Diss. ETH &+ - ETH E

Diss. ETH
&+&
Diss. ETH No. 9677
Embryonic Chick Brain Cells as
for
a
Potential Model
Developmental Toxicity:
An Immunocytochemical Study
A dissertation submitted to the
SWISS federal institute of TECHNOLOGY ZURICH
degree of
for the
Doctor of Natural Sciences
presented by
Gabriella G.
Wyle Gyurech
-
eidg. dipl. Apothekerin
born
April 3rd,
citizen of Zurich
accepted
on
(ZH)
the recommandation of
Prof. K.
Dr. Ch.
1963
Battig,
examiner
Reinhardt, co-examiner
Prof. T. Koller, co-examiner
1992
V
Summary
Optimal
culture conditions for
monolayer and aggregate
with
monolayers
adequate
To
cultures
had to be coated with
differentiation of
nerve
of fetal calf
and
collagen
chick brain cells in
among other
required,
adequate supplementation
an
growth
mechanically dissociated
polylysine
in order to enable
time to inhibit
same
vivo
conformity of our cell culture system,
differentiation of three
oligodendrocytes)
with
major
cell types of the CNS
we
studied
We found that
including the
cells in cultures showed
nerve
formation of
a
network in
cells. Some of the
cells in
glial
were
on
the other
arranged
Additionally,
into
occasional
hand,
layer
a
large
a
and their much
spans.
longer life
triggered
Our culture system
demonstrated that
cell types,
timing
an
early
patterns in monolayers
as
on
suspected teratogen,
glial fibrillary
could be found. In
found in aggregates. This
of differentiation. However,
well
our
system is
course
as
an
adequate model,
of differentiation
more
we
was
not
only of
(ontogeny).
species develop
in very similar
in aggregates. We conclude that cells from
have very similar
properties.
compounds. Cadmium
concentrations known to be toxic to humans.
humans. In
preferentially neurotoxic
chloride
differing
was
Phenytoin,
a
in concentrations which elicit CNS
therapeutic concentrations, phenytoin changed
of phenytoin. MPTP had
cultures: In
differentiated to
myelinisation
patterns of nerve cells. This mutagen effect may be
potentials
tyrosine hydroxylase
cell types, and the extent of their
cell culture with four model
generally cytotoxic in
in
periphery of the aggregates.
tissue from other
embryonic tissue of different species
toxicity in
onset
propose that
we
Furthermore, cultures based
our
differentiation,
due to the closed tissue-like system of aggregates
differentiation, but also of the
We tested
in vivo and in vitro.
number of astrocytes could be found; these
expression of these
differentiation. Thus,
and
system closely parallels in vivo development in the ratios of
our
of
no
myelinisation could be
probably
in vivo
monolayers
but
and
the arrangement into distinct
synapse-like knots
towards the
extensive differentiation is
of extensive
monolayers,
protein (GFAP) positive astrocytes,
aggregates,
signs
growth
We also examined the
immunocytochemical staining.
in aggregates and the formation of
positive
cells
excessive
(nerve cells, astrocytes,
monaminergic transmitter system with cell-type specific markers
acidic
an
an
of glial cells.
verify in
layers
culture medium
a
Cell culture dishes for
serum.
cells but at the
things,
a
reference to the
effects in
monolayer
the
growth
teratogenic
and aggregate
monolayers we found only generally cytotoxic effects, indicating that
no
VI
MPP+ had been synthesized. In aggregates,
effects
Ara-C
typical
was
toxic and
for
MPP+, indicating that
preferentially
teratogenic
toxic to
glial
and
cells in
quantitative measures
are
of
the other hand,
monolayers
toxicity
supprisingly good agreement with in vivo
is
a
we
found
no
of the
and should be used
toxicity; compounds which pass
aggregates,
to test for the
the
toxicity
resulting from biotransformation.
quick
in
our
our
cultures
screen
of overall short-term
then be tested with
teratogenicity of derivates
of
was
in vitro system
We submit that
monolayer screen should
or
We found that both
data. We propose that
as a
are
effects, which indicates
compounds
promising screen for developmental toxicity in humans.
can
found neurotoxic
in concentrations which
mostly post-mitotic.
in
monolayer cultures
we
MPTP had been biotransformed to MPP+.
in humans. In aggregates,
that cells in two-week-old aggregates
qualitative
on
compounds
VII
ZUSAMMENFASSUNG
Optimierung der Kulturbedingungen fur Flach-
Die
mechanisch dissoziierten Zellen
die
von
Ganzhirnen
Zugabe von foetalem Kalberserum
Kulturschalen mit
Entwicklung
Kollagen
und
zum
Aggregatkulturen
und
aus
embryonaler Hiihnchen ergab,
Kulturmedium und die
dass
Beschichtung
der
Polylysine unerlasslich waren fur eine gute
der Nervenzellen und fur eine
Unterdriickung von ubermassigem
Gliawachstum.
Ubereinstimmungen unserer Kulturem mit in vivo
Um
verfolgten wir die Entwicklung von
drei
Verhaltnissen
zu
iiberpriifen,
des ZNS, namlich der
Hauptzelltypen
Nervenzellen, der Astrocyten und der Ohgodendrocyten, und der Zellen des
monaminergen Transmitter-Systemes mittels zellspezifischer
vitro. Dabei
zeigte sich,
dass Nervenzellen in den Kulturen
Eigenschaften differenzierter
Zellen annahmen, wie
eines Netzwerkes in Flachkulturen, die
Schichten in
Anordnung
zum
Marker in vivo und in
weitgehende
Beispiel
die
Ausbildung
der Nervenzellen in deutlichen
Aggregaten oder die Bildung synapsenartiger Verdickungen
Tyrosinhydroxylase-positiven Zellen.
in
Gliazellen entwickelten sich vereinzelt
zu
(glial fibrillary acidic protein)-positiven Zellen mit der fur Typ-2 Astrocyten
GFAP
typischen Sternform
in Flachkulturen.
Myelinisierung nachgewiesen werden.
Anzahl
von
vereinzelt
Zellen
zu
Hingegen
In
konnte in Flachkulturen keine
Aggregatkulturen
GFAP-positiven Astrocyten und
nachgewiesen werden.
wegen deren dreidimensionalen,
Lebensdauer der Kulturen in
Zellen in
differenzierte eine grosse
auch
Myelinisierung
konnte
Aggregatkulturen konnten sich vermutlich
organotypischen Anordnung und
der viel
Aggregaten viel weitgehender entwickeln als
langeren
in
Flachkulturen.
Unser
Zellkultursystem
loste ein friiheres Einsetzen der
aus
als dies in vivo der Fall
des
proportionalen
war.
Hingegen
Differenzierung
fanden wir eine gute
Vorkommens der verschiedenen
gut mit den in vivo Ablaufen iiberein. Wir schliessen
vorliegende Zellkultursystem
nicht
nur
Ubereinstimmung
Zelltypen mit
Verhaltnissen. Weiter stimmte der Ablauf und der Grad der
aus
der Zellen
in vivo
Differenzierung
sehr
diesen Daten, dass das
ein gutes Model fur in vivo
Differenzierung
ist, sondern auch dass der Ablauf der Entwicklung (Ontogenese) der verschiedenen
Zelltypen
durch
unser
anderen Arbeiten
Kultursystem richtig wiedergegeben wird.
zeigte
eine
weitgehende Ubereinstimmung
Zellkulturen mit Zellkulturen
dass
embryonales
besitzt.
aus
Hirngewebe
anderer
der
Der
Entwicklung
Tierspezies.
Gewebe verschiedener Tierarten sehr ahnliche
Vergleich
Wir
mit
unsere
folgerten,
Eigenschaften
vin
Die Zellkulturen wurden darauf mit 4 Modellsubstanzen getestet: Cadmiumchlorid
hatte in
toxisch
unseren
Zellkulturen, in Konzentrationen, welche auch fur den Menschen
wirken, eine allgemein cytotoxische Wirkung. Phenytoin, ein potentielles
Teratogen, war in Konzentrationen, welche
Toxizitat fiihren, vorallem neurotoxisch. In
Phenytoin
einem
zu
beim Menschen vorallem
therapeutischen
abartigen Wachstum von Nervenzellen.
zu
ZNS-
Konzentrationen fiihrte
Diese mutagene
Wirkung von Phenytoin
auf Nervenzellen konnte ein Hinweis auf die teratogene
Wirkung von Phenytoin
sein. MPTP wirkte unterschiedlich in Flach- und
Aggregatkulturen:
In Flachkulturen fanden wir
MPTP vor, ein Hinweis
Wirkung von
lediglich
eine
allgemein
darauf, dass MPTP nicht
zum
toxische
neurotoxischen
MPP+ metabolisiert worden war. In Aggregatkulturen hingegen fanden wir eine
ausgepragte, fiir MPP+ typische Neurotoxizitat. Ara-C
war
in Falchkulturen in erster
Linie toxisch fur Gliazellen, in Konzentrationen welche fur den Menschen toxisch
und teratogen sind. In
Hinweis, dass
zur
Aggregaten hingegen war
Zeit der
Behandlung
keine
Wirkung feststellbar,
die Zellen schon
ein
grosstenteils postmitotisch
waren.
Qualitativ aber auch quantitativ
an unseren
deshalb in
waren
Zellkulturen in guter
unseren
Erfahrungen
Ergebnisse
Ubereinstimmung
Zellkulturen ein
Substanzen auf Toxizitat und
die
geeignetes
toxikologischen Priifungen
mit in vivo Daten. Wir
in vitro
Teratogenitat gefunden
mit den verschiedenen
der
System zur Pruning von
zu
haben.
Aufgrund
Zellkultursystemen schlagen wir vor,
Flachkulturen fur schnelle Kurzzeittests
zur
Ermittlung des
Wirkung von
Metaboliten
iiberpriift werden.
der
dass
toxischen Potentials einer
Substanz verwendet werden. In einem zweiten Schritt kann mittels
die toxische
glauben
Aggregatkulturen