Experimentelle Phytopathologie Immunologische Methoden
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Experimentelle Phytopathologie Wolfgang Arthofer Wintersemester 2008/09 Institut für Forstentomologie, Forstpathologie und Forstschutz Department für Wald- und Bodenwissenschaften Universität für Bodenkultur, Wien Experimentelle Phytopathologie Immunologische Methoden • Mikropräzipitation • Tissue Print • ELISA • andere Immunoassays • Western Blot 1 Antikörper • Bestehen aus zwei leichten und zwei schweren Proteinketten • Epitop-spezifische hypervariable Bindungsstellen • Biologische Wirkmechanismen: Neutralisation, Agglutination D. Endesfelder, Uni Mainz Antikörper: Gewinnung • Polyklonale Antikörper: Immunisierung eines Tieres und Gewinnung der Antikörper direkt aus dem Serum • Monoklonale Antikörper: Immunisierung eines Tieres, Isolation der Plasmazellen, Hybridoma-Bildung, Vereinzelung und Proteinexpression in vitro • Rekombinante Antikörper: Herstellung mittles Expressionssystems ohne Immunisierung eines Tieres 2 Agglutination und Mikropräzipitation • Antikörper-Lösung wird direkt auf die zu testende Matrix aufgebracht oder mit dieser vermischt • Ist das zu testende Epitop vorhanden kommt es zu sichtbaren Fällungen Serafol Immuno Tissue Print • Zu testendes Gewebe wird auf einer Nitozellulose-Membran abgedrückt • Membran wird anschliessend mit konjugiertem Antikörper inkubiert und ungebundener Antikörper abgewaschen E. Knapp, IAM • Gebundene Antikörper werden mittels Farbreaktion sichtbar gemacht • Beispiel: Verteilung von ACLSV in einem SproßQuerschnitt 3 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 1. Gefäß mit Antikörpern beschichten 2. Probe zugeben; gesuchte Epitope werden von den Antikörpern spezifisch gebunden 3. waschen; alle ungebundenen Anteile der Probe werden entfernt 4. an alkalische Phosphatase (AP) konjugierten Antikörper zugeben, inkubieren, waschen um ungebundene Antikörper zu entfernen 5. p-Nitrophenylphosphat (pNPP) zugeben; in Gegenwart von AP kommt es zur Bildung von gelbem p-Nitrophenol ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) • Wird fast immer in 96-well Mikrotiterplatten durchgeführt • Farbreaktion kann händisch oder über Photometer ausgewertet werden • Testergebnis nach ca. 12 Stunden 4 Weitere Immunoassays • RIA: Radio-Immunoassay • FIA: Fluorescent Immunoassay • Immunchromatographie (für Schnelltests) Western Blot Proteine werden durch Elektrophorese aufgetrennt • anschließend auf eine Membran übetragen • dort Detektion mit markierten Antikörpern • multiple Antigene können so getrennt erfasst werden www.laborpraxis.vogel.de • 5 Experimentelle Phytopathologie Molekularbiologische Methoden • Vorkommen und Isolierung von DNA • Restriktionsenzyme, RFLP • Amplifizierung von DNA • Sequenzierung von DNA • Mutationen • Häufig verwendete Marker Molekularbiologie im Laufe der Zeit 1865 1871 1903 1927 1944 1945 1953 1961 1971 1977 1977 1988 1994 1995 2001 Merkmale werden unabhängig voneinander vererbt Entdeckung der Nukleinsäuren Chromosomen sind Träger des Erbguts Mutationen sind physische Veränderungen eines Gens DNA ist der Träger der genetischen Information Gene codieren Proteine DNA hat eine Doppelhelix - Struktur Der genetische Code besteht aus Basentripletts Die zelluläre DNA enthält repetitive Elemente Eukaryotische Gene sind unterbrochen DNA kann sequenziert werden Das PCR-Verfahren revolutioniert die MolBiol Erster kommerzieller DNA-Mikroarray Erste Bakteriengenome vollständig bekannt Erster Rohentwurf der humanen Gensequenz 6 DNA: die Struktur Durchmesser etwa 2 nm Eine komplette Drehung alle 10 Basen Große Furche: 2.2 nm Kleine Furche: 1.2 nm Länge des Moleküls im menschlichen Chromosom I: 8.4 cm ! DNA: die ‚Bauteile‘ 3‘ Adenin, Thymin: 2 H-Brücken Guanin, Cytosin: 3 H-Brücken Desoxyribose Phospho-diesther-Bindung 5‘ 5‘ 3‘ 7 Wo kommt DNA vor? Prokaryota Chromosom ein einzelnes, großes Molekül Plasmide Eukaryota eher kleine (< 10 kb), zirkuläre DNA, viele Kopien pro Zelle Nucleus mehrere große, zu Chromosomen kondensierte Moleküle; meistens diploid Mitochondrien ein ~15 kb Molekül, haploid Chloroplasten ein ~250 kb Molekül, haploid DNA-Extraktion mittels Silica-Membranen Das Prinzip ... Silica Membranen binden DNA bei hohen Salz- or Alkoholkonzentrationen, und geben sie bei niedrigen Konzentrationen wieder ab ... und so wird es gemacht: • Probe homogenisieren und mit salzreichem Puffer mischen • Mischung durch eine Silica Membran pressen; die DNA wird an die Membran gebunden • Membran waschen: Puffer mit >70% EtOH • Membran trocknen (EtOH würde später stören) • DNA mit Wasser eluieren 8 DNA-Extraktion mittels Silica-Membranen Visualisierung durch Elektrophorese • DNA ist negativ geladen • Wandert im elektrischen Feld zur Anode • Zur Grössentrennung werden Agarose-Gele (0.8 – 2%) in einem leitfähigen Puffer verwendet • Kleinere Fragmente wandern schneller • Spannung 50 – 200 V, Laufzeit 15 – 120 Minuten • Ethidiumbromid (EtBr) als DNA-spezifischer Farbstoff • Betrachtung im UV-Licht 9 Visualisierung durch Elektrophorese Visualisierung durch Elektrophorese 10 • Binden an einer spezifischen DNA-Sequenz • Schneiden dann die DNA innerhalb oder in der Nähe dieser Stelle Blunt end: SmaI 5‘ CCC|GGG 3‘ 3‘ GGG|CCC 5‘ 5‘ overhangs: EcoRI 5‘ G|AATT C 3‘ 3‘ C TTAA|G 5‘ 3‘ overhangs: KpnI 5‘ G GTAC|C 3‘ 3‘ C|CATG G 5‘ EcoRI an einem DNA-Strang (Wikimedia) Restriktionsenzyme RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) • DNA unterschiedlicher Herkunft trägt an verschiedenen Stellen Sequenzen, die von Restriktionsenzymen erkannt werden • Die Restriktionsenzyme schneiden die DNA an diesen Stellen • Durch Elektrophorese auf einem Agarose-Gel werden die Bruchstücke getrennt und die Längenunterschiede sichtbar gemacht 11 Polymerase chain reaction (PCR) Science (1985) 230, 1350-13544. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Two new methods were used to establish a rapid and highly sensitive prenatal diagnostic test for sickle cell anemia. The first involves the primer-mediated enzymatic amplification of specific beta-globin target sequences in genomic DNA, resulting in the exponential increase (220,000 times) of target DNA copies. In the second technique, the presence of the beta A and beta S alleles is determined by restriction endonuclease digestion of an end-labeled oligonucleotide probe hybridized in solution to the amplified beta-globin sequences. The beta-globin genotype can be determined in less than 1 day on samples containing significantly less than 1 microgram of genomic DNA. Polymerase chain reaction (PCR) elongieren (72°C) erhitzen (94°C) erhitzen (94°C) Primer binden (50-60°C) 12 Polymerase chain reaction (PCR) elongieren (72°C) Primer binden (50-60°C) etc ...... Polymerase chain reaction (PCR) 13 PCR in der Praxis • Reaktionsvolumen 10 – 50 µl • in dünnwandigen Gefässen (Streifen, Platten) • heute zumeist 96-well Thermocycler • Laufzeit eines typischen Programms ~ 2 Stunden • Visualisierung meist durch Elektrophorese • Kosten pro Reaktion ~ 0.2 € PCR: Beispiele 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 + - Test auf Wolbachia - Infektion 1000 bp 500 bp 100 bp Bestimmung von Plasmid-Grössen 14 PCR-RFLP • PCR – Produkte werden mit Restriktionsenzym verdaut • Spezifische Unterschiede in der Sequenz können so sichtbar gemacht werden Beispiel: D- und M-strain des Plum Pox Virus (PPV) unterscheiden sich durch eine Dde I – recognition site im viralen Hüllprotein-Gen. A B C A .. PPV-D B .. Mischinfektion C .. PPV-M DNA - Sequenzierung Heute wird zumeist die „di-deoxy Strang-Abbruch Methode“ (Sanger, 1977) verwendet 5' 4' 1' 3' 2' deoxy – weil es DNA ist! di-deoxy !! • DNA wird amplifizert – aber den ‚normalen‘ dNTPs ist eine kleine Menge ddNTPs zugesetzt • Wurde in einen Strang ein ddNTP eingebaut kann dieser nicht mehr verlängert werden • Dieser Einbau geschieht an zufälliger Stelle – alle nur denkbaren Teilstränge werden mit der Zeit gebildet • ... und wie kommen wir jetzt zur Sequenz ??? 15 DNA - Sequenzierung • jedes ddNTP wird mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert: • ddATP – R6G • ddCTP – ROX • ddGTP – R110 • ddTTP – TAMRA • nach der Amplifizierung wird die DNA mittels hochauflösender Kapillar-Elektrophorese aufgetrennt • jedes Fragment ‚leuchtet‘ in der Farbe seines letzten Nukleotids DNA - Sequenzierung • Dieses System ist voll automatisierbar • Dauer eines Laufs mit 1000 bp ca. 30 Minuten • Moderne Sequenzierer verarbeiten 96 oder 384 Proben gleichzeitig • Kosten pro Sequenz 5 – 10 €, rasch sinkend 16 Mutationen • Substitution: Austausch einer einzelnen Base • Insertion: Erwerb von Basen oder längeren Abschnitten • Deletion: Verlust von Basen oder längeren Abschnitten • Frameshift: Erwerb/Verlust einer Nuklidzahl ≠ 3 in codierenden Regionen – Auswirkung auf AA-Sequenz! • Duplikation großer Regionen Viele Mutationen verhalten sich ‚still‘ • der Austausch einer Base verändert nicht notwendigerweise die Aminosäuresequenz eines Proteins • der Austausch einer Aminosäure verändert nicht notwendigerweise die Proteinfunktion • nicht mutierte Allele heterozygoter Organismen können dominant sein • möglicherweise codiert ein anderer Locus innerhalb einer Genfamilie für ein funktionales Protein • der Großteil der DNA höherer Lebewesen codiert überhaupt nicht für Proteine 17 „Junk“ DNA ? • Etwa 1 % der DNA codiert für Proteine • Intergenische DNA enthält viele regulatorische Elemente • Der Großteil der DNA wird nie transkribiert Pseudogene 5% Introns 24% Exons 1% andere intergenische DNA 22% Mikrosatelliten 3% Transposons 45% Verschiedene DNA-Regionen haben unterschiedliche Mutationsraten 18S - rDNA nieder nukleare single-copy DNA (scnDNA) nukleare Pseudogene Introns mitochondriale DNA (mtDNA) ITS - rDNA Minisatelliten hoch Mikrosatelliten 18 Genetische Marker • sind definierte Abschnitte der DNA oder ihrer Folgeprodukte (RNA, Proteine) • ihre Sequenz unterscheidet sich in charakteristischer Weise von der homologen Sequenz anderer Individuen, Populationen oder Taxa • die Sequenz des Markers kann direkt betrachtet werden • oder es werden Effekte, die direkt auf der Sequenz beruhen, untersucht (restriction sites, sekundäre Strukturen, Proteine etc.) RAPD Random Amplified Polymorphic DNA • PCR mit kurzen, zufällig ausgewählten Primern • nur wenig Ausgangs-DNA erforderlich • wo immer im Genom zwei Primer-Bindungsstellen nahe genug liegen entsteht ein Produkt • Visualisierung am Agarose-Gel • sehr schlecht reproduzierbar • heute weitgehend verdrängt 19 AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism • DNA wird mit Restriktionsenzymen verdaut • Anschließend Ligation von Adaptoren und PCR mit Adaptor-Primern • Fragmentanalyse - Kapillarelektrophorese • wesentlich besser reproduzierbar als RAPD • keine a priori Kenntnis des Genoms erforderlich Mikrosatelliten • • • • • Wiederholungen kurzer DNA-Motive (2 – 6 bp) Anzahl der repeats = Länge des Mikrosatelliten von konservierten Flankenregionen umgeben nuklear, nicht codierend unklare biologische Funktion 20 Mikrosatelliten • 1000-fach höhere Mutationsrate als scnDNA; praktisch alle Mutationen sind Erwerb/Verlust von repeat units • ‚Schneller‘ Marker für kurze evolutionäre Zeiträume • Analyse ist schnell, einfach und eher billig • Für neu zu untersuchende Arten ist de novo Isolation erforderlich, keine Erfolgsgarantie Universität für Bodenkultur Wien Department für Wald und Bodenwissenschaften Institut für Forstentomologie, Forstpathologie und Forstschutz Universität für Bodenkultur Wien Department für Wald- und Bodenwissenschaften Dr. Wolfgang Arthofer Hasenauerstraße 38, A-1190 Wien [email protected] www.boku.ac.at www.peerart.at/aw 21
