Festlegung von Zelltypen des Krebstieres Parhyale hawaiensis

Gerberding, Matthias | Festlegung von Zelltypen des Krebstieres Parhyale hawaiensis
Tätigkeitsbericht 2007
Entwicklungs- und Evolutionsbiologie/Genetik
Festlegung von Zelltypen des Krebstieres Parhyale hawaiensis
Gerberding, Matthias;
Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie, Tübingen
Projektgruppe – Gruppe Gerberding – Frühe Embryonalentwicklung von Parhyale hawaiensis
Korrespondierender Autor
Gerberding, Matthias
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Die Embryonen aller Tiere legen früh vier verschiedene Zelltypen an. Wie dies passiert, ist eine zentrale
Frage der Entwicklungsbiologie. Untersucht wird, wie dieser Prozess im 8-Zellstadium des Krebses
Parhyale hawaiensis abläuft. Die Bildung der Keimzellen benötigt z.B. die Gene vasa und nanos. Ihre
Funktion weicht von der in der Fliege Drosophila melanogaster ab. Dies verdeutlicht Funktionswechsel von Genen in der Evolution.
Abstract
Animal embryos specify four early cell types. Determining the underlying mechanism is one central
question of developmental biology. At present, it is studied how the crustacean Parhyale hawaiensis
manages such developmental program at the eight-cell stage. Specification of germ cells, e.g., depends
on the genes vasa and nanos, however, in a different way than in Drosophila melanogaster, demonstrating change of gene function during evolution.
Die Festlegung von Zelltypen in frühen Embryonen
Embryos bewältigen eine vielschichtige Aufgabe in der frühen Entwicklung. Zellen teilen sich nicht
nur, sondern erzeugen einen komplexen Organismus mit vielen verschiedenen Zelltypen, die alle aus
einer einzelnen Zelle hervorgehen, nämlich der befruchteten Eizelle. Untersucht wird, welche Programme diese Entwicklung steuern [1]. Forschungsgegenstand ist ein Organisms, der erst vor wenigen
Jahren als Labortier eingeführt wurde: der Krebs Parhyale hawaiensis [2].
Die Frage nach der Festlegung von Zelltypen im Ei ist eine der Leitfragen der Entwicklungsbiologie.
Mehrere Aspekte dieser Frage sind für verschiedene andere Labortiere bereits gut verstanden. Im
19. Jahrhundert führten erste Analysen der frühen Entwicklung bei den höheren, das heißt bilateral
symmetrischen Tieren, zur Entdeckung von vier Zelltypen: den Keimzellen und den Zellpopulationen
der drei Keimblätter. Die Keimzellen sind verantwortlich für die Reproduktion des Organismus. Die
drei Keimblätter stellen das Ektoderm, Endoderm und Mesoderm dar, die, vereinfacht dargestellt,
Aufgaben erfüllen als äußeres Schutzgewebe (Ektoderm), inneres Gewebe zur Verdauung (Endoderm)
und dazwischen liegendes Muskelgewebe für die Bewegung (Mesoderm). Diese vier Zelltypen werden
auch mit den heute eingesetzten Analyseverfahren als erste Bausteine von Embryonen erkannt. Gene,
welche die Bildung dieser Zelltypen steuern, wurden durch Untersuchungen der Modellorganismen
Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans entdeckt. Diese Untersuchungen zeigten ein
allgemein gültiges Prinzip, dass Komplexität im Embryo schrittweise angelegt wird. Die Vielfalt der
verschiedenen Zelltypen entsteht durch eine Kette von binären „Entscheidungen“, bei denen Zellen
Instruktionen bekommen, bestimmte Gene einzuschalten und andere Gene abzuschalten. Gemäß dieser
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genetischen Steuerung der Embryonalentwicklung proliferieren die Zellen nicht nur, sondern
sie durchlaufen eine Kette von Stationen bis zu ihrer vollständigen Differenzierung. Diese Stationen
ähneln Wegkreuzungen, an denen die Zellen eine von zwei möglichen Richtungen einschlagen können.
Im Embryo des Krebses Parhyale hawaiensis legt eine invariante frühe Cell Lineage
alle frühen Zelltypen fest
Wie werden in dem Krebstier P. hawaiensis, verglichen mit D. melanogaster und C. elegans, die
Keimzellen sowie Ektoderm, Endoderm und Mesoderm festgelegt? Diese Fragestellung wurde aufgeworfen durch die Entdeckung, dass die Zelltypen in P. hawaiensis in einer invarianten frühen Cell
Lineage festgelegt werden [3]. Solche invarianten frühen Cell Lineages waren vor den Untersuchungen
an P. hawaiensis für Krebse nicht aufgeklärt worden. Unter einer invarianten Cell Lineage versteht
man die Koppelung eines Zelltyps an eine festgelegte Folge von Zellteilungen. Die Zellteilungen
wiederum sind festgelegt in der Orientierung der Spindeln und der Aufteilung des Plasmas auf die
Tochterzellen und erzeugen so in allen Embryonen eine immer wiederkehrende, stereotype Anordnung
der Zellen. Die Cell Lineage von P. hawaiensis ist in zweierlei Hinsicht invariant: Zum einen werden
in der dritten zygotischen Teilung immer vier größere und vier kleinere Zellen erzeugt. Zum anderen
sind alle diese Zellen bereits darin festgelegt, welcher Zelltyp aus ihren Tochterzellen hervorgeht.
Dies wurde aus Experimenten abgeleitet, bei denen in die Zellen des 8-Zellstadiums Farbstoff injiziert
wurde und für jede der je acht Zellgruppen, die aus einer injizierten Zelle hervorgegangen sind, bereits
getrennte Zelltypen auftraten. Von den vier größeren Zellen bilden drei ausschließlich Ektodermzellen,
während eine ausschließlich Zellen des vorderen Mesoderms erzeugt. Von den vier kleineren Zellen
bilden zwei die Zellen des hinteren Mesoderms, eine die Zellen des Endoderms, und die kleinste
schließlich bildet die Keimzellen [3]. Dies bedeutet, dass die sehr kleine Zahl von lediglich acht Zellen,
die nach nur drei zygotischen Zellteilungen nach der Befruchtung entstanden sind, bereits ausreichend
unterschiedliche Instruktionen bekommen hat, um je einen der vier genannten Zelltypen auszubilden
(Abb. 1). Diese Aufteilung der vier Zelltypen im 8-Zellstadium läuft in P. hawaiensis deutlich früher
ab als in anderen Tieren. Diese frühe Aufteilung der Zelltypen unterstützt und erleichtert die Suche
nach denjenigen Genen, die diesen acht Zellen Instruktionen erteilen.
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Abb. 1: Cell Lineage in Parhyale hawaiensis am Beispiel der drei Vorläuferzellen für das Ektoderm.
a) 8-Zellstadium, die drei Vorläuferzellen des Ektoderms wurden mit drei verschiedenen Farbstoffen injiziert.
b) Die drei Zellen haben nach weiteren Zellteilungen am Vorderende des Embryos drei Ektoderm-Klone erzeugt,
erkennbar wieder an den drei verschiedenen Farben, die nahtlos aneinander grenzen.
Urheber: Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie/Gerberding
Bei der Ausrichtung unserer Experimente mit P. hawaiensis orientieren wir uns an dem für andere
Modellorganismen bereits erzielten tiefgreifenden Verständis der frühen Entwicklung. Dabei verfolgen wir den so genannten Kandidatengen-Ansatz. Mit diesem Ansatz testet man die Rolle derjenigen
Gene in den Embryonen von P. hawaiensis, deren Rolle in den Modellorganismen bereits charakterisiert wurde. Im Kandidatengen-Ansatz werden also keine neuen Gene identifiziert, sondern unterschiedliche homologe Gene bezüglich ihrer Funktion in den verschiedenen Organismen miteinander
verglichen. Unter homologen Genen versteht man solche, die mindestens zwei Organismen in ihren
jeweiligen Genomen aufweisen, sie stammen von einem Gen eines gemeinsamen Vorfahren ab. Nichthomologe Gene dagegen sind solche, die unabhängig voneinander durch Konvergenz entstanden
sind und dem gemeinsamen Vorfahren fehl(t)en.
Unter den Modellorganismen stellt die Fruchtfliege D. melanogaster den evolutionär nächsten Verwandten von P. hawaiensis dar. Deshalb gibt es Grund zu der Annahme, dass die Keimblattbildung bei
P. hawaiensis ähnlichen Regeln folgt wie in der Fruchtfliege. Dort steuern Transkriptionsfaktoren
die Festlegung von Keimzellen, Ektoderm, Endoderm und Mesoderm, indem sie dafür sorgen, dass
die Zellen jedes Zelltyps ganz bestimmte Gene, die für die Ausbildung ihres Zelltyps benötigt werden,
in Boten-RNA (mRNA) umschreiben, und ganz bestimmte andere Gene, die für die Ausbildung
eines anderen Zelltypes nötig sind, gerade nicht umschreiben. Eine Reihe von Unterschieden zwischen
D. melanogaster und P. hawaiensis lassen erwarten, dass dieser Mechanismus von D. melanogaster
nicht eins zu eins auch auf P. hawaiensis übertragen werden kann. So werden die Keimblätter in
D. melanogaster nicht bereits im 8-Zellstadium festgelegt, sondern erst nach mehr als einem Dutzend
Teilungen, wenn der Embryo bereits Tausende von Zellen besitzt. Weiterhin ist die frühe Furchung von
D. melanogaster syncytial, das heißt, nur die Kerne trennen sich voneinander, während sie weiter
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von einem gemeinsamen Zytoplasma umgeben sind. Bei P. hawaiensis dagegen ist die Furchung von
Anfang an „total“, also Kern und Zytoplasma der Tochterzellen werden vollständig durch neue
Membranen voneinander getrennt. Deshalb ist zu erwarten, dass in P. hawaiensis Kandidatengene
andersartig ausgeprägt sind [4].
Die Untersuchung des genetischen Programms in P. hawaiensis zielt ab auf einen detaillierten Vergleich mit D. melanogaster. Dieser Vergleich stellt einen Einblick her in den Ablauf der Evolution von
Insekten und Krebsen, die durch D. melanogaster und P. hawaiensis repräsentiert sind. Dabei geht
es um die Beantwortung der Frage, wie bei der Aufspaltung der gemeinsamen Stammlinie in die zwei
Linien Insekten und Krebse vor etwa 500 Millionen Jahren die Unterschiede in der frühen Entwicklung evolvierten.
Die Gene vasa, nanos sowie beta-catenin sind in P. hawaiensis zu anderen Zeitpunkten an
der Festlegung der Keimzellen beteiligt als in D. melanogaster
Bei der Suche nach Genen, die die Bildung der Keimzellen steuern, wurden die zwei Kandidatengene
vasa und nanos aus P. hawaiensis kloniert. Für D. melanogaster war bekannt, dass deren Transkripte
(mRNAs) unverzichtbar für die Bildung von Keimzellen sind. Bei P. hawaiensis verhalten sich diese
beiden mRNAs anders als bei D. melanogaster. Boten-RNA, transkribiert von vasa und nanos, wird
im Krebs vom 1- bis zum 16-Zellstadium in allen Zellen gefunden. Erst ab dem 32-Zellstadium
beschränkt sich die Verteilung der vasa und nanos mRNA auf die Keimzellen. Neben dieser unerwarteten räumlichen und zeitlichen Dynamik für diese mRNAs haben wir ein weiteres Gen gefunden,
dessen mRNA in den Keimzellen akkumuliert, jedoch früher als mRNA von vasa und nanos. Bei einer
Durchmusterung für Gene, die an Signaltransduktionen beteiligt sind, konnte gezeigt werden, dass sich
die mRNA des Gens beta-catenin bereits im 1-Zellstadium, also noch vor der ersten Zellteilung nach
Befruchtung, auf ein punktförmiges abgegrenztes Gebiet an der Oberfläche der Eizelle konzentriert.
In den darauf folgenden Teilungen wird die beta-catenin mRNA immer nur an eine von zwei Tochterzellen weitergegeben und verbleibt schließlich in der Zelle, die die Keimzellen hervorbringt.
Die Verteilung bestimmter Boten-RNAs ist aber noch keine vollständige Erklärung eines solch komplexen Entwicklungsprogramms. Deshalb wird versucht, Gene gezielt auszuschalten, um ihre Funktion genau zu studieren. Die Injektion von antisense RNA beispielsweise ist ein Weg, die Menge eines
ausgewählten Genprodukts, wie eben der mRNA, zu reduzieren. Antisense RNA ist in ihrer Nukleotidabfolge komplementär zu derjenigen mRNA, deren kodierendes Gen ausgeschaltet werden soll.
Durch ihre Komplementarität bindet die antisense RNA an das Start-Codon der mRNA und hemmt
damit deren Translation mit der Folge, dass kein Protein gebildet werden kann – die Genexpression
wird damit inhibiert.
Zum ersten Mal seit Beginn der Untersuchungen an P. hawaiensis im Jahr 1999 und als erstem Labor
weltweit gelang es, die Translation von vasa und nanos mit Hilfe von antisense Morpholinos zu
hemmen, einer zur antisense-RNA alternativen Technik. In den Experimenten zeigten die zwei vasa
und nanos Morpholinos unterschiedliche Effekte auf die Bildung der Keimzellen in P. hawaiensis:
In keinem der beiden Morpholino-Experimente wurde die frühe Bildung der Keimzellen unterbunden,
aber in beiden Experimenten gingen die Keimzellen nach der Gastrulation zugrunde. Im Fall von vasa
wurde die Teilung der Keimzellen nach der Gastrulation angehalten. Im Fall von nanos war nicht nur
die Teilung der Keimzellen gestoppt, sondern auch ihre Wanderung herabgesetzt (Abb. 2). Im Versuch
mit vasa konnte detailliert aufgeklärt werden, dass der Embryo nicht mit von der Mutter ins Ei
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gelegtem Protein ausgestattet ist und dass die mRNA in der Zeit, in der sie vom 1-Zellstadium bis zum
32-Zellstadium noch in allen Zellen vorliegt, nicht zu Protein translatiert wird. Dies wurde erst lange
nach ihrer Lokalisierung in die Keimzellen, nämlich im 175-Zellstadium, beobachtet.
Abb. 2: Rolle von vasa in der Bildung der Keimzellen.
a–c) Keimzellen in der normalen Entwicklung:
a) Die kleinste Zelle im 8-Zellstadium ist die Vorläuferzelle für die Keimzellen,
b) 30 % Entwicklungsfortschritt: Die Keimzellen bilden ein Cluster (Pfeile),
c) 40 % Entwicklungsfortschritt: Das Cluster hat sich geteilt.
e–g) Bildung von Keimzellen bei gleichzeitiger Inhibition der Translation durch vasa Morpholinos:
e) Injektion des Morpholinos in die kleinste Zelle,
f) das Cluster ist kleiner als in Kontrollen,
g) das Cluster teilt sich nicht, die Zellen sterben.
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Fazit
Unsere Tests zur Funktion von vasa und nanos in P. hawaiensis zeigen deutlich, dass diese zwei
Gene anders als bei D. melanogaster keine frühe Rolle in der Bildung von Keimzellen spielen,
jedoch genauso wie bei D. melanogaster eine späte Rolle. Die Expression des Gens beta-catenin in
den Keimzellen stellt wiederum einen Fall dar, in dem mRNA unerwartet in ihrer Verbreitung innerhalb der Zelle eng eingegrenzt ist. Für die Spezifizierung der Keimzellen konnte gezeigt werden, dass
die frühen Embryonen von P. hawaiensis und D. melanogaster sich nicht nur auf den zwei Ebenen
ihrer Morphologie und der Ausbildung einer Cell Lineage unterscheiden, sondern auch auf der Ebene
der unterschiedlichen zeitlichen wie räumlichen Expression homologer Gene.
In einem anderen Projekt werden Gene aus P. hawaiensis analysiert, deren Homologe auch im Mesoderm von D. melanogaster exprimiert werden. Auch hier hat sich durch Arbeiten in unserem Labor und
in dem Labor von Nipam Patel in Berkeley gezeigt, dass diese Gene in P. hawaiensis andere zeitliche
und räumliche Expressionsmuster und auch andere Funktionen haben als bei D. melanogaster [4]. In
der Gesamtschau wird damit deutlich, wie die Funktion von homologen Genen im Verlauf der Evolution wechselt. Als langfristiges Ziel möchten wir verstehen, wie alle Zelltypen des 8-Zellstadiums im
Embryo von P. hawaiensis festgelegt werden und wie die Evolution der Arthropoda (= Gliedertiere) die
Funktionen homologer Gene in der frühen Embryonalentwicklung derart abgewandelt hat, dass sie so
unterschiedliche Entwicklungsmechanismen wie in D. melanogaster und P. hawaiensis steuern können.
Literaturhinweise
[1] M. Gerberding, N. H. Patel:
Gastrulation in crustaceans.
In: Gastrulation. (ed.: C. Stern). Cold Spring Harbor Press, 78–89 (2004).
[2] W. E. Browne, A. L. Price, M. Gerberding, N. H. Patel:
Stages of embryonic development in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.
Genesis 42, 124–149 (2005).
[3] M. Gerberding, W. E. Browne, and N. H. Patel:
Cell lineage analysis of the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis, reveals an early restriction
of cell fates.
Development 129, 5789–5801 (2002).
[4] A. L. Price, N. H. Patel:
Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: The expression of
Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis.
Journal of Experimental Zoology B 310, 24–40 (2008).
[5] J. Havemann, U. Müller, J. Berger, H. Schwarz, M. Gerberding, B. Moussian:
Cuticle differentiation in the embryo of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.
Cell & Tissue Research. DOI 10.1007/s00441-007-0571-7 (2008).
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