Dabei
variierte
die
Menge
der
ausplattierten
Bakteriensuspension zwischen 10 und 100 µl. Wenn die vorhandene Flüssigkeit vollständig in
die Platte eingezogen war, wurden die Agarplatten mit der Unterseite nach oben, um
Kondenswasserablagerung auf dem Medium zu vermeiden, bei 37°C im Brutschrank 16-18 h
inkubiert.
Material und Methoden
36
Glycerinkultur:
Bakterien in mit Glycerin versetztem Medium können bei –70°C eingefroren und über
mehrere Monate gelagert werden. Für die Herstellung einer Glycerinkultur wurden 50% (v/v)
Bakterien-Flüssigkultur mit 50% (v/v) Glycerinmedium gemischt und in flüssigem Stickstoff
eingefroren. Die Lagerung erfolgte bei –70°C.
Alle Medien wurden vor der Verwendung sterilautoklaviert (20 min, 121°C, 1 bar) und, wenn
möglich, mit einem Selektionsmarker in Form eines Antibiotikums versetzt. Mit Hilfe der
Selektionsmarker ist es möglich, Kontaminationen zu verhindern und auf die Anwesenheit
eines Plasmids in den E. coli-Stämmen zu selektionieren. Die in dieser Arbeit verwendeten
Antibiotika sind in Tabelle 2.5 aufgeführt.
YT-Medium:
8
g/l Bacto-Tryptone
5
g/l Hefeextrakt
pH 7,0 (NaOH)
2,5 g/l NaCl
15
Glycerinmedium:
g/l Agar (für Festmedium)
20% YT-Medium
80% Glycerin
Tab. 2.5: Verwendete Antibiotika und ihre Konzentrationen.
Antibiotikum
Stammlösung
Endkonzentration
Ampicillin (Amp)
100
mg/ml in 50% Ethanol*
100-200 µg/ml
Tetrazyclin (Tet)
5
mg/ml in 50% Ethanol*
10 µg/ml
Kanamycin (Kan)
50
mg/ml in sterilem H2O*
25 µg/ml
Chloramphenicol (Clm)
12,5 mg/ml in 50% Ethanol**
25 µg/ml
*sterilfiltriert, Aufbewahrung bei - 20°C **Aufbewahrung bei + 4°C
2.3.4.2 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen
Zellen, die in der Lage sind, DNA aufzunehmen, bezeichnet man als kompetent. Die beiden
verwendeten Methoden zur Herstellung chemisch und elektrisch kompetenter Zellen sind im
Folgenden beschrieben.
Material und Methoden
37
a) Chemisch kompetente E. coli-Zellen
Die Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Zellen durch Behandlung mit Rubidiumchlorid
erfolgte nach der Methode von HANAHAN (1983). Mit einer Übernachtkultur mit Tetrazyclin
für E. coli XL1blue und Chloramphenicol für E. coli BL21(DE3)pLysS wurden 100 ml YTMedium ohne Antibiotikum im Verhältnis 1:100 angeimpft und bis zu einer optischen Dichte
von A600 = 0,5, gegen H2Obidest gemessen, angezogen und anschließend durch Zentrifugation
(10 min, 5000 × g, 4°C) geerntet. Die Zellen wurden zunächst in 30 ml TFB1-Lösung
vorsichtig resuspendiert und anschließend 5-10 min auf Eis inkubiert. Nach erneuter
Zentrifugation wurden die Zellen in 4 ml gekühlter TFB2-Lösung resuspendiert und in
200 µl-Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei
–70°C gelagert.
TFB1-Lösung:
100 mM RbCl2
pH 5,8 (Essigsäure)
50 mM MnCl2
30 mM Kaliumacetat
10 mM CaCl2
15% (v/v) Glycerin
TFB2-Lösung:
75 mM CaCl2
pH 7,0 (NaOH)
10 mM MOPS
10 mM RbCl2
15% (v/v) Glycerin
Die Kompetenz der Zellen zur DNA-Aufnahme wurde mit Hilfe eines Kompetenztests
quantifiziert. Dafür wurden 200 µl kompetenter Zellen mit 40 ng Plasmid-DNA (pBSK)
transformiert (s. Kap. 2.3.4.3). Von diesem Transformationsansatz wurden 10 µl, 50 µl und
100 µl auf selektiven Agarplatten ausplattiert und 16-18 h bei 37°C inkubiert. Bei einer gut
bewachsenen Platte wurden die Kolonien ausgezählt. Die Transformationseffizienz (Te)
wurde mit folgender Formel berechnet.
Te = gezählte Kolonien ×
1000 ng
×
eingesetzte DNA-Menge
Die Zellen zeigen eine gute Kompetenz zur
Vol gesamt
Vol ausplattiert
Aufnahme von DNA,
Transformationseffizienz zwischen 1×106 und 1×107 liegt.
wenn die
Material und Methoden
38
b) Elektrisch kompetente E. coli-Zellen
Die Herstellung elektrisch kompetenter E. coli-Zellen erfolgte in Anlehnung an das
„Electroporator II Manual“ (Invitrogen, Karlsruhe). Um E. coli-Zellen elektrisch kompetent
zu machen, wurden 50 ml selektives LB-Medium mit E. coli XL1blue angeimpft und über
Nacht bei 37°C im Schüttler (ca. 200 Upm) angezogen. Mit dieser Übernachtkultur wurde
1 Liter selektives LB-Medium angeimpft und bis zu einer optischen Dichte von A550 = 0,5-0,6
angezogen. Die Kultur wurde auf vorgekühlte Zentrifugenbecher verteilt und 30 min auf Eis
inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation (15 min, 4000 × g, 0°C)
geerntet. Das Zellpellet wurde in vier Schritten (25 ml + 25 ml + 50 ml + 150 ml) in
insgesamt
250 ml
sterilem,
kaltem
H2Obidest
resuspendiert.
Zwischen
den
Resuspensionsschritten wurden die Zellen auf Eis aufbewahrt. Nach erneuter Zentrifugation
wurden die Zellen in insgesamt 125 ml kaltem H2Obidest resuspendiert (25 ml + 50 ml + 50 ml)
und anschließend noch einmal durch Zentrifugation pelletiert. Mit einer gekühlten Glaspipette
wurde das Pellet in 20 ml steriler 10%iger Glycerinlösung resuspendiert. In sterilen
Zentrifugenbechern aus dem Gefrierschrank (- 20°C) wurden die Zellen noch einmal
zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet in 4 ml 10 %iger Glycerinlösung aufgenommen.
Diese Zellsuspension wurde in 80 µl Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur
Verwendung bei –70°C gelagert.
LB-Medium:
10 g/l Select Pepton
pH 7,5 (NaOH)
5 g/l Hefeextrakt
5 g/l NaCl
2.3.4.3 Transformation von E. coli-Zellen
Bei der Transformation wird freie, ringförmige DNA von einer Zelle aufgenommen. Die
beiden verwendeten Methoden der Transformation chemisch und elektrisch kompetenter
Zellen sind im Folgenden beschrieben.
a) Transformation chemisch kompetenter E. coli-Zellen
Chemisch kompetente E. coli-Zellen (100 µl) wurden 20 min auf Eis aufgetaut, mit bis zu
1 µg Plasmid-DNA oder einem fünffach verdünnten Ligationsansatz gemischt und 30 min auf
Eis inkubiert. Es folgte ein Hitzeschock bei 42°C für 90 s (E. coli XL1blue) bzw. 20 s
(E. coli BL21(DE3)pLysS), an den sich eine Inkubation von 1-2 min auf Eis anschloss. Zu
den Zellen wurden dann 1000 µl nicht selektives Flüssigmedium gegeben; die Zellen wurden
Material und Methoden
39
zur Regeneration für 1-2 h bei 37°C aerob angezogen. Anschließend wurden 10 µl, 50 µl und
100 µl auf selektiven Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37°C kultiviert.
b) Transformation elektrisch kompetenter E. coli-Zellen
Diese Methode diente der Transformation von E. coli-Zellen mit aus Hefen isolierten
Plasmiden. Hierbei wird die Plasmamembran der Zellen durch Anlegen einer Spannung
kurzzeitig depolarisiert und so für DNA durchlässig. Für die Elektroporation wurden
Elektroporationsküvetten (0,1 cm, Invitrogen, Karlsruhe) vorgekühlt. Auf Eis aufgetaute
elektrisch kompetente E. coli-Zellen wurden mit 20 µl aus Hefen isolierter Plasmid-DNA (s.
Kap. 2.3.5.3) gemischt und in die Küvetten gegeben.
Im Elektroporater (Gene PulserTM, Bio-Rad, München) wurden die Zellen bei folgenden
Einstellungen der elektrischen Spannung ausgesetzt:
Kapazität:
25 F
Widerstand:
200 Ω
Volt:
1,25 V
Zeit:
konstant
In die Küvetten wurde dann 1 ml SOC-Medium gegeben. Die Probe wurde aus der Küvette in
ein steriles 1,5 ml-Reaktionsgefäß pipettiert und ca. 60 min bei 37°C im Schüttler (200 Upm)
inkubiert, damit sich die Zellen regenerieren. Von dieser Zellsuspension wurden 100 µl und
200 µl auf selektiven Agarplatten ausplattiert, der Rest ca. 1 min bei 4000 × g abzentrifugiert,
das Pellet in ca. 20 µl Medium resuspendiert und ebenfalls ausplattiert. Die Platten wurden
16-18 h im Brutschrank bei 37°C inkubiert.
SOC-Medium:
20
g/l
Bacto-Tryptone
5
g/l
Hefeextrakt
0,584 g/l
NaCl
0,186 g/l
KCl
pH 7,0 (NaOH)
auf 980 ml mit H2Obidest auffüllen
Vor Gebrauch 10 ml sterile „2 Mg-Lösung“ (aus 1 M MgCl2 und 1 M MgSO4) und 10 ml
sterile 2 M Glucose-Lösung zugeben.
Material und Methoden
40
2.3.4.4 Blau-Weiß-Selektion
Die Blau-Weiß-Selektion hilft bei Klonierungen in den Vektor pDrive, um positive
Transformanden zu identifizieren. Dieses Plasmid trägt das Gen für die lacZ-Untereinheit, die
auf dem E. coli Chromosom im Stamm XL1blue deletiert ist. Innerhalb der lacZ Untereinheit befindet sich die Klonierungsstelle des Plasmids. Erfolgt die Insertion eines
DNA-Fragments in die Klonierungsstelle, kann keine Komplementation stattfinden und die
E. coli-Zellen sind dadurch nicht in der Lage, das Substrat 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-DGalaktopyranosid (X-Gal) in Galaktose und einen blauen Farbstoff zu spalten. Isopropyl-β-DThiogalaktopyranosid (IPTG) wird als molekularer Induktor des lac-Operons eingesetzt. Mit
Hilfe dieses Systems können positive Transformanden anhand ihrer weißen Koloniefarbe
identifiziert werden. Um diese Selektion durchführen zu können, wurden die Agarplatten
ca. 1 h vor dem Ausplattieren mit 80 µl X-Gal (200 mg/ml) und 8 µl 20%igem IPTG
vorbehandelt.
2.3.4.5 Plasmidisolierung aus E. coli
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterienzellen für Restriktionsanalysen, Ligationen,
Transformationen und Sequenzanalysen wurde nach der Methode von BIRNBOIM und DOLY
(1979) mit Hilfe von „QIAprep Spin Plasmid Kits“ (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben
durchgeführt.
2.3.5 Arbeiten mit Hefen
Zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen wurde ein 2-Hybrid-System in Hefe
(S. cerevisiae) gewählt. Das verwendete „MATCHMAKER Library Construction &
Screening
Kit”
(Clontech,
Heidelberg)
beruht
auf
der
Grundlage
eukaryotischer
Transkription, die unter Kontrolle von Transkriptionsfaktoren steht. Transkriptionsfaktoren
bestehen in der Regel aus zwei Domänen, der DNA-Bindedomäne (DNA-BD), die für die
spezifische Erkennung einer DNA-Sequenz (UAS = „upstream activation sequence“)
verantwortlich ist, und einer Aktivierungsdomäne (AD), die die Transkription initiiert. Die
künstlich voneinander
getrennten Domänen eines Transkriptionsfaktors können die
Transkription des spezifischen Gens nur hervorrufen, wenn beide Domänen miteinander
wechselwirken, d. h. sich räumlich sehr nahe kommen. Bei dem verwendeten System werden
vier Reportergene (MEL1, lacZ, ADE2 und HIS3) durch die Wiederherstellung des
Material und Methoden
Transkriptionsfaktors transkribiert. Die daraus resultierenden Auxotrophien und die
41
-
Galaktosidase-Aktivität ermöglichen eine schnelle Identifizierung positiver Kolonien. Die
Fusionsproteine mit den Domänen des Transkriptionsfaktors werden durch Klonierung der
entsprechenden DNA-Sequenzen in die Vektoren pGBKT7 und pGADT7-Rec (Clontech,
Heidelberg) hergestellt. Bei dem sogenannten „Bait -Protein handelt es sich um das Protein,
für das Interaktionspartner gesucht werden und das als Fusionsprotein mit der DNA-BD des
Transkriptionsfaktors hergestellt wird. Bei dem verwendeten System wird die AD mit einer
cDNA-Bank fusioniert, wodurch ermöglicht wird, in einem Versuch viele verschiedene
Interaktionspartner zu finden. Bei diesen Fusionsproteinen aus der cDNA-Bank spricht man
von „Prey -Proteinen. Die Plasmide werden dann in Hefezellen verschiedenen Paarungstyps
(a und ) transformiert, so dass die Suche nach interagierenden Proteinen über die Paarung
der Hefezellen erfolgen kann.
2.3.5.1 Anzucht von S. cerevisiae
Die Kultivierung der Hefen erfolgte in Flüssigkultur, auf Agarplatten oder zur Aufbewahrung
über einen längeren Zeitraum bei –70°C in Glycerinkulturen. Als Anzuchtmedium wurde ein
Vollmedium (YPD) bzw. das Vollmedium mit Zusatz von Adenin (YPDA) oder ein den
jeweiligen Auxotrophien entsprechendes Minimalmedium (SD-Medium) gewählt. Der Zusatz
von Adenin soll Spontanmutationen des Hefestammes AH109 verhindern.
Übernachtkultur:
Die angesetzte Menge der Übernachtkultur variierte je nach geplanter Verwendung. Für eine
Plasmidisolierung wurden 2 ml des entsprechenden Flüssigmediums mit einer Hefekolonie
inokuliert. Für die Herstellung kompetenter Hefezellen wurden 50 ml Kultur benötigt. Es
wurde jeweils eine frische, d. h. bis zu zwei Monate alte, Hefekolonie mit einem sterilen
Zahnstocher zu 1 oder 2 ml Medium gegeben und durch kräftiges Schütteln aufgelöst. Mit
dieser Lösung wurde das restliche Medium angeimpft und 16-18 h bei 30°C im Schüttler bei
ca. 200 Upm aerob bis zu einer optischen Dichte von A600 > 1,5 angezogen.
Plattenkultur:
Auf Agarplatten mit dem entsprechenden Medium wurden die Hefezellen mit einer Impföse
ausgestrichen oder, wie in Kapitel 2.3.5.5 beschrieben, nach einer Paarung mit Hilfe eines
Drygalski-Spatels ausplattiert.
Material und Methoden
42
Glycerinkultur:
Zur längeren Aufbewahrung der Hefestämme wurden Glycerinkulturen angelegt. Dafür wurde
eine Hefekolonie mit der Impföse in 200 µl des entsprechenden selektiven Mediums durch
kräftiges Schütteln gelöst. Zu dieser Hefesuspension wurden 200 µl Glycerin-YPD-Medium
gegeben und die Zellen in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung bis zur weiteren
Verwendung erfolgte bei –70°C.
YPD-Medium:
20 g/l Pepton
pH 5,8 (HCl)
10 g/l Hefeextrakt
20 g/l Agar (für Festmedium)
auf 950 ml mit H2Obidest auffüllen
Nach dem Autoklavieren wird auf ca. 55°C abgekühlt und 50 ml 40%ige sterilfiltrierte
Glucose-Lösung zugegeben.
YPDA-Medium:
YPD-Medium, wie oben beschrieben, zubereiten und zusätzlich zur
Glucose nach dem Autoklavieren 15 ml einer sterilfiltrierten 0,2%igen
Adeninhemisulfat-Lösung zugeben.
Glycerin-YPD-Medium:
SD-Medium:
50% Glycerin in YPD-Medium
6,7 g/l Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren
20
pH 5,8
g/l Agar (bei Festmedium)
auffüllen auf 850 ml mit H2Obidest
Nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf ca. 55°C 50 ml sterile 40%ige Glucose-Lösung
und 100 ml sterile 10 × „Dropout-Solution“ zugeben.
Die Zusammensetzung der 10 × „Dropout-Solution“ ist Tabelle 2.6 zu entnehmen. Je nach
„Dropout-Solution“ wurde die entsprechende Aminosäure nicht zugegeben. SD/-Leu Medium
wird mit einer „Dropout Solution“ ohne Leucin hergestellt. TDO „Dropout Solution“ („Triple
Dropout ) fehlen drei Substanzen (His/Leu/Trp) und QDO („Quadruple Dropout ) enthält
kein Adeninhemisulfat, Histidin, Leucin und Tryptophan.
Material und Methoden
43
Tab. 2.6: Zusammensetzung der „Dropout-Solution“ zur Selektion auf Hefeauxotrophien. Alle Substanzen
stammten von der Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen.
Substanz
10 x Konzentration
L-Adeninhemisulfat
200 mg/l
L-Arginin-HCl
200 mg/l
L-Histidin-HCl-Monohydrat
200 mg/l
L-Isoleucin
300 mg/l
L-Leucin
1000 mg/l
L-Lysin-HCl
300 mg/l
L-Methionin
200 mg/l
L-Phenylalanin
500 mg/l
L-Threonin
2000 mg/l
L-Tryptophan
200 mg/l
L-Tyrosin
300 mg/l
L-Uracil
200 mg/l
L-Valin
1500 mg/l
2.3.5.2 Herstellung kompetenter Hefezellen und Transformation von Hefen
Für die Herstellung kompetenter Hefezellen wurde eine 50-ml-Übernachtkultur mit einer
optischen Dichte von A600
1,5 benötigt. Diese wurde in dem entsprechendem Medium (YPD
oder YPDA) angesetzt. Mit der Übernachtkultur wurden dann 300 ml YPD/YPDA-Medium
angeimpft und auf eine optische Dichte von A600 = 0,2-0,3 eingestellt. Diese Kultur wurde
nun bei 30°C unter Schütteln mit ca. 230 Upm etwa 3 h bis zu einer optischen Dichte von
A600 = 0,4-0,6 angezogen. Die Ernte erfolgte durch Zentrifugation (5 min, 1000 × g, RT). Das
Zellpellet wurde gründlich mit ca. 25 ml 1 × TE-Puffer gewaschen und erneut zentrifugiert.
Der Überstand musste nun sehr vorsichtig dekantiert werden, da das Pellet sehr weich war. Es
wurde anschließend in 1,5 ml frisch hergestellter 1 × TE/LiAc-Lösung aufgenommen. Die
Zellen können danach bei Raumtemperatur einige Stunden aufgehoben werden.
Für die sich anschließende Transformation der kompetenten Zellen wurden 0,1 µg PlasmidDNA und 0,1 mg „Herring Testes Carrier DNA“ (Clontech, Heidelberg) gemischt. Dazu
wurden 100 µl der kompetenten Hefezellen gegeben und wiederum gut gemischt. Nach
Zugabe von 600 µl PEG/LiAc-Lösung wurde 10 s kräftig geschüttelt. Die so behandelten
Zellen wurden nun für 30 min bei 30°C und 200 Upm geschüttelt. Zu dem Zellgemisch
wurden dann 70 µl Dimethyl-Sulfoxid (DMSO) gegeben und durch vorsichtiges Invertieren
Material und Methoden
44
gemischt. Anschließend erfolgte ein Hitzeschock für 15 min bei 42°C im Wasserbad und ein
Abkühlen auf Eis für 1-2 min. Nach dem Abzentrifugieren der Zellen (5 sec, 15800 × g, RT)
wurde das Zellpellet in 0,5 ml TE-Puffer aufgenommen.
Von dieser Zellsuspension wurden 100 µl auf den entsprechenden SD-Platten ausplattiert. Um
sicherzugehen, dass gut getrennte Einzelkolonien entstehen, und um die Transformationseffizienz zu testen, wurden zusätzlich je 100 µl einer 1:10, 1:100 und 1:1000 Verdünnung
ausplattiert. Die Platten wurden bis zum Erscheinen von Kolonien nach ca. 4 Tagen bei 30°C
im Brutschrank kultiviert.
Die Transformationseffizienz konnte durch Auszählen der Kolonienanzahl von einer Platte
mit 30-300 Kolonien ermittelt werden. Mit Hilfe der unten aufgeführten Formel ist die Anzahl
der gewachsenen Hefekolonien pro µg DNA zu errechnen.
gezählte Kolonien × Vol (Suspension)
Vol (ausplattiert) × Verdünnungsfaktor × Plasmid-DNA (µg)
10 × TE-Puffer:
100 mM Tris
= Kolonien / µg DNA
pH 7,5 (HCl)
10 mM EDTA
sterilfiltriert
50% PEG 3350:
mit sterilem H2Obidest herstellen (eventuell auf 50°C erwärmen)
10 × LiAc:
1 M Lithiumacetat
PEG/LiAc-Lösung:
8 ml 50 % PEG 3350
pH 7,5 (Essigsäure), autoklavieren
1 ml 10 × TE
1 ml 10 × LiAc
vor Gebrauch frisch ansetzen
Material und Methoden
45
2.3.5.3 Plasmidisolierung aus S. cerevisiae
Das Protokoll für die Isolierung von Plasmiden aus S. cerevisiae wurde von Frau Prof. Dr.
Doris Rentsch (Molekulare Pflanzenphysiologie, Universität Bern, Schweiz) zur Verfügung
gestellt. Eine in selektivem Medium hergestellte 2 ml Übernachtkultur wurde in einem 2 mlReaktionsgefäß abzentrifugiert (3 min, 2000 × g, RT) und das Pellet wurde in 200 ml
Aufschlusspuffer resuspendiert. Zu dieser Suspension wurden in Säure gewaschene
Glasperlen (0,25-0,7 mm Durchmesser) gegeben, bis noch ca. 1-2 mm Flüssigkeit über den
Glasperlen stand. Dazu wurden 200 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) gegeben
und mindestens 1,5 min kräftig geschüttelt. Nach einer Zentrifugation (5 min, 14000 × g, RT)
wurde die entstandene wässrige Phase abgenommen. Die Phenol/Chloroform-Fällung wurde
noch zwei Mal wiederholt, jedoch ohne erneute Zugabe von Glasperlen. Nach der letzten
Phenol/Chloroform-Fällung wurden zur wässrigen Phase 0,1 Vol Na-Acetat (pH 5,2) und
2,5 Vol 100%iges Ethanol gegeben. Nach dem Mischen auf Eis wurde 20-30 min inkubiert.
Die gefällte DNA wurde durch Zentrifugation (20 min, 14000 × g, 4°C) pelletiert. Nach dem
Waschen des Pellets mit 200 µl 70%igem Ethanol und einer erneuten Zentrifugation wurde
das Pellet getrocknet. Das trockene Pellet wurde in 20 µl H2Obidest resuspendiert und bei einer
Transformation elektrisch kompetenter E. coli-Zellen vollständig verwendet.
Aufschlusspuffer:
10 mM Tris
pH 8,0 (HCl)
100 mM NaCl
1 mM EDTA
1% SDS
2% Triton X-100
In Säure gewaschene Glasperlen:
Glasperlen in einem Erlenmeyerkolben 15 min mit 1 M HCl schütteln und dann so
lange mit H2Obidest waschen, bis der pH-Wert nicht mehr im sauren Bereich liegt (pHPapier). Die Perlen zweimal mit 100%igem Ethanol spülen und im Trockenschrank ca.
2 Tage trocknen lassen.
Material und Methoden
46
2.3.5.4 Herstellung einer cDNA-Bank für das Hefe-2-Hybrid-System
Bei dem in dieser Arbeit genutzten Hefe-2-Hybrid-System wird für ein bekanntes Protein ein
Interaktionspartner aus einer cDNA-Bank gesucht. Die Herstellung der cDNA-Bank beruht
auf dem Prinzip der homologen Rekombination. Hierfür wird bei der cDNA-Synthese ein
Oligo(dT) Primer (CDS III, Clontech, Heidelberg) eingesetzt, der am 3´-Ende der RNA (PolyA-Schwanz) binden kann. Durch RNase-Verdau des 5`-Endes der RNA wird der
untranslatierte Bereich der mRNA abgespalten und durch die PowerScript Reverse
Transkriptase (Clontech, Heidelberg) werden an das 3´-Ende zusätzliche Nukleotide
(Deoxycytidine) angehängt. Daran kann dann der SMART III Primer (Clontech, Heidelberg)
binden. Die entstehenden cDNA-Fragmente besitzen am 3´-Ende die Sequenz des SMART III
Primers, am 5´-Ende die Sequenz des CDS III Primers. Bei dem linearisierten Vektor
pGADT7-Rec enthalten die Enden den Primern komplementäre Sequenzen, so dass durch
homologe Rekombination und Reparaturenzyme der Hefe der linearisierte Vektor mit den
DNA-Fragmenten in seine zirkuläre Form gebracht wird. Abb. 2.1 gibt einen Überblick über
das verwendete System.
Material und Methoden
47
Abb. 2.1: Schematische Darstellung des Hefe-2-Hybrid-Systems mit Herstellung der cDNA-Bank und
in vivo-Rekombination. Dargestellt ist die Durchführung des Versuchs durch Cotransformation, nicht durch
Paarung der Hefen (aus: „MATCHMAKER Library Construction & Screening Kit“ von Clontech,
Heidelberg).
Material und Methoden
48
Die cDNA-Bank wurde aus hypoxisch angezogenem Sproß- und Wurzelgewebe von Mais (Z.
mays L., var. Caramba) hergestellt. Dafür wurde zunächst aus dem fein gemörserten
Maisgewebe Gesamt-RNA isoliert (siehe Kap. 2.3.3.1). Die Qualität der isolierten RNA
wurde mit Hilfe eines denaturierenden Formaldehyd/Agarose-Gels (RNA-Gel) überprüft. Für
die anschließende Synthese der „first-strand cDNA“ wurden in einem 0,25 ml Reaktionsgefäß
folgende Substanzen (Clontech, Heidelberg) gemischt:
0,1-2,0 µg RNA-Probe bzw. 1 µl „Human Placenta Poly A+ RNA“ (als Kontroll-RNA)
1 µl CDS III Primer
X µl H2Obidest (autoklaviert), so dass das Endvolumen 4 µl betrug.
Nach einer Inkubation für 2 min bei 72°C und anschließendem 2-minütigem Abkühlen auf
Eis wurde die Probe kurz abzentrifugiert.
Folgende Substanzen wurden zugeben:
2,2 µl 5 × „first-strand“ Puffer
1
µl DTT (20 mM)
1
µl dNTP Mix (10 mM)
1
µl RNase I (5 U/ml)
1
µl Powerscript Reverse Transkriptase
und nach vorsichtigem Mischen und schwachem Abzentrifugieren 10 min lang bei 42°C
inkubiert. Nach Zugabe von 1 µl SMART III Oligonukleotiden folgte eine einstündige
Inkubation bei 42°C. Durch Hitzebehandlung (10 min, 75°C) wurde die Synthese beendet.
Die Probe wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und für einen RNase-Verdau wurden 2 U
Rnase H zugegeben und 20 min bei 37°C inkubiert. Die so hergestellte „first-strand cDNA
kann zur Lagerung bis zu drei Monate bei –20°C eingefroren werden.
Material und Methoden
2.3.5.4.1
49
Amplifizierung doppelsträngiger cDNA durch „long distance-PCR“
Die cDNA (2 µl) wurde auf Eis gekühlt, bevor sich die „long distance-PCR“ (LD-PCR)
anschloss.
Für die LD-PCR wurden gemischt:
2 µl cDNA
70 µl H2Obidest
10 µl 10 × Advantage 2 PCR Puffer*
2 µl 50 × dNTP Mix*
2 µl 5’ PCR-Primer*
2 µl 3’ PCR-Primer*
10 µl 10 × GC-Melt Lösung*
2 µl 50 × Advantage 2 Polymerase Mix*
100 µl Endvolumen
(*Produkte von Clontech, Heidelberg)
PCR-Programm: PCR-Block auf 95°C vorheizen
95°C 30 s
95°C 10 s
68°C 6 mina
17 Zyklen
68°C 5 min
4°C
a
: Bei jedem Zyklus wurde die Verlängerungsphase („Extension ) um 5 sec verlängert, so
dass dadurch im 17. Zyklus die „Extension -Zeit 7 min und 20 s betrug.
Die Zyklenanzahl dieser LD-PCR richtete sich nach der RNA-Menge (µg), die zur Synthese
der “first-strand cDNA“ eingesetzt worden war. Für 1-2 µg Gesamt-RNA sollten 15-20
Zyklen optimal sein.
Das Ergebnis der LD-PCR wurde durch Auftragen einer 5 µl Probe auf ein 1,2%iges
Agarosegel mit Hilfe von 0,25 µg eines 1-kb Größenstandards (GeneRulerTM 1kb DNA
Ladder, MBI Fermentas, St. Leon-Rot) analysiert. Bis zur Weiterverwendung erfolgte die
Lagerung der doppelsträngigen (ds) cDNA bei –20°C.
Material und Methoden
2.3.5.4.2
50
Reinigung der doppelsträngigen cDNA
Die Reinigung der ds cDNA erfolgte mit CHROMA SPIN+TE-400 Säulen (Clontech,
Heidelberg) nach Herstellerangaben. Mit dieser Methode werden DNA-Moleküle mit einer
Größe von über 200 Basenpaaren (bp) von kleineren DNA-Molekülen gereinigt. Das Prinzip
beruht auf der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit verschieden großer Moleküle
innerhalb einer Säule auf Grund der Porengröße der Säulenmatrix. Große Moleküle eluieren
schneller als kleine Moleküle.
Nach dieser Reinigung ist die ds cDNA für die in vivo-Rekombination in den Vektor
pGADT7-Rec fertig und kann bei –20°C gelagert werden.
2.3.5.4.3
In vivo-Rekombination
Für die Transformation des Hefestammes AH109 mit der ds cDNA und dem linearisierten
Vektor pGADT7-Rec mussten zunächst kompetente Hefezellen hergestellt werden (siehe
Kap. 2.3.5.2).
In einem vorgekühlten 15 ml Reaktionsgefäß wurden gemischt:
20 µl ds cDNA
6 µl pGADT7-Rec* (0,5 µg/µl)
20 µl denaturierte „Herring Testes Carrier DNA“*
(*Produkte der Firma Clontech, Heidelberg)
und nach Zugabe von 600 µl kompetenter Hefezellen wurde noch einmal vorsichtig gemischt.
Nachdem 2,5 ml PEG/LiAc-Lösung zugegeben worden waren, wurde wieder vorsichtig
gemischt, und die Zellen wurden anschließend für 45 min bei 30°C inkubiert. Während der
Inkubation wurden die Zellen alle 15 min vorsichtig durchmischt.
Vor einer Inkubation für 20 min im Wasserbad bei 42°C wurden 160 µl DMSO zugegeben.
Bei dieser Inkubation mussten die Zellen alle 10 min gemischt werden. Nach der
anschließenden Zentrifugation (5 min, 700 × g, RT) wurde das Zellpellet in 3 ml YPD+Medium (Clontech, Heidelberg) resuspendiert. Es folgte eine Regeneration der Zellen bei
30°C für 90 min mit Schütteln. Nach erneuter Zentrifugation wurde das Zellpellet in 15 ml
0,9%iger NaCl-Lösung resuspendiert. Davon wurden jeweils 150 µl auf eine SD/-Leu
Agarplatte (Ø 150 mm) ausplattiert.
Um die Transformationseffizienz ermitteln zu können, wurde außerdem eine Platte mit einer
1:1000 Verdünnung der Zelllösung ausplattiert. Alle Platten wurden 3-6 Tage bis zum
Erscheinen von Kolonien bei 30°C mit der Unterseite nach oben inkubiert.
Material und Methoden
51
Die Ermittlung der Transformationseffizienz erfolgte mit Hilfe folgender Formel und wird pro
eingesetzter Vektor-DNA-Menge angegeben:
Gezählte Kolonien × 1000 = Anzahl Transformanden / 3 µg pGADT7-Rec
Das Ergebnis sollte bei
2.3.5.4.4
1 × 106 Transformanden / 3 µg pGADT7-Rec liegen.
Ernte der Transformanden
Um die Zellen mit der cDNA-Bank zu ernten, wurden die Platten für 3-4 h bei 4°C gekühlt.
Auf jede Platte wurden dann 5 ml Einfriermedium gegeben, und die Kolonien wurden
vorsichtig mit einer zum Spatel geformten Pasteurpipette in die Flüssigkeit geschabt. Die
Lösungen aller Platten wurden in einer sterilen Flasche vereinigt und gut gemischt. Mit Hilfe
eines Hemocytometers (Neubauer-Zählkammer) wurde die Zelldichte überprüft. Liegt die
Zelldichte bei
2 × 107 Zellen/ml, muß das Volumen durch Zentrifugation reduziert werden.
Die Transformanden werden anschließend in 1 ml Aliquots bei –80°C aufbewahrt.
Einfriermedium: 25% Glycerin in YPD Medium
2.3.5.4.5
Überprüfung der cDNA-Bank-Größe
Auf SD/-Leu Agarplatten (Ø 100 mm) werden 100 µl Verdünnungen von 1:100, 1:1000 und
1:10 000 der Transformanden ausgestrichen und bei 30°C bis zum Erscheinen von Kolonien
inkubiert. Die Zellen müssen anschließend ausgezählt werden; mit Hilfe der folgenden
Formel kann die Größe der cDNA-Bank abgeschätzt werden.
Kolonien × 1000 µl/ml
Vol (ausplattiert) × Verdünnungsfaktor
Die Zelldichte der cDNA-Bank sollte
= Klone/ml
2 × 107 Zellen/ml entsprechen.
Material und Methoden
2.3.5.4.6
52
Test des Fusionsproteinkonstrukts ALD_pGBKT7 auf transkriptionelle
Aktivität in S. cerevisiae
Da die DNA-BD des Transkriptionsfaktors unter Kontrolle eines konstitutiven Promotors
steht,
musste
getestet
werden,
ob
das
Aldolase-Bindedomäne-Fusionsprotein
die
Reportergene ohne Interaktion mit der Aktivierungsdomäne aktiviert. Für diesen Test wurden
die Hefestämme AH109 und Y187 mit dem DNA-BD-Konstrukt (ALD_pGBKT7)
transformiert (siehe Kap. 2.3.4.3) und die Transformanden, einschließlich einer negativen
Kontrolle (Zellen mit Vektor pGBKT7 ohne „Insert ), auf drei Medien ausplattiert:
o SD/-Trp/X-α-Gal
o SD/-Trp/-His/X-α-Gal
o SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal
Zeigen die transformierten Kolonien eine weiße Färbung und wachsen nicht auf SD/-Trp/-His
und SD/-Ade/-Trp Medium, ist das Fusionsprotein inaktiv.
Das Fusionsprotein ist aktiv, wenn die transformierten Zellen eine blaue Färbung aufweisen
und auf den Medien SD/-Trp/-His und SD/-Ade/-Trp wachsen. Dann ist eine Suche nach
Interaktionspartnern mit dem Hefe-2-Hybrid-System nicht möglich, da die Blaufärbung der
Kolonien nicht durch eine Interaktion zweier Proteine hervorgerufen worden ist, sondern das
DNA-BD-Konstrukt bereits selbst die Transkription der Reportergene auslöst.
2.3.5.4.7
Toxizitätstest für das Fusionsproteinkonstrukt ALD_pGBKT7
Fusionsproteine können auf die Hefezellen toxisch wirken und damit die Wachstumsrate
herabsetzen oder zu einem Absterben der Kultur führen. Um dies zu testen, wurden 50 ml
SD/-Trp/Kan
Medium mit
einer
2-3 mm großen Y187 Kolonie mit
inseriertem
ALD_pGBKT7 Plasmid angeimpft und für 16-24 h bei 30°C und 250-270 Upm angezogen.
Nach dieser Zeit sollte die optische Dichte der Kultur bei A600
0,8, gegen H2Obidest
gemessen, liegen. Bei einem viel geringeren Wert kann das Fusionsprotein toxisch sein und
für einen Hefe-2-Hybrid-Versuch können die Zellen dann nicht in Flüssigkultur angezogen
werden. Es besteht aber die Möglichkeit, die Kolonien in diesem Fall auf Agarplatten
anzuziehen.
Material und Methoden
53
Dafür wurde eine Kolonie des entsprechenden Stammes (s. o.) in 1 ml SD/-Trp Medium
resuspendiert; diese Zellsuspension wurde auf fünf Platten mit dem gleichen Medium
ausplattiert. Die Platten wurden bei 30°C inkubiert, bis sie vollständig von einem Zellrasen
bewachsen waren. Auf jede Platte wurde 1 ml 0,5 × YPDA gegeben und die Zellen von der
Platte in das Medium geschabt. Die Zelldichte wurde mit Hilfe eines Hemocytometers
ausgezählt und sollte bei
1 × 109 Zellen/ml liegen.
0,5 × YPDA: 10 g/l Peptone
pH 5,8
5 g/l Hefeextrakt
mit H2Obidest auf 968 ml auffüllen und nach dem Autoklavieren 25 ml 40%ige
Glucose-Lösung und 7,6 ml 0,2%ige Adeninhemisulfat-Lösung zugeben.
2.3.5.5 Paarung der Hefestämme und Selektion diploider Zellen
Da die beiden verwendeten Hefestämme AH109 und Y187 zu den zwei verschiedenen HefePaarungstypen a und
gehören, kann die Hefe-2-Hybrid-Analyse über die Paarung der Hefen
erfolgen. Bei den daraus entstehenden Hefezellen handelt es sich um diploide Zellen, die
beide Plasmide enthalten. Anhand der Reportergene kann getestet werden, ob in den Zellen
eine Interaktion zwischen dem Protein aus der cDNA-Bank („Prey -Protein) und dem DNABD-Fusionsprotein (DNA-BD-Aldolase, „Bait -Protein) erfolgt ist.
Für die Paarung wurde ein 1 ml Aliquot der AH109[cDNA-Bank] ( 2 × 107 Zellen/ml) bei
Raumtemperatur aufgetaut und in einem 2 l Erlenmeyerkolben vorsichtig mit den
angezogenen
Y187
Zellen
( 1 × 109 Zellen/ml)
gemischt.
Dazu
wurden
45 ml
2 × YPDA/Kan gegeben und die Zellen 20-24 h bei 30°C und leichtem Schwenken (3050 Upm) inkubiert. Nach 20 h wurde ein Tropfen der Zellsuspension unter dem Mikroskop
auf das Vorhandensein von Zygoten untersucht. Der Kultur wurden weitere 4 h zum wachsen
gelassen, wenn noch Zygoten zu sehen waren. Ansonsten wurde die Zellkultur geerntet. Die
Zellernte erfolgte durch Zentrifugation (10 min, 1000 × g, RT). Der Überstand wurde
verworfen. Der Erlenmeyerkolben, in dem die Zellen kultiviert worden waren, wurde zweimal
mit 50 ml 0,5 × YPDA/Kan gespült. Dieses Medium wurde zum Resuspendieren der
Zellpellets verwendet; anschließend wurde noch einmal zentrifugiert. Das Pellet wurde in
10 ml 0,5 × YPDA/Kan resuspendiert; das resultierende Volumen wurde bestimmt. Die
Selektion der diploiden Hefen erfolgte durch Ausplattieren auf den entsprechenden
Minimalmedien.
Material und Methoden
54
Dafür wurden je 200 µl des resuspendierten Pellets auf SD/TDO Platten (Ø 150 mm)
ausplattiert. Zum Abschätzen der Paarungseffizienz wurden außerdem vier Verdünnungen
(1:10, 1:100, 1:1000 und 1:10 000) hergestellt und je 100 µl auf SD/-Trp, SD/-Leu und SD/Leu/-Trp-Medium (Platten Ø 100 mm) ausplattiert. Bei 30°C wurden die Platten mindestens
5 Tage bis zum Erscheinen von Kolonien mit einem Durchmesser von 2 mm inkubiert.
Die großen Kolonien (Ø
2 mm) wurden auf SD/QDO/X- -Gal Platten umplattiert und
erneut bei 30°C inkubiert (3-8 Tage). Blaue Kolonien wurden von den vierfach selektiven
Platten (SD/QDO/X- -Gal) noch 2-3 mal auf SD/-Leu/-Trp/X- -Gal umplattiert und
anschließend nochmals auf SD/QDO/X- -Gal. Wenn sie weiterhin blau blieben und gut
wuchsen, wurden von ihnen Glycerinkulturen angelegt und Plasmidisolationen durchgeführt.
2 × YPDA:
40 g/l Peptone
pH 5,8 (HCl)
20 g/l Hefeextrakt
mit H2Obidest auf 870 ml auffüllen
nach dem Autoklavieren 100 ml 40%ige Glucoselösung und
30 ml Adeninhemisulfat-Lösung zugeben.
Kanamycin-haltiges YPD-/ YPDA-Medium (z. B. YPDA/Kan):
Zum Medium wird Kanamycin (50 mg/ml in H2Obidest) in einer Endkonzentration von
10-15 mg/l zugegeben.
Um die Paarungseffizienz ermitteln zu können, muss zunächst die Lebensfähigkeit der
Kolonien auf dem jeweiligen SD-Medium bestimmt werden. Mit folgender Formel wird die
Lebensfähigkeit der Kolonien/ml berechnet:
Kolonien × 1000 µl/ml
Vol (ausplattiert) × Verdünnungsfaktor
= #* lebensfähige Kolonien/ml
Der Hefestamm mit der geringeren Lebensfähigkeit ist in einem Versuch der limitierende
Partner. Das sollte hier AH109[cDNA-Bank] sein, so dass jeder Klon aus der cDNA-Bank
einen Partner des anderen Hefestammes für die Paarung finden konnte. Damit ist
sichergestellt, dass innerhalb eines Versuchs möglichst viele unbekannte Protein-ProteinInteraktionen gefunden werden können.
(* # steht für Anzahl)
Material und Methoden
55
Die Kolonien auf den Platten (SD/-Trp, SD/-Leu und SD/-Trp/-Leu), auf denen die
Verdünnungen ausgestrichen worden waren, müssen zur Bestimmung der Paarungseffizienz
ausgezählt werden. Für die Auszählung sollten sich zwischen 30 und 300 Kolonien auf den
Platten befinden. Die Berechnung der Paarungseffizienz ergibt den prozentualen Anteil
diploider Zellen und erfolgt nach folgender Formel:
# Kolonien / ml Diploide
× 100 = % Diploide
# Kolonien / ml limit. Partner
Ergibt die Paarungseffizienz einen Wert unter 2%, sollte der Versuch wiederholt werden, da
dann die Paarung der Hefezellen nicht erfolgreich war.
Die Bestimmung der Anzahl (#) der untersuchten Klone ist durch Auszählen der Platten nach
folgender Formel möglich:
# Kolonien / ml Diploide × resusp. Vol. = # untersuchter Klone
2.3.5.6 Kontrollen für das Hefe-2-Hybrid-System
Als Kontrollen für die Versuche mit dem Hefe-2-Hybrid-System dienen zwei Vektoren
(pGBKT7-53, pGBKT7-Lam) und ein DNA-Fragment („SV40 Large T PCR-Fragment )
(Clontech, Heidelberg). Das DNA-Fragment wird, wie die cDNA-Bank mit dem linearisierten
Vektor pGADT7-Rec (Clontech, Heidelberg), in den Hefestamm AH109 durch CoTransformation mit in vivo-Rekombination eingebracht. Y187-Zellen werden mit den beiden
anderen Plasmiden transformiert. Dafür wurden kompetente Hefezellen hergestellt und mit
den in Tabelle 2.7 aufgeführten Komponenten (Clontech, Heidelberg) gemischt.
Material und Methoden
56
Tab. 2.7: Zusammensetzung der Proben für die Transformation von Hefezellen.
Komponenten
SV40 Large T PCR-Fragment
AH109
Y187
Y187
[pGADT7-Rec]
[pGBKT7-53]
[pGBKT7-Lam]
5,0 µl
-
-
0,5 µl
-
-
pGBKT7-53 (500 ng/µl)
-
0,5 µl
-
pGBKT7-Lam (500 ng/µl)
-
-
0,5 µl
5,0 µl
5,0 µl
5,0 µl
50 µl
-
-
-
50 µl
50 µl
500 µl
500 µl
500 µl
(25 ng/µl)
pGADT7-Rec (Sma I-linearisiert,
500 ng/µl)
Herring Testes carrier DNA
(10 mg/ml)
AH109 kompetente Zellen
Y187 kompetente Zellen
PEG/LiAc-Lösung
Die verschiedenen Ansätze wurden gut gemischt und 30 min auf Eis inkubiert, wobei sie alle
10 min vorsichtig geschüttelt wurden. Anschließend wurden 20 µl DMSO in die Ansätze
gegeben, gemischt und bei 42°C 15 min inkubiert. Während dieser Inkubation musste alle
5 min vorsichtig geschüttelt werden. Nach einer Zentrifugation bei höchster Geschwindigkeit
(15 s, RT) wurde der Überstand verworfen; das Pellet wurde in 1 ml 0,9 %iger NaCl-Lösung
aufgenommen. Je 100 µl einer 1:10, 1:100 und 1:1000 Verdünnung wurden auf SD-Medium
ausplattiert und bei 30°C 4 Tage inkubiert. Die Selektion der Transformanden erfolgte bei den
beiden Y187-Kontroll-Hefestämmen (Y187[pGBKT7-53] und Y187[pGBKT7-Lam]) auf
SD/-Trp Medium, die AH109-Kontrolle dagegen wuchs auf SD/-Leu Medium. Die größten
Kolonien wurden noch einmal auf dem gleichen Selektionsmedium ausgestrichen.
Für den Kontrollversuch zur Paarung der Hefen wurden nur große, frische (< 2 Wochen alt)
Kolonien verwendet. Als positive Kontrolle wurden die Hefestämme AH109[pGADT7-RecT]
und Y187[pGBKT7-53] gepaart; als Negativkontrolle diente AH109[pGADT7-RecT] mit
Y187[pGBKT7-Lam]. Die Kolonien wurden in 500 µl 2 × YPDA-Medium gegeben und
vollständig resuspendiert. Unter leichtem Schwenken erfolgte die Inkubation für 20-24 h bei
30°C. 100 µl einer 1:10 und 1:100 Verdünnung wurden dann auf SD/-Leu, SD/-Trp, SD/Leu/-Trp und QDO/X- -Gal Platten ausplattiert. Die Zellen der Positivkontrolle sollten auf
dem vierfach selektiven Medium (QDO/X- -Gal) blau werden, die negative Kontrolle sollte
Material und Methoden
57
weiß bleiben. Die anderen Platten dienten zum Auszählen für die Berechnung der
Paarungseffizienz.
2.3.6 Biochemische Methoden
2.3.6.1 Proteinbestimmung nach BRADFORD
Die Proteinkonzentration einer Lösung wurde mit Hilfe der Methode von BRADFORD (1976)
photometrisch am Uvicon 810-Photometer (Kontron, Zürich, CH) bestimmt. Durch Bindung
des Farbstoffs Coomassie Brilliantblau G-250 an basische Aminosäurereste der Proteine
kommt es zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums von 465 nm zu 595 nm. Der aus
der Steigung einer Eichgeraden errechnete Faktor (Bradford-Faktor) wird genutzt, um die
Proteinkonzentration einer Probe auf Grund der Absorption bei 595 nm zu berechnen. Zur
Erstellung einer Eichgerade wurde entfettetes Rinderserumalbumin (BSA, 0-20 µg)
eingesetzt.
Bradford-Farbreagenz:
50 mg Coomassie-Brilliantblau G-250
10 ml 95%iges Ethanol
175 ml o-Phosphorsäure (85%)
mit H2Obidest auf 825 ml auffüllen
Proteinbestimmungs-Ansatz:
X µl Probe mit H2Obidest auf 500 µl Endvolumen auffüllen
500 µl Bradford-Farbreagenz
Der Ansatz muss gut gemischt werden und wird nach ca. 10 min gemessen. Als Referenzwert
dient eine Probe ohne Protein.
Berechnung der Proteinkonzentration [µg/µl]:
C Proteinlösung =
OD 595nm (Probe)
× Bradford-Faktor [µg]
Volumen (Probe )[ l]
Der Bradford-Faktor ergibt sich aus 1/Steigung der Eichgerade.
Material und Methoden
58
2.3.6.2 SDS-Gelelektrophorese
Um Proteingemische aufzutrennen, das Molekulargewicht von Proteinen zu bestimmen oder
die Reinheit von Proteinen zu überprüfen, wurde die denaturierende, diskontinuierliche
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach LAEMMLI (1970)
durchgeführt. Die vollständige Denaturierung der Probe erfolgte durch 5-minütiges Erhitzen
der mit 6 × SDS-Ladepuffer versetzten Probe auf 99°C. Dabei lagern sich die negativ
geladenen SDS-Moleküle an die Proteine an und verleihen den Proteinen eine der
Molekülmasse entsprechende Ladung. Für die SDS-PAGE wurden vertikale Gele (10,5 × 11,5
× 0,75 cm bzw. 10,5 × 11,5 × 1 cm, Mini Protean II, BioRad, München) verwendet, die sich
aus einem 5 %igen Sammelgel und 10 oder 12%igem Trenngel zusammensetzten. Die
Elektrophorese wurde bei 120 V mit SDS-Laufpuffer in der Laufkammer durchgeführt. Die
Molekülmasse der aufgetrennten Proteine wurde durch Proteinstandardgemische (z. B.
Prestained Protein Ladder, ~10-180 kDa, MBI Fermentas, St. Leon-Rot) bestimmt.
6 × SDS-Gelladepuffer:
1,5 mM Tris pH 6,8 (HCl)
30% (w/v) SDS
0,15% (w/v) Bromphenolblau
10% Glycerin
Vor Gebrauch werden dem 6 × SDS-Ladepuffer noch 50 µl/ml -Mercaptoethanol (99%)
zugegeben.
SDS-Laufpuffer:
25 mM Tris
192 mM Glycin
4 mM SDS
pH 8,3 (HCl)
Material und Methoden
59
Tab. 2.8: Zusammensetzung der SDS-Gele.
Trenngel
Sammelgel
10%
12%
5%
H2Obidest
9,6 ml
8,6 ml
3,6 ml
40% Acrylamid/Bis-Acrylamid (30/0,8)
5,0 ml
6,0 ml
630 µl
1,5 M Tris-HCl pH 8,8 + 0,4% SDS
5,2 ml
5,2 ml
-
0,5 M Tris-HCl pH 6,8 + 0,4% SDS
-
-
680 µl
200 µl
200 µl
50 µl
8 µl
8 µl
5 µl
10% Ammoniumpersulfat
100% TEMED
Zum Anfärben der Proteine wurden die Gele für 1-2 h in Coomassiefärbelösung gelegt und
anschließend mit Entfärbelösung so lange gewaschen, bis das Gel entfärbt, die Proteinbanden
aber gut sichtbar waren.
Coomassiefärbelösung:
0,4% (w/v) Coomassie-Brillantblue R-250
9%
(v/v) Essigsäure
45,5% (v/v) Methanol
Entfärbelösung:
10%
(v/v) Essigsäure
45%
(v/v) Methanol
Für Gele mit sehr geringen Proteinmengen wurde als sensitivere Färbemethode die
Silberfärbung nach DAMERVAL et al. (1987) gewählt. Dafür wurden die Gele 15-30 min in
Entfärbelösung fixiert und anschließend 2 min in „Farmer s Reducer“ inkubiert. Die Gele
wurden bis zum vollständigen Auswaschen der gelben Farbe des „Farmer s Reducer“ dreimal
10 min in H2Obidest gewaschen. Es schloß sich eine Inkubation von 15-30 min in 0,1%iger
Silbernitratlösung an. Die Gele wurden dann zweimal 30 sec mit H2Obidest gewaschen und
ebenfalls zweimal 30 sec in 2,5% Natriumcarbonat equilibriert. Für die Entwicklung der Gele
wurden diese in Entwickler gelegt, bis die Proteinbanden gut zu sehen waren. Der
Entwicklungsprozess musste durch Inkubation der Gele in 10%iger Essigsäure gestoppt
werden.
Material und Methoden
60
„Farmer s Reducer“: 0,03 M Kaliumhexacyanoferrat (III)
0,032 M Natriumthiosulfat-(5-Hydrat)
Entwickler:
2,5% Natriumcarbonat
35%
Formaldehyd
2.3.6.3 Western-Blot-Analyse und Immundekoration
Zum qualitativen Nachweis von Proteinen dient die Western-Blot-Analyse. Hierbei werden
durch das Anlegen einer Spannung die Proteine aus einer SDS-PAGE auf eine
Nitrocellulosemembran (Protean, Schleicher & Schuell, Dassel) übertragen.
Gel, Membran und Filterpapiere wurden für den Blot 15 min in Transferpuffer equilibriert.
Anschließend wurden Gel und Membran aufeinandergelegt und von beiden Seiten mit
Filterpapier (3 mm, Whatman) bedeckt. In der richtigen Orientierung zu den Polen wurde das
„Blot-Sandwich“ in eine mit Transferpuffer gefüllte vertikale „blotting -Nasskammer
überführt und bei 4°C und 100 mA 16-18 h geblottet.
Transferpuffer:
25 mM Tris
192 mM Glycin
20% (v/v) Methanol
2.3.6.3.1
Färbung geblotteter Proteine mit Ponceau S
Mit Hilfe der Ponceau S-Färbung kann nach einem Western-Blot überprüft werden, ob der
Proteintransfer auf die Nitrozellulosemembran erfolgreich war.
Die Membran wurde dafür in Ponceau-Rot-Lösung (0,2% (w/v) Ponceau S in 5%iger
Trichloressigsäure) geschwenkt, bis Proteinbanden zu erkennen waren. Mit H2Obidest wurde
die Farbreaktion gestoppt und überschüssige Farblösung abgewaschen. Um nach der
Immundekoration eine Molekulargewichtsbestimmung zu ermöglichen, wurden die Banden
des Markers mit Bleistiftstrichen auf der Membran gekennzeichnet.
Vor dem immunologischen Nachweis wurde die Membran bis zur vollständigen Entfärbung
mit 1 × TBS-T-Lösung gewaschen.
TBS-Stammlösung (10 ×):
0,5 M Tris
pH 7,5 (HCl)
1,5 M NaCl
TBS-T-Lösung:
1 × TBS
0,2% (v/v) Tween-20
Material und Methoden
61
Für den anschließenden immunologischen Nachweis der geblotteten Proteine wurde die
Membran für mindestens 60 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln in BlockierPuffer inkubiert. Dieser Schritt dient dem Absättigen unspezifischer Bindungsstellen auf der
Membran. Die anschließende Inkubation mit primärem Antikörper, 1:1000 mit Blokierpuffer
verdünnt, wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde oder über Nacht bei 4°C durchgeführt.
Es folgten drei fünfminütige Waschschritte mit Blockier-Puffer, durch die ungebundene
Antikörper ausgewaschen wurden. Der Nachweis des Antikörper-Antigen-Komplexes
erfolgte nach einstündiger Inkubation mit sekundärem Antikörper. Die eingesetzte
Konzentration des
sekundären Antikörpers richtete sich nach der
Methode des
immunologischen Nachweises (Peroxidasereaktion oder Chemolumineszenz). Durch eine an
den zweiten Antikörper gebundene Alkalische-Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase
konnte die Antikörper-Antigen-Bindung visualisiert werden.
Blockier-Puffer:
1 × TBS
0,2% (v/v) Tween-20
3%
2.3.6.3.2
(w/v) BSAentfettet
Immunologischer Nachweis durch Peroxidasereaktion
Für die Peroxidasereaktion wurde der mit sekundärem Antikörper, in einer 1:3000
Verdünnung, inkubierte Blot zweimal in TBS gewaschen. Anschließend wurde die Membran
bis zum Erscheinen deutlicher Banden in Färbelösung inkubiert. Durch gründliches Waschen
der Membran mit H2Obidest wurde die Reaktion gestoppt.
Färbelösung: 25 ml TBS
20 mg 4-Chloro-1-Naphthol in 5 ml Methanol
15 µl Wasserstoffperoxid (37%ig)
Material und Methoden
2.3.6.3.3
62
Immunologischer Nachweis durch Alkalische-Phosphatase-Reaktion
Wie auch bei der Meerrettich-Peroxidase-Reaktion wird bei der Alkalischen-PhosphataseReaktion die Antikörperbindung durch eine Farbreaktion nachgewiesen. Der Blot wurde auch
hier nach der Inkubation mit sekundärem Antikörper (in 1:3000 Verdünnung) zweimal mit
TBS gewaschen. Die Entwicklung erfolgte in AP-Färbelösung bis zum deutlichen
Sichtbarwerden von Banden.
AP-Färbelösung:
100 mM NaCl
5 mM MgCl2
0,375 mg/ml NBT in 70%igem Dimethylformamid (DMF)
0,1 mg/ml BCIP in 100%igem DMF
mit 100 mM Tris-HCl (pH 8,8) auf das gewünschte Volumen auffüllen.
Die Farbreaktion wurde durch Waschen der Membran in H2Obidest gestoppt.
2.3.6.3.4
Immunologischer Nachweis durch Chemolumineszenz
Bei dieser Methode wird ein Substrat durch die Meerrettich-Peroxidase umgewandelt und
zerfällt,
was
die
Emmission
von
Licht
zur
Folge
hat
(ECL:
Enhanced
Chemoluminescence ). Das emittierte Licht kann durch Belichtung eines Films sichtbar
gemacht werden. Für diese Methode ist eine geringere Konzentration (1:25 000) des
sekundären Antikörpers notwendig. Das Waschen der Membran erfolgte zweimal für fünf
min in TBS-T-Lösung und anschließend für 5 min in TBS. Für die ECL-Färbung wurde die
Membran eine Minute in „ECL
Western Blotting Detection Reagent“ (Amersham
Bioscience, Freiburg) inkubiert und danach luftblasenfrei in Frischhalte-Folie eingeschlagen.
In einer Filmkassette wurde ein Kodak Bio Max Negativfilm (Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen) durch die Lichtemission belichtet. Die Belichtungszeit richtete sich nach der
Intensität der emittierten Strahlung. Die Entwicklung des Films erfolgte durch Schwenken in
Entwicklerlösung, bis deutliche Banden auf dem Film sichtbar wurden. Nach Waschen und
Fixieren des Films konnte er an der Luft getrocknet werden.
Material und Methoden
2.3.6.4
Dot-Blot
63
eine Variante des Western-Blots
Der Unterschied zum Western-Blot liegt darin, dass bei einem Dot-Blot die nachzuweisenden
Proteine nicht über eine SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend geblottet werden, sondern
dass eine Proteinlösung direkt auf die Membran getropft wird. Nach dem Trocknen der
Proteinlösung auf der Membran wird diese wie ein normaler Western-Blot behandelt.
2.3.6.5
Far-Western-Blot
Mit Hilfe eines „Far-Western-Blots“ oder auch „Overlay-Blots“ können Protein-ProteinInteraktionen nachgewiesen werden. Dabei wird ein Protein oder Proteingemisch auf einer
Membran fixiert, was durch SDS-PAGE und anschließendes „blotting
oder im Dot-Blot
erfolgen kann. Der Blot wird mit einem weiteren Protein überschichtet („overlay ). Bei einem
Western-Blot ist das „Overlay -Protein der primäre Antikörper. Im Falle des „Far-Western-“
oder „Overlay-Blots“ handelt es sich um ein Protein, das evtl. mit dem immobilisierten
Protein interagiert. Bei den durchgeführten „Far-Western-Blots“ wurden jeweils 2 µg Protein
auf eine Nitrozellulosemembran getropft und getrocknet. Anschließend wurde die Membran
mindestens 1 h in Blockier-Puffer inkubiert. Danach erfolgte der „Overlay
mit 25 nM
rekombinanter, gereinigter Strep-tag-Aldolase in Blockier-Puffer bei leichtem Schütteln bei
4°C über Nacht. Nach dreimaligem Waschen für 5 min mit Blockier-Puffer wurde der primäre
Antikörper entsprechend einem Western-Blot eingesetzt (siehe Kap. 2.3.6.3). Die weitere
Behandlung entsprach dem Western-Blot. Als Kontrolle wurde ein weiterer Blot über Nacht
in Blockier-Puffer ohne Aldolase inkubiert. Alle „Far-Western-Blots“ wurden durch
Chemolumineszenz entwickelt.
2.3.6.6 Heterologe Expression von Proteinen in E. coli BL21(DE3)pLysS
Mit Hilfe von Bakterien können Proteine rekombinant hergestellt werden. Dafür wird die
kodierende DNA-Sequenz des gewünschten Proteins in einen Expressionsvektor kloniert und
in den Proteinexpressionsstamm E. coli BL21(DE3)pLysS transformiert. Die heterologe
Expression der Proteine unterscheidet sich auf Grund der gewählten Vektoren, da diese
unterschiedliche Promotoren enthalten. Mit Hilfe von induzierbaren Promotoren ist es
möglich, die Synthese des Fremdproteins gezielt auszulösen. In dieser Arbeit kamen zwei
verschiedene Expressionssysteme zum Einsatz.
Material und Methoden
64
a) Heterologe Expression mit T7-Promoter
Bei den Vektoren pET-16b (Novagen, Schwalbach/Ts) und pRSET A (Invitrogen,
Karlsruhe) handelt es sich um Vektoren, bei denen die inserierte cDNA unter der
Kontrolle des T7-Promotors steht. Die Synthese der T7-Polymerase, die spezifisch diesen
Promotor erkennt, kann durch Isopropyl- -D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert
werden, so dass die Zellen erst nach Zugabe von IPTG mit der Synthese des
Fremdproteins beginnen.
Mit Übernachtkulturen wurden 100 ml bis zu 1 l selektives Medium 1:50 angeimpft und
bei 37°C aerob kultiviert. Das Wachstum der Zellen wurde stündlich durch Messung der
optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm gegen H2O verfolgt. Bei einer
optischen Dichte von 0,5-0,8 wurde der Kultur IPTG in einer Endkonzentration von
300 µM zugegeben. Die weitere Kultivierung der Zellen erfolgte nach der Induktion der
Proteinexpression für 3-4 h bei 30°C im Schüttler (ca. 200 Upm). Vor der Induktion sowie
jede Stunde während der Anzucht nach Induktion wurde ein 1 ml Aliquot der Kultur zur
Messung der optischen Dichte und für die Analyse der Überexpression mittels SDSPAGE entnommen. Die Zellernte erfolgte durch Zentrifugation (20 min, 5000 × g, 4°C).
Für einen Zellaufschluss mit anschließender Proteinreinigung aus Einschlusskörpern
(„inclusion bodies ) wurde das Zellpellet bei –20°C eingefroren. Sollten jedoch nach dem
Zellaufschluss die löslichen Proteine gewonnen werden, wurde das Zellpellet in 1/5 des
Kulturvolumens mit Waschpuffer I resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation wurde das
Pellet in 1/30 des Kulturvolumens an Waschpuffer I mit Proteaseinhibitor (0,02 µg/µl
Pefabloc) aufgenommen und bei – 20°C eingefroren.
Waschpuffer I :
50 mM MOPS
5 mM MgCl2
100 mM Saccharose
pH 7,5 (KOH)
Material und Methoden
65
b) Heterologe Expression mit tet-Promotor
Bei
den
Strep-tag II-Expressionsvektoren
(z. B. IBA-3)
befindet
sich
die
Expressionskassette unter Kontrolle des tetA Promotors/Operators. Durch Zugabe von
Anhydrotetrazyklin, in Konzentrationen unterhalb antibiotischer Effekte, kann der
Promotor vollständig induziert werden. In Abwesenheit des Induktors garantieren die
konstitutiv exprimierten tet Repressor-Gene, die sich ebenfalls auf dem Vektor befinden,
die vollständige Repression der Expression inserierter Fremdproteine. Mit diesem
Expressionssystem kann eine Proteinexpression auch im E. coli Stamm XL1blue erfolgen.
Dadurch ist eine Transformation des Stammes BL21(DE3)pLysS mit dem entsprechenden
Plasmid nicht unbedingt erforderlich.
Flüssigkulturen zwischen 50 und 200 ml wurden mit Übernachtkulturen 1: 50 angeimpft
und bis zu einer optischen Dichte von ca. 0,5, gemessen bei 550 nm gegen H2Obidest, bei
37°C aerob kultiviert. Die Induktion der Proteinexpression erfolgte mit 200 µg/l
Anhydrotetracyclin-Hydrochlorid (AHT). Nach der Induktion wurden die Zellen für
weitere 4 h bei 30°C aerob kultiviert. Geerntet wurden die Zellen durch Zentrifugation
(15 min, 4500 × g, 4°C) und anschließend wurde das Zellpellet bei –20°C eingefroren.
AHT-Stammlösung: 2 mg/ml AHT in DMF
2.3.6.7 Reinigung der rekombinanten Proteine
2.3.6.7.1
His-tag-Affinitätschromatographie
Mit den Expressionsvektoren pET-16b und pRSET A hergestellte rekombinante Proteine
lassen sich über Metall-Chelat-Chromatographie reinigen. Diese Vektoren enthalten im
Leseraster mit der „Multiple Cloning site“ (MCS) eine codierende His-tag-Sequenz. An die
Proteinsequenz wird dadurch bei der Expression N-terminal ein His-tag angehängt. Dieser
ermöglicht die Reinigung des Proteins aus einer Proteinlösung durch Nickel-ChelatChromatographie, da die negativ geladenen Histidine des His-tags an Kationen (z. B. NickelIonen) binden.
Für den Zellaufschluss wurde dem in 1/30 des Ausgangsvolumens der Bakterienkultur
1 × Waschpuffer gelösten Zellpellet Lysozym (200 µg/ml) zugegeben und bei 35°C aufgetaut.
Nach 1,5 h Inkubation mit leichtem Schütteln bei Raumtemperatur und anschließendem
Sonifizieren auf Eis (3 × 300 s, 50% Microtip) wurden die löslichen Bestandteile des
Rohextrakts von den unlöslichen Zellfragmenten durch Zentrifugation (30 min, 20000 × g,
4°C) getrennt. Dieser geklärte Rohextrakt wurde anschließend auf die vorbereitete NickelChelat-Säule gegeben.
Material und Methoden
66
Bei der Vorbereitung der Säule wurden zunächst Nickel-Ionen an chelatisierender Sepharose
(Chelating Sepharose®, Pharmacia, Uppsala, Schweden) immobilisiert. Überschüssiges
Nickel wurde mit H2Obidest ausgewaschen, und die Säule wurde mit 1 × Bindepuffer
equilibriert. Die Bindung der Proteine mit His-tag erfolgte anschließend durch Beladen der
Säule mit dem geklärten Rohextrakt. Dieser und alle folgenden Schritte wurden bei 4°C
durchgeführt, um ein Denaturieren des Proteins zu verhindern und die Aktivität abbauender
Enzyme (wie Proteasen) herabzusetzen. Ungebundene Proteine wurden durch anschließendes
Waschen mit 10 Säulenvolumina 1 × Bindepuffer und 6 Säulenvolumina 1 × Waschpuffer
entfernt. Die His-tag-Proteine wurden mit Hilfe eines Imidazol-Gradienten eluiert. Imidazol
konkurriert mit dem His-tag der Proteine aufgrund der ähnlichen Konformation um die
Nickel-Bindestellen des Säulenmaterials und löst so die His-tag-Proteine von der Säule. Dafür
wurde die Säule nacheinander mit je 1,5 Säulenvolumina 1× Elutionspuffer mit 150 mM
Imidazol, 300 mM Imidazol, 450 mM Imidazol und 1 M Imidazol gespült. Alle Fraktionen
wurden für die spätere Analyse aufgefangen. Für die Regeneration der Säulenmatrix erfolgte
das Lösen der Nickel-Ionen von der Säulenmatrix durch Durchfluss von 3 Säulenvolumina
1 × „strip off“-Puffer und Waschen mit 10 Säulenvolumina H2Obidest. Nach Behandlung mit 5
Säulenvolumina 1 × Ladepuffer und anschließendem Waschen mit 3 Säulenvolumina
H2Obidest war die Säule wieder mit Ni2+-Ionen beladen und konnte für eine erneute
Proteinreinigung verwendet werden.
8 × Waschpuffer:
160 mM Tris-HCl
pH 7,9
4 M NaCl
480 mM Imidazol
8 × Bindepuffer:
160 mM Tris-HCl
pH 7,9
4 M NaCl
40 mM Imidazol
8 × Elutionspuffer:
80 mM Tris-HCl
pH 7,9
2 M NaCl
Imidazol in den Endkonzentrationen 150, 300, 450 und 1000 mM
Material und Methoden
67
4 × „strip off“-Puffer: 80 mM Tris-HCl
pH 7,9
100 mM NaCl
400 mM EDTA
8 × Ladepuffer:
2.3.6.7.2
400 mM NiSO4
Reinigung von rekombinantem Protein aus „inclusion bodies“
Nicht alle heterolog überexprimierten Proteine befinden sich nach dem Zellaufschluss und der
Zentrifugation als gelöste Proteine im Überstand (geklärtem Rohextrakt). Werden während
der Expression die Proteine in den E. coli-Zellen in Einschlusskörper („inclusion bodies“)
eingelagert, erfordert das den Aufschluss der unlöslichen Bestandteile des Rohextraktes für
die Reinigung der Proteine. Dieser wurde in Anlehnung an das Protokoll „Purification of
Polyhistidine-Tagged Proteins“ (Macherey-Nagel, Düren) durchgeführt. Das Pellet der
Bakterienkultur wurde dafür in 1/125 des Kulturvolumens 1 × LEW-Puffer mit 1 mg/ml
Lysozym versetzt und 30 min auf Eis inkubiert. Nach Aufschluss der Zellen durch
Sonifizieren (2 × 60 s, 50% Microtip) wurden die löslichen Bestandteile von den unlöslichen
getrennt (Zentrifugation: 30 min, 10000 × g, 4°C). Das Pellet mit den
inclusion bodies“
wurde mit 1/50 des Kulturvolumens 1 × LEW-Puffer gewaschen und noch einmal
zentrifugiert.
Anschließend
wurde
das
Pellet
in
1/125
des
Kulturvolumens
1 × Denaturierungs-Solubilisierungs-Puffer resuspendiert. Zum vollständigen Resuspendieren
des Pellets war ein weiterer Aufschluss durch Sonifizieren (2 × 60 s, 50% Microtip)
notwendig. Nach einer Inkubation von 60 min auf Eis folgte eine Zentrifugation (30 min,
10000 × g, RT). Der Überstand dieser Zentrifugation wurde nun auf eine vorbereitete NickelChelat-Säule (vergl.
Kap.
2.3.6.7.1)
gegeben,
die jedoch mit 4 Säulenvolumina
Denaturierungs-Solubilisierungs-Puffer equilibriert worden war, und 1 h bei RT geschüttelt.
8 × LEW-Puffer:
400 mM NaH2PO4
pH 8,0 (NaOH)
2,4 M NaCl
Denaturierungs-Solubilisierungs-Puffer:
1 × LEW
8 M Harnstoff
pH 8,0
Material und Methoden
68
Ungebundene Proteine wurden mit 10 Waschschritten von je 2 Säulenvolumina mit
Denaturierungs-Solubilisierungs-Puffer ausgewaschen. Die Elution der gebundenen Proteine
erfolgte in 8 Schritten mit je 3 Säulenvolumina Denaturierungs-Solubilisierungs-Puffer mit
Imidazol. Der Imidazol-Gradient wurde dabei mit 10 mM, 50 mM, 100 mM und 250 mM
Imidazol der Bindung des rekombinanten Proteins an die Nickel-Ionen angepasst.
2.3.6.7.3
Reinigung von rekombinantem Protein mit Strep-tag
Das „Two-Step Affinity Purification System“ (Qiagen, Hilden) diente zur Proteinreinigung
über Strep-tag-Affinitätschromatographie. Der Zellaufschluss vor der Proteinreinigung
erfolgte in Anlehnung an das Protokoll „Preparation of Cleared Lysates from E. coli Cell
Cultures“ (Qiagen, Hilden). Dafür musste zunächst das Zellpellet in 15-30 min auf Eis
auftauen und anschließend in 1/50 des ursprünglichen Zellkulturvolumens 1 × LEW-Puffer
mit 1 mg/ml Lysozym resuspendiert werden. Diese Lösung wurde nach einer Inkubation auf
Eis für 30 min sonifiziert (3 × 60 s; 50% Microtip, 4°C). Die aufgeschlossene Probe wurde
anschließend durch Zentrifugation (30 min, 10000 × g, 4°C) von Zelltrümmern und
unlöslichen Zellbestandteilen getrennt. Der Überstand der Zentrifugation enthielt die löslichen
Proteine und wurde als geklärter Rohextrakt der Säulenchromatographie unterworfen.
Bei der Säulenchromatographie bindet der Strep-tag des Proteins an Strep-Tactin, und nach
Auswaschen ungebundener Proteine wird durch die spezifische Kompetition durch
Desthiobiotin das Protein eluiert. Dafür wurde der geklärte Rohextrakt mit 2 ml Säulenmatrix
(„Strep-Tactin Superflow Resin Suspension , Qiagen, Hilden) gemischt und 1 h bei 4°C
geschüttelt. Die Suspension wurde in eine leere Säule gegeben und durch vier Waschschritte
mit jeweils 4 ml 1 × LEW-Puffer von ungebundenen Proteinen gereinigt. Die gebundenen
Proteine wurden durch Zugabe von 6-8 × 0,5 ml Elutions-Puffer eluiert. Die einzelnen
Fraktionen der Reinigung wurden aufgefangen und analysiert.
Elutions-Puffer:
1 × LEW-Puffer (s. Kap. 2.3.6.7.2)
2,5 mM Desthiobiotin
Material und Methoden
69
Zur Regeneration der Säulenmatrix wurde das Desthiobiotin mit 4-Hydroxy-Azo-Benzyl-2Carboxylsäure (HABA) von der Matrix gelöst und ausgewaschen. Eine erfolgreiche
Regeneration ist durch einen Farbumschlag des Regenerationspuffers von gelb zu rot sichtbar.
Die Regeneration erfolgte mit 30 ml Regenerations-Puffer und anschließendem Waschen mit
16 ml 1 × LEW-Puffer.
Regenerations-Puffer:
50 mM NaH2PO4
pH 8,0 (NaOH)
300 mM NaCl
1 mM 4-Hydroxy-Azo-Benzyl-2-Carboxylsäure (HABA)
2.3.6.8 Aldolase-VDAC-Bindeversuch (Affinitätschromatographie)
Die Affinitätschromatographie stellt eine Möglichkeit zur Verifizierung von Protein-ProteinInteraktionen dar. Das Prinzip beruht auf der spezifischen Bindung eines His-tagFusionsproteins an die Säulenmatrix. Wird über diese Säule ein Protein ohne His-tag oder ein
Proteingemisch gegeben, sollten diese Proteine nur dann mit dem an die Matrix gebundenen
Protein eluieren, wenn eine Bindung zwischen dem an die Matrix gekoppelten Protein und
einem anderen Protein vorliegt. Um mit dieser Methode die potentielle Interaktion zwischen
dem spannungsabhängigen Anionenkanal VDAC 1 und Aldolase nachzuweisen, wurde
rekombinantes, gereinigtes His-tag VDAC-Fusionsprotein an eine Ni-NTA Säulenmatrix
gekoppelt und durch 10 Waschschritte (je 2 Säulenvolumina) mit DenaturierungsSolubilisierungs-Puffer
von
Verunreinigungen
befreit.
Über
eine
Strep-Tactin-Säule
gereinigte und gegen 1 × LEW-Puffer dialysierte Aldolase-Proteinlösung (ca. 2,5 ml,
0,42 µg/µl) wurde zum an die Ni-NTA-Säule gekoppelten VDAC-Protein gegeben und
mindestens 60 min bei RT geschüttelt. Nach erneuten 10 Waschschritten mit DenaturierungsSolubilisierungs-Puffer wurden noch je zwei Waschschritte mit Imidazol (5 mM und 7,5 mM)
in Denaturierungs-Solubilisierungs-Puffer angeschlossen, bevor das an die Säule gebundene
Protein mit einem Imidazol-Gradienten (10 mM, 50 mM, 100 mM und 250 mM in
Denaturierungs-Solubilisierungs-Puffer)
eluiert
wurde.
Alle
Fraktionen
dieser
Säulenchromatographie wurden aufgefangen und mittels SDS-PAGE analysiert. Als
Kontrolle wurde parallel dazu eine Säulenchromatographie mit den gleichen Schritten
durchgeführt, wobei hier jedoch kein His-tag VDAC-Fusionsprotein an die Ni-NTA-Säule
gebunden war.
Material und Methoden
70
2.3.7 Entsalzen über Dialyse und NAP-5 Säulen
Der Austausch von Puffern, um z. B. hochkonzentrierte Salze aus Proteinlösungen zu
entfernen, wurde durch Dialyse oder NAP-5 Säulen (Pharmacia, Uppsala, S) durchgeführt.
Bei der Dialyse wird die Proteinlösung in einen Dialyseschlauch, bestehend aus einer
Membran mit definierter Porengröße, gefüllt. Auf Grund von Diffusion treten Salze und
Flüssigkeiten durch die Membran, größere Moleküle wie Proteine werden jedoch im Inneren
des Schlauches gehalten. Die Flüssigkeit, gegen die dialysiert wird, sollte das 1000-fache
Probenvolumen haben, um eine ausreichende Verdünnung zu ermöglichen. Die Dialyse
wurde unter leichtem Rühren bei 4°C für mindestens 2 h, meist über Nacht, durchgeführt.
Dialysiert wurde z. B. nach der Proteinreinigung aus „inclusion bodies“, um aus der Probe
Imidazol zu entfernen und die Harnstoffkonzentration zu senken.
Das Prinzip der NAP-5 Säulen beruht auf der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit
von Molekülen innerhalb einer Säulenmatrix. Bei den NAP-5 Säulen kann ein
Probenvolumen von 500 µl in 1000 µl eines anderen Puffers überführt werden.
2.3.8 Herstellung eines polyklonalen Antiserums
Die
Gewinnung
von
Auftragsimmunisierung
rekombinantem Protein.
spezifischen,
eines
polyklonalen
Kaninchens
Dafür
Antikörpern
(BioScience,
wurden 500 µg
erfolgte
Göttingen)
Mais-Aldolase
mit
durch
die
gereinigtem,
(ALD_pET-16b)
in
E. coli Bl(21)DE3pLysS überexprimiert, gereinigt und auf präparative Gele (SDS-PAGE)
aufgetragen. Bei diesen präparativen Gelen gibt es nur zwei Probentaschen, eine kleine für
den Marker und eine große für die Probe. Nach der Elektrophorese wurde die Markertasche
und ein kleines Stück der Probentasche vom Rest des Gels abgeschnitten und 10-30 min in
angewärmter Coomassie-Färbelösung angefärbt. Das restliche Gel wurde in Western-BlotTransferpuffer mit 5% Methanol inkubiert. Nach dem Entfärben und Quellen in H2Obidest
wurde mit Hilfe des zuvor abgeschnittenen Gelstückes der Bereich des Gels, in dem sich das
gereinigte Protein befand, definiert. Dieser Bereich wurde aus dem ungefärbten Gel
ausgeschnitten und für die Immunisierung des Kaninchens an die oben genannte Firma
geschickt.
Die erhaltenen Kaninchen-Anti-Aldolase-Antikörper wurden an verschiedenen Geweben auf
ihre Spezifität getestet. Eine Konzentrationsreihe mit rekombinantem Protein gab Aufschluss
über die mit dem Antiserum zu detektierende Menge des nativen Proteins (im „Enzyme-linked
Material und Methoden
71
immunosorbent assay“, ELISA) und der denaturierten rekombinanten Aldolase auf
Westernblots.
2.3.9 Copolymerisationsversuche
Um eine Bindung der Aldolase an Aktin zu untersuchen, wurden Copolymerisationsversuche
mit rekombinanter Strep-tag-Aldolase und Kaninchenmuskel-Aktin (Cytoskeleton, Denver,
CO, USA) durchgeführt. Für die Copolymerisationsversuche wurde die gereinigte Strep-tagAldolase in 1 × LSB-Puffer
(„Low-Salt-Buffer“) umgepuffert
(NAP-5 Säulen) und
anschließend ankonzentriert (Centricon, Millipore Amicon, Eschborn) bis etwa eine
Konzentration von 1 mg/ml erreicht war. Das Aktin (1 mg) wurde in 500 µl eiskaltem
1 × LSB gelöst und zur Depolymerisation 1 h auf Eis inkubiert. Beide Proben (Aktin und
Aldolase) wurden anschließend 1 h bei 200 000 × g und 4°C zentrifugiert (Beckman Optima
Ultrazentrifuge, Beckman Instruments, Palo Alto, CA, USA). Vom Überstand dieser
Zentrifugation wurde der Proteingehalt gemessen und, wenn notwendig, noch einmal
ankonzentriert. Das Pellet, das unlösliche, denaturierte Proteine enthält, wurde verworfen.
Jeweils 0,5 nmol der Proteine wurde, in einer Konzentration von 5 µM, zur Polymerisation
mit 300 mM Saccharose, 4 µl Polymerisationsinduzierer und evtl. Zusätzen von z. B. 1 und
10 mM FBP, je 25 mM DTTred und DTTox sowie GSSG und 50 mM GSH auf Eis gemischt
und mit 1 × LSB auf ein Endvolumen von 100 µl aufgefüllt. Die Proben wurden dann
mindestens 1 h bei 30°C inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation für 30 min bei 10 000 × g
und 30°C, um Aktin-Bündelungsproteine, unspezifische Bindungen und denaturierte Proteine
zu pelletieren. Der Überstand der Proben wurde abgenommen, und in der anschließenden
Zentrifugation (1 h, 200 000 × g, 30°C) pelletierten Aktin-Filamente und daran gebundene
Proteine. Überstand und Pellet wurden getrennt und für die Analyse der Proben eingefroren.
Zu den Pellets wurden vor dem Einfrieren 100 µl H2Obidest gegeben. Durch das Einfrieren bei
–20°C depolymerisieren die Proben wieder. Die Auswertung der Proben erfolgte mittels SDSPAGE, wobei die Proteinmengen der Pellets densitometrisch (SpectraMaxPlus; SOFTmax
Por Version 3,0, BioRad, München) analysiert wurden.
LSB-Puffer (10 ×):
50 mM Tris
2 mM CaCl2
2 mM ATP
5 mM DTTred
pH 8,0 (HCl)
Material und Methoden
Polymerisationsinduzierer:
72
10 mM Tris
pH 7,5 (HCl)
1 M KCl
50 mM MgCl2
25 mM ATP
Die Auswertung der densitometrisch gemessenen Proben erfolgte durch den Vergleich der
verschiedenen Proben eines Proteins untereinander, wobei die in der Kontrolle nachgewiesene
Proteinbande gleich 100% gesetzt wurde. Um den Anteil der an das polymerisierte Aktin
gebundenen Aldolase ermitteln zu können, wurde außerdem für jede Probe das pelletierte
Aktin gleich 100% und das Aldolasepellet in Bezug dazu gesetzt.
Nach Berechnung von Mittelwert (MW), Standardabweichung (Sd) und Varianz (sx2) konnten
die Proben mit Hilfe des t-Tests mit der Kontrolle verglichen werden. Das daraus
resultierende Signifikanzniveau
gibt Aufschluss über die Signifikanz der gemessenen
Unterschiede zwischen Probe und Kontrolle. Alle Formeln und benutzten Werte sind dem
Buch „Biostatistik“ von KÖHLER, SCHACHTEL und VOLESKE (2002) entnommen.
Die Varianz sx2 gibt die durchschnittliche quadratische Abweichung der Einzelwerte vom
Mittelwert an und ist mit folgender Formel zu berechnen:
2

 m
 
 ∑ fi x i  

1 m
i 1
 
2
2
sx =
* ∑ fi x i −  =


n - 1 i =1
n




wobei m
die Anzahl verschiedener Messwerte,
xi
der i-te verschiedene Messwert,
fi
die Häufigkeit des Messwertes xi,
n fi
der Stichprobenumfang ist und
i
der Laufindex von 1 bis m läuft.
Material und Methoden
73
Für den Vergleich, ob die Mittelwerte zweier Stichproben signifikant verschieden sind,
muß berechnet werden:
t versuch =
wobei
x−y
SD
×
n1 − n 2
n1 + n 2
n1
der Umfang der Stichprobe x,
n2
der Umfang der Stichprobe y,
x und y
die jeweiligen Mittelwerte und
2

(
x)
1
∑
2
SD =
× ∑x −
+
n1 + n 2 − 2 
n1

(
)
(∑ y ) − (∑n y)
2
2
2

 ist.

Der Wert tVersuch wird dann mit dem Wert tTab verglichen, wobei die Freiheitsgrade
(FG = n1 + n2-2) und das Signifikanzniveau
berücksichtigt werden. Ist tVersuch
tTab,
unterscheiden sich die beiden Stichproben nicht signifikant voneinander. Ist tVersuch > tTab, sind
die Stichproben signifikant verschieden. Die Tabelle für die tTab-Werte befindet sich im
Anhang.
2.3.10 Stöchiometrie der Aldolase-Aktin-Bindung
Um die Stöchiometrie der Bindung von Aldolase an F-Aktin zu bestimmen, wurden Versuche
in Anlehnung an VITAVSKA et al. (2003) durchgeführt. Dafür wurde 1 mg Aktin in 500 µl
eiskaltem H2Obidest gelöst und bei 4°C eine Stunde depolymerisiert. Strep-tag-Aldolase wurde
in Puffer P umgepuffert und, wie das Aktin, 1 h zentrifugiert (200 000 × g, 4°C). Der
Proteingehalt des Überstandes der Zentrifugation wurde bestimmt, und das Aktin für die
Polymerisation wurde mit Puffer P auf eine Konzentration von 10 µM eingestellt. Die
Aktinpolymerisation erfolgte bei 30°C für eine Stunde. Anschließend wurden die
Aktinfilamente durch Zugabe von Phalloidin (200 nM) stabilisiert und weitere 15 min bei
30°C inkubiert. Das polymerisierte, stabilisierte Aktin wurde auf eine Konzentration von
200 nM mit Puffer P mit Phalloidin (200 nM) und DTTred (2 mM) eingestellt. Für die
Ermittlung der Bindestöchiometrie wurden je 200 nM Aktin mit Aldolase in Konzentrationen
von 25 nM bis 800 nM gemischt und bei 20°C 120 min inkubiert. Bei der anschließenden
Zentrifugation (200 000 × g, 1 h, 20°C) wurden Aktinfilamente und die daran gebundene
Material und Methoden
74
Aldolase pelletiert. Die Proben wurden in Überstand und Pellet getrennt und vor der Analyse
mittels SDS-PAGE bei –20°C eingefroren. Da die Proteinkonzentrationen der Proben sehr
gering waren, wurden die Gele durch Silberfärbung angefärbt.
Puffer P:
5 mM Tris pH 8,0 (HCl)
40 mM KCl
2 mM MgCl2
0,2 mM CaCl2
1,2 mM ATP
2.3.11 Messung der Aldolaseaktivität
Die Messungen der Aktivität gereinigter, rekombinanter His-tag- und Strep-tag-Aldolase
erfolgten photometrisch an einem Spektralphotometer (Eppendorf 1101 M, Hamburg) bei
25°C mit einer Wellenlänge von 340 nm. Die Aktivität wurde in Anlehnung an die Methode
von YELTMAN und HARRIS (1980) bestimmt.
Folgende Reaktion in der Glykolyse wird durch die Aldolase katalysiert:
Aldolase
D-Fructose-1,6-bisphosphat
Dihydroxyacetonphosphat
+
D-Glycerinaldehyd-3-phosphat
Da diese Reaktion nicht direkt messbar ist, wird eine nachgeschaltete Indikatorreaktion,
katalysiert von der Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase (GDH), gemessen. Die messbare
Absorptionsänderung bei der Umwandlung von NADH2 in NAD+ erfolgt durch die Bildung
von Glycerin-3-phosphat aus D-Glycerinaldehyd-3-phosphat. Das durch die von der Aldolase
katalysierte Reaktion ebenfalls entstehende Dihydroxyacetonphosphat wird durch die
Triosephosphat-Isomerase (TPI) in D-Glycerinaldehyd-3-phosphat umgewandelt und steht so
der Umwandlung durch GDH ebenfalls zur Verfügung. Alle drei Reaktionen sind in dem
unten gezeigten Reaktionsschema dargestellt:
Dihydroxyacetonphosphat
+
D-Glycerinaldehyd-3-phosphat
Aldolase
D-Fructose-1,6-bisphosphat
Triosephosphat-Isomerase
Dihydroxyacetonphosphat
D-Glycerinaldehyd3-phosphat
D-Glycerinaldehyd-3-phosphat
Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase
NADH2
NAD+
Glycerin-3-phosphat
Material und Methoden
75
Für die Aktivitätsmessungen bestand der Reaktionsansatz aus:
100 mM MOPS
pH 8,0 (NaOH)
0,25 mM NADH2
je 10 µg GDH/TPI
1 mM Fructose-1,6-bisphosphat
2 µg Aldolase
Für die Umsetzung von einem Mol Fructose-1,6-bisphosphat werden jeweils zwei Mol
NADH2 verbraucht.
Zur Untersuchung einer möglichen Redox-Modulation der Aldolase wurde der Messansatz
verändert, so dass oxidierende oder reduzierende Bedingungen erzeugt wurden. Dafür wurde
die Aldolase mit DTT oder Glutathion in oxidierter und reduzierter Form in einem
Aktivierungsansatz vorinkubiert. Durch die Zugabe der reduzierenden oder oxidierenden
Substanzen wurde der Aktivierungsansatz gestartet und nach 5, 10, 20, 40 und 60 min wurden
aliquote Anteile (je 100 µl) entnommen und im Aktivitätstest gemessen. Um eine mögliche
Absorption oder Bindung von Proteinen an der Oberfläche des Reaktionsgefäßes während der
Inkubationszeit des Aktivierungsansatzes zu verhindern, wurde den Proben standardmäßig
BSA zugegeben, das keinen Einfluss auf die Reaktion hat. Neben Messungen bei einem pHWert von 8,0 wurden unter reduzierenden Bedingungen zusätzlich Messungen bei pH 9,0
durchgeführt.
Aktivierungsansatz (je Probe):
Endkonzentration:
X µl Probe
2 µg
10 µl 200 mM MOPS mit unterschiedlichem pH-Wert
20 mM
10 µl BSA (10 µg/µl)
10 µg
X µl Reduktions- oder Oxidationsmittel (DTT, Glutathion)
10/50 mM
mit H2Obidest auf ein Endvolumen von 100 µl aufgefüllt
Material und Methoden
76
2.3.12 Faktor-Xa -Verdau
Bei dem Vektor pET-16b besteht die Möglichkeit, den His-tag nach der Expression vom
rekombinanten Protein durch einen Verdau mit dem Enzym „Faktor-Xa“ (Novagen, Madison,
USA) abzuspalten. Die Nukleotidsequenz für die Erkennungssequenz dieser Protease ist
zwischen der multiplen Klonierungsstelle und der Sequenz des His-tags auf dem Plasmid
enthalten.
Um
optimale
Bedingungen
für
den
Verdau
zu
finden,
wurden
Optimierungsversuche mit verschiedenen Enzymkonzentrationen, Inkubationszeiten und
-temperaturen durchgeführt. Jeweils 10 µg rekombinantes, gereinigtes Protein wurde mit 0;
0,2; 0,5; 2 und 5 U/µl Enzym 16, 23 und 46 h bei 4°C und RT geschnitten.
50 µl Reaktionsansatz:
10 µg Protein
5 µl 10 × “Cleavage Capture Buffer”
1 µl Enzym (verschiedener Konzentrationen)
mit H2Obidest auf 50 µl auffüllen.
Die Analyse des Proteaseverdaus erfolgte durch Auftragen der Proben auf SDS-PAGE.
2.3.13 Bioinformatische Analysen
Die bekannte Sequenz der cytosolischen Aldolase aus Mais (Z. mays L.) sowie des
spannungsabhängigen Mitochondrien-Kanal-Proteins 1 (VDAC) aus Mais (Z. mays L.) der
Datenbank
GenBank
(National
Center
of
Biotechnology
Information,
NCBI,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) diente der Herstellung von Primern und zur Charakterisierung
sequenzierter Proben. Das Programm „Basic Local Alignment Search Tool“ (BLAST 2,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/gorf/bl2.html,
National
Center
of
Biotechnology
Information, NCBI) wurde für die Identifizierung homologer Sequenzabschnitte verwendet
(ALTSCHUL et al., 1990; ALTSCHUL et al., 1997). Schnittstellen von Restriktionsenzymen
innerhalb
von
Gensequenzen
findet
(http://www.firstmarket.com/cutter/cut2).
das
Programm
Nukleotidsequenzen
in
„Webcutter
2.0“
Aminosäuresequenzen
umzuwandeln ist mit dem ExPASy Molecular Biology Server (ExPASy: „Expert Protein
Analysis System“) auf der Seite http://www.expasy.ch/tools/dna.html möglich, wo auch
Molekulargewichte von Proteinen errechnet werden können. Für Klonierungen in den Vektor
pASK-IBA3 stellt die Firma IBA (Göttingen) auf ihrer Internetseite (http://www.iba-go.de)
ein Programm für die Primerherstellung (“PrimerD´Signer“) zur Verfügung.
Ergebnisse
77
3 Ergebnisse
Zur Untersuchung der Mikrokompartimentierung des pflanzlichen Primärstoffwechsels am
Cytoskelett wurden zwei verschiedene Ansätze gewählt. Zunächst sollte pflanzliche
cytosolische Aldolase (E.C. 4.1.2.13) aus Mais (Z. mays L.) auf eine mögliche Interaktion mit
Aktinfilamenten untersucht werden. Eine putative Bindedomäne der pflanzlichen Aldolase
ergab sich aufgrund der Proteinsequenzhomologie mit der bekannten Aktin-Bindedomäne der
tierischen Aldolase (WINTER & HUBER, 2000, s. Kap. 1.2.2). Um Interaktionspartner der
Aldolase
denkbar wären z. B. andere glykolytische Enzyme
zu finden, wurde das Hefe-2-
Hybrid-System als Verfahren gewählt. Auf Grund dieser beiden Ansätze gliedert sich der
Ergebnisteil in mehrere Bereiche. Im ersten Teil werden notwendige Vorarbeiten für die
folgenden Untersuchungen beschrieben. Diese beinhalten die Ergebnisse von Klonierung und
Überexpression der Aldolase, Aktivitätsmessungen zur Charakterisierung der rekombinanten
Aldolasen und die Herstellung eines Antikörpers zur Immundetektion. Im zweiten Teil folgen
die Ergebnisse der Untersuchung zur Bindung der Aldolase an Aktin aus Kaninchenmuskel.
Der letzte Teil befasst sich mit den Ergebnissen des Hefe-2-Hybrid-Systems und der
Überprüfung einer mit diesem System gefundenen Interaktion mit Hilfe anderer Methoden
wie Affinitätschromatographie und Far-Western-Blot.
3.1 Vorarbeiten
3.1.1 Klonierung des Expressionskonstrukts ALD_pET-16b
Durch eine RT-PCR wurde ein 1068 bp großes DNA-Fragment amplifiziert (Abb. 3.1 A) und
mit Hilfe einer Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Nach der Klonierung dieses Fragments
in den Vektor pET-16b wurde ein Restriktionsverdau mit den Enzymen Eco RI und Xba I
durchgeführt. Dieser führte zu den in Abb. 3.1 B gezeigten zwei Banden, einer Vektorbande
bei über 5000 bp und dem Aldolase-Fragment bei ca. 1500 bp. Durch die gewählten
Schnittstellen enthält das Aldolase-Fragment zusätzlich ca. 420 bp des Vektors und hat daher
nicht die erwartete Größe von ca. 1100 bp. Dieses Plasmidkonstrukt wird im Folgenden
ALD_pET-16b genannt. Um die Nukleotidsequenz zu überprüfen und eine mögliche
Leserasterverschiebung durch Fehler während der PCR auszuschließen, wurde eine
Sequenzierung des Konstrukts durchgeführt. Das Ergebnis dieser Sequenzierung zeigt an
neun Stellen einen Nukleotidaustausch im Vergleich zur in der Datenbank GenBank
veröffentlichten Sequenz. Dabei handelt es sich jedoch in acht Fällen um sogenannte „stille
Ergebnisse
78
Mutationen“, d. h. dass die geänderte Nukleotidsequenz nicht zu einer veränderten
Aminosäure führt. Ein Aminosäureaustausch kommt durch einen Nukleotidaustausch des
ersten Nukleotids des Tripletts an Position 787 des Klons zustande, wodurch das Codon für
ein Leucin anstelle eines Valins entsteht. Bei beiden Aminosäuren handelt es sich um neutrale
Aminosäuren. Das Ergebnis der Sequenzanalyse ist im Anhang wiedergegeben.
A
B
bp
Ma
bp
11500
2838
11500
1700
1700
1093
1093
Ma
Vektor
pET-16b
2838
Aldolase
PCRProdukt
805
Aldolase„Insert
805
Abb. 3.1: Agarosegel (A) zur Überprüfung der Größe des amplifizierten PCR-Produktes und (B)
Restriktionsanalyse des klonierten Endkonstruktes ALD_pET-16b. Ma: Lambda DNA/Pst I Marker 24,
MBI Fermentas, St. Leon-Rot.
3.1.2 Heterologe Expression und Reinigung von Aldolase (Z. mays) mit His-tag
Das ALD_pET-16b Plasmidkonstrukt kodiert das Fusionsprotein Aldolase mit N-terminalem
His-tag. Für das Fusionsprotein mit His-tag wurde ein Molekulargewicht von 40 kDa
berechnet, wobei der aus zehn Histidinen bestehende His-tag mit etwa 1,6 kDa anzusetzen ist.
Zur
heterologen
Expression
wurden
E. coli BL21(DE3)pLysS-Zellen
mit
dem
Plasmidkonstrukt ALD_pET-16b transformiert und wie in Kap. 2.3.6.6 beschrieben kultiviert.
Nach Anzucht der Zellen bei 37°C, Induktion der Proteinsynthese mit IPTG und
darauffolgender Absenkung der Anzuchtstemperatur auf 30°C zeigte sich eine sehr gute
Überexpression des Fremdproteins im Vergleich zu den zelleigenen Proteinen (s. Abb. 3.2).
Die
Induktion
der
Fremdproteinsynthese
erfolgte
während
der
exponentiellen
Wachstumsphase der Bakterien ca. 120 min nach Inokulation der Kultur. Durch die Induktion
der Proteinsynthese und die Temperatursenkung sinkt die Teilungsrate der Zellen und es
erfolgt eine vermehrte Proteinexpression. Das Zellwachstum, gemessen anhand der optischen
Dichte der Zellsuspension bei 600 nm gegen H2Obidest, ist der Abb. 3.3 zu entnehmen.
Ergebnisse
79
kDa
M
Ma
vor Induktion
nach Induktion
ÜS
ÜS
P
P
83
62
48
33
25
Abb. 3.2: Heterologe Expression der cytosolischen Aldolase von Z. mays in E. coli mit dem
Plasmidkonstrukt ALD_pET-16b. Dargestellt sind verschiedene Fraktionen vor und nach der Induktion der
Proteinsynthese, die aus jeweils einem aliquoten Anteil der Bakterienkultur von 1 ml gewonnen wurden.
ÜS: Überstand mit löslichen Proteinen, P: Pellet mit unlöslichen Proteinen, Ma: Molekularmassenstandard
(Prestained Protein Marker, Broad Range, New England BioLabs, Beverly, MA, USA). Der Pfeil markiert
die Höhe der Bande der exprimierten rekombinanten Aldolase.
Bei Ernte der Zellen nach einer vierstündigen Synthese des Fremdproteins erreichte die
optische Dichte einen Wert über zwei. Mit Hilfe von 1 ml-Anteilen, die während der
Proteinsynthese der Zellkultur entnommen worden waren, konnte nach Analyse auf SDSPAGE auf Höhe von etwa 40 kDa eine deutliche Proteinanreicherung nachgewiesen werden.
Nach dem Zellaufschluss befand sich das Protein im geklärten Rohextrakt. Mit Hilfe der
Metall-Chelat-Affinitätschromatographie konnte es aufgrund seines His-tags gereinigt und
angereichert werden. Bei der in Kapitel 2.3.6.7.1 beschriebenen Reinigungsmethode wurde
das
Optische Dichte bei 600 nm
2,500
Protein
gut
Verunreinigungen
von
mit
2,000
anderen Proteinen getrennt,
1,500
und der größte Teil des
1,000
Proteins eluierte bei einer
0,500
Imidazolkonzentration von
0,000
450 mM. Die Ausbeute an
0
30
60
90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
Zeit [min]
Abb. 3.3: Wachstumskurve von E. coli BL21(DE3)pLysS mit dem
Plasmidkonstrukt ALD_pET-16b. Der Pfeil zeigt den Induktionszeitpunkt
der Proteinsynthese mit IPTG an.
gereinigter
Aldolase aus
einem Liter Kultur betrug
mindestens
Abb. 3.4).
5 mg
(s.
Ergebnisse
80
150 300 450 1000
RE
W
E
mM Imidazol
Ma
kDa
100
60
40
30
Abb. 3.4: Reinigung der rekombinanten Aldolase des Expressionskonstruktes ALD_pET-16b über MetallChelat-Affinitätschromatographie. SDS-Page-Analyse von geklärtem Rohextrakt vor dem Auftrag auf die
Affinitätssäule (RE), Waschschritte 1 und 10 mit Bindepuffer und Waschschritt 16 mit Waschpuffer (W) und
nach Elution mit Imidazol in unterschiedlichen Konzentrationen (E). Ma: Molekularmassenstandard (RotiMark 10-150, Roth, Karlsruhe). Aufgetragen wurden 25 µl der jeweiligen Fraktion.
3.1.3 Faktor-Xa-Verdau
Wegen der Größe des His-tags und seiner Ladung sollte von dem rekombinanten Protein der
Tag proteolytisch entfernt werden. Die Proteaseschnittstelle der Faktor-Xa-Protease zwischen
der codierenden Sequenz der Aldolase und dem His-tag sollte die Möglichkeit bieten, den
His-tag abzuspalten. Dafür wurden verschiedene Ansätze mit unterschiedlich viel Enzym (s.
Kap. 2.3.12) und 10 µg rekombinanter, gereinigter Aldolase angesetzt. Es konnten jedoch
keine Bedingungen gefunden werden, die zum Abspalten des His-tags ohne gleichzeitige
Degradation der Aldolase führten. Da das rekombinante Protein mit His-tag weder Aktivität
noch Aktinbindung zeigte, eignete sich diese Aldolase nicht für die weiteren Versuche,
konnte jedoch als Ausgangsmaterial zur Herstellung eines Aldolase-Antikörpers verwendet
werden. Eine mögliche Beeinflussung der biochemischen Eigenschaften eines Proteins durch
den His-tag wurde bereits von WU & FILUTOWICZ (1999) beschrieben.
Ergebnisse
81
3.1.4 Herstellung eines polyklonalen Antiserums zur Immundetektion von
Aldolase
Die gereinigte, rekombinante Aldolase mit His-tag wurde für die Erzeugung eines
polyklonalen Antiserums in Kaninchen genutzt. Das erhaltene Antiserum wurde auf seine
Spezifität auf Western-Blots mit Sproß- und Wurzelgewebe von Mais (Z. mays L., var.
Caramba), Arabidopsis (A. thaliana L., var. Columbia) und Kartoffel (Solanum tuberosum L.,
var. Serena) sowie tierischer Aldolase (Boehringer, Mannheim) getestet. Bei allen
pflanzlichen Geweben konnte eine deutliche Bande detektiert werden. Gezeigt ist in Abb. 3.5
der positive Nachweis von Aldolase aus Arabidopsis-Blatt und Spross- und Wurzelgewebe
von Mais, wogegen tierische Aldolase durch das Serum nicht erkannt wurde. Die detektierte
rekombinante Aldolase zeigt einen Größenunterschied zu den anderen Proben, der auf den mit
dem Protein fusionierten His-tag zurückzuführen ist. Auch geringe Proteinmengen (50 ng)
rekombinanter Strep-tag-Aldolase konnten auf Western-Blots mit Hilfe des Antiserums
nachgewiesen werden. Im ELISA, bei dem die Proben nicht denaturiert werden, wurde native
rekombinante Aldolase bis zu einer Menge von 3 ng erkannt (Daten nicht gezeigt).
1
2
3
4
5
kDa
Ma kDa
120
100
84
75
52
50
-His-tag
36
37
Abb. 3.5: Untersuchung der Spezifität des Mais-Aldolase-Antiserums aus Kaninchen durch Western-BlotAnalyse mit verschiedenen pflanzlichen Geweben (je 20 µg Protein) und tierischer Aldolase. 1: tierische
Aldolase (4 µg, Boehringer, Mannheim), 2: A. thaliana, 3: Wurzel Z. mays, 4: Sproß Z. mays, 5:
rekombinante Aldolase mit His-tag, Ma: Molekularmassenstandard (Prestained Protein Standard, BioRad,
München). Der Größenunterschied der rekombinanten Aldolase beruht auf der Größe des His-tags dieses
Proteins ( -His-tag).
Ergebnisse
82
3.1.5 Klonierung des Expressionskonstruktes ALD_pASK-IBA3
Für alle weiteren Versuche war es notwendig, Aldolase mit katalytischer Aktivität
herzustellen, da für Aldolase mit His-tag, die keine Aktivität zeigte, auch keine Bindung an
Aktin nachgewiesen werden konnte. Um den Einfluss des His-tags zu umgehen, wurde ein
Strep-tag Vektor gewählt. Bei dem eingesetzten Vektor (pASK-IBA3) ist eine proteolytische
Abspaltung des tags nicht möglich. Im Gegensatz zum His-tag wird der Strep-tag bei dem
eingesetzten Vektor C-terminal am Protein exprimiert. Bei der Reinigung eines Proteins mit
Strep-tag kann unter physiologischen Pufferbedingungen gearbeitet werden. Ebenfalls von
Vorteil ist, dass der Strep-tag ungeladen ist (TERPE, 2003). Die Aminosäuresequenz des
Strep-tags ist der schematischen Darstellung der Aldolase-Expressionskonstrukte im Anhang
zu entnehmen (s. Kap. 7.2.5).
Die Klonierung erfolgte wie in Kapitel 2.3.3.16.3 beschrieben. Mit Hilfe eines
Restriktionsverdaus mit den Restriktionsendonukleasen Xba I und Hind III konnten positive
Klone identifiziert werden (s. Abb. 3.6). Die Nukleotidsequenz eines positiven Klons wurde
durch Sequenzierungsreaktionen überprüft. Durch einen Vergleich der Sequenz des Klons mit
der Nukleotidsequenz der Aldolase in der Datenbank GenBank ergaben sich sieben
unterschiedliche Nukleotide, von denen eins zu einer veränderten Aminosäure in der
Proteinsequenz führt (s. Anhang Kap. 7.2.8). Dabei handelt es sich, wie schon bei der
Klonierung der Aldolase in den pET-16b Vektor, um Nukleotid 787. Das resultierende Codon
ergibt die Aminosäure Valin an Stelle eines Leucins.
bp
Ma
6
7
8
9
10
11
11500
2838
1700
1093
805
Vektor
pASK-IBA3
Aldolase
“Insert
Abb. 3.6: Identifizierung positiver Klone nach Klonierung von Aldolase in den Vektor pASK-IBA3 durch
einen Restriktionsverdau. 6: Klon 6 (enthält kein „Insert ), 7: Klon 7 (wurde für alle weiteren Versuche
verwendet), 8: Klon 8, 9: Klon 9, 10: Klon 10, 11: Klon 11, Ma: Lambda DNA/Pst I Marker 24, MBI
Fermentas, St. Leon-Rot.
Ergebnisse
83
3.1.6 Heterologe Expression und Reinigung von Aldolase (Z. mays) mit Strep-tag
Das Fusionsprotein Aldolase mit Strep-tag wurde durch Überexpression des Konstruktes
ALD_pASK-IBA3
in E. coli XL1blue-Zellen hergestellt.
Der
C-terminale
Strep-tag
ermöglicht die Reinigung des Proteins mit Hilfe der Strep-Tactin-Affinitätsmatrix. StrepTactin ist ein technisches Streptavidin, an das der aus acht Aminosäuren bestehende Strep-tag
Optische Dichte bei 550 nm
mit hoher Affinität bindet. Die
2,5
Elution des Proteins erfolgt durch
2,0
geringe
1,5
(2,5 mM) Biotin oder Desthio-
Konzentrationen
biotin.
1,0
Die Wachstumskurve der Zellen
0,5
zeigte auch nach Induktion der
0,0
0
30
60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
Zeit [m in]
Proteinsynthese
keine
deutliche
Abflachung. Die optische Dichte
stieg weiter an, die Zellen haben
Abb. 3.7: Wachstumskurve von E. coli XL1blue mit dem
Plasmidkonstrukt ALD_pASK-IBA3. Der Pfeil zeigt den
Induktionszeitpunkt der Proteinsynthese mit AHT.
sich
weiterhin
mit
gleicher
Teilungsrate vermehrt (Abb. 3.7).
Die während des Wachstums vor
und nach der Induktion abgenommenen aliquoten Anteile (1 ml) der Zellsuspension zeigen
bei einer 12 % SDS-PAGE die Anreicherung einer Proteinbande bei knapp 40 kDa, was der
erwarteten Größe der Aldolase mit dem ca. 1,06 kDa großen Strep-tag entspricht (s. Abb 3.8).
Nach dem Aufschluss der Zellen befand sich das gewünschte Protein im geklärten Rohextrakt
und konnte durch Affinitätschromatographie mit nur sehr geringen Verunreinigungen
gewonnen werden. Hundert Milliliter Zellkultur lieferten auf diese Weise ca. 2 mg Protein.
Anhand der Abbildung 3.9, bei der einige Fraktionen des Aufschlusses auf eine 12 % SDSPAGE aufgetragen wurden, ist deutlich zu erkennen, dass das gereinigte Protein in den
Fraktionen E2 bis E6 eluiert.
Ergebnisse
84
kDa
180
Ma
0
4
73
54
35
Aldolase
24
Abb. 3.8: Heterologe Expression rekombinanter Strep-tag Aldolase vor und nach der Induktion der
Proteinexpression. SDS-PAGE mit je 10 µl Bakteriensuspension vor der Induktion (0) und 4 h nach
Induktion (4). Ma: Molekularmassenstandard (Prestained Protein Ladder, ~10-160kDa, MBI
Fermentas, St. Leon-Rot).
kDa
Ma RE DF W2 E1 E2
E3 E4 E5 E6
118
48
32
19
Abb. 3.9: Reinigung rekombinanter Strep-tag Aldolase über Strep-tag-Affinitätschromatographie.
SDS-PAGE-Analyse von geklärtem Rohextrakt (RE; 5 µl) vor Auftrag auf die Säule, Durchfluss
ungebundener Proteine nach Auftragen der Probe auf die Säule (DF), Waschschritt 2 (W2) und den
Elutionschritten 1-6 (E1-E6) (je 20 µl). Ma: Molekularmassenstandard (Prestained Protein Molecular
Weight Marker, MBI Fermentas, St. Leon-Rot).
Ergebnisse
85
3.1.7 Katalytische Eigenschaften rekombinanter Aldolase
Um die rekombinanten Aldolasen zu charakterisieren, wurden Aktivitätsmessungen mit dem
Substrat FBP durchgeführt. Die Aktivitätsmessungen erfolgten nach der in Kapitel 2.3.11
beschriebenen Methode mit den heterolog hergestellten, gereinigten rekombinanten MaisAldolasen.
Rekombinant überexprimierte Aldolase mit His-tag des Konstruktes ALD_pET-16b zeigte
keine Aktivität. Die gereinigte Aldolase mit Strep-tag (ALD_pASK-IBA3, Reinheit siehe
Abb. 3.9) wies Aktivität auf. Diese betrug 1,23 U/mg Protein (+/-0,25 U/mg Protein). Im
Gegensatz zu dieser geringen Aktivität wurde eine rekombinante anaerobe cytosolische
Aldolase aus Mais mit einer Aktivität von 20,8 U/mg durch BERITAUME et al. (1989)
beschrieben.
Um eine mögliche Redox-Modulation der Aldolase zu ermitteln, wurden Aktivierungsansätze
mit dem synthetischen Redoxreagenz DTT, in reduzierter und oxidierter Form, und dem
natürlichen Redoxreagenz Glutathion (GSH und GSSG) bei verschiedenen pH-Werten
(pH 8,0 und 9,0) nach jeweils 5, 10, 20, 40 und 60 min Inkubation gemessen. Dabei konnten
bei oxidiertem Glutathion und DTT (je 10 mM) keine Änderungen der Aktivität gemessen
werden. Auch reduzierende Bedingungen führten zu keiner signifikanten Steigerung der
Aktivität (Daten nicht gezeigt).
Um den KM-Wert der Aldolase mit Strep-tag zu ermitteln, wurde ihr Substrat, Fructose-1,6bisphosphat,
in
verschiedenen
Konzentrationen
von
1M
bis
0,00012 mM
in
Aktivitätsmessungen eingesetzt. Bei Auftragung der Reaktionsgeschwindigkeit [V] (U/mg)
gegen die Substratkonzentration [S] (mM) zeigte sich eine hyperbole Kurve (s. Abb. 3.10 A).
Die Substratkonzentration bei halbmaximaler Aktivität (KM) konnte anhand eines
Lineweaver-Burk-Diagramms ermittelt werden (s. Abb. 3.10 B). Sie entspricht einer
Substratkonzentration von 0,5 µM. Die maximale Geschwindigkeit der Reaktion betrug bei
sättigender Substratkonzentration unter den gewählten Bedingungen ca. 1,2 U/mg (Vmax) und
konnte ab einer Substratkonzentration von 7,4 µM FBP nachgewiesen werden.
Ergebnisse
86
A
Aldolaseaktivität
[U/mg]
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0,002 0,004 0,006
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Substrat [mM]
B
1/ Aktivität
mg × min
4
µMol
2
0
-2
-4000
-2000
0
2000
4000
6000
8000
1 / [Substrat] (1/mM)
Abb. 3.10: Aktivität der rekombinanten Strep-tag Aldolase von Z. mays in Abhängigkeit von der
FBP-Konzentration. Die Messungen erfolgten bei pH 8,0. Mit dem Programm Grafit 5.0 erfolgte
die Auswertung als Michaelis-Menten-Modell (A) und in einem Lineweaver-Burk-Diagramm (B).
Ergebnisse
87
3.2 Copolymerisationsversuche
Für die Untersuchung der direkten Wechselwirkung zwischen pflanzlicher Aldolase und
Aktinfilamenten wurden Copolymerisationsversuche durchgeführt, wie in Kapitel 2.3.9
beschrieben. Die rekombinante Mais-Aldolase mit Strep-tag bindet an Aktinfilamente (s.
Abb. 3.11). Eine Bindung tierischer Aldolase an F-Aktin wurde schon beschrieben und
charakterisiert (z. B. ARNOLD & PETTE, 1970; DON & MASTERS, 1988, O´REILLY & CLARKE,
kDa
Ma
1
1993; WANG et al., 1996). Erst kürzlich konnte auch
2
pflanzliche Aldolase in der Cytoskelettfraktion von
73
Maisendosperm nachgewiesen werden (AZAMA et al.,
54
2003). Bei den durchgeführten Versuchen wurde der
Einfluss
24
von
Fructose-1,6-bisphosphat
(FBP,
s.
Abb. 3.11), welches im tierischen System die Bindung der
Aldolase an Aktin bei einer Konzentration von 1 mM
Abb. 3.11:
SDS-PAGE
des
Niederschlags bei 200 000 × g nach
Copolymerisation
rekombinanter
Strep-tag-Aldolase von Mais und
Aktin
aus
Kaninchenmuskel.
1: 0,5 nmol Aktin und Aldolase, 2:
wie Probe 1 mit Zusatz von 10 mM
FBP. Ma: Molekularmassenstandard
(Prestained Protein Ladder, ~10160 kDa, MBI Fermentas, St. LeonRot).
vollständig unterdrückt (ARNOLD & PETTE, 1970),
Fructose-6-phosphat (F-6P) und Fructose-2,6-bisphosphat
(F-2,6BP) untersucht. F-6P und F-2,6BP zeigten im
tierischen System bei Konzentrationen von 40 µM keinen
nachweisbaren Effekt (WANG et al., 1996).
Da es Hinweise auf den Einfluss des Redox-Milieus auf
Aldolase (OFFERMANN et al., 1984; FRATELLI et al., 2002;
ITO et al., 2003) sowie Aktin (HINSHAW et al., 1991;
WANG et al., 2001) gibt, wurde zusätzlich das Redox-Milieu während der Versuche durch
Glutathion und DTT beeinflusst. Dafür wurde die in die Versuche eingesetzte Aldolase vor
Zugabe des Aktins mit den entsprechenden Substanzen vorinkubiert. Für die Auswertung der
Ergebnisse gliedert sich dieser Abschnitt in zwei Bereiche. Diese beinhalten den Einfluss von
FBP, F-6P und F-2,6BP (s. Kap. 3.2.1) und den Einfluss des Redox-Milieus (s. Kap. 3.2.2)
auf die Aldolase-Aktin-Bindung. Die Auswertung der Proben erfolgte wie in Kapitel 2.3.9
beschrieben. Neben dem Vergleich der pelletierten Proteinmengen von Aldolase oder Aktin
mit der in der Kontrolle pelletierten Proteinmenge wurde das Aldolase-Pellet in Bezug zum
Aktin-Pellet gesetzt. Die Signifikanz der gemessenen Unterschiede wurde mit Hilfe des tTestes der einzelnen Substanzen in Bezug auf die Kontrolle ermittelt. Bei einem
Signifikanzniveau von
= 0,5 ist ein signifikanter Unterschied mit mind. 50 % Sicherheit
aufgetreten und stellt die geringste Signifikanz der durchgeführten Versuche dar. Bei
= 0,01
ist in 99 % der Versuche von einem signifikanten Unterschied auszugehen, und bei einem
Ergebnisse
88
Signifikanzniveau von
= 0,002 erreichen 99,8 % der Versuche einen signifikanten
Unterschied zur Kontrolle. Allen hier aufgeführten Ergebnissen liegen mindestens drei
unabhängig voneinander durchgeführte Versuche zugrunde.
3.2.1 Einfluss von FBP, F-6P und F-2,6BP auf die Aldolase-Aktin-Bindung
Unter Einfluss von 1 mM und 10 mM FBP polymerisierten 82% bzw. 84% des Aktins im
Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (s. Tab. 3.2). Die mit dem F-Aktin pelletierte Aldolase
entsprach jedoch bei 1 mM FBP nur 55% der Menge in der Kontrolle, bei 10 mM FBP
pelletierten noch 43%. Dies bedeutet eine Hemmung der Bindung der Aldolase an Aktin unter
Einfluss von 1 mM bzw. 10 mM FBP um etwa die Hälfte im Vergleich zur Kontrolle
(s. Tab. 3.3). Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zum für tierische Systeme bekannten
Einfluss der Metabolitkonzentrationen auf die Bindung (ARNOLD & PETTE, 1970).
Tab. 3.2: Pelletierte Aktinmenge in Abhängigkeit von FBP, F-6P und F-2,6BP in Copolymerisationsversuchen
von Strep-tag-Aldolase und Aktin im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle in %.
Exp.:
Kontrolle
1 mM FBP
10 mM FBP
10 mM F-6P
10 mM F-2,6BP
1
100
80
97
85
96
2
100
79
71
3
100
4
100
86
83
300
MW
100
82
84
164
106
4
13
118
19
Sd
95
107
128
Tab. 3.3: Pelletierte Aldolasemenge in Abhängigkeit von FBP, F-6P und F-2,6BP in Copolymerisationsversuchen von Strep-tag-Aldolase und Aktin im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle in %.
Exp.:
Kontrolle
1 mM FBP
10 mM FBP
10 mM F-6P
10 mM F-2,6BP
1
100
50
50
46
46
2
100
57
50
3
100
4
100
57
29
11
MW
100
55
43
31
42
4
12
18
11
Sd
50
37
30
Ergebnisse
89
Bezieht man die im Pellet nachgewiesene Aldolase auf das polymerisierte, pelletierte Aktin,
so ergeben sich die in Abb. 3.12 dargestellten Anteile. Die in der jeweiligen Probe pelletierte
Aktinmenge wurde gleich 100% gesetzt. Unter Kontrollbedingungen bindet mit 34%, in
Bezug auf die pelletierte Aktinmenge, der größte Anteil Aldolase an F-Aktin. Unter Einfluss
von FBP verringert sich der Anteil der mit dem F-Aktin pelletierten Aldolase auf 21% (1 mM
FBP) bzw. 17% (10 mM FBP). Das bedeutet, dass unter Einfluss von 10 mM FBP die halbe
Menge der in der Kontrolle nachgewiesenen Aldolase an das Aktin gebunden hat; der Einfluss
von 1 mM FBP führte zu einer Bindung von 60% der Aldolasemenge der Kontrolle an das
polymerisierte Aktin. Diesen Ergebnissen liegt ein Signifikanzniveau von
= 0,01 (1 mM
FBP) bzw. 0,002 (10 mM FBP) zugrunde.
Neben FBP wurde der Einfluss von F-6P und F-2,6BP auf die Bindung der Aldolase an Aktin
untersucht. Bei Einsatz beider Substanzen in einer Endkonzentration von 10 mM kam es zu
einer deutlichen Reduktion der Bindung von Aldolase an Aktin. Die Reduktion der Bindung
im Vergleich zur pelletierten Aldolasemenge der Kontrolle war durch F-6P am stärksten. Nur
ein Drittel der in der Kontrolle nachgewiesenen Aldolasemenge pelletierten unter diesen
Bedingungen (s. Abb. 3.12). Trotz der Schwankungen zwischen den Versuchen liegt diesem
Ergebnis ein Signifikanzniveau von
= 0,01 zugrunde. Der Einfluss von F-6P führte neben
der Reduktion der an das F-Aktin bindenden Aldolasemenge zu einer verstärkten
Aktinpolymerisation
im Vergleich zur
Kontrolle (s. Tab. 3.2),
die jedoch starken
Schwankungen unterlag.
Durch F-2,6BP blieb die Polymerisation des Aktin unbeeinflusst (s. Tab. 3.2). Die
Aldolasemenge dagegen, die im Pellet nachgewiesen werden konnte, war deutlich reduziert
(s. Tab. 3.3). Der an das F-Aktin gebundene Anteil der Aldolase betrug 14% im Vergleich zu
34% in der Kontrolle (s. Abb. 3.12). Damit war der Einfluss von 10 mM F-2,6BP auf die
Bindung der Aldolase an F-Aktin stärker als derjenige von 10 mM FBP (s. Abb. 3.12).
Ergebnisse
90
Anteil gebundener Aldolase [%]
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Kontrolle
1 mM FBP
10 mM FBP
10 mM F-6P
10 mM F-2,6BP
Abb. 3.12: An F-Aktin bindender Anteil an Aldolase unter Einfluss von FBP, F-6P und
F-2,6BP (in %). Das in den Proben polymerisierte Aktin entspricht 100%.
Mit Abb. 3.13 wird die hemmende Wirkung der Substanzen auf die Bindung zwischen
Aldolase
und
Aktin deutlich gemacht. Ausgangsbedingung dafür ist, dass unter
Kontrollbedingungen die maximal mit Aktin pelletierte Aldolase nachgewiesen wurde.
Der Anteil von 34% gebundener Aldolase an Aktin in der Kontrolle (Abb. 3.12) wird gleich
100% gesetzt. Die hemmende Wirkung beträgt damit in der Kontrolle 0%. Darauf bezogen
zeigt sich die stärkste hemmende Wirkung unter Einfluss von F-6P. Sie beträgt knapp 70%.
Die hemmende Wirkung von 10 mM FBP ist mit 50% geringer als die von 10 mM F-2,6BP.
eingesetzte Substanzen und
Konzentrationen
Durch 1 mM FBP erfolgte eine Hemmung der Bindung um 38% (s. Abb. 3.13).
10 mM F-2,6BP
10 mM F-6P
10 mM FBP
1 mM FBP
Kontrolle
0%
20%
40%
60%
80%
hemmende Wirkung [%]
Abb. 3.13:
Hemmende
Wirkung
auf
die
Aldolase-Aktin-Bindung.
Dargestellt ist der hemmende Einfluss verschiedener Substanzen auf den Anteil an FAktin gebundener cytosolischer Aldolase in %. Da in der Kontrolle von keiner
Hemmung der Bindung auszugehen ist, wurde der Anteil der an Aktin gebundenen
Aldolase mit 0% als ungehemmt angesehen.
Ergebnisse
91
3.2.2 Einfluss des Redox-Milieus auf die Aldolase-Aktin-Bindung
Der Einfluss des Redox-Milieus auf die Bindung der Aldolase an Aktin wurde durch
Copolymerisation von Aktin und Aldolase nach Vorinkubation der Aldolase mit Reduktionsbzw. Oxidationsmitteln untersucht. Die Aktinpolymerisation wurde vom oxidierten
Glutathion um 10% verringert, wogegen sie unter Einfluss von GSH geringfügig gesteigert
wurde (7%, s. Tab. 3.4). Die pelletierte Aktinmenge wies unter Einfluss von GSH die
stärksten Schwankungen zwischen den Versuchen auf. Eine Verringerung der Polymerisation
von Aktin durch Glutathionylierung wurde bereits von WANG et al. (2001) beschrieben.
Inkubation mit reduziertem und oxidiertem DTT führte jedoch zu einem anderen Ergebnis.
Die pelletierte Aktinmenge entsprach unter reduzierenden Bedingungen etwa der Kontrolle,
jedoch pelletierten unter Einfluss von oxidiertem DTT 24% mehr Aktin als in der Kontrolle.
Die im Pellet nachgewiesenen Aldolasemengen waren im Vergleich zur Kontrolle unter
Einfluss aller eingesetzten Reduktions- bzw. Oxidationsmittel geringfügig gesteigert. Nur
unter Einfluss von GSH konnte eine deutliche Steigerung der pelletierten Aldolase (um 27%)
nachgewiesen werden (s. Tab. 3.5).
Tab. 3.4: Einfluss des Redox-Milieus auf die pelletierte Aktinmenge im Vergleich zur Kontrolle in %.
Untersucht wurde der Einfluss des synthetischen Redoxreagenzes DTT und des natürlichen
Redoxreagenzes Glutathion nach Vorinkubation der Aldolase mit diesen auf die
Copolymerisationseigenschaften.
Exp.:
1
2
3
4
5
MW
Sd
Kontrolle
100
100
100
100
100
100
GSH
92
125
106
87
127
107
0,81
GSSG
153
46
106
113
33
90
0,5
DTTred
93
125
85
88
DTTox
117
108
67
205
98
0,18
124
0,58
Tab. 3.5: Einfluss des Redox-Milieus auf die pelletierte Aldolasemenge im Vergleich zur Kontrolle in %.
Untersucht wurde der Einfluss des synthetischen Redoxreagenzes DTT und des natürlichen
Redoxreagenz Glutathion nach Vorinkubation der Aldolase mit diesen auf die
Copolymerisationseigenschaften.
Exp.:
1
2
3
4
5
6
MW
Sd
Kontrolle
100
100
100
100
100
GSH
104
120
95
152
162
GSSG
130
60
82
178
71
DTTred
106
120
64
147
DTTox
106
116
81
127
100
127
0,29
104
0,49
109
0,35
108
0,20
Ergebnisse
92
Betrachtet man den Anteil der an das polymerisierte Aktin gebundenen Aldolase, wobei
die in der Probe polymerisierte Aktinmenge gleich 100% gesetzt wurde, so zeigt sich eine
verstärkte Bindung von Aldolase an Aktin unter Einfluss von Glutathion (red. und ox.)
und reduziertem DTT (s. Abb. 3.14). Der Einfluss von oxidiertem DTT liegt in einer
leichten Verringerung der Menge gebundener Aldolase. Eine Signifikanz der Ergebnisse
im Vergleich zur Kontrolle konnte bei Glutathion, in reduzierter und oxidierter Form, und
oxidiertem DTT trotz der starken Schwankungen zwischen den Versuchen mit einem
Signifikanzniveau von
= 0,5 ermittelt werden. Bei einem Signifikanzniveau von
= 0,5
ist von einem signifikanten Unterschied zur Kontrolle in der Hälfte der Versuche
auszugehen. Keine Signifikanz zeigt der Unterschied der Bindung von Aldolase an Aktin
Anteil der an F-Aktin gebundenen Aldolase
[%]
unter Einfluss von reduziertem DTT im Vergleich zur Kontrolle.
90,00
80,00
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
Kontrolle
GSH
GSSG
DTT red
DTT ox
Abb. 3.14: Anteil der an F-Aktin gebundenen Aldolase unter Einfluss von Reduktionsund Oxidationsmitteln im Vergleich zur Kontrolle (in %). Das in den Proben
polymerisierte Aktin entspricht 100%.
Ergebnisse
93
Um die fördernde oder hemmende Wirkung der reduzierenden und oxidierenden
Bedingungen auf die Bindung der Aldolase an Aktin zu verdeutlichen, wurde in
Abbildung 3.15 der an das polymerisierte Aktin gebundene Anteil der Aldolase in der
Kontrolle gleich 100% gesetzt. Dadurch wird deutlich, dass reduzierende Bedingungen,
hervorgerufen durch DTT und Glutathion, zu einer um 15% (DTTred) bzw. 20% (GSH)
verstärkten Aktinbindung der Aldolase führten. Zu einer verstärkten Aktinbindung der
Aldolase um 40% führte die Inkubation mit oxidiertem Glutathion, wobei hier jedoch zu
beachten ist, dass die einzelnen Versuche die größten Schwankungen im Anteil der an
Aktin gebundenen Aldolase aufwiesen (s. Abb. 3.14). Eine hemmende Wirkung auf die an
eingesetzte Substanzen
Aktin gebundene Aldolase wurde durch oxidiertes DTT hervorgerufen.
DTT ox
DTT red
GSSG
GSH
Kontrolle
0%
50%
100%
150%
relativer Anteil der an F-Aktin gebundenen
Aldolase [%]
Abb. 3.15: Einfluss reduzierender und oxidierender Bedingungen auf den relativen Anteil an FAktin gebundener cytosolischer Aldolase (in %). Der in der Kontrolle an F-Aktin gebundene
Anteil der Aldolase wurde gleich 100% gesetzt.
Ergebnisse
94
3.2.3 Stöchiometrie der Aldolase-Aktin-Bindung
Um die Stöchiometrie der Bindung von Aldolase an F-Aktin zu ermitteln, wurden Versuche
wie in Kapitel 2.3.10 beschrieben durchgeführt. Dafür wurden mit Phalloidin stabilisierte
Aktinfilamente unter die kritische Konzentration der Aktinpolymerisation verdünnt. Zu diesen
Aktinfilamenten wurde Aldolase in verschiedenen Konzentrationen gegeben, und nach
Zentrifugation bei 200 000 × g wurden die pelletierten Proteine mittels SDS-PAGE analysiert.
Da es unter den gewählten Versuchsbedingungen zur Degradation der Aldolase kam, was
auch nicht durch den Einsatz eines Serin-Protease-Inhibitors (Pefabloc 0,6 µg/µl) verhindert
wurde, und Aldolase auch ohne eine Bindung an Aktinfilamente pelletierte, konnte mit Hilfe
dieser Methode keine Bindestöchiometrie ermittelt werden. Der Einsatz von Detergenz und
eines anderen Puffers („Low-Salt-Buffer“), der durch die Copolymerisationsversuche erprobt
war, führte zu keiner Verbesserung der Ergebnisse. Der möglicherweise entscheidende
Unterschied zwischen den Copolymerisationsversuchen und den Stöchiometrieversuchen
besteht im Einsatz des Pilzgiftes Phalloidin. Dieses dient der Stabilisierung von
Aktinfilamenten. Da bei den Copolymerisationsversuchen nicht mit Aktinkonzentrationen
unterhalb der kritischen Konzentration der Aktinpolymerisation gearbeitet wurde, konnte auf
eine Stabilisierung verzichtet werden.
Ergebnisse
95
In einem weiteren Copolymerisationsversuch (s. Kap. 2.3.9) wurden 5 µM Aktin mit 0,110 µM Aldolase polymerisiert (s. Abb. 3.15). Die densitometrische Auswertung der
Aldolasebanden
im
Pellet
und
im
Überstand
der
Proben
weist
auf
eine
konzentrationsabhängige Bindung der Aldolase an Aktin hin. Von der eingesetzten Aldolase
waren bei Aldolasekonzentrationen von 10 und 5 µM 30-40% an Aktin gebunden. Wurden
geringere Aldolasekonzentrationen eingesetzt, erhöhte sich der gebundene Anteil auf 50-60%
der eingesetzten Aldolasemenge. Bei allen Proben blieb ein Teil der Aldolase ungebunden im
Überstand der Proben nachweisbar.
A
Aldolase [µM]
Ma
10
5
2,5
1,25
0,625 0,313
0,16 0,078
55 kDa
Aktin
Aldolase
40 kDa
B
Aldolase [µM]
Ma
10
5
2,5
1,25
0,625
0,313
0,16
0,078
55 kDa
40 kDa
Aktin
Aldolase
Abb. 3.16: Überstand (A) und Pellet (B) des Copolymerisationsversuches mit 5 µM Aktin und 0,078-10 µM
rekombinanter Aldolase (Z. mays) mit Strep-tag. Alle Proben enthielten 5 µM Aktin. Ma:
Molekularmassenstandard (Prestained Protein Ladder, ~10-160kDa, MBI Fermentas, St. Leon-Rot).
Ergebnisse
96
3.3 Ergebnisse der Hefe-2-Hybrid-Analysen
Um mögliche Protein-Protein-Interaktionen zu finden, wurde das Hefe-2-Hybrid-System
gewählt. Dafür wurde das glykolytische Enzym Aldolase in den Vektor pGBKT7 kloniert.
Die Ergebnisse dieser Klonierung sowie der Herstellung einer cDNA-Bank und der
durchgeführten Hefe-2-Hybrid-Analysen werden im Folgenden beschrieben.
3.3.1 Klonierung von Aldolase in den Vektor pGBKT7
Die Klonierung der Aldolase in den Vektor des Hefe-2-Hybrid-Systems, der die DNABindedomäne des Transkriptionsfaktors enthält (DNA-BD), erfolgte wie in Kapitel 2.3.3.16.2
beschrieben. Als Ausgangsmaterial diente das Plasmid ALD_pET-16b. Die positiven Klone
wurden ansequenziert. Bei dem für die weiteren Arbeiten ausgewählten Klon ergab ein
Vergleich der sequenzierten 562 Nukleotide des Klons eine Übereinstimmung von 99% mit
der
Sequenz
der
Datenbank
GenBank.
Alle
vier
Unterschiede
zwischen
den
Nukleotidsequenzen sind stille Mutationen.
3.3.2 Herstellung einer cDNA-Bank
Zur Herstellung der cDNA-Bank des Hefe-2-Hybrid-Systems wurde zunächst Gesamt-RNA
aus Mais isoliert. Konzentration und Reinheit der Proben wurde photometrisch ermittelt (s.
Kap. 2.3.3.3). Um Verunreinigungen mit DNA auszuschließen, wurden die Proben zusätzlich
auf
einem
RNA-Gel
analysiert
(Abb. 3.17). Da keine Verunreinigungen mit DNA in den Proben
nachzuweisen waren, wurde eine
Probe,
bei
der
auch
keine
Verunreinigung mit Proteinen und
Probe 1
2
3
4
5
6
7
8
Abb. 3.17: Analyse der isolierten Gesamt-RNA aus
verschiedenen Proben von Z.mays auf einem RNA-Gel. Für die
Herstellung der cDNA-Bank des Hefe-2-Hybrid-Systems
wurde die rot markierte Probe (8) verwendet, die aus einem
Gemisch von hypoxisch angezogenem Sproß- und
Wurzelgewebe bestand.
aromatischen
Phenol)
Substanzen
aufgrund
der
(z. B.
photo-
metrischen Messungen nachweisbar
war, für die weiteren Arbeiten
ausgewählt. Es handelte sich um
Probe
8,
deren
0,62 µg/µl betrug.
Konzentration
Ergebnisse
97
Die anschließende Synthese der “first-strand cDNA“ und der Amplifizierung der ds-cDNA
durch „long-distance PCR“ erfolgte wie in Kapitel 2.3.5.4.1 beschrieben. Die Proben wurden
anhand eines 1,2%igen Agarosegels überprüft und stimmten mit den Erwartungen (Handbuch
„Matchmaker Library Construction & Screening Kit“,
Clontech,
Heidelberg)
Abb. 3.18
hergestellt
aus
zeigt
links
die
Kontrolle
(ds-cDNA,
überein.
„Human Placenta
+
Poly A RNA , Clontech, Heidelberg),
10000
rechts sind drei Proben der aus Spross-
2500
2000
und
1000
750
angezogenem Mais amplifizierten ds-
Wurzel-RNA
von
hypoxisch
cDNA aufgetragen. Nach Reinigung der
500
ds-cDNA, wie in Kapitel 2.3.5.4.2
250
beschrieben,
Ma
1
2
3
4
5
6
Ma
Abb. 3.18: Analyse der amplifizierten ds-cDNA auf
einem 1,2%igen Agarosegel. Links befindet sich in drei
Spuren die Kontrolle aus „Human Placenta Poly
A+ RNA (1-3), rechts sind drei Proben ds-cDNA aus
hypoxischem Sproß- und Wurzelgewebegemisch von Z.
mays dargestellt (4-6). Ma: Gene Ruler TM 1 kb DNA
Ladder (MBI Fermentas, St. Leon-Rot).
wurde die cDNA-Bank
durch in-vivo-Rekombination in Hefen
fertiggestellt.
Die
Transformations-
effizienz wurde durch Auszählen einer
Platte mit einer 1:1000-Verdünnung des
Transformationsansatzes ermittelt und
lag mit 1 x 104 unter der erwünschten
Transformationseffizienz. Die Anzahl der Klone der cDNA-Bank betrug 1 x 105 Klone/ml
und wurde nach der in Kapitel 2.3.5.4.5 beschriebenen Formel ermittelt. Nach Ernte der
Zellen (Kap. 2.3.5.4.4) wurde die Zelldichte mit Hilfe eines Hemocytometers ausgezählt;
dabei wurde ein Wert von 1 x 1010 Zellen/ml ermittelt, der damit über der benötigten MindestZelldichte von 1 x 107 Zellen/ml lag.
3.3.3 Test auf transkriptionale Aktivität des Fusionsproteinkonstruktes und
Toxizitätstest
Für
die
Durchführung
der
Hefe-2-Hybrid-Analysen
war
es
notwendig,
das
Fusionsproteinkonstrukt aus Aldolase und der DNA-Bindedomäne des Transkriptionsfaktors
(ALD_pGBKT7) auf eine eventuelle Toxizität und auf transkriptionelle Aktivierung in Hefen
zu überprüfen. Um auszuschließen, dass durch Transkription und Translation des Konstruktes
die Reportergene ohne eine Fusion mit der Aktivierungsdomäne angeschaltet werden, wurden
beide Hefestämme mit dem Konstrukt transformiert. Die Transformanden wurden auf die
Ergebnisse
98
Aktivität der Reportergene (s. Kap. 2.3.5) untersucht, indem sie auf verschiedene selektive
Medien ausplattiert wurden.
Ohne eine Aktivierung der Reportergene sollten die Hefen nicht auf Medien ohne Histidin
und Adenin wachsen können. Durch das in den Medien enthaltene X- -Gal würden Kolonien,
bei denen die Reportergene transkribiert und translatiert würden, eine blaue Farbe zeigen.
Alle Erscheinungsformen der Kolonien sind in Tabelle 3.6 aufgeführt.
Tab. 3.6: Test der transkriptionalen Aktivität der Hefestämme mit dem Plasmidkonstrukt ALD_pGBKT7 und
dem Plasmid pGBKT7 ohne „Insert auf selektivem SD-Medium sowie untransformierter Hefen
beider Stämme.
Hefestamm [mit Plasmidkonstrukt]
SD/-Trp/
SD/-Trp/-His/
SD/-Trp/-Ade/
X- -Gal
X- -Gal
X- -Gal
AH109[ALD_pGBKT7]
+ / weiß


AH109[pGBKT7]
+ / weiß





Y187[ALD_pGBKT7]
+ / weiß


Y187[pGBKT7]
+ / weiß





AH109
Y187
: keine Kolonien gewachsen
+ / Farbe: Kolonien mit dieser Farbe gewachsen
Die Hefezellen, die ein Plasmid enthielten, wuchsen nur auf dem Medium SD/-Trp/X- -Gal,
und die Kolonien hatten eine weiße Farbe. Dadurch war bestätigt, dass es nicht zu
transkriptionaler Aktivierung durch das Bait-Konstrukt (DNA-BD fusioniert mit Aldolase,
ALD_pGBKT7) kommt. Hefezellen ohne Plasmid konnten auf keinem der selektiven Medien
wachsen.
Ergebnisse
99
Für den Toxizitätstest wurden Hefezellen wie in Kap.2.3.5.4.7 beschrieben kultiviert. Die
optische Dichte wurde bei 600 nm (OD600) nach 16-24 h gemessen. Der Hefestamm Y187 mit
dem Konstrukt ALD_pGBKT7 erreichte nach 24 h eine optische Dichte von nur 0,1
(s.Tab 3.7). Die gewünschte OD600 liegt bei 0,8.
Tab. 3.7: Optische Dichte der Hefekultur Y187[ALD_pGBKT7] gemessen bei 600 nm nach 16-24 h Anzucht.
Zeit nach Animpfung
OD600 nm
17 h
0,038
18 h
0,052
20 h
0,064
24 h
0,114
3.3.4 Analyse der Kontrollen zu den Hefe-2-Hybrid-Versuchen
Parallel zu den Hefe-2-Hybrid-Analysen wurden Kontrollen wie in Kapitel 2.3.5.6
beschrieben durchgeführt. Das Fusionsproteinkonstrukt aus DNA-Bindedomäne und Murein
p53 (pGBKT7-53) interagiert in einem Hefe-2-Hybrid-System mit dem Fusionsprotein aus
Aktivierungsdomäne und der großen Untereinheit des „SV40 large T PCR fragment“
(pGADT7-RecT) (LI & FIELDS, 1993) und diente als Positivkontrolle.
Bei der Negativkontrolle wurde ebenfalls das Konstrukt aus der mit dem „SV40 large T PCR
fragment“ fusionierten Aktivierungsdomäne eingesetzt. Dieses interagiert nicht mit dem
Fusionsproteinkonstrukt aus der mit menschlichem Lamin C fusionierten DNA-Bindedomäne
(pGBKT7-Lam). Da Lamin C weder Komplexe bildet noch mit den meisten anderen
Proteinen interagiert (BARTEL et al., 1993), können bei Hefekolonien mit diesen Konstrukten
die Reportergene nicht aktiviert werden. Durch Auszählen der gewachsenen Kolonien wurden
mit Hilfe der in Kap. 2.3.5.5 beschriebenen Formeln die lebensfähigen Kolonien/ml und die
Paarungseffizienz ermittelt. Die Paarungseffizienz sollte nach Herstellerangaben über 2%
betragen. Anhand der Daten eines Versuchs sind die Ergebnisse beispielhaft für alle
durchgeführten Kontrollversuche in den Tabellen 3.8 und 3.9 aufgeführt.
Ergebnisse
100
Tab. 3.8: Lebensfähigkeit und Anzahl der diploiden Hefezellen des positiven Kontrollversuchs mit den
Hefestämmen AH109[pGADT7-RecT] und Y187[pGBKT7-53].
Medium
Gezählte
Verdünnung
Kolonien
Anzahl
Lebensfähigkeit
lebensfähiger
der Hefezellen
Kolonien/ml
des Stammes
Y187
SD/-Leu
4.704
1 :100
4 704.000
SD/-Trp
932
1 :100
932.000
AH109
SD/-Leu/-Trp
326
1 :10
32.600
Diploide
v Die Paarungeseffizienz lag bei 3,5%, auf dem Medium SD/QDO/X- -Gal sind blaue
Kolonien gewachsen.
Tab. 3.9: Lebensfähigkeit und Anzahl der diploiden Hefezellen des negativen Kontrollversuchs mit den
Hefestämmen AH109[pGADT7-RecT] und Y187[pGBKT7-Lam].
Medium
Gezählte
Verdünnung
Kolonien
Anzahl
Lebensfähigkeit
lebensfähiger
der Hefezellen
Kolonien/ml
des Stammes
Y187
SD/-Leu
7.864
1 :100
7 864.000
SD/-Trp
862
1 :100
862.000
AH109
SD/-Leu/-Trp
239
1 :10
239.000
Diploide
v Die Paarungeseffizienz lag bei 28%, auf dem Medium SD/QDO/X- -Gal sind keine
Kolonien gewachsen.
Mit einer Paarungseffizienz von 3,5% bei der positiven Kontrolle und 28% für die negative
Kontrolle war die Paarung erfolgreich. Bei einer erfolgreichen Paarung muss die
Paarungseffizienz einen Wert von über 2% erreichen. Die Anzahl der diploiden lebensfähigen
Kolonien unterschied sich zwischen den beiden Kontrollversuchen stark. Für die positive
Kontrolle
wurden
32.600
lebensfähige
Kolonien/ml
ermittelt,
bei dem negativen
Kontrollversuch waren es 239.000. In beiden Kontrollversuchen wurden weniger lebensfähige
Kolonien/ml für den Stamm AH109 als für den Stamm Y187 nachgewiesen. AH109 war in
beiden Fällen der limitierende Partner für die Paarung. Da dieser Stamm als Kontrolle für die
cDNA-Bank dient, ist es wichtig, dass er den limitierenden Partner darstellt. Dadurch wird die
Möglichkeit gegeben, dass jede Hefezelle des Stammes AH109 eine Hefezelle des anderen
Stammes (Y187) für die Paarung finden kann.
Ergebnisse
101
3.3.5 Hefe-2-Hybrid-Analyse
der
cDNA-Bank
mit
dem Fusionskonstrukt
ALD_pGBKT7
Bei
den
mehrfach
AH109[cDNA-Bank]
durchgeführten
und
Hefe-2-Hybrid-Analysen
Y187[ALD_pGBKT7]
wurden
mit
den
Hefestämmen
unterschiedliche
Paarungs-
effizienzen ermittelt. Die geringste Effizienz lag mit 17,4% noch deutlich über den
notwendigen 2%. Mit der Paarungseffizienz schwankte auch die Anzahl der untersuchten
Klone, die bei den in Tabelle 3.10 beispielhaft aufgeführten Werten eines Versuches 130.340
Klone umfasste. Der Stamm AH109, der die cDNA-Bank trug und mit der AD des
Transkriptionsfaktors fusioniert war, stellte den limitierenden Faktor im Versuch dar,
wodurch sichergestellt wurde, dass jeder Klon der cDNA-Bank einen Interaktionspartner mit
dem DNA-BD-Fusionsprotein (DNA-BD-Aldolase) zum Paaren finden konnte. Die Anzahl
der lebensfähigen Kolonien/ml betrug in diesem Versuch für den Stamm AH109 23.700, bei
den diploiden Hefezellen waren es 9.800. Die Paarung erfolgte bei allen durchgeführten Hefe2-Hybrid-Analysen
24 h
lang,
weil
bei
mikroskopischen
Untersuchungen
der
Paarungssuspension nach 20 h noch Hefe-Zygoten (s. Abb. 3.19) in der Suspension
nachgewiesen werden konnten.
Tab. 3.10: Lebensfähigkeit und Anzahl der diploiden Hefezellen eines Hefe-2-Hybrid-Versuchs mit den
Hefestämmen AH109[pGADT7-cDNA-Bank] und Y187[ALD_pGBKT7].
Medium
Gezählte
Verdünnung
Kolonien
Anzahl
Lebensfähigkeit
lebensfähiger
der Hefezellen
Kolonien/ml
des Stammes
74 000.000
Y187
SD/-Leu
740
1 :10 000
SD/-Trp
862
1 :100
23.700
AH109
SD/-Leu/-Trp
239
1 :10
9.800
Diploide
v Die Paarungseffizienz lag bei 41,4%.
Abb. 3.19: Diploide Hefezygote (400fache
Vergrößerung)
mit
der
charakteristischen dreilappigen Gestalt.
Links und unterhalb der Zygote befinden
sich haploide Hefezellen mit kugeliger
Gestalt.
Ergebnisse
102
Aus der Paarung hervorgegangene Kolonien, die nach mehrfacher Selektion auf
verschiedenen Selektionsmedien einen Durchmesser von
X- -GAL durch die Aktivität der
2 mm aufwiesen und das Substrat
-Galactosidase in einen blauen Farbstoff umwandelten,
wurden weiter analysiert.
3.3.6 Analyse
der
pGADT7-cDNA-Bank-Konstrukte
aus
den
blauen
Hefekolonien
Die aus den Hefen isolierten Plasmide wurden, da sie Verunreinigungen mit genomischer
Hefe-DNA aufwiesen, zunächst in E. coli transformiert. Die transformierten Zellen wurden
dann durch Ampicillin auf die Anwesenheit des „Prey -Plasmides (pGADT7-cDNA-Bank)
selektioniert. Mit Hilfe der aus diesen E. coli-Zellen isolierten Plasmid-DNA konnte
anschließend eine PCR zur Identifizierung der Größe des cDNA-„Inserts
und für
Sequenzierungen durchgeführt werden. Die Anzahl der Basen, die mit Hilfe der
Sequenzierung identifiziert werden konnten, sowie die Ergebnisse der Sequenzvergleiche von
den Sequenzen aus den Hefe-2-Hybrid-Versuchen mit den Sequenzen in der Datenbank
GenBank sind in Tabelle 3.11 zusammengefasst. Nicht alle Sequenzen wiesen ein StartCodon auf und nur ein „Prey -Plasmid enthielt die vollständige kodierende Sequenz eines
Proteins (GOS2, Hefekolonie 2.11). Bei den gefundenen positiven Interaktionspartnern der
Aldolase ergaben einige Sequenzierungen rRNA, die als falsch positive Bindepartner
interpretiert werden müssen (HONG, 2000).
Des Weiteren wurde mehrfach Aldolase als Interaktionspartner identifiziert, was auf Grund
der Tetramerbildung der Aldolase zu erwarten war. Als neue Interaktionspartner der Aldolase
konnten zwei Proteine identifiziert werden: der Translations-Initiationsfaktor GOS2 aus Mais
und das mitochondriale spannungsabhängige Anionenkanalprotein VDAC 1a. Bei diesen
beiden Sequenzen lag die Übereinstimmung zur Sequenz in der Datenbank bei 96%.
Ein weiteres Ergebniss der Sequenzvergleiche ergab eine Übereinstimmung mit einer
Sequenz in der Datenbank, die nur einen kleinen Bereich der für das Protein kodierenden
Sequenz umfasste. Dabei wurde eine Methionin-Adenosyltransferase identifiziert.
Ergebnisse
103
Tab. 3.11: Ergebnisse der Sequenzanalysen der „Inserts aus dem Vektor pGADT7-cDNA-Bank nach positiver
Interaktion in einem Hefe-2-Hybrid-Versuch mit dem Plasmidkonstrukt ALD_pGBKT7. Angegeben
sind die mit Hilfe eines Agarosegels bestimmten „Insert -größen, die Anzahl sequenzierter
Nukleotide und das Ergebnis der BLAST-Analyse der jeweiligen Hefekolonie.
Hefe-
Insert-
Sequenzierte
kolonie
größe
Größe (bp)
Ergebnis des Sequenz-Alignments
gi-Nummer
kodierende Sequenz für Aldolase aus Mais
gi:168419
kodierende Sequenz des spannungs-
gi:5929927
(bp)
2.17
1400
421
7.243
1600
700
2.48
1200
493
abhängigen Anionenkanalproteins 1a
(vdac1a) aus Mais
2.11a
1000
748
kodierende Sequenz für GOS2 (Translations- gi:21206618
Initiationsfaktor) aus Mais
7.173
900
670
mRNA-Sequenz PC0102485 aus Mais
gi:21206618
7.27
850
795
mRNA-Sequenz PC0138904 aus Mais
gi:21209073
254
900
330
mRNA-Sequenz CL3683_1 aus Mais
gi:21213628
2.43
1000
480
Methionin-Adenosyltransferase aus Mais
gi:17017258
2.5
150
150
mitochondriales Gen für 18S rRNA aus Mais gi:13923
2.4
400
120
4D
500
259
7.178
2.7
25S rRNA-Gen und Transposon-ähnliche
Sequenz
2.60b
900/
1800
180
Doppelsignal, kein Ergebnis
gi:13397940
Ergebnisse
104
3.3.7 Klonierung des Expressionskonstruktes VDAC_pRSET A
Das im Hefe-2-Hybrid-System als putativer Partner für eine Protein-Protein-Interaktion mit
der
Aldolase
gefundene
spannungsabhängige
Kanalprotein
VDAC 1a
der
äußeren
Mitochondrienmembran lag im „Prey“-Vektor des Hefe-2-Hybrid-Systems nicht als
vollständige cDNA vor, sondern mit einem Sequenzstück
bp
Ma
aus
5’-untranslatiertem Bereich von 92
Basen und
kodierender DNA von 322 Basen. Dadurch konnte diese
3000
cDNA nicht für weitere Klonierungen verwendet werden.
1500
Mit den Primern vdac_pRSET-For und vdac_pRSET-Rev
900
wurde auf Mais-cDNA eine PCR durchgeführt, bei der eine
500
geringe Menge DNA in der gewünschten Größe zwischen
800 und 900 bp amplifiziert wurde (s. Abb. 3.20). Mit dieser
erfolgte die Klonierung zunächst in den Vektor pDrive.
Nach Analyse positiver Klone wurde das DNA-Fragment in
den Vektor pRSET A kloniert und in E. coli XL1blue
Abb. 3.20:
Agarosegel
zur
Überprüfung der Größe des
amplifizierten
für
VDAC
kodierenden PCR-Produkts. Ma:
Gene Ruler 100bp Ladder Plus
(MBI Fermentas, St. Leon-Rot).
transformiert. Restriktionsanalysen (s. Abb. 3.21) und ein
Überexpressionsversuch erfolgten, bevor einer dieser Klone
sequenziert wurde. Durch den Vergleich der Sequenz dieses
Klons mit der in der Datenbank GenBank veröffentlichten
Sequenz des spannungsabhängigen Anionenkanalproteins ergaben sich sechs Nukleotide, die
sich
unterschieden.
Drei
davon
führen
zu
keinem Aminosäureaustausch
in
der
Proteinsequenz. Durch einen weiteren Nukleotidunterschied an Position 424 des Klons
kodiert das entstehende Triplett die Aminosäure Valin, wogegen durch die DatenbankSequenz ein Leucin kodiert wird. Schließlich führt an Position 812 des Klons ein
Nukleotidunterschied zu einem Glycin anstelle eines Alanins. Das Nukleotid 699 des Klons
ist ein Adenin, wogegen in der Datenbank-Sequenz sich an dieser Position ein Cytosin
befindet. Die daraus resultierende Aminosäure, ein Asparagin, wird im Klon durch ein Lysin
ersetzt (s. Anhang Kap. 7.2.8).
Ergebnisse
105
bp
Ma
11500
1700
805
pRSET A
VDAC
Abb. 3.21: Identifizierung positiver Klone nach Klonierung des für VDAC
kodierenden PCR-Fragments in den Vektor pRSET A durch Restriktionsanalyse. Alle
Klone enthalten ein „Insert in der entsprechenden Größe von 831 bp. Ma: Lambda
DNA/Pst I Marker 24, MBI Fermentas, St. Leon-Rot.
3.3.8 Klonierung von VDAC in den Vektor pGBKT7
Um das Protein VDAC zukünftig auch in Hefe-2-Hybrid-Analysen einsetzen zu können,
musste die kodierende Nukleotidsequenz in den „Bait -Vektor des Hefe-2-Hybrid-Systems
kloniert werden. Eine PCR mit Mais-cDNA als „template“ führte zur Amplifikation eines
831 bp großen PCR-Fragments. Dieses DNA-Fragment wurde in den Vektor pDrive ligiert,
wobei es nur zu wenigen positiven Insertionen des Fragments in den Vektor kam. In
Abb. 3.22 A ist die Bande des „Inserts bei drei Proben schwach zu sehen, nachdem diese mit
den Restriktionsendonukleasen Nde I und Bam HI aus dem Vektor geschnitten worden war.
Dieses Fragment wurde anschließend in den geöffneten Vektor pGBKT7 ligiert und in
E. coli XL1blue kloniert. Die Restriktionsanalyse dieser Klonierung ist in Abb. 3.22 B
dargestellt. Von den insgesamt sieben positiven Klonen mit einem Insert in der
entsprechenden Größe sind zwei (Probe 10 und 12) auf dem abgebildeten Agarosegel zu
sehen.
A
B
bp
bp
11500
11500
5077
2838
1700
2838
1700
1093
805
805
Ma 1
2
3
4
5
6
Ma
10
11
12
13
Abb. 3.22: Restriktionsanalysen zur Identifizierung positiver Klone der Klonierung des für VDAC kodierenden
PCR-Fragments in pDrive (A) und des Endkonstruktes VDAC in pGBKT7 (B). Der Pfeil markiert das
herausgeschnittene „Insert . Ma: Lambda DNA/Pst I Marker 24, MBI Fermentas, St. Leon-Rot. A: Klon 2, 4 und
6 enthalten ein Insert, B: Klon 10 und 12 enthalten ein „Insert von ca. 830 bp.
Ergebnisse
106
3.3.9 Klonierung von Aktin in den Vektor pGBKT7
Um Aktin im Hefe-2-Hybrid-System als Bait“ einsetzen zu können, und Proteine, die mit
Aktin interagieren, identifizieren zu können, wurde versucht, Aktin in den Vektor pGBKT7
zu klonieren. Nachdem trotz Optimierungsversuchen die mit den Primern Aktin-sense und
Aktin-antisense amplifizierten DNA-Mengen sehr gering blieben, wurden die erhaltenen
schwachen Banden aus 15 PCR-Ansätzen vereinigt und gemeinsam gereinigt (PCR-Produkte
nicht gezeigt). Das PCR-Produkt wurde dann in pDrive ligiert. Nach Transformation des
Aktin-pDrive Plasmidkonstruktes in E. coli XL1blue wurden von den mit Blau-WeißSelektion identifizierten positiven Kolonien Übernachtkulturen angesetzt und die Plasmide
isoliert. Nach einem Restriktionsverdau mit Bam HI und Pst I konnten von den 17 Kolonien
drei als positiv identifiziert werden. Bei diesen Plasmiden war nach dem Restriktionsverdau
neben der Vektorbande bei ca. 4000 bp eine Bande bei ca. 1000 bp auf dem Agarosegel zu
sehen (Abb. 3.23). Alle drei Proben wurden zur Klonierung in den Vektor pGBKT7
eingesetzt. Dieser wurde vor der Ligation mit den aus pDrive geschnittenen DNA-Fragmenten
ebenfalls mit Bam HI und Pst I geschnitten und gereinigt. Obwohl Restriktionsanalysen
einige positive Klone zeigten, ergaben Sequenzierungen, dass es sich bei diesen Klonen nicht
um Aktin im Vektor pGBKT7 handelt, sondern weiterhin um den Vektor pDrive mit „Insert .
Eine erfolgreiche Klonierung dieses Plasmidkonstruktes wurde innerhalb der vorliegenden
Arbeit nicht mehr erreicht.
bp
5077
2838
1700
805
Ma
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Abb. 3.23: Analyse positiver Klone mit Hilfe von Restriktionsverdau des
Konstruktes Aktin in pDrive. Gezeigt sind zwei der drei positiven Klone (4 und
9), die ein „Insert von ca. 1000 bp enthielten. Ma: Lambda DNA/Pst I Marker
24, MBI Fermentas, St. Leon-Rot.
Ergebnisse
107
3.4 Heterologe Expression und Reinigung von VDAC (Z. mays) mit His-tag
Für die heterologe Expression des VDAC wurde das Plasmidkonstrukt VDAC_pRSET A in
E. coli BL21(DE3)pLysS Zellen transformiert und überexprimiert. Die Induktion der
Proteinsynthese erfolgte während der exponentiellen Wachstumsphase der Bakterien, deren
Zellteilungsrate sich daraufhin verlangsamte. Eine Abflachung der Wachstumskurve ist nach
der Induktion zu erkennen (Abb. 3.24). Während der Proteinexpression wurde der
Zellsuspension jede Stunde
ein aliquoter Anteil von 1 ml
Optische Dichte bei 600 nm
2,0
1,8
entnommen. Die Expression
1,6
1,4
wurde
1,2
vor
dem Zellauf-
schluss und der Protein-
1,0
0,8
reinigung
0,6
0,4
mittels
12%igen
0,2
SDS-PAGE
analysiert.
0,0
0
60
120
180
240
300
360
einer
Abb. 3.25 (A)
420
Zeit [min]
zeigt eine deutliche Bande,
die
Abb. 3.24: Wachstumskurve von E. coli BL21(DE3)pLysS mit dem
Plasmidkonstrukt VDAC_pRSET A gemessen anhand der optischen
Dichte bei 600 nm gegen H2O. Der Pfeil markiert den Zeitpunkt der
Induktion der Fremdproteinsynthese mit IPTG.
nach
der
zunimmt
und
Stunden
ihre
Stärke
erreicht
befindet
sich
Induktion
nach
drei
maximale
hat.
bei
Sie
etwa
37 kDa. Die errechnete Größe des Proteins mit His-tag betrug 34 kDa. Ein Aufschluss der
aliquoten Anteile in geklärtem Rohextrakt und Pellet zeigte, dass sich das Protein vollständig
im Pellet befand, was auf einen Einschluss in „inclusion bodies“ schließen lässt
(Abb. 3.25 B).
Ergebnisse
108
B
A
kDa
Ma1
0h
1h
118
84
51
3h
4h
kDa
Ma2
RE
P
180
73
54
35
27
48
35
Abb. 3.25: Heterologe Expression von VDAC in E. coli BL21(DE3)pLysS in
Abhängigkeit von der Dauer der Expression (A) und Aufschluss in geklärtem
Rohextrakt und Pellet (B). Ma1: Molekularmassenstandard (Molecular Weight Marker,
MBI Fermentas, St. Leon-Rot), 0 h: vor Induktion der Fremdproteinsynthese, 1 h, 2 h,
3 h und 4 h nach der Induktion der Fremdproteinsynthese, jeweils 1 ml der
Bakteriensuspension. Ma2: Molekularmassenstandard (Prestained Protein Ladder, ~10160 kDa, MBI Fermentas, St. Leon-Rot), RE: geklärter Rohextrakt, P: Pellet.
Dadurch wurde ein Aufschluss der „inclusion bodies“ für die Reinigung des Proteins
notwendig. Mit der in Kap. 2.3.6.7.2 beschriebenen Methode wurde dieser Aufschluss mit
Harnstoff durchgeführt, und das Protein konnte mit Hilfe seines His-tags über Metall-ChelatAffinitätschromatographie gereinigt werden. Die Fraktionen dieser Reinigung sind in
Abb. 3.26 zu sehen. Dabei fällt auf, dass während der Reinigung und der Elution
kontinuierlich Protein von der Säule eluiert und nicht eine bestimmte Imidazolkonzentration
die Elution hervorruft. Mehrere Elutionsfraktionen, die keine größeren Verunreinigungen
aufwiesen, wurden vereinigt, wodurch eine Proteinmenge von ca. 5 mg rekombinantem
VDAC gewonnen werden konnte.
Ergebnisse
kDa
109
Ma 1
2
3
4
5
6
7
8
mM Imidazol:
10
50
100
250
kDa Ma 10 11 12 13 14 15 16 17 18
9
180
73
54
180
73
54
35
35
24
24
Abb. 3.26: Reinigung des rekombinanten VDAC von Mais über Metall-Chelat-Affinitätschromatographie. SDSPAGE-Analyse von je 10 µl der folgenden Fraktionen:
1: geklärter Rohextrakt vor Aufschluss der „inclusion bodies
2: Überstand vom Waschschritt des Pellets vor Aufschluss der inclusion bodies
3: Pellet nach Aufschluss der „inclusion bodies
4: geklärter Rohextrakt (RE2) nach Aufschluss der inclusion bodies
5: Durchfluss des RE2 nach Auftragen auf die Metall-Chelat-Affinitätssäule
6-10: Waschschritte 1 bis 5 (Denaturierungs-Solubilisierungs-Puffer)
11-18: Elutionsschritte 1 bis 8 mit Imidazol in unterschiedlichen Konzentrationen
Ma: Molekularmassenstandard (Prestained Protein Ladder, ~10-160 kDa, MBI Fermentas, St. Leon-Rot)
3.5 Far-Western-Blot
Um
die
Protein-Protein-Interaktionen,
die
durch
Hefe-2-Hybrid-Analysen
und
Copolymerisationsversuche identifiziert wurden, mit einer anderen Methode nachzuweisen,
wurden „Far-Western-Blots“ durchgeführt. Bei den auf der Membran durch „Dot-Blot“
immobilisierten Proteinen handelte es sich um jeweils 2 µg Aldolase, BSA, Aktin, Tubulin
und VDAC. Diese wurden, wie in Kapitel 2.3.6.5 beschrieben, mit rekombinanter Strep-tagAldolase inkubiert und anschließend entsprechend einem Western-Blot entwickelt. Eine
deutliche Immundetektion durch die Aldolase-Antikörper ist bei Aldolase, Aktin und VDAC
zu sehen. Die Negativkontrolle BSA zeigt keine Interaktion mit Aldolase. Auf dem
Kontrollblot ist deutlich eine Immundekoration der Aldolase, jedoch keines weiteren Proteins
zu sehen. Die Detektion des Aktin und VDAC beruht also auf einer Interaktion der
immobilisierten Proteine auf der Membran mit der Aldolase, die als Overlay zu den Proteinen
gegeben wurde und an diese gebunden hat (s. Abb. 3.27).
Ergebnisse
A
110
ALD BSA
Aktin
Tubulin
VDAC
B
ALD BSA
Aktin
Tubulin
VDAC
Abb. 3.27: Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe von Far-Western-Blots. Auf dem
Kontrollblot (A) und dem Test-Blot (B) wurden als Proben je 2 µg rekombinante Strep-tag-Aldolase (Z.
mays; ALD), BSA, Aktin, Tubulin und rekombinanter VDAC (Z. mays; VDAC) im Dot-Blot-Verfahren
aufgetragen. Der Blot (B) wurde mit 25 nM rekombinanter Aldolase inkubiert. Die Entwicklung
erfolgte durch Chemolumineszenz.
3.6 Aldolase-VDAC-Bindeversuch (Affinitätschromatographie)
Für den Nachweis einer direkten Bindung zwischen Aldolase und dem spannungsabhängigen
Anionenkanalprotein VDAC 1a der äußeren Mitochondrienmembran, die als putative
Interaktionspartner in einem Hefe-2-Hybrid-Versuch identifiziert worden waren, wurden
Affinitätschromatographien durchgeführt. Diese Methode diente schon mehrfach der
Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen (z. B. KÁLMÁN & BOROSS, 1982; LU et al.,
1993).
Dafür
wurde
die
überexprimierte
Aldolase
mit
Strep-tag
über
Affinitätschromatographie gereinigt und auf eine mit VDAC beladene Ni-NTA-Säulenmatrix
gegeben. Nach 10 Waschschritten wurden die Proteine eluiert. Die verschiedenen Fraktionen
wurden mittels 12 %iger SDS-PAGE analysiert. Das Ergebnis ist in Abb. 3.28 dargestellt.
Ergebnisse
111
A
B
kDa
Ma 1
2
3
4 5 6 7 8 9
180
73 A
54
35
24
5
7,5 mM Imidazol
kDa Ma 10 11 12 13 14 15 16 17 18
180
73 B
54
35
Aldolase
24
C
kDa
180 C
73
54
35
7,5
10
50
100
250
mM Imidazol
Ma 19 20 21 22 23 24 25 26 27
Aldolase
VDAC
24
Abb. 3.28: Affinitätschromatographie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion zwischen VDAC
und Aldolase aus Mais. SDS-PAGE Analysen von jeweils 20 µl der jeweiligen Fraktion. A: Bindung des
VDAC an die Affinitätsmatrix und verschiedene Waschschritte; B: Zugabe von Aldolase zur Affinitätsmatrix mit daran gekoppeltem VDAC und Waschschritte; C: weitere Waschschritte und Elution der
gebundenen Proteine.
Ma: Molekularmassenstandard (Prestained Protein Ladder, ~10-160kDa, MBI Fermentas, St. Leon-Rot)
A:
1:
geklärter Rohextrakt (RE2) von VDAC nach Aufschluss der „inclusion bodies
2:
geklärter Rohextrakt vor Aufschluss der „inclusion bodies
3:
Durchfluss des RE2 nach Auftrag auf die Metall-Chelat-Affinitätssäule
4 - 9: Waschschritte 1, 3, 5, 7, 9 und 10 (Denaturierungs-Solubilisierungs-Puffer)
B:
10:
Durchfluss der gereinigten rekombinanten Aldolase
11-15: Waschschritte 1, 4, 6, 8 und 10 (Denaturierungs-Solubilisierungs-Puffer)
16-17: Waschschritte 11und 12 (5 mM Imidazol in Denaturierungs-Solubilisierungs-Puffer)
18:
Waschschritt 13 (7,5 mM Imidazol in Denaturierungs-Solubilisierungs-Puffer)
C:
19:
Waschschritt 14 (wie Waschschritt 13)
20-27: Elutionsschritte 1 bis 8 mit verschiedenen Konzentrationen Imidazol in DenaturierungsSolubilisierungs-Puffer
Die Pfeile markieren die Banden der Proteine VDAC (blaue Pfeile) und Aldolase (schwarze Pfeile).
Die Ni-NTA-Säule wurde mit einem Überschuss an VDAC-Protein beladen. Überschüssiges
Protein und Verunreinigungen wurden vollständig durch die Waschschritte von der Säule
entfernt (s. Abb. 3.28 A Spur 9), bevor Aldolase zugegeben wurde. Nach Zugabe der Aldolase
wurde in den folgenden Waschschritten immer etwas Aldolase ausgewaschen (s. Abb. 3.28 B
Spur 11-15). Bei den Waschschritten mit Imidazol (5 und 7,5 mM, s. Abb. 3.28 B/C Spur 1619) ist deutlich mehr Aldolase und auch ein geringer Teil VDAC in den Fraktionen zu sehen.
Während der Elution mit verschiedenen Imidazolkonzentrationen (s. Abb. 3.28 Spur 20-27)
Ergebnisse
112
erfolgte die Elution von VDAC in großen Mengen ab Elutionsschritt 4. Die Elution der
Aldolase ist im Gegensatz dazu in geringer Menge in allen Fraktionen zu erkennen. Mit Hilfe
eines Western-Blots konnte die Bande bei ca. 40 kDa eindeutig als Aldolase identifiziert
werden. Sie wurde in allen Elutionsfraktionen detektiert. Das bedeutet, dass bei der Elution
der Aldolase kein eindeutiger Zusammenhang mit der Elution des VDAC zu erkennen ist. An
VDAC gebundene Aldolase sollte zusammen mit VDAC ab Elutionsschritt 3 von der Säule
eluieren, nicht jedoch schon vorher in den Waschschritten mit Imidazol.
In einem weiteren Versuch wurde untersucht, ob Aldolase mit Strep-tag auch unspezifisch an
die Ni-NTA-Säulenmatrix bindet. Die Ni-NTA-Säulenmatrix wurde entsprechend dem
Versuch mit Puffern behandelt, jedoch wurde keine VDAC-Proteinlösung an die Matrix
gekoppelt.
Nach Zugabe der
rekombinanten Aldolase zur
Säuelnmatrix und 10
Waschschritten wurde auch hier mit Imidazol eluiert. Die Analyse der Fraktionen erfolgte
mittels 12 %iger SDS-PAGE (s. Abb. 3.29).
Anhand der SDS-PAGE wird deutlich, dass die Aldolase auch ohne einen His-tag und den
putativen Interaktionspartner an die Ni-NTA-Säulenmatrix bindet. Durch die Wasch- und
Elutionsschritte mit Imidazol wurde sie vollständig von der Säule eluiert. Ab dem
Elutionsschritt E5 (100 mM Imidazol) kann keine Aldolase mehr in den Fraktionen
nachgewiesen
werden.
Dadurch
ergibt
sich
ein
deutlicher
Unterschied
zur
Affinitätschromatographie mit VDAC, bei dem die Aldolase nicht in entsprechender Menge
in den Waschschritten mit 5 und 7,5 mM Imidazol von der Säule eluiert, dafür aber in
geringer Konzentration über die gesamten Elutionsschritte nachzuweisen ist. In den letzten
Elutionsschritten
mit
100
und
250 mM
Imidazol
Affinitätschromatographie mit VDAC nachgewiesen werden.
kann
Aldolase
nur
bei
der
Ergebnisse
113
A
B
5
kDa
180
73
54
35
Ma 1
2
7,5
3 4 5 6 7 8 9
7,5
kDa
180
10
50
100
250 mM Imidazol
Ma 10 11 12 13 14 15 16 17 18
73
54
35
24
24
Abb. 3.29: Bindung der rekombinanten, gereinigten Strep-tag Aldolase an eine Metall-ChelatAffinitätsmatrix als Kontrolle zum Aldolase-VDAC-Bindeversuch mit Affinitätschromatographie.
SDS-PAGE Analyse von jeweils 20 µl der entsprechenden Fraktion.
Ma: Molekularmassenstandard (Prestained Protein Ladder, ~10-160kDa, MBI Fermentas, St.
Leon-Rot)
A:
1:
geklärter Rohextrakt der Aldolase von Z. mays nach Strep-tag Affinitätschromatographie
2:
Durchfluss nach Auftragung auf eine Ni-NTA Säule
3 - 6: Waschschritte 1, 4, 7 und 10 (Denaturierungs-Solubilisierungs-Puffer)
7 - 8: Waschschritte 11und 12 (5 mM Imidazol in Denaturierungs-SolubilisierungsPuffer)
9:
Waschschritt 13 (7,5 mM Imidazol in Denaturierungs-Solubilisierungs-Puffer)
B:
10:
Waschschritt 14 (wie Waschschritt 13)
11-18: Elutionsschritte 1 bis 8 mit unterschiedlichen Imidazolkonzentrationen in
Denaturierungs-Solubilisierungs-Puffer
Die Pfeile markieren die Bande der Aldolase.
Aldolase
Diskussion
114
4 Diskussion
Um die Regulation eines Stoffwechsels erklären zu können, sind besonders Hinweise auf die
Organisation der einzelnen Enzyme, ihre Lokalisation in der Zelle und Interaktionen zwischen
Enzymen, die evtl. „channeling“ ermöglichen, von Bedeutung. Mais und Reis sind wichtige
Modellpflanzen geworden, um die Rolle des Cytoskeletts z. B. in der Proteinsynthese und
Proteinkörperbildung zu verstehen (ABE et al., 1991; STANKOVI et al., 1993, CLORE et al.,
1996). Es gibt seit einiger Zeit immer mehr Hinweise auf eine Assoziation von löslichen
Enzymen mit den Strukturen des Cytoplasmas. Wegen der komplexen Natur des Cytoplasmas
sind Modelle der Organisation des Stoffwechsels jedoch schwer zu erstellen und noch
schwerer zu überprüfen. Die Glykolyse wurde in vitro intensiv untersucht, aber es gibt
zunehmend Hinweise, dass man die Glykolyse in vivo nicht durch die einfache Übertragung
dieser Daten erklären kann.
In dieser Arbeit sollte eine Interaktion der pflanzlichen Aldolase mit dem Cytoskelett
nachgewiesen werden. Dafür wurden in vitro Bindeversuche mit Kaninchen-Muskel-Aktin
durchgeführt (Copolymerisationsversuche, s. Kap. 3.2). Weitere Hinweise auf eine mögliche
Metabolonbildung innerhalb der pflanzlichen Glykolyse, vor allem unter Stressbedingungen,
sollten Versuche mit einem Hefe-2-Hybrid-System bringen (s. Kap. 3.3). Dieses System
eignet sich besonders zur Aufdeckung unbekannter Protein-Protein-Interaktionen.
4.1 Sequenzen der Expressionskonstrukte von Aldolase und VDAC
Durch die BLAST-Analyse der Expressionskonstrukte ALD_pET-16b, ALD_pASK-IBA3
und VDAC_pRSET A konnten Unterschiede zwischen den Sequenzen der Konstrukte und
den in der Datenbank GenBank veröffentlichten Sequenzen für diese Gene festgestellt
werden. Unterschiede zwischen den Nukleotiden der Sequenzen treten hauptsächlich an der
dritten Stelle des codierenden Tripletts auf. Die meisten Aminosäuren werden von mehreren
Tripletts kodiert (degenerierter Code), bei denen häufig Variationen am dritten Nukleotid
auftreten. Codons, die die gleiche Aminosäure codieren, heißen Synonyme. Die
Nukleotidaustausche am dritten Nukleotid des Tripletts bezeichnet man als „single nucleotide
polymorphism“
(SNP).
Ein
Nukleotidaustausch,
der
keine
Veränderung
in
der
Aminosäuresequenz hervorruft, wird dementsprechend als „synonymer SNP“ oder stille
Mutation bezeichnet. Sie können durch die Verwendung unterschiedlicher Variationen
(Ökotypen) des den Sequenzen zugrundeliegenden Materials, in diesem Falle von
Maispflanzen, auftreten. Es können aber auch bei der Amplifikation der DNA während der
Diskussion
115
PCR oder Sequenzierungs-PCR Fehler aufgetreten sein, die zu diesen verschiedenen
Nukleotiden geführt haben.
Der Klon ALD_pET-16b unterscheidet sich in neun Nukleotiden von der GenBank-Sequenz.
Jedoch nur durch eines dieser unterschiedlichen Nukleotide wird eine veränderte Aminosäure
im Protein kodiert. Bei dieser veränderten Aminosäure ist das Nukleotid an erster Position des
Tripletts (Position 787) anders als in der GenBank-Sequenz, so dass das Codon für ein Leucin
anstelle eines Valins kodiert wird. Bei beiden Aminosäuren handelt es sich um neutrale
Aminosäuren mit einer aliphatischen Seitenkette.
Ausgangsmaterial für den Klon ALD_pASK-IBA3 war der Klon ALD_pET-16b. Dadurch
war zu erwarten, dass der Klon ALD_pASK-IBA3 dieselben Unterschiede in der
Nukleotidsequenz aufweist. Es treten innerhalb dieser Sequenz jedoch nur sieben
unterschiedliche Nukleotide im Vergleich zur GenBank Sequenz auf. Das deutet darauf hin,
dass es sich bei einigen Unterschieden um Fehler handelt, die während der SequenzierungsPCR zustande gekommen sind. Jedoch zeigt sich auch in diesem Klon der Nukleotidaustausch
an Position 787, der zu der veränderten Aminosäure führt. Deshalb ist davon auszugehen,
dass durch einen Fehler bei der PCR hier das Codon für ein Leucin entstanden ist.
Insgesamt sechs Nukleotide unterscheiden sich innerhalb der Nukleotidsequenzen von
VDAC1a aus der Datenbank GenBank und dem Klon VDAC_pRSET A. Auch hier besteht
die Möglichkeit, dass es sich um Fehler während der Sequenzierungs-PCR handelt. Drei der
Unterschiede sind synonyme SNPs, wogegen jedoch die anderen drei unterschiedlichen
Nukleotide zu einer veränderten Aminosäuresequenz führen. Dabei führt das Nukleotid an
Position 424 zum Codon für ein Valin anstelle eines Leucins, wie es an dieser Position in der
Datenbanksequenz veröffentlicht ist. An Position 812 führt ein unterschiedliches Nukleotid zu
einem Alanin anstelle eines Glycins in der Aminosäuresequenz. Bei diesen beiden
Unterschieden sind jeweils neutrale Aminosäuren durch andere neutrale Aminosäuren ersetzt.
Durch den Nukleotidunterschied an Position 699 des Klons entsteht die Aminosäure
Asparagin, an deren Stelle sich in der Datenbanksequenz das Codon für ein Lysin befindet.
Die basische Seitenkette des Lysins fehlt dadurch in der Aminosäuresequenz des Klons.
Inwieweit diese Unterschiede zwischen den Sequenzen Einfluss auf die Faltung oder
Eigenschaften der Proteine haben, kann nicht beurteilt werden. Aufschluss darüber könnten
Vergleiche zwischen den Eigenschaften der nativen und rekombinanten Proteine bringen.
Diskussion
116
4.2 Katalytische Eigenschaften rekombinanter Aldolasen
Mit den beiden rekombinant hergestellten Aldolasen der Expressionskonstrukte ALD_pET16b und ALD_pASK-IBA3 wurden Aktivitätsmessungen mit dem Substrat FBP durchgeführt.
Wie in Kapitel 3.1.7 beschrieben, zeigte Aldolase mit His-tag (ALD_pET-16b) keine
Spaltungsaktivität für FBP. Ursache für die fehlende Aktivität könnte der mit dem Protein
exprimierte His-tag am N-Terminus der rekombinanten Aldolase sein. Durch den His-tag
befinden sich am N-Terminus des Proteins zehn basische Histidine, die möglicherweise einen
Einfluss auf die Proteinstruktur oder direkt auf die katalytische Aktivität haben. Eine
schematische Darstellung der Expressionskonstrukte ALD_pET-16b und ALD_pASK-IBA3
befindete sich im Anhang (s. Kap. 7.2.5).
Dagegen konnte eine geringe katalytische Aktivität der Aldolase mit Strep-tag des
Konstruktes ALD_pASK-IBA3 nachgewiesen werden. Jedoch war diese deutlich geringer als
die von BERTHIAUME et al., 1989 bei rekombinanter cytosolischer Mais-Aldolase gemessene
(vgl. Kap. 3.1.7). Bei Untersuchungen des Einflusses des C-Terminus auf die Aktivität von
Aldolase wurde für wild-typ Mais-Aldolase eine Aktivität von 11,32 U/mg und ein KM-Wert
von 7,7 µM für FBP beschrieben. Fehlen der Aldolase die letzten acht Aminosäuren am CTerminus verringert sich die Aktivität auf 1,24 U/mg und der KM-Wert beträgt 0,8 µM
(BERTHIAUME et al., 1991). Dies entspricht annähernd den für Strep-tag-Aldolase ermittelten
Eigenschaften, für die eine Aktivität von 1,23 U/mg und ein KM-Wert von 0,5 µM ermittelt
wurde. Der mit der Enzym-Sequenz exprimierte Strep-tag befindet sich am C-Terminus der
Aldolase. Im Gegensatz zur Sequenz für das aktive Zentrum des Enzyms ist die Sequenz des
C-Terminus in Vertebraten, Invertebraten und Pflanzen nicht konserviert und könnte die
unterschiedlichen Aktivitäten der verschiedenen Aldolasen hervorrufen (SYGUSCH et al.,
1987). Aufgrund der Bedeutung des C-Terminus für die Aktivität der Aldolase liegt es nahe,
dass die geringe gemessene Aktivität auf dem Einfluss des Strep-tags beruht, der z. B. die
notwendige Mobilität des C-Terminus oder die Faltung des Proteins beeinflussen könnte.
4.3 Immunologischer Nachweis von Aldolase
Um ein wichtiges
Werkzeug für
die Durchführung verschiedener Versuche wie
Immunpräzipitation, Western-Blotting und ELISA zur Verfügung zu haben, wurde im
Rahmen dieser Arbeit ein Antiserum gegen gereinigte, rekombinante Aldolase aus Mais
hergestellt. Dieses diente innerhalb der vorliegenden Arbeit zur Detektion von rekombinanter
Aldolase im Far-Western-Blot (s. Kap. 3.5). Die Spezifität des Antiserums wurde mittels
Western-Blot-Analyse untersucht. In allen getesteten pflanzlichen Geweben aus Mais,
Diskussion
117
Arabidopsis und Kartoffel wurde eine einzelne Bande durch das Antiserum spezifisch
erkannt. Dagegen wurde durch tierische Aldolase keine Antigen-Antikörper-Reaktion
hervorgerufen. Rekombinante Aldolase konnte mit Hilfe des Antiserums in einer Menge von
50 ng auf Western-Blots gut detektiert werden, im ELISA wurden 3 ng nativer rekombinanter
Aldolase detektiert. Damit steht ein spezifisches Antiserum zur Immundekoration von
cytosolischer Aldolase aus Mais sowie aus den dikotylen Pflanzen Arabidopsis und Kartoffel
für verschiedene Anwendungen zur Verfügung. Die Möglichkeit, mit einem Antiserum gegen
Aldolase aus einer monokotylen Pflanze auch Aldolasen dikotyler Pflanzen zu detektieren,
beruht auf der Sequenzhomologie cytosolischer Aldolasen, die zwischen 67% und 92%
beträgt (PELZER-REITH et al., 1993).
4.4 Copolymerisationsversuche
Bei der Untersuchung einer möglichen Bindung pflanzlicher, cytosolischer Aldolase an
Aktinfilamente, die aufgrund der Sequenzhomologie eines zehn Aminosäuren umfassenden
Sequenzabschnitts zu Aktin selbst und zu Aktinbinderegionen anderer ABPs zu vermuten war
(vergl. Kap. 1.2.2; WINTER & HUBER, 2000), zeigte sich, dass eine Aktinbindung erfolgt (s.
Abb. 3.11).
4.4.1 Einfluss von FBP, F-6P und F-2,6BP auf die Aldolase-Aktin-Bindung
Die nähere Untersuchung der Bindung ergab Unterschiede im Hinblick auf den Einfluss der
Metabolitkonzentration auf die Bindung pflanzlicher Aldolase im Vergleich zur gut
untersuchten Bindung tierischer Aldolase an Aktinfilamente. So konnte eine vollständige
Hemmung der Bindung nicht durch 1 mM des Substrates der Aldolase, FBP, hervorgerufen
werden. Für tierische Aldolase ist eine vollständige Hemmung der Bindung durch 1 mM FBP
bekannt (ARNOLD & PETTE, 1970). Auch eine zehnfache Erhöhung der Substratkonzentration
führte nicht zu einer vollständigen Unterdrückung der Aktinbindung der pflanzlichen
Aldolase. Unter Einfluss von 10 mM FBP wurde der Anteil an Aktin gebundener Aldolase im
Vergleich zur Kontrolle um die Hälfte verringert (s. Abb. 3.12). Die Hemmung der AldolaseAktin-Bindung durch 1 mM FBP betrug 38% (s. Abb. 3.13).
Die Substanzen F-2,6BP und F-6P wurden in derselben Konzentration, in der mit FBP eine
deutliche Hemmung der Bindung hervorgerufen wurde (10 mM), auf ihren Einfluss auf die
Aldolase-Aktin-Bindung untersucht. Das strukturell ähnliche F-2,6BP zeigte einen stärkeren
Effekt als FBP. Es führte zur Hemmung der Bindung um 60% (s. Abb. 3.13). Die
Aktinpolymerisation blieb dabei unbeeinflusst (s. Tab. 3.2). Eine noch deutlichere Reduktion
Diskussion
118
der Bindung von Aldolase an Aktin ergab sich durch den Einfluss von F-6P. Die
Aktinpolymerisation steigerte sich, jedoch sank der Anteil gebundener Aldolase auf 11% im
Vergleich zu 34% in der Kontrolle (s. Abb. 3.12). Für die Berechnung des Anteils an Aktin
gebundener Aldolase wurde das in der Probe polymerisierte Aktin gleich 100% gesetzt. Damit
wurde die Bindung durch F-6P um knapp 70% gehemmt (s. Abb. 3.13).
Dass bei den in dieser Arbeit eingesetzten Konzentrationen auch ein Einfluss von F-6P und F2,6BP auf die Bindung tierischer Muskel-Aldolase an Aktin nachweisbar wäre, ist aufgrund
der Arbeiten von WANG et al. (1996) nicht auszuschließen. Weil Fructose-1-phosphat und
FBP die Bindung tierischer Aldolase an Aktin unterdrückten, F-6P und F-2,6BP jedoch nicht,
wurde vermutet, dass die Loslösung der Aldolase von F-Aktin durch die Konkurrenz
zwischen Substrat und Aktin um die Bindung an Aldolase durch die Bindestelle des
Phosphats in C1-Position stärker als in C6-Position ist (WANG et al., 1996). Im Gegensatz
dazu war der hemmende Einfluss von F-6P und F-2,6BP bei pflanzlicher Aldolase stärker als
der des Substrates FBP. Schließt man jeweils das Experiment, bei dem unter Einfluss von F6P (Exp. 4; s. Tab. 3.2) und F-2,6BP (Exp. 3, s. Tab. 3.2) eine ungewöhnlich große Menge
Aktin pelletierte, aus, so ist dennoch ein deutlich hemmender Einfluss der beiden Substanzen
auf die Aldolase-Aktin-Bindung nachzuweisen. Die Aktinpolymerisation würde dann der
Kontrolle entsprechen, und die im Pellet nachgewiesene Aldolase entspräche dem Einfluss
von FBP. Ein Einfluss der Position des Phosphates auf die Aldolase-Aktin-Bindung kann
durch die vorliegende Untersuchung nicht
nachgewiesen werden. Die eingesetzte
Konzentration des F-2,6BP, das als Signalstoff in sehr geringen Konzentrationen wirkt, hat
keine physiologische Relevanz. Ob F-2,6BP, das an der Regulation von Glykolyse und
Guconeogenese beteiligt ist, auf die Bindung pflanzlicher Aldolase an Aktin auch in
geringeren Konzentrationen einen Einfluss hat, ist nicht untersucht worden.
Da es zur Kompetition zwischen der Substrat- und Aktinbindung in Anwesenheit des
Substrates kommt, ist von einer Überlappung der Bindestellen auszugehen. Da im tierischen
System eine Gewebespezifität der Bindung nachgewiesen wurde, wird diskutiert, ob durch die
Bindung eines Teils der cytosolischen Aldolase an Aktin ein Gerüst oder Ankopplungsort für
die Bindung anderer Enzyme in der Zelle aufgebaut wird (MOORHEAD & PLAXTON, 1992,
WANG et al., 1997, KUSAKABE et al., 1997, KAO et al., 1999).
Dadurch, dass die Bindung pflanzlicher Aldolase an Aktin durch ihr Substrat, auch in hohen
Konzentrationen, nicht vollständig aufgelöst oder verhindert wurde, ist anzunehmen, dass die
Positionierung der Aldolase in der Zelle in pflanzlichen Geweben eine noch wichtigere Rolle
spielt als in tierischen Geweben.
Diskussion
119
4.4.2 Einfluss des Redox-Milieus auf die Aldolase-Aktin-Bindung
Bei der Untersuchung, welchen Einfluss das Redox-Milieu auf die Aldolase-Aktin-Bindung
hat, wurde das natürliche Redoxreagenz Glutathion sowie als synthetisches Reagenz DTT
eingesetzt. Glutathion ist für die aerobe Lebensweise wichtig zur Entgiftung von reaktiven
Sauerstoffspezies und hat viele weitere Funktionen in Pflanzen. Beschrieben wurde z. B. ein
Einfluss von Glutathion auf das Wurzelwachstum, die Blütenentwicklung, die Genexpression
und bei der Entgiftung von Schwermetallen (SÁNCHEZ-FERNÁNDEZ et al., 1997; OGAWA et
al., 2001; OGAWA et al., 2004; SEN, 2000; COBBETT, 2000).
Glutathion kommt in reduzierter (GSH) und oxidierter Form (GSSG) vor. Die oxidierte Form
inaktiviert Aldolase durch die Bildung gemischter Disulfide. Dadurch wird die Aldolase
destabilisiert und ist bei geringeren Temperaturen denaturierbar sowie leichter angreifbar für
Proteasen. Das Substrat der Aldolase schützt diese vor dem schädlichen Einfluss von
Disulfiden (BOND & OFFERMANN, 1981; OFFERMANN et al., 1984). Die Bildung der
Disulfidbrücken geht einher mit Veränderungen der Sekundär- oder Tertiärstruktur; das
Molekulargewicht und die Quartärstruktur oder zumindest Teile davon bleiben jedoch
erhalten (BOND & OFFERMANN, 1981). In Arabidopsis konnten plastidäre Aldolase und
cytosolische Triosephosphat-Isomerase als Ziele für eine Glutathionylierung identifiziert
werden (ITO et al., 2003).
Neben Enzymen der Glykolyse wurden auch glutathionylierte Bestandteile des Cytoskeletts
gefunden (GODON et al., 1998; FRATELLI et al., 2002, CHAI et al., 1994), bei einem davon
handelt es sich um Aktin. Durch langsame Oxidation bilden sich Aktin-Dimere und
Oligomere, die beim Einbau in Filamente zu deren Quervernetzung und zu Veränderungen
der Elastizität der Filamente führen (TANG et al., 1999). Von DREWES & FAULSTICH (1993)
wurde eine Destabilisierung von Aktinfilamenten durch gemischte Disulfide beschrieben. An
der Disulfidbindung ist das C-terminale Cystein 374 beteiligt. Der C-Terminus schafft
normalerweise den engen Kontakt zwischen den Aktin-Untereinheiten und stabilisiert so die
Filamente. Ein weiterer interessanter Aspekt der Einflussnahme des Redox-Milieus auf Aktin
ist die Untersuchung an A 431-Zellen (WANG et al., 2001). Dort wurde unter Einfluss des
Wachstumsfaktors EGF, der das zelluläre Redox-Gleichgewicht in Richtung oxidativer
Bedingungen verschiebt, die aktive Deglutathionylierung von Aktin beobachtet, wodurch die
Polymerisationsrate stieg. Eine Zunahme der Polymerisation wurde zuvor unter oxidativen
Bedingungen auch in einer anderen Zelllinie (P388D1) beobachtet (HINSHAW et al., 1991).
Aufgrund dieser vielfältigen Einflüsse des Redox-Milieus auf Proteine des Cytoskeletts und
der Glykolyse ist es denkbar, dass auch die Aldolase-Aktin-Bindung dadurch beeinflusst
Diskussion
120
wird. Bei den Messungen zeigten sich jedoch im Vergleich zum Substrateinfluss (s. o.) nur
geringfügige Abweichungen von der Kontrolle. Auch müssen bei den Ergebnissen die starken
Schwankungen, die zwischen den Versuchen auftraten und die sich in den hohen
Standardabweichungen widerspiegeln, berücksichtigt werden. Diese führten auch zu der recht
geringen Signifikanz der Ergebnisse von
= 0,5 (s. Kap. 3.2.2).
Unter Einfluss von GSH wurden knapp 9% mehr Aldolase an Aktin gebunden als in der
Kontrolle. Auch GSSG führte zu einer gesteigerten Bindung der Aldolase an Aktin. Hier lag
der Unterschied zur Kontrolle bei 16% (s. Abb 3.14). Die Aktinpolymerisation wurde dabei
unter reduzierenden Bedingungen leicht gesteigert und nahm bei oxidierenden Bedingungen
ab. Da die von WANG et al. (2001) beschriebene Steigerung der Aktinpolymerisation unter
oxidierenden Bedingungen auf aktiver Deglutathionylierung des Aktins beruht, stehen diese
Ergebnisse im Einklang miteinander.
Im Gegensatz zu Glutathion zeigte DTT in reduzierter Form kaum Einfluss auf die
Aktinpolymerisation. In oxidierter Form führte es zu einer gesteigerten Aktinpolymerisation
(s. Tab. 3.4). Der Anteil der an das polymerisierte Aktin gebundenen Aldolase wurde durch
DTTred um knapp 6% gesteigert (s. Abb. 3.14). Damit fiel die Steigerung der Bindung von
Aldolase an Aktin durch DTTred geringer aus als durch GSH. Eine Reduktion des Anteils
gebundener Aldolase um 5% im Vergleich zur Kontrolle erfolgte durch DTTox. Der Einfluss
des oxidierten DTT unterschiedet sich von dem des GSSG, durch das die Bindung gesteigert
wurde (vergl. Abb. 3.15).
Da Glutathion und DTT, vor allem bei Betrachtung der oxidierten Form, keinen gleichen
Einfluss auf die Bindung zeigten, ist anhand der Ergebnisse nicht abzuschätzen, welchen
Einfluss das Redox-Milieu auf die Bindung hat.
Diskutiert
wird
eine
Verlangsamung
der
Glykolyse
und
Verschiebung
des
Kohlenhydratflusses zur Regeneration von NADPH, das für die Entgiftungsreaktionen unter
oxidativem Stress essentiell ist (GODON et al., 1998; CABISCOL et al., 2000). Ob dafür die
Verlagerung der Enzyme innerhalb der Zelle, eine stärkere oder schwächere Bindung an
Cytoskelettbestandteile oder andere Vorgänge notwendig sind, muss noch untersucht werden.
Diskussion
121
4.5 Protein-Protein-Interaktionen im Hefe-2-Hybrid-System
Die Suche nach Protein-Protein-Interaktionen erfolgte mit dem Hefe-2-Hybrid-System. Bei
diesem System werden Fusionsproteinkonstrukte über Plasmide in Hefezellen eingeschleust.
Dort findet im Cytosol an den Ribosomen die Synthese der Fremdproteine statt. Es handelt
sich um Fusionsproteine aus einer Domäne eines Transkriptionsfaktors und einem anderen zu
untersuchenden Protein. Die Fusionsproteine müssen, um als Transkriptionsfaktor zu wirken,
in den Zellkern der Hefen transportiert werden. Cytosolische Aldolase aus Mais diente als
Köder („bait ) für interagierende Proteine einer cDNA-Bank aus anaerobem Mais (Beute,
„prey ).
4.5.1 Aldolase-Aldolase-Interaktion
Nur ein Protein konnte in zwei unabhängig voneinander durchgeführten Hefe-2-HybridAnalysen als Interaktionspartner der Aldolase identifiziert werden (Hefekolonie 2.17 und
7.243, vgl. Tab. 3.11). Dabei handelte es sich um Aldolase. Da Aldolase Homotetramere
bildet, wurde diese Interaktion erwartet. Alle anderen Interaktionspartner, die identifiziert
wurden, konnten nicht im Rahmen weiterer Hefe-2-Hybrid-Versuche verifiziert werden. Eine
mögliche Ursache hierfür liegt in der Toxizität des „Bait“-Konstruktes aus Aldolase und der
Bindedomäne des Transkriptionsfaktors. Die Hefezellen mit diesem Konstrukt wuchsen sehr
langsam, konnten aber mit Hilfe der Plattenanzucht in ausreichender Zelldichte für die
Paarung der Hefezellen herangezogen werden. Die der Paarung folgende Anzucht der
diploiden Hefezellen und die Selektion auf positive Interaktionspartner überlebten jedoch nur
sehr wenige Kolonien, so dass alle anderen gefundenen Interaktionspartner der cytosolischen
Mais-Aldolase in jeweils nur einem Versuch identifiziert werden konnten. Da kaum
vollständige, für Proteine codierende Sequenzen identifiziert werden konnten, scheinen einige
„Prey -Plasmide nur Bruchstücke der cDNA-Bank zu enthalten.
4.5.2 VDAC-Aldolase-Interaktion
Einen interessanten Bindepartner der Aldolase stellt das mitochondriale spannungsabhängige
Anionenkanalprotein VDAC dar. Die Übereinstimmung der im Hefe-2-Hybrid-System
identifizierten Sequenz aus der cDNA-Bank mit der in der Datenbank GenBank
veröffentlichten Sequenz beträgt 96% auf Nukleotidebene. Dabei handelt es sich um einen
Teil der für VDAC kodierenden Sequenz, der vom N-terminalen Methionin ausgehend für108
Aminosäuren des Proteins kodiert. Das gesamte Protein setzt sich aus 276 Aminosäuren
zusammen.
Diskussion
122
VDAC, auch Porin genannt, befindet sich in der äußeren Mitochondrienmembran und stellt
dort das dominierende Kanalprotein dar. Ein Modell über die Anordnung des Porins aus den
Mitochondrien von Rinderherzen in der Membran (DE PINTO et al., 1991) zeigt 16
Transmembrandomänen und eine N-terminale -Helix, die cytosolisch exponiert ist.
VDAC bildet eine wässrige Pore, durch die ein Austausch gelöster Stoffe zwischen
Mitochondrien und Cytosol erfolgen kann. In der Literatur schwanken die Angaben über die
Größe der Moleküle, die durch die Pore die Membran passieren können, zwischen 3 und
6 kDa. Für VDAC aus Mais geben ALJAMAL et al. (1993) einen Porendurchmesser von
1,6 nm an, der für Moleküle bis zu einer Masse von ca. 3 kDa permeabel ist.
Bei geringem Membranpotential befindet sich VDAC im geöffneten Zustand und zeigt
geringe Anionenselektivität. Bei Spannungen über 20 mV geht der Kanal in seinen wenig
leitenden oder geschlossenen Zustand über. Der Fluss von Substraten wie Succinat, Citrat und
Adeninnukleotiden ist dann stark reduziert. Die Spannungssensitivität resultiert aus einer
Konformationsänderung und Bewegung geladener Domänen, vermutlich dienen positiv
geladene Reste als Sensoren (THOMAS et al., 1993). In Anwesenheit von NADH wird der
Kanal für Änderungen des Membranpotentials sensitiver und ist so wahrscheinlich besser in
der Lage, sich den aktuellen Bedingungen des Stoffwechsels anzupassen (ZIZI et al., 1994).
Die Regulation von VDAC ist ein effektiver Mechanismus, um den Fluss von Metaboliten
zwischen Mitochondrien und Cytoplasma zu steuern. Auch die Funktionen der Mitochondrien
können so reguliert werden. Durch das Schließen des Kanals wird die mitochondriale
Respiration gehemmt (LIU & COLOMBINI, 1992). Eine direkte Verknüpfung zwischen den
Mitochondrien und der Glykolyse war bis vor kurzem nur über die Interaktion der Hexokinase
mit Mitochondrien bekannt (s. Kap. 1.2.1). Für zwei menschliche VDAC-Isoformen konnte
man unterschiedliches Bindeverhalten für Hexokinase nachweisen (BLACHLY-DYSON et al.,
1993). Die an VDAC gebundene Hexokinase nutzt für die Bildung von Glucose-6-phosphat
ausschließlich ATP aus den Mitochondrien (BELTRANDELRIO & WILSON, 1992). Mit der
Bindung an das Kanalprotein wird die Kinase aktiviert und verknüpft so die Verfügbarkeit
von Glucose und den Glucose-Stoffwechsel mit den mitochondrialen Funktionen. Dies hat
z. B. einen Einfluss auf die Apoptose, bei der die Mitochondrien eine wichtige Rolle durch
die Freigabe von Cytochrom c spielen (GOTTLOB et al., 2001).
Zusätzlich zur Hexokinase wurde kürzlich an isolierten Mitochondrien aus Arabidopsis die
Assoziation von mindestens sieben Proteinen der Glykolyse an der äußeren mitochondrialen
Membran entdeckt (GIEGÉ et al., 2003). Diese Assoziation ermöglichte den vollständigen
Ablauf der Glykolyse an den Mitochondrien. Der Mechanismus der Assoziation blieb jedoch
Diskussion
123
ungeklärt, und es wurde keine direkte Interaktion der Proteine mit dem Kanalprotein VDAC
nachgewiesen.
Die im Hefe-2-Hybrid-System gefundene Interaktion zwischen Aldolase und VDAC steht im
Einklang mit der Assoziation der Glykolyse an Mitochondrien. Mit diesen Erkenntnissen
erhärtet sich die Annahme, dass eine Mikrokompartimentierung der Glykolyse an
Mitochondrien stattfindet und so eine direkte Verknüpfung zwischen dem Stoffwechsel der
Mitochondrien und der im Cytosol der Zellen ablaufenden Glykolyse erfolgt. Neben dem
Transfer von Metaboliten kann diese Interaktion auch regulatorische Aufgaben haben. Viele
Proteine haben neben ihrer enzymatischen Aktivität weitere Funktionen, die häufig
regulatorischer Art sind (JEFFREY, 1999). Die glykolytischen Enzyme können also auch eine
Rolle in der Regulation mitochondrialer Funktionen ausüben. Hierüber müssen weitere
Untersuchungen Aufschluss geben.
4.5.3 Interaktionen mit mRNA-Sequenzen unbekannter Funktion und einem
Translationsinitiationsfaktor
Den als Interaktionspartner der Aldolase identifizierten drei mRNA-Sequenzen (PC0102485,
PC0138904 und CL3683_1) konnte auch mit Hilfe des Arabidopsis- oder Reis-Genoms keine
Funktion zugewiesen werden. Die Interaktion eines Translations-Initiationsfaktors mit der
Aldolase könnte auf die Regulation der Translation von mRNA, die mit der Glykolyse in
Zusammenhang steht, hinweisen. Die Translation der Aldolase selbst könnte dadurch
beeinflusst werden. Bei dem Translations-Initiationsfaktor GOS2 handelt es sich um den
einzigen identifizierten Klon der cDNA-Bank, der die vollständige codierende Sequenz des
Proteins enthält. Ob es sich bei diesen Interaktionen um tatsächlich vorhandene oder falsch
positive handelt, müsste durch weitere Versuche geklärt werden.
4.5.4 Vermutlich falsch positive Interaktionen
Bei der gefundenen Interaktion mit dem mitochondrialen Gen für 18S rRNA dürfte es sich um
eine falsch positive Interaktion handeln, da nicht anzunehmen ist, dass in vivo eine Interaktion
zwischen einem cytosolischen Protein und mitochondrialer ribosomaler RNA durch die
räumliche Trennung der Kompartimente vorkommt. Ribosomale Proteine sind, wie auch
Hitzeschockproteine, in der Lage, mit vielen verschiedenen Proteinen Komplexe zu formen,
die stabil genug sind, um einen positiven Phänotyp hervorzubringen (HONG, 2000). Dies trifft
vermutlich auch auf ribosomale RNA zu, so dass auch die Interaktion zwischen 25S rRNA
und Aldolase ein falsch positives Ergebnis sein dürfte.
Diskussion
124
Mit einem Anteil von zehn Prozent der Gesamtsequenz zeigte die identifizierte Sequenz des
„Prey -Plasmids der Hefekolonie 2.43 nur einen kleinen Bereich an Identität zur MethioninAdenosyltransferase. In diesem Bereich lag die Übereinstimmung zwischen den beiden
Sequenzen bei 88%. Die Methionin-Adenosyltransferase (oder auch S-Adenosyl-LMethionin-Synthetase,
kurz
SAM-S
genannt)
vermittelt
die
Synthese
von
S-
Adenosylmethionin. Dieses entsteht durch den Transfer einer Adenosylgruppe von ATP auf
das Schwefelatom des Methionins. Durch die positive Ladung des Schwefelatoms wird die
Methylgruppe des Methionins aktiviert. Bei S-Adenosylmethionin handelt es sich um den
wichtigsten Methylgruppendonor, der an der Methylierung von Nukleinsäuren, Proteinen,
Kohlenhydraten, Membranlipiden und vielen anderen Substanzen in der Zelle beteiligt ist. Es
ist außerdem das Ausgangsprodukt der Ethylensynthese (YANG & HOFFMAN, 1984). Somit
stellt es eines der wichtigsten und zentralen biologischen Moleküle dar, es existiert in
Organismen in vielfältigen Formen, die von verwandten Genen kodiert werden. Die SAM-SGene von Arabidopsis und Reis zeigen 80% Übereinstimmung, jedoch unterscheidet sich das
Expressionsmuster in den Pflanzen (VAN BREUSEGEM et al., 1994). In Blättern von
Arabidopsis konnte im Gegensatz zu Reis kaum SAM-S nachgewiesen werden. Eine
individuelle Regulation der Gene oder Unterschiede in der Enzymkinetik der Isoenzyme
wurden nur in wenigen Fällen beschrieben. Daher besteht die Möglichkeit, dass Assoziationen
mit anderen Enzymen, die z. B. das Produkt S-Adenosylmethionin nutzen, Spezialisierungen
hervorrufen (SCHRÖDER et al., 1997).
Welche Rolle eine Assoziation der Aldolase mit SAM-S spielen könnte, ist jedoch unklar.
Eine gewagte These wäre, dass diese Interaktion einen regulatorischen Einfluss auf die
Richtung des Kohlenhydratflusses ausübt. Dieser kann in Richtung der Glykolyse stattfinden
oder aber auch zur Synthese von Zellwandbestandteilen erfolgen. Weshalb die Regulation
dann jedoch erst auf Ebene der Aldolase und nicht schon früher, z. B. bei der
Saccharosespaltung oder der Bildung von Fructose-6-phosphat, erfolgen sollte, ist fraglich.
Denkbar wäre auch eine Regulation auf Ebene der Enolase, durch die Phosphoenolpyruvat,
das Ausgangsprodukt für die Bildung der Aminosäure Phenylalanin, gebildet wird. Daher
scheint es realistischer, diese Interaktion als eine falsch positive einzustufen.
Diskussion
125
4.6 Überprüfung der Protein-Protein-Interaktionen
Die Interaktion von Aldolase und VDAC sollte mit Hilfe von Affinitätschromatographie
überprüft werden. Dabei wurde das rekombinante His-tag-VDAC-Fusionsprotein an eine NiNTA-Säulenmatrix gekoppelt. Durch Zugabe rekombinanter Aldolase mit Strep-tag wurde
eine Bindung zwischen den beiden Proteinen untersucht. Da jedoch das rekombinante
Kanalprotein bei der Überexpression in E. coli in inclusion bodies“ eingeschlossen wurde,
konnte nur unter denaturierenden Bedingungen gearbeitet werden. Dies schloss auch eine
Untersuchung der Interaktion durch an Strep-Tactin gekoppelte Aldolase aus, da Strep-Tactin
nicht für eine Behandlung mit Harnstoff geeignet ist. Diese Probleme und die unspezifische
Bindung der Aldolase an die Ni-NTA-Matrix machen eine Aussage über eine Assoziation der
Proteine innerhalb dieses Versuchsaufbaus schwierig. Es zeigte sich jedoch, dass sich die
Elution der Aldolase von den Säulen mit und ohne VDAC unterscheidet. Die unspezifisch an
die Matrix gebundene Aldolase in der Kontrolle konnte durch Imidazolkonzentrationen von
50 mM vollständig ausgewaschen werden. In Anwesenheit des VDAC dagegen wurde
Aldolase auch noch in den Elutionsfraktionen mit 100-250 mM Imidazol nachgewiesen
(s. Kap. 3.6). Diese Verschiebung der Elution der Aldolase könnte durch eine Interaktion mit
dem Kanalprotein VDAC hervorgerufen worden sein. Eine denaturierende Behandlung der
Proteine führt jedoch zur Zerstörung der nativen Konformation, die für die Bindung zwischen
den Proteinen essentiell sein kann. Um die Interaktion zwischen VDAC und Aldolase
eindeutig zu beweisen, müssten andere Methoden gewählt werden. Möglich wäre z. B. die
Visualisierung der Protein-Protein-Interaktion in vivo durch „bimolecular fluorescence
complementation“, bei der in Protoplasten zwei nichtfluoreszierende Fragmente des „yellow
fluorescent protein“ (YFP) durch interagierende Proteine zu einem fluoreszierenden Komplex
zusammengefügt werden (BRACHA-DRORI et al., 2004; WALTER et al., 2004). Obwohl
Aldolase-YFP-Fusionsproteine durch die Verbreitung im Cytosol der Zellen zu einem
cytosolischen Signal führen, konnte durch GIEGÉ et al. (2003) zusätzlich eine Konzentration
des Fluoreszenssignals um Mitochondrien nachgewiesen werden. Voraussetzung für die
Untersuchung der VDAC-Aldolase-Interaktion in Protoplasten wäre, dass VDAC mit dem
nichtfluoreszierenden Fragment des YFP in Mitochondrien eingebaut wird und sich das YFPFragment im Cytosol der Zellen befindet.
Diskussion
126
Die anhand der Hefe-2-Hybrid-Analysen und der Copolymerisationsversuche identifizierten
Interaktionen der Aldolase mit Aktin und VDAC konnten mit Hilfe eines „Far-WesternBlots“ bestätigt werden (s Abb. 3.27). Es zeigte sich eine deutlich nachweisbare Interaktion
zwischen den Proteinen. Dass eine Interaktion mit Tubulin, die von tierischer Aldolase
bekannt ist (KARKHOFF-SCHWEIZER & KNULL, 1987; WALSH et al., 1989), mit Hilfe dieser
Methode nicht möglich war, kann verschiedene Ursachen haben. Da Reste von Tubulin aus
anderen Versuchen eingesetzt wurden, war es nicht möglich, die genaue Proteinmenge zu
bestimmen. Es besteht daher die Möglichkeit, dass weniger als 2 µg Protein auf der Membran
fixiert waren. VÉRTESSY et al. (1997) haben nachgewiesen, dass die Interaktion zwischen
Aldolase und Tubulin konzentrationsabhängig und im Vergleich zur Bindung zwischen PFK
und Tubulin schwächer ist. Die fehlgeschlagene Detektion kann somit auch auf einer für
einen „Far-Western-Blot“ zu schwachen Interaktion zwischen Aldolase und Tubulin beruhen.
In in vitro-Polymerisationsversuchen mit rekombinanter Strep-tag-Aldolase und tierischem
Tubulin konnte jedoch in aktuellen Untersuchungen eine Interaktion pflanzlicher Aldolase mit
Tubulin nachgewiesen werden (Daniela Holtgräwe, mündliche Mitteilung).
Zusammenfassung
127
5 Zusammenfassung
Um Beweise für eine mögliche Mikrokompartimentierung der Glykolyse im pflanzlichen
System zu erhalten, sollten in der vorliegenden Arbeit Protein-Protein-Interaktionen der
cytosolischen Mais-Aldolase mit anderen Proteinen experimentell nachgewiesen werden. Die
in Tieren bekannte Interaktion des glykolytischen Enzyms Aldolase mit Aktin, einem
Bestandteil des Cytoskeletts, wurde für Pflanzen in vitro durch Copolymerisationsversuche
bestätigt. Die dafür benötigte katalytisch aktive Aldolase konnte nach heterologer Expression
in Escherichia coli mit guter Ausbeute (0,02 mg/ml Zellkultur) gereinigt werden. Ihre
Aktivität für Fructose-1,6-bisphosphat betrug 1,23 U/mg.
Die Bindung pflanzlicher Aldolase an Aktinfilamente wurde – anders als im tierischen
System – durch das Substrat Fructose-1,6-bisphosphat auch in hohen Konzentrationen
(10 mM) nicht vollständig verhindert, sondern führte lediglich zu einer um 50% verringerten
Bindung. Eine ebenfalls hemmende Wirkung auf die Bindung der Aldolase an Aktin wiesen
Fructose-6-phosphat und Fructose-2,6-bisphosphat in Konzentrationen von 10 mM auf. Ein
eindeutiger Einfluss des Redox-Milieus auf die Aldolase-Aktin-Bindung konnte nicht
nachgewiesen werden. Glutathion führte in reduzierter und oxidierter Form zu einer geringen
Zunahme der an Aktin gebundenen Aldolase. Unter Einfluss von reduziertem DTT zeigte sich
ebenfalls eine erhöhte Aktinbindung. Dagegen sank der an Aktin gebundene Anteil der
Aldolase unter Einfluss von oxidiertem DTT.
Mit Hilfe des im Rahmen dieser Arbeit etablierten Hefe-2-Hybrid-Systems wurden weitere
Interaktionspartner der Aldolase identifiziert. Insgesamt wurden neun mögliche ProteinProtein-Interaktionen nachgewiesen, bei denen es sich jedoch zum Teil um falsch-positive
Interaktionen handeln kann.
Neben einigen noch unbekannten Proteinen konnten
Interaktionen mit einem Translations-Initiationsfaktor und dem spannungsabhängigen
Anionenkanalprotein VDAC nachgewiesen werden. In Bindeversuchen auf Grundlage der
Affinitätschromatographie mit den rekombinanten Proteinen VDAC und Aldolase wurde ein
weiterer Hinweis auf eine Interaktion zwischen VDAC und Aldolase erhalten. Aufgrund
unspezifischer Bindungen der Aldolase an die Affinitätsmatrix konnte mit dieser Methode
jedoch keine eindeutige Verifizierung der Interaktion erzielt werden. Eine eindeutige
Bestätigung der Interaktionen zwischen Aldolase und Aktin sowie zwischen Aldolase und
VDAC erfolgte durch „Far-Western-Blots“.
Zusammenfassung
128
Das im Rahmen dieser Arbeit hergestellte polyklonale Antiserum gegen cytosolische
Aldolase aus Mais (Bioscience, Göttingen) steht für weitere immunologische Arbeiten zur
Verfügung. Im Western-Blot wird damit spezifisch eine einzelne Bande von ca. 40 kDa in
Rohextrakten von Maiskeimlingen und -wurzeln sowie von Arabidopsis-Blattgewebe und
Kartoffelknollen erkannt.
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153
Danksagung
154
Ich danke...
für die freundliche Aufnahme in die Arbeitsgruppe, die interessante
Themenstellung und Bereitstellung des Arbeitsplatzes sowie für die Hilfe bei
auftretenden Problemen und die Diskussionsbereitschaft
Frau Prof. Dr. R. Scheibe,
für das Vertrauen, das sie in mich gesetzt hat, und die Betreuung der Arbeit
Frau Dr. H. Winter,
Prof. Dr. A. von Schaewen, Dr. J. Backhausen, Dr. S. Holtgrefe und
Dr. H. Merzendorfer für die Hilfe in praktischen Dingen,
Prof. Dr. O. Bakker-Grunwald für die Unterstützung,
allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe für eine schöne Zeit in kollegialer
Umgebung,
besonders hervorgehoben seien hier:
Gudrun Kemper, die mich geduldig in die Laborarbeit eingeführt hat,
Bianca Altmann, die immer zur Stelle war, wenn ich sie brauchte,
Susanne Klocke, ohne die viele Dinge nicht so reibungslos gelaufen wären,
Heike Wolf-Wibbelmann, die sich um die Pflanzen gekümmert hat,
Daniela Holtgräwe, die mit mir gemeinsam diese Strecke gegangen ist, und
Julia Pelz für die schöne gemeinsame Zeit und Unterstützung,
für die ausdauernde private Unterstützung meinen Eltern Brigitte und Guntram
Thilo, meiner Schwester Dörte Thilo und vor allem meinem Mann
Thorsten Scholz,
der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die Gewährung eines Stipendiums
im Rahmen des Graduiertenkollegs 612.
Anhang
155
7 Anhang
7.1 Abkürzungsverzeichnis
A
Absorption
ABP/ABPs
Aktin-Bindeprotein/Aktin-Bindeproteine
AD
Aktivierungsdomäne
Ade
L-Adenin
ADP
Adenosin-5’-diphosphat
AHT
Anhydrotetracyclin-Hydrochlorid
ALD
Aldolase
Amp
Ampicillin
ATP
Adenosin-5’-triphosphat
BD
Bindedomäne
BLAST
„Basic Local Alignment Search Tool“
bp
Basenpaar
BSA
Rinderserumalbumin
CC
kritische Konzentration
cDNA
komplementäre DNA
Clm
Chloramphenicol
Da
Dalton
DEPC
Diethyl-Pyrocarbonat
DF
Durchfluss
DMF
Dimethylformamid
DMSO
Dimethyl Sulfoxid
DNA
Desoxyribonucleinsäure
ds
doppelsträngig
DTT
Dithiothreitol
E
Elutionsschritt
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
EF-1
„elongation factor 1 “
ELISA
„Enzyme linked immunosorbent assey“, Enzymimmunoassay
Exp.
Experiment
FBP
Fructose-1,6-bisphosphat
F-6P
Fructose-6-phosphat
Anhang
156
F-2,6BP
Fructose-2,6-bisphosphat
g
Erdbeschleunigung
GAPDH
Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase
GDH
Glycerin-3-phosphat Dehydrogenase
gi
GenBank-Identifizierungsnummer
GSH
reduziertes Glutathion
GSSG
oxidiertes Glutathion
GTP
Guanosintriphosphat
His
L-Histidin
IPTG
Isopropyl β-D-Thiogalaktopyranosid
Kan
Kanamycin
KM
Michaelis-Menten Konstante
LD-PCR
„long distance-PCR“
Leu
L-Leucin
Lys
L-Lysin
M
Molar
Ma
Marker, Molekularmassenstandard
MOPS
3-(N-Morpholino)-propan-sulfonat
mRNA
„messenger-RNA“, Boten-RNA
MW
Mittelwert
n
Nano
NAD+
Nicotinamid-adenin-dinucleotid
NADP
Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat
Ni-NTA
Nickel-Nitrilotriessigsäure
OD
optische Dichte
ox
oxidiertes
p
Piko
P
Pellet
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PCR
„polymerase chain reaction“, Polymerasekettenreaktion
PEP
Phosphoenolpyruvat
PFK
Phosphofructokinase
PGK
Phosphoglycerat-Kinase
Pi
anorganisches Phosphat
Anhang
157
QDO
„Quadruple Dropout“
RE
Rohextrakt
red
reduziertes
RNA
Ribonucleinsäure
RT
Raumtemperatur
RT-PCR
Reverse Transkriptase-PCR
SAM-S
S-Adenosyl-L-Methionin-Synthetase
SD
Minimalmedium
Sd
Standardabweichung
SDS
Natriumdodecylsulfat
SNP
„single nucleotid polymorphism“
TDO
„Triple Dropout“
Tet
Tetrazyclin
TPI
Triosephosphat-Isomerase
Tris
Tris-(hydroxymethyl)-amino-methan
Trp
L-Tryptophan
ÜS
Überstand
Upm
Umdrehungen pro Minute
V
Volt
var.
Varietät
VDAC
spannungsabhängiger Anionenkanal
Vmax
maximale Reaktionsgeschwindigkeit
Vol
Volumen
v/v
Volumen pro Volumen
W
Waschschritt
w/v
Gewicht pro Volumen
X- -Gal
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-Galaktopyranosid
X-Gal
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-Galaktopyranosid
Signifikanzniveau
µ
mikro
unendlich
sx2
Varianz
Anhang
158
7.2 Ermittelte Sequenzdaten der Expressionskonstrukte
7.2.1 Nukleinsäuresequenz des Expressionskonstruktes ALD_pET-16b
Dargestellt ist die Nukleinsäuresequenz des Konstruktes ALD_pET-16b mit N-terminalem
His-tag (unterstrichen) und dem Start- und Stopcodon der für cytosolische Aldolase aus Mais
kodierenden Sequenz (grau unterlegt).
CATCATCATCATCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCATATCGAAGGTCGTCATATG
TCGGCCTACTGCGGAAAGTACAAGGATGAGCTCATCAAGAATGCTGCCTACATTGGCACC
CCTGGCAAGGGTATCCTTGCTGCTGATGAGTCCACTGGCACCATTGGCAAGCGCCTTTCC
AGCATCAATGTCGAGAACGTTGAGGAGAACCGCCGTGCCCTCCGTGAGCTCCTATTCTGC
TGCCCTGGTGCTCTCCAGTACATCAGCGGTGTGATCCTCTTCGAGGAGACCCTGTACCAG
AAGACCAAGGATGGCAAGCCTTTTGTTGATGTCCTCAAGGAGGGAGGCGTCCTCCCTGGC
ATCAAGGTTGACAAGGGCACCATTGAGGTTGTTGGCACTGATAAGGAGACCACCACCCAA
GGCCATGACGACCTTGGCAAGCGCTGCGCCAAGTACTACGAGGCAGGTGCCCGCTTTGCC
AAGTGGCGCGCTGTTCTCAAGATTGGCCCTAATGAGCCATCACAGCTTGCCATCGACCTG
AACGCTCAGGGTCTAGCTCGCTACGCCATCATCTGCCAGGAGAATGGTCTGGTGCCAATT
GTTGAGCCTGAGATCCTTGTTGATGGCCCTCATGACATTGATCGCTGTGCTTACGTCACT
GAGACCGTCCTTGCTGCCTGCTACAAGGCGCTCAACGAGCACCATGTCCTCCTGGAGGGT
ACCCTCCTGAAGCCCAACATGGTGACTCCAGGCTCCGACTCCAAGAAGGTGACCCCTGAG
GTGATTGCTGAGTACACCGTCCGTACCCTCCAGAGGACCGTACCTGCTGCTGTGCCTGCT
GTTGTTTTCCTCTCTGGTGGACAGAGCGAGGAGGAGGCCACCCGCAACCTCAATGCCATG
AACAAGCTCAGCACCAAGAAGCCGTGGTCCCTGTCTTTCTCCTTCGGCCGTGCCCTCCAG
GCGAGCACCCTCAAGGCCTGGGCTGGCAAGGTGGAGAACTTGGAGAAGGCTAGAGCTGCC
TTCCTCGCCAGGTGCAAGGCCAACTCTGAGGCTACCCTCGGCACCTACAAGGGTGATGCT
GCCGCCGACACCGAGAGCCTCCACGTCAAGGACTACAAGTACTGA
7.2.2 Abgeleitete Aminosäuresequenz des Expressionskonstruktes
ALD_pET-16b
Dargestellt ist die Aminosäuresequenz des Konstruktes ALD_pET-16b mit N-terminalem
His-tag (unterstrichen) und dem Start-Methionin (M) der cytosolische Aldolase aus Mais.
H
I
N
F
K
G
R
Y
T
A
L
L
K
H
K
V
E
G
A
Y
V
P
V
S
A
Y
H H H
N A A
E N V
E T L
T I E
R F A
A I I
T E T
G S D
V F L
F S F
R C K
Stop
H
Y
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Y
V
K
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G
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K
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G
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G
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V
E
L
C
M
V
W
A
D
L
I
L
D
A
A
A
V
P
S
F
Y
Anhang
159
7.2.3 Nukleinsäuresequenz des Expressionskonstruktes ALD_pASK-IBA3
Dargestellt ist die Nukleinsäuresequenz des Konstruktes ALD_pASK-IBA3 mit C-terminalem
Strep-tag (unterstrichen) und dem Startcodon der für cytosolische Aldolase aus Mais
kodierenden Sequenz (grau unterlegt).
ATGTCGGCCTACTGCGGAAAGTACAAGGATGAGCTCATCAAGAATGCTGCCTACATTGGC
ACCCCTGGCAAGGGTATCCTTGCTGCTGATGAGTCCACTGGCACCATTGGCAAGCGCCTT
TCCAGCATCAATGTCGAGAACGTTGAGGAGAACCGCCGTGCCCTCCGTGAGCTCCTATTC
TGCTGCCCTGGTGCTCTCCAGTACATCAGCGGTGTGATCCTCTTCGAGGAGACCCTGTAC
CAGAAGACCAAGGATGGCAAGCCTTTTGTTGATGTCCTCAAGGAGGGAGGCGTCCTCCCT
GGCATCAAGGTTGACAAGGGCACCATTGAGGTTGTTGGCACTGATAAGGAGACCACCACC
CAAGGCCATGACGACCTTGGCAAGCGCTGCGCCAAGTACTACGAGGCAGGTGCCCGCTTT
GCCAAGTGGCGCGCTGTTCTCAAGATTGGCCCTAATGAGCCATCACAGCTTGCCATCGAC
CTGAACGCTCAGGGTCTAGCTCGCTACGCCATCATCTGCCAGGAGAATGGTCTGGTGCCA
ATTGTTGAGCCTGAGATCCTTGTTGATGGCCCTCATGACATTGATCGCTGCGCTTACGTC
ACTGAGACCGTCCTTGCTGCCTGCTACAAGGCGCTCAACGAGCACCATGTCCTCCTGGAG
GGTACCCTCCTGAAGCCCAACATGGTGACTCCAGGCTCCGACTCCAAGAAGGTGACCCCT
GAGGTGATTGCTGAGTACACCGTCCGTACCCTCCAGAGGACCGTACCTGCTGCTGTGCCT
GCTGTTGTCTTCCTCTCTGGTGGACAGAGCGAGGAGGAGGCCACCCGCAACCTCAATGCC
ATGAACAAGCTCAGCACCAAGAAGCCGTGGTCCCTGTCTTTCTCCTTCGGCCGTGCCCTC
CAGGCGAGCACCCTCAAGGCCTGGGCTGGCAAGGTGGAGAACTTGGAGAAGGCTAGAGCT
GCCTTCCTCGCCAGGTGCAAGGCCAACTCTGAGGCTACCCTCGGCACCTACAAGGGTGAT
GCTGCCGCCGACACCGAGAGCCTCCACGTCAAGGACTACAAGTACAGCGCTTGGAGCCAC
CCGCAGTTCGAAAAATAA
7.2.4 Abgeleitete Aminosäuresequenz des Konstruktes ALD_pASK-IBA3
Dargestellt ist die Aminosäuresequenz des Konstruktes ALD_pASK-IBA3 mit C-terminalem
Strep-tag (unterstrichen) und dem Start-Methionin (M) der cytosolische Aldolase aus Mais.
M
S
P
K
D
Q
L
L
R
A
K
A
S
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G
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L
L
V
L
T
M
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G
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G
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K
V
K
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E
S
L
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I G P
P I V
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Stop
A
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C
V
H
P
E
H
T
L
A
D
E
C
L
D
S
I
V
V
N
G
A
Anhang
160
7.2.5 Schematische Dartsellung der Aldolase-Expressionskonstrukte
Schematische Darstellung der Expressionskonstrukte ALD_pET-16b und ALD_pASK-IBA3
mit His- bzw. Strep-tag zur Reinigung nach heterologer Expression.
His-tag
ALD_pET-16b
HHHHHHHHHH
N
C
Aldolase
Strep-tag
ALD_pASK-IBA3
Aldolase
WSHPQFEK
7.2.6 Nukleinsäuresequenz des Expressionskonstruktes VDAC_pRSET A
Dargestellt ist die Nukleinsäuresequenz des Konstruktes VDAC_pRSET A mit N-terminalem
His-tag (unterstrichen) und dem Start- und Stopcodon der codierenden Sequenz für VDAC
aus Mais (grau unterlegt).
CATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGAT
CTGTACGACGATGACGATAAGGATCGATGGGGATCCATGGTCGGGCCAGGCCTCTACACC
GAGATCGGCAAGAAGACCAGGGATCTGCTGTACAAGGACTACCAGACTGACCACAAGTTC
ACCCTCACTACCTACACCTCCAATGGCGTCGCTGTAACTGCTTCTGGCACAAAGAAAGCT
GACCTGATCCTTGGCGAGATCCAATCACAGATAAAGAACAAGAACATGACCATAGATGTG
AAAGCAAACTCGGAGTCAAATATCATTACGACAATTACTGTTGATGAGATTGCAACACCA
GGGCTGAAGACCATCTTAAGTTTTGCTGTTCCTGATCAGAGATCTGGAAAGGTTGAGCTC
CAGTATTTGCATGATTATGCTGGAGTTAATGCAAGCATCGGTCTGACAGCCAATCCTGTA
GTCAACCTCTCTGCTGCCTTTGGTACTAAGGCTGTTGCAGTTGGTGCCGATATCTCACTT
GATACTGCAACTGGGAACTTGACTAAATACAATGCTGCACTGAGGTTCACTCATGAAGAC
CTTGTCGCATCCCTGAACCTGAACAACAAGGGAGACAGCCTTACTGGAGCCTACTATCAC
AAGGTGAGCGAATTGACCAACACAGCTGTTGGGGCAGAGCTTACCCACAGCTTCTCGACC
AATGAAAACACCCTCACCTTTGGCAGGCAGCACGCCCTGGACCCACTAACCGTCTTGAAG
GCCCGCATTAACAACTCTGGCAAGGCCAGTGCCCTGATCCAGCACGAGTGGAGGCCAAAG
TCGCTGGTCACCATCTCGGCCGAGGTCGACACAAAGACCATCGAGAAGAGCTCGAAGGTT
GGGATTGCTGTGGCCCTCAAGCCCTGA
7.2.7 Abgeleitete Aminosäuresequenz des Konstruktes VDAC_pRSET A
Dargestellt ist die Aminosäuresequenz des Konstruktes VDAC_pRSET A mit N-terminalem
His-tag (unterstrichen) und dem Start-Methionin (M) von VDAC aus Mais.
HHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGSMVGPGLY
TEIGKKTRDLLYKDYQTDHKFTLTTYTSNGVAVTASGTKKA
DLILGEIQSQIKNKNMTIDVKANSESNIITTITVDEIATPGLKT
ILSFAVPDQRSGKVELQYLHDYAGVNASIGLTANPVVNLSA
AFGTKAVAVGADISLDTATGNLTKYNAALRFTHEDLVASLN
LNNKGDSLTGAYYHKVSELTNTAVGAELTHSFSTNENTLTF
GRQHALDPLTVLKARINNSGKASALIQHEWRPKSLVTISAEV
D T K T I E K S S K V G I A V A L K P Stop
Anhang
161
7.2.8 Sequenzvergleiche der Expressionskonstrukte
In den folgenden drei Abbildungen sind die Ergebnisse der Sequenzvergleiche der
Expressionskonstrukte mit den in der Datenbank GenBank veröffentlichten Nukleinsäuresequenzen dargestellt.
ALD 8
1
MZEADL 22
ALD 8
61
MZEADL 82
ALD 8
121
MZEADL 142
ALD 8
181
MZEADL 202
ALD 8
241
MZEADL 262
ALD 8
301
MZEADL 322
ALD 8
361
MZEADL 382
ALD 8
421
MZEADL 442
ALD 8
481
MZEADL 502
ALD 8
541
MZEADL 562
ALD 8
601
MZEADL 622
ALD 8
661
MZEADL 682
ALD 8
721
MZEADL 742
atgtcggcctactgcggaaagtacaaggatgagctcatcaagaatgctgcctacattggc 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
atgtcggcctactgcggaaagtacaaggatgagctcatcaagaatgctgcctacattggc 81
acccctggcaagggtatccttgctgctgatgagtccactggcaccattggcaagcgcctt 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
acccctggcaagggtatccttgctgctgatgagtccactggcaccattggcaagcgcctt 141
tccagcatcaatgtcgagaacgttgaggagaaccgccgtgccctccgtgagctcctattc 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
tccagcatcaatgtcgagaacgttgaggagaaccgccgtgccctccgtgagctcctattc 201
tgctgccctggtgctctccagtacatcagcggtgtgatcctcttcgaggagaccctgtac 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
tgctgccctggtgctctccagtacatcagcggtgtgatcctcttcgaggagaccctgtac 261
cagaagaccaaggatggcaagccttttgttgatgtcctcaaggagggaggcgtcctccct 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
cagaagaccaaggatggcaagccttttgttgatgtcctcaaggagggaggcgtcctccct 321
ggcatcaaggttgacaagggcaccattgaggttgttggcactgataaggagaccaccacc 360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ggcatcaaggttgacaagggcaccattgaggttgttggcactgataaggagaccaccacc 381
caaggccatgacgaccttggcaagcgctgcgccaagtactacgaggcaggtgcccgcttt 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||
caaggccatgacgaccttggcaagcgctgcgccaagtactacgaggccggtgcccgcttt 441
gccaagtggcgcgctgttctcaagattggccctaatgagccatcacagcttgccatcgac 480
|||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||
gccaagtggcgcgctgttctcaagattggccccaatgagccatcacagcttgccatcgac 501
ctgaacgctcagggtctagctcgctacgccatcatctgccaggagaatggtctggtgcca 540
||||||||||||||||| |||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||
ctgaacgctcagggtctggctcgctatgccatcatctgccaggagaatggtctggtgcca 561
attgttgagcctgagatccttgttgatggccctcatgacattgatcgctgtgcttacgtc 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||
attgttgagcctgagatccttgttgatggccctcatgacattgatcgctgcgcttacgtc 621
actgagaccgtccttgctgcctgctacaaggcgctcaacgagcaccatgtcctcctggag 660
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
actgagaccgtccttgctgcctgctacaaggcgctcaacgagcaccatgtcctcctggag 681
ggtaccctcctgaagcccaacatggtgactccaggctccgactccaagaaggtgacccct 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||
ggtaccctcctgaagcccaacatggtgactccaggctccgactccaagaaggtgactcct 741
gaggtgattgctgagtacaccgtccgtaccctccagaggaccgtacctgctgctgtgcct 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||
gaggtgattgctgagtacaccgtccgtaccctccagaggaccgtccctgctgctgtgcct 801
Anhang
ALD 8
162
781
MZEADL 802
ALD 8
901
MZEADL 922
ALD 8
961
MZEADL 982
gctgttgttttcctctctggtggacagagcgaggaggaggccacccgcaacctcaatgcc 840
|||||| | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
gctgttctcttcctctctggtggacagagcgaggaggaggccacccgcaacctcaatgcc 861
caggcgagcaccctcaaggcctgggctggcaaggtggagaacttggagaaggctagagct 960
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
caggcgagcaccctcaaggcctgggctggcaaggtggagaacttggagaaggctagagct 981
gccttcctcgccaggtgcaaggccaactctgaggctaccctcggcacctacaagggtgat 1020
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
gccttcctcgccaggtgcaaggccaactctgaggctaccctcggcacctacaagggtgat 1041
ALD 8
1021 gctgccgccgacaccgagagcctccacgtcaaggactacaagtactga 1068
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MZEADL 1042 gctgccgccgacaccgagagcctccacgtcaaggactacaagtactga 1089
Abb. 8.1: Sequenzvergleich der Aldolase des Expressionskonstruktes ALD_pET-16b mit der cytosolischen
Aldolase aus Mais (MZEALD). Der Sequenzvergleich erfolgte mit dem BLAST-Programm gegen die
Datenbank GenBank. Die grau unterlegten Bereiche zeigen ungleiche Nukleotide an. Durch das rot markierte
Nukleotid kommt es zu einem Aminosäureaustausch in der Proteinsequenz.
Anhang
ALD-IBA3
163
1
MZEALD
22
ALD-IBA3
61
MZEALD
82
ALD-IBA3
121
MZEALD
142
ALD-IBA3
181
MZEALD
202
ALD-IBA3
241
MZEALD
262
ALD-IBA3
301
MZEALD
322
ALD-IBA3
361
MZEALD
382
ALD-IBA3
421
MZEALD
442
ALD-IBA3
481
MZEALD
502
ALD-IBA3
541
MZEALD
562
ALD-IBA3
601
MZEALD
622
ALD-IBA3
661
MZEALD
682
ALD-IBA3
721
MZEALD
742
ALD-IBA3
781
MZEALD
802
ALD-IBA3
841
MZEALD
862
atgtcggcctactgcggaaagtacaaggatgagctcatcaagaatgctgcctacattggc 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
atgtcggcctactgcggaaagtacaaggatgagctcatcaagaatgctgcctacattggc 81
acccctggcaagggtatccttgctgctgatgagtccactggcaccattggcaagcgcctt 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
acccctggcaagggtatccttgctgctgatgagtccactggcaccattggcaagcgcctt 141
tccagcatcaatgtcgagaacgttgaggagaaccgccgtgccctccgtgagctcctattc 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
tccagcatcaatgtcgagaacgttgaggagaaccgccgtgccctccgtgagctcctattc 201
tgctgccctggtgctctccagtacatcagcggtgtgatcctcttcgaggagaccctgtac 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
tgctgccctggtgctctccagtacatcagcggtgtgatcctcttcgaggagaccctgtac 261
cagaagaccaaggatggcaagccttttgttgatgtcctcaaggagggaggcgtcctccct 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
cagaagaccaaggatggcaagccttttgttgatgtcctcaaggagggaggcgtcctccct 321
ggcatcaaggttgacaagggcaccattgaggttgttggcactgataaggagaccaccacc 360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ggcatcaaggttgacaagggcaccattgaggttgttggcactgataaggagaccaccacc 381
caaggccatgacgaccttggcaagcgctgcgccaagtactacgaggcaggtgcccgcttt 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||
caaggccatgacgaccttggcaagcgctgcgccaagtactacgaggccggtgcccgcttt 441
gccaagtggcgcgctgttctcaagattggccctaatgagccatcacagcttgccatcgac 480
|||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||
gccaagtggcgcgctgttctcaagattggccccaatgagccatcacagcttgccatcgac 501
ctgaacgctcagggtctagctcgctacgccatcatctgccaggagaatggtctggtgcca 540
||||||||||||||||| |||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||
ctgaacgctcagggtctggctcgctatgccatcatctgccaggagaatggtctggtgcca 561
attgttgagcctgagatccttgttgatggccctcatgacattgatcgctgcgcttacgtc 600
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
attgttgagcctgagatccttgttgatggccctcatgacattgatcgctgcgcttacgtc 621
actgagaccgtccttgctgcctgctacaaggcgctcaacgagcaccatgtcctcctggag 660
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
actgagaccgtccttgctgcctgctacaaggcgctcaacgagcaccatgtcctcctggag 681
ggtaccctcctgaagcccaacatggtgactccaggctccgactccaagaaggtgacccct 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||
ggtaccctcctgaagcccaacatggtgactccaggctccgactccaagaaggtgactcct 741
gaggtgattgctgagtacaccgtccgtaccctccagaggaccgtacctgctgctgtgcct 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||
gaggtgattgctgagtacaccgtccgtaccctccagaggaccgtccctgctgctgtgcct 801
gctgttgtcttcctctctggtggacagagcgaggaggaggccacccgcaacctcaatgcc 840
|||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
gctgttctcttcctctctggtggacagagcgaggaggaggccacccgcaacctcaatgcc 861
atgaacaagctcagcaccaagaagccgtggtccctgtctttctccttcggccgtgccctc 900
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
atgaacaagctcagcaccaagaagccgtggtccctgtctttctccttcggccgtgccctc 921
Anhang
164
ALD-IBA3
901
MZEALD
922
ALD-IBA3
961
MZEADL
982
ALD-IBA3 1021
MZEADL
1042
caggcgagcaccctcaaggcctgggctggcaaggtggagaacttggagaaggctagagct 960
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
caggcgagcaccctcaaggcctgggctggcaaggtggagaacttggagaaggctagagct 981
gccttcctcgccaggtgcaaggccaactctgaggctaccctcggcacctacaagggtgat 1020
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
gccttcctcgccaggtgcaaggccaactctgaggctaccctcggcacctacaagggtgat 1041
gctgccgccgacaccgagagcctccacgtcaaggactacaagtac 1065
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
gctgccgccgacaccgagagcctccacgtcaaggactacaagtac 1086
Abb. 8.2: Sequenzvergleich der Aldolase des Expressionskonstruktes ALD_pASK-IBA3 mit der cytosolischen
Aldolase aus Mais (MZEALD). Der Sequenzvergleich erfolgte mit dem BLAST-Programm gegen die
Datenbank GenBank. Die grau unterlegten Bereiche zeigen ungleiche Nukleotide an. Durch das rot markierte
Nukleotid kommt es zu einem Aminosäureaustausch in der Proteinsequenz.
Anhang
vdac
165
1
vdac1a 93
vdac
atggtcgggccaggcctctacaccgagatcggcaagaagaccagggatctgctgtacaag 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
atggtcgggccaggcctctacaccgagatcggcaagaagaccagggatctgctgtacaag 152
61
gactaccagactgaccacaagttcaccctcactacctacacctccaatggcgtcgctgta 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
vdac1a 153 gactaccagactgaccacaagttcaccctcactacctacacctccaatggcgtcgctgta 212
vdac
121 actgcttctagcacaaagaaagctgacctgatccttggcgagatccaatcacagataaag 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
vdac1a 213 actgcttctagcacaaagaaagctgacctgatccttggcgagatccaatcacagataaag 272
vdac
181 aacaagaacatgaccatagatgtgaaagcaaactcggagtcaaatatcattacaacaatt 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||
vdac1a 273 aacaagaacatgaccatagatgtgaaagcaaactcggagtcaaatatcattacgacaatt 332
vdac
241 actgttgatgagattgcaacaccagggctgaagaccatcttaagttttgctgttcctgat 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||
vdac1a 333 actgttgatgagattgcaacaccagggctgaagaccatcttaagctttgctgttcctgat 392
vdac
301 cagagatctggaaaggttgagctccagtatttgcatgattatgctggagttaatgcaagc 360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
vdac1a 393 cagagatctggaaaggttgagctccagtatttgcatgattatgctggagttaatgcaagc 452
vdac
361 atcggtctgacagccaatcctgtagtcaacctctctgctgcctttggtactaaggctgtt 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
vdac1a 453 atcggtctgacagccaatcctgtagtcaacctctctgctgcctttggtactaaggctgtt 512
vdac
421 gcagttggtgccgatatctcacttgatactgcaactgggaacttgactaaatacaatgct 480
||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
vdac1a 513 gcacttggtgccgatatctcacttgatactgcaactgggaacttgactaaatacaatgct 572
vdac
481 gcactgaggttcactcatgaagaccttgtcgcatccctgaacctgaacaacaagggcgac 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||
vdac1a 573 gcactgaggttcactcatgaagaccttgtcgcatccctgaacctgaacaacaagggagac 632
vdac
541 agccttactggagcctactatcacaaggtgagcgaattgaccaacacagctgttggggca 600
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
vdac1a 633 agccttactggagcctactatcacaaggtgagcgaattgaccaacacagctgttggggca 692
vdac
601 gagcttacccacagcttctcgaccaatgaaaacaccctcacctttggcgggcagcacgcc 660
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
vdac1a 693 gagcttacccacagcttctcgaccaatgaaaacaccctcacctttggcgggcagcacgcc 752
vdac
661 ctggacccactaaccgtcttgaaggcccgcattaacaaatctggcaaggccagtgccctg 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||
vdac1a 753 ctggacccactaaccgtcttgaaggcccgcattaacaactctggcaaggccagtgccctg 812
vdac
721 atccagcacgagtggaggccaaagtcgctggtcaccatctcggccgaggtcgacacaaag 780
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
vdac1a 813 atccagcacgagtggaggccaaagtcgctggtcaccatctcggccgaggtcgacacaaag 872
vdac
781 accatcgagaagagctcgaaggttgggattggtgtggccctcaagccctga 831
||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||
vdac1a 873 accatcgagaagagctcgaaggttgggattgctgtggccctcaagccctga 923
Abb. 8.3: Sequenzvergleich des spannungsabhängigen Anionenkanalproteins VDAC (vdac) mit der Sequenz der
Datenbank GenBank (vdac1a). Der Sequenzvergleich erfolgte mit dem BLAST-Programm. Die grau unterlegten
Bereiche zeigen ungleiche Nukleotide an. Durch rot markierte Nukleotide kommt es zu einem
Aminosäureaustausch in der Proteinsequenz.
Anhang
166
7.3 Sequenzen der pGADT7-cDNA-Bank-Konstrukte
Im Folgenden sind die ermittelten Sequenzen der pGADT7-cDNA-Bank-Konstrukte aus den
blauen Hefekolonien aufgelistet. Sequenzen, die mehrfach identifiziert wurden, sind
beispielhaft nur einmal dargestellt und zu jeder Sequenz ist die entsprechende BLASTAnalyse abgebildet. Unterstreichungen kennzeichnen Teile der Vektorensequenz.
Sequenzen der pGADT7-cDNA-Bank-„Inserts der Hefekolonien 2.4, 2.5 und 2.7:
CCATTATGGCCGGGAACAAAACCTGTCTTTAACGGGATGGTACTTACTTTCATACAGGTG
CTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTTGGTCAAGTCCTATAACGAGCGAA
ACCCTCGTTTTGTGTTGCTGAGACATGCGCCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
>gi|13923|emb|X00794.1|MIZMRN01 Maize mitochondrial gene for 18S rRNA
Length = 1968
Score = 278 bits (140), Expect = 2e-75
Identities = 140/140 (100%)
Strand = Plus / Plus
Query: 2
aacaaaacctgtctttaacgggatggtacttactttcatacaggtgctgcatggctgtcg
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 1053 aacaaaacctgtctttaacgggatggtacttactttcatacaggtgctgcatggctgtcg
Query: 62
tcagctcgtgtcgtgagatgtttggtcaagtcctataacgagcgaaaccctcgttttgtg
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 1113 tcagctcgtgtcgtgagatgtttggtcaagtcctataacgagcgaaaccctcgttttgtg
Query: 122
ttgctgagacatgcgcctaa 141
||||||||||||||||||||
Sbjct: 1173 ttgctgagacatgcgcctaa 1192
Sequenzen der pGADT7-cDNA-Bank-„Inserts der Hefekolonien 2.17 und 7.243:
GTATGTGNTTTANCCCCTTTTCCTGCAGTACCCATACGACGTACCAGATTACGCTCATAT
GGCCATGGAGGCCAGTGAATTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATG
GCCGGGGGCCTTAACCATTCCTCCCAACACCACCTCGCCGCGATCTCCGTAGCCTCCGTC
GCGTCGAGCATCGATCATGTCGGCCTACTGCGGAAAGTACAAGGATGAGCTCATCAAGAA
TGCTGCCTACATTGGCACCCCTGGCAAGGGTATCCTTGCTGCTGATGAGTCCACTGGCAC
CATTGGCAAGCGCCTTTCCAGCATCAATGTCGAGAACGTTGAGGAGAACCGCCGTGCCCT
CCGTGAGCTCCTATTCTGCTGCCCTGGTGCTCTCCAGTACATCAGCGGTGTGATCCTCTT
CGAGGAGACCCTGTACCAGAAGACCAAGGATGGCAAGCCTTTTGTTGATGTCCTCAAGGA
GGGAGGCGTCCTCCCTGGCATCAAGGTTGACAAGGGCACCATTGAGGTTGTTGGCACTGA
TAAGGAGACCACCACCCAAGGCCATGACGACCTTGGCAAGCGCTGCGCCAAGTACTACGA
GGCAGGTGCCCGCTTTGCCAAGTGGCGCGCTGTTCTCAAGATTGGCCCTAATGAGCCATC
ACAGCTTGCCATCGACCTGAACGCTCANGGTCTAGCTCGCTACGCCATCATCTGCCAGGA
GAATGGTCTGGTGCCAATTGTTGAGCCTGAGATCCTTGTTGATGGCCCTCATGACATTGA
TCGTGTNTTACGTACTGANNCGTCTTGTGCTGTCAAGCGCTCAACAGCACCATGTNCTCT
GAGGTCCCTCTGAGCCCACTGNGACTCAGCTCGNTCAAAAGNGACCCTGAGNGATGTGAT
CACGNCNACCTCAAGACGACCTGTGTGGCTGTGTGTTCTTTGNGAAANCAGAGAGCCCCN
CACTATGCTGACAC
Anhang
167
>gi|168419|gb|M16220.1|MZEALD Maize (Z.mays) aldolase mRNA, complete cds
Length = 1388
Score = 1168 bits (589), Expect = 0.0
Identities = 603/608 (99%)
Strand = Plus / Plus
Query: 176 ccgtcgcgtcgagcatcgatcatgtcggcctactgcggaaagtacaaggatgagctcatc 235
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 1
ccgtcgcgtcgagcatcgatcatgtcggcctactgcggaaagtacaaggatgagctcatc 60
Query: 236 aagaatgctgcctacattggcacccctggcaagggtatccttgctgctgatgagtccact 295
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 61 aagaatgctgcctacattggcacccctggcaagggtatccttgctgctgatgagtccact 120
Query: 296 ggcaccattggcaagcgcctttccagcatcaatgtcgagaacgttgaggagaaccgccgt 355
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 121 ggcaccattggcaagcgcctttccagcatcaatgtcgagaacgttgaggagaaccgccgt 180
Query: 356 gccctccgtgagctcctattctgctgccctggtgctctccagtacatcagcggtgtgatc 415
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 181 gccctccgtgagctcctattctgctgccctggtgctctccagtacatcagcggtgtgatc 240
Query: 416 ctcttcgaggagaccctgtaccagaagaccaaggatggcaagccttttgttgatgtcctc 475
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 241 ctcttcgaggagaccctgtaccagaagaccaaggatggcaagccttttgttgatgtcctc 300
Query: 476 aaggagggaggcgtcctccctggcatcaaggttgacaagggcaccattgaggttgttggc 535
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 301 aaggagggaggcgtcctccctggcatcaaggttgacaagggcaccattgaggttgttggc 360
Query: 536 actgataaggagaccaccacccaaggccatgacgaccttggcaagcgctgcgccaagtac 595
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 361 actgataaggagaccaccacccaaggccatgacgaccttggcaagcgctgcgccaagtac 420
Query: 596 tacgaggcaggtgcccgctttgccaagtggcgcgctgttctcaagattggccctaatgag 655
|||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||
Sbjct: 421 tacgaggccggtgcccgctttgccaagtggcgcgctgttctcaagattggccccaatgag 480
Query: 656 ccatcacagcttgccatcgacctgaacgctcanggtctagctcgctacgccatcatctgc 715
|||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| |||||||| ||||||||||||
Sbjct: 481 ccatcacagcttgccatcgacctgaacgctcagggtctggctcgctatgccatcatctgc 540
Query: 716 caggagaatggtctggtgccaattgttgagcctgagatccttgttgatggccctcatgac 775
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 541 caggagaatggtctggtgccaattgttgagcctgagatccttgttgatggccctcatgac 600
Query: 776 attgatcg 783
||||||||
Sbjct: 601 attgatcg 608
Anhang
168
Sequenz des pGADT7-cDNA-Bank-„Inserts der Hefekolonie 2.43:
CCATTATGGCCGGGCGGAACCTGCCCCTGGCTCAGGCCTGATGGGAAGACCCAGGTGACA
GTCGAGTACCGCAATGAGGGTGGTGCCATGGTCCCCATCCGTGTCCACACCGTCCTCATC
TCCACCCAGCACGACGAGACAGTGACCAATGATGAGATCGCTGCTGACCTGAAGGAGCAT
GTCATCAAGCCTATCATCCCTGAGCAGTACCTTGACGAGAAGACCATCTTCCACCTTAAC
CCATCCGGCCGCTTTGTCATTGGTGGACCTCACGGCGATGCTGGCCTCACTGGCCGCAAG
ATCATCATTGACACCTACGGTGGCTGGGGAGCCCATGGTGGTGGCGCTTTNTNCGGCAAG
GACCCAACCAAGGTTGACCGCAGCGGAGCCTATGTNGNGAGGCAGGCTGCCAAGAGCATC
GTCGCCAGCGGCCTTGCTCGCCGCGCCATCGTNCAGGTGTNCTACGCCATCGGTGTGCCC
NAGCCTCTCTCCGTGT
>gi|17017258|gb|AF439721.1|AF439721 Zea mays methionine adenosyltransferase
mRNA, partial cds
Length = 760
Score = 87.7 bits (44), Expect = 1e-17
Identities = 71/80 (88%)
Strand = Plus / Plus
Query: 194 cagtaccttgacgagaagaccatcttccaccttaacccatccggccgctttgtcattggt 253
||||||||||| ||||| |||||||||||||| |||||||| || ||||| ||||| |||
Sbjct: 634 cagtaccttgatgagaataccatcttccacctcaacccatcaggtcgcttcgtcatcggt 693
Query: 254 ggacctcacggcgatgctgg 273
||||| ||||| ||||||||
Sbjct: 694 ggaccacacggagatgctgg 713
Sequenz des pGADT7-cDNA-Bank-„Inserts der Hefekolonie 2.48:
TCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATTGCCGGGGGCTTCGCCTCCAC
CTATCCGCCGCCTCCCAATCATNCTGCCCCCAAACTCCCACCCCGCAGCATNCCCACGCC
GCCGCACCTNGTCGCGTNGCGTCGTCACCGGCGTGGAGATGGTCGGGCCAGGCCTNTACA
CCGAGATCGGCAAGAAGACCAGGGATCTGCTGTACAAGGACTACCAGACTGACCACAAGT
TCACCCTCACTACCTACACCTNCAATGGCGTCGCTGTAACTGCTTNTAGCACAAAGAAAG
CTGACCTGATCCTTGGCGAGATCCAATCACAGATAAAGAACAAGAACATGACCATAGATG
TGAAAGCAAACTCGGAGTCAAATATNATTACAACAATTACTGNTGATGAGATTGCAACAC
CAGGGCTGAAGACCATCTTAAGCTTTGCTGTTCCTGATCAGAGATCTGGAAAGGNTGAGC
TNCANTATTTGCATGATTATGCTGGAGTTAATGCNAANCATTGGTCTGACNNNCNATCC
>gi|5929927|gb|AF178950.1|AF178950 Zea mays voltage-dependent anion channel
protein 1a (vdac1a) mRNA, complete cds; nuclear gene for mitochondrial
product
Length = 1179
Score = 731 bits (369), Expect = 0.0
Identities = 401/415 (96%)
Strand = Plus / Plus
Query: 82
Sbjct: 1
gccgcctcccaatcatnctgcccccaaactcccaccccgcagcatncccacgccgccgca 141
|||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||| |||||||| || ||
gccgcctcccaatcatcctgcccccaaactcccaccccgcagcatccccacgccaccaca 60
Query: 142 cctngtcgcgtngcgtcgtcaccggcgtggagatggtcgggccaggcctntacaccgaga 201
||| ||||||| ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||
Sbjct: 61 cctcgtcgcgtcgcgtcgtcaccggcgtgaagatggtcgggccaggcctctacaccgaga 120
Query: 202 tcggcaagaagaccagggatctgctgtacaaggactaccagactgaccacaagttcaccc 261
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 121 tcggcaagaagaccagggatctgctgtacaaggactaccagactgaccacaagttcaccc 180
Anhang
169
Query: 262 tcactacctacacctncaatggcgtcgctgtaactgcttntagcacaaagaaagctgacc 321
||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||
Sbjct: 181 tcactacctacacctccaatggcgtcgctgtaactgcttctagcacaaagaaagctgacc 240
Query: 322 tgatccttggcgagatccaatcacagataaagaacaagaacatgaccatagatgtgaaag 381
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 241 tgatccttggcgagatccaatcacagataaagaacaagaacatgaccatagatgtgaaag 300
Query: 382 caaactcggagtcaaatatnattacaacaattactgntgatgagattgcaacaccagggc 441
||||||||||||||||||| ||||| |||||||||| |||||||||||||||||||||||
Sbjct: 301 caaactcggagtcaaatatcattacgacaattactgttgatgagattgcaacaccagggc 360
Query: 442 tgaagaccatcttaagctttgctgttcctgatcagagatctggaaaggntgagct 496
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||
Sbjct: 361 tgaagaccatcttaagctttgctgttcctgatcagagatctggaaaggttgagct 415
Sequenz des pGADT7-cDNA-Bank-„Inserts der Hefekolonie 4D:
CCATTATGGCCGGGGAATCGGGCGGCCTCGCCGCCCGAATTGTAGTCTGGAGAGGCGTCC
TCAGCGACGGACCGGGCCCAAGTTCTCTGGAAAGGGACGCCTGGGAGGGTGAGAGCCCCG
TCCGGCCCGGACCCTGTCGCACCACGAGGCGCCGTCAACGAGTCGGGTTGTTTGGGAATG
CAGCCCAAATCGGGCGGTAAACTCCGTCCAAGGCTAAATACAGGCGAGAGACCGATAGCG
AACAAGTACCGCGAGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
>gi|13397940|emb|AJ309824.2|ZMA309824 Zea mays 25S rRNA gene and
transposon-like sequence
Length = 10658
Score = 438 bits (221), Expect = e-123
Identities = 241/245 (98%), Gaps = 2/245 (0%)
Strand = Plus / Plus
Query: 1
Sbjct: 855
Query: 59
Sbjct: 915
Query: 119
Sbjct: 975
gaatcgggcggcct-cgccgcccgaattgta-gtctggagaggcgtcctcagcgacggac
|||||||||||||| |||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||
gaatcgggcggccttcgccgcccgaattgtaagtctggagaggcgtcctcagcgacggac
cgggcccaagttctctggaaagggacgcctgggagggtgagagccccgtccggcccggac
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
cgggcccaagttctctggaaagggacgcctgggagggtgagagccccgtccggcccggac
cctgtcgcaccacgaggcgccgtcaacgagtcgggttgtttgggaatgcagcccaaatcg
||| ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
cctatcgcaccacgaggcgccatcaacgagtcgggttgtttgggaatgcagcccaaatcg
Query: 179
ggcggtaaactccgtccaaggctaaatacaggcgagagaccgatagcgaacaagtaccgc
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 1035 ggcggtaaactccgtccaaggctaaatacaggcgagagaccgatagcgaacaagtaccgc
Query: 239
gaggg 243
|||||
Sbjct: 1095 gaggg 1099
Anhang
170
Sequenz des pGADT7-cDNA-Bank-„Inserts der Hefekolonie 2.11a:
GNGTATNANNCCTNCGACTGGCGTACCCATACGACGTACCAGATTACGCTCATATGGCCA
TGGAGGCCAGTGAATTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGG
GGGAGCACCAAGGACCTTCGGCGCCCGTTCAGGATCCACATCTTCCCGAGCGAGTTCTTG
GTTGACCTCTTCCTCTTCGGACCACCTCCAAGGCTCTTGGTGTAGCTTGCCACTCTCACC
AATCAAGTTTTCATGTCTGATCTCGACATTCAGATCCCAACTGCCTTCGATCCCTTCGCT
GAGGCCAATGCTGGGGACTCTGGTGCGGCAGCAGGGTCAAAGGACTACGTACACGTGCGC
ATCCAGCAGCGTAATGGTCGCAAGAGCCTGACCACCGTCCAGGGATTGAAGAAGGAGTTC
AGCTACAGCAAGATCCTCAAAGATCTCAAGAAAGAGTTCTGCTGCAATGGTACAGTGGTC
CAGGACCCAGAACTTGGACAGGTCATTCAGCTCCAGGGTGATCAGAGGAAGAACGTCTCG
AATTTCCTCGTCCAGGCCGGCATTGTGAAGAAGGAGCACATCAAGATTCATGGTTTCTGA
GCAACCGCCGGGTCCATAGCAAACCAACCCTGCATGCAGGGCCAGCTTATTATATATAAT
ATCTGAGGTGGAGCATATCTATCTGGCTGTGACTGCAAGCAGCCTATACGCCGCTGGCGT
TCCTTCTATTACACATATAGGCCCCTCCTGCTGATGCTTGTACCGTCGTGTCNACCTTGA
CTACAAGCTCATCGACATCATGCTTGTTCTTATAAGACATGTTGATAACCTATTGGTAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTGTGGCCGCTGGCTTAAGGGGCTCGTCGGANCTCACTCA
CTGAAGATCGAATCTGAAACCCNAGTACTTACTGGATGGNCATTAATNTNATTTCTNTTG
CTNTTTGACTTCTCTTAGTCACT
>gi|2668739|gb|AF034944.1|AF034944 Zea mays translation initiation factor
GOS2 (TIF) mRNA, complete cds
Length = 759
Score = 1164 bits (587), Expect = 0.0
Identities = 625/631 (99%), Gaps = 5/631 (0%)
Strand = Plus / Plus
Query: 5
Sbjct: 6
Query: 65
Sbjct: 66
gagcaccaaggaccttcggcgcccgttcaggatccacatcttcccgagcgagttcttggt 64
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
gagcaccaaggaccttcggcgcccgttcaggatccacatcttcccgagcgagttcttggt 65
tgacctcttcctcttcggaccacctccaaggctcttggtgtagcttgccactctcaccaa 124
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
tgacctcttcctcttcggaccacctccaaggctcttggtgtagcttgccactctcaccaa 125
Query: 125 tcaagttttcatgtctgatctcgacattcagatcccaactgccttcgatcccttcgctga 184
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 126 tcaagttttcatgtctgatctcgacattcagatcccaactgccttcgatcccttcgctga 185
Query: 185 ggccaatgctggggactctggtgcggcagcagggtcaaaggactacgtacacgtgcgcat 244
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 186 ggccaatgctggggactctggtgcggcagcagggtcaaaggactacgtacacgtgcgcat 245
Query: 245 ccagcagcgtaatggtcgcaagagcctgaccaccgtccagggattgaagaaggagttcag 304
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 246 ccagcagcgtaatggtcgcaagagcctgaccaccgtccagggattgaagaaggagttcag 305
Query: 305 ctacagcaagatcctcaaagatctcaagaaagagttctgctgcaatggtacagtggtcca 364
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 306 ctacagcaagatcctcaaagatctcaagaaagagttctgctgcaatggtacagtggtcca 365
Query: 365 ggacccagaacttggacaggtcattcagctccagggtgatcagaggaagaacgtctcgaa 424
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 366 ggacccagaacttggacaggtcattcagctccagggtgatcagaggaagaacgtctcgaa 425
Query: 425 tttcctcgtccaggccggcattgtgaagaaggagcacatcaagattcatggtttctgagc 484
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 426 tttcctcgtccaggccggcattgtgaagaaggagcacatcaagattcatggtttctgagc 485
Query: 485 aaccgccgggtccatagcaaaccaaccctgcatgcagggccagcttattatatataatat 544
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 486 aaccgccgggtccatagcaaaccaaccctgcatgcagggccagcttattatatataatat 545
Anhang
171
Query: 545 ctgaggtggagcatatctatctggctgtg-actgcaagca-gccta-tacgccg-ctg-g 599
||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||| ||||| ||||||| ||| |
Sbjct: 546 ctgaggtggagcatatctatctggctgtgtactgcaagcaggcctagtacgccgcctgcg 605
Query: 600 cgttccttctattacacatataggcccctcc 630
||||||| |||||||||||||||||||||||
Sbjct: 606 cgttcctcctattacacatataggcccctcc 636
Sequenzen der pGADT7-cDNA-Bank-„Inserts der Hefekolonien 7.173 und 7.178:
GTATGNGNTTTAAANCCTNTNACTGCAGTACCCATACGACGTACCAGATTACGCTCATAT
GGCCATGGAGGCCAGTGAATTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATG
GCCGGGGACCCACTCCAGAAAACCTCACAAAAACCCTCGCTCCCCACAACCCGCCGCCGC
CCACGCCGCCGCCTGTACCAGCGGCGTCAAGATGAGTCGGCACCCTGAAGTGAAGTGGGC
TCAGAGGATCGACAAGGTTTACATCACTGTACAGTTACCTGATGCCAAGGACGCTAAGGT
CAATTTGGAACCAGATGGTGTCTTCACATTCTCTGGCAGTGTTGGTACAAACTTATATGA
ATTGAAACTAGATCTGAATGACAAAGTAAACGTTGAGGCTAGCAAAATAAGTGGGTGTCA
GGTCCATATTCTGTATTGTAGAAAAAGCTGAGGCCAAATGGTGGAAGAAACTTGTTCGAG
ATGATCAAAGGGCACCTCACTTTGTGAAAGTTGATTGGGACAAATGGGTTGACGAAGATG
ATGATGGTGCTGATGTCAACTTGGATGGGATGGACTTCTCGAATTTTGGCGGTATGGGTG
GTATGGGTGGCATGGGTGATATGGCTGGCTTGGGTGGTCTTGGTGGCATGGGTGGAATGG
GTGGATGGGTGGTATGGGAATGGNTGATNCNNAGGTCATNNNGTNAANAC
>gi|21206618|gb|AY103540.1| Zea mays PCO102485 mRNA sequence
Length = 1129
Score = 680 bits (343), Expect = 0.0
Identities = 385/426 (90%), Gaps = 2/426 (0%)
Strand = Plus / Plus
Query: 184 cgccgccgcctgtaccagcggcgtcaagatgagtcggcaccctgaagtgaagtgggctca 243
||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||
Sbjct: 119 cgccgccgcctgtaccagctgcgtcaagatgagtcggcaccctgaggtgaagtgggctca 178
Query: 244 gaggatcgacaaggtttacatcactgtacagttacctgatgccaaggacgctaaggtcaa 303
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || ||||| |||||||||||
Sbjct: 179 gaggatcgacaaggtttacatcactgtacagttacctgacgcaaaggatgctaaggtcaa 238
Query: 304 tttggaaccagatggtgtcttcacattctctggcagtgttggtacaaacttatatgaatt 363
|||||| ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| ||||||||
Sbjct: 239 tttggatccagatggtgtcttcacattctctggcagtgctggtacaaacttgtatgaatt 298
Query: 364 gaaactagatctgaatgacaaagtaaacgttgaggctagcaaaataa--gtgggtgtcag 421
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| |||||
Sbjct: 299 gaaactagatctgaatgacaaagtaaacgttgaggctagcaaaataagtgtgggggtcag 358
Query: 422 gtccatattctgtattgtagaaaaagctgaggccaaatggtggaagaaacttgttcgaga 481
||||||||||||||| |||||||||||||| |||||||||||||||||||| ||||||||
Sbjct: 359 gtccatattctgtatcgtagaaaaagctgaagccaaatggtggaagaaactcgttcgaga 418
Query: 482 tgatcaaagggcacctcactttgtgaaagttgattgggacaaatgggttgacgaagatga 541
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||
Sbjct: 419 tgatcaaagggcacctcactttgtgaaagttgattgggacaaatgggttgatgaagatga 478
Query: 542 tgatggtgctgatgtcaacttggatgggatggacttctcgaannnnnnnnnnnnnnnnnn 601
||||||||||||| ||||| ||||||||||||||||||||||
Sbjct: 479 tgatggtgctgatatcaacatggatgggatggacttctcgaatttcggtggcatgggtgg 538
Anhang
172
Sequenz des pGADT7-cDNA-Bank-„Inserts der Hefekolonie 2.27:
TTTTTAAAAAANCATCTTTAATATTNCTCACTATACGGCGAGCGCCGCCATGGAGTACCC
ATACGACGTACCAGATTACGCTCATATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCCACCCAAGCAG
TGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGTCCGGGGACACAAGGCATTGTCAGCGGCGGCGG
CGGCGGCGGGCCGGCGGAGACTCCCAGGCCAGGANCAGTCTGCCGATTGGAAGGGGAGAT
GAAGGCCACGCTNAAGGGCCGNTACGAGGGCGACAAGGCCACGGCCGCCACCACCCTCGC
CGCCCCCGNCGGCGAACCTTCGNCTCAAGGNCCTNCGCCACCGAAGGCCNCTTCACCAAC
GGTNCTTTTCCTTGCGANGGCCTNACCCTTNACCCTTNAAAAAAGCCCGGGNGCTTTTCN
TNNTTTGNACCNNTCAAGCCCCCNAANCCAAGAATGTTGCNCTTTTTAANNTTNATTAAA
CTTTCCNNCCTTNNTNCNTTNAANAAANNNCCCTTAATNCTTTNNCCTAAATTTATTTCN
AATTANCCTTTNCCCNNGGTNACC
>gi|21209273|gb|AY106195.1| Zea mays PCO138904 mRNA sequence
Length = 857
Score = 226 bits (114), Expect = 4e-56
Identities = 156/170 (91%), Gaps = 2/170 (1%)
Strand = Plus / Plus
Query: 198 agactcccaggccaggancagtctgccgattggaaggggagatgaaggccacgctnaagg 257
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Sbjct: 56 agactcccaggccaggagcagtctgccgattggaaggggagatgaaggccacgctcaagg 115
Query: 258 gccgntacgagggcgacaaggccacggccgccaccaccctcgccgcccccgncggcgaac 317
|||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| ||
Sbjct: 116 gccgctacgagggcgacaaggccacggccgccaccaccctcgccgcccccgccggcg-ac 174
Query: 318 cttcgnctcaaggncctncgccaccgaaggccncttcaccaacggtnctt 367
|| || ||||||| ||| ||||||||| | | ||||||||||||| |||
Sbjct: 175 ctccgcctcaagg-cctccgccaccgaggccgccttcaccaacggtcctt 223
Sequenz des pGADT7-cDNA-Bank-„Inserts der Hefekolonie 2.27:
TAAAAAGCNNTCTTTAATACNACTCACTATANGGCGAGCGCCGCCATGGAGTACCCATAC
GACGTACCAGATTACGCTCATATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCCACCCAAGCAGTGGT
ATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGGGACTCTACTCACCCACCCACTCACGGACTCA
TCTACTGAGCAGCGCGGTGGGCATCCGAGCGAGAGGGCGAGCGCGGAAGGATCGGAATTC
CGAAGGTTGGGCATGGAGGCGAGCGGCGAGAAGGCTGCGGTGGTGCGACGGNTGATGGAG
GCGAANGAGGTGTTCGGGAAGACCTTTTTNNGGAATNCNCCGCCNANACCGGNTNTCACC
ANCTNNTNCNTGGNNNCANNTNNTTGNNGNNNCCNNNNNCNNNNTNAANGGNCNNNCAAC
NNNNNNCNNNNNCTTANNGNCNNNNNNTNNNCANNNCNNNCNNNCNNNNNNNT
gi|21213628|gb|AY109778.1| Zea mays CL3683_1 mRNA sequence
Length = 600
Score = 168 bits (85), Expect = 7e-39
Identities = 92/95 (96%)
Strand = Plus / Plus
Query: 232 tcggaattccgaaggttgggcatggaggcgagcggcgagaaggctgcggtggtgcgacgg 291
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Sbjct: 52 tcggaattccgaaggttgggcatggaggcgagcggcgagaaggctgcggtggtgcgacgg 111
Query: 292 ntgatggaggcgaangaggtgttcgggaagacctt 326
||||||||||||| ||||||| ||||||||||||
Sbjct: 112 ctgatggaggcgaaggaggtgtccgggaagacctt 146
Anhang
Score = 44.1 bits (22), Expect = 0.28
Identities = 29/30 (96%), Gaps = 1/30 (3%)
Strand = Plus / Plus
Query: 180 atctactgagcagcgcggtgggcatccgag 209
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Sbjct: 1
atctactgagcagcgc-gtgggcatccgag 29
7.4 Tabelle zur statistischen Auswertung
Tab. 8.1: Tabelle für die tTab-Werte zur statistischen Auswertung der Signifikanz zweier Proben. Aus:
KÖHLER, SCHACHTEL & VOLESKE (2002).
173
Lebenslauf
174
Lebenslauf
12.05.1972
geboren in Berlin
1978-1980
Privatschule der Deutschen Botschaft Ankara,
Zweigstelle Istanbul, Türkei
1980-1985
Evangelische Schule Steglitz, Grundschule, Berlin
1985-1989
Evangelische Schule Steglitz, Realschule, Berlin
1989-1992
Robert-Blum-Oberschule, Gymnasium, Berlin
1992-1999
Studium der Biologie an der Freien Universität Berlin
Diplomarbeit bei Priv.-Doz. Dr. R. Schmidt am Institut
für Gemüse- und Zierpflanzenbau Großbeeren/Erfurt
e.V. mit dem Thema: „Einfluss einer pilzlichen Infektion
der Wurzel auf die Assimilatverteilung der Tomate
(Lycopersicon esculentum Mill.) in Abhängigkeit von der
Strahlung“
Juni 2000- Oktober 2000
Praktikum
zum
Erlernen
molekularbiologischer
Methoden am Fachbereich Biologie/Chemie an der
Universität
Osnabrück
in
der
Abteilung
Pflanzenphysiologie bei Frau Prof. Dr. Renate Scheibe
November 2000- Oktober 2003
Stipendiatin
des
Graduiertenkollegs:
Physiologie,
Wechselwirkungen
„Molekulare
zwischen
zellulären
Nanostrukturen“
Durchführung
der
experimentellen
vorliegenden
Dissertation
in
Arbeiten
der
zur
Abteilung
Pflanzenphysiologie der Universität Osnabrück
November 2003- Dezember 2003
Wissenschaftliche
Hilfskraft
in
der
Pflanzenphysiologie der Universität Osnabrück
Abteilung
Eidesstattliche Versicherung
175
Erklärung über die Eigenständigkeit der erbrachten wissenschaftlichen Leistung
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und
ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus
anderen Quellen direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter
Angabe der Quelle gekennzeichnet.
Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher
Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Berlin, den