BMP-Signale bei der Somitenentwicklung

Aus dem Institut für Anatomie und Zellbiologie
-Abteilung für Molekulare Embryologieder Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
(Kommissarischer Direktor: Prof. Dr. med. Michael Frotscher)
BMP-Signale bei der Somitenentwicklung
Experimentelle Untersuchungen beim Vogelembryo
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
Vorgelegt im Jahre 2007
von Baigang Wang
geboren in Liaoning, VR China
Dekan
Prof. Dr. med. C. Peters
1. Gutachter
Prof. Dr. med. R. Huang
2. Gutachter
Prof. Dr. med. S. Rosahl
Jahr der Promotion
2008
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung.......................................................................................................................... 1
1.1.
Übersicht über BMP-Signale............................................................................... 1
1.2.
Entstehung des Mesoderms und des Entoderms ............................................... 2
1.3.
Entstehung des Neuralrohrs................................................................................ 3
1.4.
Entstehung und Kompartimentierung der Somiten ......................................... 4
1.5.
Fragestellung und methodischer Zugang zur Bildung des lateralen
Sklerotoms............................................................................................................. 5
1.6.
Das Dermomyotom liefert die Vorläuferzellen der Scapula-Klinge ................ 7
1.7.
Fragestellung und methodischer Zugang zur Entwicklung der
Scapula-Klinge...................................................................................................... 8
2.
Material und Methoden................................................................................................. 10
2.1.
Tiere ..................................................................................................................... 10
2.2.
Mikrochirurgische Technik ............................................................................... 10
2.2.1
Instrumentarium ................................................................................... 10
2.2.2.
Allgemeine Operationstechnik und Fixierung...................................... 11
2.2.3.
Spezielle Operationstechniken ............................................................. 12
2.2.3.1. Implantation einer Barriere zwischen Somiten und intermediärem
Mesoderm............................................................................................. 12
2.2.3.2. Implantation einer Barriere zwischen Chorda-Bodenplatten-Komplex
und Somiten ......................................................................................... 12
2.2.3.3. Implantation zweier Barrieren zwischen Somiten und intermediärem
Mesoderm bzw. Chorda-Bodenplatten-Komplex ................................ 13
2.2.3.4. Implantation mit BMP4 getränkter Kügelchen.................................... 13
2.2.3.5. Herstellung der Wachtel-Huhn-Chimären............................................ 14
2.2.3.6. Injektion Noggin-Protein-sezernierender Zellen ................................. 15
2.3.
Whole-mount in situ-Hybridisierung................................................................ 16
2.3.1.
Protokoll für in situ-Hybridisierung ..................................................... 17
2.3.2.
2.4.
Analyse des Skelettmusters................................................................................ 18
2.5.
Histologie und Färbetechniken ......................................................................... 19
2.6.
3.
Herstellung von Vibratomschnitten ...................................................... 18
2.5.1.
Herstellung der Paraffinschnitte für die histologische Untersuchung .. 19
2.5.2.
Immunhistochemische Färbung der Paraffinschnitte ........................... 19
Chemische Reagenzien und Zusammensetzung der verwendeten Lösungen20
2.6.1.
Lösungen für die Operationen .............................................................. 20
2.6.2.
Lösungen für die Whole-mount in situ-Hybridisierung ....................... 20
2.6.3.
Lösungen für die Skelettanalyse und Immunhistochemie.................... 22
Ergebnisse ....................................................................................................................... 23
3.1.
Ergebnisse zur Entwicklung des lateralen Sklerotoms ................................... 23
3.1.1.
Unterbrechung der lateralen Signalwege durch Implantation einer
Barriere zwischen Somiten und intermediärem Mesoderm ................. 23
3.1.2.
Unterbrechung der axialen Signalwege durch Implantation einer
Barriere zwischen Somiten und Chorda-Bodenplatten-Komplex ........ 24
3.1.3.
Unterbrechung der axialen und lateralen Signalwege durch
Implantation zweier Barrieren zwischen Somiten und intermediärem
Mesoderm bzw. Chorda-Bodenplatten-Komplex ................................. 25
3.1.4.
3.2.
Applikation des BMP4-Signalproteins................................................. 26
Ergebnisse zur Entwicklung der Scapula-Klinge ............................................ 27
3.2.1.
Homotope Wachtel-Huhn-Chimärisierungen vom dorsomedialen und
dorsolateralen Somitenabschnitt........................................................... 27
3.2.2.
Unterbrechung der lateralen BMP-Signalwege durch Injektion
Noggin-Protein-sezernierender Zellen ................................................. 28
4.
Diskussion ....................................................................................................................... 30
4.1.
Ein Antagonismus medialer und lateraler Signale während der
Sklerotomentwicklung ist für die Wirbelsäulenentwicklung erforderlich.... 30
4.2.
Signale aus dem Dermomyotom und dem Myotom sind für die
Rippenentwicklung erforderlich ....................................................................... 32
4.3.
Intrinsische und extrinsische Faktoren steuern gemeinsam die Entwicklung
der Scapula-Klinge ............................................................................................. 35
5.
Zusammenfassung.......................................................................................................... 40
6.
Literatur.......................................................................................................................... 41
7.
Abbildungen ................................................................................................................... 48
8.
Lebenslauf....................................................................................................................... 58
9.
Eigene Publikationen und Posterpräsentationen ........................................................ 59
10. Danksagung .................................................................................................................... 61
11. Erklärung........................................................................................................................ 62
1
1.
Einleitung
1.1.
Übersicht über BMP-Signale
Einleitung
Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) gehören zu der Superfamilie des Transforming Growth
Factor-ß (TGF-ß). Die TGF-ß Superfamilie ist aufgrund der Sequenzhomologien in der
TGF-ß-spezifischen carboxy-terminalen Domäne des Proteins in Subfamilien eingeteilt.
BMPs sind Mitglieder der Subfamilie von decapentaplegic (dpp) und 60A (Kingsley 1994).
Die dpp-Subfamilie wurde nach dem Drosophila-Gen dpp benannt und enthält die humanen
BMP-2 und -4. Die 60A-Subfamilie wurde nach dem Drosophila-Gen 60A benannt, zu der die
humanen BMP-5, -6, -7, -8a und -8b gehören. BMPs werden von signalgebenden Zellen
sezerniert und binden an Membranrezeptoren, welche das Signal durch die Zellmembran ins
Zellinnere weiterleiten. Die Rezeptoren von BMPs sind in zwei Unterarten klassifiziert, Typ I
Rezeptor (BMPR I) und Typ II Rezeptor (BMPR II). Die beiden Rezeptoren bilden
gemeinsam einen Rezeptorkomplex an der Zellmembran (Wrana et al., 1994). Die
Signaltransduktion der BMPs erfolgt durch ihre Bindung an die extrazelluläre Domäne des
BMPR II, welcher den BMPR I phosphoryliert. Der durch die Phosphorylierung aktivierte
BMPR I phosphoryliert Smad 1, Smad 5, Smad 8 im Zytoplasma, welche zusammen mit
Smad 4 in den Zellkern translokalisieren, um bestimmte Gene zu aktivieren (Heldin er al.,
1997). Antagonisten von BMPs sind Noggin, Chordin und Follistatin, die an BMPs binden
können und so deren Bindung an den Rezeptor verhindern.
In den vergangenen Jahren wurden die Funktionen von BMPs für die embryonale
Entwicklung bei verschiedenen Organismen untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass sich
BMPs an vielen Entwicklungsprozessen beteiligen (Übersicht von Hogan 1996). BMPs
werden für die Bildung der embryonalen Achsen benötigt. Bei Drosophila ist eine
Fehlbildung der dorsoventralen Achse in Embryonen mit einer Mutation im dpp-Gen, einem
Homolog von BMP-2 und BMP-4, zu beobachten (Ray et al., 1991). In der Maus sind BMPs
auch an der Ausbildung der dorsoventralen und kraniokaudalen Achse beteiligt (Mishina
2
Einleitung
2003). BMPs spielen auch eine wichtige Rolle bei der Gastrulation des Mäusembryonen
(Übersicht von Kishigami et al., 2005).
1.2.
Entstehung des Mesoderms und des Entoderms
Bei der Gastrulation entstehen das Mesoderm sowie das Entoderm durch die Zellwanderung
aus der oberen Zellschicht (Epiblast) des Primitivstreifens. Der Primitivstreifen stellt eine
longitudinale Verdickung in der kaudalen Region der Keimscheibe dar. Diese verlängert sich
zunehmend, wobei in der Mitte die Primitivrinne und am vorderen Ende der Primitivknoten
entsteht. Während der Gastrulation lösen sich die Zellen aus dem epithelialen Epiblasten im
Bereich des Primitivknotens und Primitivstreifens durch eine epithelio-mesenchymale
Transition und wandern in den Raum zwischen dem Epiblast und Hypoblast (der unteren
Zellschicht) nach kranial und lateral, um die verschiedenen Mesodermkompartimente zu
bilden (Übersicht von McClay 1991).
Die Zellen, die aus dem Primitivknoten in der kranialen Richtung auswandern, entwickeln
sich zum axialen Mesoderm (Selleck und Stern 1991). Das am weitesten kranial gelegene
axiale Mesoderm wird als prächordales Mesoderm bezeichnet, das sich an der Bildung
bestimmter Kopfstrukturen beteiligt (Schoenwolf et al., 1992; Smith et al., 1994). Der
Primitivknoten verlagert sich nach kaudal. Durch Apposition von Material aus dem
Primitivknoten verlängert sich das axiale Mesoderm auch nach kaudal. Dieser Teil vom
axialen
Mesoderm
bildet
die
Chorda
dorsalis,
die
für
die
Entwicklung
des
Zentralnervensystems und der Wirbelsäule von Bedeutung ist (Brand-Saberi et al., 1993;
Goulding et al., 1993, 1994).
Eine Zellpopulation, die aus dem Primitivknoten in kranio-lateraler Richtung wandert, bildet
den medialen Abschnitt des paraxialen Mesoderms. Zellen, die aus dem kranialen Abschnitt
des Primitivstreifens hervorgehen, entwickeln sich zum lateralen Abschnitt des paraxialen
Mesoderms.
3
Einleitung
Das intermediäre Mesoderm und das Seitenplattenmesoderm, die lateral vom paraxialen
Mesoderm liegen, entstehen aus dem weiter kaudal liegenden Abschnitt des Primitivstreifens.
Das intermediäre Mesoderm besteht aus dem Wolff-Gang und einem darunter liegenden
schmalen Gewebsband, das das paraxiale Mesoderm mit dem Seitenplattenmesoderm
verbindet. Das intermediäre Mesoderm ist das Anlagematerial der Nieren. Das
Seitenplattenmesoderm, das den am weitesten lateral liegenden Abschnitt des Mesoderms
darstellt, wird in zwei Schichten unterteilt: das an das Entoderm angrenzende viszerale
(Splanchnopleura) und das an das Ektoderm angrenzende parietale Seitenplattenmesoderm
(Somatopleura). Zwischen den zwei Mesodermplatten entsteht ein Hohlraum, das Zölom, das
die künftige Brust- und Bauchhöhle darstellt (Christ et al., 1974; Chevallier 1977).
Während das Mesoderm als mittleres Keimblatt neu entsteht, ersetzt das Entoderm, dessen
Zellen aus dem kranialen Abschnitt des Primitivstreifens hervorgehen, die bereits bestehende
untere Zellschicht (Hypoblast). Nachdem mesodermale und entodermale Vorläuferzellen
ausgewandert sind, wird der kraniale Epiblast zum Ektoderm. Die Folge der Gastrulation ist
die Entstehung eines dreischichtigen Keimes mit äußerem Oberflächenektoderm, mittlerem
Mesoderm und innerem Entoderm.
1.3.
Entstehung des Neuralrohrs
Das axiale Mesoderm induziert im darüberliegenden Ektoderm die Bildung der Neuralplatte.
Die lateralen Ränder der Neuralplatte erheben sich im weiteren Verlauf beiderseits der
Längsachse zu den Neuralfalten. Während sich die Neuralfalten an den lateralen Rändern der
Neuralplatte aufwölben, entsteht in der Mittellinie der Neuralplatte über dem axialen
Mesoderm die Neuralrinne. Die beiden Neuralfalten berühren einander und verschmelzen
schließlich zum Neuralrohr. Durch die Fusion der Neuralfalten wird das Neuralrohr vom
Oberflächenektoderm abgetrennt, das nun als kontinuierliche Schicht das Neuralrohr, das
paraxiale Mesoderm, das intermediäre Mesoderm und das Seitenplattenmesoderm bedeckt
(Übersicht von Le Douarin et al., 1998; Christ und Wachtler 1998).
4
1.4.
Einleitung
Entstehung und Kompartimentierung der Somiten
Das paraxiale Mesoderm besteht aus einem präotischen und einem postotischen Abschnitt.
Der präotische Abschnitt ist nicht segmentiert, während der postotische Abschnitt segmentiert
wird. Die Segmentierung erfolgt in kranio-kaudaler Richtung und beginnt direkt hinter der
Ohrplakode. Durch Segmentierung und Epithelialisierung entstehen die Somiten.
Der neu gebildete Somit besteht aus einem Ball epithelialer Zellen, die die mesenchymalen
Zellen, Somitozoelzellen genannt, umschließen. Der Somit differenziert sich in ein dorsales
und ein ventrales Kompartiment. Der dorsale epithelial gebliebene Abschnitt wird
Dermomyotom genannt, während das ventrale Kompartiment infolge einer Veränderung der
Zellorganisation mesenchymal wird und das Sklerotom bildet. Das Dermomyotom ist die
Quelle für die Skelettmuskulatur, Dermis des Rückens, Bindegewebe, Endothelium und
Knorpel (Übersicht von Scaal et al., 2004). Das Sklerotom liefert die Skelettelemente der
Wirbelsäule und der Rippen (Christ et al., 2000; Huang et al., 2000a; Christ et al., 2004).
Die Somitenkompartimentierung wird durch die aus den umliegenden Strukturen sezernierten
Faktoren
gesteuert.
Wnt-Signale,
die
vom
dorsalen
Neuralrohrabschnitt
und
Oberflächernektoderm sezerniert werden, induzieren die Expression von Paraxis, das für die
Aufrechterhaltung der epithelialen Struktur des dorsalen Somitenabschnitts essenziell ist
(Schmidt et al., 2004). Die Dermomyotomzellen exprimieren Pax3 und Pax7 (Otto et al.
2006). Das Dermomyotom lässt sich wiederum in ein epaxiales und ein hypaxiales
Kompartiment gliedern. Die Differenzierung des epaxialen Kompartiments ist von axialen
Signalen abhängig, während sich das hypaxiale Kompartiment in Abhängigkeit von lateralen
Signalen
entwickelt
(Dietrich
et
al.,
1998).
Das
intermediäre
Mesoderm
und
Seitenplattenmesoderm sezernieren BMPs, die für die Spezifizierung des hypaxialen
Dermomyotomabschnitts erforderlich sind (Pourquié et al., 1996).
Die Sklerotombildung wird durch Signale aus der Chorda dordalis und Bodenplatte des
Neuralrohrs (Chorda-Bodenplatten-Komplex) gesteuert. Dieser Komplex, aus dem Sonic
5
Einleitung
hedgehog (Shh), Noggin, Chordin und Follistatin sezerniert werden, stellt die axiale
Signalquelle für die Induktion des Sklerotoms dar. Shh induziert die Expression der
Sklerotom-spezifischen Markergene Pax1 und Pax9 (Dietrich et al., 1993, 1997; Koseki et al.,
1993), und reguliert die Expression von Paraxis im ventralen Somitenabschnitt herunter
(Christ et al., 1998). Dies führt zu einer epithelio-mesenchymalen Transition in diesem
Somitenabschnitt und zur Bildung des Sklerotoms.
1.5.
Fragestellung und methodischer Zugang zur Bildung des lateralen Sklerotoms
Es gibt Hinweise darauf, dass das Sklerotom, ähnlich wie das Dermomyotom, auch aus zwei
Kompartimenten besteht. Die Expression des Sklerotom-spezifischen Markergens Pax1
beschränkt sich auf die mediale Domäne des Sklerotoms. Demzufolge lässt sich das
Sklerotom in zwei Abschnitte unterteilen: einen medial liegenden Pax1-positiven und einen
lateral liegenden Pax1-negativen Abschnitt. Ähnliche Hinweise auf die Unterteilung des
Sklerotoms findet man auch bei der Rippenentwicklung. Die Rippe des Vogels lässt sich in
einen proximalen und einen distalen Abschnitten unterteilen (Aoyama et al., 2005). Die
proximale Rippe entsteht aus dem medialen Sklerotom (Christ et al., 2004), und ihre
Entwicklung ist von der Expression von Pax1 und Pax9 abhängig, die durch Shh aus dem
Chorda-Bodenplatten-Komplex induziert wird (Peters et al., 1999; Chiang et al., 1996).
Demgegenüber entwickelt sich die distale Rippe unabhängig vom Shh-Signal (Aoyama et al.,
2005). In der Pax1-knock-out-Maus und der Pax1/Pax9-doppel-knock-out-Maus sind die
gesamte Wirbelsäule und die proximalen Rippen fehlgebildet, während sich jedoch die
distalen Rippen normal entwickeln (Wallin et al., 1994; Peters et al., 1999). Einen
vergleichbaren Phänotyp findet man auch in der Shh-knock-out-Maus (Chiang et al., 1996).
Da die Rippen Derivate des Sklerotoms sind (Huang et al., 2000a), müsste es daher neben
einem Shh-abhängigen, Pax1-und Pax9-positiven Abschnitt, aus dem die Wirbel und die
proximalen Rippen hervorgehen, noch einen Sklerotomabschnitt geben, der sich unabhängig
von Shh und Pax1-und Pax9-Expression entwickelt, und dem die distalen Rippen
entstammen.
6
Einleitung
Bislang ist noch nicht bekannt, wie die Entwicklung des lateralen Sklerotoms kontrolliert
wird. Da der Pax1-negative Sklerotomabschnitt an das intermediäre Mesoderm angrenzt, und
seine Entwicklung unabhängig von Shh ist, werden die nachfolgenden Fragen aufgeworfen:
a) Sind
laterale
Signale
aus
dem
intermediären
Mesoderm
und
dem
Seitenplattenmesoderm an der Bildung dieses Sklerotomabschnitts beteiligt?
b) Handelt es sich bei den lateralen Signalen um BMPs?
Laterale Signale, die aus dem intermediären Mesoderm und dem Seitenplattenmesoderm
sezerniert werden, könnten diffundierende Proteinen sein. Um die Diffusion der lateralen
Signale zum epithelialen Somiten zu verhindern, wird eine undurchlässige Barriere zwischen
dem intermediären Mesoderm und den epithelialen Somiten implantiert. Es wird untersucht,
ob die Bildung des lateralen Sklerotoms in Abwesenheit der lateralen Signale ausbleibt.
BMPs werden aus dem intermediären Mesoderm und dem Seitenplattenmesoderm sezerniert.
Um die Rolle von BMPs zu untersuchen, soll die Bildung des lateralen Sklerotoms nach
Implantation von mit BMP4 getränkten Kügelchen in den epithelialen Somiten analysiert
werden.
Aus dem Chorda-Bodenplatten-Komplex werden Shh und die Antagonisten von
BMP-Signalen,
Noggin,
Chordin
und
Follistatin
sezerniert.
Shh
induziert
die
Sklerotombildung und die Expression seiner Markergene Pax1 und Pax9 (Dietrich et al., 1993,
1997; Koseki et al., 1993). Da BMPs diese Sklerotom-spezifischen Gene unterdrücken, ist
Noggin für die durch Shh induzierte Sklerotomentwicklung und die Expression von Pax-Gene
von Bedeutung (McMahon et al., 1998). Dabei wird die Funktion von BMPs in dieser
Domäne durch Bindung mit den Antagonisten unterbunden. Sollten laterale BMPs die
Entwicklung des lateralen Sklerotoms induzieren, ließe sich vermuten, dass eine Balance
zwischen medialem und lateralem Sklerotomabschnitt durch die BMP-Antagonisten aus der
Chorda dorsalis gewährleistet wird. Daraus ergibt sich die dritte Frage:
c) Lässt sich die laterale Sklerotomdomäne ohne axiale Signale nach medial
ausdehnen?
7
Einleitung
Um die Wirkung der axialen Signale auf den Somiten zu blockieren, soll der
Chorda-Bodenplatten-Komplex entfernt oder eine undurchlässige Barriere zwischen den
Komplex und die epithelialen Somiten implantiert werden. Danach soll die Bildung des
lateralen Sklerotoms untersucht werden.
1.6.
Das Dermomyotom liefert die Vorläuferzellen der Scapula-Klinge
Wie bereits erwähnt, entsteht das Dermomyotom bei der Somitenkompartimentierung. Es ist
bekannt, dass das Dermomyotom die Vorläuferzellen nicht nur für die Skelettmuskulatur, die
Dermis des Rückens, das Bindegewebe und das Endothel sondern auch für den Knorpel der
Scapula liefert. Die Scapula des Vogels ist ein langer schmaler Knochen. Er hat eine gelenkige
Verbindung mit dem Oberarmknochen und dem Schlüsselbein, und dient als Befestigung des
Armes sowie als Ursprung und Ansatz von Schultergürtelmuskeln. Die Scapula lässt sich
aufgrund ihrer Herkunft in zwei Abschnitte einteilen: einen kranialen Teil (Scapula-Kopf), der
Acromion, Glenoid Fossa, und Coracoid Tuberculum umfasst, und einen kaudalen Teil
(Scapula-Klinge), die durch den Musculus rhomboideus an den Thorax befestigt wird. Der
Scapula-Kopf entstammt der Somatopleura im Bereich der oberen Extremität, während die
Scapula-Klinge aus dem Dermomyotom der Somiten 17-24 hervorgeht (Huang et al., 2000b).
Die Vorläuferzellen der Scapula-Klinge exprimieren zuerst Pax3 im Dermomyotom. Sie
exprimieren später in der Scapulaanlage anstelle von Pax3 das Scapula-spezifische Pax1
(Ebensperger et al., 1995; Healy et al., 1999; Moeller et al., 2003) und differenzieren sich zum
Scapulaknorpel. Die Zuordnung der Vorläuferzellen zur Scapula-Klinge erfolgt segmental.
Die Vorläuferzellen im Dermomyotom im Somiten 17 befinden sich später im kranialen Teil
der Scapula-Klinge, während die Zellen im Somiten 24 zum kaudalen Teil beitragen. Darüber
hinaus erweitert sich die Expressionsdomäne von Pax1 in der Scapulaanlage in der
kranio-kaudalen Richtung.
Die Fähigkeit, eine Scapula zu bilden, ist im Dermomyotom festgelegt. Ein ektopisches
Knorpelstück
entsteht
nach
heterotoper
Transplantation
des
Scapula-bildenden
8
Einleitung
Dermomyotoms in eine nicht Scapula-bildende Region (Ehehalt et al., 2004). Die aus den
umliegenden Strukturen sezernierten Signale haben Einfluss auf die Entwicklung der
Scapula-Klinge. Signale aus dem Oberflächenektoderm sind an der Entwicklung der
Scapula-Klinge beteiligt. In Abwesenheit der Signale aus dem Oberflächenektoderm wird das
Scapula-spezifische Pax1 nicht exprimiert, und die Scapula-Klinge sowie die der Scapula
zugehörigen Muskeln sind fehlgebildet (Pröls et al., 2004; Ehehalt et al., 2004). Wnts
regulieren die Pax3-Expression im Dermomyotom (Schmidt et al., 2004), und Wnt6 aus dem
Oberflächenektoderm hält die Expression von Pax3 und Pax7 im Dermomyotom aufrecht
(Otto et al., 2006). Die Überexpression der Metallocarboxypeptidase CPZ, die die Induktion
der Wnt-Signale verstärkt, verursacht eine verstärkte und andauernde Expression von Pax3,
die die Expression von Pax1 in der Scapulaanlage unterbindet, und eine Fehlbildung der
Scapula-Klinge verursacht (Moeller et al., 2003).
1.7.
Fragestellung und methodischer Zugang zur Entwicklung der Scapula-Klinge
Shh-knock-out-Mäuse weisen eine Fehlbildung der axialen Skelettelemente und der epaxialen
Muskeln auf, besitzen jedoch eine normal ausgebildete Scapula-Klinge (Chiang et al., 1996;
Teillet et al., 1998). Dies deutet darauf hin, dass sich das epaxiale Dermomyotom abhängig
von Shh, die Scapula-Klinge jedoch unabhängig von Shh entwickelt. Da die Scapula-Klinge
ihren Ursprung im Dermomyotom hat, sind wir der Frage nachgegangen:
a) Entstammt die Scapula-Klinge dem hypaxialen Dermomyotomabschnitt?
Die
Lokalisation
der
Scapula-Vorläuferzellen
im
Dermomyotom
soll
mittels
Wachtel-Huhn-Chimärisierung untersucht werden. Dabei wird der epaxiale und hypaxiale
Dermomyotomabschnitt im Hühnchen durch einen entsprechenden Dermomyotomabschnitt
aus der Wachtel ersetzt. Im Hühnerembryo entwickelt sich das implantierte Wachtelgewebe
wie Hühnchengewebe. Nach Fixierung können die transplantierten Wachtelzellen mit einem
spezifischen Antikörper (QCPN, Wachtel-spezifischer Antikörper) im Hühnerembryo
nachgewiesen werden. Auf diese Weise können Derivate des Wachteltransplantats in der
9
Einleitung
Entwicklung verfolgt werden.
Sollte die Scapula-Klinge dem hypaxialen Dermomyotomabschnitt entstammen, stellen wir
uns die weitere Frage:
b) Sind
laterale
BMP-Signale,
Dermomyotomabschnitts
die
benötigt
für
werden,
die
Entwicklung
auch
für
die
des
hypaxialen
Entwicklung der
Scapula-Klinge erforderlich?
Um die Frage zu klären, ob sich laterale BMPs an der Steuerung der Scapulaentwicklung
beteiligen, sollen die BMP-Signalwege aus dem Seitenplattenmesoderm durch Injektion
Noggin-Protein-sezernierender Zellen in die Scapulaanlage blockiert werden. Die
Entwicklung der Scapula-Klinge wird nach der Unterbindung der BMP-Signalwege analysiert.
10
2.
Material und Methoden
2.1.
Tiere
Material und Methoden
Befruchtete Hühner-Eier der Rasse „Weiße Leghorn“ (Gallus gallus) und Eier der
Japanischen Wachtel (Coturnix coturnix japonica) wurden vom Hühnerhof Bronner in
Freiburg/Tiengen bezogen und bis zur Inkubation (für begrenzte Zeit) bei 10°C aufbewahrt.
Die Eier wurden bei 37.8°C und 80% Luftfeuchtigkeit in einem Brutschrank inkubiert bis das
angestrebte Entwicklungsstadium erreicht war.
Das Entwicklungsstadium wurde nach den Maßgaben von Hamburger und Hamilton (1951)
bestimmt.
Im
Folgenden
wird
das
Entwicklungsstadium
mit
der
Abkürzung
„HH-Stadium“ angegeben. Die Somitenstadien wurden nach Christ und Ordahl (1995)
bestimmt (römisch I bezeichnet den zuletzt gebildeten jüngsten Somiten, römisch II den
nächst älteren Somiten; römisch III, IV, V entsprechend noch ältere Somiten).
2.2.
Mikrochirurgische Technik
2.2.1
Instrumentarium
Alle mikrochirurgischen Operationen dieser Arbeit wurden unter binokularen Mikroskopen
(Wild M10 oder MZ75, Leica) durchgeführt.
Metallsägen (Haushaltsbedarf) wurden zum Sägen der Eischale verwendet.
Zur kontrastreicheren Darstellung des Embryos im binokularen Mikroskop wurden Färbestifte
verwendet. Zur Herstellung der Färbestifte wurde die Spitze eines Glasstäbchens zu einer
kleinen Kugel geschmolzen, die nach Abkühlung mit einer Farbstofflösung aus Nilblau A
(Fluka) und Agarose (Sigma) beschichtet wurde.
Für die feinen Operationen im embryonalen Gewebe wurde elektrolytisch geschärfter
Wolfram-Draht (Durchmesser 0.5 mm; Elektrolyse in gesättigter NaNO2-Lösung bei 12V
Spannung) verwendet. Sein ungeschärftes Ende wurde in das schmale Ende einer als
11
Material und Methoden
Halterung dienende Glaspipette eingeschmolzen.
Federscheren und Sieblöffel wurden von den Firmen Aesculap und Geuder bezogen. Als
Greifinstrumente kamen Dumont-Pinzetten (Schweiz) zur Anwendung. Solche feinen
Instrumente wurden vor der Fixierung der Embryonen sterilisiert.
Bei Transplantationen und Zellinjektionen dienten Saugkapillaren aus Glaspipetten als Träger
des Spendergewebes und der Zellen. Zur Herstellung einer Saugkapillare wurde das schmale
Ende der Glaspipetten über der Flamme einer Ethanolflamme erhitzt, und mit der Pinzette
außerhalb der Flamme so schnell wie möglich ausgezogen. Durch Brechen der so
entstandenen Kapillare an verschiedenen Stellen können Saugkapillaren mit einem
bestimmten Durchmesser hergestellt werden (ca. 200µm bei den Transplantationen und ca.
100µm bei der Zellinjektion). Ein ca. 40 cm langer Gummischlauch wurde auf das andere
Ende der Glaspipette aufgesteckt. Der Transfer des Spendergewebes und der Zellen wurde
über den Gummischlauch durch Saugen und Ausblasen mit dem Mund kontrolliert.
2.2.2.
Allgemeine Operationstechnik und Fixierung
Alle Operationen wurden in einem dafür eingerichtet Raum durchgeführt, der mit
UV-Strahlen frei von Mikroorganismen gehalten wurde. Vor dem Operationsbeginn wurden
die Arbeitsoberflächen und die Hände mit 70%igem Ethanol desinfiziert.
Die Position des Embryos und der Luftkammer im Ei wurde mit Hilfe von Durchlicht
festgestellt, und mit einem Bleistift auf der Eischale markiert. Vor dem Öffnen wurde die
markierte Eischale mit 70%igem Ethanol desinfiziert. Durch Ansägen mit der Metallsäge
wurde ein rechteckiges Operationsfenster (ca. 5x5 mm) in der markierten Eischale eröffnet.
Dazu wurde die Schale über der Luftkammer angesägt. Physiologische Lockelösung (nach
Locke und Rosenheim, 1907) mit Antibiotikazusatz wurde auf die Eihaut im Fenster getropft,
um das Ankleben der embryonalen Gewebe an der Eihaut zu vermeiden. Unter dem
Mikroskop wurde die Eihaut im Fenster mit einer feinen Pinzette entfernt. Ein Stich mit
Pinzette in die Luftkammer durch die angesägte Eierschale führte zum Absinken des Embryos
im Ei. Das Tropfen der Lockelösung durch das Operationsfenster ins Ei führte zu einem
Aufschwemmen des Embryos. Die Vitellinmembran über dem Operationsgebiet wurde unter
12
Material und Methoden
dem Mikroskop mit einer elektrolytisch geschärften Wolfram-Nadel entfernt. Anschließend
konnte die jeweilige Operation durchgeführt werden.
Nach einer gelungenen Operation wurden ca. 2 ml Eiweiß mit einer großlumigen
Injektionskanüle (Braun Sterican Gr. 2) durch das Loch an der Luftkammerseite abgesaugt,
was zum Absinken des Embryos führte. Das Operationsfenster und die Öffnung zur
Luftkammer wurden mit medizinischem Klebeband (Leukosilk) abgedichtet. Danach wurde
das Ei zur Weiterentwicklung des Embryos in den Inkubator zurückgestellt.
Vor der Fixierung der operierten Embryonen wurden die Arbeitsoberflächen, die Hände und
die feinen Instrumente mit 70%igem Ethanol desinfiziert, um die Embryonen RNAse frei zu
halten. Während der Fixierung wurden Einweg-Gummihandschuhe (Hartmann) angezogen.
Zur Fixierung wurden die Embryonen aus dem Ei entnommen und in eine Petri-Schale
(Falcon) mit PBT-DEPC-Lösung gelegt. Die inneren Organe und der Kopf der Embryonen
wurden gegebenenfalls entfernt, bevor der Embryo in einer entsprechenden Fixierlösung
fixiert wurde.
2.2.3.
Spezielle Operationstechniken
2.2.3.1. Implantation einer Barriere zwischen Somiten und intermediärem Mesoderm
Um die epithelialen Somiten von den lateralen Signalen aus dem intermediären Mesoderm
und dem Seitenplattenmesoderm abzuschirmen, wurde in Hühnerembryonen im HH-Stadium
11 ein Schlitz zwischen den epithelialen Somiten I-V und dem intermediären Mesoderm mit
einer Wolfram-Nadel geschnitten. In den so entstandenen Schlitz wurde eine dreieckige
Aluminiumfolie (20µm in Dicke) passender Größe so implantiert, dass sie sich während der
Weiterentwicklung des Embryos nicht aus dem Schlitz herauslösen konnte.
2.2.3.2. Implantation einer Barriere zwischen Chorda-Bodenplatten-Komplex und Somiten
Um die epithelialen Somiten von dem Chorda-Bodenplatten-Komplex zu trennen, wurde das
Neuralrohr von Hühnerembryonen im HH-Stadium 11 dorsal mit einer Wolfram-Nadel
13
Material und Methoden
eröffnet. Die Chorda dorsalis war nun unter der Bodenplatte des Neuralrohrs als weißer
Strang zu sehen. In das eröffnete Neuralrohr wurde nun ventral ein Schnitt zwischen den
epithelialen Somiten I-V und dem Chorda-Bodenplatten-Komplex gemacht, in den eine
dreieckige Aluminiumfolie passender Größe implantiert wurde, um die Wirkung der axialen
Signale auf die Somiten zu blockieren.
2.2.3.3. Implantation zweier Barrieren zwischen Somiten und intermediärem Mesoderm bzw.
Chorda-Bodenplatten-Komplex
Um die epithelialen Somiten sowohl von den lateralen wie auch von den axialen Signalen
abzuschirmen, wurden zwei Schlitze zwischen den epithelialen Somiten I-V in
Hühnerembryonen im HH-Stadium 11 und dem intermediären Mesoderm bzw. dem
Chorda-Bodenplatten-Komplex
geschnitten.
Danach
wurde
in
jeden
Schlitz
eine
Aluminiumfolie implantiert.
2.2.3.4. Implantation mit BMP4 getränkter Kügelchen
Die Rolle der lateralen BMPs bei der Bildung des lateralen Sklerotoms sollte durch die
Applikation von BMP4-Protein untersucht werden. Hierbei wurden Recombinant Human
BMP4 (R&D) und Affi-Gel Kügelchen (Bio-Rad) verwendet.
Vorbereitung der mit BMP4 getränkten Kügelchen:
Zur Vorbereitung der mit BMP4 getränkten Kügelchen wurde ein 10g BMP4-Lyophilisat mit
PBS zu einer Stammlösung mit 500µg/ml in Konzentration aufgelöst. Ein Aliquot von 5µl der
Stammlösung wurde mit 45 µl PBS zu einer Konzentration von 50µg/ml verdünnt. Je 2µl der
so zu 50 µl verdünnten Lösung wurde in ein PCR-Reaktionsgefäß verteilt und bei -20 °C im
Gefrierschrank gelagert. Affi-Gel Kügelchen wurden in PBS im Kühlschrank bei 4 °C für eine
Stunde gewaschen. Die Innenseite eines PCR-Reaktionsgefäßes wurde zum Schutz des
Proteins mit Sigmacote (Sigma) beschichtet und mit ca. 100 der gewaschenen Affi-Gel
Kügelchen gefüllt. Danach wurde 2µl BMP4 in einer Konzentration von 50µg/ml auf die
14
Material und Methoden
Kügelchen in das PCR-Reaktionsgefäß getropft. So behandelt wurde das Reaktionsgefäß im
Kühlschrank bei 4 °C für 12 Stunde gestellt. Nach 12 Stunden standen die Affi-Gel
Kügelchen als BMP4-Reservoir zur Verfügung.
Implantation der mit BMP4 getränkten Kügelchen:
Während
der
Implantation
der
mit
BMP4
getränkten
Kügelchen
wurde
das
PCR-Reaktionsgefäß auf Eis gestellt. Mit einer Wolfram-Nadel wurde ein kleiner Schlitz in
der dorsalen Wand eines epithelialen Somiten (Somit I-V) 2-tägiger Hühnerembryonen
(HH-Stadium 11) gemacht. Anschließend wurde ein mit BMP4 getränktes Kügelchen mit
feiner Pinzette durch den Schlitz in den Somiten implantiert.
2.2.3.5. Herstellung der Wachtel-Huhn-Chimären
Das Prinzip der Wachtel-Huhn-Chimäre besteht darin, dass dem Hühnerembryo ein
bestimmtes Gewebestück entnommen und durch ein Gewebestück des Wachtelembryos
ersetzt wird. Im Hühnerembryo entwickelt sich das implantierte Wachtelgewebe wie
Hühnchengewebe. Nach Fixierung können die transplantierten Wachtelzellen mit einem
spezifischen Antikörper (QCPN, Wachtel-spezifischer Antikörper) im Hühnerembryo
nachgewiesen werden. Auf diese Weise können Derivate des Wachteltransplantats in der
Entwicklung verfolgt werden.
Da der epaxiale und hypaxiale Dermomyotomabschnitt entsprechend aus dem dorsomedialen
und dem dorsolateralen Somitquadranten hervorgehen (Ordahl und Le Douarin 1992), wurde
der dorsomediale und dorsolaterale Quadrant eines Scapula-bildenden Somiten transplantiert,
um die Lokalisation der Vorläuferzellen der Scapula-Klinge im Dermomyotom zu
identifizieren.
Herstellung des Transplantats aus Wachtelembryonen:
Die Wachtelembryonen wurden bis HH-Stadium 14 inkubiert. In diesem Stadium sind die
Scapula-bildenden Somiten in epithelialem Zustand. Der dorsomediale bzw. der dorsolaterale
Quadrant des Somiten 19/20 wurde mit darüberliegendem Ektoderm mittels einer
15
Material und Methoden
Wolfram-Nadel ausgeschnitten. Das Transplantat wurde mit einer Saugkapillare zum
präparierten Empfänger transportiert.
Vorbereitung der Hühnerembryonen:
Die Hühnerembryonen wurden bis HH-Stadium 14 inkubiert. Die dorsomediale oder
dorsolaterale Hälfte des Somiten 19/20 wurden mit darüberliegendem Ektoderm mit einer
Wolfram-Nadel zuerst ausgeschnitten, und dann mit einer Saugkapillare entfernt. Der
dorsomediale oder dorsolaterale Quadrant der Wachtel wurden in die entsprechende Lücke im
Huhn eingebracht.
2.2.3.6. Injektion Noggin-Protein-sezernierender Zellen
Noggin
kann
die
BMP-Signalwege
unterbinden.
Mit
Hilfe
der
Injektion
Noggin-Protein-sezernierender Zellen soll geklärt werden, ob die lateralen BMPs an der
Entwicklung der Scapula-Klinge beteiligt sind.
Vorbereitung der Noggin-Protein-sezernierenden Zellen:
Noggin-Protein-sezernierende CHO B3 Zellen (Gabe von Professor Richard Harland,
Universität California, Berkeley) kamen in dieser Untersuchung zur Anwendung. Das
Medium für diese CHO B3 Zellen besteht aus 1% Penicillin, 1% Aminosäure, 1%
nicht-essenziellen Aminosäuren, 5% dialysiertem Rinderserum und 92% MEM Alpha
Medium ohne Ribonukleoside (GIBco BRL). Alle Zellen wurden in einem Tank bei -80 °C
eingefroren. Für die Zellkultur wurde ein Gefäß von CHO B3 Zellen in 10ml Medium in einer
Petri-Schale bei 37 °C kultiviert. Nach 3 Tagen blieben alle Zellen am Boden der Schale, und
das Medium wurde durch frisches Medium ersetzt. Nach einer Kulturzeit von insgesammten 6
Tagen hatte sich am Boden der Schale ein dichter Zellrasen gebildet. Zur Isolierung der Zellen
wurde das Medium aus der Schale abgegoßen, und der zellhaltige Boden mit PBS gewaschen.
Zur Ablösung der Zellen vom Boden wurde 2 µl Trypsin-Lösung aufgetropft. Nach ein paar
Sekunden hatten sich alle Zellen vom Boden abgelöst. Zur Neuralisierung wurde 2 µl
Medium in die Trypsin-Lösung gegeben. In einem 15ml Falcon-Gefäß wurden die Zellen in
16
Material und Methoden
der Lösung bei 1000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Danach wurde das Pellet mit 1ml
Medium durch Vortexen gemischt und in ein kleines 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt. Nach
weiterem Zentrifugieren bei 1000 rpm für 5 Minuten war das Pellet für die Zellinjektion
bereit.
Injektion Noggin-Protein-sezernierender Zellen:
Während der Zellinjektion wurde dieses 1.5 ml Reaktionsgefäß auf Eis gestellt. Die
Hühnerembryonen wurden bis HH-Stadium 22 inkubiert. In diesem Stadium fangen die
Vorläuferzellen der Scapula-Klinge an, aus dem Dermomyotom in den subektodermalen
Raum auszuwandern. Mit einer Wolfram-Nadel wurde ein Loch zwischen dem Somiten und
der Somatopleura in Höhe von Somiten 21/22 im Ektoderm erzeugt. Ein stumpfer Glasstab
wurde durch das Loch in den subektodermalen Raum eingeführt. Durch diesen Glasstab
wurde ein Tunnel unter dem Ektoderm in Höhe von Somiten 17-22 gebohrt. Zellen, die
Noggin-Protein sezernieren, wurden in eine feine durch Mund kontrollierte Saugkapillare
angesaugt und in den Tunnel injiziert. Die Zellen blieben bei der Weiterentwicklung im
Tunnel. Durch das Produkt der Zellen wurde die Wirkung der BMP-Signalwege auf die
Entwicklung der Scapula-Klinge blockiert.
2.3.
Whole-mount in situ-Hybridisierung
Whole-mount in situ-Hybridisierung ist eine molekulare Methode, mit der die Expression
eines bestimmten Markergens durch die Detektion seiner mRNA untersucht wird. Diese
Methode basiert auf der Eigenschaft von Nukleinsäuren, Doppelstränge zu bilden, wenn zwei
komplementäre Einzelstränge vorliegen. Die mRNA liegt als Einzelstrang in der Zelle vor.
Ein markierter Gegenstrang eines bestimmten Markergens kann mit der entsprechenden
mRNA einen Doppelstrang bilden. Mit Hilfe einer enzymatisch katalysierten Farbreaktion mit
dem markierten Gegenstrang kann die Bindung mit der mRNA in der Zelle sichtbar gemacht
werden.
17
2.3.1.
Material und Methoden
Protokoll für in situ-Hybridisierung
Arbeitsschritte
Zeit
Temp.
Fixierung der Embryonen mit 4% PFA in PBT-DEPC
über Nacht
4°C
Waschen in PBT-DEPC
1x 20 Min.
4°C
2x 20 Min.
4°C
Rehydrierung in PBT-DEPC
1x 20 Min.
4°C
Enzym-Verdau mit Proteinase K (20 g/ml) in PBT
ca. 1 Min./St.
Raum Temp.
Waschen in PBT
1x 10 Min.
4°C
Fixierung in 1% Glutaraldehyd in 4% PFA in PBT-DEPC
30-45 Min.
4°C
Waschen in PBT
1x 10 Min
4°C
Prähybridisieren in Hybridisierungspuffer
2 Stunden
65°C
In frischem Hybridisierungspuffer
übernacht
65°C
2 Tage
65°C
Waschen in 2 x SSC ohne CHAPS
1x 20 Min
65°C
Waschen in 2 x SSC mit CHAPS (CHAPS:SSC = 1:50)
2x 20 Min
65°C
Waschen in 0,2 x SSC mit CHAPS (CHAPS:SSC = 1:50) 2x 20 Min
65°C
Wechsel in KTBT
5 Min
Raum Temp.
4 Stunden
Raum Temp.
Inkubation mit Antikörper-Lösung (anti-DIG)
übernacht
4°C
Waschen in KTBT
6x 2 Stunden
Raum Temp.
Waschen in KTBT
übernacht
4°C
Waschen in AP-Puffer
2x 15 min
Raum Temp.
I. Vorbehandlung der Embryonen
Dehydrierung in 100% Methanol
(Aufbewahrung in Methanol bei -20°C möglich)
II. Hybridisierung
Hinzufügen der RNA-Sonde zum Hybridisierungspuffer
III. Waschen
IV. Immunhistochemischer Sonden-Nachweis
Blockierung
unspezifischer
Bindungen
Pferdeserum in KTBT
mit
10%
18
Material und Methoden
Inkubation mit der Färbe-Lösung (vor Licht geschützt)
nach Bedarf
Raum Temp.
Waschen in AP-Puffer
übernacht
4°C
Refixierung in 4% PFA in PBS
2.3.2.
Herstellung von Vibratomschnitten
Um das Expressionsmuster eines bestimmten Markergens in Schnitte zu analysieren, wurden
die Embryonen nach der Whole-mount in situ-Hybridisierung in 3% Agar in PBS eingebettet
und in 50 µm dicke Schnitte geschnitten. Die Serienschnitte wurden auf Objektträger
aufgezogen und auf einer Wärmeplatte getrocknet. Danach wurden die Schnitte mit Aquatex
(Merck) bedeckt und unter einem Durchlichtmikroskop (Wild M10 Leica) mit einer Kamera
(DFC 420 Leica) fotografiert.
2.4.
Analyse des Skelettmusters
Um einen optimalen dreidimensionalen Überblick des Skeletts zu erhalten, wurde das
Skelettsystem im intakten Embryo angefärbt. Die Scapula ist am 9. Entwicklungstag
(HH-Stadium 35) fast vollständig knorpelig angelegt. Die operierten Embryonen wurden
deshalb nach 8 bis 9 Tagen Inkubationszeit in einer Farblösung (siehe 2.6.) fixiert. Zur
Anfärbung von Knorpel kam als Farbstoff Alcian-Blau zur Anwendung. Um das angefärbte
Skelett darzustellen, muss nach der Anfärbung das umliegende Gewebe transparent gemacht
werden.
Die Knorpelfärbung wurde nach dem folgenden Protokoll durchgeführt:
-
Fixierung und Anfärbung in Farblösung für 24 Stunden.
-
Dehydrierung in 100% Ethanol für 2 Tage.
-
Aufhellung und Aufbewahrung in 100% Methylsalicylat (Sigma).
Dieses
Protokoll
erlaubt
nach
immunhistologischer Techniken.
der
Knorpelfärbung
die
Durchführung
weiterer
19
Material und Methoden
2.5.
Histologie und Färbetechniken
2.5.1.
Herstellung der Paraffinschnitte für die histologische Untersuchung
Nach der Analyse der Knorpelfärbung wurden die Embryonen direkt in Paraffin bei 58 °C
übernacht inkubiert und dann in Paraffin eingebettet. Mit einem Mikrotom wurden die
operierten Abschnitte der Embryonen in der Transversalebene lückenlos 8 µm dick in Serra
geschnitten. Die Serienschnitte wurden auf mit Glycerin-Gelatine beschichtete Objektträger
aufgezogen und in einem Wärmeschrank bei 40°C getrocknet.
2.5.2.
Immunhistochemische Färbung der Paraffinschnitte
Die Paraffinschnitte wurden hergestellt, um immunhistochemisch das Muskelmuster und/oder
die transplantierten Wachtelzellen darzustellen. In Prinzip werden zur Detektion von
bestimmten Zelltypen Antikörper verwendet, die an spezifischen Antigenen binden können.
Muskelzellen exprimieren das muskelspezifische Antigen Desmin. Gegen Desmin gibt es
sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper. Wachtelzellen exprimieren andere
Kernmembran-Antigene als Hühnerzellen, für welche monoklonale Antikörper (z.B. QCPN,
Wachtel-spezifischer Antikörper) zur Verfügung stehen. Diese ersten Antikörper können von
zweiten Antikörpern erkannt werden, die mit einem Enzym konjugiert sind. Durch eine
Farbreaktion mit dem Enzym werden die Antigene sichtbar gemacht.
Um die Muskulatur des operierten Embryos darzustellen, wurden die Paraffinschnitte von
Hühnerembryonen mit einem murinen, monoklonalen Anti-Desmin-Antikörper (Dako,
Verdünnung
1:100
in
PBS)
Ziegen-anti-Maus-Antikörper
mit
inkubiert.
Als
zweiter
Peroxidase-Konjugation
Antikörper
(GamPo,
diente
ein
Sigma).
Die
Diaminobenzidin (DAB)-Reaktion mit Ammoniumnickelsulfat ergab eine Braunfärbung der
Desmin enthaltenden Zellen.
Die Paraffinschnitte von Wachtel-Huhn-Chimären wurden durch eine Doppelmarkierung von
QCPN und Desmin-Antikörper angefärbt. Im ersten Schritt erkannte ein polyklonaler
Anti-Desmin-Antikörper aus Kaninchenserum (Sigma, Verdünnung 1:400) das Desmin, und
20
Material und Methoden
ein muriner, monoklonaler QCPN-Antikörper (Quail Cell Nuclei, Hybridoma Bank,
Überstand der Zellkultur) die Zellkerne der Wachtelzellen. Im zweiten Schritt erkannte ein
Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper, der mit Peroxidase konjugiert war (GarPo, Sigma,
Verdünnung 1:250), den anti-Desmin-Antikörper und ein Ziegen-anti-Maus-Antikörper, der
mit alkalischer Phosphatase konjugiert war (GamAP, Dako, Verdünnung 1:100), den
QCPN-Antikörper. Nach Inkubation wurde zuerst die Peroxidase-Reaktion mit DAB-Lösung
ohne Ammoniumnickelsulfat entwickelt. Danach wurden die Schnitte in AP-Puffer überführt,
und die Alkalische-Phosphatase-Farbreaktion mit NBT/BCIP-Färbelösung bis zu 60 Minuten
durchgeführt. Aus dem AP-Puffer heraus erfolgte die Gegenfärbung mit Kernecht-Rot. Die
Desmin enthaltenden Muskelzellen wurden hellbraun, die Wachtelzellkernen blau angefärbt.
2.6.
Chemische Reagenzien und Zusammensetzung der verwendeten Lösungen
2.6.1.
Lösungen für die Operationen
•
Farblösung für die Farbstifte:
1% Nil-Blau-Sulfat und 2, 5% Agarose in Aqua bidest.
•
Locke-Lösung:
Stammlösung A: 94,270 g NaCl auf 1000 ml Aqua bidest.
Stammlösung B: 12,0253 g KCl auf 1000 ml Aqua bidest.
Stammlösung C: 15,8092 CaCl*H2O auf 1000 ml Aqua bidest.
100 ml A auf 1000 ml mit Aqua bidest. auffüllen + 37 ml B + 21 ml C + 0,03 g
Penicillin G Natriumsalz
2.6.2.
•
Lösungen für die Whole-mount in situ-Hybridisierung
Paraformaldehyd (PFA) (Sigma)
10 x PBS-Stammlösung:
72 g NaCl, 4,3 g KH2HPO4, 14,8 g Na2HPO4*12H2O auf 2000 ml mit Aqua bidest.
auffüllen.
21
•
PBT: 0,1% Triton X-100 (Sigma) in PBS.
•
Proteinase K-Stammlösung:
Material und Methoden
20 mg/ml Proteinase K (Sigma) in PBT.
•
Glutaraldehyd-Stammlösung:
25 % Glutaraldehyd (Sigma)
•
Hybridisierungspuffer:
2% Blockierungspulver (Boehringer)
0,1% Triton X-100
in 1:1
Formamid : 5 x SSC
0,1% CHAPS (Sigma)
1 mg/ml tRNA
5mM EDTA
50 µg/ml Heparin
•
20 x SSC-Stammlösung:
3M NaCl und 0,3M Natrium-Citrat; pH 7.0
•
KTBT-Lösung:
50mM Tris-HCl, pH 7.5; 150mM NaCl; 10mM KCl, 1% Triton X-100
•
Antikörper-Lösung:
Anti-Digoxigenin-Antikörper (Boehringer) und 10% Lamm-Serum in KTBT werden
im Verhältnis 1:2000 verdünnt.
•
AP-Puffer:
5 ml 1M Tris-Puffer pH 9,5
2,5 ml 1M MgCl2
1 ml 5M NaCl
mit Aqua bidest. auf 50 ml auffüllen
2 ml Triton X-100 (Firma)
•
Färbe-Lösung:
4,5 µl/ml 4-Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT) (Boehringer)
3,5 µl/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphat (BCIP) (Boehringer)
•
CHAPS-Lösung:
10 g Trockensubstanz in 100 ml Aqua bidest.
•
1 M Tris-Puffer-Stammlösung:
in AP-Puffer
22
Material und Methoden
121,1 g Tris in 800 ml Aqua bidest. auflösen, pH-Einstellung mit konzentrierter HCl,
auf 1000 ml mit Aqua bidest. auffüllen
2.6.3.
•
Lösungen für die Skelettanalyse und Immunhistochemie
Farblösung zur Knorpelfärbung:
0.0375g Alcian-Blau
200ml 100% Ethanol
0.015% Alcian-Blau in Konzentration
50ml 100% Essigsäure
•
Serra-Fixierlösung 1l:
600 ml Ethanol, 300 ml Formol, 100 ml Eisessig
•
PBS-Tween:
500 µl Tween in 1000 ml PBS
•
BSA: Rinderserumalbumin (Serva)
•
Diaminobenzidin (DAB)-Lösung ohne Ammoniumnickelsulfatzusatz:
200 ml Tris-HCl Puffer pH 7.6 + 80 mg DAB + 40 µl H2O2
•
DAB-Lösung mit Ammoniumnickelsulfatzusatz:
175 ml Tris-HCl pH 7.6 + 1% Ammoniumnickelsulfat in 25 ml Tris-HCl pH 7.6
+ 80 mg DAB + 40 µl H2O2
•
80 mg DAB-Portionen:
Diaminobenzidin (DAB) 5g in 62,5 ml Aqua bidest. lösen und in 1 ml portionieren
ergibt eine Endkonzentration von 80 mg/ml. Lagerung bei –20°C.
•
Kernecht-Rot-Lösung:
1 g Kernecht-Rot in 1000 ml 5%iger Aluminiumsulfatlösung lösen und filtrieren.
23
Ergebnisse
3.
Ergebnisse
3.1.
Ergebnisse zur Entwicklung des lateralen Sklerotoms
3.1.1.
Unterbrechung der lateralen Signalwege durch Implantation einer Barriere zwischen
Somiten und intermediärem Mesoderm
Laterale Signale aus dem intermediären Mesoderm und dem Seitenplattenmesoderm spielen
bei der Somitenentwicklung eine wichtige Rolle. Für die Entwicklung des hypaxialen
Dermomyotomabschnitts sind laterale Signale erforderlich (Pourquié et al., 1996). Da der
laterale Sklerotomabschnitt an das intermediäre Mesoderm angrenzt, und sich unabhängig
von axialem Shh entwickelt, könnten laterale Signale bei der Bildung des lateralen
Sklerotoms von Bedeutung sein. Zur Klärung der Funktion lateraler Signale wurden Somiten
von den lateralen Signalen durch Implantation einer Aluminium-Barriere zwischen den neu
gebildeten Somiten und dem intermediären Mesoderm abgeschirmt (Abb. 1A). Nach 1-tägiger
Reinkubation wurden die operierten Embryonen für die In situ-Hybridisierung fixiert.
Insgesamt wurden zwölf operierte Hühnerembryonen fixiert. Die Hälfte der Embryonen
wurde mit Paraxis und die andere Hälfte mit cMfh1 in situ hybridisiert. Paraxis, das im
unsegmentierten paraxialen Mesoderm und im Epithel der neu gebildeten Somiten exprimiert
wird, ist essenziell für die Epithelialisierung der Somiten (Sosic et al., 1997). Bei der
Kompartimentierung der Somiten wird die Expression von Paraxis im ventralen
Somitenabschnitt herunterreguliert. Dies führt zu einer epithelio-mesenchymalen Transition in
diesem Somitenabschnitt und zur Bildung des Sklerotoms. Demgegenüber wird die
Paraxis-Expression im dorsalen epithelialen Somitenabschnitt aufrechterhalten (Barnes et al.,
1997). Daher wurde Paraxis in dieser Untersuchung als epithelialer Marker verwendet. cMfh1
ist das einzige Markergen, das im gesamten Sklerotom exprimiert ist (Sudo et al., 2001), und
wurde deshalb in dieser Untersuchung als Sklerotommarker verwendet.
24
Ergebnisse
Nach der In situ-Hybridisierung wurden die Embryonen transversal geschnitten. Auf der
Kontrollseite und der operierten Seite war die Expression von Paraxis im dorsalen
Somitenabschnitt ähnlich (Abb. 1B und 1C). Die Expression von Paraxis im ventralen
Somitenabschnitt
war
jedoch
verändert.
Während
auf
der
Kontrollseite
die
Paraxis-Expression im gesamten ventralen Abschnitt herunterreguliert wurde, blieb sie auf
der operierten Seite im ventrolateralen Somitenabschnitt weiter aufrechterhalten (Abb. 1B).
Dies weist darauf hin, dass das Epithel im ventrolateralen Somitenabschnitt, das während der
Sklerotombildung
normalerweise
durch
eine
epithelio-mesenchymale
Transition
mesenchymal wird, ohne laterale Signale epithelial bleibt. Der sklerotomale Marker cMfh1 ist
auf der Kontrollseite im gesamten Sklerotom exprimiert. Demgegenüber ist seine Expression
auf der Operationsseite nur im ventromedialen Somitenabschnitt zu erkennen. Die
cMfh1-Expression im ventrolateralen Abschnitt blieb dagegen aus (Abb. 1C). Dies weist
darauf hin, dass sich der ventrolaterale Somitenabschnitt in Abwesenheit lateraler Signale
nicht zum Sklerotom entwickelt.
Laterale Signale sind also an der Induktion des lateralen Sklerotoms beteiligt, während sich
das mediale Sklerotom unabhängig von lateralen Signalen entwickelt.
3.1.2.
Unterbrechung der axialen Signalwege durch Implantation einer Barriere zwischen
Somiten und Chorda-Bodenplatten-Komplex
Shh aus dem Chorda-Bodenplatten-Komplex induziert die Sklerotombildung und die
Expression seiner Markergene Pax1 und Pax9 (Dietrich et al., 1993, 1997; Koseki et al.,
1993). BMPs verhindern diese Wirkung von Shh (McMahon et al., 1998). Noggin ist für die
durch Shh induzierte Sklerotomentwicklung von Bedeutung, indem es die Funktion lateraler
BMPs blockiert. Es besteht durch axiales Noggin eine antagonistische Wirkung zwischen den
medialen Signalen und den lateralen BMPs bei der Sklerotomentwicklung. Zur Klärung der
Frage, ob das Territorium des lateralen Sklerotoms in Abwesenheit axialer Signale nach
medial ausdehnt, wurde die Wirkung axialer Signale auf die Somiten durch Implantation einer
Barriere zwischen den neu gebildeten Somiten und dem Chorda-Bodenplatten-Komplex
blockiert (Abb. 2A). Nach 1-tägiger Reinkubation wurden die Embryonen zur Untersuchung
25
Ergebnisse
der Sklerotombildung für die In situ-Hybridisierung mit Paraxis und cMfh1 fixiert.
Insgesamt zwanzig Embryonen wurden operiert und fünfzehn davon hatten überlebt. Nach der
In situ-Hybridisierung wurden die Embryonen transversal geschnitten. Paraxis-Expression
war sowohl auf der Kontrollseite als auch auf der operierten Seite im dorsalen
Somitenabschnitt zu sehen. Demgegenüber wurde sie im ventrolateralen Somitenabschnitt auf
beiden Seiten herunterreguliert. Im ventromedialen Somitenabschnitt jedoch wurde Paraxis
nur auf der Kontrollseite herunterreguliert, wohingegen die Expression auf der operierten
Seite aufrechterhalten wurde (Abb. 2B). Dies weist darauf hin, dass Zellen im ventromedialen
Somitenabschnitt in Abwesenheit axialer Signale in diesem Stadium noch epithelial bleiben,
während sie im ventrolateralen Somitenabschnitt zu deepithelialisieren beginnen. Das
mesenchymale Markergen cMfh1 wurde im gesamten Sklerotom auf der Kontrollseite
exprimiert. Im ventromedialen Somitenabschnitt auf der operierten Seite wurde cMfh1 stark
herunterreguliert. Demgegenüber wurde es in einer kleinen Zellpopulation des ventrolateralen
Abschnitts exprimiert, die Sklerotomzellen darstellte (Abb. 2C).
Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass ohne die antagonisierende Wirkung
axialer Signale auf die lateralen Signale das Territorium des lateralen Sklerotoms nicht nach
medial erweitert wird.
3.1.3.
Unterbrechung der axialen und lateralen Signalwege durch Implantation zweier
Barrieren
zwischen
Somiten
und
intermediärem
Mesoderm
bzw.
Chorda-Bodenplatten-Komplex
Nach der bisherigen Ergebnissen geht man davon aus, dass das Sklerotom aus einem
medialen und einem lateralen Abschnitt besteht, die durch axiale und laterale Signale
induziert werden. Danach könnte vermutet werden, dass kein Sklerotom gebildet würde, wenn
beide Signale gleichzeitig blockiert würden. Um diese Vermutung zu überprüfen, wurden die
Somiten sowohl von axialen und als auch von lateralen Signalen durch Implantation zweier
Barrieren zwischen neu gebildeten Somiten und intermediärem Mesoderm bzw. dem
Chorda-Bodenplatten-Komplex abgeschirmt (Abb. 3A). Nach 1-tägiger Reinkubation wurden
26
Ergebnisse
die Embryonen für die In situ-Hybridisierung mit Paraxis fixiert. Träfe die aufgestellte
Hypothese zu, sollte Paraxis im ventralen Somitenabschnitt auf der operierten Seite nicht
mehr herunterreguliert werden.
Zehn Embryonen wurden in dieser Weise operiert, von denen acht überlebten und ausgewertet
werden konnten. Nach der In situ-Hybridisierung mit Paraxis wurden die Embryonen
transversal geschnitten. Auf der Kontrollseite wurde Paraxis wie üblich im dorsalen
Somitenabschnitt exprimiert, während es im ventralen Abschnitt herunterreguliert wurde. Auf
der operierten Seite wurde Paraxis, wie vermutet, im gesamten Somiten sowohl im dorsalen
als auch im ventralen Abschnitt gleich stark expimiert (Abb. 3B). Daraus kann geschlossen
werden, dass die Bildung sowohl des medialen als auch des lateralen Sklerotoms in
Abwesenheit axialer und lateraler Signale ausbleiben.
3.1.4.
Applikation des BMP4-Signalproteins
BMPs sind sezernierte Signale aus dem intermediären und dem Seitenplattenmesoderm. An
der Bildung des lateralen Sklerotoms sind laterale Signale beteiligt. Es stellte sich die Frage,
ob es sich bei den lateralen Signalen um BMPs handelt. Zur Klärung dieser Frage wurden mit
BMP4 getränkte Kügelchen in die neu gebildeten Somiten implantiert. Um die Bildung des
lateralen Sklerotoms durch In situ-Hybridisierung mit Paraxis zu untersuchen, wurden die
Embryonen nach 1-tägiger Reinkubation fixiert.
Insgesamt fünfzehn Hühnerembryonen wurden operiert. Es wurde dabei sichergestellt, dass
die Kügelchen nach der Operation an der Stelle verblieben, an der sie während der Operation
eingebracht
worden
waren.
Whole-mount
in
situ-Hybridisierung
zeigte
eine
Herunterregulation von Paraxis in den Somiten an der Stelle, an der die Kügelchen
implantiert worden waren. Danach wurden die operierten Somiten transversal geschnitten.
Die Paraxis-Expression wurde auf der Kontrollseite im epaxialen und hypaxialen
Dermomyotomabschnitt aufrechterhalten, und im ventralen Abschnitt herunterreguliert. Auf
der operierten Seite wurde Paraxis im ventralen Somitenabschnitt um das Kügelchen stärker
27
Ergebnisse
herunterreguliert als auf der Kontrollseite. Im dorsalen Somitenabschnitt waren die Zellen, die
nahe am Kügelchen lagen, ebenfalls Paraxis negativ (Abb. 4). Dies deutet darauf hin, dass
BMPs
die
Expression
von
Paraxis
herunterregulieren,
und
damit
eine
epithelio-mesenchymale Transition induzieren.
3.2.
Ergebnisse zur Entwicklung der Scapula-Klinge
3.2.1.
Homotope Wachtel-Huhn-Chimärisierungen vom dorsomedialen und dorsolateralen
Somitenabschnitt
Das Dermomyotom besteht wie bereits beschrieben aus einem epaxialen und einem
hypaxialen Abschnitt. Shh aus dem Chorda-Bodenplatten-Komplex beteiligt sich an der
Regulation der Entwicklung des epaxialen Dermomyotoms (Borycki et al., 1999), während
laterale BMPs für die Entwicklung des hypaxialen Dermomyotomabschnitts von Bedeutung
sind (Pourquié et al., 1996). Da sich die Scapula-Klinge, die dem Dermomyotom entstammmt
(Huang et al., 2000b), unabhängig von Shh entwickelt (Chiang et al., 1996; Teillet et al.,
1998), kann vermutet werden, dass sich die Vorläuferzellen der Scapula-Klinge im hypaxialen
Dermomyotomabschnitt befinden. Mit folgender Experimentesserie sind wir dieser
Hypothese nachgegangen.
Es ist bekannt, dass der epaxiale und der hypaxiale Dermomyotomabschnitt aus dem
dorsomedialen bzw. dem dorsolateralen Somitenabschnitt hervorgeht (Ordahl und Le Douarin
1992). Daher wurden der zukünftige epaxiale und hypaxiale Dermomyotomabschnitt durch
homotope Wachtel-Huhn-Chimärisierungen markiert (Abb. 5A). Nach 6-tägiger Reinkubation
wurden die Hühnerembryonen für die Analyse des Skelettmusters und weitere
immunhistochemische Untersuchungen vorbereitet.
Sechs Transplantationen vom dorsomedialen Quadranten wurden durchgeführt. Nach
immunhistochemischer Färbung war zu erkennen, dass sich keine Scapula-Klinge auf der
operierten Seite entwickelt hatte, die aus Wachtelzellen bestand. In weiteren sieben Chimären
28
Ergebnisse
wurde der dorsolaterale Quadrant transplantiert. Zwei Embryonen aus dieser Serie wurden
nach kurzer Reinkubation fixiert und geschnitten. Nach immunhistochemischer Färbung
befanden sich die Wachtelzellen im hypaxialen Dermomyotomabschnitt und in einem
subektodermalen Raum lateral vom Dermomyotom (Abb. 5B). Die Analyse des
Skelettmusters der anderen fünf Chimären zeigte, dass alle Hühnerembryonen auf der
operierten Seite eine unterbrochene Scapula-Klinge aufwiesen. Auf der unterbrochenen Stelle
war ein kleines schmales Knorpelstück zu beobachten. Nach immunhistochemischer Färbung
im transversalen Schnitt befanden sich Wachtelzellen in diesem kleinen Knorpelstück und in
seinem Perichondrium. Die mit der Scapula assoziierten Muskeln und die interkostalen
Muskeln enthielten auch Wachtelzellen (Abb. 5C und 5D).
Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass sich die Vorläuferzellen der
Scapula-Klinge nicht im epaxialen, sondern im hypaxialen Dermomyotomabschnitt befinden.
3.2.2.
Unterbrechung
der
lateralen
BMP-Signalwege
durch
Injektion
des
hypaxialen
Noggin-Protein-sezernierender Zellen
Wie
oben
dargelegt,
ist
die
Scapula-Klinge
ein
Derivat
Dermomyotomabschnitts. Für die Entwicklung dieses Abschnitts sind laterale BMPs von
Bedeutung (Pourquié et al., 1996). Da die lateralen Signale nach unseren vorherigen
Ergebnissen für die Entwicklung der Scapula-Klinge benötigt werden (Wang et al., 2005),
gingen wir der Frage nach, ob die lateralen BMPs die Entwicklung der Scapula-Klinge
beeinflussen. Zur Klärung dieser Frage wurde die Wirkung der BMP-Signalwege durch
Injektion Noggin-Protein-sezernierender Zellen in die Scapulaanlage in Höhe von Somiten
16-19 und 19-23 blockiert (Abb. 6A). Nach einer Reinkubationszeit von zwei bis vier Tagen
wurden die Embryonen für die In situ-Hybridisierung mit dem Scapula-spezifischen
Markergen Pax1 bzw. für die Analyse des Skelettmusters isoliert und fixiert.
Die Embryonen, in denen Zellen in Höhe von Somiten 16-19 injiziert wurden, wurden für In
situ-Hybridisierung nach 2-tägiger Reinkubation isoliert. Auf der Kontrollseite wurde das
29
Ergebnisse
Scapula-spezifische Pax1 in der Scapulaanlage exprimiert. Auf der operierten Seite wurde
Pax1 in Höhe von Somiten 16-19, in der sich die Noggin-Protein-sezernierenden Zellen
befinden, herunterreguliert. Die restliche Pax1-Expression in der Scapulaanlage auf der
operierten Seite war schwächer als die auf der Kontrollseite (Abb. 6B und 6C). Nach der
Analyse des Skelettmusters wiesen alle operierten Embryonen auf der operierten Seite eine
unterbrochene Scapula-Klinge auf (Abb. 6G). Die Skelettelemente der Wirbelsäule und der
Rippen wurden normal gebildet. Weitere immunhistochemische Untersuchungen zeigten auf
der operierten Seite eine Abwesenheit der Scapula-Klinge und der der Scapula zugehörigen
Muskeln. Die anderen epaxialen und hypaxialen Muskeln wurden normal gebildet (Abb. 6J
und 6K).
Die Embryonen, in denen Zellen in Höhe von Somiten 19-23 injiziert wurden, wurden für In
situ-Hybridisierung nach 1,5-tägiger Reinkubation isoliert. Die Pax1-Expression war auf der
Kontrollseite bis in Höhe von Somiten 20 erweitert, während es auf der Operationsseite nur
bis in Höhe von Somiten 18/19 exprimiert wurde (Abb. 6D und 6E). Auf den transversalen
Schnitten in Höhe von Somiten 19 blieb die Pax1-Expression auf der Operationsseite aus
(Abb. 6F). Nach 4-tägiger Reinkubation zeigte sich auf der Kontrollseite eine normale
Scapula-Klinge (Abb. 6H), während auf der Operationsseite nur der kraniale Teil der
Scapula-Klinge gebildet wurde (Abb. 6I).
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass für die Expression von Pax1 und die weiteren
Differenzierungen der Scapula-Klinge laterale BMPs notwendig sind.
30
4.
Diskussion
Diskussion
BMP-Signale sind wichtige Signalmoleküle, die an vielen Entwicklungsprozessen beteiligt
sind. In dieser Untersuchung konnte gezeigt werden, dass BMPs aus dem lateralen Mesoderm
bei der Somitenentwicklung unterschiedlicher Entwicklungsphasen ihre unterschiedlichen
Funktionen ausüben. In der Frühentwicklung induzieren sie die Entwicklung des lateralen
Sklerotoms. Anschließend leiten sie das Auswachsen der Rippen und Interkostalenmuskeln in
die Thoraxwand ein. In einem relativ späten Entwicklungsstadium der Somiten spezifizieren
sie die Scapulavorläuferzellen für den Schultergürtel. In diesem Abschnitt werde ich mit der
Diskussion der Bedeutung medialer und lateraler Signale bei der Sklerotomentwicklung
beginnen. Dann werde ich mich mit dem Mechanismus der Verlängerung der Rippen in der
Thoraxwand beschäftigen. Im letzten Abschnitt dieses Kapitels werden die intrisischen und
extrinsischen Einflüssen auf die Scapulaentwicklung diskutiert.
4.1.
Ein
Antagonismus
medialer
und
lateraler
Signale
während
der
Sklerotomentwicklung ist für die Wirbelsäulenentwicklung erforderlich
Bei der Somitenkompartimentierung bildet der ventrale Somitenabschnitt durch eine
epithelio-mesenchymale Transition das Sklerotom, während der dorsale Somitenabschnitt
seine epitheliale Eigenschaft beibehält und Dermomyotom genannt wird. Das Sklerotom ist
die Quelle für die Skelettelemente der Wirbelsäule und der Rippen (Huang et al., 2000a;
Christ et al., 2004), während das Dermomyotom die Vorläuferzellen für die Skelettmuskulatur,
die Dermis des Rückens, das Bindegewebe, das Endothel und den Knorpel liefert (Scaal et al.,
2004).
Für die Sklerotomentwicklung stellt der Chorda-Bodenplatten-Komplex die mediale
Signalquelle dar. Aus diesem Komplex wird Shh sezerniert, das die Pax1-Expression im
ventralen Somitenabschnitt induziert (Koseki et al., 1993; Dietrich et al., 1993; Müller et al.,
1996). Die Pax1-Expression ist kurz vor der epithelio-mesenchymalen Transition angeschaltet,
31
Diskussion
und wird bei der weiteren Sklerotomentwicklung durch Shh aufrechterhalten (Übersicht von
Christ et al., 2004). Nach der Entfernung der Chorda dorsalis wird Pax1 im ventralen
Sklerotom nicht exprimiert (Ebensperger et al., 1995). In späteren Entwicklungsstadien
migrieren die Pax1-positiven Sklerotomzellen in den Raum um die Chorda dorsalis und
bilden die Perichordalröhre, von dem sich die Wirbelkörper und Bandscheiben entwickeln
(Töndury 1958; Jacob et al., 1975a; Christ und Wilting 1992). In der Shh-knock-out-Maus ist
die Pax1-Expression im Sklerotom stark herunterreguliert, was zu einer Fehlbildung der
gesamten Wirbelsäule und der proximalen Rippen führt (Chiang et al., 1996). Einen ähnlichen
Phänotyp findet man auch in der Pax1-knock-out-Maus (Wallin et al., 1994). Daher markiert
Pax1 eine Zellpopulation im Sklerotom, die die Vorläuferzellen der Wirbelsäule und der
proximalen Rippe darstellt.
Neben den medialen Signalen sind noch laterale Signale für die Sklerotomentwicklung von
Bedeutung, die aus dem intermediären Mesoderm und Seitenplattenmesoderm freigesetzt
werden. Laterale Signale sind BMP2, BMP4 und BMP7. Es wird in der vorliegenden
Untersuchung nachgewiesen, dass neben der induktiven Funktion bei der Entwicklung des
hypaxialen Dermomyotomabschnitts (Pourquié et al., 1996) laterale BMPs auch die
Entwicklung des lateralen Sklerotoms induzieren. Das laterale Sklerotom liefert die
Vorläuferzellen für die distalen Rippen (Huang et al., 1994, 2000a). Nach der Blockierung der
lateralen BMPs mittels Injektion Noggin-Protein-sezernierender Zellen in das intermediäre
Mesoderm ist die distale Rippe fehlgebildet (Sudo et al., 2001).
Da Shh und laterale BMPs die Entwicklung des medialen und lateralen Sklerotoms
kontrollieren, muss im Sklerotom eine bestimmte Grenze durch beide Signale festgelegt
werden. Durch diese Grenze wird das Sklerotom in zwei Abschnitte unterteilt, einen medialen
zur Bildung der Wirbelsäule und der proximalen Rippe, und einen lateralen zur Bildung der
distalen Rippe. Die Festlegung dieser Grenze beruht auf einem Gegengewicht zwischen Shh
und lateralen BMPs. Shh induziert die Bildung des medialen Sklerotoms und die Expression
seines Markergens Pax1, während laterale BMPs die Pax1-Expression unterdrücken
(McMahon et al., 1998). Um die Pax1–Expression im medialen Sklerotom aufrechtzuerhalten,
32
Diskussion
wird die latero-mediale Diffusion der lateral gebildeten BMPs durch ihre Antagonisten
Noggin, Chordin und Follistatin, die aus dem Chorda-Boden-Komplex freigesetzt werden,
unterbunden. Für die Aufrechterhaltung des lateralen Sklerotoms wird die medio-laterale
Diffusion von Shh durch seinen Antagonist Gli3 im lateralen Sklerotom verhindert (Buttitta et
al., 2003). Durch diese antagonistischen Wirkungen wird ein Gegengewicht zwischen Shh
und lateralen BMPs ausgebildet, wodurch die Territorien des medialen und lateralen
Sklerotoms festgelegt werden.
Wir haben deutliche Hinweise darauf, dass sich die Expressionsdomäne von Pax1 im
medialen Sklerotom nach Unterbindung von lateralen BMPs durch Noggin nicht nach lateral
ausdehnt (eigene unveröffentlichte Befunde). In dieser Untersuchung wurde auch gezeigt,
dass das Territorium des lateralen Sklerotoms ohne axiale Signale nicht nach medial erweitert
wird. Dies lässt vermuten, dass bei der medio-lateralen Musterbildung des Sklerotoms neben
den antagonistischen Mechanismen auch der Proteingradient von Shh und lateralen BMPs
eine Rolle spielt. Zur Überprüfung dieser Vermutung wurden in unseren Vorarbeiten mit Shh
getränkte Kügelchen in die Somiten implantiert. Durch das zusätzliche Shh wird die
Pax1-Expression stark hochreguliert. Darüber hinaus wird die Expressionsdomäne von Pax1
nach lateral ausgedehnt. Das weis darauf hin, dass der Proteingradient von Shh und lateralen
BMPs bei der medio-lateralen Musterbildung des Sklerotoms von Bedeutung ist.
4.2.
Signale
aus
dem
Dermomyotom
und
dem
Myotom
sind
für
die
Rippenentwicklung erforderlich
Die Rippen sind wichtige Bestandteile der Thoraxwand. Zwei benachbarten Rippen sind
durch die Interkostalmuskeln verspannt. Beim Vogel sind sieben Rippenpaare vorhanden.
Abgesehen von den ersten zwei Paaren sind die übrigen fünf vorn mit dem Sternum
verbunden. Die Entwicklung der Rippen erfolgt durch ein Einwachsen ihrer Vorläuferzellen in
die Somatopleura. Dies wurde zuerst durch Implantation einer Tantalfolie zwischen den
Thoraxsomiten und der Somatopleura nachgewiesen. Nach der Implantation wurde der
Eingang der Somatopleura für die Rippenvorläuferzellen blockiert und es entwickelten sich
33
keine distalen Rippen (Sweeney und Watterson 1969).
Diskussion
Später wurde mittels der
Huhn-Wachtel-Chimärisierung gezeigt, dass die distalen Rippen bis zum Sternum Derivate
der Somiten sind (Christ et al., 1974). Die Rippenvorläuferzellen können mit dem Markergen
cMfh1 markiert werden (Sudo et al., 2001). Die cMfh1-exprimierenden Rippenvorläuferzellen
dringen in die Somatopleura ein und entwickeln sich zu distalen Rippen. Für diesen Prozess
wird die Induktion lateraler BMPs benötigt. Nach der Blockierung lateraler BMPs durch
Noggin wird cMfh1 herunterreguliert und werden distale Rippen nicht angelegt.
Die
Interkostalmuskeln
sind
ein
dermomyotomales
Derivat.
Nach
der
Somitenkompartimentierung fängt das Dermomyotom an, das Myotom zu bilden. Die mediale
und laterale Dermomyotomlippen liefern Zellen für das epaxiale und hypaxiale Myotom.
Zellen aus der kranialen und kaudalen Dermomyotomkante tragen zu den beiden Abschnitten
des Myotoms bei (Gros et al., 2004). Das Myotom, das die myogenen Determinationsfaktoren
MyoD, Myf5 und Myogenin exprimiert, ist die Quelle für die Skelettmuskeln der Wirbelsäule
und der Brust- und Bauchwand (Übersicht von Brand-Saberi 2005). Während der
Myotombildung fängt der zentrale Dermomyotomabschnitt an, durch epithelio-mesenchymale
Transition auszuwandern und das subektodermale Mesenchym zu bilden (Sengel und Mauger
1976). Als Folge bleiben nur die medialen und lateralen Dermomyotomknospen als
Proliferationszentren über lange Zeit erhalten. Die lateralen Dermomyotomlippen der
Thoraxsomiten wachsen in die Somatopleura ein, und bilden ein hypaxiales Myotom, aus dem
sich die Interkostalmuskeln entwickeln. Pax3 markiert diese lateralen Dermomyotomlippen
(Goulding et al., 1994). Das Einwachsen der lateralen Dermomyotomlippen in die
Somatopleura wird von lateralen BMPs gesteuert (Sudo et al., 2001). In Abwesenheit lateraler
BMPs wird Pax3 in der lateralen Dermomyotomlippe herunterreguliert.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Entwicklung sowohl der distalen Rippen als auch
der Interkostalenmuskeln unter dem Einfluss lateraler BMPs ablaufen. Es stellt sich die Frage,
ob BMP-Signale direkt auf die Rippenvorläuferzellen oder indirekt über die Dermomyotome
wirken. Während der Thoraxwandentwicklung haben die Rippenvorläuferzellen eine sehr
enge Lagebeziehung mit den lateralen Dermomyotomlippen. Dabei spielt das Dermomyotom
34
Diskussion
eine essenzielle Rolle für die Rippenbildung. Nach der Entfernung des Dermomyotoms der
Thoraxsomiten
ist
zu sehen,
dass
sowohl
die dermomyotomalen
Derivate,
die
Interkostalmuskeln, als auch die distalen Rippen nicht gebildet werden (Kato und Aoyama
1998). Das Oberflächenektoderm beeinflusst die Entwicklung des Dermomyotoms (Dietrich
et al., 1997; Sosic et al., 1997). Die Entfernung des Oberflächenektoderms führt auch zur
Fehlbildung der distalen Rippen (Huang et al., 2000a). Pax3 ist ein wichtiger
Transkriptionsfaktor
für
das
Dermomyotom
(Goulding
et
al.,
1994).
In
Pax3-knock-out-Mäusen ist eine Fusion und Malformation der distalen Rippen zu beobachten
(Henderson et al., 1999; Dickman et al., 1999). Diese sind Hinweise dafür, dass Signale aus
den lateralen Dermomyotomlippen für die Entwicklung der Rippenvorläuferzellen
erforderlich sind.
Im Vergleich zum medialen Sklerotom besteht das laterale Sklerotom nur aus einer kleinen
Zellpopulation, die aber für das Längenwachstum der Rippen verantwortlich sind. Daher
müsste eine ständige Zellproliferation im lateralen Sklerotom aufrechterhalten werden.
Zwischen Sklerotom und Dermomyotom entwickelt sich das Myotom, in dem Fibroblasten
Wachstumsfaktoren ( Fibroblast Growth Factors, FGFs) freigesetzt werden (Floss et al., 1997;
Stolte et al., 2002). In den Myf5-knock-out-Mäusen ist eine Fehlbildung der Rippen zu
beobachten (Braun et al., 1992). Dies ist auf das Ausbleiben des Myotoms und damit auch der
myotomalen FGF-Sekretion zurückzuführen, die gemeinsam mit TGFß-2 die Entwicklung
von Knorpel in Zellkultur induzieren (Grass et al., 1996). Zusätzliches FGF8 in den
Thoraxsomiten verstärkt die Zellproliferation im Sklerotom (Huang et al., 2003). Daraus
resultiert eine verdickte Rippe. Demgegenüber entwickeln sich nach der Blockierung von
FGF8 durch seinen Inhibitor SU 5402 keine distalen Rippen. Daraus kann geschlossen
werden, dass FGF-Signale aus dem Myotom für die Rippenentwicklung unerlässlich sind.
Dabei induzieren FGFs nicht nur die Chondrogenese sondern stimulieren auch die
Zellproliferation der Sklerotomzellen.
Aus den bisherigen Befunden möchte ich ein Modell für die Thoraxwandentwicklung
vorschlagen. Die lateralen Abschnitte des Sklerotoms und des Dermomyotoms erwerben
35
Diskussion
durch den Einfluss lateraler BMPs eine laterale Identität. Durch weitere Induktion dieser
Signale wachsen die Rippenvorläuferzellen des lateralen Sklerotoms gemeinsam mit den
Dermomyotomlippen in die Somatopleura ein, wo sie die Rippen und die Interkostalmuskeln
bilden. Dabei empfangen die Rippenvorläuferzellen FGFs aus dem Myotom, wodurch die
eine andauernde Proliferation dieser Zellen für das Langenwachstum der Rippen
aufrechterhalten wird.
4.3.
Intrinsische und extrinsische Faktoren steuern gemeinsam die Entwicklung der
Scapula-Klinge
In diesem Abschnitt wird diskutiert, wie die Vorläuferzellen der Scapula-Klinge spezifiziert
werden. Zwei Mechanismen können in Betracht gezogen werden:
(1) Das Zellschicksal der Vorläuferzellen wird bereits früh in den Somiten festgelegt
(intrinsische Determination) oder
(2) Die Spezifizierung der Vorläuferzellen erfolgt unter Einfluss umliegender Signale
(extrinsische Determination).
Das Mechanismus der intrinsischen Determination von Vorläuferzellen wurde zuerst bei der
Entwicklung der Wirbelsäule und der Rippen, die Derivate des Sklerotoms darstellen,
beobachtet (Christ et al., 2004). Nach heterotoper Transplantation der prospektiven
Thoraxsomiten in die zervikale Region wurde die Bildung zusätzlicher Rippen in der
zervikalen Region beobachtet. Die Wirbel, die aus dem Transplantat hervorgegangenen waren,
wiesen die für das thorakale Segment charakteristische Größe und Form (Identität der
Thoraxsegment) auf. Nach Transplantation zervikaler Somiten in die thorakale Region
werden weder Rippe noch Scapula angelegt (Kieny et al., 1972). Nach Transplantation
thorakaler Somiten in das Zölom entwickeln sich aus dem Transplantat Rippen im Zölom
(Jacob et al., 1975b). Das deutet darauf hin, dass die Somiten bereits hinsichtlich ihrer
Segmentidentität während ihrer Bildung festgelegt werden.
Dass die Fähigkeit der Somiten im zervikothorakalen Übergangsbereich, die Scapula-Klinge
36
Diskussion
zu bilden, bereits während der Somitenbildung intrinsisch festgelegt wird, wurde in einer
früheren Arbeit gezeigt (Ehehalt et al., 2004). Nach heterotoper Transplantation der
Segmentplatte bzw. des Somiten aus der Scapula-bildenden Region in die zervikale Region
konnte eine Scapula-ähnliche Knorpelstruktur unter dem Ektoderm beobachtet werden. Wenn
die oberen zervikalen Somiten in das Scapula-bildenden Feld transplantiert werden,
entwickelt sich dort keine Scapula.
Es ist bekannt, dass Hox-Gene diese Segmentidentität der Wirbelsäle festlegen. Bei der Maus
ist beispielsweise der Atlas durch die Expression von HoxA-1, HoxA-3 und HoxB-1
charakterisiert (Kessel und Gruss 1991). Eine Veränderung dieser Expression hat eine
Verschiebung der Regionengrenze zur Folge. In der Maus mit mutierten von HoxB5-Gen,
dessen anteriore Expressionsgrenze in Höhe der kranialen Scapula-bildenden Somiten liegt
(Burke et al., 1995), verschiebt sich der Schultergürtel in anteriorer Richtung (Rancourt et al.,
1995). Nach Herunterregulation von HoxC6 sind Defekte im Bereich des kranialen Abschnitts
der Scapula zu sehen (Oliver et al., 1989). Die Mutation von HoxA5 führt in Kombination mit
der Pax1-Mutation zur Fehlbildung des Acromions (Aubin et al., 2002). Das deutet darauf hin,
dass das Zellschicksal der Scapulavorläuferzellen im Somiten durch Hox-Gene festgelegt
wird.
In dieser Untersuchung wurde durch homotope Transplantation von dorsomedialem und
dorsolateralem Somitenabschnitt nachgewiesen, dass die Scapula-Klinge ein Derivat des
hypaxialen Dermomyotomabschnitts ist. Nach einer kurzen Reinkubationszeit befanden sich
die Wachtelzellen aus dem dorsolateralen Quadranten in der lateralen Dermomyotomlippe
und im lateralen Abschnitt des subektodermalen Mesenchyms, das dem Dermomyotom
entstammt. Das deutet darauf hin, dass sich der transplantierte Somitenquadrant tatsächlich
zum hypaxialen Dermomyotom bzw. seinen Derivaten entwickelt. Da sich die Vorläuferzellen
der Scapula-Klinge, die durch eine Pax1-Expression charakterisiert sind, im lateralen
Abschnitt des subektodermalen Mesenchyms befinden (Huang et al., 2000b), kann
geschlossen werden, dass die Vorläuferzellen der Scapula-Klinge im hypaxialen
Dermomyotomabschnitt
lokalisiert
sind.
Diese
Zellen
migrieren
nach
einer
37
Diskussion
epithelio-mesenchymalen Transition in den subektodermalen Raum, wo sie sich zur
Scapula-Klinge differenzieren.
In einer frühen Arbeit aus unserer Arbeitsgruppe wurden Segmentplattenabschnitte und
epitheliale Somiten aus der prospektiven Thoraxregion um 180° um die Längsachse rotiert
und in die Halsregion implantiert. Danach konnte beobachtet werden, dass ektopische
Bildungen von Rippen- und Scapulaabschnitten in der Halsregion stattfanden. Des Weiteren
wurden die ursprünglich ventralen Somitenhälften der prospektiven Thoraxregion in die
Position der dorsalen Somitenhälften der prospektiven Halsregion implantiert. Diese
ursprünglich ventralen Somitenhälfte, die dorsal zu liegen kamen, wurden durch Signale aus
den umgebenden Strukturen zu Dermomyotomen umgestimmt (Aoyama und Asamoto 1988;
Christ et al., 1992). Aus diesen Dermomyotomen entwickelte sich ein ektopischer
Scapula-Körperabschnitt. Das deutet darauf hin, dass nicht eine bestimmte Zellpopulation des
hypaxialen Dermomyotoms sondern alle Zellen des epithelialen Somiten aus der
Thoraxregion in der Lage sind, Knorpelzellen für die Scapula-Klinge zu bilden. In einer noch
nicht abgeschlossenen Untersuchung haben sich Hinweise ergeben, dass erst nach der
epithelio-mesenchymalen Transition des Dermomyotoms die Verläuferzellen für die
Scapula-Klinge spezifiziert werden. Die Spezifizierung der Scapula-bildenden Zellen im
hypaxialen Dermomyotom kann nur durch den Einfluss extrinscher Signale erfolgen.
Die an die Scapula-bildenden Zellen angrenzenden Strukturen sind das Oberflächenektoderm
und die Somatopleura. Es wird gezeigt, dass Signale aus dem Oberflächenektoderm für die
Entwicklung der Scapula-Klinge von Bedeutung sind (Pröls et al., 2004; Ehehalt et al., 2004).
Dabei hängt die Funktion des Ektoderms für die Scapulabildung vom Entwicklungsstadium
ab (Ehehalt et al., 2004). Entfernung des Ektoderms über den neu gebildeten epithelialen
Somiten führt zur Fehlbildung aller Derivate des hypaxialen Dermomyotoms, der
Scapula-Klinge, der Schultergürtelmuskulatur und der Interkostalmuskulatur. Wenn das
Oberflächenektoderm über den kompartimentierten Somiten entfernt wurde, wurden nur die
Scapula-Klinge und die an ihr befestigten Muskeln nicht gebildet. Die Interkostalmuskeln
waren dagegen normal angelegt. Wnt-Signale und ihre Antagonisten sind die bisher
38
Diskussion
bekannten ektodermalen Faktoren (Übersicht von Roelink 1996; Baranski et al., 2000;
Cauthen et al., 2001). Eine Applikation von Wnt-Protein führt zu einer Überexpression von
Pax3 im Dermomyotom und einer Aufrechterhaltung der epithelialen Struktur des
Dermomyotoms (Schmidt et al., 2004). Bei der Überexpression von Wnt6 wird die Expression
von Pax1 in der Scapulaanlage nicht angeschaltet, und die Scapula-Klinge ist fehlgebildet
(Möller et al., 2003). Dies deutet darauf hin, dass die epithelio-mesenchymale Transition der
Scapula-bildenden
dermomyotomalen
Zellen
essentiell
für
die
Entwicklung
der
Scapula-Klinge ist.
BMPs
aus
der
Somatopleura,
die
für
die
Entwicklung
des
hypaxialen
Dermomyotomabschnitts erforderlich sind (Pourquié et al., 1996), müssen auch einen
Einfluss auf die Scapulaentwicklung ausüben, weil die Scapula-Klinge ein Derivat des
hypaxialen Dermomyotomabschnitts ist. Die Wirkung der BMPs wurde durch Injektion von
Noggin-Protein-sezernierenden Zellen in die Scapulaanlage vor bzw. während der
Spezifizierung der Scapula-bildenden Zellen blockiert. Nach der Blockierung von BMPs
wurde die Scapula-spezifische Pax1-Expression in der Scapulaanlage nicht angeschaltet, und
die Scapula-Klinge war im Operationsbereich fehlgebildet. Daraus kann geschlossen werden,
dass BMPs aus der Somatopleura die Entwicklung der Scapula-Klinge steuern. Das ist ein
interessantes Paradoxon: BMPs sind für die Pax1-Expression in der Scapulaanlage
erforderlich,
während
dieselben
BMP-Signale
Pax1
im
Sklerotom
während
der
Somitenkompartimentierung unterdrücken (McMahon et al., 1998). Die Gründe dafür sind
noch nicht bekannt und müssen weitere Untersuchungen vorbehalten bleiben.
Wir fanden nach der Injektion von Noggin-sezernierenden Zellen keine Fehlbildung der
Interkostalmuskulatur, die aus dem hypaxialen Dermomyotomabschnitt hervorgeht, obwohl
laterale BMPs für diesen Abschnitt erforderlich sind (Pourquié et al., 1996). Dies liegt
wahrscheinlich an den unterschiedlichen Entwicklungsphasen der beiden Zelllinien. Die
Markergene der hypaxialen Muskeln, MyoD und Myf5, werden im Scapula-bildenden Bereich
erst im 4-tägigen Embryo exprimiert (Dietrich et al., 1998; Teillet et al., 1998), während das
Scapula-spezifische Pax1 erst im 5-tägigen Embryo exprimiert wird (Healy et al., 1999;
39
Diskussion
Huang et al., 2000b). Man kann davon ausgehen, dass die Vorläuferzellen der
Interkostalmuskulatur
bereits
durch
laterale
BMPs
determiniert
waren,
als
die
Noggin-Protein-sezernierenden Zellen in der Scapulaanlage injiziert wurden.
Das Modell für die Entwicklung der Scapula-Klinge könnte folgendermaßen aussehen. Zuerst
erwerben die Scapula-bildenden Somiten bei ihrer Bildung die regionale Kompetenz, die
Scapula-Klinge zu bilden. Nach der Somitenreifung gelangen Zellen des Dermomyotoms
durch Zellmigration in den subektodermalen Raum. Nach der Migration beginnt eine
Zellpopulation, die im lateralen Abschnitt des subektodermalen Mesenchyms liegt, unter dem
Einfluss von Signalen aus dem Oberflächenektoderm und BMPs aus der Somatopleura, das
Scapula-spezifische Pax1-Gen zu exprimieren. Dies führt schließlich zur Differenzierung
dieser Zellpopulation zu den Knorpelzellen der Scapula-Klinge.
40
5.
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Somiten, die metamere Strukturen der embryonalen Körperwand darstellen, bestehen aus
einem Ball epithelialer Zellen, die die mesenchymalen Somitozölzellen umschließen. Sie
liegen unter dem Oberflächenektoderm und zwischen den axialen Organen, der Chorda
dorsalis und dem Neuralrohr, und dem lateralen Mesoderm. Unter Einfluss dieser
umliegenden Strukturen werden die epithelialen Somiten kompartimentiert. Dabei bildet der
ventrale Somitenabschnitt durch eine epithelio-mesenchymale Transition das Sklerotom,
während der dorsale Somitenabschnitt durch ektodermale Signale epithelial bleibt und das
Dermomyotom bildet. Das Sklerotom liefert die Vorläuferzellen der Wirbelsäule und der
Rippen, und das Dermomyotom ist die Quelle der Skelettmuskulatur, der Dermis des Rückens,
von Bindegewebe, Endothel und Knorpel.
In dieser Untersuchung stellte sich die Frage, ob neben dem durch axiales Shh induzierten
medialen Sklerotom noch ein laterales Sklerotom existiert, und wie es induziert wird. Zur
Klärung dieser Frage wurde die Sklerotombildung mittels Barriere-Implantation bzw.
Applikation von BMP-Protein und In situ-Hybridisierung untersucht. Unsere Experimente
ergaben, dass das Sklerotom aus einem medialen und einem lateralen Abschnitt besteht und
das laterale Sklerotom durch BMPs aus dem lateralen Mesoderm induziert wird.
Es stellte sich in dieser Untersuchung weiterhin die Frage, ob sich die Scapulavorläuferzellen
im hypaxialen Dermomyotomabschnitt befinden, und ob laterale BMPs ihre Entwicklung
kontrollieren. Durch Wachtel-Hühnchen-Chimäre wurden die Scapulavorläuferzellen im
hypaxialen Dermomyotom identifiziert. Die Vorläuferzellen können nach Unterbindung der
BMP-Funktion das Pax1-Gen nicht exprimieren und die Scapula-Klinge nicht bilden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass laterale BMPs räumlich und zeitlich ihre
unterschiedlichen Funktionen bei der Somitenentwicklung ausüben. In der Frühentwicklung
spezifizieren sie die laterale Identität des lateralen Sklerotoms und Dermomyotoms. In diesen
zwei Domänen induzieren sie das Längenwachstum der distalen Rippen und die Entwicklung
der Interkostalmuskeln. In einer Spätentwicklungsphase spezifizieren sie eine Zellpopulation
aus dem hypaxialen Dermomyotom zu Chondroblasten, die die Scapula-Klinge bilden.
41
6.
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48
7.
Abbildungen
Abbildungen
Abbildung 1:
Die Unterbrechung lateraler Signalwege führt zu einer Aufrechterhaltung von Paraxis und
einer Herunterregulation von cMfh1 im ventrolateralen Somitenabschnitt.
(A) Operationsschema: Implantation einer Aluminiumfolien-Barriere zwischen den neu
gebildeten Somiten und dem intermediären Mesoderm. Grün gefärbt ist das Gewebe, das die
lateralen Signale freisetzt.
(B) In situ-Hybridisierung mit Paraxis nach der Operation und 1-tägiger Reinkubation. Die
roten Pfeile markieren die Paraxis-Expression im ventrolateralen Somitenabschnitt auf der
Operationsseite (rechts) in Abwesenheit lateraler Signale. Die rote Pfeilspitze zeigt eine
normale Herunterregulation von Paraxis auf der Kontrollseite (links).
(C) In situ-Hybridisierung mit cMfh1 nach der Operation und 1-tägiger Reinkubation. Der
rote Pfeil markiert die Herunterregulation von cMfh1 im ventrolateralen Somitenabschnitt auf
der Operationsseite in Abwesenheit lateraler Signale.
Die rote Linie zeigt die Position, in der die Barriere implantiert worden war.
Ch: Chorda dorsalis, DM: Dermomyotom, SPM: Seitenplattenmesoderm, NR: Neuralrohr, S:
Somit, Skl: Sklerotom
49
Abb. 1
Abbildungen
50
Abbildungen
Abbildung 2:
Die Unterbrechung axialer Signalwege führt zu einer Aufrechterhaltung von Paraxis und
einer Herunterregulation von cMfh1 im ventromedialen Somitenabschnitt.
(A) Operationsschema: Implantation einer Aluminiumfolien-Barriere zwischen den neu
gebildeten Somiten und dem Chorda-Bodenplatten-Komplex. Gelb gefärbt ist der
Chorda-Bodenplatten-Komplex, aus dem die axialen Signale hervorgehen.
(B) In situ-Hybridisierung mit Paraxis nach der Operation und 1-tägiger Reinkubation. Der
rote Pfeil markiert die Paraxis-Expression im ventromedialen Somitenabschnitt auf der
Operationsseite (rechts) in Abwesenheit axialer Signale.
(C) In situ-Hybridisierung mit cMfh1 nach der Operation und 1-tägiger Reinkubation. Der
rote Pfeil markiert eine Herunterregulation von cMfh1 im ventromedialen Somitenabschnitt
auf der Operationsseite. Die rote Pfeilspitze zeigt eine cMfh1-positive Zellpopulation im
ventrolateralen Somitenabschnitt, die die Sklerotomzellen darstellt.
Die roten untergebrochenen Linien markieren die beiden Neuralrohrhälften.
Ch: Chorda dorsalis, DM: Dermomyotom, SPM: Seitenplattenmesoderm, NR: Neuralrohr, S:
Somit, Skl: Sklerotom
51
Abb. 2
Abbildungen
52
Abbildungen
Abbildung 3:
Die Unterbrechung axialer und lateraler Signalwege führt zu einer Aufrechterhaltung von
Paraxis im gesamten ventralen Somitenabschnitt.
(A) Operationsschema: Implantation zweier Aluminiumfolien-Barrieren zwischen den neu
gebildeten Somiten und dem Chorda-Bodenplatten-Komplex sowie dem intermediären
Mesoderm. Gelb und grün gefärbt sind die Quellen axialer und lateraler Signale.
(B) In situ-Hybridisierung mit Paraxis nach der Operation und 1-tägiger Reinkubation. Auf
der Operationsseite (rechts) wird Paraxis im gesamten Somiten exprimiert, während im
Sklerotom auf der Kontrollseite (links) eine Herunterregulation zu erkennen ist.
Die roten unterbrochenen Linien markieren die beiden Neuralrohrhälften. Die zwei roten
Linien zeigen die Position, in der die Barrieren implantiert worden waren.
Ch: Chorda dorsalis, DM: Dermomyotom, SPM: Seitenplattenmesoderm, NR: Neuralrohr, S:
Somit, Skl: Sklerotom
Abb. 3
53
Abbildungen
Abbildung 4:
Applikation von BMP4-Signalprotein in den neu gebildeten Somiten reguliert die
Paraxis-Expression herunter.
In situ-Hybridisierung mit Paraxis nach der Operation und 1-tägiger Reinkubation. Paraxis
wurde auf der Kontrollseite im gesamten Dermomyotom stark exprimiert, und im ventralen
Abschnitt herunterreguliert. Auf der Operationsseite wurde Paraxis im ventralen
Somitenabschnitt nicht exprimiert. Im dorsalen Somitenabschnitt waren die Zellen, die nahe
am Kügelchen lagen, Paraxis negativ. Der rote Pfeil zeigt das implantierte Kügelchen.
Ch: Chorda dorsalis, DM: Dermomyotom, NR: Neuralrohr, Skl: Sklerotom
Abb. 4
54
Abbildungen
Abbildung 5:
Homotope Wachtel-Huhn-Chimärisierungen des dorsolateralen Somitenabschnitts
(A) Operationsschema: Der dorsolaterale Somitenabschnitt vom Huhn wurde durch den
dorsolateralen Somitenabschnitt von der Wachtel ersetzt. Blau gefärbt ist das Transplantat.
(B) Nach einer kurzen Reinkubationszeit befanden sich die Wachtelzellen mit blauen
Zellkernen in der lateralen Dermomyotomlippe und im lateralen Abschnitt des
subektodermalen Mesenchyms, das dem Dermomyotom entstammt. Die Pfeilspitzen
markieren die Wachtelzellen im subektodermalen Mesenchym.
(C) Übersicht des Querschnitts einer Chimäre nach 6-tägiger Reinkubation.
(D) Vergrößerung der Region, die durch das Rechteck in (C) markiert wird. Der rote Stern
markiert die Scapula. Die Knorpelzellen und die der Scapula zugehörigen Muskeln bestehen
aus Wachtelzellen.
Ch: Chorda dorsalis, d: Dermomyotom, m: Myotom, NR: Neuralrohr, R: Rückenmark S:
Somit, W: Wirbelkörper
Abb. 5
55
Abbildungen
Abbildung 6:
Die
Unterbrechung
der
lateralen
BMP-Signalwege
durch
Injektion
Noggin-Protein-sezernierender Zellen hat die Scapula-spezifische Pax1-Expression und die
Bildung der Scapula-Klinge beeinträchtigt.
(A) Operationsschema: Noggin-Protein-sezernierende Zellen (roter Kreis) wurden im
lateralen Abschnitt des subektodermalen Mesenchyms 4-tägiger Hühnerembryonen injiziert.
(B) und (C) Pax1-Expression nach der Zellinjektion im Bereich der Scapula-bildenden
Somiten 16-19 und 2-tägiger Reinkubation.
(B) Die weißen Pfeile markieren eine normale Pax1-Expression in der Scapulaanlage auf der
Kontrollseite.
(C) Die weißen Pfeile markieren auf der Operationsseite die Höhe von Somiten 16-19, wo die
Scapula-spezifische Pax1-Expression abwesend ist. Das rote Zeichen S19 zeigt den 19te
Somiten. Die restliche Pax1-Expression auf der Operationsseite ist im Vergleich mit der auf
der Kontrollseite (B) schwächer.
(D)-(F) Pax1-Expression nach der Zellinjektion in Höhe von Somiten 19-23 und 1,5-tägiger
Reinkubation.
(D) Pax1-Expression erweitet sich in diesem Entwicklungsstadium auf der Kontrollseite bis
in Höhe von Somiten 20 (S20). Die zwei weißen Pfeile markieren die Expressionsmuster von
Pax1.
(E) Pax1-Expression erweitet in diesem Entwicklungsstadium auf der Operationsseite nur bis
in Höhe von Somiten 18/19 (S19). Die zwei weißen Pfeile markieren die Expressionsmuster
von Pax1.
(F) Transversale Schnitte des Embryos in
(D) und (E) in Höhe von Somiten 19. Die
Pax1-Expression blieb in der Scapulaanlage auf der Operationsseite (rechts) aus.
(G)-(K) Analyse des Skelettmusters und weitere immunhistochemische Untersuchungen nach
56
Abbildungen
der Zellinjektion in Höhe von Somiten 16-19 und 4-tägiger Reinkubation.
(G) Auf der Kontrollseite (links) markieren zwei weiße Pfeile die normale Scapula-Klinge.
Auf der Operationsseite (rechts) zeigt sich eine Fehlbildung des kranialen Scapulaabschnitts
(zwischen weißen Pfeilen).
(H) und (I) Analyse des Skelettmusters nach der Zellinjektion in Höhe von Somiten 19-23.
Zwei weiße Pfeile markieren die normale Scapula-Klinge auf der Kontrollseite (H). Auf der
Operationsseite (I) wurde nur der kraniale Teil der Scapula-Klinge gebildet.
(J) und (K) Transversale Schnitte des Embryos in (G) in Höhe von Somiten 20. Auf der
Kontrollseite (J) wurden die Scapula-Klinge sowie epaxiale und hypaxiale Muskeln normal
gebildet. Auf der Operationsseite wurden die Scapula-Klinge und ihre zugehörigen Muskeln
nicht angelegt, während sich die anderen epaxialen und hypaxialen Muskeln eine normale
Entwicklung zeigten.
Ch: Chorda dorsalis, ep: epaxiale Muskeln, h: Oberarmknochen, lat: M. latissimus dorsi, M:
Myotom, NR: Neuralrohr, R: Rippe, RM: Rückenmark, S: Scapula, sem: subektodermales
Mesenchym, ser: M. serratus, Skl: Sklerotom, W: Wirbelkörper
57
Abb. 6
Abbildungen
58
8.
Lebenslauf
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Baigang Wang
Geburtsdatum
13. November 1974
Geburtsort
Liaoning, VR China
Staatsangehörigkeit
chinesisch
Eltern:
Shiyou Wang (Architekt)
Ailing Guo (Buchhalterin)
Schulbildung
Sep. 1981-Jul. 1987
Shiyan Grundschule, Pulandian
Sep. 1987-Jul. 1990
Mittelstufe in der Mittelschule Nr. 11, Pulandian
Sep. 1990-Jul. 1993
Oberstufe in der Mittelschule Nr. 2, Pulandian
Studium
Sep. 1993-Jul. 1998
Studium der Humanmedizin an der China Medical University,
Shenyang, VR China (mit Staatsexam in Jul. 1998 abgeschlossen).
Erwerbstätigkeit
Jul. 1998-Mär. 2002
Dozent an der China Medical University, Shenyang, VR China
Weiterbildung
Mär. 2002-Jan. 2003
Deutschkurs am Sprachenkolleg, Freiburg
Jan. 2003-Okt. 2004
wissenschaftliche Mitarbeit in der Abteilung für Molekulare
Embryologie, Institut für Anatomie und Zellbiologie, Universität
Freiburg
Okt. 2004-Aug. 2007
Promotion bei Prof. Dr. Huang in der Abteilung für Molekulare
Embryologie, Institut für Anatomie und Zellbiologie, Universität
Freiburg
Okt. 2005-Sep. 2007
Stipendiat der Promotionsstiftung der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg
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9.
Eigene Publikationen und Posterpräsentationen
Eigene Publikationen und Posterpräsentationen
Publikationen aus diesem Projekt:
Ehehalt, F., Wang, B., Christ, B., Patel, K. und Huang, R. (2004). Intrinsic cartilage-forming
potential of dermomyotomal cells requires ectodermal signals for the development of the
scapula blade. Anat Embryol (Berl) 208, 431-7.
Wang, B., He, L., Ehehalt, F., Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Christ, B., Scaal, M.
und Huang, R. (2005). The formation of the avian scapula blade takes place in the hypaxial
domain of the somites and requires somatopleure-derived BMP signals. Dev Biol 287, 11-8.
Dieuguie Fomenou, M., Wang, B., Christ, B., Huang, R. und Pröls, F. Hox Expression
Spreads in the Somite Compartments Along the Dorso-Ventral and Latero-Medial Axes. (in
Vorbereitung)
Poster aus diesem Projekt:
Wang, B., Nimmagadda, S., Geetha-Loganathan, P., He, L., Huang, R. und Christ, B. Rib
development depends on BMP signaling. Poster in der 99. Versammlung der Anatomischen
Gesellschaft 2.-5. April 2004, Wien.
Huang, R., Wang, B., Ehehalt, F., Pröls, F. und Christ, B. Signalmechanismen während der
Scapulaentwicklung. Poster in der Arbeitstagung der Anatomischen Gesellschaft in Würzburg
im Jahre 2004.
Wang, B., Christ, B. und Huang, R. Scapula forming cells are located in the hypaxial domain
of the avian somite. Poster in der 101. Versammlung der Anatomischen Gesellschaft 7.-10.
April 2006, Freiburg.
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Eigene Publikationen und Posterpräsentationen
Wang, B., Christ, B., Pröls, F. und Huang, R. Lateral plate mesoderm regulates Hox gene
expression and rib development. Poster im 2nd International Symposium of SFB 592
Signaling Mechanisms in Embryogenesis and Organogenesis and GRK 1104 From Cells to
Organs: Molecular Mechanisms in Organogenesis October 5-7, 2006, Freiburg.
Wang, B., Pröls, F., Christ, B., Scaal, M. und Huang, R. Two mechanisms involved in
sclerotom formation. Poster im International Chick Meeting 11-14 April 2007, Barcelona.
De, D-R., Wang, B., Pröls, F., Christ, B., Scaal, M. und Huang, R. Specification of the scapula
precursors takes place after the epithelio-mesenchymal transition of the dermomyotome.
Poster in der Arbeitstagung der Anatomischen Gesellschaft in Würzburg im Jahre 2007.
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10.
Danksagung
Danksagung
Mein tiefster Dank gilt Herrn Prof. Dr. Huang für die Überlassung des Themas und die
Erstellung des Erstgutachtens zur vorliegenden Arbeit. Herr Prof. Dr. Huang ist ein
renomierter und ausgezeichneter Wissenschaftler im Fachgebiet molekularer Embryologie.
Mit seinen wissenschaftlichen Fachkenntnissen beriet und begleitete Herr Prof. Dr. Huang
mich geduldig durch meine Doktorarbeit, so dass ich unter seiner ständigen und umfassenden
Betreuung meine Doktorarbeit erfolgreich durchführen konnte.
Für die Übernahme des Zweitgutachtens bedanke ich mich zutiefst bei Herrn Prof. Dr. med.
Steffen Rosahl.
Ein weiterer herzlicher Dank gilt Herrn Prof. Dr. Christ. Sein beständiges Interesse am
Fortgang der Arbeit und seine begleitenden Anregungen haben grundlegend das
Zustandekommen der Arbeit gefördert und seine Beratungen waren mir bei der Durchführung
der Arbeit hilfreich.
Frau Prof. Dr. Pröls und Herrn PD. Dr. Scaal danke ich herzlich für ihre wertvollen Beratungen
und ihre freundlichen Unterstützungen.
Auf die hervorragende technische Assistenz von Frau Baur, Herrn Frank, Frau Gimbel, Frau
Konradi, Frau Koschny und Frau Uhl baut ein wesentlicher Teil meiner methodischen
Ausbildung im Labor auf, wofür ich ihnen sehr dankbar bin.
Herr Wiegreffe und Frau Theis haben viele Ideen und Anregungen durch intensive und
umfassende Diskussionen für diese Arbeit beigesteuert. Für ihre Beratungen, sowie die
sprachliche Hilfe, bin ich zu tiefem Dank verpflichtet.
Für ihre Hilfsbereitschaft und das freundschaftliche Verhältnis im Labor bedanke ich mich bei
Daniel-Raja De, Stefanie Krück, Venugopal Rao Mittapalli und Wolfram Regen.
Ich danke der Promotionsstiftung der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. für die
Gewährung eines Promotionsstipendiums, das mir die Durchführung finanziell sehr erleichtert
hat.
Meiner Familie danke ich aus vollem Herzen. Ohne die menschliche und die finanzielle
Unterstützung durch meine Familie wäre diese Arbeit nicht auszuführen gewesen.
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11.
Erklärung
Erklärung
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne
Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus anderen Quellen
direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe der Quelle
gekennzeichnet. Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe von
Vermittlungs-bzw. Beratungsdiensten in Anspruch genommen. Niemand hat von mir
unmittelbar oder mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang
mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer
anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
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(Datum)
(Unterschrift)