ENZYME

ENZYME
Teil 2: Enzymkinetik &
Enzymaktivitäts- und
Proteinbestimmung
Kinetik
unkatalysierte Reaktion
Wenn [S] >> [P]
() S  P ()
z.B. Hydrolyse von Saccharose in saurer Lösung
v = -d[S] dt-1 = k x [S]
k....Geschwindigkeitskonstante
4
v
[S]
3
2
1
0
0
1
2
3
t
4
5
Kinetik
unkatalysierte Reaktion
Umformung der Grafik: Anfangsgeschwindigkeit
der Reaktion gegen die Substratkonzentration
linearer Zusammenhang !!
4
v
3
2
1
0
0
1
2
[S]
3
4
Kinetik
unkatalysierte Reaktion
bimolekulare Reaktion
() ()
A + B C + D
() ()
v = -d[A] dt-1 = -d[B] dt-1 = k x [A] [B]
Enzymkinetik
enzymkatalysierte Reaktion
Anfangsgeschwindigkeit in Abhängigkeit der Substratkonzentration
Sättigungsbereich
linearer Bereich
v prop. [S]
Ursache der Sättigungskinetik ??
Ursachen der Sättigung ??
E + S  ES  EP  E + P
Wenn [S] >> [E] sind alle Enzymmoleküle mit Substrat
besetzt und eine höhere Umsetzungsrate v ist nicht möglich
# SÄTTIGUNGSKINETIK #
Michaelis-Menten-Gleichung
vmax . [S]
v = K + [S]
M
Sonderfall 1
Hohe Substratkonzentration
[S] >> KM

KM + [S] ~ [S]
die Gleichung geht über in v = vmax
Sättigung - v unabhängig von [S]
Sonderfall 2
[S] << KM
Niedrige Substratkonzentration

KM + [S] ~ KM
v=
vmax . [S]
vmax
=
KM
KM .[S]
Linearität - linearer Anstieg von v mit Zunahme von [S]
Ermittlung des Zahlenwertes KM
[S] = KM
vmax . [S]
vmax . [S]
v = [S] + [S] = 2 [S]
vmax
= 2
bei vmax/2 ist die Substratkonzentration gleich KM
 großer Zahlenwert für KM heißt lockere Bindung von Substrat
an das Enzym:
geringe Affinität
 kleiner Zahlenwert für KM heißt feste Bindung von Substrat an
das Enzym
hohe Affinität
Berechnung des KM-Wertes eines Enzyms
Lineweaver-Burke-Plot
doppelt reziproke Auftragung von v und [S]
vmax
5
ausschlaggebend für
die maximale Geschwindigkeit ist die Menge an Enzym
4
1/v
3
KM
2
Eigenschaft des Enzyms,
die auch ohne Enzymreinigung
bestimmt werden kann
1
1/vmax
0
-1
0
1/KM
1
1/[S]
2
3
Verhalten verschiedener Isoenzyme
gleicher vmax bei verschiedenen Substrataffinitäten
Enzymaktivitätsbestimmung
Enzymextraktion
Welche Faktoren beeinflussen bzw. beeinträchtigen die Enzymaktivität?
Regulative Einflüsse
wie Inhibitoren oder Aktivatoren
Destruktive Einflüsse
Schwermetalle
Sauerstoff
Phenole und Gerbstoffe
Temperatur
pH-Wert
Proteasen
Abhilfen gegen diese Interferenzen ??
Schwermetalle
>> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Na+)
• Komplexierungsreagens (Chelator) mit hoher Affinität zu
Schwermetallen, Calcium, Magnesium
• nicht für alle Enzyme einsetzbar (Metallkofaktoren)
Oxidierendes Milieu
>> Dithiothreit (DTT)
• Problem der Disulfidbrückenbildung im Enzymprotein
• Zusatz von Stoffen mit frei verfügbaren SH-Gruppen
(Sulfhydryl-Gruppen), die leicht oxidierbar sind
• -SH HS- + 1/2 O2 -> -S-S- + H2O
Phenole/Gerbstoffe
>> Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP)
• Phenole bilden mit Proteinen sehr starke H-Brücken aus
• Phenoloxidasen oxidieren Phenole zu Quinonen, die mit
Proteinen polymerisieren
• PVPP bildet ebenfalls starke H-Brücken mit Phenolen aus
• zusätzlich Schaffung reduzierender Bedingungen (DTT, Ascorbinsäure)
gegen Phenoloxidasen
Temperatur
>> Arbeiten bei +4°C
• Enzymaktivität ist von Erhalt der aktiven Proteinkonformation abhängig
• basiert auf hydrophoben Wechselwirkungen im Inneren, die
bei höheren Temperaturen reduziert werden
• Proteasen
pH-Wert
>> Pufferung der Medien
• Verwendung (an)organischer Puffer (Acetat, Phosphat)
• enzymkompatibler, organischer Puffer (sg.
Good`sche Puffer) wie Tris, HEPES etc.
gegen die Säuredenaturierung
Proteasen
>> Proteaseinhibitoren (Cocktails)
• Metalloproteasen
• Serinproteasen
• Saure Proteasen
• Thiolproteasen
EDTA, EGTA
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)
Benzamidin
Pepstatin A
Leupeptin, Antipain
Enzymaktivitätsbestimmung
Weitere Aufreinigung
# Filtration (Cheesecloth, Miracloth)
# Abzentrifugieren
# Fällungen (Ammoniumsulfat, Protaminsulfat)
# Gelfiltration
•
Abtrennung störender niedermolekularer Verbindungen
•
Pufferaustausch
# Ultrafiltration (Extraktkonzentrierung)
Proteinbestimmung
UV-Absorptionsmethoden
>> Proteine absorbieren im UV mit 2 Maxima, bei 200 und 280 nm.
>> Die Extinktion einer 0.1% Proteinlösung ist 0.4-0.6 bei 280 nm,
bzw. 45 bei 200 nm.
Probleme
Verfälschung durch DNA/
RNA in diesem Bereich
>> 2-Wellenlängenmessung
Interferenzen durch UV-absorbierende Substanzen sowie
Additiva und pflanzliche Inhaltsstoffe
nicht denaturierend
Proteinbestimmung
nach Lowry et al. (1951)
>> Unter alkalinen Bedingungen komplexieren Cu2+-Ionen mit Peptidbindungen und werden zu Cu+ reduziert.
>> Das Folin-Reagens enthält Phosphomolybdat-Wolframat Mischsäuren,
die durch Protein-Cu+-Komplexe [sowie phenolische Seitengruppen
von Tyr/Trp, und Cys] zu blauen Mischoxiden reduziert werden
z.B. 3H2O . P2O5 . 13WO3 . 5MoO3 . 10H2O
3H2O . P2O5 . 14WO3 . 4MoO3 . 10H2O
>> Vermessung bei 750 nm.
Proteinbestimmung
nach Lowry et al. (1951)
# Interferenzen durch Gerbstoffe und
Additiva, durch Vorfällung mit Trichloressigsäure/Deoxycholat behebbar
# hohe Sensitivität und Linearität für
verschiedenste Proteine
# höherer Zeit- und Arbeitsaufwand
Proteinbestimmung
Bradford-Assay
>> Protein-Farbstoffkomplex mit Coomassie Brilliant Blue G250
(Schafwollfärberei)
>> CBB G250 ist ein synthetischer, amphoterer Farbstoff, der in saurer Lösung
in der kationischen braunroten Leukoform vorliegt (Emax 465 nm)
>> im Basischen: anionische blaue
Form (Emax 595 nm)
>> durch WW mit basischen und
aromatischen Aminosäuren der
Proteine auch im Sauren stabilisiert
wird.
Proteinbestimmung
Bradford-Assay
# variable Farbausbeute für verschiedene
Proteine
# einfach, rasch, sehr empfindlich
# nur geringe Interferenzen mit Chemikalien
Auf baldiges Wiedersehen bei
Sinn und Unsinn von
Isotopen stabiler und instabiler Natur