trotzdem sind alle E. coli

Bakterien
Entdeckung der genetischen Transformation
Prokaryoten nehmen aus ihrer Umgebung
oft genetischen Material auf um ihren
Genom verändern zu können – Adaptation
zur veränderten Umgebung
Entdeckung des Gentransfers:
Frederick Griffith, 1928,
Streptococcus pneumoniae
DNA ist das genetische Material: Oswald
Avery (MacLeod und McCarty) 1944
Streptococcus
Riesige Bedeutung in der Medizin:
Verbreitung der Antibiotikaresistenz und
der Pathogenität
Allgemeine Genpool der Bakterien
E. coli Stämme können bis zu 30-40% Unterschiede in ihrem Genom haben –
trotzdem sind alle E. coli
Das menschliche Genom und das der Maus heben weniger als 30-40 %
Unterschiede.
In den Bakterien können in nur wenigen Generationen neue metabolischen
Wege erscheinen und Gene verlohren gehen
Im Genom von zwei, genetisch sehr unterschiedlichen Bakterien können bis zu
60-70 % homologe Gene anwesend sein!
Der Begriff „Species” ist im Fall von Bakterien sinnlos:
OTU = operational taxonomic unit, aufgrund 16S rRNA Gensequenzen
Vertikaler und horizontaler Gentransfer:
DNA aus der Umgebung
Gene die evolutionsmässig vorteilhaft sind verbreiten sich unter Mikroorganismen
„wertlose” Gene gehen schnell verloren
Die Tatsache, dass die natürliche Transformation in unter verschiedene Bedingungen
lebende Bakterien detektiert wurde (inkl. Archaea) lasst vermuten, dass die
Transformationsfähigkeit während der Evolution früh entstanden ist.
Tree of Life aufgrund 16S rRNA Gene
Sogar ausgestorbene Arten
passen in dieses System
Prokaryote Archea können
klar unterscheidet werden
Carl Woese
Prokaryot-Zellen bei 0, 37 und 130 °C
Gene die sich an die Umwelt anpassen
Das bakterielle Metagenom
Die Nummer von bakteriellen OTUs in dem menschlichen Körper wird ungefähr auf 40 000
geschätzt. Ein durchschnittliches Bakterium besitzt etwa 4-5 Tausend Gene (0.5 -10 000 )
• Man vermutet, dass sie über fast 200 Millionen Gene verfügen, 10 000-mal so viel wie
wir Menschen
• In der Wirklichkeit kodieren warscheinlich nur weniger als eine Millionen bakteriellen
Gene : sie haben viele
Homologen Gene
(Gene die eine positive
Selektion ausüben werden
in mikrobialen Populationen
schnell verbreitet, sogar in
genetisch nicht-verwandten
Zellen)
Unterschiedliche „Spezien”
die in ähnlicher Umgebung
leben entwickeln einen
ähnlichen Metabolismus:
konvergente Evolution
Gen-Aufspürung, eine neue bioinformatische Methode kann alte
horizontale Genübertragungsmomente auch unter sehr
unterschiedlichen Arten aufspüren
Das endosymbiotische Bakterium Wolbachia hat Teile seines Genoms in zahlreiche
Stämme von Drosophila ananassae, die Wespe Nasonia und der Wurm Brugia malayi
eingebracht
Transfer von Gene, mobile Gene
• Manche Gene werden zwischen verschiedenen Zellen
durch randome Ereignisse übergebracht
(DNA von toten Zellen wird aufgenommen und integriert
von lebendigen Zellen)
• Andere Gene „bewegen” sich ständig (Transposone),
oder sie vermehren sich (Retrotransposone) um ihre
Chance in andere Zellen gelingen zu können zu vergrössern
• Gene sind entstanden welche für Proteine kodieren die
solche Strukturen (sex pili) formen die den Transfer
zwischen Zellen ermöglichen
• Gengruppen wurden entwickelt die das eigene
Überleben sichern, falls die Wirtszelle sterben sollte
(lysogene Phagen)
• mehrere egoistische Gene benutzen den Wirt nur damit
sie sich vermehren können
(bacterielle Viren = Bacteriophage)
Genaustausch unter Prokaryoten
Transformation:
Aufnahme von DNA aus
(toten) Zellen
Konjugation:
Transfer von DNA
(unter lebendigen Zellen)
Transduktion:
Genübertragung
(durch Infektion)
„Markern” von Bakterien
prototroph - „wilder Typ" Bakterien haben minimale Nahrungsbedingungen,
charakteristisch für die Arten (oft: nur Wasser, anorganische Salze, C = Energie und N
Quelle).
Minimale Bedingungen können variieren (Stickstoff fixation, Photosynthese, anaerobe
Umstände, usw.) Pathogene Organismen benötigen in der Regel viele komplexe Zutaten.
auxotroph – mutanter Stamm, benötigt bestimmte Zutaten die von dem wilden Typ nicht
benötigt werden.
Genetische Markern:
Resistenz
Antibiotika, Faktore aus der Umgebung:
Osmose, pH,Schwermetalle, UV, Hitze,
Detergente, Phagen
Andere: Farbe, Bewegungsfähigkeit,
Plaquemorphologie, Enzyme
„Markern” von Bakterien
Sichtbare Markern
wildes and mutantes Wachsen ist anders: Kolonie Grösse,
wild und mutant weisen Enzymunerschiede auf, andere Metaboliten: Farbe oder Färbung
selektierbare Markern
permissive und restriktive Medien, Umstände
wildes oder mutantes Allel bedeutet selektiven Vorteil
Bakteriengenetik
Die erste „Kreuzung” der Bakterien:
rekombination (Lederberg & Tatum)
Die Stämme A und B
wurden gemeinsam in
einer Flüssigkultur vermehrt
Prototrophe Bakterien sind
mit 10-7Wahrscheinlichkeit
Entstanden
Weder Stamm A noch B können
auf Minimalmedium wachsen
Biotin: Vitamin H
Thiamin: Vitamin B1
Entdeckung der Konjugation
U-tube Experiment - William Hayes, 1953
Der filter erlaubt den Austausch von
subzellulären Materialien,verhindert aber die
Vermischung der Zellen.
Keine Rekombination detektiert (keine
prototrophe Kolonien).
Formation von Rekombinanten benötigt
physischen Kontakt der Zellen von
verschiedenen Stämmen.
Der Transfer geht nur in eine Richtung! "Sexual„-als Unterschied zwischen den Zellen
A = Donor („Männchen"), B = Rezipient („Weibchen").
Fertilität geht in den „Männchen” Zellen oft verloren – unabhängig von anderen
Merkmalen
Entdeckung der Konjugation
Bestimmung der Richtung des
Gentransfers/Konjugation (Hayes)
„A” Zellen: Streptomycin resistent
„B” Zellen: Streptomycin sensitiv
Gemeinsame Vermehrung der Zellen bildet KEINE Wildtypkolonie auf Minimalmedium
mit Streptomycin
Richtung des Gentranfers: „A” -> „B”
„A” Zellen: Streptomycin sensitiv
„B” Zellen: Streptomycin resistent
Gemeinsame Vermehrung der Zellen bildet Wildtypkolonien auf Minimalmedium mit
Streptomycin
Richtung des Gentranfers: „A” -> „B”
„A” Zellen + Streptomycin: sterben
Mischung der toten „A” + lebendige „B” Zellen ergibt Wildtypkolonien
Richtung des Gentranfers: „A” -> „B”
Veränderung der genetischen
Information: die Konjugation
Die F+-Zellen von E. coli besitzen zwei
genetische Elemente, das Chromosom und
das F(Fertilitäts)-Plasmid/Faktor. Direkter
Kontakt mit der F - Zelle über
Konjugationsbrücke, Sex-Pili (Protein-Rohre).
F + Donorzelle überträgt den Fertilitätsfaktor (FPlasmid) in die Empfängerzelle als
einzelsträngige DNA. Der Empfänger
synthetisiert den zweiten Strang.
Während der Konjugation wandelt sich der F Stamm in F+. Der Transfer beginnt an der
oriT (transfer) Stelle des F-Plasmids
Die Konjugationsbrücke von E. coli
Die Donorzelle überträgt ihre einzelsträngige DNA in die Empfängerzelle
über die Konjugationsbrücke, Sex-Pilus (ein Proteinrohr)
Entdeckung der Konjugation mit hoher Frequenz
Luca Cavalli-Sforza: unerwartet hohe Transformationsfrequenz (1000 x), sehr niedriger oder
kein Transfer von Fertilität
Integration des F-Plasmids ins Chromosom:
Hfr-Zelle (high frequency of recombination)
mit einer 10-3Wahrscheinlichkeit
Während der Paarung/Konjugation überträgt die HfrZelle ihre einzelsträngige DNA in die F—Zelle.
Die Übertragung beginnt mit der oriT-Sequenz.
Keine Sexualität sondern Parasexualität.
Die Übertragung dauert ~100 Minuten, aber wird
spontan unterbrochen.
Konsequenz: ein vollkommenes, ringförmiges
Chromosom, zusätzlich mehr oder weniger lange lineare
DNA-Abschnitte, die Zelle ist Merozygot, nur teilweise
Diploid
Genetische „Kartierung”
F-Plasmide können sich in verschiedene Positionen des
Genoms integrieren.
Abhängig von der Stelle und Orientation werden
verschiedene Gene in verschiedene Sequenzen
übergebracht.
Falls der Plasmid sich in das Chromosom integriert werden
die Fertilitätsgene zuletzt transferiert.
Die Chance auf dies ist sehr niedrig, meisstens wird die
Konjugation früher unterbrochen.
Bei F-Plasmiden die sich selbstständig replizieren ist es
genau der Gegenteil: Donor-Fähigkeit wird oft transmittiert,
da das Origo von den Fertilitätsgen nicht durch den
Chromosom separirt ist.
Konjugation ist das meisstverbreitene und wichtigste
Ereignis für Antibiotikaresistenz.
Genetische „Minutenkartierung”
Während der Konjugation folgen sich die einzelnen Gene von Donor zu
Rezipient. Wird die Konjugation unterbrochen werden nur manche Gene
übergebracht.
90 Minuten wurden benötigt um das ganze E. coli Genom zu
transferieren.
Transfer von Fertilitätsgene
In Hfr Stämme werden die Fertilitätsgene zuletzt übergebracht:
Hohe Effizienz des Gentransfers, niedrige warscheinlichkeit, dass F auch
übergebracht wird.
Unabhängige F-Plasmide:
Niedrige Effizienz des Gentransfers, F wird mit derselben Warscheinlichkeit
übergebracht. Bei Bakterien ist die Konjugation bei Weitem die meisst
effektive Art der Genübertragung.
Genkartierung durch unterbrochene
Konjugation
Donorzelle: str- s; Empfängerzelle:
Str-r; Wildtyp Donorzellen werden mit
Streptomycin getötet ab und zumales
Schütteln der Zellkultur: die Konjugation wird
Unterbrochen.
Der F--Stamm kann ausschliesslich in der
Anwesenheit von Methionin, Leucin und
Arginin, auf Streptomycin Wachsen.
Nach 9 Min. Paarung: met+ Rekombinanten;
18 Min: arg+;
24 Min: leu+Rekombinanten
Die Genkarte: met-9 Einheit (Min.) -arg–6
Einheit -leu
Genkartierung durch Rekombination
In dieser Konjugation wird das leuGen als letztes übertragen
Selektion: Minimalmedium + Arginin, Methionin, Streptomycin (nur leu+kann
wachsen)
Analyse der Kolonien mit Replika-Plattierung auf verschiedene Medien
Genkartierung durch Rekombination
Die unterbrochene Konjugation ergibt bloss raue Kartierungsdaten; die Gene die näher als 1-2
Einheit/Min. liegen können nicht kartiert werden
Ein Abschnitt von ~1 Min. kann durchschnittlich 40-50 E. coli Gene enthalten
Rekombinationskartierung, wie bei Eukaryonten, ermöglicht Kartierung naher
Gene
Selektion: Minimalmedium +Arg.+Met. + Str., wo ALLE leu+-Rekombinanten
Wachsen können
Alle mögliche Rekombinantenkategorien:
90%: leu+ arg+ met+
4 %: leu+ arg--met-6 %: leu+ arg+ met-0.25 %: leu+ arg--met+ (Die seltenen, vierfachen Rekombinanten)
Kartenabstände: leu 4 E. arg 6 E. met (keine Information über Reihenfolge!) Kartenabstände:
leu 4 E. arg 6 E. met (keine Information über Reihenfolge!)
Reihenfolge der Gene: leu+ arg-met+ , aufgrund der seltenen Rekombinanten