Bedeutung eines putativen Fructose / H +

Promotionsprojekt (Prof. Hahn)
Bedeutung eines putativen Fructose / H+-Symporters für die Keimung
und Infektion des Grauschimmelerregers Botrytis cinerea
Es soll geklärt werden, welche Bedeutung der putative Fructose-Transporter
Bc-FSY1p und andere Zucker-Transporter für die Nährstoffaufnahme
während der Keimung und Penetration von B. cinerea besitzen. Hierzu sind
folgende Schritte vorgesehen:
1. Aufnahmeversuche mit radioaktiv markierten Zuckern (Suc, Glc, Frc) mit
keimenden Konidien zur Bestimmung der Aufnahmekapazität für diese
Zucker. Messung der extrazellulären Invertase-Aktivität zum Nachweis der
Hydrolyse von Saccharose vor der Aufnahme. Untersuchung der Regulation
der Zuckeraufnahme durch Kultivierung der Keimlinge in verschiedenen
Nährlösungen (Wasser, versch. Zuckerkonzentrationen, Zucker-Analoga) auf
künstlichen
und
pflanzlichen
Oberflächen.
Bestimmung
der
internen
Zuckermetabolit-Konzentrationen während der Keimung.
2.
Expressionsanalysen
von
B.
cinerea-Genen
für
Zucker-
und
Aminosäuretransporter und Zucker-metabolisierende Enzyme (Invertase,
Hexokinase etc.) mit Hilfe mit Hilfe von RT-PCR und der DNA-chip
Hybridisierung. Nach Erwartung vieler Experten wird innerhalb der nächsten
1-2 Jahre das komplette Genom von B. cinerea publiziert sein. In diesem
Falle wäre eine komplette Analyse aller relevanten Zuckertransporter- und
Metabolismus-Gene möglich.
3. Klonierung und Sequenzierung von Bc-FSY1. Expression der Bc-FSY1cDNA
in
einer
Glucose-aufnahmedefekten
Hefe-Mutante
(αhxt1-7;
Reifenberger et al. 1995), und in Xenopus-Oozyten. Detaillierte funktionelle
und
kinetische
Untersuchung von Bc-FSY1p in beiden heterologen
Expressionssystemen,
ähnlich
zu
früheren
Untersuchungen
des
Antragstellers (Voegele et al. 2000).
4. Erzeugung einer Bc-FSY1 K.O.-Mutante von B. cinerea, um die Bedeutung
des Fructose-Transporters für die Pathogenese aufzuklären. Phänotypische
Charakterisierung
der
Mutante
nach
folgenden
Kriterien:
a)
Aufnahmekapazität von Konidien und isolierten Plasmamembranen für
Fructose und Glucose. b) Pathogenität der Mutante. c) Kinetik der Keimung
und
Infektion
von
Mutante
und
Wildtyp
auf
verschiedenen
Pflanzenoberflächen und bei verschiedenen Zuckerkonzentrationen im
Inokulationstropfen. d) Kompetitionsfähigkeit der Mutante gegenüber dem
Wildtyp bzgl. Zuckeraufnahme- und Infektions-Effizienz.
Das vorliegende Projekt ist innerhalb einer Promotionsarbeit durchführbar und
in sich abgeschlossen. Es charakterisiert einen wichtigen Aspekt der
Pathogenese von Pilzen und beinhaltet eine Reihe von Methoden, die in
diesem Graduiertenkolleg angewandt werden. Kooperationen sind mit den
AGs
Neuhaus
(Metaboliten-Analysen) und Deitmer (Oozyten-Expression)
geplant.
Zitierte Literatur
Reifenberger, E., Freidel, K., Ciriacy, M. (1995). Identification of novel HXT
genes in Saccharomyces cerevisiae reveals the impact of individual hexose
transporters on glycolytic flux. Mol. Microbiol. 16, 157-167.
Voegele, R.T., Struck, C., Hahn, M. and Mendgen, K. (2001). The role of
haustoria in sugar supply during infection of broad bean by the rust fungus
Uromyces fabae. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 98, 8133-8138.