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Jahrbuch 2007/2008 | Gerberding, Matthias | Festlegung von Zelltypen des Krebstieres Parhyale haw aiensis
Festlegung von Zelltypen des Krebstieres Parhyale hawaiensis
Cell type specification in the crustacean Paryhale hawaiensis
Gerberding, Matthias
Max-Planck-Institut für Entw icklungsbiologie, Tübingen
Korrespondierender Autor
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Die Embryonen aller Tiere legen früh vier verschiedene Zelltypen an. W ie dies passiert, ist eine zentrale Frage
der Entw icklungsbiologie. Untersucht w ird, w ie dieser Prozess im 8-Zellstadium des Krebses Parhyale
hawaiensis abläuft. Die Bildung der Keimzellen benötigt z.B. die Gene vasa und nanos. Ihre Funktion w eicht von
der in der Fliege Drosophila melanogaster ab. Dies verdeutlicht Funktionsw echsel von Genen in der Evolution.
Summary
Animal embryos specify four early cell types. Determining the underlying mechanism is one central question of
developmental biology. At present, it is studied how the crustacean Parhyale hawaiensis manages such
developmental program at the eight-cell stage. Specification of germ cells, e.g., depends on the genes vasa
a n d nanos, how ever, in a different w ay than in Drosophila melanogaster , demonstrating change of gene
function during evolution.
Die Festlegung von Zelltypen in frühen Embryonen
Embryos bew ältigen eine vielschichtige Aufgabe in der frühen Entw icklung. Zellen teilen sich nicht nur, sondern
erzeugen einen komplexen Organismus mit vielen verschiedenen Zelltypen, die alle aus einer einzelnen Zelle
hervorgehen, nämlich der befruchteten Eizelle. Untersucht w ird, w elche Programme diese Entw icklung steuern
[1]. Forschungsgegenstand ist ein Organisms, der erst vor w enigen Jahren als Labortier eingeführt w urde: der
Krebs Parhyale hawaiensis [2].
Die Frage nach der Festlegung von Zelltypen im Ei ist eine der Leitfragen der Entw icklungsbiologie. Mehrere
Aspekte dieser Frage sind für verschiedene andere Labortiere bereits gut verstanden. Im 19. Jahrhundert
führten erste Analysen der frühen Entw icklung bei den höheren, das heißt bilateral symmetrischen Tieren, zur
Entdeckung von vier Zelltypen: den Keimzellen und den Zellpopulationen der drei Keimblätter. Die Keimzellen
sind verantw ortlich für die Reproduktion des Organismus. Die drei Keimblätter stellen das Ektoderm, Endoderm
und Mesoderm dar, die, vereinfacht dargestellt, Aufgaben erfüllen als äußeres Schutzgew ebe (Ektoderm),
inneres Gew ebe zur Verdauung (Endoderm) und dazw ischen liegendes Muskelgew ebe für die Bew egung
(Mesoderm). Diese vier Zelltypen w erden auch mit den heute eingesetzten Analyseverfahren als erste
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Bausteine von Embryonen erkannt. Gene, w elche die Bildung dieser Zelltypen steuern, w urden durch
Untersuchungen der Modellorganismen Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans entdeckt. Diese
Untersuchungen zeigten ein allgemein gültiges Prinzip, dass Komplexität im Embryo schrittw eise angelegt
w ird. Die Vielfalt der verschiedenen Zelltypen entsteht durch eine Kette von binären „Entscheidungen“, bei
denen Zellen Instruktionen bekommen, bestimmte Gene einzuschalten und andere Gene abzuschalten. Gemäß
dieser genetischen Steuerung der Embryonalentw icklung proliferieren die Zellen nicht nur, sondern sie
durchlaufen eine Kette von Stationen bis zu ihrer vollständigen Differenzierung. Diese Stationen ähneln
W egkreuzungen, an denen die Zellen eine von zw ei möglichen Richtungen einschlagen können.
Im Embryo des Krebses Parhy ale hawaiensis legt eine invariante frühe Cell Lineage alle frühen Zelltypen
fest
W ie w erden in dem Krebstier P. hawaiensis, verglichen mit D. melanogaster und C. elegans, die Keimzellen sow ie
Ektoderm, Endoderm und
Mesoderm festgelegt?
Diese
Fragestellung
w urde
aufgew orfen
durch
die
Entdeckung, dass die Zelltypen in P. hawaiensis in einer invarianten frühen Cell Lineage festgelegt w erden [3].
Solche invarianten frühen Cell Lineages w aren vor den Untersuchungen an P. hawaiensis für Krebse nicht
aufgeklärt w orden. Unter einer invarianten Cell Lineage versteht man die Koppelung eines Zelltyps an eine
festgelegte Folge von Zellteilungen. Die Zellteilungen w iederum sind festgelegt in der Orientierung der
Spindeln und der Aufteilung des Plasmas auf die Tochterzellen und erzeugen so in allen Embryonen eine immer
w iederkehrende, stereotype Anordnung der Zellen. Die Cell Lineage von P. hawaiensis ist in zw eierlei Hinsicht
invariant: Zum einen w erden in der dritten zygotischen Teilung immer vier größere und vier kleinere Zellen
erzeugt. Zum anderen sind alle diese Zellen bereits darin festgelegt, w elcher Zelltyp aus ihren Tochterzellen
hervorgeht. Dies w urde aus Experimenten abgeleitet, bei denen in die Zellen des 8-Zellstadiums Farbstoff
injiziert w urde und für jede der je acht Zellgruppen, die aus einer injizierten Zelle hervorgegangen sind,
bereits getrennte Zelltypen auftraten. Von den vier größeren Zellen bilden drei ausschließlich Ektodermzellen,
w ährend eine ausschließlich Zellen des vorderen Mesoderms erzeugt. Von den vier kleineren Zellen bilden
zw ei die Zellen des hinteren Mesoderms, eine die Zellen des Endoderms, und die kleinste schließlich bildet die
Keimzellen [3]. Dies bedeutet, dass die sehr kleine Zahl von lediglich acht Zellen, die nach nur drei zygotischen
Zellteilungen nach der Befruchtung entstanden sind, bereits ausreichend unterschiedliche Instruktionen
bekommen hat, um je einen der vier genannten Zelltypen auszubilden (Abb. 1). Diese Aufteilung der vier
Zelltypen im 8-Zellstadium läuft in P. hawaiensis deutlich früher ab als in anderen Tieren. Diese frühe Aufteilung
der Zelltypen unterstützt und erleichtert die Suche nach denjenigen Genen, die diesen acht Zellen
Instruktionen erteilen.
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C e ll Line a ge in Parhyale hawaiensis a m Be ispie l de r dre i
Vorlä ufe rze lle n für da s Ek tode rm . (a ) 8-Ze llsta dium , die dre i
Vorlä ufe rze lle n de s Ek tode rm s wurde n m it dre i ve rschie de ne n
Fa rbstoffe n injizie rt. (b) Die dre i Ze lle n ha be n na ch we ite re n
Ze llte ilunge n a m Vorde re nde de s Em bryos dre i Ek tode rm Klone e rze ugt, e rk e nnba r wie de r a n de n dre i ve rschie de ne n
Fa rbe n, die na htlos a ne ina nde r gre nze n.
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Bei der Ausrichtung
unserer Experimente
mit P. hawaiensis orientieren w ir uns an dem für andere
Modellorganismen bereits erzielten tiefgreifenden Verständis der frühen Entw icklung. Dabei verfolgen w ir den
so genannten Kandidatengen-Ansatz. Mit diesem Ansatz testet man die Rolle derjenigen Gene in den
Embryonen
von P. hawaiensis, deren Rolle in den Modellorganismen bereits charakterisiert w urde. Im
Kandidatengen-Ansatz w erden also keine neuen Gene identifiziert, sondern unterschiedliche homologe Gene
bezüglich ihrer Funktion in den verschiedenen Organismen miteinander verglichen. Unter homologen Genen
versteht man solche, die mindestens zw ei Organismen in ihren jew eiligen Genomen aufw eisen, sie stammen
von einem Gen eines gemeinsamen Vorfahren ab. Nicht-homologe Gene dagegen sind solche, die unabhängig
voneinander durch Konvergenz entstanden sind und dem gemeinsamen Vorfahren fehl(t)en.
Unter den Modellorganismen stellt die Fruchtfliege D. melanogaster den evolutionär nächsten Verw andten von
P. hawaiensis dar. Deshalb gibt es Grund zu der Annahme, dass die Keimblattbildung bei P. hawaiensis
ähnlichen Regeln folgt w ie in der Fruchtfliege. Dort steuern Transkriptionsfaktoren die Festlegung von
Keimzellen, Ektoderm, Endoderm und Mesoderm, indem sie dafür sorgen, dass die Zellen jedes Zelltyps ganz
bestimmte Gene, die für die Ausbildung ihres Zelltyps benötigt w erden, in Boten-RNA (mRNA) umschreiben, und
ganz bestimmte andere Gene, die für die Ausbildung eines anderen Zelltypes nötig sind, gerade nicht
umschreiben. Eine Reihe von Unterschieden zw ischen D. melanogaster und P. hawaiensis lassen erw arten, dass
dieser Mechanismus von D. melanogaster nicht eins zu eins auch auf P. hawaiensis übertragen w erden kann. So
w erden die Keimblätter in D. melanogaster nicht bereits im 8-Zellstadium festgelegt, sondern erst nach mehr
als einem Dutzend Teilungen, w enn der Embryo bereits Tausende von Zellen besitzt. Weiterhin ist die frühe
Furchung von D. melanogaster syncytial, das heißt, nur die Kerne trennen sich voneinander, w ährend sie w eiter
von einem gemeinsamen Zytoplasma umgeben sind. Bei P. hawaiensis dagegen ist die Furchung von Anfang an
„total“, also Kern und Zytoplasma der Tochterzellen w erden vollständig durch neue Membranen voneinander
getrennt. Deshalb ist zu erw arten, dass in P. hawaiensis Kandidatengene andersartig ausgeprägt sind [4].
Die Untersuchung des genetischen Programms in P. hawaiensis zielt ab auf einen detaillierten Vergleich mit D.
melanogaster. Dieser Vergleich stellt einen Einblick her in den Ablauf der Evolution von Insekten und Krebsen,
die durch D. melanogaster und P. hawaiensis repräsentiert sind. Dabei geht es um die Beantw ortung der Frage,
w ie bei der Aufspaltung der gemeinsamen Stammlinie in die zw ei Linien Insekten und Krebse vor etw a 500
Millionen Jahren die Unterschiede in der frühen Entw icklung evolvierten.
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Die
Gene v asa, nanos
sowie beta- catenin
sind in P. hawaiensis zu anderen Zeitpunkten an der
Festlegung der Keimzellen beteiligt als in D. m elanogaster
Bei der Suche nach Genen, die die Bildung der Keimzellen steuern, w urden die zw ei Kandidatengene vasa und
nanos
aus P. hawaiensis
kloniert.
Für D. melanogaster w ar bekannt, dass deren Transkripte (mRNAs)
unverzichtbar für die Bildung von Keimzellen sind. Bei P. hawaiensis verhalten sich diese beiden mRNAs anders
als bei D. melanogaster. Boten-RNA, transkribiert von vasa und nanos, w ird im Krebs vom 1- bis zum 16Zellstadium in allen Zellen gefunden. Erst ab dem 32-Zellstadium beschränkt sich die Verteilung der vasa und
nanos mRNA auf die Keimzellen. Neben dieser unerw arteten räumlichen und zeitlichen Dynamik für diese
mRNAs haben w ir ein w eiteres Gen gefunden, dessen mRNA in den Keimzellen akkumuliert, jedoch früher als
mRNA von vasa und nanos. Bei einer Durchmusterung für Gene, die an Signaltransduktionen beteiligt sind,
konnte gezeigt w erden, dass sich die mRNA des Gens beta-catenin bereits im 1-Zellstadium, also noch vor der
ersten Zellteilung nach Befruchtung, auf ein punktförmiges abgegrenztes Gebiet an der Oberfläche der Eizelle
konzentriert. In den darauf folgenden Teilungen w ird die beta-catenin mRNA immer nur an eine von zw ei
Tochterzellen w eitergegeben und verbleibt schließlich in der Zelle, die die Keimzellen hervorbringt.
Die Verteilung bestimmter Boten-RNAs ist aber noch keine vollständige Erklärung eines solch komplexen
Entw icklungsprogramms. Deshalb w ird versucht, Gene gezielt auszuschalten, um ihre Funktion genau zu
studieren. Die Injektion von antisense RNA beispielsw eise ist ein Weg, die Menge eines ausgew ählten
Genprodukts, w ie eben der mRNA, zu reduzieren. Antisense RNA ist in ihrer Nukleotidabfolge komplementär zu
derjenigen mRNA, deren kodierendes Gen ausgeschaltet w erden soll. Durch ihre Komplementarität bindet die
antisense RNA an das Start-Codon der mRNA und hemmt damit deren Translation mit der Folge, dass kein
Protein gebildet w erden kann – die Genexpression w ird damit inhibiert.
Zum ersten Mal seit Beginn der Untersuchungen an P. hawaiensis im Jahr 1999 und als erstem Labor w eltw eit
gelang es, die Translation von vasa und nanos mit Hilfe von antisense Morpholinos zu hemmen, einer zur
antisense-RNA alternativen Technik. In den Experimenten zeigten die zw ei vasa und nanos Morpholinos
unterschiedliche Effekte auf die Bildung der Keimzellen in P. hawaiensis: In keinem der beiden MorpholinoExperimente w urde die frühe Bildung der Keimzellen unterbunden, aber in beiden Experimenten gingen die
Keimzellen nach der Gastrulation zugrunde. Im Fall von vasa w urde die Teilung der Keimzellen nach der
Gastrulation angehalten. Im Fall von nanos w ar nicht nur die Teilung der Keimzellen gestoppt, sondern auch
ihre Wanderung herabgesetzt (Abb. 2). Im Versuch mit vasa konnte detailliert aufgeklärt w erden, dass der
Embryo nicht mit von der Mutter ins Ei gelegtem Protein ausgestattet ist und dass die mRNA in der Zeit, in der
sie vom 1-Zellstadium bis zum 32-Zellstadium noch in allen Zellen vorliegt, nicht zu Protein translatiert w ird.
Dies w urde erst lange nach ihrer Lokalisierung in die Keimzellen, nämlich im 175-Zellstadium, beobachtet.
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R olle von vasa in de r Bildung de r Ke im ze lle n. (a - c)
Ke im ze lle n in de r norm a le n Entwick lung: (a ) Die k le inste Ze lle
im 8-Ze llsta dium ist die Vorlä ufe rze lle für die Ke im ze lle n, (b)
30 % Entwick lungsfortschritt: Die Ke im ze lle n bilde n e in C luste r
(P fe ile ), (c) 40 % Entwick lungsfortschritt: Da s C luste r ha t sich
ge te ilt. (e - g) Bildung von Ke im ze lle n be i gle ichze itige r
Inhibition de r Tra nsla tion durch vasa Morpholinos: (e )
Inje k tion de s Morpholinos in die k le inste Ze lle , (f) da s C luste r
ist k le ine r a ls in Kontrolle n, (g) da s C luste r te ilt sich nicht, die
Ze lle n ste rbe n.
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Fazit
Unsere Tests zur Funktion von vasa und nanos in P. hawaiensis zeigen deutlich, dass diese zw ei Gene anders
als bei D. melanogaster keine frühe Rolle in der Bildung von Keimzellen spielen, jedoch genauso w ie bei D.
melanogaster eine späte Rolle. Die Expression des Gens beta-catenin in den Keimzellen stellt w iederum einen
Fall dar, in dem mRNA unerw artet in ihrer Verbreitung innerhalb der Zelle eng eingegrenzt ist. Für die
Spezifizierung der Keimzellen konnte gezeigt w erden, dass die frühen Embryonen von P. hawaiensis und D.
melanogaster sich nicht nur auf den zw ei Ebenen ihrer Morphologie und der Ausbildung einer Cell Lineage
unterscheiden, sondern auch auf der Ebene der unterschiedlichen zeitlichen w ie räumlichen Expression
homologer Gene.
In einem anderen Projekt w erden Gene aus P. hawaiensis analysiert, deren Homologe auch im Mesoderm von
D. melanogaster exprimiert w erden. Auch hier hat sich durch Arbeiten in unserem Labor und in dem Labor von
Nipam Patel in Berkeley gezeigt, dass
diese
Gene
in P. hawaiensis andere zeitliche und räumliche
Expressionsmuster und auch andere Funktionen haben als bei D. melanogaster [4]. In der Gesamtschau w ird
damit deutlich, w ie die Funktion von homologen Genen im Verlauf der Evolution w echselt. Als langfristiges Ziel
möchten w ir verstehen, w ie alle Zelltypen des 8- Zellstadiums im Embryo von P. hawaiensis festgelegt w erden
und w ie die Evolution der Arthropoda (= Gliedertiere) die Funktionen homologer Gene in der frühen
Embryonalentw icklung derart abgew andelt hat, dass sie so unterschiedliche Entw icklungsmechanismen w ie in
D. melanogaster und P. hawaiensis steuern können.
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[1] M. Gerberding, N. H. Patel:
Gastrulation in crustaceans.
In: Gastrulation. (ed.: C. Stern). Cold Spring Harbor Press, 78-89 (2004).
[2] W. E. Browne, A. L. Price, M. Gerberding, N. H. Patel:
Stages of embryonic development in the amphipod crustacean Parhy ale hawaiensis.
Genesis 42, 124-149 (2005).
[3] M. Gerberding, W. E. Browne, and N. H. Patel:
Cell lineage analysis of the amphipod crustacean, Parhy ale hawaiensis, reveals an early restriction of
cell fates.
Development 129, 5789-5801 (2002).
[4] A. L. Price, N. H. Patel:
Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: The expression of Ph-twist
and Ph-mef2 in Parhy ale hawaiensis.
Journal of Experimental Zoology B 310, 24-40 (2008).
[5] J. Havemann, U. Müller, J. Berger, H. Schwarz, M. Gerberding, B. Moussian:
Cuticle differentiation in the embryo of the amphipod crustacean Parhy ale hawaiensis.
Cell & Tissue Research. DOI 10.1007/s00441-007-0571-7 (2008).
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