Isolation von Plamid-DNA aus Bakterien

Experiment 22 / Student report
Laboratory to Biology III “Diversity of Microorganisms” / Wintersemester 2002/03 / page 1
Experiment Nr.22
Isolation of Plasmid-DNA from bacteria
Verfasserinnen
Angela Stütz, [email protected]
Nadine Pletscher, [email protected]
Betreuer
Dominique Grüter, [email protected]
Einleitung
In diesem Versuch ging es darum, Plasmid-DNA aus 2
verschiedenen Escherichia coli-Klonen zu isolieren, um sie im
Weiteren (Experiment 23) mit Restriktions-Enzymen zu verdauen
und anschliessend durch Gel-Elektrophorese zu analysieren.
In einem Eppendorfröhrchen wurden uns zwei verschiedene E.
coli Bakterienkulturen bereitgestellt. Diese mussten zuerst
komplett aufgetaut und anschliessend 3 min abzentrifugiert
werden, damit sich die Bakterien am Boden absetzten. ( Zentrifuge
auf 5’000rpm, um Bakterien nicht zu zerstören! )
Danach wurde der Überstand mit einer Pipette vorsichtig
abgesaugt und verworfen.
Vorgehen
Das Bakterien-Pellet resuspendierten wir mit 250µl P1-Puffer
( pH 7, enthält Rnase um RNA auf der Bakterienoberfläche zu
zerstören), bis die Lösung homogen war.
Danach gaben wir 250µl P2-Puffer* dazu und mischten vorsichtig,
bis die Lösung klarer wurde.
*Der P2-Puffer ist sauer und beschädigt die Zellwand der
Bakterien, die daraufhin abgetötet werden und in kleinere Teile
zerfallen ( Lösung wird klar). Die chromosomale DNA bleibt an
den Zellwandbruchstücken haften, nur das für uns interessante
Plasmid schwimmt frei in der Lösung.
Nun gaben wir 350µl N3-Puffer hinzu und mischten durch
mehrmaliges Umdrehen des Röhrchens bis die Lösung „wolkig“
(durch ausfallende Proteine) wurde.
Die Mischung zentrifugierten wir nun 10 min bei 10’000rpm,
wobei sich die Proteine am Boden absetzten.
Den Überstand gaben wir auf QUlagen* Säulen. Die ganzen
Säulen zentrifugierten wir 60 sek bei 10’000rpm und verwarfen
danach den Durchfluss.
*Die DNA verbleibt hierbei als Rückstand auf der Membran, was
evtl. auf eine positive Ladung dieser zurückzuführen ist.
(DNA negativ geladen!)
Nun mussten wir die Membran noch mit 0.75 ml PE-Puffer
(alkoholhaltig) waschen und zweimal 60 sek bei 10’000rpm
abzentrifugieren, um sicher zu sein, dass kein PE-Puffer auf der
Membran verbleibt.
(Alkoholreste würden spätere Enzymreaktionen behindern!)
Experiment 22 / Student report
Weiterführende
Fragen
Laboratory to Biology III “Diversity of Microorganisms” / Wintersemester 2002/03 / page 2
Die gewaschene Säule stellten wir in ein neues EppendorfRöhrchen und gaben nun 50µl EB-Puffer* auf die Membran. Nach
ca. 1 min zentrifugierten wir erneut 60 sek bei 10’000rpm.
Der Durchfluss wurde für Experiment 23 zur Analyse aufbewahrt.
*Der EB-Puffer enthält stark negativ geladene Verbindungen, die
mit der DNA auf der Membran konkurrieren, sodass diese von der
Membran gelöst wird.
Wie ist es möglich, chromosomale DNA von Plasmid-DNA zu
trennen?
Mit einem sauren Puffer (oben wird der P2-Puffer erwähnt)
beschädigt man Zellwand der Bakterien, die daraufhin abgetötet
werden und in kleinere Teile zerfallen ( Lösung wird klar). Die
chromosomale DNA bleibt an den Zellwandbruchstücken haften,
das für uns interessante Plasmid schwimmt frei in der Lösung.
Man darf nun die Lösung nicht mehr zu stark schütteln, sonst
würde sich die chromosomale DNA von der Zellwand lösen.