Methoden der molekularen Biowissenschaften
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ZMBH Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg PD Dr. M. Mayer Im Neuenheimer Feld 282 D-69120 Heidelberg Praktikumsskript Methoden der molekularen Biowissenschaften Mikrobiologie Hinweise zum Praktikum Im Praktikum werden mikrobiologische Grundtechniken und Methoden zur Charakterisierung und Analyse von Mikroorganismen so wie Grundlagen der Bakterien- und Phagengenetik vermittelt. Das Praktikum beginnt mit einer täglichen Vorbesprechung im Praktikumsraum. Anschließend sollen Sie mit Hilfe der Anleitungen aus dem Skript so selbständig wie möglich die Versuche erfolgreich durchführen und dokumentieren. Im Laborbereich müssen Sie die Richtlinien der guten Laborpraxis befolgen: immer einen Labormantel tragen, immer Pipettierhilfen ver wenden und wo nötig, Handschuhe und eine Schutzbrille tragen. Bitte beachten Sie, dass die Sicherheitsvorschriften das Essen, Trinken und Rauchen im Labor verbieten. Abfälle mit lebenden Mikroorganismen müssen gesammelt werden, so dass sie vor der Entsorgung durch Hitzesterilisation inaktiviert werden können. Glasabfälle und Glasbruch werden getrennt gesammelt und entsorgt. Alle Laborgeräte dürfen erst nach Anleitung in Betrieb genommen werden. Achten Sie immer auch auf die ausreichende und dauerhafte Beschriftung der Proben und Reaktionsgefäße (Platznummer, Inhalt evtl. mit Konzentration, Datum). Sauberkeit und ein gewisses Maß an Ordnung sind selbstverständlich. Bitte bringen Sie am ersten Praktikumstag einen Labormantel und einen wasserfesten Filzstift (z.B. Edding) mit. Die Resultate der Experimente werden als Ergebnisprotokoll in einem Vordruck festgehalten und durch Rechnungen, Skizzen und Interpretationen ergänzt. Ein von den Betreuern akzeptiertes Protokoll ist Voraussetzung für die Zulassung zur Klausur (studienbegleitende Prüfung). Bei Fragen oder Wünschen wenden Sie sich bitte an die Betreuer: Andrea Trendl-Kern Peter Prior Walter Reiser [email protected] [email protected] [email protected] ZMBH Im Neuenheimer Feld 282, Praktikum Raum 022, Büro Raum 021c Tel. 546838 Tel. 546838 Tel. 546838 -2- Themenkatalog als Grundlage für die Vorbereitung auf das Praktikum - Womit beschäftigt sich die Mikrobiologie? Welche Vorteile bieten Mikroorganismen als Forschungsobjekte? In welche Reiche ist die Welt des Lebendigen eingeteilt? Was versteht man unter Taxonomie, was ist der Unterschied zur Phylogenie? Welche Nomenklatur wird zur Benennung der Mikroorganismen angewandt? Was versteht man unter einem Klon? Wie kommen Stoffe in die Zelle? Welche Transportmechanismen gibt es? Wie sieht der grundlegende Stoffwechsel einer Bakterienzelle aus? (Unterscheidung von Bau- und Energiestoffwechsel, Glycolyse, Tricarbonsäurecyclus) Welche Abmessungen besitzen Viren, Bakterien, eukaryontische Mikrooganismen? Wie ist die chemische Zusammensetzung einer Bakterienzelle z.B. E.coli ? Was ist ein Vollmedium, was ein definiertes Medium (Minimalmedium)? Wie wird die Lactoseverwertung bei Bakterien reguliert? Wie sieht die Wachstumskurve einer Bakterienkultur aus? Wie lässt sich bakterielle Vermehrung messen? Wie ist die Zellwand Gram-positiver und die Gram-negativer Bakterien aufgebaut? Wie funktioniert bei B. subtilis die Differenzierung zu Endosporen? Was sind Antibiotika? Bei welchen Prozessen greifen Antibiotika ein? Wie wirkt Penicillin und warum kann man es als ideales Antibiotikum bezeichnen? Wie können sich Bakterien gegen Antibiotikawirkung schützen? Warum ist die Resistenzbildung gegen Antibiotika gefährlich für den Menschen? Wie können Bakterien genetische Information austauschen/übertragen? Was sind Plasmide und welche Funktionen erfüllen sie, bzw. welche Strukturelemente besitzen sie? Was versteht man unter Kompetenz bei Bakterien? Wie wird ein Virus definiert? Wie sind Viren aufgebaut, welche Gestalt besitzen sie? Was versteht man unter den Begriffen Wirtsbereich, Adsorption, Latenzzeit, Eklipse, PFU, MOI, EOP, Temperenz, Lysogenie, Immunität im Zusammenhang mit Bakteriophagen? Wie funktioniert ein Restriktions-/Modifikationssystem? Wie funktioniert ein Autoklav? Wie sieht die Kinetik der Abtötung aus? Was versteht man unter dezimaler Reduktionszeit? Welche weiteren Verfahren zur Sterilisation von Lösungen und Gegenständen gibt es und wie funktionieren sie? Die fett gedruckten Themen werden durch einen Versuch oder ausführliche Besprechung im Praktikum behandelt und sind auch Gegenstand der studienbegleitenden Prüfung Literatur: Madigan, Martinko; Brock Mikrobiologie, 11. Auflage (2006) Fuchs, Hrsg.; begr. v. Schlegel; Allgemeine Mikrobiologie, 8. Aufl. (2006) -3- INHALTSVERZEICHNIS Seite 1. ALLGEMEINE TECHNIKEN DER MIKROBIOLOGIE 4 1.1 Animpfen von Bakterienkulturen 1.2 Herstellen von Nährböden (Flüssig-Medium, Agar-Platten) 1.3 Mikroskopische Untersuchung von Bakterien nach verschiedenen Färbeverfahren Gramfärbung Sporenfärbung 4 5 5 2. PHYSIOLOGISCHE TESTS MIT AUSGEWÄHLTEN BAKTERIEN 6 2.1 Charakterisierung von Bakterien anhand von Stoffwechselleistungen Nachweis der Zuckerverwertung unter Säurebildung Empfindlichkeit gegen Antibiotika 2.2 Messung des Wachstums von Escherichia coli (Zellzahlbestimmung durch Auszählung unter dem Mikroskop, Trübungsmessung einer wachsenden Bakterienkultur, Korrelation zwischen Trübung und Zellzahl, graphische Darstellung, Wachstumskurve von E. coli, Bestimmung der Generationszeit) 2.3 Überprüfen der Pipettiergenauigkeit 6 3. GENETISCHER AUSTAUSCH BEI BAKTERIEN 10 3.1 Bakterielle Konjugation (Konjugation in Flüssigkultur, Selektionsverfahren für konjugierte Bakterien Kinetik des Transfers genetischer Marker, Berechnung der Effizienz des Transfers) 3.2 Transformation von Escherichia coli (Herstellung kompetenter Bakterien, Transformationstechnik, Sättigungskurve mit DNA (Plasmid), Berechnung der Effizienz der Transformation) 10 4. BAKTERIOPHAGEN 15 4.1 Nachweis und quantitative Bestimmung von Phagen (Konzentrationsbestimmung einer Phagensuspension durch Plaquebildung) 4.2 Wechselwirkung von Bakteriophagen mit ihren Wirtszellen (Bestimmung der Wirtsspezifität definierter Phagen und Bakterien) 4.3 Restriktions-Modifikationssysteme in Bakterien (Nachweis der Effizienz verschiedener Restriktionssysteme durch Plattieren von λ Phagen auf Stämme von E.coli mit verschiedenen Restriktions-Modifikations-Systemen) 15 MEDIEN ALPHABETISCH 19 8 10 13 16 18 -4- 1. ALLGEMEINE TECHNIKEN DER MIKROBIOLOGIE 1.1 Animpfen von Bakterienkulturen "Impfen", „Animpfen“ in der Mikrobiologie: das Einbringen von Mikroorganismen in ein Milieu (Medium), in dem diese zuvor nicht enthalten waren. Mögliche Impfinstrumente: Impfösen, Pipetten, o.ä. Abb. 1 Aufbau des Bunsenbrenners und Flammentemperaturen Impfen mit der Impföse: Vor und nach einem Impfvorgang (Ausstrich) wird die Impföse zunächst im inneren Bereich der Bunsenflamme getrocknet und danach im heißen Kegel der Flamme ausgeglüht. Nach dem Ausglühen kühlt man die Öse ab, indem man sie in den sterilen Agar einsticht (Plattenrand) oder in sterile Kulturflüssigkeit taucht. Danach berührt man die Kultur, von der abgeimpft werden soll (wenig abnehmen! ein Stecknadelkopf großes Stück einer Bakterienkolonie enthält bereits 106-107 Bakterien!) und streicht das abgenommene Material aus. WICHTIG: Sind die Mikroorganismen auf der Platte (Bildung von Bakterienkolonien oder eines zusammenhängenden Bewuchses) oder in der Flüssigkultur (Trübung des Nährmediums) soweit wie erforderlich gewachsen (meist nach 1 Tag), müssen sie aus den Brutschränken genommen und bei 4o C im Kühlschrank gelagert werden. Fraktionierte Aussaat (Impfen, mit dem Ziel einzeln liegende Bakterienkolonien zu erhalten) Im Praktikumsversuch wird zunächst eine Bakteriensuspension der Flüssigkultur Escherichia coli (E. coli K12 y mel) und Bacillus subtilis auf einer Standard I-Platte mit einer 0,1ml Pipette ausgestrichen, dann wird mit der Impföse weiter gearbeitet. (siehe Abb. 2) Abb . 2 Impfschema für die fraktionierte Aussaat (Ausstreichen auf Einzelkolonien) -5- Zwischen den einzelnen Impfstrichen wird die Impföse ausgeglüht und abgekühlt. Vor dem Beimpfen wird jede Platte möglichst klein am Rand des Bodens oder seitlich am Boden beschriftet. Am folgenden Tag sind die Bakterien gewachsen. Dann wird das Aussehen der Kolonien kurz beschrieben. Impfen in Flüssig-Medium Impfen Sie (siehe Impfschema) jeweils mit einer Einzelkolonie E. coli K 12ymel und Micrococcus luteus je 3 ml Standard I- sowie je mit einer Kolonie E. coli und Bacillus subtilis je 3 ml Standard II-Medium (enthält keinen Zucker) an und inkubieren Sie die Kulturen bei 37°C. Micrococcus luteus Standard I Medium, 3ml Impfschema: Mit Impföse von Einzelkolonie in große Wassermann-Röhrchen Escherichia coli Bacillus subtilis Standard I Medium, 3ml Standard II Medium, 3ml Standard II Medium, 3ml 1.2 Herstellen von Nährböden (Flüssig-Medium, Agar-Platten) Im Kurs werden 400 ml Standard I-Agar-Medium für Standard I-Kan-Platten hergestellt. Dieses wird autoklaviert. Nach dem Erkalten auf ca. 50°C wird Kanamycin (Vorratslösung Kan: 25mg/ml) zu einer Endkonzentration von 0,025mg/ml zugegeben und der Agar in sterile Petrischalen gegossen. 1.3 Mikroskopische Färbeverfahren Untersuchung von Bakterien nach versch. Drei Bakterien-Stämme (Escherichia coli, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus) werden nach Gram (Hans Christian Gram, 1884) angefärbt. Die bei den Versuchen verwendeten Farbstoffe Kristallviolett (Gram) und Malachitgrün (Sporen) stehen im Verdacht, kanzerogen zu sein. Hautkontakt vermeiden bzw. Handschuhe tragen! Herstellung von Ausstrichpräparaten: Je ein kleiner !! Tropfen einer Flüssigkultur von Escherichia coli, Micrococcus luteus und Bacillus subtilis wird auf einem Objektträger mit einer sterilen 0,1ml-Glaspipette verteilt. Das Präparat wird zunächst einige Minuten an der Luft getrocknet und dann dreimal durch die leuchtende Bunsenbrennerflamme gezogen (hitzefixiert). • Gram-Färbung: Grampositive und gramnegative Bakterien unterscheiden sich im molekularen Aufbau ihrer Zellwand. Grampositive Bakterien sind phylogenetisch verwandt! -6- 1. Die hitzefixierten Präparate werden auf einem Färbebänkchen mit Kristallviolett überschichtet. Nach 2 Minuten wird der Farbstoff abgegossen (nicht spülen) und einige Tropfen Lugol'scher Lösung aufgetropft und nach 2 Min. abgegossen. 2. Auf den schräg gehaltenen Objektträger wird 96%iger Alkohol aus der EthanolSpritzflasche maximal 4-6 Sekunden lang gegeben, bis keine Farbwolken mehr entstehen. Dann wird sofort mit VE-Wasser nachgespült (Spritzflasche). 3. Es wird 2 Minuten mit Safranin gegengefärbt, um gramnegative Bakterien darzustellen. Es wird mit Wasser abgespült und zwischen Filterpapier getrocknet. Mikroskopische Untersuchung: Die gefärbten und getrockneten Präparate werden ohne Deckglas betrachtet. Man sucht zunächst mit dem 10 x - Objektiv eine geeignete Stelle im Präparat, gibt dann einen kleinen! Tropfen Immersionsöl auf den Objektträger (Schichtseite oben!) und untersucht mit dem Ölimmersionsobjektiv (100x) im Hellfeldmikroskop. Grampositive Bakterien erscheinen dunkel blau-violett, Gram-negative hellrot. Achten Sie auf die Form der Einzelzellen und auf die Anordnung der Zellen zueinander (Ketten, Häufchen etc.) achten (Bestimmungskriterium bei Kokken). • Sporenfärbung von Bacillus-Sporen Mit Malachitgrün den hitzefixierten Objektträger überschichten, vorsichtig diesen mit einer Holzklammer über den Bunsenbrenner halten, bis man eine Dampfentwicklung sieht, dann sofort wieder kühl halten (RT). Diese Prozedur 3x durchführen. Vorsicht, nicht kochen! Danach mit H2O spülen. 2 Minuten mit Safranin gegenfärben, mit H2O spülen und zwischen Filterpapier trocknen. Mikroskopische Untersuchung: siehe Gramfärbung. Die Sporen sind grün gefärbt, die vegetativen Zellen rot. Beachten Sie die Spore innerhalb einer Bakterienzelle. 2. PHYSIOLOGISCHE TESTS MIT AUSGEWÄHLTEN BAKTERIEN 2.1 Charakterisierung von Bakterien anhand von Stoffwechselleistungen Nachweis der Zuckerverwertung unter Säurebildung Material: Standard II-Agarplatten, Übernachtkulturen von E.coli und B. subtilis in Standard IIBouillon, mit verschiedenen Zuckerlösungen (ca. 10%) getränkte und anschließend getrocknete Filterblättchen Durchführung: Der Nachweis der Zuckerverwertung mit den Standard II-ÜN-Kulturen von E. coli und B. subtilis wird als Erstes angesetzt und sofort bei 37oC inkubiert. Die Auswertung erfolgt nach ca. 3 Stunden (E. coli) und nach ca. 5 Stunden (B. subtilis). Zwei Agarplatten werden entsprechend der unten stehenden Abbildung beschriftet (Schrift am unteren oder seitlichen Rand der Platte!) F ilterbl ättch en mit Zuckerlösung Abb. 3 Zuckertest jedes Feld beschriften! E. coli B. subtilis -7- 0,2 ml der E. coli-Kultur bzw. 0,3ml der B. subtilis-Kultur werden mit einer 1mlPipette auf einer Standard II-Platte (+ Phenolrot als Indikator) gleichmäßig verteilt. Die mit 5 verschiedenen Zuckern getränkten Testblättchen werden mit einer sterilen Pinzette auf die entsprechenden Felder gelegt (je 1 pro Feld). Die Zucker diffundieren in den Agar und können von den Bakterien verwertet werden. Die Verwertung von Zucker wird durch die Änderung des pH-Wertes und die damit verbundenen Farbänderung des Nährbodens angezeigt. Der Test auf Zuckerverwertung unter Säurebildung wird zur Charakterisierung und Identifizierung von Bakterienstämmen verwendet. Empfindlichkeit gegen Antibiotika Material: St.I-Agarplatten, Übernachtkulturen von E.coli K12 y mel (ca. 2.109/ml) und Micrococcus luteus (ca. 2 .109/ml), Filterblättchen, Penicillinlösung unterschiedlicher Konzentration Durchführung: Zwei Agarplatten werden entsprechend der unten stehenden Abbildung beschriftet (Schrift am unteren oder seitlichen Rand der Platte!) Abb.4 Antibiotikatest Fi lterblättchen (niedr. Konz.) E. coli Fi lterblättchen Fi lterblättchen (niedr. Konz.) mit Antibiotikum (hohe Konzentration) Fi lterblättchen M. luteus mit Antibiotikum (hohe Konzentration) Weichagar wurde bei 100°C im Wasserbad geschmolzen (Praktikumsbetreuung). In 2 kleine Wassermannröhrchen, die im 48°C Wasserbad vorgewärmt werden, wird je 2,5 ml heißer Weichagar gefüllt. Dann wird in ein Röhrchen 0,1 ml ÜN-Kultur E. coli K12 y mel zugegeben, gemischt, auf eine Standard I-Platte gegossen und auf der gesamten Oberfläche der Agarplatte durch leichtes Schwenken oder kreisförmiges Verschieben verteilt. (Schnelles Arbeiten ist wichtig.) In das andere Röhrchen wird 0,1 ml ÜN-Kultur Micrococcus luteus pipettiert und ebenso verfahren. Nach Erstarren des Weichagars (ca. 2min) legt man mit einer Pinzette vorsichtig je ein Filterblättchen in jede Plattenhälfte auf die Oberfläche des Weichagars. Mit einer Gilson-Pipette werden dann 4µl der jeweiligen Penicillinlösung (25 µg/ml bzw. 250 µg/ml) auf die Blättchen pipettiert. Die Platten werden bei 37°C mit dem Deckel nach oben inkubiert und das Ergebnis wird am nächsten Tag abgelesen. Sind die Indikatorbakterien sensitiv gegen ein Antibiotikum, tritt eine Wachstumshemmung auf (Hemmhof). Vorbereitung für die Versuche des 3. Praktikumstags Für die Herstellung kompetenter TOP 10 Zellen muss eine 3 ml ÜNK in Standard IMedium angesetzt werden. -810ml LB-Medium und 22ml Standard I-Medium müssen in je 1 Blaukappenflasche steril umgefüllt werden. Das Auftreten einer Trübung des Mediums am folgenden Tag (Flasche aufschütteln!) zeigt unsteriles Arbeiten an! 2.2 Messung der Vermehrung von E. coli Durchführung: Dieser Versuch wird zu zweit durchgeführt. Jede Gruppe beimpft 24 ml LB-Medium mit 1,0 ml einer Übernachtkultur von E. coli K12 y mel (ca. 2 x 109/ml). Diese Kultur wird für 2,5 Stunden im Schüttelwasserbad bei 37°C inkubiert. Die Vermehrung der Bakterien während dieser Zeit wird mit folgenden 2 Methoden analysiert: (1) Trübungsmessung im Photometer bei 600 nm (alle 15 min) (2) Zellzahl-Bestimmung mit einer Zählkammer unter dem Mikroskop (alle 30 min) Immer wenn Messung (2) mit Messung (1) zusammenfällt, sollten Sie die Küvette mit ca. 0,8 ml Kultur füllen und dann sofort aus der Küvette 2-4 µl in die Zählkammer pipettieren. Ein Gruppenmitglied misst am Photometer, das andere zählt unter dem Mikroskop. Abb. 5 Pipettierschema für OD-Messung und Zählkammer Erläuterung: Alle 15 min werden je ca. 0,8 ml Probe steril entnommen, direkt in die jeweilige Küvette pipettiert und im Photometer die Absorption bei 600 nm bestimmt. Als Vergleichslösung wird StI-Medium benutzt. Eine Küvette/Gruppe reicht für die ganze Versuchsreihe. Küvetten vor neuer Messung mit H2O spülen und auf Filterpapier trocknen! (Küvette muss außen vollkommen trocken sein!) Sobald Sie höhere OD- -9Werte als 0.5 haben, sollen Sie eine 1:5 Verdünnung machen (unbedingt in einem Wassermannröhrchen; d.h. 0,2 ml aus der wachsenden Kultur + 0,8 ml StI-Medium) und messen. Für die Zellzahlbestimmung dann nur die verdünnte Kultur nehmen. Auswertung: Graphische Darstellung der Resultate. Auftragen von OD bzw. Zellzahl gegen Zeit. Ermittlung der Generationszeit innerhalb der logarithmischen Wachstumsphase. Die Neubauer-Zählkammer Der optisch plane Boden einer Zählkammer ist mit einem rechtwinkligen Zählnetz versehen, das aus Linien in definierten Abständen besteht (s. Abb. 6). Durch Aufbringen eines optisch plan geschliffenen Deckglases wird über der Bodenfläche ein Raum abgegrenzt (s. Abb. 5), in dem die Partikel mikroskopisch ausgezählt werden. Abb. 6 Zählkammer seitlich, von oben Die zum Befestigen des Deckglases vorgesehenen plan geschliffenen Glasflächen der Kammer leicht anfeuchten (anhauchen) und das geschliffene Deckglas so von der Seite her aufschieben, dass auf beiden Flächen NEWTON'sche Ringe sichtbar werden; dadurch ist gewährleistet, dass sich das Deckglas in reproduzierbarem Abstand vom Boden der Kammer befindet. Abb. 7 Zählkammmer nach Neubauer: Detailansicht Ein kleines Volumen (ca. 3 µl) wird mit einer Gilsonpipette auf die Zählkammer am Rand zwischen Deckglas und Kammer gegeben. Um die Zellzahl pro ml zu 7 ermitteln, muss die Zahl der Zellen in einem kleinen Feld mit dem Faktor F = 2 x 10 multipliziert werden. Immer 16 kleine Felder (= 1 großes Feld) auszählen, 7 dementsprechend mit dem Faktor 2 x 10 /16 multiplizieren. - 10 - 2.3 Überprüfen der Pipettiergenauigkeit Material: Als Ausgangslösung erhalten Sie eine Methylenblaulösung c=1mmol/l (37mg/100ml). . . . Für eine Lösung c=0,02mmol/l gilt: OD620 =0,80. (ε620nm= 40000 cm-1 mol-1 l) Durchführung: Zunächst wird eine Verdünnung von 1:10 hergestellt. Die Verdünnung 1:10 wird weiter 1:5, 1:10, und 1:20 in Kunststoffröhrchen verdünnt. Die Verdünnungen ab einer Verdünnungsstufe von 1:50 werden im Photometer bei einer Wellenlänge von 620nm vermessen und die Werte werden in eine Tabelle eingetragen. Die Kunststoffküvette wird nach jeder Messung kurz mit Wasser ausgespült und auf Papierhandtuch ausgeklopft. Sie messen aufsteigend, also mit der geringsten Konzentration (=höchsten Verdünnung) beginnend. Die Auswertung des Versuchs erfolgt durch eine Grafik. Die OD wird gegen die Konzentration der Lösungen aufgetragen. Die Sollwertkurve und die einzelnen Messwerte (als Soll-Konz/OD-Werte) werden eingetragen, wobei die Messwerte farblich nach Pipettentyp gekennzeichnet werden. Das Ergebnis soll anhand der Grafik kurz diskutiert werden. 3. GENETISCHER AUSTAUSCH BEI BAKTERIEN 3.1 Bakterielle Konjugation Erläuterung: Bei der Konjugation wird genetische Information von einer Zelle auf eine andere übertragen. Voraussetzung für die Konjugation sind zwei verschiedene Typen von Zellen, ein Donor, der sog. F-Pili besitzt, und ein Rezipient. Um Konjugation nachzuweisen, müssen Donor und Rezipient verschiedene genetische Marker tragen. Bakterien: Donor: E. coli D15, lac-, nals, (F'lac+); Rezipient: E. coli K12, lac-, nalr Der Donor ist lac- (lacZ Mutant), kann aber trotzdem Lactose verwerten, da der Defekt durch das F'-Plasmid ausgeglichen wird, und sensitiv gegen Nalidixinsäure (nals). Der Rezipient, der kein Plasmid enthält, ist ebenfalls lac- und durch Mutation des Gyrase-Gens resistent gegen Nalidixinsäure (nalr). Nach einer erfolgreichen Konjugation kann der Rezipient Lactose verwerten und ist natürlich weiterhin resistent gegen Nalidixinsäure (F´lac+, nalr). Verwertung von Lactose wird durch eine Rotfärbung der Kolonien nachgewiese; deshalb enthält der MacConkey-Agar den pH-Indikator Neutralrot, der saure Kompartimente rot anfärbt (rote, positiv geladene Form ist nicht membrangängig) Der Rezipient wächst auf einer - 11 Nalidixinsäure-haltigen MacConkey-Platte mit gelben Kolonien, der Rezipient nach Konjugation mit roten, der Donor überhaupt nicht. Material: MacConkey-Platten, MacConkey-Nal-Platten, St.I-Medium z. Verdünnen Bakterienstämme: Donor: E. coli D15, lac-,nals, (F' lac+) Rezipient: E. coli K12, lac-, nalr, Zur Vorbereitung werden 9,9 ml Standard I-Medium mit 0,1 ml ÜNK angeimpft und bei 37°C schüttelnd inkubiert. Die Vermehrung wird durch Auszählen in der Zählkammer bestimmt und bei 2.108/ml durch Kühlen gestoppt (von Betreuung erl.). Durchführung: 1 ml Rezipienten-Kultur (K12) wird mit 2 ml Donor-Kultur (D15) gemischt und bei 37°C ohne Schütteln im Wasserbad inkubiert (=Konjugation). Um die Titer beider Stämme ermitteln zu können, werden sowohl der Rezipientenals auch der Donorstamm unbehandelt (Eistopf = Zeitpunkt 0) verdünnt und ausplattiert. Nach den folgenden Schemata werden Proben entnommen und in den angegebenen Endverdünnungsstufen ausplattiert (Angabe auf Platte). Abb. 8 Verdünnen in Schritten Abb. 9 Schema der Verdünnungsund Plattierungsschritte - 12 Die Verdünnungen werden jeweils 1:10 angesetzt (0,1ml der Proben + 0,9ml des Standard I-Mediums). Beim Verdünnen muss geschüttelt werden! Je 0,1ml der oben angegebenen Verdünnungsstufen werden ausplattiert Abb. 10 Platten und Beschriftung Auswertung: Ermitteln Sie, wie viel Prozent des Rezipientenstammes jeweils lac+ geworden sind Kolonien Rezipient lac+ x 100 _______________________ = % Kolonien Rezipient insgesamt 3.2 Transformation von E. coli Aufgabe: Transformation von Escherichia coli TOP 10 (Genotyp: F-, mcr A (mrr-hsdRMSmcrBC) φ80lacZ M15 lacX74 deoRrecA1 araD139 (ara-leu)7697 gal U gal K rps L(StrR)end A1nup G) mit isolierter DNA. Im allgemeinen wird DNA von Bakterien nur sehr schlecht aufgenommen. Durch entsprechende Vorbehandlung kann die Zellwand/-membran der Bakterien so verändert werden, dass diese Zellen "kompetent" werden, d.h. sie nehmen DNA besser auf. Eine der einfachsten Methoden, um Bakterien kompetent zu machen, ist die Vorbehandlung mit CaCl2. • Herstellung kompetenter Zellen Material: ÜNK E. coli TOP 10 (ca. 2x109/ml), Standard I Medium 100mM CaCl2/10%Glycerin-Lösung (gut vorgekühlt) Plasmid pBK (Kanr, vermittelt Resistenz gegen Kanamycin) Durchführung: Präparation kompetenter E. coli (ein 35 ml Ansatz ergibt 1 ml kompetente Zellen) -0,4 ml ÜNK E.coli TOP 10 in 40 ml Standard I-Medium bei 37° C bis zu OD600 = 0,3 - 0,5 hochwachsen lassen. (während der Zentrifugationsschritte muss die Zellkonzentration der Suspension noch mit Hilfe der Zählkammer bestimmt werden - Zelltiter Anfang! Dazu eine 1:5 Verdünnung herstellen!) -35 ml Kultur in steriles Zentrifugenröhrchen überführen, 5' in Eis kühlen -5' bei 6000 UpM bei 4° C zentrifugieren, -Sediment in 10 ml 100 mM CaCl2/Glycerin-Lösung (kalt) aufnehmen -20' Eis -5' bei 6000 UpM zentrifugieren - 13 -Sediment in 1 ml 100mM CaCl2/10%Glycerin-Lösung (kalt) auf Eis aufnehmen in 5 auf Eis vorgekühlte, beschriftete Eppendorfreaktionsgefäße je 100 µl kompetente Zellen verteilen Abb. 11 Versuchsschritte zur Herstellung kompetenter Zellen • Transformation Verschiedene Aliquots kompetenter Zellen werden mit dem Plasmid pBK in verschiedenen Mengen sowie einer Negativkontrolle (TE) transformiert. Vorbereitungen zur Transformation: Plasmidausgangslösung (AL): pBK in TE-Puffer gelöst Zunächst wird folgende Verdünnungsreihe vom Plasmid pBK hergestellt: 1. Verdünnung: 3µl Ausgangslösung + 27µl TE 2. Verdünnung: 3µl von 1. Verd. + 27µl TE 3. Verdünnung: 3µl von 2. Verd. + 27µl TE Abb. 12 Verdünnung der Plasmid-DNA Dann werden die 5 vorgekühlten Eppis mit je 100 µl kompetenten Zellen beschickt. Für die Transformation werden pro Ansatz jeweils 5µl der AL pBK und der drei Verdünnungen zu den Zellen pipettiert. Als Kontrollexperiment werden 100µl kompetente Zellen nur mit 5µl TE-Puffer ohne DNA "transformiert". Siehe Schemazeichnung!! Abb. 13 Transformationsansätze und Kontrolle - 14 - Durchführung: Wichtig ist, dass die Zellen auf Eis stehen und dazu vorsichtig die Plasmid-DNA pipettiert und vorsichtig gemischt wird. - Röhrchen 2' im Eis inkubieren - dann 4' auf 37° C bringen (Wasserbad), - 2' in Eis kühlen - Jedes Röhrchen mit 900 µl LB-Medium auffüllen, 20' bei 37° C im Wasserbad inkubieren. Unmittelbar vor dem Ausplattieren müssen die Eppi-Reaktionsgefäße mehrfach invertiert und mit dem Vortex-Mischer behandelt werden, um die Kultur zu mischen! Zum NACHWEIS DER TRANSFORMATION werden die Bakterien auf selektiven Standard I-Platten ausgestrichen, welche das Antibiotikum Kanamycin enthalten. - Von allen Ansätzen werden zunächst jeweils 100µl gleichmäßig auf eine KanPlatte mit einer Pipette verteilt. Der Rest von 900µl wird 30'' in einer Eppendorf Tischzentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit (13000 UpM ≈ 12000 g) zentrifugiert. Der Überstand wird abgegossen, das Sediment in einem kleinen Rest Überstand resuspendiert und alles wieder auf jeweils eine Kan-Platte verteilt (die Zellzahl bleibt, das Medium-Volumen wird reduziert). - Platten bei Raumtemperatur trocknen lassen und dann mit dem Boden nach oben bei 37° C im Wärmeschrank mindestens 12 h inkubieren. Abb. 14 Agarplatten nach der Transformation Abb. 15 Karte des Plasmids pBK-CMV Auswertung: Ermitteln Sie die Anzahl der transformierten Zellen in Abhängigkeit von der Plasmidmenge (Transformationseffizienz). Berechnen Sie für jeden Ansatz, wie viele Plasmidmoleküle je eingesetzte, kompetent gemachte Zelle vorhanden sind. Leiten Sie daraus Schlüsse für die Transformationseffizienz ab. Molare Masse eines Basenpaares ≈ 660 g/mol ; Plasmidgröße von pBK: 4518bp - 15 - 4. BAKTERIOPHAGEN 4.1 Nachweis und quantitative Bestimmung von Phagen (Bestimmung des Titers / der Konzentration einer Phagensuspension ) Material: Bakteriophage: λ C; Titer ≈ 108 Phagen/ml Wirtsbakterien: Escherichia coli C Übernachtkultur (ÜNK); Titer ca. 2.109 Zellen/ml Durchführung: Abb. 16 Pipettierschema zur Titerbestimmung Bakteriophagen können indirekt durch die sog. Plaquebestimmung nachgewiesen werden. Dazu werden Phagen bis zu einer Konzentration von etwa 102 Phagen/ml verdünnt. Eine kleine Menge - 0.1 ml - der verdünnten Phagen wird zusammen mit 0,1 ml (≈ 108) Indikatorbakterien ausplattiert. Am nächsten Tag ist ein dichter Bakterienrasen über die ganze Platte gewachsen. Sie erscheint trüb; nur da, wo ein Klon von Phagen die Bakterien lysiert hat, gibt es ein kleines Loch (Plaque). Die Zahl der Plaques entspricht direkt der Anzahl der infektiösen Phagenpartikel. Die Berechnung des Ausgangstiters ergibt sich aus der Verdünnung. 50 - 200 Plaques (je nach Größe) pro Standard I-Platte können gut ausgezählt werden. Die Verdünnungsreihen werden in 10-1 Schritten durchgeführt. Zum Verdünnen wird λG-Puffer verwendet. Pipetten gut abstreifen, jede Verdünnung gut mischen. Es sollen Platten mit je 10, 100 und 1000 Plaques (kalkuliert) hergestellt werden. Platten schon vor dem Plattieren mit dem Verdünnungsschritt beschriften !!! Plattieren: Weichagar wurde bei 100o C im Wasserbad geschmolzen (Praktikumsbetreuung). Je 2,5 ml verflüssigter, heißer Weichagar wird in kleine, im Wasserbad auf 48o C vorgewärmte Wassermannröhrchen verteilt. Zum Weichagar werden 0,1 ml Bakterien Übernachtkultur (ca. 2 x109/ml) und 0,1 ml Phagenverdünnung zugegeben, gemischt, auf eine Standard I-Agarplatte (8,5 cm Ø) gegossen und durch vorsichtiges Schwenken gleichmäßig über die gesamte Oberfläche verteilt. Es können in mehrere Röhrchen Weichagar und 0,1 ml Bakterien vorpipettiert werden (mit einer 0,5 ml oder 1,0 ml Pipette), die jedoch innerhalb von 4 min mit der - 16 zupipettierten Phagenverdünnung ausplattiert werden müssen. Nach Erstarren des Weichagars (ca. 3 min) werden die Platten umgedreht bei 37o C inkubiert. Zwischen 5h und 12h nach Beginn der Inkubation kann man Plaques deutlich erkennen. Die Platten werden am Boden beschriftet. Tatsächliche Verdünnung notieren, d.h., da 0,1 ml Phagensuspension in den Weichagar pipettiert werden und der Titer immer in Phagen/ml angegeben wird, handelt es sich um einen zusätzlichen Verdünnungsschritt (1:10!). Rechenbeispiel: von einer 10-2 Verdünnung werden 0,1 ml plattiert = Verdünnungsfaktor 1000; dieser wird multipliziert mit der Anzahl der ausgezählten Plaques und ergibt die Anzahl der infektiösen Phagen/ml (PFU/ml) in der Suspension. Auswertung: Bestimmen Sie den Titer der Phagensuspension. Beschreiben Sie das Aussehen der Plaques (Durchmesser, Rand, klar oder trübe). Wodurch wird die Größe eines Plaques beeinflußt? 4.2 Wechselwirkung von Bakteriophagen mit ihren Wirtszellen Theorie: Lysogenie - Immunität - Virulenz - Resistenz - Wirtsbereich Bakteriophagen sind Viren (intrazelluläre Parasiten), die auf Bakterien parasitieren. Sie befallen ihre Wirtszelle, indem sie an sie adsorbieren, ihre Nukleinsäure injizieren und den Syntheseapparat der Zelle auf die Synthese virusspezifischer Makromoleküle umprogrammieren. Nach der so erreichten Synthese von Nachkommen (bei Lambda ca. 100 Viren pro Zelle) wird die Zelle durch ein virusspezifisches Enzym (Lysozym) von innen lysiert und die Phagen entlassen. Ein neuer lytischer Infektionszyklus kann beginnen. Nicht alle Viren vermehren sich nur lytisch. Es gibt Phagen, deren DNA ins Bakteriengenom integriert ist (als Prophage). Ein Beispiel ist der Bakteriophage λ. Nach der Infektion der Zelle kann seine DNA ins Bakterienchromosom integrieren und der Phage lässt sich als ein Teil des Chromosoms mitvermehren. Dabei stirbt die Zelle nicht. Man nennt sie lysogen, da unter bestimmten Umständen - selten der Prophage das Chromosom verlassen (dieser Vorgang heißt Induktion) und sich dann wieder lytisch vermehren kann. Im lysogenen Zustand ist die Zelle immun gegen eine neue Infektion, da als Folge der in das Chromosom integrierten PhagenDNA ein Protein (Repressor) synthetisiert wird, das die neu eindringenden Phagen ebenso wie den Prophagen an der lytischen Vermehrung hindert. Es gibt allerdings Mutanten der Phagen, die unempfindlich gegen den Repressor sind, sich daher auch in lysogenen Zellen vermehren und als virulent bezeichnet werden. Manche Wirtszellen sind resistent gegen Phageninfektion. Solche Zellen haben veränderte Oberflächeneigenschaften, aufgrund derer die Phagen sie nicht infizieren können, da sie nicht adsorbieren. Diese Resistenz ist sehr eng begrenzt. Nahe verwandte Phagen, die einen anderen Wirtsbereich haben, können eine gegen einen bestimmten anderen Phagen resistente Zelle erfolgreich infizieren. - 17 Material: Sie erhalten folgende E. coli-Stämme (mit Code-Buchstaben X,Y,Z): JM 101, λ+ : λ sensitiv, nicht lysogen, Φ80 sensitiv Hfr (λ) : λ lysogen (λ immun), Φ80 sensitiv JM 101, λ : λ resistent, Φ80 sensitiv Sie erhalten folgende Phagen (mit Code-Zahlen 1,2,3) λc I (Mutation im λ-Repressorgen) λvir (virulent) (Mutation im λ-Operatorgen = Bindungsstelle für Repressor) Φ80 (λ-ähnlicher Phage mit anderer Immunität u. anderem Wirtsbereich) Durchführung: Sie geben je 0,1 ml der Bakterienkultur in 2,5 ml Weichagar (wird bereitgehalten) und gießen pro Kultur eine Platte. Nun bringen Sie auf jede Platte je 4µl des Phagenlysats vorsichtig mit Gilson-Pipette auf. Die Platten werden bei 37°C inkubiert. Abb. 17 Platten und Beschriftung des Tropfversuchs zur Immunität Auswertung: Am nächsten Tag sind die Lysezonen (viele überlappende Plaques) sichtbar. Die Identität der Bakterienstämme X, Y und Z bzw. der Phagen 1, 2 und 3 ist aufgrund der Ergebnisse anzugeben. 4.3 Restriktions-Modifikationssysteme in Bakterien Viele Bakterien enthalten ein Enzyme, die fremde DNA erkennen und degradieren können (Restriktionsenzyme). Viren, die auf einem "fremden" Wirt plattiert werden, unterliegen ebenfalls diesem Vorgang und plattieren mit sehr niedriger Effizienz (Efficiency of plating = EOP << 1 = Restriktion der Phagenvermehrung). Durchführung: Es wird jeweils eine Indikatorplatte von E. coli B, C und K angelegt. Dazu werden jeweils 0,1 ml der Bakterien zu 2,5 ml Weichagar von 48°C gegeben, gemischt und auf einer Standard I-Platte durch Schwenken gleichmäßig verteilt. Nach dem Erstarren des Agars wird jeweils 4µl der jeweiligen Phagenver-dünnung vorsichtig in ein Quadrat eines Schachbrettmusters, welches man unter die Agarplatte legt, mit der Gilsonpipette aufgetropft. Die Spitze wird beim Wechsel der Phagenverdünnung durch eine neue ersetzt. (3 Pipettierschritte mit einer Spitze) Bevor die Platten bei 37°C inkubiert werden, müssen die Tropfen ganz eingezogen sein, da sie sonst ineinander laufen und die Auswertung unmöglich wird. Material: Die Konzentration der Phagensuspensionen, die Sie erhalten, liegt bei 107 PFU/ml - 18 4 µl dieses Lysats entsprechen ca. 104 Phagen Sie müssen jeweils drei 10-1-Verdünnungen der Phagen mit λG-Puffer herstellen. Nach folgendem Schema auftropfen: Anzahl Phagen/4µl (Verdünnungsstufe) λB ~104 (4µl von 107/ml = unv.); ~103 (1:10); ~102(1:100) ~101 (1:1000) λC ~104 (4µl von 107/ml = unv.); ~103 (1:10); ~102(1:100) ~101 (1:1000) λK ~104 (4µl von 107/ml = unv.); ~103 (1:10); ~102(1:100) ~101 (1:1000) Abb. 18 Platten und Tropfschema zum Versuch Modifikation/Restriktion Auswertung: Anlage einer Tabelle über Lysezonen-/Plaquebildung (Anzahl) in Abhängigkeit von Wirtszelle und Phage. Leiten Sie aus den Ergebnissen Aussagen über den Wirkungsmechanismus des Restriktionssystems ab. MEDIEN KRISTALLVIOLETT-LÖSUNG Vorratslösung: 2 g Kristallviolett in 50 ml Ethanol 96% p.A. auflösen. Arbeitslösung: Vorratslösung 1 : 9 mit Aqua dest. verdünnen. Lösung ist 1 - 2 Wochen haltbar. LUGOL'SCHE LÖSUNG (JOD-JODKALIUM) 1 g Jod + 2 g Kaliumjodid in ca. 5 ml Aqua dest. im Mörser verreiben, in 300 ml Aqua dest verdünnen (1 : 60) MALACHITGRÜN-LÖSUNG 10 g Malachitgrün in 400 ml Aqua dest. lösen, danach filtrieren. SAFRANIN-LÖSUNG 3 g Safranin in 100 ml siedendem Aqua dest. lösen, danach filtrieren. LB- MEDIUM 10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Yeastextr., 10 g NaCl ad 950 ml H2O, lösen, mit 1 M NaOH pH 7.0 einstellen ad 1 l H2O zugeben und autoklavieren. LB - PLATTEN Wie LB - Medium jedoch mit 15g Agar/l zusätzlich ad 1 l H2O zugeben . λG-PUFFER 1. Folgende Stammlösungen herstellen: Tris/Cl 1 M pH 7.4 (1 Mol = 121,14 g/l; mit HCl auf pH 7.4); MgSO4 1 M; NaCl 5M; Gelatine 10 %ig 2. λG-Puffer komplettieren: Tris/Cl pH 7.4 (1 M) 50 ml; MgSO4 (1 M) 20 ml; NaCl (5 M) 10 ml Gelatine 10%ig 10 ml (vorher im Wasserbad erwärmen) abmessen, zusammengießen, auf 1000 ml mit Aqua dest. auffüllen, abfüllen und autoklavieren. - 19 MAC CONKEY-AGAR Wirkungsweise: Die Gallensalze und das Kristallviolett hemmen weitgehend die grampositive Flora. Lactose dient im Zusammenhang mit dem pH-Indikator Neutralrot zum Nachweis des Lactoseabbaus. ZUSAMMENSETZUNG Pepton aus Casein 17 0 g/l; Pepton aus Fleisch 3.0 g/l Lactose 10.0 g/l; Gallesalzmischung 1.5 g/l Natriumchlorid 5.0 g/l; Neutralrot 0.03 g/l Kristallviolett 0.001 g/l; Agar 13.5 g/l HERSTELLUNG 50 g Fertigmedium werden in 1 Liter destilliertem oder vollentsalztem Wasser suspendiert und 15 min eingeweicht. Anschließend wird bis zum vollständigen Auflösen gekocht. Die Sterilisation erfolgt im Autoklaven (15 min bei 121° C). Der auf ca. 50° C abgekühlte Nährboden wird zu Platten gegossen. Vor dem Beimpfen soll die Oberfläche des Nährbodens gut abtrocknen. PH-Wert des gebrauchsfertigen Nährbodens bei 370 C : 7,1 + 0,1. MAC-CONKEY-NAL-AGAR Fertigmedium + 50 µg/ml Nalidixinsäure in 1 M NaOH Endkonzentration vor Zugabe (in auf ca. 50°C abgekühltes Medium) lösen. STANDARD I - NÄHRBOUILLON (FERTIGMEDIUM) Zusammensetzung: Spezialpepton15.6 g/l, Hefeextrakt 2.8 g/l, Natriumchlorid 5.6 g/l, D (+)-Glucose 1.0 g/l 25 g Fertigmedium werden in 1 Liter Aqua dest. vollständig gelöst. Die Sterilisation erfolgt im Autoklaven. pH-Wert des gebrauchsfertigen Nährbodens bei 37° C: 7,5 + 0,1. Zur Herstellung von Agarplatten 1.5% Agar zusetzen und autoklavieren, d.h. für einen Liter Plattenmedium werden zu 25 g Fertigmedium 15 g Agar trocken eingewogen und nach Zugabe von VE-Wasser auf dem Magnetrührer gelöst. STANDARD II-NÄHRBOUILLON (FERTIGMEDIUM) Zusammensetzung: Spezialpepton 8.6 g/l, Natriumchlorid 6.4 g/l BEREITUNG: 15 g Fertigmedium werden in 1 l Aqua dest. vollständig gelöst. Die Sterilisation er-folgt im Autoklaven. pH-Wert des gebrauchsfertigen Nährbodens bei 37° C 7.5 ± 0.1. Zur Herstellung von Platten werden 1.5 % Agar zugesetzt und der Nährboden sterilisiert. STANDARD II - PLATTEN FÜR ZUCKERVERWERTUNGSTEST Standard II Nährbouillon 15 g/l; Agar 1.5% (= 15 g/l); Phenolrot 20m g/l WEICHAGAR Standard I-Bouillon + 0.6 % Agar ansetzen und aufkochen, bis sich der Agar aufgelöst hat; dann in Meplatflaschen abfüllen (ca. halb füllen), verschließen und autoklavieren. ZUCKERBLÄTTCHEN Mit einem Locher aus Filterpapier (3MM-Papier) Blättchen stanzen. Die Blättchen werden zunächst in einem Becherglas bei 150° C trocken sterilisiert. Man tränkt sie dann mit der sterilen Zuckerlösung und trocknet sie getrennt in sterilen Plastik-Petrischalen 1 Stunde bei 70° C.
