partieller Verdau mit Restriktionsenzymen
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Vorlesung LV-Nr. 954.104 Molekularbiologie für Agrarwissenschaften J. Glößl, SS 2007 Thematik: Molekularbiologische Methoden Teil 1 Die ppt Folien wurden freundlicherweise von Prof. Florian Rüker aus der Vorlesung „Einführung in die Molekularbiologie“, LV 954100, bereitgestellt Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 1 Biotechnologie vs. Gentechnik • In der Biotechnologie werden (Mikro)organismen selektiert und genutzt, die in der Lage sind, ein bestimmtes Produkt mit guter Effizienz zu synthetisieren. Stammverbesserung erfolgt durch Selektion bzw. Screening. Oft werden die Organismen einer mutagenen Behandlung unterworfen (chemisch, Bestrahlung). Die Herstellung der Produkte erfolgt meist durch Fermentation – Produktbeispiele: Alkohol, Antibiotika, Vitamine, Aminosäuren, Enzyme, ... • In der Gentechnik werden Veränderungen an isolierter DNA vorgenommen. Die neukombinierte oder mutierte DNA wird in eine Zelle eingebracht, die so mit neuen Eigenschaften ausgestattet wird. Der Austausch der genetischen Information ist möglich über Artgrenzen hinweg, zwischen Pflanzen- und Tierreich, zwischen Pro- und Eukaryonten – Produktbeispiele: Expression menschlicher genetischer Information in Bakterien, Hefen, Pflanzen, etc., z.B. Insulin, Wachstumshormon, Interferone, Interleukine, Antikörper, Erythropoietin, etc.. Zur Produktion werden in der Regel biotechnische Verfahren (Fermentation) eingesetzt • Gentechnik und Molekularbiologie werden oft synonym verwendet. Meist handelt es sich um eine Kombination gentechnischer, biotechnischer, biochemischer, mikrobiologischer und genetischer Verfahren Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 2 Eine einfache Klonierung Viele Fragen: •Warum will ich etwas klonieren? •Was mache ich mit dem klonierten Gen? •Woher kommt die "Fremd-DNA"? •Was ist ein Vektor und wozu brauche ich ihn? •Was für Vektoren habe ich zur Auswahl? •Wie bringe ich den Vektor in die Zellen hinein? •Wie finde ich den "richtigen" Klon? •Was mache ich dann damit? •Wie führe ich die einzelnen Schritte durch? •Was sind Restriktionsenzyme? •Was ist Ligase? •Brauche ich noch andere Enzyme? Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 3 Welche einzelnen Schritte muß ich bei einer Klonierung durchführen? • • • • • • • • • • Gewinnung der "Fremd"-DNA ("Insert") Auswahl eines geeigneten Vektors Präparation des Vektors (meist aus E. coli) Restriktionsverdau von Vektor und Insert Behandlung des Vektors mit Alkalischer Phosphatase Analyse der DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese Ligation Transformation Selektion Screening Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 4 Warum will ich etwas klonieren? • • • • um einen (Mikro)organismus besser zu charakterisieren um (Mikro)organismen untereinander zu vergleichen um ein neues Gen zu finden um ein Protein herzustellen (= zu exprimieren) Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 5 Was mache ich mit dem klonierten Gen? • • • • • • sequenzieren, um die Basenabfolge analysieren zu können (regulatorische Regionen, codierende Regionen, ...) mit anderen Genen vergleichen in einen anderen (Mikro)organismus einbringen, um dessen Eigenschaften zu veränden ausschalten, um die Bedeutung des Gens für den (Mikro)organismus zu untersuchen exprimieren, um das entsprechende Protein zu gewinnen verändern (= mutieren), um die Eigenschaften des mutierten Proteins zu untersuchen Query: 1 Sbjct: 1 agcttttctcttctgtcaaccccacacgcctttggcaca 39 |||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| agcttttctcttatgtcaaccccacacgcctttggcaca 39 Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 6 Restriktionsenzyme • Die Entdeckung und Nutzbarmachung der Restriktionsendonukleasen (kurz Restriktionsenzyme) und der Ligasen waren die Meilensteine, die die Entwicklung der Gentechnik möglich machten. • Die Restriktionsenzyme wurden entdeckt, als man untersuchte, wie sich Bakterien gegen Viren (Phagen) schützen. Sie zerschneiden die eindringende DNA der Viren. Ihre eigene DNA ist durch Methylierung an entsprechenden Stellen der DNA geschützt. Dafür besitzen die Bakterien ein entsprechendes Modifikationsenzym, das DNA an den Stellen methyliert, an denen das eigene Restriktionsenzym die DNA schneiden würde. • Mit den Restriktionsenzymen lassen sich DNA-Stücke gezielt an bestimmten Stellen spalten. • Ligasen sind Enzyme, die die zerschnittene DNA wieder zusammenfügen können. Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 7 Beispiele für Restriktionsenzyme • Hpa I stammt von Haemophilus parainfluenza. Es schneidet die 6 bp lange palindromische DNA-Sequenz in der Mitte glatt (blunt) durch. • Eco RI stammt von Escherichia coli und schneidet eine 6 bp lange DNA-Sequenz überlappend durch, wobei klebrige Enden entstehen. Klebrig heißt hier, dass komplementäre Sequenzen mit dem herausragenden Ende hybridisieren können. Hier handelt es sich um 5‘ Überhänge. • Hind III stammt von Haemophilus influenza und schneidet eine 6 bp lange DNA-Sequenz überlappend durch. Es entstehen 5‘ Überhänge. • Pst I stammt von Providencia stuartii und schneidet ebenfalls überlappend. Es entstehen 3‘ Überhänge. Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 8 Restriktionsenzyme • Nutzung der klebrigen Enden: • Zwei DNA-Sequenzen werden beide mit Eco RI geschnitten, wodurch die gezeigten überhängenden Enden entstanden. Sie passen genau zueinander. Der Spalt, der nach dem Verbinden (annealing) entstanden ist, kann durch Ligasen geschlossen werden. Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 9 Restriktionsenzyme Typ II Restriktionsenzyme – Schneide- und Methylierungsaktivität auf getrennten Proteinen – binden an der Restriktionsstelle und schneiden auch dort (die meisten) – benötigen kein ATP – beliebt in der Gentechnik • Typ I und III Restriktionsenzyme – ein und dasselbe Enzym methyliert und schneidet die DNA – binden an der Restriktionsstelle und schneiden woanders – benötigen ATP als Energiequelle – beschränkter Nutzen in der Gentechnik Laufrichtung • DNA des Bakteriophagen λ, geschnitten mit EcoRI und HindIII Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 10 Prokaryotische Methylasen • Methyltransferasen (Methylasen) erkennen spezifische DNA Sequenzen und übertragen eine Methylgruppe vom Cofaktor S-Adenosyl-L-Methionin (AdoMet) auf die Base der DNA. Methyltransferasen haben Bedeutung beim Schutz der Bakterien vor ihren eigenen Restriktionsenzymen, da entsprechend methylierte DNA gegen die Restriktionsaktivität unempfindlich ist. Auch beim mismatch repair System der Prokaryonten hat die Methylierung der DNA große Bedeutung. • Zu jedem Restriktionsenzym gehört eine entsprechende Methyltransferase. Gewisse Methylasen, wie z.B. die dam Methylase, sind in vielen Bakterienstämmen verbreitet. Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 11 Prokaryotische Methylasen • Methylierung muß die Aktivität eines Restriktionsenzyms nicht unbedingt verhindern! • Spezifität der dam-Methylierung: GATC – Erkennungssequenzen der Restriktionsenzyme sind kursiv und grün, dam-Sequenz unterstrichen • Enzyme die bei dam-Methylierung nicht schneiden: – – – – • ClaI NruI TaqI XbaI ATCGATC TCGCGATC TCGATC TCTAGATC Enzyme die trotz dam-Methylierung schneiden: – BamHI GGATCC – BglII AGATCT – PvuI CGATCG Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 12 DNA-Ligation DNA Ligase Reaktion. DNA Ligase katalysiert die Verbindung eines DNA-Stranges mit einer freien 3‘′Hydroxylgruppe mit der freien 5‘-Phosphatgruppe eines anderen Stranges. In Eukaryoten und Archea wird dabei ATP zu AMP und PPi gespalten. In Bakterien wird NAD+ zu AMP und Nicotinamide-mononucleotide (NMN) gespalten. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Books Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 13 Alkalische Phosphatase Ziel: zu verhindern, daß der Vektor ohne Insert ligiert Insert P OH P OH P OH Unbehandelter Vektor kann ohne Insert rezirkularisieren, was zu hohem Hintergrund an nichtrekombinantem Vektor führt. 3' OH OH P OH OH OH OH Dephosphorylierter Vektor kann ohne Insert nicht rezirkularisieren 5' OH Insert 5' OH 3' OH Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 Ligation eines Inserts in dephosphorylierten Vektor. Die gaps werden nach der Transformation in der Zelle repariert. 14 Agarose-Gel-Elektrophorese Vertikal Horizontal Gelmaterial: Agarose oder Polyacrylamid DNA wandert zur Anode auf Grund der stark negativen Ladung der Phosphatgruppen Siebeffekt des Gels lässt große Moleküle langsamer wandern als kleine Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 15 Agarose-Gel-Elektrophorese Konformation der DNA entscheidend für Wanderungseigenschaften: Plasmid-DNA kann in superhelicaler, entspannter oder linearer Form vorliegen. nur lineare Form nützlich zur Abschätzung der Größe eines DNA Fragments. Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 16 • Woher kommt das Insert (die "Fremd-DNA") ? • genomische (chromosomale) DNA – enthält u.U. Introns – kann direkt aus Zellen isoliert und kloniert werden – kann auch mittels PCR vervielfältigt werden • cDNA (copy DNA) – frei von Introns – hergestellt mit Reverser Transkriptase, meist mit PCR vervielfältigt • chemisch synthetisierte DNA – jede beliebige Sequenz herstellbar – Optimierung der verwendeten Codons Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 17 • Isolierung von DNA aus Zellen • • • Lyse der Zellen – erste Barriere ist (meistens) die Zellwand • Bakterien : Murein : Lysozym (meist aus Hühnereiweiß) • Hefe : Glucane, Mannane, Chitin : Lyticase (aus Pilzen gewonnen) • Pflanzen : Hauptbestandteil Zellulose : Zellulase • allgemein: zermahlen (Kugelmühle), Hochdruck (French Press) – zweite Barriere ist die Cytoplasmamembran • Hitze • SDS und andere Detergentien • mechanische Belastung (Zermahlen, Pipettieren, Schütteln, Ultraschall) nächstes Problem sind Enzyme in der Zelle, v.a. DNasen • Inaktivierung durch Hitze oder Proteasen (z.B. Proteinase K) Reinigung – Fällung (Ethanol) – Dialyse – Chromatographie Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 18 Präparation eines Inserts aus genomischer DNA • Das "Problem" ist es, die DNA in Stücke geeigneter Größe zu zerkleinern – Verdau mit Restriktionsenzymen – Zerkleinerung durch mechanische Kräfte, z.B. Scherkräfte oder Ultraschall partieller Verdau mit Restriktionsenzymen ist oft besser als kompletter Verdau, besonders dann, wenn man die Sequenz des Gens noch nicht kennt. Genom Vollständige Restriktion das ist das Gen, das wir klonieren wollen: zerschneidet unser Gen: partieller Verdau erzeugt eine große Zahl überlappender Fragmente Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 19 Was ist ein "partieller Verdau" und wie macht man ihn? • ganz einfach: – weniger Restriktionsenzym nehmen – kürzer inkubieren partieller Verdau erzeugt eine große Zahl überlappender Fragmente Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 20 Einige Genom-Größen Organismus Genom-Größe ORFs Mycoplasma genitalium 580,000 470 living) Methanococcus jannaschii 1,664,974 1,738 Haemophilus influenzae 1,830,137 1,727 Escherichia coli 4,639,221 3,574 Saccharomyces cerevisiae 12,067,280 5,800 Arabidopsis thaliana 115,400,000 25,498 Caenorhabditis elegans 97,000,000 19,099 Drosophila melanogaster 116,000,000 13,601 Homo sapiens > 2,693,000,000 ~39,114 Zea mays ~5,000,000,000 ? Pinus resinosa ~68,000,000,000 ? Amoeba dubia ~670,000,000,000 ? Klassifikation Bacteria (not free Archaaea Bacteria Bacteria Eukarya (fungus) Eukarya (angiosperm) Eukarya (nematode) Eukarya (insect) Eukarya (mammal) Eukarya (angiosperm) Eukarya (pine tree) Eukarya (alveolate) ORF: open reading frame, d.h. längerer Abschnitt der für ein Protein codiert, begrenzt von Start- und Stopcodon Für Hintergrundinformation: http://www.genomenewsnetwork.org/articles/02_01/Sizing_genomes.shtml Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 21 Präparation des Inserts mit Hilfe von Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR Produkt Primer genomische DNA Buch von Kary Mullis (Nobelpreis Chemie 1993) Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 22 Präparation des Inserts in Form von cDNA Problem: Expression eines eukaryontischen Gens, welches aus Introns und Exons aufgebaut ist, in einem prokaryontischen Expressionssystem. Bakterien können Introns nicht entfernen, d.h. sie können nicht splicen! Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 23 Präparation des Inserts in Form von cDNA •cDNA = copy DNA (in DNA kopierte mRNA) •Wie bringe ich die Introns raus, um nur mehr die codierenden Abschnitte des Gens zu haben? •Erkennung der reifen, gesplicten mRNA: reife mRNAs in Eukaryonten haben am 3'-Ende einen "poly-A-Schwanz" mit 50 - 250 Adenin-Resten, der erst nach dem Splicen von einem eigenen Enzym angehängt wird. •1. Reinigung der mRNA durch chemische Extraktion und Affinitätschromatographie mit oligo-dT (Basenpaarung mit dem poly-ASchwanz !!!). •2. Synthese des ersten Stranges der cDNA mit Hilfe von Reverser Transkriptase. Als Primer kann z.B. oligo-dT oder auch ein spezifischer Primer eingesetzt werden. •3. Synthese des zweiten Stranges und Amplifikation der cDNA mit Taq Polymerase und PCR Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 24 Isolierung von polyA+ mRNA •RNA in Puffer mit hoher Salzkonzentration •Hitzedenaturierung, rasches Abkühlen •Bindung an oligo-dT Zellulose •Elution der polyA+ RNA in Puffer mit niedriger Salzkonzentration Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 gesamt RNA polyARNA polyA+ RNA 25 Synthese von cDNA oligo dT Primer Reverse Transcriptase dNTPs RNA zerstören durch Behandlung mit NaOH oder einfacher: Hitzedenaturierung Primer (meist Zufallshexamere) DNA Polymerase (meist Taq Polymerase dNTPs Gemisch einzelner cDNA Klone kann z.B. mit Gen-spezifischer Probe gescreent Molekularbiologie für AW,werden VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 gewünschte cDNA mit Gen-spezifischem Primer amplifizieren 26 Präparation des Inserts durch chemische DNA Synthese Es kann vorkommen, daß ein Gen bzw. eine cDNA mit den bis jetzt beschriebenen Methoden nicht oder nur schwer zu erhalten ist, weil z.B. kein geeignetes Gewebe zur Verfügung steht, oder weil die mRNA in ganz geringer Konzentration im Gewebe vorliegt. In so einem Fall bietet es sich an, das Gen durch chemische Synthese herzustellen. Ein weiterer Vorteil synthetischer Gene ist, daß man die Codons für die einzelnen Aminosäuren frei wählen kann. Es bestehen nämlich große Unterschiede in der "Vorliebe" der verschiedenen Lebewesen für einzelne Codons. Entsprechend exprimieren z.B. humane Gene in E. coli oft besser, wenn man anstatt der natürlichen, humanen cDNA ein synthetisches Gen mit den von E. coli bevorzugten Codons verwendet. Synthetische Gene werden heute durch eine Kombination aus organischchemischer Synthese (Oligonukleotide) und enzymatischem Assembly und Amplifikation (PCR) hergestellt. Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 27 Zusammenfassung Biotechnologie und Gentechnik - Begriffe, Anwendungen Einfache Klonierung - Prinzip Fragen, die sich stellen wie und warum kloniert man ein Gen Woher kommt das Gen (das Insert) beim Klonieren genomische DNA cDNA chemisch synthetisierte DNA Molekularbiologie für AW, VO 954.104, SS 2007 J. Glößl, Teil 1 28
