Lebenslauf

Ergebnisse
130
5.5
In situ–Hybridisierung zur zellulären Lokalisation der Transkripte des
Gens 83.5
Die zu Beginn der hier vorgestellten Arbeiten vorliegenden Ergebnisse wiesen darauf
hin, dass die ausgehend vom Gen 83.5 gebildeten Transkripte gehirnspezifisch gebildet
werden. Mittels Northern Blot-Analysen sowie RT-PCR-Experimenten konnte gezeigt
werden (Schepelmann, 1996), dass das Gen nicht wie bisher angenommen
ausschließlich im Hirnkapillarendothel, sondern vielmehr im gesamten Gehirn des
Schweins transkribiert wird. Zu diesem Zeitpunkt war jedoch über das genaue zelluläre
Vorkommen der beiden Transkripte tmp 83.5 und sp 83.5, welche für das
Transmembranprotein TMP 83.5 bzw. für dessen cytosolische Isoform kodieren, noch
keinerlei Anhaltspunkt vorhanden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte deshalb der zelluläre Nachweis beider
Transkripte im Schweinegehirn mittels in situ-Hybridisierungsexperimenten erfolgen.
Diese ermöglichen es, Genprodukte in ihrer mRNA-Form direkt im Gewebeschnitt
nachzuweisen, so dass Aussagen über eine zellspezifische Transkription dieser
Sequenzen getroffen werden können. Ein weiterer Vorteil des Nachweises auf
Transkriptebene ist die Möglichkeit, die beiden mRNA-Sequenzen tmp und sp 83.5
aufgrund ihrer individuellen 5'-Bereiche separat nachweisen zu können. Als Sonden für
die in situ-Hybridisierungsversuche wurden Digoxigenin-markierte, einzelsträngige
cDNA- und cRNA-Moleküle verwendet, die komplementär zur jeweiligen mRNASequenz der Transkripte sind. Werden diese auf Gewebeschnitte aufgebracht, binden sie
dort an die komplementäre mRNA unter Ausbildung von doppelsträngigen
cDNA/mRNAbzw.
cRNA/mRNA-Hybridmolekülen,
die
mittels
eines
immunologischen Nachweissystems detektiert werden können.
Deshalb ist es notwendig, die verwendeten Gewebeschnitte möglichst ohne
Degradierung der mRNA-Moleküle herzustellen sowie bis zur Hybridisierungsreaktion
alle Arbeitsschritte unter RNase-freien Bedingungen durchzuführen (4A.13.2).
5.5.1 In situ –Hybridisierung mit Digoxigenin-markierter cRNA
5.5.1.1 Herstellung von 83.5-spezifischen cRNA-Sonden
Zum Nachweis beider Transkripte in Schweinegehirnschnitten wurden in vitro
generierte cRNA-Sonden verwendet, die zu unterschiedlichen Bereichen beider
Transkripte komplementär sind.
Ergebnisse
131
Dabei wurde zunächst eine 285 nt lange cRNA-Sequenz synthetisiert, die komplementär
zum identischen Bereich beider Transkripte ist, jedoch keinerlei signifikante
Übereinstimmungen zu bereits bekannten Transkripten besitzt. Die Sonde enthält die
Positionen 906-1190 des Transkripts tmp 83.5 bzw. die Positionen 626-910 der sp 83.5Sequenz (siehe Anhang) und umfasst neben den letzten 110 nt des kodierenden
Bereichs beider Transkripte die sich daran anschließenden 175 nt des nicht translatierten
3'-Bereichs. Mit knapp 300 nt besitzt die cRNA-Sonde eine ideale Länge für die
Verwendung bei in situ-Hybridisierungen. Einerseits gewährleistet die geringe Größe
eine optimale Zugänglichkeit für die im Gewebeschnitt vorliegende mRNA. Zum
Anderen ist die Sequenz jedoch ausreichend lang genug, um bei der Hybridisierung eine
höhere Temperatur sowie stringente Waschschritte zu erlauben, so dass insgesamt eine
höhere Spezifität der Hybridisierung sowie eine verminderte Hintergrundfärbung der
Gehirnschnitte erreicht wird.
Die Herstellung der Sonde erfolgte mittels in vitro-Transkription in Gegenwart von
Digoxigenin-markiertem UTP (4A.13). Hierfür wurde der entsprechende
Sequenzbereich, der von den Oligonukleotidprimern SC1 und SC8 begrenzt wird,
mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (4A.8) aus Schweinegehirn cDNA generiert (4A.7)
und in den Vektor pGemT (3.11.1) gemäß 4A.11.2 ligiert. Anschließend wurden
kompetente E. coli DH5α-Zellen (4A.3) mit diesem Ligationsansatz transformiert
(4A.4). Die bei der Transformation entstandenen plasmidtragenden Bakterienkolonien
wurde mittels Blau-Weiß-Test selektiert und auf die Anwesenheit von rekombinanten
Plasmiden untersucht. Hierfür wurden die Plasmide aus den Bakterienklonen gemäß
4A.5.1 isoliert und anschließend einer Restriktionsanalyse (4A.11.1) unterzogen, bei der
das integrierte PCR-Produkt mit den Endonukleasen Sac I und Sac II aus dem
Plasmidvektor geschnitten wird. In der sich anschließenden Gelelektrophorese
(4A.10.2) konnten die rekombinanten Plasmide dann durch die Detektion dieses PCRFragmentes identifiziert werden.
Abb. 5.5.1 zeigt die Gelanalyse der mittels PCR generierten cDNA-Fragmente (A)
sowie die Restriktionsanalyse von 21 nach der Transformation isolierten
Bakterienklonen (B).
Ergebnisse
132
Abb. 5.5.1 Bildung und Klonierung des cDNA-Fragments SC1/SC8
A: Gelanalyse (4A.10.2) des PCR-Ansatzes (10 µl) mit cDNA aus Schweinegehirn und den
Oligonukleotidprimern SC1 und SC8. Spur 1 (PCR-Ansatz) zeigt das zu erwartende, 284 bp
lange 83.5-spezifische cDNA-Fragment, während Spur 2 die Negativkontrolle ohne cDNA
enthält. B: exemplarische Restriktionsanalyse (4A.11.1) der mittels 4A.5.1 isolierten,
rekombinanten pGem-Plasmide unter Verwendung der Endonukleasen Sac I und Sac II. Die
Spuren C, L, M und U zeigen hydrolisierte Plasmide, die das SC1/SC8-Fragment enthaltenden.
Nach diesem Verfahren konnten die zwei rekombinanten Plasmide pFF1 und pFF2
isoliert werden, die sich nur aufgrund der Orientierung ihrer 83.5-spezifischen Insertion
bezüglich des T7-Promotors unterschieden. Unter Verwendung dieser beiden
Plasmidkonstrukte war es daher möglich, die für die in situ-Hybridisierungen
notwendigen antisense- und sense-Sonden über einen identischen Sequenzbereich zu
generieren. Die antisense Sonde, die zur in der Zelle vorkommenden mRNA
komplementär ist, hybridisiert im Gewebeschnitt mit den 83.5-Transkripten und
ermöglicht somit über die Detektion der entstandenen mRNA-cRNA-Hybride die
Identifizierung des transkriptbildenden Zelltyps im Gewebeschnitt. Die sense-Sonde
wird als Negativkontrolle verwendet, da sie identisch zur mRNA-Sequenz ist und
deshalb im in situ-Experiment keine Hybridisierungssignale ergeben sollte.
Abb. 5.5.2 zeigt schematisch die Bildung der rekombinanten Plasmide pFF1 und pFF2
sowie die Herstellung der Digoxigenin-markierten cRNA-Sonden.
133
Ergebnisse
f 1 ori
pGem-T
3003 bp
Amp R
lacZ
Pos. 906
T7-Promotor
5‘
3‘
T
Pos.1190
3‘
5‘
83.5
83.5 cDNA
ori
Ligation
f 1 ori
f 1 ori
pFF 1
3287 bp
Amp R
pFF 2
3287 bp
Amp R
lacZ
T7-Promotor
T7-Promotor
ori
ori
lacZ
Pos. 906
Pos. 1190
Pos. 1190
Pos. 906
Linearisierung mit Not I
Pos. 1190
Pos. 906
Pos. 906
Pos. 1190
T7-Promotor
T7-Promotor
in vitro-Transkription mit T7 RNA-Polymerase
und Dig-markierten UTP
Pos. 1190
Pos. 906
T7-Promotor
285 nt antisense cRNA tmp 83.5
Pos. 906
Pos. 1190
T7-Promotor
285 nt sense cRNA tmp 83.5
Abb. 5.5.2 Synthese der cRNA-Sonden AS1 und S1
Die Abbildung zeigt die Bildung der 83.5-spezifischen cRNA-Sonden ausgehend von den
Plasmiden pFF1 und pFF2. Die Positionen beziehen sich auf die Nukleinsäuresequenz des
Transkripts tmp 83.5. Verwendete Abkürzungen: siehe Abb. 3.1 und 3.2.
Ergebnisse
134
Die antisense-Sonde AS1 wurde ausgehend von 1 μg nach 4A.5.2 präpariertem Plasmid
pFF1 hergestellt, das zuvor mit der Restriktionsendonuklease Not I linearisiert wurde
(4A.13). Die Linearisierung des Plasmids verhindert die Bildung Plasmid-spezifischer
cRNA, die das Ergebnis durch unspezifische Hybridisierungen verfälschen könnte. Die
sense-Sonde S1 wurde analog dem oben beschriebenen Prozess ausgehend von 1 μg
Plasmid pFF2 hergestellt.
Entsprechend zu der oben beschriebenen Vorgehensweise wurde ein weiteres
Sondesystem generiert, dass das 3‘-Ende beider Transkripte tmp bzw. sp 83.5
repräsentiert. Hierfür wurden die bereits vorhanden Plasmide p83V-22a und pG2/1
(3.11.2) unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase zur Synthese der 83.5-spezifischen
cRNA-Sonden verwendet.
Gemäß 4A.13 wurde zur Herstellung der antisense-Sonde AS2 1 µg des mit Sac I
linearisierten Plasmids p83V-22a verwendet, während die sense-Sonde S2 (337 nt)
ausgehend von 1 µg des mit Bst E II fragmentierten Plasmids pG2/1 erhalten wurde.
Vor dem Einsatz der Sonden in die in situ-Hybridisierung wurden diese zuerst auf ihre
einheitliche Größe sowie ihre prinzipielle Nachweisbarkeit über das eingebaute
Digoxigenin überprüft. Hierfür wurden die cRNA-Sonden im denaturierenden
Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt (4A.10.3) und anschließend auf Nitrozellulose
transferriert (4A.13.1). Der Nachweis der Digoxigenin-Markierung erfolgte mit dem
immunologischen Detektionsverfahren, das später auch für die in situ-Hybridisierungen
verwendet werden sollte.
Hierbei erfolgt die Detektion der mRNA-cRNA-Hybride mit anti-DigoxigeninAntikörpern, die mit dem an die cRNA gebundenen Digoxigenin wechselwirken. Die
Visualisierung der Antikörperbindung erfolgt über die Enzymreaktion der an die
Antikörper gekoppelten alkalischen Phosphatase. Nach Zugabe einer Substratlösung,
die aus Nitroblue Tetrazolium (NBT) und 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP)
besteht, erfolgt der Nachweis über die Bildung eines dunkelvioletten Formazans.
In Abb. 5.5.3 ist die Gelanalyse sowie der immunologische Nachweis der Sonden auf
der Nitrozellulose-Membran dargestellt. Dabei zeigt sich die einheitliche Größe der
generierten antisense- und sense-Sonden der verschiedenen in vitro-Ansätze
(Abb. 5.5.3 B) sowie die Nachweisbarkeit der cRNA-Markierung mittels Digoxigeninspezifischer Antikörper (Abb. 5.5.3 A).
135
Ergebnisse
Die Probenquantifizierung erfolgte nach 4A.13. Hierzu wurden von den in vitroAnsätzen Verdünnungen hergestellt, die mit einer Verdünnungsreihe einer KontrollDNA bekannter Konzentration verglichen wurden. Es zeigte sich, dass pro in vitroAnsatz ungefähr 3 μg Digoxigenin-markierte antisense- und sense-cRNA gebildet
wurde.
A
B
S1
285 nt
AS1
S2 AS2
AS2 S2 AS1 S1
330 nt
285 nt
Abb. 5.5.3 Gelanalyse sowie immunologische Detektion der in vitro generierten cRNASonden
A: Für den immunologischen Nachweis der cRNA-Sonden auf Nitrozellulose wurden jeweils
1 µl (~30 ng) des in vitro-Ansatzes im denaturierenden Agarosegel aufgetrennt. B: Zur
Visualisierung der cRNA im Agarosegel wurden pro Spur 5 µl (~150 ng) der cRNA-Sonde
verwendet, da der Nachweis von RNA-Molekülen mit Ethidiumbromid weniger sensitiv ist als
die immunologische Detektion.
Abb 5.5.4 zeigt die einzelnen cRNA-Sondenverdünnungen der verschiedenen in vitroTranskriptionsansätze im Vergleich zum Eichteststreifen mit definierten
Konzentrationen.
136
Ergebnisse
1
2 3
4 5
E
AS1
S1
AS2
S2
Abb. 5.5.4 Quantifizierung der in vitro generierten 83.5-spezifischen cRNA-Sonden
Der Eichstreifen (E) ist mit 300 (5), 100 (4), 30 (3), 10 (2) und 3 pg (1) Dig-markierter
Kontroll-DNA beladen.
Zusätzlich wurde in Northern Blot-Analysen die Spezifität der antisense-Sonden
bezüglich der Transkripte des Gens 83.5 überprüft. Hierfür wurde Gesamt-RNA aus
Schweinegehirn gemäß 4A.6.1 isoliert, im denaturierenden Agarosegel
elektrophoretisch aufgetrennt (4A.10.3) und anschließend auf eine Nylon-Membran
transferriert (4A.13.1). Exemplarisch ist im Folgenden das Autoradiogramm eines
Northern Blots von Gesamt-RNA mit der cRNA-Sonde AS2 dargestellt (Abb. 5.5.5).
Dabei wurde für die Hybridisierung eine antisense-Sondenkonzentration von 40 ng pro
Milliliter Hybridisierungslösung eingesetzt. Das Hybridisierungsprotokoll sowie die
sich anschließende Detektion der cRNA-mRNA-Hybride erfolgte nach der unter
4A.13.1 beschriebenen Methode.
28 S
18 S
Abb. 5.5.5 Northern Blot-Analyse zur Überprüfung der cRNA-Sonde AS2
Für den Northern Blot wurden 100 µg Gesamt-RNA aus Schweinegehirn gelelektrophoretisch
aufgetrennt und auf Nylon-Membran transferriert. Die Hybridisierung mit 400 ng AS2-cRNA
führte zu zwei detektierbaren Signalen (Pfeile).
Ergebnisse
137
Die Northern Blot-Analyse ergab zwei Hybridisierungssignale, deren Länge im
Vergleich mit ribosomaler 18S- und 28S-RNA, die ungefähr 2 kb bzw. 5 kb umfassen,
abgeschätzt wurde. Dabei ergaben sich für die zwei 83.5-spezifischen Transkripte
ungefähre Größen von 2.6 bzw. 2.3 kb. Diese Ergebnisse stimmen mit den von
Schepelmann, 1996 und Bangsow, 1997 durchgeführten Northern Blot-Analysen zur
Bestimmung der Transkriptlängen von tmp und sp 83.5 überein, so dass die Eignung der
verwendeten antisense-Sonde zum Nachweis der 83.5-spezifischen Transkripte im
Gewebeschnitt bewiesen wurde.
5.5.1.2 in situ-Hybridisierungen von Schweinegehirnschnitten
Für die in situ-Hybridisierung wurden 12 μm dicke Gefrierschnitte aus Cerebellum und
Cortex des Schweins präpariert. Die Schnitte wurden gemäß 4A.13.2 aufbewahrt und
für die Hybridisierungen wie unter 4A.13.2.1 beschrieben vorbereitet. Die
Hybridisierung erfolgte mit einer Sondenkonzentration von 300 pg pro Mikroliter
Hybridisierungspuffer bei einer Temperatur von 45 ºC. Nach 17 Stunden wurden die
Gewebeschnitte in mehreren Schritten mit abnehmender Salzkonzentration bis zu einer
Stringenz von 0.2 x SSC / 50 % Formamid bei 45 ºC gewaschen. Anschließend erfolgte
die Detektion der mRNA-cRNA-Hybride mit anti-Digoxigenin-Antikörpern wie oben
beschrieben, wobei nach der Substratreaktion sich positiv gefärbte Zellen durch die
dunkelviolette Färbung ihres Cytoplasmas auszeichneten.
Die folgenden Abbildungen zeigen lichtmikroskopische Aufnahmen in verschiedenen
Vergrößerungen von Gewebeschnitten des Schweinekleinhirns nach Hybridisierungen
mit der ausgehend von p83.5/22 generierten antisense-Sonde AS2 und der ausgehend
von pG2/I hergestellten sense-Sonde S2.
Ergebnisse
138
A
B
Abb. 5.5.6 A: in situ-Hybridisierungen eines Kleinhirnschnittes mit der antisense-Sonde AS2 in
100facher Vergrößerung. B: Kristallviolett-Färbung eines Cerebellumschnittes in 200facher
Vergrößerung, die die charakteristische Zellstruktur dieses Gehirnbereichs sichtbar macht. Der
Vergleich macht deutlich, dass bei der in situ-Hybridisierung die Neuronen der Körner – und
Molekularschicht intensiv angefärbt wurden.
Ergebnisse
139
A
B
Abb. 5.5.7 A: Ausschnitt von Abb. 5.5.6 A in 200facher Vergrößerung. In der
Ausschnittsvergrößerung zeigt sich deutlich die intensive Färbung der Körnerzellen und einiger
Neuronen in der Molekularschicht sowie die Färbung von Purkinje-Zellen (Pfeil). B: Die
in situ-Hybridisierung mit der sense-Sonde S2 zeigt im Kleinhirnschnitt keine spezifischen
Signale (200fache Vergrößerung).
Ergebnisse
140
Abb. 5.5.8 Ausschnittsvergrößerung von Abb. 5.5.7 A, auf der im Detail die Färbung von
unterschiedlichen Interneuronen der Molekularschicht des Schweinekleinhirns sichtbar wird
(400fache Vergrößerung).
Die in situ-Hybridisierung von Kleinhirnschnitten des Schweins führte mit der cRNASonde AS2 zu einer intensiven Färbung (Abb. 5.5.6). Dabei wurden in der
dreischichtigen Kleinhirnrinde vor allem Neuronen der Körnerschicht sowie
unterschiedliche Neuronen der Molekularschicht (Interneuronen) angefärbt
(Abb. 5.5.7 A und Abb. 5.5.8). Bei Verwendung der sense-Sonde (Abb. 5.5.7 B)
resultierte dagegen lediglich eine diffuse Hintergrundfärbung der Schnitte.
Auf den folgenden Seiten sind die Ergebnisse von in situ-Hybridisierungen mit den
cRNA-Sonden AS1 und S1 wiedergegeben.
Ergebnisse
141
A
B
Abb. 5.5.9 in situ-Hybridisierungen an Cerebellumschnitten mit der cRNA-Sonde AS1 in
100facher (A) und 200facher (B) Vergrößerung. Die Körnerzellen sowie die Purkinjezellen
werden intensiv gefärbt. Die starke Akkumulation des farbgebenden Formazans erklärt sich
daraus, dass die dargestellten Gewebschnitten mehrere Ebenen der zellreichen
Körnerzellschichten enthalten.
Ergebnisse
142
A
B
Abb. 5.5.10 A: Ausschnittsvergrößerung (400fach) des in Abb 5.5.9 B dargestellten
Kleinhirnschnittes, der die Färbung von verschiedenen Interneuronen verdeutlicht. B: Die
Hybridisierung mit der sense-Sonde S2 mit diffuser, unspezifischer Hintergrundfärbung (400
fache Vergrößerung).
Ergebnisse
143
A
B
Abb. 5.5.11 in situ-Hybridisierungen an Cerebellumschnitten unter Verwendung der antisenseSonde AS 1 in 200facher (A) und 400facher (B) Vergrößerung. A: Neben der stark angefärbten
Körnerzellschicht (linke, untere Ecke) sind zahlreiche Zellen in der Molekularschicht angefärbt.
Die Ausschnittsvergrößerung B verdeutlicht die charakteristische Zellfärbung, bei der sich die
Zellkerne hell gegen das stark angefärbte Cytoplasma abheben (Pfeile) sowie ungeschnittene
Nervenzellkörper vollständig gefärbt vorliegen.
Ergebnisse
144
Abb. 5.5.12 Neocortex aus dem Parietallappenbereich nach der Hybridisierung mit AS 2 in
100facher Vergrößerung. Es wird deutlich, dass
die Transkripte in den verschiedenen Schichten
des
Rindenbereichs
unterschiedlich
stark
exprimiert werden. Eine besonders intensive
Färbung der Neuronen ist in den Schichten I-III,
den Laminae moleculare, granularis externa sowie
pyramidalis externa ersichtlich.
Ergebnisse
145
A
B
Abb. 5.5.13 A: Die Ausschnittsvergrößerung (200fach) von Abb. 5.5.12. Neben den durch ihre
charakteristische, dreieckige Form auffallenden Pyramidenzellen werden in der Lamina
pyramidalis externa auch zahlreiche Neuronen unterschiedlicher Größe und Form angefärbt. B:
Die in situ-Hybridisierung mit der sense-Sonde S2 ergibt in Cortexschnitten ausschließlich eine
diffuse, unspezifische Zellfärbung.
Ergebnisse
146
A
B
Abb. 5.5.14 Die Photographien A und B zeigen mittels in situ-Hybridisierungen visualisierte
neuronale Zellen aus unterschiedlichen Bereichen des Neocortex in 400facher Vergrößerung.
Dabei handelt es sich um dreieckige Zellformen (geschlossener Pfeil) und runde Zellkörper
(offener Pfeil) aus der Lamina pyramidalis externa. B: In den inneren Cortexschichten sind
darüber hinaus spindelförmige Nervenzellen zu erkennen (offener Pfeil).
Ergebnisse
147
Die Photographien der Abb. 5.5.6 bis 5.5.14 zeigen deutlich eine intensive Färbung
neuronaler Zellen in den Schweinegehirnschnitten der Kleinhirn- und Großhirnrinde. In
den in Abb. 5.5.6 bis 5.5.11 abgebildeten Cerebellumschnitten ist unter Verwendung
der antisense-Sonden eine besonders intensive Färbung das Stratum granulosum, sowie
die Anfärbung von Neuronen des zellärmeren Stratum moleculare sichtbar. Zusätzlich
wurden Purkinjezellen des Stratum gangliosum angefärbt, was besonders gut in
Abb. 5.5.9 ersichtlich wird. Die angefärbten, birnenförmigen Zellkörper der
Purkinjezellen bilden perlenschnurartig die Grenze zwischen der intensiv gefärbten
Körnerschicht und der Molekularschicht, in der lediglich einzelne Neuronen angefärbt
sind.
Die Ausschnittsvergrößerungen 5.5.7 A und 5.5.9 B zeigen in 200 facher Vergrößerung
die im Stratum granulosum angefärbten Körnerzellen. Diese Neuronen erscheinen als
eng nebeneinander liegende, schwarz-violett gefärbte Ringe, bei denen der ungefärbte
Zellkern sich hell hervorhebt. Einerseits ist die starke Färbung dieser
Kleinhirnzellschicht durch die enorme Anzahl der vorliegenden Körnerzellen mit 2.7
Mio. Zellen pro Kubikmillimeter Körnerschicht (Heck and Sultan, 2001) bedingt,
resultiert aber auch aus der Anfärbung von Körnerzellen aus unterschiedlichen
Zellebenen, die im Gewebeschnitt übereinander vorliegen.
Die in der Molekularschicht angefärbten Nervenzellen sind in den Abb. 5.5.8 bis
Abb. 5.5.11 in unterschiedlicher Vergrößerung dargestellt. Dabei handelt es sich um
neuronale Zellen, die unter dem Sammelbegriff Interneurone zusammengefasst werden.
Die in Abb. 5.5.11 B dargestellte 400fache Vergrößerung von postiv gefärbten
Interneuronen verdeutlicht deren unterschiedliche Größe und Form. Es könnte sich hier
um Korb- bzw. Sternzellen handeln, die in der Molekularschicht des Kleinhirns zu
finden sind.
Auch in den Neocortexschnitten ist eine deutliche Färbung der Neuronen in den
unterschiedlichsten Schichten der Großhirnrinde sichtbar. Der in Abb. 5.5.12
dargestellte Querschnitt durch eine Gehirnwindung des Parietallappenbereichs in
100facher Vergrößerung zeigt positiv gefärbte Zellen unterschiedlicher Form und
Größe, die über alle Schichten der Großhirnrinde verteilt sind. Eine besonders intensive
Zellfärbung ist dabei im Bereich der äußeren Körner- und Pyramidenschicht zu
beobachten. So sind in der sehr zellreichen äußeren Körnerschicht, die hauptsächlich
aus dicht gepackten, kleinen Pyramidenzellen und Sternzellen besteht, sowohl runde als
auch kleine pyramidenförmige Zellkörper positiv gefärbt. In der sich der Pia mater
anschließenden Molekularschicht sind dagegen nur vereinzelt Zellen angefärbt. In der
Ergebnisse
148
dritten Zellschicht, der äußeren Pyramidenzellschicht, sind vor allem größere, neuronale
Zellen dreieckiger Form neben eher runden Neuronen angefärbt.
Die Ausschnittsvergrößerung in Abb. 5.5.13 zeigt positiv gefärbte Pyramidenzellen, die
aufgrund ihrer charakteristischen Form und Größe eindeutig identifiziert werden
konnten. Zusätzlich sind eher runde Perikarya in dieser Schicht angefärbt. Neben
ungeschnittenen Neuronen, die durch eine flächige schwarzviolette Färbung auffallen,
sind angeschnittene Nervenzellen sichtbar, die eine für in situ-Hybridisierungen
typische saumartige Anfärbung des Cytoplasmas um einen hell ausgesparten Zellkern
aufweisen. Abb. 5.5.14 A zeigt in 400facher Vergrößerung die positive Färbung von
Pyramidenzellen sowie von Neuronen mit runder bis ovaler Zellform der dritten
Zellschicht des Neocortex. In dieser Auflösung ist im Ansatz der apikal entspringende
Dendrit einer dreieckigen Pyramidenzelle zu erkennen. Abb. 5.5.14 B zeigt die
Zellkörper verschiedener Nervenzellen aus einer inneren Cortexschicht. Neben ovalen
und birnenförmigen Zellkörpern sind auch spindelförmige Neuronen positiv gefärbt.
Die als Negativkontrolle an Kleinhirn- und Cortexschnitten des Schweinegehirns
durchgeführten in situ-Hybridisierungen mit den sense-Sonden S1 und S2 führten nur
zu diffusen Hintergrundfärbungen (Abb.5.5.7 B, Abb. 5.5.10 B und Abb.5.5.13 B), so
dass die Ergebnisse mit den entsprechenden antisense-Sonden als spezifisch beurteilt
werden konnten. Für die spezifsche Detektion der 83.5-Transkripte in Gewebeschnitten
des Schweinehirns spricht außerdem, dass die beiden zu unterschiedlichen
Sequenzbereichen komplemtentären antisense-Sonden zu vergleichbaren in situHybridisierungsergebnissen führten.
Die bei den in situ-Hybridisierungen detektierten 83.5-positiven Neuronen
unterschiedlichster Größe und Form verdeutlichen, dass die Transkripte des Gens 83.5
in den verschiedenen Neuronentypen des Schweinegehirns exprimiert werden. Da
weder in den Kleinhirn- noch in den Neocortex-Schnitten kapillarähnliche Strukturen
angefärbt werden konnten, ist eine Lokalisation der Transkripte tmp und sp 83.5 in
Hirnkapillarendothelzellen definitiv auszuschließen. Die ursprüngliche Isolierung von
Teilen des sp 83.5-Transkripts aus Hirnkapillarendothelzellen erklärt sich dadurch, dass
entsprechend
den
damaligen
Präparationsmöglichkeiten
nicht
nur
Hirnkapillarendothelzellen, sondern darüber hinaus auch mit den Kapillaren assoziierte
Neuronen isoliert wurden.
Ergebnisse
149
5.5.2 In situ-Hybridisierung unter Verwendung eines an alkalische Phosphatase
gekoppelten Oligonukleotids
Da die unter 5.5.1.2 verwendeten cRNA-Sonden ausschließlich aus dem gemeinsamen
Sequenzbereich beider Transkripte stammen, konnten damit nur beide mRNASequenzen gleichzeitig im Gewebeschnitt nachgewiesen werden. Für den individuellen
Nachweis von tmp bzw. sp 83.5 war es daher notwendig, geeignete in situ-Sonden zu
generieren, die jeweils nur mit einem der beiden Transkripte hybridisieren.
Demzufolge wurde zunächst eine tmp 83.5-spezifische cRNA-Sonde aus dem 626 nt
langen individuellen Bereich generiert. Die hiermit durchgeführten in situHybridisierungen scheiterten jedoch daran, dass neben der antisense- auch die senseSonde in den Gewebeschnitten zu Färbungen führte, so dass über die Spezifität der
Hybridisierung keine Aussagen getroffen werden konnte.
Darüber hinaus war die Herstellung einer sp 83.5-spezifischen cRNA-Sonde nicht
möglich, da die ersten 208 nt des entsprechenden 343 nt langen individuellen Bereichs
nahezu identisch mit einer repetitiven Schweinesequenz sind (Abb. 5.5.15). Hierbei
handelt es sich um das SINE (short interspersed repeat) DNA-Element, das im gesamten
Genom des Schweins zu finden ist (Lenstra, 1993) und allein im Gen 83.5 mehrfach in
Intronsequenzen in beiden Orientierungen vorliegt (Bangsow, 1997). Desweiteren ist
das SINE-Element auch in Sequenzen anderer Transkripte des Schweins zu finden, wie
z. B. in der mRNA-Sequenz des Ryanodin-Rezeptors und der Inhibin β-Untereinheit.
Abb. 5.5.14 Vergleich der cDNA-Sequenz des Transkripts sp 83.5 mit der des SINEElements aus Schwein.
Die oberste Zeile entspricht dem 5'-Bereich des Transkripts sp 83.5, die untere entspricht der
SINE-Sequenz aus Schwein. Identische Nukleotide sind rot unterlegt.
Ergebnisse
150
Aufgrund dieser Übereinstimmungen eignet sich als sp 83.5-spezifische Sonde lediglich
eine 30 nt lange, individuelle Sequenz (Pos. 258-288) der mRNA, die jedoch an ihren
5'- und 3'-Enden von langen polyU-Passagen umgeben ist. Da somit das Ableiten einer
längeren, sp 83.5-spezifischen Sonde unmöglich war und dieser Sequenzabschnitt
gleichzeitig zu kurz ist, um als cRNA-Sonde in vitro transkribiert zu werden, wurden
die Hybridisierungsexperimente stattdessen mit einem zu diesem Sequenzbereich
komplementären Oligonukleotid durchgeführt. Mit einer verkürzten Variante dieses
Oligonukleotids wurden bereits die Startpunktsbestimmungen für das Transkript sp 83.5
durchgeführt (S. Perl, mündliche Mitteilung), so dass deren sp 83.5-Spezifität
experimentell nachgewiesen werden konnte.
Um die Sensitivität der mit dieser 30 nt langen Oligonukleotidsonde durchgeführten
in situ-Hybridisierung zu erhöhen, wurde das Oligonukleotid Pe03a verwendet, an
dessen 5'-Ende das Enzym alkalische Phosphatase gekoppelt ist, da dieses von Kiyama
und Emson, 1990 entwickelte in situ-Hybridisierungverfahren schon mehrfach
erfolgreich zur Detektion von Transkripten in Gehirnschnitten eingesetzt wurde
(Kiyama et al., 1990; Asan and Kugler, 1995; Schmitt et al., 1996).
Die in situ-Hybridisierungen wurden an unfixierten Cerebellumschnitten des Schweins
gemäß 4A.13.2.2 durchgeführt, wobei eine Sondenkonzentration von 10 fmol pro
Mikroliter Hybridisierungslösung verwendet wurde. Die Ergebnisse dieser in situHybridisierung sind in Abb. 5.5.15 und 5.5.16 aufgeführt.
Abb. 5.5.15 in situ-Hybridisierung eines Kleinhirnschnittes mit dem Oligonukleotid Pe03a in
200facher Vergrößerung.
Ergebnisse
151
A
B
Abb. 5.5.16 A: Ausschnittsvergrößerung des in Abb. 5.5.15 dargestellten Kleinhirnschnittes,
400fach vergrößert. B: in situ-Hybridisierung an einem zweiten Cerebellumschnitt in 400facher
Vergrößerung.
Die in Abb. 5.5.15 dargestellte in situ-Hybridisierung eines Kleinhirnschnittes mit dem
an alkalische Phosphatase gekoppelten Oligonukleotid Pe03a zeigt vereinzelt angefärbte
Bereiche, die in dieser Vergrößerung aber noch nicht eindeutig als Zellkörper
identifiziert werden können. Eine Ausschnittsvergrößerung (Abb. 5.5.16 A) zeigt
vereinzelt angefärbte Zellkörper, wobei die Zuordnung zu einem bestimmten Zelltyp
jedoch nicht eindeutig möglich ist. Die Abb. 5.5.16 (A und B) dargestellten
Ergebnisse
152
Ausschnittsvergrößerung zeigen mehrere angefärbte kleine Zellkörper, bei denen es sich
aufgrund ihrer Größe um einen gliären Zelltyp handeln könnte. In situ-Hybridisierungen
mit einer anschließenden immunchemischen Färbung von Astrocyten ließen jedoch
auch keine Rückschlüsse auf den genauen Zelltyp zu.
Auffallend bei diesen in situ-Hybridisierungen ist darüber hinaus, dass die Schnitte
nicht einheitlich angefärbt wurden. Dabei stehen Bereiche, in denen lokal viele Zellen
angefärbt sind, Abschnitten entgegen, die kaum gefärbte Zellen aufweisen. Da aufgrund
der Verwendung von unfixiertem Gewebe bei dieser in situ-Hybridisierungsmethode die
Gefahr besteht, mRNA-Transkripte durch Diffusion sowie Degradierung durch nicht
inaktivierte RNasen zu verlieren, könnte das schwache, uneinheitliche
Hybridisierungssignal somit auf einen partiellen Abbau der mRNA zurückzuführen
sein. Um eine einsetzende Degradierung zu unterbinden, müsste das verwendete
Schweinegehirn dementsprechend sofort post mortem der nachfolgenden in situHybridisierung gerecht eingefroren werden, was jedoch bei vom Schlachthof bezogenen
Gewebe aufgrund der räumlichen Begebenheiten nicht durchführbar ist.
Leider brachten auch in situ-Hybridisierungen an post mortem eingefrorenen
Rattengehirnen, die freundlicherweise im Arbeitkreis von Prof. Kugler am Institut für
Anatomie an der Universität Würzburg durchgeführt werden konnten, keine neuen
Erkenntnisse über den zellulären Bildungsort des Transkripts sp 83.5. Dieses Ergebnis
ist jedoch noch nicht als eindeutiger Beweis dafür zu werten, dass ein sp 83.5homologes Transkript im Rattengehirn nicht existiert. Da die als Sonde verwendete
Nukleotidsequenz bisher noch in keinem anderen tierischen Organismus beschrieben
worden ist, könnte der individuelle 5'-Bereich eines homologen Transkripts in Ratte
eine vollständig von der des Schweins abweichende Nukleotidsequenz besitzen.
Abschließend läßt sich sagen, dass die hier vorgestellten Ergebnisse zum
Einzelnachweis des Transkripts sp 83.5 im Schweinegehirn keine eindeutigen Aussagen
über dessen zellulären Bildungsort ermöglichen. Aufgrund der oben beschriebenen
Abbauvorgänge in unfixiertem Gewebe müssen sich zukünftige Untersuchungen daher
auf die Optimierung der Gewebepräparation konzentrieren, um schließlich doch noch
Hinweise über das Vorkommen des sp 83.5-Transkripts erhalten zu können.
Diskussion
6
153
Diskussion
Das Gehirn – mit Abstand das komplexeste Organ höherer Wirbeltiere – bewältigt seine
übergeordnete Aufgabe als Steuerzentrum des Körpers durch die Ausbildung
komplizierter neuronaler Netzwerke, die aus einer Vielzahl differenzierter Nervenzellen
bestehen. Das komplizierte Wechselspiel hochspezialisierter Neuronen ermöglicht es
dem Gehirn, über die Aufrechterhaltung der lebenserhaltenden Funktionen hinaus so
unterschiedliche Leistungen wie Wahrnehmung, Erinnerung, emotionales Empfinden,
Lernen und die Durchführung gezielter Bewegungsabläufe zu vollbringen. Die
jeweilige Spezialisierung der Neuronen ist dabei durch ihr Proteinrepertoir bedingt, das
somit ihre individuelle Funktion im Gehirn gewährleistet. In der Vergangenheit wurde
oftmals versucht, gehirnspezifische Proteine über die Isolierung ihrer mRNASequenzen zu identifizieren (Adams et al., 1993). Diese Projekte sowie die jüngsten
Sequenzierungsprogramme zur Entschlüsselung kompletter Genome führten jedoch
eher zu einer Akkumulation unbekannter Transkriptsequenzen, denen keinerlei
Funktion zugeordnet werden konnte, als dass die Charakterisierung neuartiger
Proteinfamilien dadurch beschleunigt worden wäre. So ergab die Entschlüsselung des
humanen Genoms 13.000 neue proteinkodierende Gensequenzen unbekannter Funktion,
was über 40 % aller aus der humanen Genomsequenz abgeleiteten Genbereiche
entspricht (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001;
Venter et al., 2001).
In Anbetracht dieser Problematik sind strategische Lösungsansätze, wie sie in unserem
Arbeitskreis am Beispiel des gehirnspezifisch exprimierten Gens 83.5 durchgeführt
wurden, aktueller denn je. Ausgehend von einem cDNA-Fragment unbekannter
Funktion, das bei dem Versuch isoliert wurde, Blut-Hirn-Schranke-spezifische Proteine
zu identifizieren, konnten zwei bisher noch nicht beschriebene mRNA-Sequenzen (tmp
und sp 83.5) charakterisiert werden, die ausschließlich im Gehirn gebildet werden. Die
Transkripte kodieren möglicherweise für ein potenzielles Membranprotein TMP 83.5
sowie für dessen lösliche Isoform SP 83.5.
Auf dem Weg vom unbekannten cDNA-Fragment zum Protein sollte im Rahmen der
vorliegenden Arbeit nun die Identifizierung der aus den Gensequenzen postulierten
Proteinformen TMP und SP 83.5 im Schweinegehirn sowie deren Isolierung mittels
peptidspezifischer Antikörper erfolgen. Ergänzend dazu sollte mittels in situHybridisierungen an Gehirnschnitten das genaue zelluläre Vorkommen der beiden
Transkripte aufgeklärt werden.
Diskussion
154
Die spezifischen Antikörper konnten durch Immunisierung von Kaninchen gewonnen
werden, wobei synthetische Peptide als Antigene verwendet wurden. Zur Identifizierung
von zur Immunisierung geeigneten Sequenzbereichen wurde die AS-Sequenzen der
hypothetischen Proteine TMP und SP 83.5 mittels Hydrophobizitäts- und
Sekundärstrukturanalysen auf potenziell immunogen wirkende Bereiche hin untersucht
(5.1.1; 5.2.1). Dabei konnten zwei AS-Bereiche identifiziert werden, die sich durch eine
hohe Oberflächenwahrscheinlichkeit und Antigenizität auszeichneten. Während das
18 AS-lange Peptid AO1 ausschließlich in der TMP 83.5-Sequenz (Pos. 77-94)
vorkommt, ist das 17 AS-lange Peptid AO2 sowohl im C-terminalen Bereich von TMP
83.5 (Pos. 107-123) als auch in der AS-Sequenz der löslichen Isoform (Pos. 11-27)
enthalten. Die Verwendung dieser beiden synthetischen Peptide zur Immunisierung von
Kaninchen sollte es hierbei ermöglichen, sowohl ein TMP-spezifisches (AO1) als auch
ein gegen beide Proteinisoformen gerichtetes Immunserum (AO2) zu erhalten. Dagegen
war die Generierung eines SP 83.5-spezifischen Immunserums prinzipiell nicht
möglich, da die Primärsequenz der löslichen Isoform absolut identisch mit dem CTerminus des Membranproteins ist.
Beide resultierenden Immunseren zeichneten sich im ELISA (5.2.2) durch eine hohe
Spezifität bezüglich des zur Immunisierung verwendeten Peptids aus. Bei der weiteren
Charakterisierung zeigte sich jedoch, dass beide Seren bezüglich ihres Gesamt-IgGGehaltes deutlich von den üblicherweise zu erwartenden Werten von 10–20 mg IgGs
pro Milliliter Serum (Harlow and Lane, 1988) abwichen. Während das AO2-spezifische
Serum noch eine Konzentration von ca. 7 mg Gesamt-IgGs / ml Serum aufwies, enthielt
das AO1-spezifische Serum lediglich 2.6 mg Gesamt-IgGs im entsprechenden
Volumen.
Die so gewonnenen Immunseren wurden anschließend zur Identifizierung der aus der
Gensequenz abgeleiteten Proteine sowie zu deren Isolierung eingesetzt.
TMP 83.5, ein neuartiges gehirnspezifisches Transmembranprotein
Sequenzanalysen des aus der mRNA-Sequenz tmp 83.5 abgeleiteten Proteins TMP 83.5
mit den Sekundärstrukturanalyse-Programmen GOR IV (Garnier et al., 1996) und
PSIPRED (Jones, 1999) ergaben, dass die Aminosäuren im Bereich der Pos. 38-57/59
mit hoher Wahrscheinlichkeit eine α-helikale Struktur einnehmen. Der ergänzend
durchgeführte Hydrophobizitätsplot nach Eisenberg wies diesem Bereich darüber
hinaus einen hohen hydrophoben Charakter zu. In Kombination mit den
Untersuchungen auf mögliche Signalsequenzen unter der Verwendung des Programmes
Diskussion
155
SignalP (Nielsen et al., 1997) sowie der Vorhersage einer möglichen
Transmembranproteinstruktur mit dem Programm TMHMM (Sonnhammer et al., 1998)
ergab sich für das hypothetische Protein TMP 83.5 (5.1.1) somit folgendes Bild
(Abb. 6.1):
Entsprechend den Sequenzanalyse-Ergebnissen scheint es sich bei TMP 83.5 um ein
Transmembranprotein mit einer membrandurchspannenden Domäne (Pos. 32-54) zu
handeln, das sich durch Nout-Cin-Topologie bezüglich der Orientierung innerhalb der
Plasmamembran auszeichnet. Aufgrund der Abwesenheit von abspaltbaren
Signalsequenzen am N-Terminus scheint diese Orientierung durch eine intern liegende
Signal-Anker-Sequenz bedingt zu sein, die die Zielsteuerung des Membranproteins
TMP 83.5 zum ER, dessen Translokation über die ER-Membran sowie die letztendliche
Verankerung des Proteins in der Plasmamembran bewirkt.
Die vorhergesagte Topologie eines Transmembranproteins des Typs I mit SignalAnker-Sequenz (Typ III) wird durch das Auftreten eines Clusters positiv geladener
Aminosäuren (Pos. 55-58), der sich direkt an die Membrandomäne anschließt, weiterhin
unterstützt. Gemäß der "positive-inside-rule"(von Heijne and Gavel, 1988) favorisiert
das Überwiegen von positiv geladenen AS auf einer Seite der Transmembrandomäne,
dass dieser Proteinbereich cytosolisch vorliegt. Hierfür spricht außerdem, dass in dem
als extrazellulär deklarierten Proteinbereich (1-31) zwei potenzielle NGlycosylierungsstellen (Marshall, 1972; Bause, 1983) an den Pos. 6 und 12 sowie vier
potenzielle O-Glycosylierungsstellen an den Pos. 13, 14, 15 und 16 identifiziert werden
konnten. Auch wenn die Existenz von N-Glycosylierungs-Konsensus-Sequenzen noch
kein Beweis für die tatsächliche Glycosylierung des Asparaginrestes an dieser Position
ist (Gavel and von Heijne, 1990) und die Vorhersage der O-Glycosylierungstellen nicht
anhand von definierten Konsensus-Sequenzen sondern mit dem Programm
NetOGlyc.2.2 (Hansen et al., 1995 und 1998) erfolgte, so scheint doch das Fehlen
jeglicher N- bzw. O-Glycosylierungsstellen im hypothetisch angenommen
cytosolischen Teil des Proteins für das extrazelluläre Vorkommen des N-Terminus zu
sprechen.
Weitere Indizien für diese Orientierung des Transmembranproteins TMP 83.5 stellen
die bei AS-Sequenzvergleichen gefundenen Ähnlichkeiten der membrandurchspannenden Domäne von TMP 83.5 zu den Membransegmenten von anderen
singulären Membranproteinen des Typs I mit Signal-Anker-Sequenz dar. Die höchste
Übereinstimmung besteht dabei mit einer Klasse von Rezeptortyrosinkinasen
(Abb. 6.2). Ähnlichkeiten sind jedoch auch zu den Membrandomänen von Leukosialin
aus Maus und Thrombomodulin aus Rind zu finden, die an so unterschiedlichen
Aufgaben wie Zell-Zell-Erkennung und ligandenvermittelter Signalweiterleitung
Diskussion
156
beteiligt sind. Alle oben genannten Membranproteine weisen eine Akkumulation der
Aminosäuren Alanin, Valin, Leucin sowie Isoleucin am C-terminalen Ende ihrer
Membrandomäne auf, der sich ein Cluster aus mehreren positiv geladenen AS
anschließt. Der Vergleich mit einem von Landolt-Marticorena et al., 1993 postulierten
Sequenzmotiv für Transmembranproteine des Typs mit Signal-Anker-Sequenz ergibt,
dass sich die Homologien zwischen diesen Proteinen und TMP 83.5 ausschließlich auf
die AS-Verteilung innerhalb und in nächster Umgebung der Membrandomäne
beschränken.
H2N*
*****
|
|||||
H2NH2N-MSFSLNFTLPANTTSSPVVTSGKGADCGPSLGLAAGIPSLVATALLVALLLILIHRRRR
P
P
P
H2N-PP P
H2N-|| |
|
|
|
H2N-SSESTEEIERPCEISEIYDNPRVAENPRRSPTHEKNIMGAEEAHIYVKTVSGSQEPMRD
H2N-P
P
H2N-|
|
H2N-TYRPAVEMERRRGLWWLIPRLSLE-COOH
Abb. 6.1 AS-Sequenz des Transmembranproteins TMP 83.5 mit potenziellen posttranslationalen Modifikationen
Blau: Transmembrandomäne. Grün: Peptid AO1. Rot: Peptid AO2
Während die mit (*) markierten Positionen potenziellen N- und O-Glycosylierungsstellen
entsprechen, repräsentieren die
mit (P)
gekennzeichneten
Stellen
mögliche
Phosphorylierungspositionen des Proteins TMP 83.5.
Neben der Konsensus-Sequenz für Typ I-Membranproteine mit Signal-Anker weist
TMP 83.5 noch weitere für diesen Proteintyp charakteristische AS-Sequenzen auf. So
ist unmittelbar vor der helikalen Membrandomäne ein Prolin (Pos. 29), das oft als
Helixinitiator wirkt, sowie ein Serinrest (Pos. 30), der eine helixstabilisierende Funktion
haben könnte (Richardson and Richardson, 1988), zu finden.
Das Vorkommen der in globulären Proteinen destabilisierend auf α-Helixstrukturen
wirkenden AS Prolin und Glycin im Transmembranbereich von TMP 83.5 entspricht
ebenfalls der normalerweise für Transmembranproteine gefundenen Häufigkeit (Arkin
and Brunger, 1998). Dabei induziert ein Prolinrest innerhalb der Membrandomäne
oftmals eine Knick innerhalb der Helixachse, wie das Beispiel der Cytochrom C
Oxidase-Struktur verdeutlicht (Ostermeier et al., 1997).
Das am N-terminalen Ende der Transmembrandomäne von TMP 83.5 zu findende
Sequenzmotiv GxxxG in der Nachbarschaft der verzweigten AS Isoleucin stellt das am
Diskussion
157
häufigsten
in
Transmembrandomänen
auftretende
AS-Paarmotiv
dar
(Senes et al., 2000). Die Bedeutung dieses Motivs für die Wechselwirkung zwischen
Membrandomänen, wie sie beispielsweise bei der Oligomerisierung von Rezeptorkomplexen beobachtet wird, konnte schon mehrfach in vitro (Lennon et al., 1992) und
in vivo (Brosig and Langosch, 1998; Russ and Engelman, 2000) bestätigt werden.
Basierend auf diesen Ergebnissen kann das Protein TMP 83.5 somit
höchstwahrscheinlich als membranständig betrachtet werden, wobei alle Indizien für
eine Toplogie des Typs I mit Signal-Anker-Sequenz sprechen, bei der der N-Terminus
extrazellulär lokalisiert ist.
Der Nachweis dieses Proteins mit Hilfe von Western Blot-Analysen erfolgte
dementsprechend unter Verwendung der Membranfraktion von Gehirnaufschlüssen
(5.3.1). Mit Hilfe des TMP-spezifischen Immunserums konnten dabei drei
immunreaktive Banden unterschiedlicher Intensität identifiziert werden. Im Vergleich
mit den Proteinmarkerbanden des prestained Markers (Tab. 3.5) zeigten die Proteine im
SDS-PAGE eine Mobilität, die Molmassen von ca. 35, 17.5 sowie 11 kDa entspricht.
Aufgrund der bereits beschriebenen möglichen N- und O-Glycosylierungsstellen des
Transmembranproteins TMP 83.5 könnte es sich bei der 17.5 kDa großen Proteinbande
möglicherweise um die glycosylierte Form des Proteins handeln. Da solubilisierte
Membranproteine dazu neigen, in Lösung zu aggregieren, könnte die immunreaktive
Bande bei 35 kDa eine dimere Form von TMP 83.5 darstellen. Dieses Dimer könnte
artifiziell bei der Probenpräparation zur Gelelektrophorese entstehen und während der
SDS-PAGE nicht aufgetrennt werden.
Die unter Verwendung der Peptid AO1-spezifischen IgGs durchgeführten
Immunaffinitätschromatographien ermöglichten die Isolierung (5.3.2) der im Western
Blot identifizierten Proteinbanden. Dabei wurde hauptsächlich ein Protein isoliert, dem
im Größenvergleich mit dem Low Molecular Weight Marker eine Molmasse von ca.
14 kDa zugeordnet werden konnte, die somit in dem für das Protein TMP 83.5 zu
erwartenden Bereich liegt. Bei der Konzentrierung der Probe wurden zusätzlich coisolierte Proteinbanden ober- und unterhalb dieser Hauptbande sichtbar (~11 und
~17 kDa), die den weiteren immunreaktiven Banden der Western Blot-Analyse
entsprechen. Die zwischen Western Blot-Analyse und Immunaffinitätschromatographie
auftretenden Unterschiede in der molaren Masse der immunreaktiven Proteine könnten
darauf zurückzuführen sein, dass für die jeweilige SDS-PAGE-Analyse zwei
unterschiedliche Markersysteme verwendet wurden.
Diskussion
158
Bei den zusätzlich isolierten Proteinbanden könnte es sich um post-translational
modifizierte Formen des TMP 83.5-Proteins handeln. Neben den bereits schon
aufgeführten Glycosylierungen sind zusätzlich auch N-terminal verkürzte Varianten des
Proteins TMP 83.5 denkbar.
Die Ergebnisse der Immunaffinitätschromatographie-Experimente zeigen deutlich, dass
unter Verwendung des peptidspezifischen Immunserums die Etablierung eines
effizienten Reinigunssystems für das Transmembranprotein gelungen ist. Da dieses nun
für weiterführende in vitro- und in vivo-Funktionsanalysen, Glycosylierungs- und
Phosporylierungsstudien sowie für die Bestimmung der tatsächlichen Proteintopologie
eingesetzt werden kann, besteht somit zum ersten Mal die Möglichkeit, dass bisher noch
nicht beschriebene, gehirnspezifische Membranprotein TMP 83.5 zu isolieren und näher
zu charakterisieren.
Da bei Datenbankvergleichen außer der Membrandomäne keine weiteren funktionellen
Übereinstimmungen zu anderen Proteinen gefunden werden konnten, scheint es sich bei
TMP 83.5 möglicherweise um eine neue Rezeptorklasse des Säugergehirns zu handeln.
Die Abb. 6.2 zeigt den AS-Sequenzvergleich von TMP 83.5 mit der
Rezeptortyrosinkinase UFO aus Mensch und Maus. Die Sequenzähnlichkeit beschränkt
sich auf einen Bereich von 64 AS, in dem die Membrandomänen der beiden Proteine zu
finden ist (32 % Identität). Da das Transmembranprotein TMP 83.5 selbst jedoch kein
Sequenzmotiv aufweist, das auf eine Kinaseaktivität des Proteins hinweisen würde, und
ihm außerdem die für diese Rezeptorklasse charakteristische extrazelluläre Domäne
(Rescigno et al., 1991) fehlt, ist eine Klassifizierung als Rezeptortyrosinkinase der
UFO-Unterfamilie nicht möglich. Lediglich die Ausbildung homophiler
Rezeptorkomplexe innerhalb dieser Proteinfamilie (Bellosta et al., 1995) könnte ein
Hinweis dafür sein, welche Funktion das Transmembranprotein TMP 83.5 in der
Zellmembran ausübt.
So wird bei genauerer Analyse der AS-Sequenz der Transmembrandomäne deutlich,
dass das Protein TMP 83.5 zwei für die Oligomerisierung von Membranproteinen
notwendige Sequenzmotive enthält. Am N-terminalen Ende der Membrandomäne findet
sich das bereits erwähnte GxxxG-Motiv, das für die starke homophile Wechselwirkung
von Glycophorin A verantwortlich ist (Brosig and Langosch, 1998).
Diskussion
159
Abb. 6.2 Ähnlichkeit der AS-Sequenz von TMP 83.5 mit der AS-Sequenz von Vertretern
der UFO-Rezeptorklasse aus Maus und Mensch
Außerdem zeigt die Membrandomäne von TMP 83.5, dass dessen C-terminale Hälfte
ein Leucinzipper-ähnliches Motiv enthält, dessen Funktion als homotypisch
interagierendes Transmembran-Segment nachgewiesen werden konnte. Bei diesem
Motiv liegen alle Leucinreste auf einer Seite der Helix und ermöglichen dadurch die
Interaktion mit einer gegenüberliegenden Helix, die ein entsprechendes LeucinzipperMotiv aufweist. Bei Datenbankrecherchen wurden bereits degenerierte Versionen des
idealisierten Leuzinzippermotivs in den Transmembransegmenten verschiedener
Membranproteine identifiziert, die eine entscheidende Rolle bei der homo- und
heterooligomeren
Komplexbildung
dieser
Membranproteine
spielen
(Gureza et al., 1999).
Dies
gilt
auch
für
die
Membrandomäne
des
Erythropoietinrezeptors, der bereits vor der Ligandenbindung als Dimer in der
Plasmamembran vorliegt (Kubatzky et al., 2001; Remy, et al., 1999).
Da die Transmembrandomäne von TMP 83.5 beide Sequenzmotive enthält, ist dessen
Beteiligung an der Ausbildung von oligomeren Strukturen in der Plasmamembran, wie
sie für die Klasse der Cytokinrezeptoren beschrieben ist (Moutoussamy et al., 1998),
denkbar. Diese Rezeptorklasse ohne intrinsische Kinaseaktivität bewältigt die
Signalweiterleitung über an deren cytosolische Domäne gebundene Janus-Kinasen, die
durch die Ligandenbindung aktiviert werden (Ihle, 1995). Da im Zuge dieser
Aktivierung der Rezeptor selbst phosphoryliert wird, könnten auch die vielen
Diskussion
160
potenziellen Phophorylierungsstellen innerhalb der AS-Sequenz, die sowohl über die
Identifizierung von Konsensus-Sequenzen als auch mittels des Programms NetPhos
(Blom et al., 1999) bestimmt wurden, für eine Beteiligung des Proteins TMP 83.5
(Abb. 6.1) an signalweiterleitenden oder zellregulierenden Prozessen sprechen.
In diesem Zusammenhang ist die Ähnlichkeit von TMP 83.5 zu den
membrandurchspannenden Ephrinen vom Typ B interessant. Die Sequenzähnlichkeit
beträgt über einen Bereich von 69 AS, der die jeweilige Membrandomäne einschließt,
über 45 %, wobei zur rezeptorbindenden Domäne keine Sequenzhomologien bestehen.
Bei den Ephrinen handelt es sich um membrangebundene Liganden von
Rezeptortyrosinkinasen (Pandey et al., 1995), die über die Rezeptorbindung an
benachbarten Zellen an einer bidirektionalen Signalweiterleitung beteiligt sind. Neben
der durch die Ligandenbindung ausgelösten Autophosphorylierung des Rezeptors,
welche die Signalkaskade in der rezeptortragenden Zelle initiiert, wird auch der Ligand
in Folge der Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung phosphoryliert (Brückner et al.,
1997). Somit wird ebenfalls in der ligandentragenden Zelle eine Signalweiterleitung
erzeugt (Davy and Robbins, 2000; Holland et al., 1996). Das Ephrinrezeptor-EphrinSystem reguliert somit u. a. über Zell-Zell-Signale bei der Entwicklung auftretende
Zellmigrationsprozesse (Holder and Klein, 1999). Zusätzlich konnte erst kürzlich auch
ihre Beteiligung bei dem Vorgang der Zelladhäsion nachgewiesen werden.
Aufgrund der geringen Größe der extrazellulären Domäne des Transmembranproteins
ist eine direkte Ligandenbindung an diesen Proteinbereich unwahrscheinlich. Daher
scheint die Beteiligung von kovalent an die extrazelluläre Domäne gebundenen
Oligosacchariden an der Ligandenbindung als sehr wahrscheinlich. Das gehäufte
Vorkommen von potenziellen N- und O-Glycosylierungstellen sowie die hohe
Ähnlichkeit der vorhergesagten O-Glycosylierungstellen (Pos. 13-16) zu einem Teil der
stark O-glycosylierten, extrazellulären Domäne von Episialin aus Maus (Q02496)
unterstützen diese Vermutung.
Keine Beweis für die Existenz der cytosolischen Isoform SP 83.5
Anders als im Fall von TMP 83.5 war es für den Nachweis des von Bangsow, 1997
postulierten und sich vom Transkript sp 83.5 ableitenden löslichen Proteins SP 83.5
nicht möglich, ein spezifisches Immunserum zu erhalten, da das 46 AS lange Protein
identisch mit dem C-terminalen Ende des Transmembranproteins ist. Daher wurde
hierfür das gegen beide Proteinformen gerichtete Peptid AO2-spezifische Serum
verwendet.
Diskussion
161
Da bei Strukturanalysen der Primärsequenz (5.1.2) keine potenziellen MembrandomänBereiche identifiziert werden konnten und auch die Untersuchung auf abspaltbare
Signalsequenzen, wie sie für sekretorische Proteine charakteristisch sind, zu keinem
positiven Ergebnis führte, scheint es sich bei SP 83.5 um ein cytosolisches Protein von
ca. 6 kDa zu handeln. Dementsprechend wurden die Western-Blot-Analysen zum
Nachweis der löslichen Proteinform mit der cytosolischen Fraktion von
Gehirnaufschlüssen durchgeführt (5.4.1) Dabei zeigte sich jedoch, dass das
hypothetische Protein SP 83.5 weder in der Rohfraktion noch in einer mittels
Ultrafiltration konzentrierten Fraktion von Proteinen kleiner Molmasse mit dem AO2spezifischen Antiserum im Western Blot nachzuweisen war. Dieses negative Ergebnis
ist jedoch kein Beweis dafür, dass die lösliche Isoform im Schweinegehirn tatsächlich
nicht vorkommt, da eine Reihe weiterer Erklärungsansätze für diese Beobachtung
denkbar sind:
a) Das Protein SP 83.5 ist zwar in geringer Konzentration im Rohaufschluss
enthalten, geht aber im Verlauf des Konzentrierungsverfahren durch Adsorption
an die verwendeten Filtermembranen verloren.
b) Das Protein ist lediglich in Western Blot-Analysen nicht nachweisbar, da es
möglicherweise unter den Gelelektrophoresebedingungen strukturell verändert
vorliegt. Eine erfolgreiche Verwendung des spezifischen Immunserums für
Immunaffinitätschromatographien wäre demzufolge nicht auszuschließen.
c) Der isolierte Antikörper erkennt zwar mit hohem Titer das zur Immunisierung
verwendete Peptid AO2, nicht aber das native Protein SP 83.5.
d) Die Expression des hypothetische Proteins SP 83.5 ist strikt reguliert, so dass es
nur temporär im Schweinegehirn gebildet und daher im verwendeten
Schlachthofgewebe grundsätzlich nicht nachzuweisen ist.
Um die möglichen Ursachen für den beobachteten Nichtnachweis systematisch
einzuschränken, wurden daher zunächst die AO2-spezifischen IgGs isoliert (5.4.2.2)
und an Agarose immobilisiert (5.4.2.3). Mit der so erhaltenen Immunaffinitätssäule
wurde anschließend versucht, SP 83.5 aus Rohgehirnfraktionen zu isolieren (5.4.2.4).
Da auch diese Versuche erfolglos blieben, scheint somit weder der Verlust an Protein
während der Konzentrierung noch eventuelle strukturändernde Bedingungen in der
Gelelektrophorese als Erklärungsmöglichkeiten in Betracht zu kommen.
Diskussion
162
Anschließend wurden Western Blot-Analysen von solubilisierten Membranfraktionen
des Schweinegehirns durchgeführt (5.4.2.4). Da die Peptidsequenz AO2 auch im
membranständigen Protein TMP 83.5 enthalten ist und dessen Existenz bereits mit Hilfe
des AO1-spezifischen Immunserums in der Membranfraktion bewiesen wurde, konnten
diese Analysen somit als Nachweis für die Spezifität des Serums dienen. Da das Protein
SP 83.5 außerdem am Glycin in Pos. 2 eine potenzielle Myristylisierungsstelle aufweist
(Towler et al., 1988), sollte mit diesem Experiment darüber hinaus geklärt werden, ob
sich das Protein SP 83.5 aufgrund einer möglichen Acylierung an dieser Stelle vielleicht
in der Membranfraktion von Gehirnaufschlüssen befindet. Da bei diesen Western BlotAnalysen jedoch weder das lösliche Protein SP 83.5 noch das membranständige TMP
83.5 identifiziert werden konnte, scheint es somit sehr wahrscheinlich, dass die AO2spezifischen IgGs nicht in der Lage sind, die nativen Proteine zu erkennen.
Gründe für das Nichterkennen der nativen Proteinformen könnten sowohl strukturelle
Ursachen besitzen als auch durch mögliche Phosphorylierungen des Proteins innerhalb
der Peptidsequenz bedingt sein. Da sowohl bei Sequenzrecherchen in der
Motivdatenbank Prosite als auch unter Verwendung des PhosphorylierungsvorhersageProgramms NetPhos (Blom et al., 1999) drei potenzielle Phophorylierungstellen
innerhalb der AS-Sequenz des Proteins SP 83.5, zwei davon im Bereich der
Peptidsequenz AO2, identifiziert wurden, könnte somit eine Phophorylierung des
nativen Proteins an diesen Stellen für das Versagen des AO2-spezifischen Antiserums
verantwortlich zu sein.
H2NP
P
P
|
|
|
H2N- *
H2N-MGAEEAHIYVKTVSGSQEPMRDTYRPAVEMERRRGLWWLIPRLSLE-COOH
Abb. 6.3 AS-Sequenz des löslichen Proteins SP 83.5 mit potenziellen Modifikationen.
rot: AO2-Peptidsequenz
Gezeigt sind die potenziellen Phophorylierungsstellen, die mit dem Programm NetPhos
innerhalb der AS-Sequenz von SP 83.5 vorhergesagt wurden. Aufgrund des bekannten
Phophorylierungsmotivs kann die zweite Phophorylierungsstelle (P) als potenzielle
Proteinkinase C-Akzeptorseite deklariert werden. (*) Potenzielle Myristylisierungsstelle des
Proteins SP 83.5.
Aufgrund der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente konnte somit die
Existenz der cytosolischen Isoform SP 83.5 im Schweinegehirn nicht nachgewiesen
werden. Wie oben ausgeführt ist dadurch allerdings noch nicht bewiesen, dass diese
Proteinform tatsächlich nicht gebildet wird.
Die daher notwendigen weiteren Versuche zur Identifizierung könnten auf der
Verwendung eines gegen beide Proteinisoformen gerichteten polyklonalen
Diskussion
163
Immunserums (May, 1999) basieren, das aufgrund vorläufiger Ergebnisse (5.4.2.4)
erfolgversprechend erscheint. Allerdings könnte sich eine Isolierung aus
Schlachthofgewebe auch unter Verwendung eines spezifischeren Immunserums als
äußerst schwierig erweisen, falls dieses Protein tatsächlich nur temporär gebildet wird.
Daher wäre es weiterhin von Vorteil, wenn zusätzlich Schweinegehirn aus anderen
Quellen untersucht werden könnte.
Neuronen, der zelluläre Bildungsort der Genprodukte tmp und sp 83.5
Die zu Beginn dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse wiesen zwar auf eine
gehirnspezifische Bildung der Transkripte tmp und sp 83.5 hin, jedoch war über deren
genaues zelluläres Vorkommen noch keinerlei Anhaltspunkt vorhanden.
Deshalb sollte im Rahmen dieser Arbeit der zelluläre Nachweis beider Transkripte im
Schweinegehirn mittels in situ-Hybridisierungen erfolgen, wodurch mRNA-Sequenzen
direkt im Zellverband des Gewebes nachgewiesen werden können.
Unter Verwendung von transkriptspezifischen Oligonukleotid-Sonden durchgeführte in
situ-Hybridisierungsexperimente waren aufgrund schwacher Färbungen allerdings nur
schwer auswertbar und daher wenig aussagekräftig (5.5.2). Im Gegensatz dazu konnten
in situ-Hybridisierungen mit unterschiedlichen antisense-cRNA-Sonden (5.5.1.1), die
komplementär zu identischen Bereichen beider Transkripte waren, erstmals eindeutig
Neuronen als Bildungsort der mRNA-Sequenzen tmp und sp 83.5 ausweisen (5.5.1.2).
Die als Negativkontrolle an Kleinhirn- und Cortexschnitten des Schweinegehirns
durchgeführten in situ-Hybridisierungen mit sense-Sonden führten lediglich zu diffusen
Hintergrundfärbungen, so dass die Ergebnisse mit den entsprechenden antisense-Sonden
als spezifisch beurteilt werden können. Für eine Detektion der 83.5-Transkripte in
Gewebeschnitten des Schweinehirns spricht außerdem, dass zwei zu unterschiedlichen
Sequenzbereichen komplementäre antisense-Sonden zu vergleichbaren in situHybridisierungsergebnissen führten.
Die in situ-Hybridisierungen mit den antisense-Sonden zeigten deutlich eine intensive
Färbung neuronaler Zellen in den Schweinegehirnschnitten der Kleinhirn- und
Großhirnrinde (5.5.1.2). Dabei ist in Cerebellumschnitten eine besonders intensive
Färbung des Stratum granulosum, sowie die Anfärbung von Neuronen des zellärmeren
Stratum moleculare sichtbar. Zusätzlich wurden Purkinjezellen des Stratum gangliosum
angefärbt, die die Grenze zwischen der intensiv gefärbten Körnerschicht und der
Molekularschicht bilden. Bei den in der Molekularschicht angefärbten Nervenzellen
unterschiedlicher Größe und Form könnte es sich um Korb- bzw. Sternzellen handeln,
Diskussion
164
die in dieser Rindenschicht des Kleinhirns zu finden sind. Auch in den
Neocortexschnitten ist eine deutliche Färbung der Neuronen in den unterschiedlichsten
Schichten der Großhirnrinde sichtbar. Eine besonders intensive Zellfärbung ist dabei im
Bereich der äußeren Körner- und Pyramidenschicht zu beobachten. So sind in der sehr
zellreichen äußeren Körnerschicht, die hauptsächlich aus dicht gepackten, kleinen
Pyramidenzellen und Sternzellen besteht, sowohl runde als auch kleine
pyramidenförmige Zellkörper positiv gefärbt. Während in der sich der Pia mater
anschließenden Molekularschicht nur vereinzelt Zellen angefärbt wurden, lassen sich in
der dritten Zellschicht, der äußeren Pyramidenzellschicht, vor allem größere, neuronale
Zellen dreieckiger Form neben eher runden Neuronen erkennen.
Die auf diese Weise erstmals detektierten 83.5-positiven Neuronen verdeutlichen somit,
dass die Transkripte des Gens 83.5 in den verschiedenen Neuronentypen des
Schweinegehirns exprimiert werden. Da weder in den Kleinhirn- noch in den
Neocortex-Schnitten kapillarähnliche Strukturen angefärbt werden konnten, ist eine
Lokalisation der Transkripte tmp und sp 83.5 in Hirnkapillarendothelzellen dagegen
definitiv auszuschließen. Die ursprüngliche Isolierung von Teilen des sp 83.5Transkripts aus Hirnkapillarendothelzellen lässt sich dadurch erklären, dass
entsprechend der damaligen Präparationsmöglichkeiten offenbar nicht nur
Hirnkapillarendothelzellen, sondern darüber hinaus auch mit den Kapillaren assoziierte
Neuronen isoliert wurden.
Schließlich decken sich diese Ergebnisse vollständig mit den später von May, 1999
unter
Verwendung
des
polyklonalen
Antiserums
93
durchgeführten
Immunfluoreszenzuntersuchungen an Schweinegehirnschnitten, die den Nachweis der
Proteine TMP und SP 83.5 in Neuronen aller Schichten der Kleinhirn- sowie
Großhirnrinde ergaben.
TMP 83.5, ein universelles Transmembranprotein des Säugetiergehirns?
Sequenzuntersuchungen ergaben eine hohe Ähnlichkeit des Transkripts tmp 83.5 zu
expressed sequence tags (ESTs) aus anderen Säugetierorganismen und wiesen somit auf
das Vorkommen des Proteins TMP 83.5 in diesen Spezies hin. Hierbei handelt es sich
beispielsweise um einen aus Mausgehirn isolierten, 603 nt langen EST (AU035253
Sugano mouse brain mncb), der ab Position 69 eine Ähnlichkeit von 82-91 % zum
Transkript tmp 83.5 aus Schwein aufweist. Die hohe Ähnlichkeit bezieht sich dabei
hauptsächlich auf den kodierenden Bereich von tmp 83.5. Die Existenz des
Maustranskripts konnte außerdem durch die Isolierung eines weiteren Mausklons
Diskussion
165
(BE651315) aus einer subtraktiven cDNA-Bank aus Mäusegehirn (Bonaldo et al., 1996)
bestätigt werden. Es zeigte sich jedoch, dass das aus der Nukleotidsequenz abgeleitete
Protein im zweiten Klon 4 AS kürzer ist als das des Sugano mouse-Klons. Die
unterschiedlich auftretenden STOP-Codons könnten dabei auf Sequenzierfehler oder
Mutationen, die während der Herstellung der cDNA-Bank entstanden sind,
zurückzuführen sein. Trotz dieses Unterschiedes zeigen beide ESTs, dass ein tmp 83.5ähnliches Transkript im Mausgehirn gebildet wird und dass das darin kodierte Protein
das homologe Protein TMP 83.5 in Maus repräsentiert (Abb.6.5).
Das Vorkommen des Transkript tmp 83.5 im menschlichen Gehirn konnte schließlich
sowohl über ein EST-Sequenzierprojekt (Neto et al., 2000) als auch durch die
Entschlüsselung des humanen Genoms bestätigt werden. Schon die Isolierung eines
446 nt langen ESTs aus humanen Nervengewebe (BF365005), der fast den gesamten
kodierenden Bereich der cDNA tmp 83.5 mit einer Übereinstimmung von 81 %
abdeckt, wies darauf hin, dass auch im menschlichen Gehirn ein TMP 83.5-homologes
Protein zu finden ist. Doch erst durch die Entschlüsselung des humanen Genoms, dass
die Veröffentlichung des vollständigen humanen Transkripts tmp 83.5 (XM 05099) zur
Folge hatte, wurde dessen hohe Konservierung im Vergleich zum Schweinetranskript
tmp 83.5 bzw. zum darin kodierten Protein TMP 83.5 deutlich.
Auf DNA-Ebene weisen beide Transkripte über weite Teile eine Sequenzidentität von
77 bis 81 % auf. Die höchste Identität erstreckt sich dabei über den kodierenden Bereich
beider Transkripte, der über 725 bp (tmp 83.5: 499-1219; htmp 83.5: 60-719) eine
81 %ige Sequenzidentität besitzt (Abb. 6.4). In diesem Bereich fehlen dem humanen
Transkript 3 Nukleotide (1 Codon). Aus dieser AS-Deletion resultiert das um eine AS
verkürzte humane Protein TMP 83.5 (hTMP 83.5) mit 141 AS (XP05099). Der sich
daran anschließende Sequenzbereich (tmp 83.5: 1271-1426; htmp 83.5: 767-925) ist zu
77 % identisch. Die nächsten Sequenzidentitäten können erst wieder im
nichttranslatierten 3'-Bereich beider Transkripte identifiziert werden. Ab der Pos. 2214
(tmp 83.5) sind beide Sequenzen über 200 bp zu 76 % identisch, wobei zu bemerken ist,
dass dieser Bereich im humanen Transkript weiter in 3'-Richtung (Pos. 2786-2886) liegt
als ein linearer Abgleich beider Transkripte ergeben würde. Die zweithöchste
Sequenzidentität ergibt sich für das 200 bp lange 3'-Ende beider Transkripte (79 %). Zur
Verdeutlichung der hohen Sequenzähnlichkeit beider Transkripte ist in Abb. 6.4
exemplarisch ein Sequenzabgleich über den proteinkodierenden Bereich mit einer
Sequenzidentität von 81 % dargestellt.
Diskussion
166
499 acaaatgcaagacacacgccaacaacaccagcaagaaaggagcttgccaagggcagtgtt 558
||||||| |||||||| ||||| || |||| |||||||||||| |||| ||||||||
1 acaaatgaaagacacaagccaataaagccagtgagaaaggagcttaccaaaggcagtgta 60
559 tggagaaggctcctgggaggctgtcggaaatgagtttttcactgaacttcacgctccccg 618
| |||||| ||||||||| ||||| |||||||||||||||||||||||||| || || |
61 cgaagaaggttcctgggagactgtcagaaatgagtttttcactgaacttcaccctgccgg 120
619 ccaacacaacgtcctccccagttgttaccagtggaaaaggagcggactgtgggccctctc 678
| |||||||||||||| ||
||| || |||| |||| | ||||||||||||||||||
121 cgaacacaacgtcctctcc---tgtcacaggtgggaaagaaacggactgtgggccctctc 177
679 tgggattagcagcaggcatcccatccctggtggccacagccctgctggtggccttactgt 738
| |||||||| || ||||| |||| |||||||||||||||||||||||||| ||||| |
178 ttggattagcggcgggcataccattgctggtggccacagccctgctggtggctttactat 237
739 tgattctgattcaccgcagaagaagaagcagcgaatccaccgaggaaatcgagaggcctt 798
| | | |||||||||| |||||||| |||| || ||| ||||||| || || || |
238 ttactttgattcaccgaagaagaagcagcattgaggccatggaggaaagtgacagaccat 297
799 gtgaaatttcagaaatctatgacaatcccagggtagctgagaatcctaggaggtcaccca 858
|||||||||||||||| |||||||||||| | || |||||||||||||||| |||||||
298 gtgaaatttcagaaattgatgacaatcccaagatatctgagaatcctaggagatcaccca 357
859 cacatgagaagaacataatgggagcagaagaagcccacatatacgtgaagacggtatcag 918
||||||||||||| | ||||||||| |||| ||||||||||| |||||||| ||| |||
358 cacatgagaagaatacgatgggagcacaagaggcccacatatatgtgaagactgtagcag 417
919 gcagccaggagcccatgcgtgacacgtaccgtcctgccgtggaaatggagagaaggaggg 978
| ||| |||| || ||| ||||
||||||||| | | |||||||| ||||||||||
418 gaagcgaggaacctgtgcatgaccgttaccgtcctactatagaaatggaaagaaggaggg 477
979 gactgtggtggcttattcccagactgagcctggagtgatgcagcccagccaagg---agc 1035
|| ||||||||||| | ||||||||||||||||| ||||||||| ||| |||||
|||
478 gattgtggtggcttgtgcccagactgagcctggaatgatgcagctcagtcaaggagcagc 537
1036 agatccggggctggaacagagctaaacacacaggcctttgcacttggagtgaggagagac 1095
||| | || ||||||||| | | || || ||| |||| ||||||| ||||| |||
538 agacctggcactggaacagggttgaaaaccaagggttttgtacttgga--gaggaaagat 595
Abb. 6.4 Sequenzvergleich der Transkripte tmp 83.5 und htmp 83.5.
Der proteinkodierende Bereich des Transkripts tmp 83.5 aus Schwein wurde mit dem des
humanen Transkripts (htmp 83.5) verglichen. Dabei ergab sich eine Sequenzidentität von über
81 % für diesen Sequenzbereich. Die Deletion von 3 hintereinander liegenden Nukleotiden im
kodierenden Bereich führt zur einer AS-Deletion im humanen Protein hTMP 83.5. Der
proteinkodierende Bereich beider Transkripte ist durch Start- (rot) und Stopp-Codon (blau)
hervorgehoben.
Noch deutlicher zeigt sich die hohe Ähnlichkeit zwischen den beiden Transkripten
allerdings in den von ihnen kodierten Proteinsequenzen. Der in Abb. 6.5 dargestellte
AS-Sequenzvergleich zwischen dem Schweineprotein und dem humanen Protein
demonstriert, dass diese fast identisch miteinander sind (Identität: 86 %). Dadurch wird
deutlich, dass die meisten Nukleotidaustausche im humanen Transkript als konservativ
betrachtet werden können, da sie nicht zu einer Änderung des AS-kodierenden Codons
geführt haben.
Diskussion
167
6.5 Vergleich der AS-Sequenz TMP 83.5 aus Schwein mit dem homologen Proteinen aus
Mensch und Maus.
In der ersten Reihe ist die 142 AS lange TMP 83.5-Sequenz dargestellt, darunter die des 141 AS
langen homologen Proteins aus Mensch sowie des homologen Proteins aus Maus (123 AS). Die
4. Reihe repräsentiert die sich aus dem Vergleich ergebende Konsensus-Sequenz.
Zum Vergleich wurde in Abb. 6.5 zusätzlich die AS-Sequenz des aus dem Sugano
mouse-Klon abgeleiteten Proteins aufgeführt. Alle drei Sequenzen zeichnen sich durch
eine fast identische Membrandomäne mit dem sich daran anschließenden Cluster positiv
geladener Aminosäuren aus. Während das Protein aus Schwein und Mensch auch im
cytosolischen Bereich bis auf einige AS-Austausche nahezu identisch ist, zeigt auch die
verkürzte cytosolische Domäne des Mausproteins noch hoch konservierte Bereiche
(Pos. 70-93 und 100-115).
Schließlich ermöglichte die auf der Entschlüsselung der humanen Genomsequenz
basierende sequenzielle Chromosomenkartierung die Detektion des tmp 83.5-bildenden
Gens 83.5 auf Chromosom 10. Dort ist es im Bereich 10q24 lokalisiert, der eine
Vielzahl an Genen enthält, die an fundamentalen biologischen Prozessen beteiligt sind
(Gray et al., 1997). Außerdem konnten bereits zahlreiche ESTs diesem
Chromosomenabschnitt zugeordnet werden (Deloukas et al., 1999), von denen viele
gehirnspezifisch gebildet werden (Nobile et al., 1998). Desweiteren sind einige
neuronalen Fehlfunktionen mit diesem Chromosomenabschnitt assoziiert. So stehen
z. B. die vererbbare Form der partiellen Epilepsie (Ottman et al., 1995) sowie der
spastischen Paraparesis (Seri et al., 1999) mit diesem Genbereich in Zusammenhang.
Diskussion
168
Der hohe Konservierungsgrad des Proteins TMP 83.5 in den Organismen Schwein,
Mensch und Maus sowie die sich aus den in situ-Hybridisierungen an Schweinegehirnschnitten ergebende Lokalisation des Transkripts tmp 83.5 in den
unterschiedlichsten Neuronentypen des Klein– und Großhirns weisen auf eine
grundlegende Funktion dieses Proteins in den Nervenzellen des Säugetierorgansimus
hin.
Nicht zuletzt durch den möglichen Zusammenhang mit neuronalen Fehlfunktionen
erscheint die weitere Charakterisierung dieses Proteins als ein interessantes, zukünftiges
Forschungsfeld.
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Anhang
8
185
Anhang
cDNA-Sequenz des Transkripts tmp 83.5 (Accession-No. X89480)
>gi|1843452|emb|X89480.1|SSRNAMEMP S.scrofa mRNA for membrane protein
TGCATTCAAGGGCGTGCACTCTCCGTGGCAGCTATAGCCGTGCCTCCAACACAGAGCAGGCTGCACCCCC
CACCTCCAAGGCTTCCTACATCGACACAGGTAATGTGTTGACTCCATCACTGCGGGATGGTGGGCAGTGC
CACTGCCTGGCAGCTGGGGATGGAGTGGCCAACTAAGCCTCACTTCGCCTGTGTAACCCATTGTCTCTAA
AGAGCAGCTGGCTGCAGAAGCCACCAAGGTCTCGGGCCAGCTGTGGGCTCTTTGCTGAGATGAAGGGGTA
ACCATGGAAGAGGCTTGAAAAGTCAATAAGGACCAAAAATGACTGCGAAGTGGTTAGATGACCCGGGGCC
TTCCATGGTGGCCATGACACAGGAGACCTTCTTCCCCGGGGGCTGGGCCAAAGACTCAGCTACTCCCCTG
ACCATAAATGGCTTGGCCAGCATTCTCTTGGAGCCACCTCTTGCTCTGTCACCCTTGCTCTCCCAGCTGG
ATGGTCCTACAAATGCAAGACACACGCCAACAACACCAGCAAGAAAGGAGCTTGCCAAGGGCAGTGTTTG
GAGAAGGCTCCTGGGAGGCTGTCGGAAATGAGTTTTTCACTGAACTTCACGCTCCCCGCCAACACAACGT
CCTCCCCAGTTGTTACCAGTGGAAAAGGAGCGGACTGTGGGCCCTCTCTGGGATTAGCAGCAGGCATCCC
ATCCCTGGTGGCCACAGCCCTGCTGGTGGCCTTACTGTTGATTCTGATTCACCGCAGAAGAAGAAGCAGC
GAATCCACCGAGGAAATCGAGAGGCCTTGTGAAATTTCAGAAATCTATGACAATCCCAGGGTAGCTGAGA
ATCCTAGGAGGTCACCCACACATGAGAAGAACATAATGGGAGCAGAAGAAGCCCACATATACGTGAAGAC
GGTATCAGGCAGCCAGGAGCCCATGCGTGACACGTACCGTCCTGCCGTGGAAATGGAGAGAAGGAGGGGA
CTGTGGTGGCTTATTCCCAGACTGAGCCTGGAGTGATGCAGCCCAGCCAAGGAGCAGATCCGGGGCTGGA
ACAGAGCTAAACACACAGGCCTTTGCACTTGGAGTGAGGAGAGACGCCAAGCTGCTTCTTAACCAGTCCA
AATTTCATTTGCAGATCTGGAAAAGTTTCAAGTTGATTTTTCTCTTTAGGGGACTGATCTGATAAAGTGC
ATTCCGACTCTCAGATCTTGGGGTTTAGTGCAATGAATTCATTGTGCTTCCAAAGGGAGCCCTCGGATCC
TGTCCTTGAGCCCAGTGACAACTTGCTTTTCTTGGTGACTGGGCGAAAGGGGTTTGATTTCTCGGTGACT
GGCCTCCTGATCTTTTTTCACATCCATTTTCTCAAAAGAGCCATCAGACCTGGCTGCCATGGGAGGGTGG
CCAAGGCTAGCATGGTGCAAGCTGGGCTGGGCTATACAGGGCATGTGTGAGGAGAAGAAGTTCCTTATCT
TTGAACCACTCGGGGCAGAAATCACAAGGAGCCACATGTTCCCCAATCACAGGGGCAGCACGTGCGTGCG
CATTCACCACGCCCACTTGTGATTGGGGGCATCCAAGGAAGGCAGTTCTGCAGTGGGCTCTGTGTGTGTG
TGCTGAAGATAAACAGTGTGGAGGGAAGGCAGAGGTTGTTTCAAAAGGTCATTAGCAATGAGGACTATAC
CTGTTTTTGTGGGAGTGGAGAGAAAGGCTCAAGTCCTGGAACGGTCATGGGGAGAAACTCACTAGGAGGA
AGCGAGATCAAGAGGCTCTGAGTGGCTGAGGGCCTAAGGGATGGGCCCTGTGACTGTCCTTGTGTCACAC
TGTGACTGTCAGTAGCATTGAAGCATTGTGATTGTCATCTGAGGGGAGCTGGTGCACAGAGGCAGCTGGT
CCAGGGATGCCTTTGCCATCACTTCTGTGAGGAGGCTAAGGGGAGTCCCCCTGTGCAGGCCCATCGTCCT
CCTGATGAGAGAGCCCGGGTCCAGGGCATCGGGGGGTTCACCCACCAGCTCCCTGGGCCACCTTGATAAG
CTGTGGAAACAGTCCTCACAAAGGGCCCCTGATTGCTCAGAAACACACCTCCTCTTCTTCAAATAGCCAA
GGACAGGTTCTACAAACCCACTCACTGCCACGTACCAGCACGCTCCCTTCAAAGCTCCTTGTGACATTCA
GTTTTGCGCTAAGTCCACTAGATCCCGTCACCTAACAAGCATATTTTAAGCAGACGTGCACAGTGACCCG
GATACTTGTGCTTATCTTACATATTGGGGAGGACTTTGGATTTGCTGAGAACATGACGGTGGCCTTGGCT
TTGAGGCTCAGGTGTGAGTTCTGGGGCAGATCAAGGGTCTGAGCTCTGTATGTGCAGAATGGAGAGCGCT
GTTTTCGTCCTCCTACCCTTAGGGCTGTTGTGAGTCCCAACAGAAATATGCGCAGGTGATGATAAGTCTT
GTGGTCTATAGAGTAAGGTGTGACTTGTATTTTTGGACCATTCATTTTAATTCTACTTACAGGCCGTTGC
TTAGTATCTTTATTTGAAATGGTTTCTACTAAACTAGCAAGATTCAGTATTTCTGTCACTTTTTTTTCCT
GCTCTGATGCACAAAAACTTATTTTGGAATAAAGTGGAAAGTAAAATGGCCATTCTTGTGGACCTCAAAA
AAAAAAAAAAAAAA
Anhang
186
cDNA-Sequenz des Transkripts sp 83.5 (Accession-No. Y11026)
GTTCCCAGGCTAGGGGTCTAATCAGAGATGTAGACACCGGCCTACACCAGAGCCACAGCAATGCGGGATC
CGAGCTGCATCTGCGACCTACACCACAGCTCATGGCAACGCTGGATCCTTAACCCACTGAGTGAGGCCAG
GGATTGAACCTGCCACCACATGGTTCCTAGTCGGATTCGTTAACCACTGAGCCACGACGGGAACTCCATC
TGTTGTTTTTTTAATAGAAAGTTTGGCAAAGGGATACACTTTAGGCACCATACCCTAACCTTGCACAGAC
TGTCTCATAGGATGCGCATTCTACAGATTTTGGTTTTTTAAAGATGTGTATTCTTTTTCCACACAGACGT
CCTCCCCAGTTGTTACCAGTGGAAAAGGAGCGGACTGTGGGCCCTCTCTGGGATTAGCAGCAGGCATCCC
ATCCCTGGTGGCCACAGCCCTGCTGGTGGCCTTACTGTTGATTCTGATTCACCGCAGAAGAAGAAGCAGC
GAATCCACCGAGGAAATCGAGAGGCCTTGTGAAATTTCAGAAATCTATGACAATCCCAGGGTAGCTGAGA
ATCCTAGGAGGTCACCCACACATGAGAAGAACATAATGGGAGCAGAAGAAGCCCACATATACGTGAAGAC
GGTATCAGGCAGCCAGGAGCCCATGCGTGACACGTACCGTCCTGCCGTGGAAATGGAGAGAAGGAGGGGA
CTGTGGTGGCTTATTCCCAGACTGAGCCTGGAGTGATGCAGCCCAGCCAAGGAGCAGATCCGGGGCTGGA
ACAGAGCTAAACACACAGGCCTTTGCACTTGGAGTGAGGAGAGACGCCAAGCTGCTTCTTAACCAGTCCA
AATTTCATTTGCAGATCTGGAAAAGTTTCAAGTTGATTTTTCTCTTTAGGGGACTGATCTGATAAAGTGC
ATTCCGACTCTCAGATCTTGGGGTTTAGTGCAATGAACTCATTGTGCTTCCAAAGGGAGCCCTCGGATCC
TGTCCTTGAGCCCAGTGGGAACTTGCTTTTCTTGGTGACTGGGCGAAAGGGGTTTGATTTCTCGGTGACT
GGCCTCCTGATCTTTTTTCACACCCATTTTCTCAAAAGAGCCATCAGACCTGGCTGCCATGGGAGGGTGG
CCAAGGCTAGCATGGTGCAAGCTGGGCTGGGCTATACAGGGCATGTGTGAGGAGAAGAAGTTCCTTATCT
TTGAACCACTCGGGGCAGAAATCACAAGGAGCCACATGTTCCCCAATCACAGGGGCAGCACGTGGCTGCG
CATTCACCACGCCCACTTGTGATCGGGGGCATCCAAGGAAGGCAGTTCTGCAGTGGGCTCTGTGTGTGTG
TGCTGAAGATAAACAGTGTGGAGGGAAGGCAGAGGTTGTTTCAAAAGGTCATTAGCAATGAGGACTATAC
CCGTTTTTGTGGGAGTGGAGAGAAAGGCTCAAGTCCTGGAACGGTCATGGGGAGAAATTCACTAAGAGGA
AGCGAGATCAAGAGGCTCTGAGTGGCTGAGGGCCAAAGGGATGGGCCCTGTGACTGTCCTTGTGTCACAT
TGTGACTGTCAGTAGCATTGAAGCATTGTGATTGTCATCTGAGGGGAGCTGGTGCACAGAGGCAGCTGGT
CCGGGGATGCCTTTGCCATCACTTCTGTGAGGAGGCTAAGGGGAGTCCCCCTGTGCAGGCCCATCGTCCT
CCTGATGAGAGAGCCCGGGTCCAGGGCATCCTGGGGTTCACCCACCAGCTCCCTGGGCCACCTTGATAAG
CTGTGGAAACAGTCCTCACAAAGGGCCCCTGATTGCTCAGAAACACACCTCCTCTTCTTCAAATAGCCAA
GGACAGGTTCTACAAACCCACTCACTGCCACGTACCAGCACGCTCCCTTCAAAGCTCCTTGTGACATTCA
GTTTTGTGCTAAGTCCACTAGATCCCGTCACCTAACAAGCAGATTTAAGCAGACGTGCCCAGTGACCCGG
ATACTTGTGCTTATCTTACATATTGGGGAGGACTTTGGATTTGCTGAGAACATGACGGTGGCCTTGGCTT
TGAGGCTCAGGTGTGAGTTCTGGGGCAGATCAAGGGTCTGAGCTCTGTATGTGTAGAATGGAGAGCACTG
TTTTCATCCTCCTACCCTTAGGGCTGTTGTGAGTCCCAACAGAAATATGCGCAGGTGATGATAAGTCTTG
TGGTCTATAGAGTAAGGTGTGACTTGTATTTTTGGACCATTCATTTTAATTCTACTTACAGGCCGTTTCT
TAGTATCTTTATTTGAAATGGTTTCTACTAAACTAGCAAGATTCAGTATTTCTGTCACTTTTTTTTCCTG
CTCTGATGCACAAAAACTTATTTTGGAATAAAGTGGAAAGTAAAATGGCCATTCTTGTGGACCT
Anhang
187
Abkürzungen
% (v/v)
% (w/v)
A
Abb.
ABTS
aP
APS
AS
ATP
Axxx
BCA
BCIP
bp
BSA
C
cDNA
Ci
cRNA
CSPD
DEPC
DMF
DNA
dNTP
E. coli
E-64
EDTA
ELISA
EST
G
GFAP
h
hTMP 83.5
htmp 83.5
IgG
IPTG
kb
kDa
LB
MHC
min
mRNA
NBT
Volumenprozent
Massenprozent pro Volumeneinheit
Adenosin
Abbildung
2.2’-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolinsulfonat(6))
alkalische Phosphatase
Ammoniumperoxodisulfat
Aminosäure
Adenosin-5‘-triphosphat
Absorption bei angegebener Wellenlänge xxx
Bicinchoninsäure
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat-p-toluidinsalz
Basenpaar
Rinderserumalbumin
Cytosin
copy-DNA
Curie
copy RNA
3-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetan-3,2'-(5'
chloro)tricyclo[3.3.1.13,7]decan}-4-yl)
Phenylphosphat, Dinatriumsalz
Diethylpyrrocarbonat
N,N-Dimethylformamid
Desoxyribonukleinsäure
2‘-Desoxyribonukleosid-5‘-triphosphat
Escherichia coli
L-trans-Epoxysuccinyl-leucylamido-(4-guanidino)butan
Ethylendiamin-N,N,N‘,N‘-tetraacetat
Enzyme linked Immunosorbent Essay
expressed sequence tag
Guanosin
Glial fibrillary acid protein
Stunde
humanes Protein TMP 83.5
humanes Transkript tmp 83.5
Immunglobulin G
Isopropyl-1-thio-ß-D-galactopyranosid
Kilobasen
Kilodalton
Luria-Bertani
Haupt-Histokompatibilitätskomplex
Minute
Boten-Ribonukleinsäure (messenger RNA)
p-Nitrotetrazoliumblauchlorid
Anhang
nt
OD
ODxxx
PAGE
PBS
PCR
POD
PVDF
RACE
RNA
RNase
rpm
RT-PCR
SDS
sp 83-5
SP 83-5
T
Tab.
Taq
TEMED
tmp 83-5
TMP 83-5
TM-Segment
Tris
U
UF
UV
X-Gal
188
Nukleotid
optische Dichte
optische Dichte bei angegebener Wellenlänge
Polyacrylamide gel electrophoresis
Phosphate Buffered Saline
Polymerase-Kettenreaktion
Peroxidase
Polyvinyldifluorid
Rapid amplification of cDNA ends
Ribonukleinsäure
Ribonuklease
Umdrehungen pro Minute (revolution per minute)
Reverse Transkriptase-PCR
Natriumdodecylsulfat
für die lösliche Proteinisoform SP 83.5 kodierendes
Transkript
lösliche Isoform des Proteins TMP 83-5
Thymin
Tabelle
Thermus aquaticus
N,N,N‘,N‘-tetramethylethylendiamin
für das Membranprotein TMP 83.5 kodierendes
Transkript
Transmembranprotein 83-5
Transmembran-Segment
Tri-(hydroxymethyl)-aminomethan
Unit, Einheit der Enzymaktivität
Ultrafiltration
Ultra-Violett
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid
Lebenslauf
Persönliche Daten
Angela Maria Oberthür, geb. Fischer
geboren am 13. Februar 1971 in Frankfurt am Main
verheiratet
Bildungsweg
1977-1981
Goethe-Grundschule, Offenbach
1981-1983
Förderstufe der Schillerschule, Offenbach
1983-1990
Albert-Schweitzer-Gymnasium, Offenbach
Juni 1990
Zeugnis der Allgemeinen Hochschulreife
10/1990-01/1996
Studium der Chemie an der Technischen Hochschule
Darmstadt
September 1992
Abschluss des Diplom-Vorexamens
Mai 1995
Diplom-Hauptexamen
07/1995-01/1996
Diplomarbeit unter Anleitung von Prof. Dr. H. G. Gassen:
„Charakterisierung weiterer Transkripte einer zu den „HeatShock“-Proteinen homologen Proteinkinase aus Schwein“,
ausgeführt am Institut für Biochemie der Technischen
Universität Darmstadt
Februar 1996
Beginn der Promotion am Institut für Biochemie der
Technischen Universität Darmstadt unter Leitung von Prof. Dr.
H. G. Gassen
05/1997-12/1999
Promotionsstipendiatin des Landes Hessen
Angela Maria Oberthür
Darmstadt, 12. Dezember 2001
Alicenstr. 20a
64293 Darmstadt
Eidesstattliche Erklärung
Ich erkläre hiermit an Eides Statt, dass ich meine Dissertation selbständig und nur mit den
angegebenen Hilfsmitteln angefertigt habe.
Angela Oberthür
Darmstadt, 12. Dezember 2001
Alicenstr. 20a
64293 Darmstadt
Erklärung
Ich erkläre hiermit, noch keinen Promotionsversuch unternommen zu haben.