Kein Folientitel

Vorlesung LV-Nr. 954.104
Molekularbiologie für
Agrarwissenschaften
J. Glößl, SS 2007
Thematik:
Molekularbiologische Methoden
Teil 2
Die ppt Folien wurden freundlicherweise von Prof. Florian Rüker aus der
Vorlesung „Einführung in die Molekularbiologie“, LV 954100, bereitgestellt
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
1
Eine einfache Klonierung
Viele Fragen:
•Warum will ich etwas klonieren?
•Was mache ich mit dem klonierten Gen?
•Woher kommt die "Fremd-DNA"?
•Wie bringe ich den Vektor in die Zellen hinein?
Was ist ein Vektor und wozu brauche ich ihn?
•Was für Vektoren habe ich zur Auswahl?
•Wie finde ich den "richtigen" Klon?
•Was mache ich dann damit?
•Wie führe ich die einzelnen Schritte durch?
•Was sind Restriktionsenzyme?
•Was ist Ligase?
•Brauche ich noch andere Enzyme?
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
2
Transformation, Transfektion, Infektion oder:
Wie bringe ich die rekombinante DNA in die Zelle?
Transformation:
Bedeutet einmal die Aufnahme freier DNA durch ein Bakterium, zum anderen
die Änderung von Eigenschaften eines Organismus nach dem Einbau von
Fremd-DNA. Außerdem wird mit Transformation auch die Entartung einer
Zelle zur Tumorzelle beschrieben
Transfektion:
Beschreibt (so wie die Transformation) den Einbau von DNA in eine intakte
lebende Zelle. Transfektion wird aber vorwiegend zur Beschreibung der
Manipulation mit Zellen höherer Organismen benutzt.
Infektion ist der Befall eines Lebewesens durch Viren, Mikroorganismen (z.B.
Bakterien) oder auch mehrzellige Organismen, der oft mit einer Übertragung
genetischen Materials verbunden ist.
Transduktion:
Eine Art Gentransfer, der dann auftritt, wenn Bakteriophagen Bruchstücke der
Erbsubstanz ihrer Wirtszelle mitschleppen und so auf andere Bakterien
übertragen.
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
3
Transformation vs. Infektion
wird DNA passiv über eine vorgeschädigte Membran in eine bakterielle Zelle
aufgenommen, so bezeichnen wir das als Transformation. Die aktive Aufnahme
von Fremd-DNA mit Hilfe von Phagen bezeichnen wir hingegen als Infektion.
Transformation
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
Infektion
4
Methoden zur Transformation lebender Zellen
•
generell: physikalische, chemische und biologische Methoden
•
Bakterien:
– Elektroporation, CaCl2 Transformation
Hefen:
– LiCl2 Transfektion, Elektroporation
tierische Zellen (Zellkultur in vitro):
– Ca3 (PO4) 2 Kopräzipitation von DNA, Elektroporation, Lipofektion,
Mikroinjektion, "Gene gun"
Pflanzenzellen:
– Gene gun, Infektion mit Agrobacterium tumefaciens, Elektroporation (aber
nur für Protoplasten geeignet)
•
•
•
•
•
Tiere: Injektion von DNA (intradermal, intramuskulär), Gene gun
transgene Tiere: Mikroinjektion von befruchteten Eizellen
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
5
Gene Gun
•
DNA-beschichtete Goldpartikel werden mit "Luft"druck (Helium, analog zum
Luftdruckgewehr) beschleunigt und auf die Zellen geschossen. Die
Zellmembran wird durchschossen, die DNA gelangt so ins Innere der Zellen und
führt zur Transformation
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
6
Mikroinjektion
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
7
• Was ist ein Vektor und wozu brauche ich ihn?
•
•
•
•
•
Vektoren sind die Träger der rekombinanten DNA
sie sind oft zur Einschleusung der DNA in die Zelle nötig
sowie zur stabilen Erhaltung der DNA im transformierten (Mikro)organismus
sie bringen meist nicht nur das Zielgen, sondern auch andere Funktionen in die
Zelle ein
• Promotoren (Startpunkt der Transkription)
• Selektionsmarker
• Replikationsursprung (Startpunkt der Replikation)
die wichtigsten Arten von Vektoren sind
• Plasmide
• Viren, Phagen
• künstliche Chromosomen (artificial chromosome, bacterial artificial
chromosome, yeast artificial chromosome)
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
8
• Vektoren für E. coli - Eigenschaften und Funktionen
•
Plasmide
– "einfache" Klonierungsvektoren, Expressionsvektoren
– einige Kilobasen können kloniert werden
– Transfer mittels physikalischer und chemischer Methoden (CaCl2, Elektroporation,...)
•
Bacteriophage Lambda
– Lambda Phage oft für das Anlegen großer Libraries verwendet, weil:
– Transfer mittels Infektion wesentlich effizienter als Transformation
– bis zu 23 Kilobasen können kloniert werden
•
künstliche Chromosomen (artificial chromosome, bacterial artificial chromosome,
yeast artificial chromosome)
– besonders für das Klonieren von besonders großen Inserts
– bis zu 300 Kilobasen können kloniert werden
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
9
Kriterien für die Auswahl eines Vektors
•
brauche ich spezielle Funktionen ?
– Promoter für Expression des Gens
– tag zur Reinigung bzw. Detektion des rekombinanten Proteins (z.B. His-tag, myctag)
– Regulationsgene (z.B. lacI)
•
•
•
•
welcher Selektionsmarker (Antibiotika-Resistanz, Auxotrophie-Marker) ?
welcher Replikationsursprung (Kopienzahl, Art der Replikation) ?
welche Restriktionsstellen stehen zur Verfügung ?
Brauche ich einen Shuttle-Vektor (kann in verschiedene Organismen
eingebracht werden, z.B: in Bakterien und in Hefe) ?
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
10
Beipiel für ein Plasmid als Expressionsvektor
•
•
•
•
•
•
•
•
•
ori = origin of Replikation
P = Promoter
RBS = Ribosomenbindungsstelle
ATG = Startcodon
(His)6 = Histidin-tag zur
Reinigung des Proteins
MCS = multiple cloning site
term = Transkriptionsterminator
ampR = Ampicillin-Resistenz-Gen
lacI = Lac Repressor (als Beispiel für eine
Regulationsfunktion)
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
11
Replikation: Ori (Replikationsursprung)
Ein Replikationsursprung ist für die
unabhängige Replikation des Vektors
in der Wirtszelle nötig. Man spricht
von einem "Episom" und auch von
"autonomer Replikation", die
unabhängig von der Replikation des
Chromosoms (des Genoms) der
Wirtszelle verläuft.
Enthält der Vektor keinen
Replikationsursprung, so besteht
immer noch die Möglichkeit der
Integration in das Genom der
Wirtszelle, und Weitervererbung auf
diesem Weg.
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
12
Transkription: Promoter und Transkriptionsterminator
Wenn das klonierte Gen exprimiert werden soll, d.h. wenn das entsprechende
Protein produziert werden soll, müssen Transkription und Translation
stattfinden. Entsprechende Vektoren nennt man auch "Expressionsvektoren"
Animation der Transkription: http://www-class.unl.edu/biochem/gp2/m_biology/animation/gene/gene_a2.html
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
13
Translation: Ribosomen
"Expressionsvektoren"
...enthalten alle Sequenzen die nötig
sind für
•Transkription und
•Translation
also
•Promotor
•Transkriptionstermiator
•Ribosomenbindungsstelle
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
14
Resistenzgene, selektierbare Marker
Die Transformation ist meistens sehr ineffizient (Ausnahme: Mikroinjektion),
d.h. nur äußerst wenige der behandelten Zellen werden tatsächlich transformiert.
Um diese wenigen Zellen finden zu können ist es nötig, alle nichttransformierten abzutöten.
Dies macht man durch den Einsatz von Selektionsmarkern
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
15
Resistenzgene, selektierbare Marker
Vektoren enthalten in der Regel einen oder mehrere selektierbare Marker.
Hierbei handelt es sich um Gene, deren Produkte der transformierten Zelle
besondere Eigenschaften verleihen, sodaß sie leicht von nicht-transformierten
Zellen zu unterscheiden ist.
Meist handelt es sich bei diesen Markern um Gene für eine AntibiotikaResistenz. Der verbreitetste Marker ist das Gen für die ß-Lactamase. Dieses Gen
verleiht E. coli Zellen die Fähigkeit, in Gegenwart von Ampicillin (ein ß-Lactam
Antibiotikum) zu wachsen, da die ß-Lactamase den ß-Lactam Ring spaltet und
das Antibiotikum damit inaktiviert.
Auch andere Antibiotika-Resistenzen, z.B. gegen Tetracyclin, Kanamycin,
Chloramphenicol oder Neomycin können als Marker für Klonierungsvektoren
verwendet werden.
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
16
Resistenzgene, selektierbare Marker
Als Alternative zu
Antibiotkaresistenzen werden
häufig auch Auxotrophiemarker
eingesetzt, vor allem beim
Arbeiten mit Hefen.
Voraussetzung ist, daß man als
Wirtszelle für die Klonierung
eine Mutante verwendet, die auf
Minimalmedium nicht wächst.
Erst nach Transformation mit
dem Vektor, der das "richtige"
(also das im Wirtsstamm nichtfunktionelle) Gen mitbringt,
wird die Zelle prototroph, d.h.
sie kann auf Minimalmedium
wachsen.
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
17
Multiple cloning site
Als "multiple cloning site"
(MCS, oder "polylinker") wird
ein Abschnitt auf dem Vektor
bezeichnet, der eine Vielzahl
von Erkennungssequenzen für
unterschiedliche Restriktionsendonukleasen enthält. Jede
dieser
Erkennungssequenzen
kommt nur einmal auf dem
Vektor
vor,
d.h.
durch
Schneiden
mit
den
entsprechenden Restriktionsenzym wird der Vektor
linearisiert, und damit bereit
zum Aufnehmen der zu
klonierenden
DNA
(des
Inserts).
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
18
Regulierbare Promotoren
Beispiel: lac Promotor/Operator mit lacI Gen am
Vektor
Hintergrund: Regulation des lac Operons
rekombinante Proteinexpression und "normales"
Wachstum der Wirtzelle sind oft nicht vereinbar,
deswegen werden viele gentechnische Prozesse
zweistufig angelegt:
•Produktion der Biomasse (Promotor ist
reprimiert),
gefolgt von
•Induktion des Promotors und Proteinproduktion
•Dieses Prinzip ist auch bei transgenen Tieren und
Pflanzen anwendbar.
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
zusätzliche Kopie des lac
Repressors am Vektor
für noch dichtere Repression
19
• Zusammenfassung Vektoreigenschaften
• Zweck:
–
–
–
–
einfache Klonierung
Library
Expression
shuttle vector
• Insertgröße:
– Plasmid: einige kB
– Lambda Phage: max ca 23 kB
– BAC: bis zu 300 kB
• Transformation / Infektion
• .....
Molekularbiologie für Agrarwiss., VO 954.104 SS 2007, J. Glößl, Teil 2
20