ENZYME

ENZYME
Teil 1: Grundlagen und
Substratbestimmungen
Metastabiler Zustand
Beispiel:
Glucose-6-Phosphat + H2O
•
Glucose + Pi
[Glc6P] [H20]
K=
= 1.135 x 10-3
[Glc] [Pi]
 Gleichgewicht stark auf Seite von Glc + Pi
•
DGo‘ = - 4.02 kcal mol-1 (Exergonische Reaktion)
 Reaktion läuft freiwillig ab!
ABER:
Beim Lösen von Glc6P in Wasser passiert aber
scheinbar nichts!
Vorrausetzungen
für den Ablauf einer Reaktion
Zusammenstoß der Moleküle:
•
•
Räumlich richtig !
Energiereich genug !
25 °C
75 °C
Energiezufuhr (Temperaturerhöhung) steigert die Reaktionsgeschwindigkeit !
Aktivierungsenergie
notwendige
Energie
die Energie, die man einem System
zuführen muß, damit die Reaktion
messbar schnell abläuft
Energieprofil
(unkatalysierte Reaktion)
DGH
DGR
A+ B
DG
C+ D
Aktivierungsenergie
Energieprofil
(enzymkatalysierte Reaktion)
EAB = Enzym-Substrat
Komplex
DGH
DGR
ECD = Enzym-Produkt
Komplex
A
E+A+B
E
B
C
E+C+D
DG
E
D
A+B+E  EAB  ECD  C+D+E
Enzymkatalysierte Reaktionen
benötigen geringere Aktivierungsenergie, weil:
•
•
•
Näherungseffekt
räumlich richtige Ausrichtung der Substrate durch
Bindung an Enzym
Milieueffekt
optimale Bedingungen für Reaktion am Enzym (pH,
Solvatisierung, etc)
Konformationsstreckungseffekt
durch Substratbindung Gestaltänderung des Enzyms
(Übergangszustand)
Enzymkatalysierte Reaktionen
•
Gleichgewicht
Ein Enzym verändert die Geschwindigkeit einer Reaktion
in Richtung des Gleichgewichts.
Das Gleichgewicht selbst kann aber nicht verändert
werden!
Wenn das Gleichgewicht einer Reaktion stark auf einer
Seite liegt spricht man von einer nicht umkehrbaren
Reaktion.
•
Hin- und Rückreaktion
Ein Enzym kann eine Reaktion in beide Richtungen
beschleunigen. Die Reaktion läuft aber immer in Richtung
Gleichgewicht ab.
Was sind Enzyme
Enzyme sind Biokatalysatoren, die die Aktivierungsenergie einer Reaktion herabsetzen können!
Unterschiede zu anderen Katalysatoren sind:
•
•
•
Spezifität
für die Substrate (Gruppen) und Reaktionen
Kapazität
sehr hohe Effizienz (Beschleunigung bis zu 1014-fach)
Regulation
Aktivität kann an Umweltbedingungen angepasst
werden.
Regulation von Enzymen
•
•
Proteinsynthese und Proteinabbau
Neusynthese des gewünschten Enzyms;
Aktivierung oder Deaktivierung von Genen
Konformationsänderung
(a) Allosterische Effekte
Effektoren (Inhibitoren oder Aktivatoren) binden an
regulatorisches Zentrum des Proteins
Allosterische Effekte
Inhibitor
Aktivator
Enzym
inaktiv
Enzym
aktiv
Regulation von Enzymen
•
•
•
Proteinsynthese und Proteinabbau
Neusynthese des gewünschten Enzyms;
Aktivierung oder Deaktivierung von Genen
Konformationsänderung
(a) Allosterische Effekte
Effektoren (Inhibitoren oder Aktivatoren) binden an
regulatorisches Zentrum des Proteins
(b) Kompetitive Hemmung
„Konkurrenz“ um das aktive Zentrum
Chemische Veränderung
Phosphorylierungen (Protein-Kinasen) oder
Dephosphorylierungen (Phosphatasen)
Einteilung von Enzymen
1. Oxidoreduktasen
Transfer von H, O oder e- von einem Substrat auf ein anderes
2. Transferasen
Transfer von chem. Gruppen zwischen Substraten
3. Hydrolasen
hydrolytischer Abbau
4. Lyasen
nicht-hydrolytische Spaltung von Bindungen
5. Isomerasen
Intramolekulare Umlagerungen
6. Ligasen
Knüpfung von kovalenten Bindungen unter ATP-Verbrauch
Benennung von Enzymen
Beispiel:
Fructose + NADP+  5-Anhydro-D-Fruktose + NADPH + H+
Bezeichnung
Fructose 5-Dehydrogenase
Fructose:NADP 5-Oxidoreduktase
Einteilung
EC-Nummer, hier EC 1.1.1.124
(Oxidoreduktase, wirkt an CH-OH Donoren, NAD oder NADP als
Akzeptor, Enzymnummer)
Analytisches Arbeiten
mit Enzymen
1. Enzymbestimmung
Bestimmung der Biologische Aktivität
 Bestimmung der Enzymaktivität
Daneben kann auch der Proteingehalt bestimmt
werden (z.B. mit Immunologischen Methoden)
2. Substratbestimmung
Bestimmung eines Analyten (eines Substrates)
mit Hilfe eines Enzyms
Das Enzym muß dazu aber käuflich erhältlich sein,
oder selbst gereinigt werden.
KSubstra onzetraion od.Prukt
Enzymreaktionen
Z
e
i
t
KSubstra onzetraion od. Produkt
Enzymreaktionen
Z
e
i
t
Enzymatische Substratbestimmung
Aufbau eines Testsystems
1.
Spezifisches Enzym
Enzym sollte nur das Substrat umsetzen
2.
Co-Substrate
wo notwendig muß man Co-Substrate (Co-Enzyme) einsetzen
3.
Reaktionsmilieu
pH-Wert, Pufferung, Aktivatoren, etc
4.
Detektionsmöglichkeit
(a) Direkte Messung mittels Extinktion
Produkt absorbiert, Substrat nicht (oder umgekehrt);
Co-Substrat oder Co-Produkt absorbiert
(b) Produktnachweis chemisch
5.
Abfangreaktionen
sind notwendig wenn das Gleichgewicht ungünstig liegt.
Das NAD(P)H-System
Die reduzierte Form des
Co-Substrats NADH oder
NADPH absorbiert Licht im
UV-Bereich bei 340 nm.
Die oxidierte Form NAD+
oder NADP+ aber nicht.
Universell mit Oxidoreduktasen anwendbar!
Bespiel: Sorbitbestimmung
D-Sorbit +
NAD+
SDH
D-Fruktose + NADH + H+
Extinko(340nm)
DE (NADH)
SDH
Probe + NAD+
Z
e
i
t
Extinko(340nm)
Allgemeine Überlegungen 1
A+B
C+D
Vorraussetzungen
• Gleichgewicht der Reaktion
liegt auf Seite von C +D
• [Cosubstrat] > [Analyt]
sonst kann nicht alles an
Probe verbraucht werden
Z
e
i
t
Extinko(340nm)
Allgemeine Überlegungen 2
A+B
C+D
Regeln
• v nimmt ab, wenn [c] kleiner
wird.
Steigung =
Geschwindigkeit
• Wenn A+B mit C+D im
Gleichgewicht, dann v = 0
(kein Netto-Umsatz)
• Konzentration (Aktivität) des
Enzyms ändert v, hat aber
keinen Einfluß auf den
Endpunkt (DE bleibt gleich)
Z
e
i
t
Bestimmung von Glu & Frc
1. Glukose + ATP
HK
Glukose-6-P + ADP
Reaktion nicht umkehrbar (vollständig)
Auch Fruktose wird umgesetzt
2. Glu-6-P +
NADP+
G6PDH
Glukonat-6P + NADPH + H+
Indikatorreaktion
3. Fructose-6-P
Zusatzreaktion
PGI
Glucose-6-P
PGI
E
GDH
HK
Frc
Glu
t
ENZYME
Teil 2: Enzymkinetik &
Enzymaktivitäts- und
Proteinbestimmung
Kinetik
unkatalysierte Reaktion
Wenn [S] >> [P]
() S  P ()
z.B. Hydrolyse von Saccharose in saurer Lösung
4
v
[S]
3
2
1
0
0
1
2
3
t
4
5
Kinetik
unkatalysierte Reaktion
Umformung der Grafik: Anfangsgeschwindigkeit
der Reaktion gegen die Substratkonzentration
linearer Zusammenhang !!
4
v = -d[S] dt-1 = k x [S]
k....Geschwindigkeitskonstante
v
3
2
1
0
0
1
2
[S]
3
4
Kinetik
unkatalysierte Reaktion
bimolekulare Reaktion
() ()
A + B C + D
() ()
v = -d[A] dt-1 = -d[B] dt-1 = k x [A] [B]
Enzymkinetik
enzymkatalysierte Reaktion
Anfangsgeschwindigkeit in Abhängigkeit der Substratkonzentration
Sättigungsbereich
linearer Bereich
v prop. [S]
Ursache der Sättigungskinetik ??
Ursachen der Sättigung bei
enzymkatalysierten Reaktionen ??
E + S  ES  EP  E + P
Wenn [S] >> [E] sind alle Enzymmoleküle mit Substrat
besetzt und eine höhere Umsetzungsrate v ist nicht möglich
# SÄTTIGUNGSKINETIK #
Michaelis-Menten-Gleichung
vmax . [S]
v = K + [S]
M
Sonderfall 1
Hohe Substratkonzentration
[S] >> KM

KM + [S] ~ [S]
die Gleichung geht über in v = vmax
Sättigung - v unabhängig von [S]
Sonderfall 2
[S] << KM
Niedrige Substratkonzentration

KM + [S] ~ KM
v=
vmax . [S]
vmax
=
.[S]
KM
KM
Linearität - linearer Anstieg von v mit Zunahme von [S]
Ermittlung des Zahlenwertes KM
[S] = KM
vmax . [S]
vmax . [S]
v = [S] + [S] = 2 [S]
vmax
= 2
bei vmax/2 ist die Substratkonzentration gleich KM
 großer Zahlenwert für KM heißt lockere Bindung von Substrat
an das Enzym:
geringe Affinität
 kleiner Zahlenwert für KM heißt feste Bindung von Substrat an
das Enzym
hohe Affinität
Berechnung des KM-Wertes eines Enzyms
Vmax
Km
Lineweaver-Burke-Plot
doppelt reziproke Auftragung von v und [S]
vmax
5
ausschlaggebend für
die maximale Geschwindigkeit ist die Menge an Enzym
4
1/v
3
2
KM
1
1/vmax
0
-1
0
1/KM
1
1/[S]
2
3
Eigenschaft des Enzyms,
die auch ohne Enzymreinigung
bestimmt werden kann
Verhalten verschiedener Isoenzyme
gleicher vmax bei verschiedenen Substrataffinitäten
Enzymaktivitätsbestimmung
Enzymextraktion
Welche Faktoren beeinflussen bzw. beeinträchtigen die Enzymaktivität?
Regulative Einflüsse
>
wie Inhibitoren oder Aktivatoren
Destruktive Einflüsse
>
>
>
>
>
>
Schwermetalle
Sauerstoff
Phenole und Gerbstoffe
Temperatur
pH-Wert
Proteasen
Abhilfen gegen diese Interferenzen ??
Schwermetalle
>> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Na+ Salz)
• Komplexierungsreagens (Chelator) mit hoher Affinität zu
Schwermetallen, Calcium, Magnesium
• nicht für alle Enzyme einsetzbar (Metallkofaktoren)
Oxidierendes Milieu
>> Dithiothreit (DTT)
• Problem der Disulfidbrückenbildung im Enzymprotein
• Zusatz von Stoffen mit frei verfügbaren SH-Gruppen
(Sulfhydryl-Gruppen), die leicht oxidierbar sind
• -SH HS- + 1/2 O2 -> -S-S- + H2O
Phenole/Gerbstoffe
>> Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP)
• Phenole bilden mit Proteinen sehr starke H-Brücken aus
• Phenoloxidasen oxidieren Phenole zu Quinonen, die mit
Proteinen polymerisieren
• PVPP bildet ebenfalls starke H-Brücken mit Phenolen aus
• zusätzlich Schaffung reduzierender Bedingungen (DTT, Ascorbinsäure)
gegen Phenoloxidasen
Temperatur
>> Arbeiten bei +4°C
• Enzymaktivität ist von Erhalt der aktiven Proteinkonformation abhängig
• basiert auf hydrophoben Wechselwirkungen im Inneren, die
bei höheren Temperaturen reduziert werden
• Proteasen
pH-Wert
>> Pufferung der Medien
• Verwendung (an)organischer Puffer (Acetat, Phosphat)
• enzymkompatibler, organischer Puffer (sg.
Good`sche Puffer) wie Tris, HEPES etc.
gegen die Säuredenaturierung
Proteasen
>> Proteaseinhibitoren (Cocktails)
• Metalloproteasen
• Serinproteasen
• Saure Proteasen
• Thiolproteasen
EDTA, EGTA
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)
Benzamidin
Pepstatin A
Leupeptin, Antipain
Enzymaktivitätsbestimmung
Weitere Aufreinigung
# Filtration (Cheesecloth, Miracloth)
# Abzentrifugieren
# reversible Fällungen (Ammoniumsulfat, Protaminsulfat)
# Gelfiltration
•
Abtrennung störender niedermolekularer Verbindungen
•
Pufferaustausch
# Ultrafiltration (Extraktkonzentrierung)
Proteinbestimmung
UV-Absorptionsmethoden
>> Proteine absorbieren im UV mit 2 Maxima, bei 200 und 280 nm.
>> Die Extinktion einer 0.1% Proteinlösung ist 0.4-0.6 bei 280 nm,
bzw. 45 bei 200 nm.
Probleme
Verfälschung durch DNA/
RNA in diesem Bereich
>> 2-Wellenlängenmessung
Interferenzen durch UV-absorbierende Substanzen sowie Additiva
und pflanzliche Inhaltsstoffe
nicht denaturierend
Proteinbestimmung
nach Lowry et al. (1951)
>> Unter alkalinen Bedingungen komplexieren Cu2+-Ionen mit Peptidbindungen und werden zu Cu+ reduziert.
>> Das Folin-Reagens enthält Phosphomolybdat-Wolframat Mischsäuren,
die durch Protein-Cu+-Komplexe [sowie phenolische Seitengruppen
von Tyr/Trp, und Cys] zu blauen Mischoxiden reduziert werden
z.B. 3H2O . P2O5 . 13WO3 . 5MoO3 . 10H2O
3H2O . P2O5 . 14WO3 . 4MoO3 . 10H2O
>> Vermessung bei 750 nm.
Proteinbestimmung
nach Lowry et al. (1951)
# Interferenzen durch Gerbstoffe und
Additiva, durch Vorfällung mit Trichloressigsäure/Deoxycholat behebbar
# hohe Sensitivität und Linearität für
verschiedenste Proteine
# höherer Zeit- und Arbeitsaufwand
Proteinbestimmung
Bradford-Assay
>> Protein-Farbstoffkomplex mit Coomassie Brilliant Blue G250
(Schafwollfärberei)
>> CBB G250 ist ein synthetischer, amphoterer Farbstoff, der in saurer Lösung
in der kationischen braunroten Leukoform vorliegt (Emax 465 nm)
>> im Basischen: anionische blaue
Form (Emax 595 nm)
>> durch WW mit basischen und
aromatischen Aminosäuren der
Proteine auch im Sauren stabilisiert
wird.
Proteinbestimmung
Bradford-Assay
# variable Farbausbeute für verschiedene
Proteine
# einfach, rasch, sehr empfindlich
# nur geringe Interferenzen mit Chemikalien