Persistent virus integration into the genome of it`s algal host
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Persistent virus integration into the genome of it's algal host, Ectocarpus siliculosus (Phaeophyceae) Nicolas Delaroque, Ingo Maier, Rolf Knippers & Dieter G.Müller Fakultät für Biologie, Universität Konstanz Journal of General Virology (1999) (Short Communication) Persistent virus integration into the genome of it's algal host, Ectocarpus siliculosus Phaeophyta | Virus | Verhalten | Experimente/Ergebnisse | Diskussion | Quellen Systematik: Phaeophyta Domäne: Eukaryoten (Eucaryota) Reich: Protisten (Protista) Unterreich: Stramenopile (Stramenopila) Abteilung: Braunalgen Ordnungen : Chordariales Desmarestiales Dictyosiphonales Ectocarpales Fucales Sphacelariales ­ Thallus nur wenige cm ­> besteht aus verzweigten Fäden (interkalares Wachstum) ­ Bewohner des Benthos, wachsen als Lithophyten auf Felsen oder anderem festen Untergrund ­ können bis zu 100m lang werden und in bis zu 150m Tiefe vorkommen ­ Chlorophyll a & c als akzessorische Pigmente, als pigmentüberdeckendes Pigment dient braunes Fucoxanthin ­ saure Polysaccharide (Alginate) gewonnen, die als Gelbildner ­ isomorphen und heterophasischen Generationswechsel aufweisen Persistent virus integration into the genome of it's algal host, Ectocarpus siliculosus Phaeophyta | Virus | Verhalten | Experimente/Ergebnisse | Diskussion | Quellen isomorphen und heterophasischen Generationswechsel ● Sporophyt (2n = 50) : relativ klein und nur kurze Zeit vorhanden vegetative Vermehrung ● Gametophyt (1n) : ● eigentlicher Tang meist etwas stärker verzweigt unilokuläre Sporangien : nach meiotischer Teilung entstehen Zoosporen (1n) ● >> daraus entstehen nach vielen mitotischen Teilungen die haploiden Gametophyten (zu 50% weibl. oder männl.) Gameten vereinigen sich dann später zur Zygote ● >> wichtige Angriffsstelle für den Virus! Persistent virus integration into the genome of it's algal host, Ectocarpus siliculosus Phaeophyta | Virus | Verhalten | Experimente/Ergebnisse | Diskussion | Quellen EsV­1 : ● ­ zirkulär, dsDNA (320kbp) ­ icosaedrische Struktur des Capsids ­ infiziert unizelluläre Gameten/Zoosporen (zellwandfrei) ­ latente Präsenz in allen somatischen Zellen des Wirtes ­ Vermehrung erfolgt nur in den generativen Zellen (Sporangien) Persistent virus integration into the genome of it's algal host, Ectocarpus siliculosus Phaeophyta | Virus | Verhalten | Experimente/Ergebnisse | Diskussion | Quellen Verhalten der Alge bei Infektion : ● ­ Sporangien/Gametangien können mit Viren gefüllt sein [a] ­ latent infizierte Pflanzen zeigen keine Symptome > können entwicklungsfähige Sporen bilden [b] ­ Genom wird in der Meiose nach MENDEL weitergegeben (PCR­Analysen) offene Frage: Ist die virale DNA als Episomen vorhanden oder liegt die genomische Information frei vor? [a] [b] Persistent virus integration into the genome of it's algal host, Ectocarpus siliculosus Phaeophyta | Virus | Verhalten | Experimente/Ergebnisse | Diskussion | Quellen Materialien: ● DNA von Zoosporen/Gameten infizierter bzw. nichtinfizierter Zellen ­ PAr 10n­Stamm (keine Infektion) [b] ­ NZVicZ14 (gesunder weiblicher Gametophyt) >> produzierte Viren und infizierte Zoosporen >> virale DNA­Präperation ­ Nap R­B1 latent infizierter Stamm [d] (phänotypisch normaler männlicher Gametophyt) >> produziert keine Vironen ­ 2°C über Nacht ... zum Sporolieren gebracht mit Hilfe von Volumenverkleinerungen und Erhöhung der Temperatur (18°C) und der Lichtintensität [d] [b] Persistent virus integration into the genome of it's algal host, Ectocarpus siliculosus Phaeophyta | Virus | Verhalten | Experimente/Ergebnisse | Diskussion | Quellen Test auf Infektion ● PCR­Analyse zeigte (bild rechts) ● Detektion von viraler DNA­Stücken M 1 1. EsV­1 Vironen 2. Gameten von Par 10n 3. Sporen von NZVicZ14 4. Sporen von Nap R­B1 ● Isolierung erfolgreich, Teile des Genoms sind inseriert 1033 bp 653 bp Abb.1 virale DNA 2 3 4 Persistent virus integration into the genome of it's algal host, Ectocarpus siliculosus Phaeophyta | Virus | Verhalten | Experimente/Ergebnisse | Diskussion | Quellen DNA von Zoosporen und Gameten infizierter und nichtinfizierter Zellen ● 1. DNA der Vironen 2. Par n10 3&5 NZVicZ14 4. Nap R­B1 ­ 3&4 zeigen keine freie virale DNA >> PCR konnte keine virale DNA detektieren, aber in Abb.1 konnte DNA festgestellt werden >> weitere Untersuchungen mit Southern­Blotting (keine guten Ergebnisse, Hybridizierung schwierig) Abb.2 Puls­Feld­Gelelektrophorese Persistent virus integration into the genome of it's algal host, Ectocarpus siliculosus Phaeophyta | Virus | Verhalten | Experimente/Ergebnisse | Diskussion | Quellen ● Alternative ­ einzelne Banden werden isoliert ­ Behandlung der Agarblöckchen mit Beta­Agarase1 ­ PCR mit spezifischen Primern von EsV­1 Persistent virus integration into the genome of it's algal host, Ectocarpus siliculosus Phaeophyta | Virus | Verhalten | Experimente/Ergebnisse | Diskussion | Quellen ­ Kontrollexperiment ­ positive Signale erhalten, dass unabhängig von Konzentration ist DNA­Fragmente gereinigte EsV­1 DNA Persistent virus integration into the genome of it's algal host, Ectocarpus siliculosus Phaeophyta | Virus | Verhalten | Experimente/Ergebnisse | Diskussion | Quellen ­ 2. Kontrollexperiment ­ auch hier positives Signale erhalten zelluläre DNA von Par 10n Persistent virus integration into the genome of it's algal host, Ectocarpus siliculosus Phaeophyta | Virus | Verhalten | Experimente/Ergebnisse | Diskussion | Quellen Eigentliche Experimente ­ infizierte Zellen zeigten immer virale DNA, egal ob von Sporen [c] oder Gameten [d] am wichtigsten ! ­ die gefundenen Signale, liegen nicht nur an den Stellen, an denen intakte oder Frakmente zu erwarten waren NZVicZ14 Nap R­B1 Persistent virus integration into the genome of it's algal host, Ectocarpus siliculosus Phaeophyta | Virus | Verhalten | Experimente/Ergebnisse | Diskussion | Quellen letztes Experiment ­ um sicher zu gehn, dass DNA nicht chemisch/mechanisch gebunden oder eingeschlossen ist, wurden nochmals PFGE gemacht 1. 600kbp­Komplex wurde herausgeschnitten >> änl. Abb.2 und PCR/und Elektrophoreseuntersuchungen >> Ergebnisse ähnlich wie in Abb.3 Ergebniss: es wird ein kovalenter Komplex zwischen beiden Genomen ausgebildet!! Persistent virus integration into the genome of it's algal host, Ectocarpus siliculosus Phaeophyta | Virus | Verhalten | Experimente/Ergebnisse | Diskussion | Quellen Diskussion ­ mölglich das EsV­1 DNA, als „Provirus“ integriert wird und dann in latent infizierten Zellen vorkommt ! PCR Methode gibt keinen quantitativen Vergleich! > Daher kann die Anzahl der integrierten Genome/Nucleus nicht festgestellt werden. Inseriert das Genom an spezielle Sequenzen, im Wirtsgenom, oder eher zufällig?? > Dafür muss erst die gesamte Sequenz von E.siliculosus aufgeschlüsselt werden. Wie wird die inserierte DNA „ruhig“ gehalten?? ! Virus zeigt keinen Einfluss auf das Wachstum, der Alge! >> Transformationsvektor?? Persistent virus integration into the genome of it's algal host, Ectocarpus siliculosus Phaeophyta | Virus | Verhalten | Experimente/Ergebnisse | Diskussion | Quellen Persistent virus integration into the genome of its algal host, Ectocarpus siliculosus > Nicolas Delaroque, Ingo Maier, Rolf Knippers & Dieter G.Müller; Fakultät für Biologie, Universität Konstanz; Journal of General Virology (1999)
