UE Molekulare Biologie und Biochemie

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UE Molekulare Biologie und
Biochemie
Kurs Enzymkinetik: Alkalische Phosphatase
Prof. Albert Duschl
Kinetik chemischer Reaktionen:
Aktivierungs-Energie
Enzyme verringern die
Aktivierungs-Energie
freiwerdende
Energie
Kinetik chemischer Reaktionen:
Geschwindigkeit
Energie
Verringerung der Aktivierungs-Energie führt zu
höherer Reaktionsgeschwindigkeit,
weil es mehr Moleküle gibt, deren Energie für
eine Überschreitung der Barriere groß genug
ist.
Y (ohne Enzym)
Energie-Verteilung in einem Pool
von Molekülen
n
X (mit Enzym)
X
Energie
Y
Alkalische Phosphatase:
katalyt. Zentrum
Strukturelle Eigenschaften
Ser-102
2 Untereinheiten mit je 1 katalytischen Zentrum.
Der Rest Ser102 bindet während der
enzymatischen Reaktion transient kovalent die
Phosphat-Gruppe
2 Zn++ Ionen im katalytischen Zentrum sind für
die Aktivität essentiell.
1 Mg++ Ion bindet allosterisch und erhöht die
Aktivität.
Glycoprotein
Typ 4-Membranprotein: Durch kovalent
gebundenes Lipid (Phosphatidyl-Inositol-Anker)
an der Außenseite der Zell-Membran lokalisiert.
A
B
Alkalische Phosphatase: Funktion
Katalysiert die Hydrolyse von Phosphorsäure-Estern:
O-
O- Ser-102
R—O—P==O
R—OH +
O-
HO—P==O
OH2O
pH-Optimum im alkalischen Bereich (9 – 11)
Beispiele für Substrate:
5‘ Phosphat-Reste an Nucleinsäuren
Phosphat-Reste an Proteinen (Ser, Thr, Tyr)
ATP
Synthetische organische Verbindungen
A
B
Was geschieht im katalytischen Zentrum?
Ser-102
O
R—O—P==O
O-
O
R—O—P==O
O-
B
Bindung von Zink
Zn++
Zn++
O-
R—O—P==O
OZn++
OR—O—P==O
OZn++
Ser-102
Assoziation des Substrats
Enzym
Ser-102
Ser102
Zn++
O-
OH
R—O—P==O
OZn++
Enzym
O
R—OH Ser-O-P==O
O-
Dissoziation des Substrats, Regeneration des
Enzyms
Enzym
Enzym
OIOHSer-O-P==O
O-
O
Ser-OH
HO-P==O
O-
Nachweisreaktion
p-Nitrophenyl-Phosphat
(farblos)
Nitrophenolat Anion
(gelb)
Nitrophenon
(gelb)
Geschwindigkeit von Enzym-Reaktionen
1) Je mehr Substrat desto höher die Geschwindigkeit, aber ...
2) ... je höher der Besetzungsgrad der vorhandenen Enzym-Moleküle,
desto schwieriger ist es für neue Substrat-Moleküle
ein freies Enzym zu finden.
3) Wenn alle verfügbaren Enzym-Moleküle mit Substrat besetzt sind,
ist die maximal mögliche Geschwindigkeit erreicht.
Geschwindigkeit von Enzym-Reaktionen
Maximal-Geschwindigkeit
50
Geschwindigkeit
Wenn man die ReaktionsVmax
Geschwindigkeit gegen die
Substrat-Konzentation aufträgt,
erhält man eine
Vmax / 2
Sättigungskurve, die einem
Maximalwert zustrebt
40
30
20
10
0
Die halbmaximale Geschwindigkeit ist
erreicht, wenn die Hälfte aller EnzymMoleküle mit Substrat besetzt sind.
0
50
100
150
200
250
Substrat-Konzentration
300
Geschwindigkeit und Affinität
Die Michaelis-Konstante
60
Geschwindigkeit
Je besser ein Substrat an ein
Enzym binden kann, desto
geringer ist die SubstratKonzentration, die nötig ist
um die Hälfte aller EnzymVmax / 2
Moleküle zu besetzen.
50
40
30
20
10
0
0
200
400
600
800
Substrat-Konzentration
1000
Geschwindigkeit und Affinität
Das Michaelis-Menten Diagramm
Km ist die Substrat-Konzentration,
bei der die halb-maximale
Reaktions-Geschwindigkeit
erreicht wird.
60
Geschwindigkeit
Je höher die Affinität eines
Substrates zum Enzym, desto
geringer ist die SubstratKonzentration, die nötig ist
um die Hälfte aller EnzymVmax / 2
Moleküle zu besetzen.
50
40
30
20
10
0
0
200
400
600
800
Substrat-Konzentration
Km ist also eine Konzentration,
mit der Dimension mol x l-1
Km
1000
Probleme mit der Hyperbel-Auftragung
?
Am Michaelis-Menten Diagramm ist
Vmax nur ungenau zu ermitteln.
Damit wird auch die Bestimmung
von Vmax / 2 ungenau und ...
Geschwindigkeit
Vmax
50
40
30
20
10
0
0
20
40
60
80
Substrat-Konzentration
... infolgedessen auch die
Bestimmung des Km-Werts.
Km ungenau
100
Das Lineweaver-Burk Diagramm:
... nur eine andere Darstellung
Im Lineweaver-Burk Diagramm
werden anstelle von V gegen S die
Kehrwerte 1/v gegen 1/S
aufgetragen.
0.1
1/v
0.08
0.06
Die Michaelis-Konstante Km finden
wir dann exakt am Schnittpunkt der
Geraden mit der X-Achse
als -1/Km
0.04
0.02
0
-0.01
-0.005
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
1/S
- 1 / Km
Das Lineweaver-Burk Diagramm:
... hat auch seine Schwächen
Im Lineweaver-Burk Diagramm
gehen die einzelnen Werte nicht mit
gleichem Gewicht ein, einer davon
(►) bestimmt die Steigung ganz
deutlich. Wenn das Enzym nicht nach
Michaelis-Menten geht dann merkt
man das nicht immer.
0.1
1/v
0.08
►
0.06
0.04
0.02
Alternativen: Eadie-Hofstee (v über
v/[S]) oder Hanes ([S]/v über [S]).
Versuchen sie‘s ruhig mal.
0
-0.01
-0.005
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
1/S
- 1 / Km
Inhibition von Enzymreaktionen
kompetitive Inhibitoren

Kompetitive Inhibitoren haben
strukturelle Ähnlichkeiten mit dem
Substrat und binden reversibel ans
katalytische Zentrum.

Ein Überschuß an Substrat kann den
Inhibitor verdrängen.

Km wird dadurch SCHEINBAR erhöht
(weil mehr Substrat gebraucht wird,
um die Hälfte aller Enzymmoleküle zu
besetzen).
Geschwindigkeit
60
50
40
30
20
10
0
0
200
400
600
800
Substrat-Konzentration
1000
Inhibition von Enzymreaktionen
allosterische Inhibitoren



Allosterische Regulatoren binden
NICHT an dieselbe Stelle wie das
Substrat.
Km bleibt daher unverändert, aber
Vmax sinkt.
Geschwindigkeit
60
50
40
30
20
10
0
0
200
400
600
800
Substrat-Konzentration
1000
Versuch A1
Bestimmung von Km und Vmax der AP
5 Reaktions-Ansätze mit steigenden Substrat-Konzentrationen
1)
Pipettieren Sie in der nachstehenden Reihenfolge:
Puffer  Wasser  Substrat
2) Mit jedem Ansatz separat:
Starten Sie die Reaktion durch Zugabe des Enzyms, mischen Sie und dann gleich
ins Meßgerät
3) Notieren Sie die Absorption genau 20“ und 80“ nach Reaktions-Start.
Versuch A1
Bestimmung von Km und Vmax der AP
Auswertung:
1. Reaktions-Geschwindigkeit: als Dc/min (aus D OD/min)
1.1. Konzentrations-Änderung: aus DOD nach Lambert-Beer
DAbs = e x Dc x d  c = DAbs / (e x d)
1.2. V als Dc/min
2. Kehrwerte von V und S
3. Lineweaver-Burk Diagramm zeichnen
4. Km und Vmax grafisch ermitteln
Bringen Sie bitte einen Taschenrechner mit!
Versuch A2
Kompetitive Inhibition durch Phosphat

Als Endprodukt der Reaktion ist Phosphat ein kompetitiver
Inhibitor.

Durchführung und Auswertung: exakt wie A1, nur mit einem
Puffer, der 0.5mM Phosphat enthält.

Ki: (beschreibt analog zu Km die Affinität des Inh. zum Enzym
die für kompetitive Inhibitionen typische scheinbare Erhöhung
von Km läßt sich durch folgende Gleichung ausdrücken:
Km‘ = Km x (1 + I/Ki)
Km = ohne Inhibitor
Km‘ = mit Inhibitor
I
= Konz. d. Inhibitors
[I] kennen Sie aus dem Puffer-Rezept,
Km und Km‘ haben Sie gemessen
und damit sollten Sie Ki nach obiger Gleichung
berechnen können.
Versuch B:
pH-Optimum der AP

Durchführung: wie A1, aber

unter Substrat-Sättigung (für Vmax) in
allen Ansätzen und

in Puffer-Lösungen mit
unterschiedlichen pH-Werten

Ergebnis:
Zeichnen Sie ein Diagramm, in dem die
Reaktions-Geschwindigkeit gegen den
pH-Wert aufgetragen wird.
Versuch C:
Allosterische Regulation

AP benötigt Zn++ Ionen um aktiv zu sein
und wird durch Mg++ zusätzlich aktiviert.

EDTA entzieht zweiwertige Kationen und
inaktiviert dadurch das Enzym.

Dieser EDTA-Effekt läßt sich durch einen
Überschuß an Zn++ rückgängig machen.
Versuch C:
Allosterische Regulation
Reaktions-Ansatz 1:
800 µL Puffer
80 µL Substrat
80 µL Wasser
40 µL Enzym

Stellen Sie die Küvette ins Photometer
und notieren Sie 3 min. lang alle 30“ die
Absorption.
Reaktions-Ansatz 2:
800 µL Puffer
80 µL Substrat
80 µL Wasser
10 µL EDTA
40 µL Enzym

Stellen Sie die Küvette ins Photometer
und notieren Sie 3 min. lang alle 30“ die
Absorption.

Danach geben Sie in dieselbe Küvette
50 µL ZnCl2 und messen nochmals 3
min. wie zuvor.
Auswertung: Tragen Sie die Absorptionen aus
beiden Experimenten in einem gemeinsamen
Diagramm gegen die Zeit auf.
Nachtrag:
Photometrie
Photometrie:
Abs = -
10log
(
I
Io
)
Io 
Beispiele:
Abs.
I/
Io = 1
 - 10log (1)
=0
I/
Io = 0.1
 - 10log (0.1)
=1
I/
Io = 0.01
 - 10log (0.01) = 2
I/
Io = 0.001  -
10log
(0.001) = 3
I
Photometrie:
Abs = -
10log
(
I
Io
)
Io 
Abs = -
10log
(
I
Io
) =e x
I
cxd
e = ein Proportionalitäts-Faktor (der „molare Extinktions-Koeffizient“)
C = die Konzentration
D = die Schichtdicke der Küvette
Photometrie:
Schichtdicke
Einfache Schichtdicke
1
Abs:
 0.1
 1
Abs = -
10log
(
I
Io
) =e x
cxd
Doppelte Schichtdicke
1  0.1  0.01
Abs:  1  2
doppelte Schichtdicke ergibt
doppelte Absorption
Photometrie:
Abs = -
10log
Konzentration
1  0.1
Abs:
 1
1  0.1  0.01
Abs:  1  2
(
I
Io
) =e x
cxd
1  0.01
Abs:  2
doppelte Konzentration ergibt
doppelte Absorption
Photometrie:
Abs = -
10log
Was steckt hinter e, dem
molaren Extinktions-Koeffizienten ?
(
I
Io
) =e x
cxd
• Die Fähigkeit eines Moleküls, Licht zu
absorbieren hängt mit der chemischen
Struktur der Substanz zusammen.
( delokalisierte Orbital-Systeme!)
• Stellen sie sich vor, Sie lösen einen Löffel
Zucker in einer Tasse Wasser.
.............. oder einen Löffel Kaffee.
?
e ist die Absorption einer 1M Lösung in einer
Küvette mit 1cm Schichtdicke [L x mol-1 x cm-1]
Protoporphyrin IX
(die Grundstruktur von Häm,
dem roten Blutfarbstoff)
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