DeniseMackrodtDissertation
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Etablierung und Funktion maternaler Proteingradienten im Tribolium-Blastoderm Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Denise Mackrodt aus Jeddah Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 29.01.2016 Vorsitzende/r des Promotionsorgans: Prof. Dr. Jörn Wilms Gutachter/in: PD Dr. Michael Schoppmeier Prof. Dr. Martin Klingler Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung ............................................................................................................... VI Summary ............................................................................................................................. VII Abbildungsverzeichnis ........................................................................................................ VIII Tabellenverzeichnis ............................................................................................................... X Abkürzungsverzeichnis........................................................................................................ XII 1. Einleitung .......................................................................................................................... 1 1.1 Allgemeine Einleitung.................................................................................................. 1 1.2 Embryonalentwicklung der Insekten ............................................................................ 2 1.3 Drosophila melanogaster - Modellorganismus No.1, jedoch sehr speziell ................... 2 1.3.1 Determinierung der embryonalen Achsen während der Oogenese .................... 3 1.3.2 Maternale Signale regulieren die früh embryonalen Musterbildungsprozesse entlang der anterior-posterioren Achse ....................... 4 1.3.3 Bicoid-Evolution und die Regulation von caudal................................................. 5 1.3.4 Hierarchische Genkaskaden führen zur Segmentierung des Drosophila Blastoderms ....................................................................................................... 6 1.4 Tribolium castaneum - Ein Vertreter der Kurzkeim-Entwicklung .................................. 9 1.4.1 Zygotische Regulationsmechanismen während der Segmentierung von Tribolium ............................................................................................................ 9 1.4.2 Früh embryonale Musterbildungsprozesse im Käfer und das Tc'zen2/Tc'Mex3/Tc'cad - System .................................................................... 12 1.4.3 Caudal Funktion in Tribolium ........................................................................... 16 1.5 Caudal in anderen Spezies ....................................................................................... 17 1.6 Ziele dieser Arbeit ..................................................................................................... 19 2. Material und Methoden .....................................................................................................20 2.1 Lösungen .................................................................................................................. 20 2.2 Käferhaltung ............................................................................................................. 21 2.3 Klonierung ................................................................................................................. 21 2.4 Verwendete Primer ................................................................................................... 23 III Inhaltsverzeichnis 2.5 Verwendete Plasmide ............................................................................................... 24 2.6 Keimbahntransformation durch embryonale Injektion ................................................ 24 2.7 Etablieren transgener Linien ..................................................................................... 25 2.8 Hitzeschock-Prozedur ............................................................................................... 25 2.9 Fixierung von Embryonen ......................................................................................... 26 2.10 Sonden-Synthese ..................................................................................................... 26 2.11 In-situ Hybridisierung ................................................................................................ 26 2.12 Antikörperfärbung ..................................................................................................... 27 2.13 Präparation von Embryonen...................................................................................... 28 2.14 Kutikula-Präparate .................................................................................................... 28 2.15 Fresh-Preps .............................................................................................................. 29 2.16 Dokumentation .......................................................................................................... 29 3. Ergebnisse .......................................................................................................................30 3.1 Ein maternales Misexpressionssystem in Tribolium castaneum ................................ 30 3.1.1 Strategie zur Etablierung eines maternalen Misexpressionssystems ............... 30 3.1.2 Maternale Misexpression mittels regulatorischer Sequenzen von Tc'eagle ...... 32 3.1.3 Klonierung weiterer Misexpressionskonstrukte ................................................ 34 3.1.4 Maternale Misexpression mittels regulatorischer Sequenzen von Tc'pangolin ...................................................................................................... 37 3.1.5 Generierung eines maternalen UAS/Gal4-Systems in Tribolium castaneum .... 39 3.1.6 Erste Analysen der UAS/Gal4-Linien ............................................................... 44 3.2 Analyse des Tc'zen2/Tc'Mex3/Tc'cad Systems ......................................................... 46 3.2.1 Generierung von Peptid-Antikörpern gegen Tc'ZEN1, Tc'ZEN2 und Tc'MEX3 .......................................................................................................... 46 3.2.2 Expression der generierten Antikörper gegen Tc'ZEN1, Tc'ZEN2 und Tc'MEX3 .......................................................................................................... 48 3.2.3 Misexpression von Tc'ZEN2, Tc'MEX3 und Tc'CAD mittels Hitzeschock ......... 54 3.2.4 Tc'ZEN2- Misexpression verursacht starke Defekte auf Kutikula-Ebene .......... 60 3.2.5 Die zeitlich veränderte Misexpression von Tc'ZEN2 führt zu einer Verschiebung der Kutikula-Defekte innerhalb der Larven................................. 63 IV Inhaltsverzeichnis 3.2.6 Tc'wg Streifen gehen nach der Misexpression von Tc'ZEN2 verloren .............. 73 3.2.7 Tc'ZEN2 Misexpression verursacht auch homeotische Transformationen........ 75 3.2.8 Tc'CAD - Misexpression verursacht starke anteriore Defekte........................... 77 3.2.9 Tc'MEX3 - Misexpression verursacht keinen Defekt auf Kutikula-Ebene .......... 82 3.2.10 Tc'ZEN2 reguliert die Tc'CAD Expression ........................................................ 85 3.2.11 Tc'eve Streifen sind nach Tc'ZEN2 Misexpression gestört ............................... 88 3.2.12 Die anterioren Hox-Gene Tc'Scr und Tc'Dfd sind nach Tc'ZEN2 Misexpression stark reduziert........................................................................... 92 3.2.13 Die Gap-Gene Tc'Kr und Tc'hb sind nach Tc'ZEN2 Misexpression stark reduziert ........................................................................................................... 95 4. Diskussion ........................................................................................................................99 4.1 Ein maternales Misexpressionssystem in Tribolium castaneum ................................ 99 4.2 Analyse des "Tc'zen2/Tc'Mex3/Tc'cad-Systems" mittels embryonalem Hitzeschock ............................................................................................................ 103 4.2.1 Tc'ZEN2 - ein weiteres homeotisches Gen mit der Fähigkeit RNA zu binden . 103 4.2.2 Translationsreprimierung durch Tc'MEX3 mit Hilfe von Co-Faktoren ............. 106 4.3 Tc'CAD Funktion während der früh-embryonalen Musterbildung in Tribolium castaneum .............................................................................................................. 107 4.3.1 Die Misexpression von Tc'CAD zeigt Ähnlichkeiten zu Tc'Mex3 RNAi ........... 108 4.3.2 Der HSzen2 offenbart mögliche Tc'CAD-Funktionsmodelle ........................... 109 4.4 CAUDAL steht in basalen Insekten an der Spitze der frühen Musterbildungsprozesse ......................................................................................... 118 Anhang ...............................................................................................................................122 Anhang A - Sequenzier-Primer ....................................................................................... 122 Anhang B - Detaillierte Statistiken zu Kutikula-Auswertungen ......................................... 124 Literaturverzeichnis ............................................................................................................138 Erklärung ............................................................................................................................155 Danksagung .......................................................................................................................156 V Zusammenfassung Zusammenfassung Die früh-embryonalen Musterbildungsprozesse entlang der anterior-posterioren Achse in Insekten sind von entscheidender Bedeutung für ihre weitere Entwicklung. In Drosophila melanogaster sind diese Mechanismen bereits sehr gut verstanden. Jedoch sind sie auf Grund der Langkeim-Entwicklung und der exklusiven Anwesenheit des Faktors BICOID in höheren Dipteren sehr spezialisiert und nur schlecht auf andere Insekten übertragbar. Deshalb sollte diese Arbeit neue Erkenntnisse über die Musterbildung im basaleren Käfer Tribolium castaneum liefern. Hierfür wurde zum einen der Grundstein für ein modular-aufgebautes, maternales Misexpressions-System gelegt. Durch den Einsatz endogener maternaler Promotoren und spezifischer 3'UTRs soll es in Zukunft möglich sein jedes Gen von Interesse, lokalisiert, in frühen Entwicklungsstadien zu misexprimieren und so seine jeweilige Funktion zu analysieren. Das System ist zudem auf dem Gal4/UAS-System aufgebaut, wodurch eine gezielte zeitliche und räumliche Misexpression erreicht werden kann. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem genaueren Verständnis der Funktionen und Interaktionen der einzelnen Faktoren innerhalb des "Tc'zen2/Tc'Mex3/Tc'cad - Systems" im Tribolium Blastoderm. Alle drei Einzel-Faktoren wurden in frühen Entwicklungsstadien mittels embryonalem Hitzeschock, zeitlich begrenzt, misexprimiert und die Auswirkungen analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass Tc'ZEN2 tatsächlich die Translation der Tc'cad mRNA inhibiert. Die Reduktion der Tc'CAD Expression nach HSzen2 eröffnete zudem die Möglichkeit, die Funktion von Tc'cad während der blastodermalen Musterbildungsprozesse eingehender zu untersuchen. Auf Ebene der larvalen Phänotypen zeigten sich starke Verluste anteriorer Segmente. Durch die zusätzliche Analyse der embryonalen Phänotypen, konnten letztendlich zwei Modelle entwickelt werden, wie Tc'CAD die korrekte Segmentierung entlang der anterior-posterioren Achse des Tribolium Blastoderms beeinflusst. Zum einen besitzt es wohl einen regulatorischen Einfluss auf die Ebene der Paarregel-Gene, insbesondere Tc'eve, wobei hier die Ausbreitung und Steilheit des Tc'CAD ProteinGradienten eine Rolle zu spielen scheint. Zum anderen initiiert Tc'CAD, über die Aktivierung von Tc'hb, scheinbar die Gap-Gen-Kaskade, und somit letztendlich die Expression aller weiteren Genklassen, welche für die korrekte Segmentierung benötigt werden. Tc'CAD stellt also einen essentiellen Faktor in der früh-embryonalen Musterbildung entlang der anterior-posterioren Achse dar und kann an die Spitze der Segmentierungskaskade in Tribolium castaneum gestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit untermauern zudem die Hypothese, dass CAUDAL ursprünglich in basalen Insekten der Hauptinitiator der embryonalen Musterbildungsprozesse ist. VI Summary Summary Early systems of embryonic patterning along the anterior-posterior axis in insects are crucial for its further development. These mechanisms are already very well understood in Drosophila melanogaster. However they are very specialized and poorly transferable to other insects, due to the long-germ mode of development, and the exclusive presence of the factor BICOID in higher diptera. Therefore this work should provide new insights into the pattern formation of the more basal beetle Tribolium castaneum. For this purpose, the foundation of a modular built maternal misexpression system was laid. By using endogenous maternal promoter elements and specific 3'UTRs it should be possible to achieve a localized misexpression of genes of interest in early developmental stages and therefore analyze its functions. Moreover the system is build on the GAL4/UAS-system, whereby a specific temporal and spatial misexpression can be achieved. The second part of this thesis deals with the precise understanding of the function and interactions of the individual factors within the "Tc'zen2/Tc'Mex3/Tc'cad - system" in the Tribolium blastoderm. All three individual factors were temporarily misexpressed by embryonic heatshock in early stages of development, and the consequences were analyzed. It could be shown that Tc'ZEN2 actually inhibits the translation of Tc'cad mRNA. Furthermore the reduction of Tc'CAD expression after HSzen2 offers the chance to analyze the function of Tc'cad during blastodermal patterning. Larval phenotypes showed severe losses of anterior segments. After additional analysis of the embryonic phenotypes, it was possible to originate two models of how Tc'CAD could affect the correct segmentation along the anterior-posterior axis in the Tribolium blastoderm. On the one hand Tc'CAD seems to have a regulatory influence on the level of pair rule genes, particularly on Tc'eve, where the extension and steepness of the Tc'CAD protein gradient seems to play a role. On the other hand, Tc'CAD apparently initiates the gap gene cascade by the activation of Tc'hb and thus the expression of all other classes of genes that are required for proper segmentation. So Tc'CAD represents an essential factor of early embryonic patterning along the anteriorposterior axis and therefore can be placed at the top of the segmentation cascade in Tribolium. The results of this study also support the hypothesis of CAUDAL being originally the main initiator of embryonic patterning in basal insects. VII Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Schematische Darstellung des Ausgangsvektors pRed[eagle-upstreamnls-eGFP-eagle 3’UTR] ............................................................................................... 31 Abbildung 2: In-Situ Hybridisierung gegen Tc'eagle im WT (A). In-Situ Hybridisierung und Antikörperfärbung gegen eGFP in transgenen pRed[eagle-upstream-nlseGFP-eagle3’UTR] Embryonen der Linie1 (eg up L1) (B-D). ....................................... 33 Abbildung 3: pRed[Tc'eg-8kb-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] ............................ 35 Abbildung 4: pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] ................................. 35 Abbildung 5: pRed[Tc'exu-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] ................................. 36 Abbildung 6: In-Situ Hybridisierung gegen Tc'pangolin im WT (A). In-Situ Hybridisierung und Antikörperfärbung gegen eGFP in transgenen pRed[Tc'panupstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] Embryonen (pan up L1/6) (B-D).. ............. 38 Abbildung 7: pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_Gal4∆_Tc'eg-3'UTR] ...................................... 40 Abbildung 8: pBac[UAS_pan-minPromoter_eg5'UTR_Mex3ORF_eg3'UTR] ........................ 42 Abbildung 9: pBac[UAS_pan-minPromoter_eg5'UTR_otdORF_eg3'UTR] ............................ 42 Abbildung 10: In-Situ Hybridisierung gegen Tc'zen1 im WT (A-B). Antikörperfärbung gegen Tc'ZEN1 im WT (C-F).. ..................................................................................... 49 Abbildung 11: In-Situ Hybridisierung gegen Tc'zen2 im WT (A-B*). Antikörperfärbung gegen Tc'ZEN2 im WT (C-D*).. ................................................................................... 51 Abbildung 12: In-Situ Hybridisierung gegen Tc'Mex3 im WT Blastoderm (A-D). Antikörperfärbung gegen Tc'MEX3 im WT Blastoderm (E-F). ...................................... 53 Abbildung 13: Schema des Hitzeschock-Vektors................................................................. 55 Abbildung 14: Hitzeschock induzierte Misexpression von Tc'ZEN2, Tc'MEX3 und Tc'CAD in blastodermalen Stadien 1h nach Hitzeschock............................................. 57 Abbildung 15: Hitzeschock induzierte Misexpression von Tc'ZEN2, Tc'MEX3 und Tc'CAD in Keimstreifen 1h nach Hitzeschock.. ............................................................ 59 Abbildung 16:Statistische Verteilung der Kutikula-Phänotypen der 2h Ablagen von HSzen2 L9 homozygot ................................................................................................ 66 Abbildung 17: HSzen2 Kutikula-Phänotypen nach 8-10h - Hitzeschock. .............................. 68 Abbildung 18: HSzen2 Kutikula-Phänotypen nach 10-12h - Hitzeschock.............................. 69 Abbildung 19: HSzen2 Kutikula-Phänotypen nach 12-14h - Hitzeschock.............................. 71 Abbildung 20: : HSzen2 Kutikula-Phänotypen nach 14-16h - Hitzeschock............................ 72 Abbildung 21: Tc'wg In-Situ Hybridisierung auf 10-12h vw- und HSzen2 Embryonen. .......... 74 Abbildung 22: Homeotische Transformationen in HSzen2 Kutikulas..................................... 76 Abbildung 23: Statistische Verteilung der Kutikula-Phänotypen der 2h Ablagen von HScad homozygot ....................................................................................................... 79 VIII Abbildungsverzeichnis Abbildung 24: HScad Kutikula-Phänotypen nach Hitzeschock.............................................. 80 Abbildung 25: Tc'wg In-Situ Hybridisierung auf 10-12h vw- und HScad Embryonen.............. 82 Abbildung 26: Doppel-AK-Färbung gegen Tc'ZEN2 (rot) und Tc'CAD (grün) in vw- und HSzen2 Embryonen 2h nach HS.. ............................................................................... 87 Abbildung 27: Vergleich der frühen Tc'eve Expansion in Blastodermen von vw- und HSzen2. (8-10h-HS +2h). ............................................................................................ 90 Abbildung 28: In-Situ Hybridisierung gegen Tc'even-skipped (Tc'eve) auf vw- und HSzen2 Embryonen. ................................................................................................... 91 Abbildung 29: Tc'Scr In-Situ Hybridisierung und Tc'Scr + Tc'wg Doppel-In-Situ Hybridisierung auf 10-12h vw- und HSzen2 Embryonen .............................................. 94 Abbildung 30: Tc'Dfd In-Situ Hybridisierung auf 10-12h vw- und HSzen2 Embryonen .......... 94 Abbildung 31: Tc'Kr In-Situ Hybridisierung auf 10-12h vw- und HSzen2 Embryonen ............ 96 Abbildung 32: Tc'hb In-Situ Hybridisierung auf 10-12h vw- und HSzen2 Keimstreifen .......... 97 Abbildung 33: Tc'hb In-Situ Hybridisierung auf 10-12h vw- und HSzen2 Blastoderme. ......... 98 Abbildung 34: Einfluss des Tc'CAD Proteingradienten auf die Tc'even-skipped Expression (modifiziert nach Schoppmeier et al., 2009 und El-Sherif et al., 2014) .... 114 Abbildung 35: Regulation der Gen-Kaskaden durch Tc'CAD (modifiziert nach Cerny et al., 2005; Marques-Souza et al., 2008; J. Distler, 2012) ............................................ 117 Abbildung 36: Regulations-Modelle ausgelöst durch Tc'CAD.. ........................................... 119 IX Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tabelle 1: PCR-Bedingungen für die Klonierung der 5' upstream Regionen. ........................ 22 Tabelle 2: verwendete Primer zur Klonierung neuer Misexpressions-Konstrukte .................. 23 Tabelle 3: verwendete Plasmide ........................................................................................... 24 Tabelle 4: verwendete Antikörper ......................................................................................... 28 Tabelle 5: Zweite embryonale Injektion von pRed[Tc'panupstream+5'UTR_Gal4∆_Tc'eg-3'UTR] ....................................................................... 43 Tabelle 6: Auswertung der Kutikula-Präparate der Kreuzungen von ♀ der ersten Gal4Treiberlinie (pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_Gal4∆_Tc'eg-3'UTR]) mit ♂ den UAS-Linien pBac[UAS_pan-minPromoter_eg5'UTR_Mex3ORF_eg3'UTR], pBac[UAS_pan-minPromoter_eg5'UTR_otdORF_eg3'UTR] und UAS_tGFP. ............. 45 Tabelle 7: Peptid-Sequenzen zur Herstellung der Antikörper gegen Tc'ZEN1, Tc'ZEN2 und Tc'MEX3 ............................................................................................................... 47 Tabelle 8: Antikörperverdünnungen der generierten AK gegen Tc'ZEN1, Tc'ZEN2 und Tc'MEX3...................................................................................................................... 47 Tabelle 9: HSzen2 Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 4-9h alte Embryonen. ......... 61 Tabelle 10: HSzen2 Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 8-12h alte Embryonen.. ................................................................................................................ 62 Tabelle 11: Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 8-12h alte Embryonen in HSzen2 L2 und L9....................................................................................................... 63 Tabelle 12: 2h Ablagen für den Hitzeschock und die korrespondierenden embryonalen Stadien. ....................................................................................................................... 64 Tabelle 13: HSzen2 Kutikula-Phänotypen der 2h Ablagefenster Anzahl und prozentualer Anteil der verschiedenen Phänotyp-Klassen. .......................................... 65 Tabelle 14: HScad Kutikula-Phänotypen der 2h Ablagefenster Anzahl und prozentualer Anteil der verschiedenen Phänotyp-Klassen. .............................................................. 78 Tabelle 15: HSMex3 Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 4-9h alte Embryonen. ...... 84 Tabelle 16: HSMex3 Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 8-12h alte Embryonen. ................................................................................................................. 85 Tabelle 17: Prozentuale Expansion der Tc'eve Expressionsdomänen in vw- und HSzen2 Blastodermen (8-10h-HS+2h). ....................................................................... 91 Tabelle 18: Sequenzier-Primer der klonierten Konstrukte ................................................... 123 Tabelle 19: Auswertung der Kutikula-Präparate der Kreuzungen von ♀ der ersten Gal4Treiberlinie (pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_Gal4∆_Tc'eg-3'UTR]) mit ♂ den UAS-Linien pBac[UAS_pan-minPromoter_eg5'UTR_Mex3ORF_eg3'UTR], pBac[UAS_pan-minPromoter_eg5'UTR_otdORF_eg3'UTR] und UAS_tGFP. ........... 127 X Tabellenverzeichnis Tabelle 20: Ausführliche HSzen2 Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 4-9h alte Embryonen. (vgl. Tabelle 9) ...................................................................................... 128 Tabelle 21: Ausführliche HSzen2 Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 8-12h alte Embryonen. (vgl. Tabelle 10) .................................................................................... 130 Tabelle 22: Ausführliche Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 8-12h alte Embryonen in HSzen2 L2 und L9. (vgl. Tabelle 11)................................................... 131 Tabelle 23: Ausführliche HSzen2 Kutikula-Phänotypen der 2h Ablagefenster. (vgl. Tabelle 13) ................................................................................................................ 133 Tabelle 24: Ausführliche HScad Kutikula-Phänotypen der 2h Ablagefenster (vgl. Tabelle 14) ................................................................................................................ 135 Tabelle 25: Ausführliche HSMex3 Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 4-9h alte Embryonen. (vgl. Tabelle 15) .................................................................................... 136 Tabelle 26: HSMex3 Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 8-12h alte Embryonen. (vgl. Tabelle 16) .................................................................................... 137 XI Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis µl Mikroliter µM mikromolar A1-8 abdominales Segment 1-8 Abb. Abbildung Abd-A Abdominal-A AK Antikörper Amp Ampicillin An Antenne AP Alkalische Phosphatase a-p anterior-posterior bcd bicoid BRE Bicoid response elements cad caudal CDS kodierende Sequenz Ce Caenorhabditis elegans Dfd Deformed DIG Digoxigenin Dm Drosophila melanogaster DNA Desoxyribonukleinsäure d-v dorso-ventral eg eagle EGF Epidermal Growth Factor eGFP enhanced GFP en engrailed eve even-skipped exu exuperantia FLU Fluoreszin ftz fushi-tarazu G Ziege g Gramm Gb Gryllus bimaculatus GFP grün fluoreszierendes Protein GP Meerschweinchen grk Gurken gt giant XII Abkürzungsverzeichnis h Stunde h hairy H2O Wasser hb hunchback Hom-C Homeotischer Komplex HS Hitzeschock hsp Hitzeschock Protein HybA/B Hybridisierungslösung A/B KH K homology kni knirps Kr Krüppel Lb Labium Lr Labrum M molar Md Mandibel Mex muscle excess mg Milligramm ml Milliliter mM millimolar mRNA messenger Ribonukleinsäure Mx Maxille ng Nanogramm NLS nuclear localization signal Nv Nasonia vitripennis Oc okulare Domäne odd odd-skipped ORF open reading frame otd orthodenticle PAL-1 Posterior ALae in males - 1 pan pangolin pBac piggyBac PCR Polymerase-Ketten-Reaktion POD Peroxidase prd paired Py Pygopodien Rb Kaninchen RNA Ribonukleinsäure XIII Abkürzungsverzeichnis RNAi RNA Interferenz rpm Umdrehungen pro Minute run runt SB San Bernadino Scr Sex comb reduced slp sloppy-paired T1-3 thorakales Segment 1-3 Tc Tribolium castaneum tGFP Turbo GFP UAS upstream activation sequence Ug Urogomphi up upstream UTR vw - untranslatierte Region vermillion white wg wingless WT Wildtyp zen zerknüllt XIV Einleitung 1. Einleitung 1.1 Allgemeine Einleitung Omne vivum ex vivo - Alles Leben kommt aus dem Leben Dieser Grundsatz von Louis Pasteur (1822 - 1895) hat seine Gültigkeit noch immer nicht verloren. Die Frage nach dem Ursprung und der Entwicklung des Lebens gibt bis heute viele Rätsel auf und beschäftigt große Bereiche der Naturwissenschaften. "Wo kommen wir her?", "Wie ist das Leben entstanden?" und "Wie ist es möglich, dass sich aus einer einzelnen Zelle die unterschiedlichsten, multizelluläre Systeme entwickeln?". All dies sind grundlegende Fragen, auf die wir noch immer Antworten suchen. Schon im neunzehnten Jahrhundert versuchten verschiedenste Wissenschaftler die Geheimnisse des Lebens zu verstehen. Charles Darwin legte mit seinem Werk "On the Origin of Species", 1859 die Grundlage der modernen Evolutionsbiologie. Ernst Häckel (1834 - 1919) prägte unter anderem Begriffe wie Phylogenese und Onthogenese, die den Entstehungsprozess eines Lebewesens aus einer einzigen Eizelle beschreibt. Und der Naturforscher Gregor Mendel veröffentlichte 1866 seine Regeln der Vererbung, die bis heute Bestand haben. All das führte letztendlich zur modernen Entwicklungsbiologie, welche sich zur Aufgabe gemacht hat, die Rätsel der Entwicklung unterschiedlichster Organismen zu entschlüsseln und, insbesondere auch auf molekularbiologischer Ebene, die Abläufe zu verstehen, welche zur Entstehung eines funktionalen Organismus beitragen. Klar ist: das Leben wurde nicht mehrfach neu erfunden. Heute weiß man, dass viele Prozesse während der frühen Embryonalentwicklung verschiedenster Spezies sehr ähnlich, also konserviert ablaufen. Diese Erkenntnis geht auf Untersuchungen an unterschiedlichsten Organismen zurück. Einige von ihnen haben sich dabei, durch ihre spezifischen Merkmale und für den Laboralltag optimalen Eigenschaften, zu sogenannten Modellorganismen entwickelt. Für eine erfolgreiche Forschung ist es hierbei wichtig, dass die Organismen unter Laborbedingungen einfach und kostengünstig zu halten sind, eine möglichst schnelle Generationsfolge besitzen und zugänglich für molekulargenetische Analysen und Manipulationen sind. Zudem gibt es, beispielhaft für unterschiedliche Unterstämme und Klassen im Tierreich, verschiedene Modellorganismen. Diese sind zum Beispiel die Maus (Mus musculus) als Säugetiervertreter, das Haushuhn (Gallus gallus domesticus) für die Klasse der Vögel, der Krallenfrosch (Xenopus laevis) als Amphib oder auch der Zebrafisch (Danio rerio) als Vertreter der Fische (Vignali et al., 1994; Dooley und Zon, 2000; Judd, 2001; Burt, 2005; Stern 2005; Bier und McGinnis, 2008). 1 Einleitung Aber auch auf Ebene der Invertebraten findet man Modellorganismen wie beispielsweise die Taufliege (Drosophila melanogaster), den Fadenwurm Caenorhabditis elegans oder den rotbraunen Mehlkäfer (Tribolium castaneum), mit dessen Entwicklung sich diese Arbeit beschäftigt (Culetto und Sattelle, 2000; Bernards und Haiharan, 2001; Judd, 2001; Lee et al., 2004; Denell, 2008; Bier und McGinnis, 2008). 1.2 Embryonalentwicklung der Insekten Zu Beginn der Embryonalentwicklung gleichen sich die morphologischen Abläufe in den meisten Insekten. Nach der Befruchtung kommt es zunächst zu mehreren Teilungsrunden des zygotischen Kerns, wobei jedoch keine Zellteilungen stattfinden (Davis und Patel, 2002). Zunächst verbleiben die Kerne im Inneren des dotterreichen Eis, sodass ein sogenanntes Synzytium entsteht. Im weiteren Verlauf wandern sie dann in die Peripherie, bilden dort eine "einzellige" Schicht und je nach Organismus kommt es direkt, oder aber zeitlich verzögert zur Zellularisierung (Davis und Patel, 2002). Etwa zu diesem Zeitpunkt werden auch die extraembryonalen Membranen und das embryonale Gewebe spezifiziert (Davis und Patel, 2002). Der prozentuale Anteil dieser Gewebe und der weitere Verlauf der embryonalen Entwicklung ist ab diesem Stadium abhängig vom jeweiligen Entwicklungs-Mechanismus (Davis und Patel, 2002). Grundsätzlich kann man zwischen Langkeim- und KurzkeimEntwicklung unterscheiden (Krause, 1939; Rosenberg et al., 2009). In Langkeiminsekten, wie zum Beispiel Drosophila melanogaster (Dm), werden bereits im Blastodermstadium alle Segmente von Kopf bis Abdomen angelegt (Davis und Patel, 2002; Rosenberg et al., 2009). Dieser Mechanismus gilt als evolutionär sehr viel abgeleiteter als der Mechanismus der Kurzkeim-Entwicklung, nach welchem sich beispielsweise Tribolium castaneum (Tc) entwickelt (Rosenberg et al., 2009). Im Gegensatz zur Langkeim-Entwicklung werden hier im Blastodermstadium zunächst nur wenige anteriore Segmente spezifiziert und alle weiteren Segmente entstehen während der weiteren Entwicklung aus der posterior gelegenen Wachstumszone (Davis und Patel, 2002; Rosenberg et al., 2009). 1.3 Drosophila melanogaster - Modellorganismus No.1, jedoch sehr speziell Die Taufliege Drosophila melanogaster ist wahrscheinlich, bis heute, der bekannteste Insekten-Modellorganismus und ihre Entwicklung, wohl die am genauesten verstandene. Schon sehr früh wurde sie für verschiedenste biologische Forschungen genutzt. Bereits Anfang des zwanzigsten Jahrhunderts entwickelte Thomas H. Morgan seine Chromosomentheorie der Vererbung anhand von Forschungen an D. melanogaster (Morgan, 1915). Christiane Nüsslein-Volhard und Eric Wieschaus konnten 1980, mit Hilfe von 2 Einleitung Mutanten-Screens, erste Erkenntnisse über die embryonalen Regulationsmechanismen der Fliege erlangen. Zudem veröffentlichten sie in weiteren Arbeiten ihre Ergebnisse zur frühen Achsendetermination und Musterbildung im Drosophila Embryo (Fronhöfer et al., 1996; Nüsslein-Volhard et al., 1987; Nüsslein-Volhard, 1991). Im Jahr 2000 wurde schließlich das Drosophila Genom fast vollständig sequenziert (Adams, 2000). 1.3.1 Determinierung der embryonalen Achsen während der Oogenese Bereits während der Oogenese im Mutterleib werden die ersten wegweisenden Signale vermittelt, welche später zur korrekten Entwicklung des Drosophila-Embryos beitragen. Dabei werden die Oozyte selbst und auch das somatische Follikelepithel benötigt, welches die Oozyten im Ovar umgibt (Roth und Lynch, 2009). Sowohl die anterior-posteriore Achse (a-p) als auch die dorso-ventrale Achse (d-v) werden durch den Oozyten-Kern und das von ihm sezernierte Gurken-Signal (grk) determiniert (van Eeden und St Johnston, 1999; Roth und Lynch, 2009). Für die Etablierung der anterior-posterioren Achse ist es zunächst nötigt, dass das GURKEN Protein an den EGF-Rezeptor TORPEDO der terminalen Follikelzellen bindet (GonzálezReyes et al., 1995; Roth und Lynch, 2009). Durch die Aktivierung von EGF-Zielgenen werden diese Zellen dann, als posteriore Follikelzellen spezifiziert (Roth und Lynch, 2009). Nachdem die Follikelzellen ihr Schicksal angenommen haben, senden sie ihrerseits ein noch unbekanntes Signal zurück an den Oozyten-Kern, wodurch eine Reorganisation des Mikrotubuli-Netzwerks innerhalb der Oozyte ausgelöst wird, sodass die Minus-Enden der Mikrotubuli letztendlich am anterioren Ende der Oozyte zu liegen kommen (Riechmann und Ephrussi, 2001; Roth und Lynch, 2009). Durch diese Änderung der Mikrotubuli-Polarität kann nun die bicoid mRNA an den anterioren Pol transportiert und dort lokalisiert werden, was vor allem mit Hilfe der Gene swallow, staufen und exuperantia geschieht (Berleth et al., 1988; Nüsslein-Volhard, 1991; Weil et al. 2006). Am posterioren Pol kommt es zur Anreicherung der oskar mRNA, welche im Folgenden für die Lokalisation der maternal exprimierten nanos mRNA, ebenfalls am posterioren Pol der Oozyte, benötigt wird (Ephrussi et al. 1991). BICOID und NANOS sind im späteren Verlauf der Entwicklung wichtige Hauptfaktoren der embryonalen Musterbildung entlang der anterior-posterioren Achse (Driever und NüssleinVolhard, 1988; Lehmann und Nüsslein-Volhard, 1991). Die dorso-ventrale Achse wird ebenfalls über die Interaktion zwischen dem GURKEN Signal und dem EGF-Rezeptor TORPEDO festgelegt (González-Reyes et al., 1995; Roth und Lynch, 2009). Durch die Umordnung des Cyto-Skeletts nach Etablierung der a-p-Achse, wandert der Oozyten-Kern entlang einer Seite der Oozyte in Richtung anterior (van Eeden und St Johnston, 1999). Während dieser Wanderung sezerniert der Kern weiterhin das 3 Einleitung GURKEN Signal, das in den benachbarten Follikelzellen EGF-Signale aktiviert, und so die Expression des Faktors pipe in diesen Zellen inhibiert (van Eeden und St Johnston, 1999). Auf der gegenüberliegenden Seite, welche die ventrale Seite wird, kann pipe in den Follikelzellen exprimiert werden und eine Protease-Kaskade innerhalb des ventralen Perivitellinraums aktivieren, die letztendlich über weitere Faktoren wie Spätzle zur Aktivierung des Toll Rezeptors in der ventralen Plasmamembran des Embryos führt (Lynch und Roth, 2011). Durch diese Aktivierung wird das CACTUS Protein phosphoryliert und abgebaut (Lynch und Roth, 2011). In Abwesenheit von PIPE-Signalen, bindet CACTUS den Transkriptionsfaktor DORSAL und verhindert so dessen Eindringen in den Kern und die Aktivierung seiner Zielgene (Lynch und Roth, 2011). Durch die Zerstörung des Komplexes auf der ventralen Seite kommt es somit dort zu DORSAL-Signalen, welche konzentrationsabhängig verschiedene Gene aktivieren und letztendlich zur Musterbildung entlang der d-v-Achse führen (Roth und Lynch, 2011). 1.3.2 Maternale Signale regulieren die früh embryonalen Musterbildungsprozesse entlang der anterior-posterioren Achse Wie bereits erwähnt, ist Drosophila ein Beispiel für die Langkeim-Entwicklung, in der alle Segmente des späteren Organismus entlang der a-p-Achse simultan bereits im Blastodermstadium spezifiziert werden (Davis und Patel, 2002; Rosenberg et al., 2009). Dies geschieht prinzipiell über drei verschiedene Systeme: Das anteriore, das posteriore und das terminale System (Nüsslein-Volhard, 1991). Das terminale System definiert in Drosophila die terminalen Strukturen Acron (anterior) und Telson (posterior) (Nüsslein-Volhard, 1991). Hierzu wird in den anterioren und posterioren Follikelzellen der Faktor torso-like exprimiert, von welchem angenommen wird, dass er an der Prozessierung und Aktivierung des Faktors trunk beteiligt ist (Nüsslein-Volhard, 1991; Li et al., 2011). Der embryonale Rezeptor TORSO wird daraufhin von seinem potentiellen Liganden TRUNK aktiviert und so die Expression von TORSO-Zielgenen, wie huckebein und tailless, initiiert (Nüsslein-Volhard, 1991; Li et al., 2011). Durch die gleichzeitige Integration des anterioren und posterioren Systems kann es schlussendlich zur Unterscheidung der zwei verschiedenen terminalen Strukturen kommen (Nüsslein-Volhard, 1991; Li et al., 2011). Für die Entstehung von abdominalen Segmenten ist das posteriore System mit seinem Hauptfaktor NANOS verantwortlich, was in nanos-Mutanten zum Verlust dieser Strukturen führt (Lehmann und Nüsslein-Volhard, 1991; Nüsslein-Volhard, 1991). Durch die Lokalisation der maternal exprimierten nanos mRNA am posterioren Pol kann ein NANOS Proteingradient von posterior nach anterior entstehen (Ephrussi et al. 1991; NüssleinVolhard, 1991). NANOS inhibiert in posterioren Bereichen dann zusammen mit pumillio die 4 Einleitung Translation der maternal bereitgestellten hunchback (hb) mRNA und gewährleistet so unter anderem die Expression des posterioren Gap-Gens knirps (kni) (Niessing et al., 1997; Jaeger, 2011). Wie das posteriore System, basiert auch das anteriore System auf einem ProteinGradienten, der durch maternal exprimierte und während der Oogenese lokalisierte mRNA entsteht (Berleth et al., 1988; Nüsslein-Volhard, 1991). Der Hauptfaktor hier ist BICOID und in bicoid (bcd) Mutanten fehlen zum einen die anterioren Strukturen Kopf und Thorax, zum anderen ist das terminale Acron zum Telson transformiert (Nüsslein-Volhard et al., 1987; Nüsslein-Volhard, 1991). Nach der Translation der anterior lokalisierten bicoid mRNA kommt es durch Diffusion des Proteins innerhalb des synzytialen Blastoderms zu einem BICOIDGradienten von anterior nach posterior (Berleth et al., 1988; Driever und Nüsslein-Volhard, 1988). Dieser hat grundsätzlich zwei Funktionen während der früh-embryonalen Musterbildung in der Fliege. Einerseits wirkt BICOID als Morphogen entlang der a-p-Achse und aktiviert auf transkriptioneller Ebene, konzentrationsabhängig weitere Gene wie zum Beispiel die zygotische hunchback Domäne (Driever und Nüsslein-Volhard, 1988; Driever und Nüsslein-Volhard, 1989; Struhl et al., 1989). Auf der anderen Seite wird BICOID anterior auch als Translationsrepressor der caudal (cad) mRNA benötigt (Rivera-Pomar et al., 1996; Dubnau und Struhl et al., 1996) und sorgt so dafür, dass das CAUDAL Protein nur auf posteriore, embryonale Bereiche beschränkt wird und dort einen Gradienten von posterior nach anterior bilden kann (Macdonald und Struhl, 1986; Mlodzik und Gehring, 1987). 1.3.3 Bicoid-Evolution und die Regulation von caudal Das homeotische Gen Dm'bicoid ist also ein entscheidender Faktor der embryonalen Musterbildung in Drosophila. Im Reich der Insekten stellt es jedoch einen Sonderfall dar, da es außerhalb der höheren Dipteren in keiner weiteren Insekten-Klasse existiert (Stauber et al., 1999; Brown et al., 2001). Seinen Ursprung hat bicoid in einem anzestralen Hox3-Gen, was auch seine Lage innerhalb des homeotischen Gen Komplexes (Hom-C) in Drosophila erklärt (Stauber et al., 1999). Zunächst entstand aus diesem Hox3-Gen das Ortholog zerknüllt (zen), welches die ursprüngliche Funktion eines Hox-Gens, nämlich die Spezifizierung einzelner Segmentidentitäten, verloren hat (Hughes und Kaufmann, 2002). Im Gegensatz dazu wird zen in Insekten nun hauptsächlich für die Entstehung von extraembryonalen Membranen benötigt (Panfilio et al., 2006; Panfilio et al. 2007). Auch Drosophila besitzt ein solches zenGen und nach einem Knockout kommt es unter anderem zum Verlust der extraembryonalen Amnioserosa (Rushlow et al., 1987). 5 Einleitung In der Linie zu den höheren Dipteren kam es zu einer zusätzlichen Duplikation dieses zenGens aus welcher dann bicoid entstanden ist (Stauber et al., 1999). Durch seine Funktionen als Transkriptionsaktivator (Driever und Nüsslein-Volhard, 1989; Struhl et al., 1989) und Translationsinhibitor (Rivera-Pomar et al., 1996; Dubnau und Struhl et al., 1996) beeinflusst bicoid die Embryonalentwicklung nicht nur in bestimmten Regionen, sondern entlang der gesamten anterior-posterioren Achse. Bis heute ist es außerdem das einzige Protein für das nachgewiesen wurde, dass es mit Hilfe seiner Homeodomäne die Translation einer mRNA, nämlich der von Dm'cad, im anterioren Bereich des Embryos inhibieren kann (Dubnau und Struhl, 1996; Baird-Titus et al., 2006). Die Translationsreprimierung erfolg dabei durch die Bindung der Dm'BCD Homeodomäne an sogenannte Bicoid response elements (BRE) innerhalb der 3'UTR der Dm'cad mRNA (Dubnau und Struhl, 1996). Dm'BCD interagiert dann mit seinem Cofaktor d4EHP, welcher an die 5'Cap der Dm'cad mRNA bindet (Cho et al., 2005). Durch diese Interaktion wird verhindert, dass der Translationsinitiator deIF4E an die 5'Cap der Dm'cad mRNA bindet und mit Hilfe weiterer Faktoren, wie dem Adapterprotein eIF4G, die Translation des Dm'CAD Proteins startet (Cho et al., 2005). Außerdem konnte nachweisen werden, dass für die Funktion als Translationsinhibitor ein bestimmtes Arginin an Position 54, innerhalb der Homeodomäne von Dm'BCD, von ausschlaggebender Bedeutung ist (Niessing et al., 2000). Wird dieses Arginin mutiert ist Dm'BICOID zwar in der Lage weiter als Transkriptionsfaktor zu wirken, die Reprimierung der Dm'cad Translation kann jedoch nicht mehr statt finden (Niessing et al., 2000). 1.3.4 Hierarchische Genkaskaden führen zur Segmentierung des Drosophila Blastoderms Nach der Etablierung der embryonalen, anterior-posterioren Achse durch die maternalen Protein-Gradienten kommt es im Lauf der weiteren Segmentierung des Embryos zunächst zur Aktivierung der zygotischen Gap-Gene (Rivera-Pomar und Jäckle, 1996). Durch die Kombination der maternalen Protein-Gradienten und einem zusätzlichen Einfluss ihrer Konzentrationen werden Positionsinformationen an die einzelnen Zellen übermittelt, wodurch in bestimmten Bereichen innerhalb des Blastoderms spezifische Gap-Gene aktiviert werden (Rivera-Pomar und Jäckle, 1996; Jäger, 2011). Neben den terminalen Gap-Genen huckebein und tailless, welche durch das terminale System aktiviert werden (Nüsslein-Volhard, 1991; Li et al., 2011), werden die weiteren Gap- 6 Einleitung Gen-Domänen im Blastoderm vornehmlich durch bicoid, hunchback und caudal definiert (Rivera-Pomar und Jäckle, 1996). Anterior aktiviert BCD die zygotische hunchback Expressionsdomäne (Driever und NüssleinVolhard, 1989; Struhl et al., 1989; Rivera-Pomar und Jäckle, 1996). Die Expression von Krüppel (Kr) wird ebenfalls von BDC aktiviert, allerdings wird hier zusätzlich HB benötigt (Hoch et al., 1991; Schulz und Tautz, 1994; Rivera-Pomar und Jäckle, 1996). Durch eine Kombination von BCD und CAD kommt es zur Aktivierung von knirps und giant (gt) (Schulz und Tautz, 1995; Rivera-Pomar et al., 1995). In dieser Situation zeigt sich jedoch, dass CAD in der Fliege posterior nicht die gleiche wichtige Musterbildungsfunktion erfüllt wie BCD dies anterior übernimmt (Rivera-Pomar und Jäckle, 1996). Denn nach einem Knockout von Dm'cad ist BCD teilweise in der Lage die Funktionen von CAD zu übernehmen und so dafür zu sorgen, dass Segmentierungs-Gene wie giant und knirps posterior trotzdem exprimiert werden und es zumindest teilweise zu posteriorer Segmentierung kommt (Rivera-Pomar et al., 1995; Rivera-Pomar und Jäckle, 1996). Nach der Aktivierung durch maternale Faktoren beeinflussen sich die Gap-Gene zudem, vornehmlich reprimierend, noch gegenseitig um ihre genauen Expressionsdomänen zu definieren (Rivera-Pomar und Jäckle, 1996; Niessing et al., 1997). Ist dies geschehen kann die nächste Gen-Klasse innerhalb der Segmentierungs-Kaskade aktiviert werden: die Paarregel-Gene. Paarregel-Gene werden im Drosophila-Blastoderm in sieben Streifen entlang der anterior-posterioren Achse exprimiert und können in primäre (hairy (h), runt (run) und even-skipped (eve)) und sekundäre Paarregel-Gene (fushi-tarazu (ftz), odd-skipped (odd), odd-paired (opa), sloppy-paired (slp) und paired (prd)) unterteilt werden (Ingham, 1988; Small und Levine, 1991). Diese Unterteilung geschieht aufgrund der Aktivierungsmechanismen der einzelnen Gene (Ingham, 1988; Small und Levine, 1991). Primäre Paarregel-Gene werden durch Gap-Gene und maternale Faktoren reguliert, wohingegen die sekundären Paarregel-Gene ihre regulatorischen Signale vornehmlich durch die primären Paarregel-Gene erhalten (Ingham, 1988; Small und Levine, 1991). Die Aktivierung der einzelnen Streifen erfolgt zudem streifenspezifisch was bedeutet, dass einzelne Streifen durch spezifische Kombinationen von Genen reguliert werden (Small et al., 1992; Häder et al., 1998). Die Expression des zweiten eve Streifens wird beispielsweise durch eine Kombination von bcd und hb aktiviert und seine Expansion nach anterior und posterior durch gt bzw. Kr reprimiert (Small et al., 1991; Small et al. 1992). Ein weiteres Beispiel dieses Mechanismus liefert das primäre Paarregel-Gen hairy dessen sechster Streifen durch das Gap-Gen kni aktiviert wird, Streifen sieben jedoch über eine Kombination aus cad und Kr (Pankratz et al., 1990; La Rosée et al., 1997; Häder et al., 1998). 7 Einleitung Mutanten der Paarregel-Gene zeigen in larvalen Phänotypen den Verlust von alternierenden Segmenten, sodass entweder geradzahlige oder ungeradzahlige Segmente fehlen (Nüsslein-Volhard und Wieschaus, 1980). Da die Expressionsdomänen der einzelnen Paarregel-Gene gegeneinander verschoben sind kann im weiteren Verlauf der Segmentierung durch ihre Überlappung und spezifische Kombination die Aktivierung der segmental exprimierten Segmentpolaritäts-Gene, wie wingless (wg) oder engrailed (en), erfolgen (Ingham et al., 1988; DiNardo und O'Farrell, 1987). Durch die gegenseitige Regulierung der Segmentpolaritäts-Gene untereinander werden zunächst die Parasegmentgrenzen und ein wenig später, posterior der en exprimierenden Zellen, die Grenzen der funktionalen Segmente festgelegt (Martinez-Arias und Lawrence, 1985; DiNardo und O'Farrell, 1987; Martinez-Arias et al., 1988; Ingham und Martinez-Arias, 1992; Lawrence und Struhl, 1996). Die letzte Genklasse, welche für die Musterbildung in Drosophila essentiell ist, sind die HoxGene (Lewis, 1978). Diese Transkriptionsfaktoren legen in späteren Stadien der embryonalen Entwicklung die Identität der einzelnen Segmente entlang der anteriorposterioren Achse fest (Ingham, 1988; Garcia-Fernandes, 2005). So kommt es nach einem Ausfall von Hox-Genen zur homeotischen Transformation eines Segments in die Identität eines anderen (Ingham, 1988; Garcia-Fernandes, 2005). Hox-Gene sind im Tierreich hoch konserviert und im Genom als Cluster organisiert (Akam, 1989; McGinnis und Krumlauf, 1992). Die Expression der einzelnen Hox-Gene entlang der a-p-Achse des Embryos entspricht dabei ihrer Anordnung innerhalb des genomischen Clusters, was als sogenannte Kolinearität bezeichnet wird (Ferrier und Minguillón, 2003). In Drosophila existieren zwei Hox-Cluster mit insgesamt acht homeotischen Genen (Ferrier und Minguillón, 2003). Die Gene des Antennapedia-Komplexes spezifizieren die Segmente von Kopf und Thorax, die abdominalen Segmente werden mit Hilfe des Bithorax Komplexes gebildet (McGinnis und Krumlauf, 1992; Ferrier und Minguillón, 2003). Reguliert werden die Expressionsdomänen der Hox-Gene in Drosophila hauptsächlich über die Gap- und Paarregel-Gene (Harding und Levine, 1988; Irish et al., 1989; Jack und McGinnis, 1990). Trotz der sehr gut untersuchten und verstandenen Mechanismen während der Entwicklung von Drosophila melanogaster ist die Taufliege jedoch nur eingeschränkt nutzbar um die allgemeinen Entwicklungsmechanismen von Insekten zu erforschen, da sie sich als Langkeim-Insekt entwickelt. Wie bereits erwähnt stellt diese Embryonalentwicklung unter den Insekten eine sehr spezialisierte Variante der Embryogenese dar (Tautz et al., 1994; Davis und Patel, 2002) und ist somit nicht auf die meisten Insekten übertragbar, da diese sich nach dem mehr basalen Mechanismus als Kurzkeim-Embryo entwickeln (Bucher und Klingler 2004). 8 Einleitung Somit war es erforderlich weitere Modellorganismen zu etablieren, die die mehr basaleren Entwicklungsmechanismen repräsentieren. In den letzten Jahrzehnten hat sich hier vor allem Tribolium castaneum hervor getan (Klingler, 2004; Richards et al., 2008). 1.4 Tribolium castaneum - Ein Vertreter der Kurzkeim-Entwicklung Der rotbraune Reismehlkäfer Tribolium castaneum gehört innerhalb der Coleoptera zur Familie der Schwarzkäfer (Tenebrionidae) und seine Embryonalentwicklung entspricht der Kurzkeim-Entwicklung Modellorganismus hat (Davis er und sich Patel, 2002; jedoch nicht Rosenberg nur et al., aufgrund 2009). seines Als basalen Entwicklungsmechanismus durchgesetzt. Der Käfer bietet zum Beispiel auch den Vorteil, dass die Entwicklung von Kopf und Extremitäten bereits während der Embryonalentwicklung untersucht werden kann (Klingler, 2004). Dies ist in Drosophila nicht möglich, da der larvale Kopf invaginiert ist und sich die Beine erst im Übergang zum adulten Tier ausbilden (Klingler, 2004). Zudem ist es möglich in Tribolium die zwei extraembryonalen Membranen, Amnion und Serosa, getrennt voneinander zu untersuchen, da diese nicht wie in der Fliege zu einem einzigen Gewebe, der Amnioserosa, fusioniert sind (Handel et al., 2000; Schmitt-Ott, 2000). Darüber hinaus konnten bis heute mehrere molekular-genetische Modifikations-Methoden für Tribolium etabliert werden, um die Entwicklungsmechanismen besser untersuchen zu können. Es besteht die Möglichkeit Mutanten-Stämme oder Keimbahntransformationen zu generieren, durch parentale RNA Interferenz (RNAi) ist es möglich einen Knockdown spezifischer Gene zu erzielen, wie dies großflächig im iBeetle-Screen durchgeführt wurde, und auch ein Gal4/UAS-System existiert (Bucher et al., 2002; Lorenzen et al., 2003; Klinger 2004; Schinko et al., 2010; Schmitt-Engel et al., 2015). 2008 wurde zudem sein Genom vollständig sequenziert (Richards et al., 2008). All dies macht Tribolium castaneum heute zu einem der wichtigsten Vertreter der Kurzkeim-Insekten unter den Modellorganismen. 1.4.1 Zygotische Regulationsmechanismen während der Segmentierung von Tribolium Die Mechanismen während der Entwicklung von Tribolium castaneum sind natürlich noch nicht so detailliert verstanden wie in Drosophila. Trotzdem können anhand der bisher gewonnenen Daten bereits Ähnlichkeiten aber auch Unterschiede ausgemacht werden. Auf Ebene der Expressionsdomänen zeigen sich, auf Grund des anderen Entwicklungsmechanismus von Tribolium, deutliche Veränderungen in den meisten Genklassen. Da die Segmente im Kurzkeim-Embryo erst während der fortschreitenden Entwicklung aus der posterioren Wachstumszone gebildet werden, können natürlich nicht 9 Einleitung alle Streifen bzw. Expressionsdomänen der einzelnen Gene gleichzeitig entstehen, wie dies in Drosophila der Fall ist. Bezüglich der Genfunktionen können vor allem in späteren Stadien der Entwicklung die meisten Übereinstimmung zwischen den beiden Spezies gefunden werden. In Tribolium werden die Segmentidentitäten, wie auch in Drosophila, durch die homeotischen Gene festgelegt (Stuart et al., 1991; Beeman et al., 1993; Dennell et al., 1996). Im Käfer existiert jedoch nur ein Hox-Komplex der alle acht homeotischen Gene beinhaltet (Brown et al., 2002; Shippy et al., 2008). Ihre Expressionen zeigen jedoch ebenfalls eine Kolinearität entlang der a-p-Achse und bisherige Erkenntnisse sprechen dafür, dass ihre Regulation vor allem durch Gap-Gene erfolgt (Cerny et al., 2005; Marques-Souza et al., 2008). Orthologe der Segmentpolaritäts-Gene wg und en wurden in Tribolium ebenfalls bereits beschrieben (Brown et al., 1994; Nagy und Carroll, 1994). Ihre Expressionsdomänen werden durch die Paarregel-Gene aktiviert und reguliert (Choe et al., 2006; Choe und Brown, 2007, 2009), zudem legen sie, wie in Drosophila, zunächst die Parasegmentgrenzen fest (Choe und Brown, 2009). Auf Ebene der Paarregel-Gene zeigen sich hingegen schon deutliche Unterschiede zwischen Tribolium und Drosophila. Im Käfer wird ebenfalls zwischen primären und sekundären Paarregel-Genen unterschieden, jedoch stellen hier Tc'eve, Tc'run und Tc'odd die primären, und Tc'prd und Tc'slp die sekundären Paarregel-Gene dar (Choe et al., 2006). Neben diesen fünf Genen existieren zudem noch Tc'hairy und Tc'fushi-tarazu, welche ebenfalls in einem Paarregel-Gen-Muster exprimiert sind, jedoch scheinbar nicht für die Segmentierung von Tribolium benötigt werden (Stuart et al., 1991; Sommer und Tautz, 1993; Brown et al., 1994; Aranda et al., 2008). Wie genau die primären Paarregel-Gene in Tribolium aktiviert werden ist bisher noch nicht vollständig verstanden. Es existieren Hinweise darauf, dass vielleicht Gap-Gene wie Tc'hunchback (Tc'hb) oder Tc'giant (Tc'gt) an ihrer Regulation beteiligt sind (A. Cerny, 2007) und für Tc'hairy wurde eine streifenspezifische Regulation, ähnlich zu Drosophila, postuliert (Small et al., 1992; Häder et al., 1998; Eckert et al., 2004). Zudem konnte auch ein Einfluss von Tc'cad besonders auf die Expression von Tc'eve nachgewiesen werden (Schoppmeier et al., 2009; El-Sherif et al., 2014). Nach ihrer Aktivierung kommt es zunächst zur Regulation der primären PaarregelGene untereinander, welche dann im Folgenden die Expressionsdomänen der sekundären Paarregel-Gene Tc'slp und Tc'prd aktivieren und regulieren (Choe et al., 2006). 2012 konnten außerdem oszillierende Genaktivitäten für Tc'eve und Tc'odd gezeigt werden, was darauf hin deutet, dass die Segmentierung in Tribolium ähnlich wie in der VertebratenSomitogenese auf einer Art "segmentation clock" beruht (McGrew und Pourquié, 1998; Dequéant et al., 2006; Choe und Brown, 2009; Sarrazin et al., 2012; El-Sherif et al., 2012). 10 Einleitung Die larvalen Phänotypen nach dem Verlust einzelner Paarregel-Gene unterscheiden sich in Tribolium teilweise von jenen in der Fliege. Ein Knockdown der sekundären Paarregel-Gene Tc'prd und Tc'slp zeigt mit dem Verlust von allen gerad- bzw. ungeradzahligen Segmenten einen ähnlichen Paarregel-Gen-Phänotyp wie er auch aus schwachen Paarregel-GenMutanten in Drosophila bekannt ist (Nüsslein-Volhard und Wieschaus, 1980; Coulter und Wieschaus, 1988; Maderspacher et al., 1998; Choe und Brown, 2007). RNAi gegen die primären Paarregel-Gene verursacht hingegen einen kompletten Abbruch der Segmentierung (Choe et al., 2006). Die Analysen der Gap-Gen-Orthologen in Tribolium Tc'hb (Wolff et al., 1995), Tc'gt (Bucher und Klingler, 2004), Tc'kni (Cerny et al., 2008) und Tc'Kr (Sommer und Tautz, 1993; Cerny et al., 2005) ergaben ebenfalls Unterschiede zu den Expressions- und Regulations-Daten aus Drosophila. Grundsätzlich sind die Gap-Gene in Tribolium, wie auch in der Fliege (Hülskamp und Tautz, 1991), in breiten Domänen exprimiert, die mehrere Segmentanlagen überspannen (Sommer und Tautz, 1993; Wolff et al., 1995; Bucher und Klinger, 2004; Cerny et al., 2005; Cerny et al., 2008; Marques-Souza et al., 2008). Auf Grund der Kurzkeim-Entwicklung werden die abdominalen Expressionsdomänen von Tc'hb, Tc'gt und Tc'kni jedoch erst später während des Auswachsens des Keimstreifs gebildet (Wolff et al., 1995; Bucher und Klingler, 2004; Davis und Patel, 2002; Cerny et al., 2008; Marques-Souza et al., 2008). Die Domänen der einzelnen Gap-Gene in Tribolium korrelieren außerdem nicht genau mit der Position der Orthologen in Drosophila, sondern sind im Anlagenplan meist etwas verschoben (Wolff et al., 1995; Bucher und Klinger, 2004; Cerny et al., 2005; Cerny et al., 2008; Marques-Souza et al., 2008). Auch in Tribolium existieren gegenseitige Interaktionen und Regulationsmechanismen zwischen den Gap-Genen (Cerny et al., 2005; Marques-Souza et al., 2008). Tc'Kr wird beispielsweise ebenfalls durch hunchback aktiviert, was im Folgenden zur Aktivierung von Tc'kni führt (Cerny, 2007; Marques-Souza et al., 2008), zudem wird die anteriore Tc'Kr Grenze, wie auch in Drosophila, von Tc'gt inhibiert (Rivera-Pomar und Jäckle, 1996; Niessing et al., 1997; Cerny et al., 2005). Andererseits zeigen sich jedoch auch Unterschiede im Vergleich mit der Fliege, so wird Tc'Kr etwa für die Aktivierung der posterioren Tc'gt Domäne benötigt (Cerny, 2007) was in Drosophila nicht der Fall ist (Niessing et al., 1997). Ein Knockdown von Gap-Genen wie Tc'hb, Tc'gt und Tc'Kr führt in Tribolium zu homeotischen Transformationen und Segmentierungsabbrüchen (Bucher und Klingler, 2004; Cerny et al., 2005; Marques-Souza et al., 2008). Lediglich nach dem Knockdown von Tc'kni kommt es zum Verlust jener Segmente in welchen Tc'kni auch exprimiert ist (Cerny et al., 11 Einleitung 2008), was dem typischen Gap-Phänotyp aus Drosophila entspricht (Hülskamp und Tautz, 1991). Die Tatsache, dass es in Tribolium jedoch meist zu homeotischen Transformationen kommt zeigt, dass die Gap-Gene eine entscheidende Funktion bei der Aktivierung und Positionierung der Hox-Gen-Domänen besitzen (Cerny et al., 2005; Marques-Souza et al., 2008). Dies ist auch in Drosophila der Fall, jedoch überdecken hier, aufgrund der LangkeimEntwicklung, die Segmentdeletionen diese Funktion der Gap-Gene (White und Lehmann, 1986; Harding und Levine, 1988; Irish et al., 1989; Hülskamp und Tautz, 1991; Casares und Sánchez-Herrero, 1995; Davis und Patel, 2002). Die initiale Aktivierung der Gap-Gene muss sich in Tribolium grundsätzlich von den Machanismen in Drosophila unterscheiden, da der Hauptfaktor der embryonalen Musterbildung in der Fliege, Dm'BICOID, wie bereits erwähnt außerhalb der höheren Dipteren und somit auch in Tribolium nicht existiert (Stauber et al., 1999; Brown et al., 2001). Analysen von Tc'hb-lacZ-Konstrukten in Drosophila ergaben, dass die embryonale Tc'hb Domäne wohl durch caudal aktiviert wird (Wolff et al., 1995; Wolff et al., 1998), somit würde Tc'cad die bicoid Funktion bezüglich der Aktivierung der Gap-Gen-Kaskade in Tribolium übernehmen. Die Abwesenheit von bicoid in Tribolium erfordert zudem generell andere Regulationsmechanismen um die korrekte früh embryonale Musterbildung im Käfer zu gewährleisten. Wie dies geschieht soll im folgenden Abschnitt erläutert werden. 1.4.2 Früh embryonale Musterbildungsprozesse im Käfer und das Tc'zen2/Tc'Mex3/Tc'cad - System Die frühen Musterbildungs-Prozesse entlang der anterior-posterioren Achse im TriboliumBlastoderm sind bis heute nicht im gleichen Maße verstanden wie dies in Drosophila der Fall ist. Allerdings kann man auch hier zwischen verschiedenen Systemen unterscheiden, welche teilweise sogar mit den Mechanismen in der Fliege überein stimmen. Die terminalen Strukturen werden, wie in der Fliege, auch in Tribolium über ein terminales System und die Faktoren torso-like und torso spezifiziert (Schoppmeier und Schröder, 2005). Aufgrund der Kurzkeim-Entwicklung und des daraus resultierenden veränderten Anlagenplans in Tribolium sind es hier jedoch anterior die extraembryonale Serosa und posterior die Wachstumszone deren Entstehung durch das terminale System beeinflusst wird (Schoppmeier und Schröder, 2005). Anterior aktiviert das terminale System zusammen mit Tc'orthodenticle (Tc'otd) die Expression von Tc'zerknüllt1 (Tc'zen1) (Schoppmeier und Schröder, 2005; Kotkamp et al., 2010), welches für die Spezifizierung und Ausbildung der extraembryonalen Serosa verantwortlich ist (van der Zee et al., 2005). Posterior werden durch das terminale System Faktoren wie beispielsweise Tc'wg und Tc'cad reguliert, sodass 12 Einleitung es nach einem Knockdown von torso-like bzw. torso zu frühen Segmentierungsabbrüchen kommt, weil die posteriore Wachstumszone nicht mehr gebildet wird (Schoppmeier und Schröder, 2005). Da das Morphogen bicoid in Tribolium nicht existiert müssen seine Funktionen im Käfer durch andere Gene übernommen werden (Driever und Nüsslein-Volhard, 1988; Struhl et al., 1989; Stauber et al., 1999; Brown et al., 2001). 2003 wurde postuliert, dass Tc'otd-1 und Tc'hb die frühe Musterbildungs-Funktion in den Kopf- und thorakalen Anlagen im Tribolium-Blastoderm übernehmen (Schröder et al., 2003). Sowohl Tc'otd-1 als auch Tc'hb sind zunächst maternal ubiquitär exprimiert (Wolff et al., 1995; Schröder et al., 2003). Im weiteren Verlauf der Entwicklung bildet Tc'otd dann einen Gradienten von anterior nach posterior und ist im differenzierten Blastoderm in einer zentral gelegenen dreieckigen Domäne exprimiert, die die Kopfanlagen markiert (Li et al., 1996; Schröder et al., 2003). Die Tc'hb mRNA bildet im differenzierten Blastoderm ebenfalls eine zentral gelegene embryonale Expressionsdomäne aus und ist zudem anterior in der extraembryonalen Serosa vorhanden (Wolff et al., 1995). Nach Tc'otd-1 RNAi kommt es in Tribolium-Larven zu stark reduzierten und teilweise vollständig fehlenden Köpfen (Schröder et al., 2003). Durch den zusätzlichen Knockdown von Tc'hb lässt sich dieser Phänotyp noch verstärken, sodass Kopf, Thorax und sogar abdominale Segmente verloren gehen (Schröder et al., 2003). Dieser Phänotyp ähnelt den Phänotypen von Dm'bcd Mutanten (Driever und Nüsslein-Volhard, 1988) weshalb vermutet wurde, dass Tc'otd-1 und Tc'hb die Dm'bcd Funktion der frühen Musterbildung in Tribolium übernehmen (Schröder et al., 2003; Marques-Souza et al., 2008). Inzwischen konnte diese Hypothese jedoch wiederlegt werden (Kotkamp et al., 2010). Der Verlust von anterioren Segmenten geht wohl viel mehr auf eine Kombination der beiden Einzelphänotypen zurück (Marques-Souza et al., 2008; Schinko et al., 2008; Kotkamp et al., 2010). Zum einen besitzt das früh ubiquitär exprimierte Tc'otd-1 wohl einen Einfluss auf die dorso-ventrale Musterbildung, wobei der Gradient aber keine Rolle zu spielen scheint (Kotkamp et al., 2010). Ein Knockdown von Tc'otd-1 löst die Dorsalisierung des Embryos aus (Kotkamp et al., 2010). Da die Kopf-Anlage in Tribolium castaneum, aufgrund seines Anlagenplans, eine ventrale Struktur darstellt, kommt es somit in Folge dieser Dorsalisierung zum Verlust von Kopfstrukturen (Kotkamp et al., 2010). Zum anderen kann der scheinbare Verlust thorakaler Segmente durch die homeotischen Transformationen von Thorax hin zu abdominaler Identität erklärt werden, welche nach Tc'hb RNAi auftreten (Marques-Souza et al., 2008). Es bleibt also noch immer offen welche Faktoren in Tribolium die Morphogen-Funktion von Dm'bicoid übernehmen. 13 Einleitung Bezüglich der zweiten Funktion von BICOID, nämlich der Repression der Tc'cad Translation (Rivera-Pomar et al., 1996; Dubnau und Struhl et al., 1996), konnten die Faktoren in Tribolium bereits identifiziert werden (Schoppmeier et al., 2009) 2009 wurde gezeigt, dass diese Funktion im anterioren Bereich des Tribolium Blastoderms durch die zwei zygotischen Gene Tc'zerknüllt2 (Tc'zen2) und Tc'Mex3 gewährleistet wird (Schoppmeier et al., 2009). Tc'Mex3 ist im differenzierten Blastoderm zentral in einer dreieckigen Domäne, direkt posterior der extraembryonalen Serosa exprimiert, welche die Anlagen des zukünftigen Kopfes markiert (Schoppmeier et al., 2009). Nach dem Knockdown von Tc'Mex3 kommt es zunächst zur Ausbreitung des Tc'CAD Proteins in diesen Bereich und folglich zu Verlusten von blastodermalen Tc'wg und Tc'eve Expressionsdomänen, was letztendlich in den stärksten larvalen Phänotypen zum vollständigen Verlust des Kopfes führt (Schoppmeier et al., 2009). Tc'zen2 inhibiert die Translation von Tc'cad im extraembryonalen Gewebe der anterior gelegenen Serosa (van der Zee et al., 2004; Schoppmeier et al., 2009). Werden sowohl Tc'Mex3 als auch Tc'zen2 durch RNAi herunter reguliert, wird das Tc'CAD Protein im gesamten Embryo entlang der anterior-posterioren Achse exprimiert (Schoppmeier et al., 2009). Tc'zen2 hat seinen Ursprung, wie auch Dm'bicoid, in einem anzestralen Hox3-Gen, wodurch die beiden Gene nah verwandt sind (Falciani et al., 1996; Stauber et al., 1999). Wie bereits erwähnt ist in Insekten zunächst das Hox3 Ortholog zerknüllt entstanden, welches für die Entstehung extraembryonaler Membranen benötigt wird (Panfilio et al., 2006; Panfilio et al. 2007). Durch eine unabhängige Duplikation des zen Gens, innerhalb der Linie zu Tribolium, sind dann die zwei Gene Tc'zen1 und Tc'zen2 entstanden (Brown et al., 2001). Wie auch Dm'zen und Dm'bcd liegen sie im Genom innerhalb des homeotischen Komplexes (Falciani et al., 1996; Stauber et al., 1999; Brown et al., 2001). Im Tribolium-Blastoderm werden beide Gene in der anterioren Serosa exprimiert, wo sie teilweise ähnliche Aufgaben übernehmen wie zen und bicoid in Drosophila (Falciani et al., 1996; van der Zee et al., 2004). Tc'zen1 wird weiterhin, wie das ursprüngliche Insekten zen-Gen, für die Spezifizierung der extraembryonalen Serosa benötigt und ein Knockdown führt zum fast vollständigen Verlust dieser Struktur (van der Zee et al., 2005; Panfilio et al., 2006; Panfilio et al. 2007). Tc'zen2 hat hingegen keinen Einfluss auf die Bildung der Serosa sondern sorgt, wie bereits erwähnt, in diesem Gewebe für die Translationsinhibierung von Tc'cad (van der Zee et al., 2005; Schoppmeier et al., 2009) und übernimmt somit zusammen mit Tc'Mex3 eine der wichtigen Dm'bicoid Funktionen im Käfer (Rivera-Pomar et al., 1996; Dubnau und Struhl et al., 1996). Wie die zygotischen Faktoren Tc'zen2 und Tc'Mex3 aktiviert werden ist bisher nicht bekannt, 14 Einleitung zudem muss auch geklärt werden wie genau die Interaktionen innerhalb dieses "Tc'zen2/Tc'Mex3/Tc'cad - Systems" aussehen. Dies soll Hauptbestandteil dieser Arbeit sein. Neben der Repression der Tc'cad Translation in anterioren Bereichen des Embryos scheint in Tribolium zudem auch der kanonische Wnt-Signalweg für die korrekte Ausbildung der a-pMusterbildung essentiell zu sein (Schoppmeier et al., 2009; Fu et al., 2012). Wie Fu et al., 2012 zeigen konnten, muss dieser Signalweg anterior inhibiert werden um die Entstehung anteriorer Strukturen zu gewährleisten. Nach einem Knockdown des maternal anterior exprimierten negativen Wnt-Regulators Tc'axin kommt es zur Verschiebung des embryonalen Anlagenplans, was unter anderem auch durch eine Expansion der Tc'cad Expression nach anterior zu erkennen ist (Fu et al., 2012). Diese Verschiebung resultiert letztendlich in Larven, welchen anteriore Strukturen wie Kopf und Thorax bis hin zu abdominalen Segmenten fehlen (Fu et al., 2012). Eine solch wichtige Beteiligung des WntFunktionsgradienten bei der frühen Achsen-Determinierung ist unter anderem auch für Vertebraten, nicht aber in Drosophila, bekannt (Petersen und Reddien, 2009). Neben Tc'axin sind in Tribolium, mit Tc'eagle (Tc'eg) und Tc'pangolin (Tc'pan), noch zwei weitere Gene bekannt deren mRNAs bereits früh im Ei am anterioren Pol lokalisiert werden (Bucher et al. 2005; Fu et al., 2012). Allerdings konnte für beide Gene keine Beteiligung bei der blastodermalen Musterbildung nachgewiesen werden (Bucher et al., 2005). Ebenso wie in Drosophila, scheint jedoch auch Tc'nanos eine Rolle bei der embryonalen Musterbildung entlang der anterior-posterioren Achse im Käfer zu spielen (Schmitt-Engel et al., 2012). Zusammen mit Tc'pumillio ist es für die posteriore Translationsrepression von maternalem Tc'hb und die Expression der Tc'gt Domäne zuständig (Schmitt-Engel et al., 2012). Durch diese Funktionen sind die beiden Gene letztendlich an der korrekten Expression weiterer Gap-Gene im Tribolium Blastoderm beteiligt (Schmitt-Engel et al., 2012). Im Gegensatz zu Drosophila konnte bisher jedoch keine Lokalisation der Tc'nanos mRNA nachgewiesen werden (Schmitt-Engel et al., 2012). Außerdem zeigt sich, dass Tc'nanos und Tc'pumillio nicht nur für die Ausbildung abdominaler Segmente benötigt werden, sondern auch für die korrekte anteriore Musterbildung, da es nach einem gleichzeitigen Knockdown beider Gene auch zu Transformationen und Verlusten von prägnathalen und gnathalen Segmenten kommt (Schmitt-Engel et al., 2012). Wie die frühe Festlegung der embryonalen Achsen schon während der Oogenese in Tribolium castaneum erfolgt ist bis heute, im Gegensatz zu Drosophila, noch nicht genau verstanden. In Drosophila erfolgt der erste Symmetriebruch durch die asymmetrische Wanderung des Oozyten-Kerns und die gleichzeitige Sezernierung des EGF-Liganden Dm'GURKEN (González-Reyes et al., 1995; Roth und Lynch, 2009). Auch in Tribolium 15 Einleitung konnte ein gurken-ähnliches tgfα-Gen gefunden werden, welches bereits in der Oozyte exprimiert wird (Lynch et al., 2010). Und Analysen der EGF-Aktivität und der Auswirkungen von Tc'tgfα RNAi zeigen, dass auch in Tribolium die spätere dorsale Seite durch die Position des Oozyten-Nukleus festgelegt wird und es nach Tc'tgfα RNAi zu Defekten in der embryonalen dorso-ventralen-Polarität kommt (Lynch et al., 2010). Die anterior-posteriore Polarität war nach Tc'tgfα RNAi jedoch hauptsächlich in Oozyten gestört, wohingegen blastodermale Stadien kaum Defekte in der a-p-Musterbildung zeigten (Lynch et al., 2010). Somit bleiben weiterhin noch viele Fragen zu beantworten, wie genau die frühe AchsenDetermination in Tribolium castaneum erfolgt. 1.4.3 Caudal Funktion in Tribolium Für die korrekte anteriore Musterbildung in Tribolium scheint es von entscheidender Bedeutung zu sein, die Tc'CAD Expression in anterioren blastodermalen Bereichen zu reprimieren (Schoppmeier et al., 2009; Fu et al., 2012). Zudem entsteht durch diese Mechanismen, wie auch in Drosophila, ein Tc'CAD-Protein Gradient von posterior nach anterior, der im Folgenden für die Musterbildungsprozesse in posterioren Bereichen ausschlaggebend ist (McDonald und Struhl, 1986; Schulz et al., 1998; Copf et al., 2004; van der Zee et al., 2005; Schoppmeier et al., 2009; El-Sherif et al., 2014). Dass Tc'caudal hierbei in Tribolium einen äußerst wichtigen Faktor darstellt, belegen auch die extrem starken Phänotypen nach Tc'cad RNAi (Copf et al., 2004; Schoppmeier et al., 2009). Schon die injizierten Weibchen zeigen einen Ovar-Defekt, welcher zu einer stark reduzierten Eiablage führt. Zudem bestehen Embryonen, welche sich dennoch entwickeln nur aus den anterioren Kopfanhängen Labrum und Antennen und bilden nur noch selten eine Kutikula aus (Copf et al., 2004; Schoppmeier et al., 2009). Diese Phänotypen gehen auf die Tatsache zurück, dass caudal in Tribolium in verschiedensten Stadien der Entwicklung wichtige Funktionen übernimmt (Copf et al., 2004; Schoppmeier et al., 2009; El-Sherif et al., 2014). Zum einen ist es bereits während der Oogenese von Nöten, was nach einem Knockdown zu den oben beschriebenen Legedefekten führt. Zum anderen muss die Translation des maternalen Tc'cad in anterioren blastodermalen Regionen durch Tc'zen2 und Tc'Mex3 inhibiert werden, um korrekte Musterbildungsprozesse und die Etablierung der Wachstumszone zu gewährleisten (Schoppmeier et al., 2009; El-Sherif et al., 2014). Dieser Einfluss auf die frühe blastodermale Musterbildung konnte bereits durch Analysen des Paarregel-Gens Tc'eve, nach Tc'cad RNAi, nachgewiesen werden (Schoppmeier et al., 2009; El-Sherif et al., 2014). Nach dem Knockdown von Tc'cad zeigen sich Verschiebungen und Verluste der Tc'eve Expressionsdomänen (Schoppmeier et al., 2009; El-Sherif et al., 16 Einleitung 2014). Hierbei scheint die Expressionsstärke und -ausbreitung des Tc'CAD Proteins von Bedeutung zu sein (El-Sherif et al., 2014). Nach El-Sherif et al., 2014, wird zum einen die Position des ersten Tc'eve Streifens durch die anteriore Grenze des Tc'CAD Gradient definiert. Kommt es beispielsweise zu einer Verringerung von Tc'CAD und somit zu einer Verschiebung seiner anterioren Grenze nach posterior, wird auch der erste Tc'eve Streifen nach posterior verschoben sein (El-Sherif et al., 2014). Zum anderen wurde postuliert, dass auch die Breite der Tc'eve Streifen vom Tc'CAD Gradienten, und hier vor allem von seiner Steilheit, abhängt (El-Sherif et al., 2014). Nach einer Verringerung der Tc'CAD Konzentration, was zu einem flacheren Gradienten führt, kommt es nach El-Sherif et al., 2014, durch die langsamere Oszillation der Tc'eve exprimierenden Zellen zu breiteren Tc'eve Streifen. Im umgekehrten Fall, wenn mehr Tc'CAD vorhanden ist, der Gradient somit steiler und die Oszillation schneller, zeigen sich schmalere Tc'eve Streifen verglichen mit dem Wildtyp (El-Sherif et al., 2014). Es scheint also Hinweise darauf zu geben, dass die Expressionsstärke von Tc'CAD während der frühen Musterbildungsprozesse in Blastodermstadien eine Rolle spielt. Zudem konnte auch gezeigt werden, dass CAUDAL in der Promoter-Region des Gap-Gens Tc'hunchback binden kann (Wolff et al., 1998). Es ist somit möglich, dass Tc'CAD über die Aktivierung von Tc'hb auch zur korrekten Ausbildung von Segmenten beiträgt (Wolff et al., 1998; Shinmyo et al., 2005). Während der weiteren Entwicklung von Tribolium ist zygotisches Tc'CAD dann kontinuierlich in der posterior gelegenen Wachstumszone der Keimstreifen exprimiert. Hier wird es für dessen Aufrechterhaltung und somit für die weitere Segmentierung benötigt (Copf et al., 2004). Wie genau diese Expressionsdomäne in Tribolium reguliert wird ist noch nicht genau bekannt, aber der Wnt-Signalweg scheint daran beteiligt zu sein (Fu et al., 2012; Oberhofer et al., 2014). 1.5 Caudal in anderen Spezies Nicht nur in Tribolium ist caudal für die posteriore Musterbildung von entscheidender Bedeutung (Copf et al., 2004; Schoppmeier et al., 2009), sondern auch in anderen Spezies werden caudal Homologe für die Entstehung posteriorer Strukturen benötigt (Macdonald und Struhl, 1986; Hunter und Kenyon, 1996; Pownell et al., 1996; Isaacs et al., 1998; Edgar et al., 2001; Lohnes, 2003; Shinmyo et al., 2005; Olesnicky et al., 2006). Im Fadenwurm Caenorhabditis elegans (Ce) wird die Protein-Aktivität des maternal exprimierten caudal Homologs PAL-1 im 4-Zell-Stadium zunächst auf die zwei posterioren Blastomere beschränkt, wenig später ist PAL-1 dann nur noch im posterioren Blastomer P2 exprimiert, aus welchem sich Mesoderm, posteriores Ektoderm und Keimbahn-Vorläufer 17 Einleitung entwickeln (Hunter und Kenyon, 1996). Diese Repression der PAL-1 Aktivität in anterioren Blastomeren geschieht zudem, ähnlich wie in Tribolium, unter anderem durch die Inhibition seiner Translation mittels Ce'MEX-3 (Draper et al., 1996; Huang et al., 2002). Wird Ce'mex-3 mutiert, kommt es zu einer Expansion von PAL-1 in anteriore Blastodmere, wodurch diese später ektopische Muskeln bilden (Draper et al., 1996). Zygotische PAL-1 Aktivität ist während der weiteren Entwicklung dann ebenfalls für posteriore Musterbildungsprozesse essentiell (Edgar et al., 2001). Auch in Insekten scheint die Ausbildung einer posterioren CAD-Expressionsdomäne und ihre Funktion bezüglich der posterioren Musterbildung konserviert zu sein. Im Kurzkeimer Gryllus bimaculatus (Gb) bildet maternales Gb'cad einen Gradienten von posterior nach anterior bis hinein ins Gnathum, welcher unter anderem durch die Aktivierung von Gap-Genen wie Gb'hb und Gb'Kr entscheidend zur frühen Musterbildung im Embryo beiträgt (Shinmyo et al., 2005). Zudem wurde postuliert, dass diese Aktivierung von der Gb'CAD Konzentration abhängt, da es nach Gb'cad RNAi zur Verschiebung der Gb'Kr und Gb'hb Domänen nach posterior kommt (Shinmyo et al., 2005). Somit hätte Gb'cad in der Grille eine Morphogen-Funktion inne. Die larvalen Phänotypen nach Gb'cad RNAi ähneln stark den Phänotypen aus Tribolium (Copf et al., 2004; Shinmyo et al., 2005; Schoppmeier et al., 2009). Auch hier wird in den stärksten Phänotypen keine Kutikula mehr gebildet oder es fehlen alle Segmente posterior des anterioren Kopfes (Shinmyo et al., 2005). Während des Auswachsens des Keimstreif ist zygotisches Gb'cad, wie auch in Tribolium, in der posterioren Wachstumszone exprimiert, wo es für die korrekte Bildung neuer Segmente benötigt wird (Shinmyo et al., 2005). Die Aktivierung dieser Gb'cad Domäne erfolgt über Gb'wingless Signale (Shinmyo et al., 2005). Für die Wespe Nasonia vitripennis (Nv), welche wie Drosophila zu den Langkeim-Insekten gezählt wird, konnte ebenfalls eine wichtige Funktion von Nv'cad in der frühen Musterbildung nachgewiesen werden (Olesnicky et al., 2006). Der Nv'cad Gradient bildet sich hier durch die Lokalisation der maternal bereit gestellten Nv'cad mRNA am posterioren Pol des Embryos aus und aktiviert in der Wespe Gap-Gene wie Nv'Kr und Nv'gt (Olesnicky et al., 2006). Die Nv'cad Expression reicht dabei, wie in Gryllus und Tribolium, sehr weit nach anterior und nach einem Knockdown kommt es auch in Nasonia zum Verlust von posterioren Segmenten (Olesnicky et al., 2006). Dieser Segmentverlust kann sich anterior bis in die thorakalen Segmente ausstrecken, sodass nur noch Kopfstrukturen gebildet werden (Olesnicky et al., 2006). Im Gegensatz dazu zeigen Drosophila caudal-Mutanten nur Störungen bzw. den Verlust von abdominalen Segmenten (Macdonald und Struhl, 1986). Der Einfluss von Dm'cad auf die früh-embryonale Musterbildung scheint in der Fliege also sehr viel geringer zu sein, was sich auch durch die Tatsache äußert, dass Dm'cad zwar Gap-Gene wie Dm'kni und Dm'gt 18 Einleitung reguliert, dies jedoch nur in Kombination mit Dm'bcd erfolgen kann (Rivera-Pomar et al., 1995; Shinmyo et al., 2005). Zum jetzigen Zeitpunkt besteht die Hypothese, dass die ursprünglich wichtige Musterbildungs-Funktion von caudal in der Linie zu Drosophila vom neu entstandenen Morphogen Dm'bicoid übernommen wurde und Dm'cad nur noch eine untergeordnete Rolle während der früh-embryonalen Musterbildung spielt (Driever und Nüsslein-Volhard, 1988; Struhl et al., 1989; Olesnicky et al., 2006). In Vertebraten existieren ebenfalls caudal-Homologe, die Cdx-Gene (Lohnes, 2003), für welche zum Beispiel in der Maus oder dem Krallenfrosch Xenopus nachgewiesen werden konnte, dass sie ebenfalls für die Musterbildung entlang der a-p-Achse und die Entstehung posteriorer Strukturen benötigt werden (Pownell et al., 1996; Isaacs et al., 1998; Lohnes, 2003). Die caudal-Gene scheinen somit über das gesamte Tierreich hinweg einen essentiellen Faktor in der früh-embryonalen Entwicklung darzustellen. 1.6 Ziele dieser Arbeit Um die ursprünglichen Prozesse während der früh-embryonalen Musterbildung in Insekten zu entschlüsseln ist es unbedingt nötig die Mechanismen in basalen Insekten wie Tribolium castaneum zu analysieren, da Drosophila melanogaster aufgrund des KurzkeimMechanismus und vor allem der exklusiven Anwesenheit von BICOID einen sehr speziellen Fall der Embryonalentwicklung darstellt (Stauber et al., 1999; Brown et al., 2001). Um zu verstehen welche Faktoren bei der frühen Musterbildung im Käfer beteiligt sind gibt es zum einen natürlich die Möglichkeit mit Hilfe des Kandidatengenansatzes oder groß angelegten Screening-Ansätzen, wie dem genomweiten iBeetle RNAi Screen (Schmitt-Engel et al., 2015) nach neuen, noch unbekannten Genen zu suchen. Auf der anderen Seite ist es jedoch auch von entscheidender Bedeutung ein besseres Verständnis von bereits bekannten Faktoren und Systemen, ihrer Funktion und den Interaktionen zu erlangen. Dies ist Hauptbestandteil dieser Arbeit. Das "Tc'zen2/Tc'Mex3/Tc'cad - System" in Tribolium soll näher analysiert werden. Dazu wird der embryonale Hitzeschock genutzt (Schinko et al., 2012). Die Auswirkungen der hitzeschock-induzierten Misexpression der einzelnen Faktoren, in frühen embryonalen Stadien, soll Aufschluss über ihre Funktion und weitere Erkenntnisse zu den Interaktionen innerhalb des Systems liefern. Da der embryonale Hitzeschock jedoch nicht maternal induzierbar ist, soll zudem ein maternales Misexpressions-System für Tribolium castaneum etabliert werden. Mit diesem soll es in Zukunft möglich sein Gene sehr früh in der Entwicklung, und auch lokalisiert zu misexprimieren und so ein genaueres Verständnis über ihre Funktionen zu erlangen. 19 Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1 Lösungen Alkalische Phosphatase (AP) - Färbepuffer (1ml) 100μl 1M TrisHCl pH 9,5, 50μl 1M MgCl2, 20μl 5M NaCl, 5μl 20%Tween20, 825µl MQ H2O Alkalische Phosphatase (AP) - Färbelösung (1ml) 1ml AP-Färbepuffer, 15μl NBT/BCIP (Roche) β-Gal Färbepuffer (3ml) 90µl 0,1mM K3Fe(CN)6, 90µl 0,1mM K4Fe(CN)6, 2,7µl 1M MgCl2, auffüllen mit PBT auf 3ml β-Gal Färbelösung (1ml) 1ml β-Gal Färbepuffer, 25µl 2% X-Gal Blocking Reagenz Stammlösung (10%): 5g Blocking Reagenz (Blocking Reagent, Roche) in 50ml Maleinsäurepuffer (bei 65°C lösen), pH 7-7,5 (mit NaOH) Hoyers-Medium 30g Gummi Arabicum, 16ml Glycerol, 200g Chloralhydrat, auffüllen mit H2O auf 50ml Hybridisierungslösung A (HybA) 50% Formamid (deionisiert), 5x SSC (pH 7,0); 0,2mg/ml Lachshoden DNA (gekocht und fragmentiert), 0,1mg/ml tRNA, 50μg/ml Heparin, pH 5,5 Hybridisierungslösung B (HybB) 50% Formamid, 5x SSC (pH 7,0), pH 5,5 Injektionspuffer 1,4mM NaCl, 0,7mM Na2HPO4, 0,03mM KH2O4, 4mM KCl Maleinsäurepuffer 100mM Malein Säure, 150mM NaCl, pH 7,5 (mit NaOH) 20 Material und Methoden PEMS 0,1M Pipes, 2mM MgSO4, 1mM EDTA, pH 6,9 10x PBS 1,2M NaCl, 70mM Na2HPO4, 30mM NH2PO4, pH 7,2 PBT 1x PBS mit 0,02% Tween20 TELT-Puffer (für 12 Ansätze) 100μl 1M Tris, pH 7,5 - 8, 260μl 0,5M EDTA, pH 7,5, 80μl 10% Triton, 1560μl 3,2M LiCl, 200μl Lysozym (c = 50mg/ml), 2μl RNAse (c = 10mg/ml) 20x SSC 3M NaCl, 300mM tri-Natrium-Citrat, pH 7,0 (mit HCl) 2.2 Käferhaltung Die Käfer werden auf doppelgriffigem Mehl (Rosenmühle GmbH) mit 5% Bierhefe (50g/kg, Heirler Cenovis GmbH) gehalten. Standardmäßig erfolgt die Entwicklung bei 25°C. Soll die Entwicklung beschleunigt werden, werden die Käfer auf 32°C gehalten. Auch alle Eiablagen erfolgen bei 32°C. Als Kontrolle dient meist der Wildtypstamm San Bernardino (SB-Stamm). Die Kontrolle für alle Hitzeschock Experimente ist der vermillionwhite Stamm (vw-), welcher eine Mutation im vermillion Gen (Tryptophan Oxygenase) trägt und somit weiße Augen hat (Lorenzen et al., 2002). Für die längerfristige Haltung heterozygoter, transgener Linien werden diese auf 25°C gehalten und alle drei Monate auf ihren Transformationsmarker hin selektiert. 2.3 Klonierung Die Amplifizierung der gewünschten Fragmente erfolgte mit Hilfe der Phusion HighFidelity Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt) und einem Two-Step Phusion PCR Programm. Für die 5' upstream Regionen von eagle, pangolin und exuperantia (exu) diente genomische DNA als Template für PCR I. Die anschließende zweite, nested PCR erfolgte auf PCR I. Die genauen PCR-Programme und Bedingungen sind in Tabelle 1 dargestellt. 21 Material und Methoden Phusion Two-Step PCR Programm Initiale Denaturierung 98°C Denaturierung Annealing I Elongation 98°C s. Tabelle 72°C 5x Denaturierung Annealing II Elongation 98°C s. Tabelle 72°C 25x Finale Elongation 72°C Phusion PCR Ansatz 100ng / 0,5µl genomische DNA/ PCR I 10µl 5x HF-Puffer 5µl dNTPs (2mM) 1,5µl Primer I (20µM) 1,5µl Primer II (20µM) 0,5µl Phusion DNA Polymerase auf 50µl mit H2O PCR-Bedingungen PCR I PCR II Primer: #407 + #409 Primer: #408 + #410 Annealing I: 54°C Annealing I: 56°C exu up Annealing II: 69°C Annealing II: 69°C Elongation: 4 min 10s Elongation: 3 min 50s Primer: #419 + #406 Primer: #420 + #262 Annealing I: 64°C Annealing I: 64°C eg8kb up Annealing II: 67°C Annealing II: 67°C Elongation: 5 min 20s Elongation: 4 min 40s Primer: #415 + #417 Primer: #416 + #418 Annealing I: 64°C Annealing I: 64°C pan up Annealing II: 67°C Annealing II: 67°C Elongation: 4 min Elongation: 3 min 35s Tabelle 1: PCR-Bedingungen für die Klonierung der 5' upstream Regionen. Das Gal4∆ Fragment wurde aus dem Vektor #350 pSLfa[Hsp-p-Gal4∆-SV40_attp] amplifiziert. Die Fragmente und Backbones wurden anschließend mit den spezifischen Restriktionsenzymen (New England Biolabs) verdaut und über ein Agarose-Gel und das "High Pure PCR Product Purification Kit" von Roche aufgereinigt. Mittels der T4 DNA Ligase (New England Biolabs) erfolgte dann eine gerichtete Ligation der einzelnen Komponenten (1µl T4 DNA Ligase, 2µl 10x T4 Ligase Puffer, ~100ng Vektor, 22 Material und Methoden ~120-180ng Insert, auffüllen auf 20µl mit H2O. Ligation: 1h bei Raumtemperatur; evtl. noch 16h bei 16°C). Durch Elektroporation wurden die Vektoren in elektrokompetente 'Top 10 One Shot®' Escherichia coli Zellen (Life Technologies, Darmstadt) transformiert und diese auf LB-Amp Platten ausgestrichen. Jeweils 10 Klone wurden über TELT-Minipräparationen (Laborprotokoll: "TELT-Minipreps for Plasmids modified from Tautz lab 99/ Schoppmeier 06") aufgereinigt. Durch einen Testverdau wurde überprüft, ob das Insert in den jeweiligen Klonen enthalten ist. Für je vier vielversprechende Klone wurde im Folgenden eine Plasmid-MidiPräparation (QIAfilter Plasmid Midi Kit; Qiagen, Hilden) durchgeführt und die Klone zum Sequenzieren geschickt (Seqlab, Göttingen). Aufgrund dieser Sequenzierung wurde dann jeweils der beste Klon ausgewählt und vollständig sequenziert. 2.4 Verwendete Primer Die unten aufgeführten Primer wurden für die Klonierung neuer Plasmide genutzt. Alle Primer stammen von Metabion (Planegg/Steinkirchen). Name Sequenz Schnittstelle 407-Tc-exu-up-fw1 409-Tc-exu-up-bw1 5‘- ttaaGGCCGGCCCAAATCCCCGAACCAAAA -3‘ 5‘- ttaaGCGGCCGCAGTTTGTTCTTGGGTAAAGG -3‘ Spacer, FseI, spezifische Sequenz Spacer, NotI, spezifische Sequenz 408-Tc-exu-up-fw2 410-Tc-exu-up-bw2 5‘- ttaaGGCCGGCCCGCGTGTTTGTTATTGTGA -3‘ 5‘- ttaaGCGGCCGCGTTGAGGTGTTGGGAAAG -3‘ Spacer, FseI, spezifische Sequenz Spacer, NotI, spezifische Sequenz 419-Tc-eg-up8kb-fw3 406-Tc-eg-up-bw2 5‘- ttaaGGCCGGCCGCCGAAAGGCAATTACAAAA -3‘ 5‘- ttaaGCGGCCGCACAGCATGATTGGAGGGAAC -3‘ Spacer, FseI, spezifische Sequenz Spacer, NotI, spezifische Sequenz 420-Tc-eg-up8kb-fw4 262-eg-upstream-bw 5‘- ttaaGGCCGGCCCGGCACAAAAAGCCATAACT -3‘ 5‘- ttaaGCGGCCGCGGGCAGCGCAACATTCC -3‘ Spacer, FseI, spezifische Sequenz Spacer, NotI, spezifische Sequenz 415-Tc-pan-up-fw3 417-Tc-pan-up-bw3 5‘- ttaaGGCCGGCCACCACCACGTGATTCTCTCC -3‘ 5‘- ttaaGCGGCCGCCACAGCGGCATCACACAG -3‘ Spacer, FseI, spezifische Sequenz Spacer, NotI, spezifische Sequenz 416-Tc-pan-up-fw4 418-Tc-pan-up-bw4 5‘- ttaaGGCCGGCCCACTTTGACTGGTGGCTTGA -3‘ 5‘- ttaaGCGGCCGCTCACACAGCTCTCGCTCACT -3‘ 473_Gal4+AsiSI_fw 5‘- ttaaGCGATCGCTTGCGGGGTTTTTCAGTATC -3‘ Spacer, FseI, spezifische Sequenz Spacer, NotI, spezifische Sequenz Spacer, AsiSI, spezifische Sequenz Spacer, NotI, spezifische Sequenz 474_Gal4+NotI_bw 5‘- ttaaGCGGCCGCGAGGTACACGTCTCCCATGAA -3‘ Tabelle 2: verwendete Primer zur Klonierung neuer Misexpressions-Konstrukte Die Primer, welche zur Überprüfung der Sequenzen der fertigen Konstrukte genutzt wurden sind im Anhang aufgelistet (Tabelle 18). 23 Material und Methoden 2.5 Verwendete Plasmide Folgende bereits existierende Plasmide wurden für die Klonierungsarbeiten und embryonale Injektionen herangezogen. pRed[eagle-upstream-nls-eGFP-eagle-3’UTR] Tobias Merkel, Masterarbeit 2010 (Erlangen) pRed[eg-upstream-Intron-nls-eGFP-eg 3’UTR] Tobias Merkel, Masterarbeit 2010 (Erlangen) #352 pBac[UAS-hb-eg3'UTR] Tina Loy, Martin Klingler (Erlangen) #350 pSLfa[Hsp-p-Gal4∆-SV40_attp] Johannes Schinko, Gregor Bucher (Göttingen) #177 pBluescript[UAS-pan_min-eg5'UTR-Mex3] synthetisiert bei GeneCust, Luxemburg #178 pBluescript[UAS-pan_min-eg5'UTR-otd] synthetisiert bei GeneCust, Luxemburg pBac[Tc'hsp5'-dsRedEx-3'UTR;5'Tc-hsp68-Tc-zen2-Tc-hsp68-3'] Dorothea Musazzi, Michael Schoppmeier (Erlangen) pBac[Tc'hsp5'-dsRedEx-3'UTR;5'Tc-hsp68-Tc-Mex3-Tc-hsp68-3'] Tabelle 3: verwendete Plasmide Dorothea Musazzi, Michael Schoppmeier (Erlangen) 2.6 Keimbahntransformation durch embryonale Injektion Zur Generierung neuer transgener Stämme wurde die Methode der Keimbahntransformation mittels des piggyBac Transposons genutzt, welche im Detail in Berghammer et al. 2009 beschrieben ist. Die Injektionslösung setzt sich aus 500ng/μl Vektor-Plasmid und 350ng/μl Helper-Plasmid (Handler und Harrell, 1999), gelöst in MQ Wasser, zusammen. Für eine bessere Sichtbarkeit der Lösung während der Injektion wird zusätzlich 10% Phenolrot beigefügt. Unmittelbar vor Start der Injektion wird die DNA-Lösung nochmals für 15min bei 4°C und 14000rpm zentrifugiert, um eventuelle Partikel, welche die Injektionsnadel verstopfen könnten, ab zu zentrifugieren. Um eine noch stärkere Reinheit des Injektionsgemisches zu erreichen, kann es zusätzlich noch durch Millipore UltrafreeMC 0,5mL, 0,45μm Säulchen zentrifugiert werden. Für die Injektion wurden Embryonen des vermillionwhite Stammes genutzt, um später den fluoreszenten Transformationsmarker in den Augen sehen zu können. Zunächst wird ein 1h Gelege bei 32°C genommen, welches nochmal für eine weitere Stunde bei 25°C auf doppelgriffigem Mehl nachreift. Die Embryonen werden dann unter Leitungswasser in einem 200μm Siebchen gewaschen und anschließend mit Hilfe eines Pinsels auf einen Objektträger aufgereiht. Die Injektion erfolgt unter Luft, am Mikroskop mit Hilfe eines 3D-Mikromanipulators. Um eine Transformation in die Keimbahn zu erreichen wird in das posteriore (spitze) Ende der Eier injiziert. Die injizierten Embryonen werden dann in eine geschlossene Feuchtigkeitskammer mit 100ml 15% NaCl überführt und bei 32°C bis zum Schlupf (max. 5 Tage) inkubiert. 24 Material und Methoden Geschlüpfte Larven werden in dieser Zeit täglich abgesammelt und mit Hilfe eines Pinsels auf doppelgriffiges Mehl überführt. 2.7 Etablieren transgener Linien Die aus der embryonalen Injektion hervorgegangenen G0Tiere werden im pupalen Stadium nach Männchen und Weibchen getrennt und einzeln miteinander verpaart. Überschüssige Individuen werden mit vw- Tieren gekreuzt. Sobald die Tiere das adulte Stadium erreicht haben, werden vier wöchentliche Ablagen hergestellt. Die adulten Tiere dieser G1 Generation werden dann auf den Transformationsmarker hin analysiert. Ein positives Männchen wird mit 4 – 5 vw- Weibchen ausgekreuzt um eine unabhängige Linie zu etablieren. Die Nachkommen dieser Linien müssen im Folgenden kontinuierlich auf den Transformationsmarker hin selektiert werden, wenn diese für Versuche herangezogen werden sollen. Zur Etablierung homozygoter Stämme werden positive Tiere im pupalen Stadium einzeln verpaart und, wie oben beschrieben, vier wöchentliche Ablagen genommen. Werden unter den Nachkommen, in vier Wochen, keine Tiere ohne Transformationsmarker gefunden, können diese zum „homozygoten“ Stamm vereint werden. 2.8 Hitzeschock-Prozedur Um eine Misexpression des gewünschten Gens zu erreichen werden Embryonen der Hitzeschock-Linien abgesiebt und in ein Szintilationsgefäß gefüllt, sodass der Boden gerade so bedeckt ist. Der Hitzeschock erfolgt daraufhin im Wasserbad bei 48°C für 5 Minuten. Für jeden Hitzeschock wird eine vw- Kontrolle mitgeführt. Für die meisten Experimente wird eine 2h Ablage bei 32°C genommen, die dann bis zum Hitzeschock für 20h bei 25°C nachreift. Durch die Annahme, dass die Entwicklungszeit sich bei 25°C gegenüber der bei 32°C etwa verdoppelt, wird so eine Misexpression des Gens im späten undifferenzierten bzw. frühen differenzierten Blastodermstadium erreicht (10-12h nach Eiablage bei 32°C). Sollen die Embryonen fixiert werden, reifen sie nach dem Hitzeschock, je nach gewünschtem Stadium, für gewisse Zeit bei 32°C nach. Für Kutikula-Präparate werden sie auf 200μm Nachreifesiebchen überführt, auf denen sie für 4 weitere Tage nachreifen, bevor sie weiter verarbeitet werden. 25 Material und Methoden 2.9 Fixierung von Embryonen Alle Ablagen für Fixierungen werden bei 32°C genommen. Die Embryonen werden in ein 200μm Sieb gegeben und für 3 x 2 Minuten in 50% Klorix (DanKlorix, CP GABA GmbH, Hamburg) mit Leitungswasser dechorionisiert. Nach dem Spülen unter Wasser werden sie mittels Pipette in ein Szintilationsgefäß mit der Fixierlösung (6 ml Heptan, 2 ml PEMS, 300 μl 37% Formol) überführt. Die Fixierung erfolgt für 30 - 40 Minuten auf dem Schüttler (Nr. 3015, Gesellschaft für Labortechnik GmbH, GFL). Nach dem Abnehmen der unteren, wässrigen Phase (Formol und PEMS) werden 8ml Methanol hinzugegeben und 30 Sekunden kräftig geschüttelt. Mit Hilfe dieses Methanol-Schocks sollen die Embryonen devitellinisiert werden. Alle Embryonen ohne Membran sammeln sich am Gläschenboden. Die Eier in der Interphase werden zusätzlich zwei Mal durch eine Kapillare mit 1,1mm Durchmesser (Neolus 1,1 x 25mm, TERUMO Corporation) gespült, um mit Hilfe der Scherkräfte doch noch die Vitellinmembran zu entfernen. Alle abgesunkenen Embryonen werden dann in 1,5ml Eppendorfgefäße überführt, dreimal mit Methanol gewaschen und bei -20°C gelagert. Für Färbungen mit dem Antikörper Rb2 α-MEX3 müssen die Embryonen speziell fixiert werden. Die Fixierdauer wird hierfür auf 15 Minuten reduziert. Außerdem werden die Embryonen nach den Methanol-Waschschritten direkt in PBT überführt und bei 4°C gelagert. Dies soll die Zugänglichkeit der Epitope für den Antikörper gewährleisten. 2.10 Sonden-Synthese Die Synthese der DIG (Digoxigenin) bzw. FLU (Fluoreszin) markierten antisense RNASonden erfolgt nach dem Standardlaborprotokoll („Preparation of DIG-labeled RNA probes for in situ hybridization“), das auf Jowett und Lettice, 1994 basiert. Die Sonden werden in 50μl MQ-Wasser gelöst und bei -20°C gelagert. Alle genutzten Komponenten zur SondenSynthese stammen von Roche Diagnostics GmbH. Die zur Herstellung genutzten Klone waren bereits vorhanden und wurden von Michael Schoppmeier zur Verfügung gestellt. 2.11 In-situ Hybridisierung Die Einzel-Wholemount In-Situ Hybridisierung erfolgt nach dem Protokoll „Kling lab July 2004“. Jedoch wird auf die Postfixierung und den Proteinase K Verdau verzichtet. Die Genexpression wird bei dieser Methode mit Hilfe von Digoxigenin markierten antisense Sonden sichtbar gemacht. Diese einzel-strängigen RNA Stücke binden die komplementäre mRNA. Im Folgenden wird ein α-DIG Antikörper zugegeben, an den eine Alkalische Phosphatase (AP) gebunden ist (1:2000 Anti-Digoxigenin-AP Fab Fragments, Roche 26 Material und Methoden Diagnostics GmbH). Diese kann dann die NBT/BCIP Lösung (NBT/BCIP Stock Solution, Roche Diagnostics GmbH) im Färbepuffer zu einem lila Substrat umsetzen und somit die Genexpressionsdomänen sichtbar machen. Die Doppel In-situ Hybridisierung („Turquois/ purple in-situ hybridisation protocol – Klingler Lab, Schoppmeier 2005“) erfolgt nach ähnlichem Prinzip. Hierbei werden jedoch zwei verschiedene antisense Sonden zugegeben. Eine DIG markiert die zweite mit Fluoreszin. NBT/BCIP wird diesmal mittels eines α-FLU-AP Antikörpers (1:2000, Fab Fragments, Roche Diagnostics GmbH) umgesetzt. Die Detektion der DIG markierten Sonde erfolgt über einen α-DIG POD (Peroxidase) Antikörper (1:2000, Fab Fragments, Roche Diagnostics GmbH), einer Amplifikation des Signals mit Hilfe des Perkin Elmer TSA Biotin Systems (10μl Biotin Reagent in 500μl Amplifikationspuffer für 10 Minuten) und der anschließenden Zugabe von Steptavidin-β-Gal (1:2000, Roche Diagnostics GmbH), welches dann im Färbeschritt X-Gal zu einem türkisen Farbstoff umsetzt. Alle Embryonen werden außerdem über Nacht mit dem Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33258 (1:20, SIGMA) gefärbt. Dieser färbt DNA und hilft somit die Embryomorphologie besser sichtbar zu machen. 2.12 Antikörperfärbung Für die Einzel-Antikörperfärbung wird das Protokoll „Antibody staining of Tribolium embryos“ nach Klingler 3/99 verwendet. Die Proteinexpression wird mit Hilfe eines AP-gekoppelten sekundären Antikörpers und NBT/BCIP detektiert. Für die fluoreszente Doppel-Antikörper-Färbung wurde das Protokoll etwas modifiziert, sodass am Ende zwei Antikörper-Färbungen in Folge durchgeführt werden. Zunächst wird der erste primäre Antikörper über Nacht bei 4°C inkubiert. Dieser wird am folgenden Tag durch einen biotinylierten, sekundären Antikörper gebunden. Das Signal wird dann mittels des ABC Systems (Vectastain) und des TSA Cyanine 3 Systems (20 Minuten; PerkinElmer Inc.) amplifiziert und sichtbar gemacht. Die Bindung des zweiten Erst-Antikörpers erfolgt dann ebenfalls über Nacht bei 4°C. Dieser wird mit Hilfe eines DyLight-gekoppelten sekundären Antikörpers detektiert. Wie auch in den In-Situ Färbungen, werden die Embryonen anschließend noch mit Hoechst 33258 (1:20, SIGMA) gefärbt. Die verwendeten Antikörper sind in Tabelle 4 aufgelistet. 27 Material und Methoden Rb α - CAD 1:100 (Schulz et al., 1998) Rb1 α - ZEN1 1:2000 Pineda (Berlin); M. Schoppmeier, D. Mackrodt (Erlangen) Rb2 α - ZEN1 1:2000 Pineda (Berlin); M. Schoppmeier, D. Mackrodt (Erlangen) GP1 α - ZEN1 1:500 Pineda (Berlin); M. Schoppmeier, D. Mackrodt (Erlangen) GP2 α - ZEN1 1:500 Pineda (Berlin) ; M. Schoppmeier, D. Mackrodt (Erlangen) Rb1 α - ZEN2 1:2000 Pineda (Berlin) ; M. Schoppmeier, D. Mackrodt (Erlangen) Rb2 α - ZEN2 1:2000 Pineda (Berlin) ; M. Schoppmeier, D. Mackrodt (Erlangen) GP1 α - ZEN2 1:500 Pineda (Berlin) ; M. Schoppmeier, D. Mackrodt (Erlangen) GP2 α - ZEN2 1:500 Pineda (Berlin) ; M. Schoppmeier, D. Mackrodt (Erlangen) Rb2 α - MEX3 1:2000 Pineda (Berlin) ; M. Schoppmeier, D. Mackrodt (Erlangen) α - DIG AP (Fab) 1:2000 Roche Diagnostics GmbH α - FLU AP (Fab) 1:2000 Roche Diagnostics GmbH α - DIG POD (Fab) 1:2000 Roche Diagnostics GmbH G α - Rb AP 1:1000 Jackson ImmunoResearch G α - GP AP 1:2000 Jackson ImmunoResearch Rb α - GFP 1:2000 Invitrogen G α - GP DyLight 1:100 Jackson ImmunoResearch G α - Rb bio 1:500 Tabelle 4: verwendete Antikörper Vector Laboratories 2.13 Präparation von Embryonen Für Blastoderm- und Keimstreif-Präparate werden die Embryonen einzeln mit möglichst wenig PBT in ein 50% PBS/Glycerol-Gemisch auf einen Objektträger überführt. Bei Blastoderm-Präparaten ist es wichtig das Deckglas mit Plastilin-Füßchen zu versehen um den Embryo nicht zu quetschen. Keimstreif-Präparate werden am Durchlicht-Binokular von möglichst viel Dotter befreit um diese langgestreckt auf dem Objektträger platzieren zu können. 2.14 Kutikula-Präparate Zur Herstellung von Kutikula-Präparaten wird zunächst eine 3 Tages-Eiablage (32°C) genommen. Diese Embryonen werden dann auf ein 300μm Nachreife-Siebchen überführt und weitere 3 Tage (bei Hitzeschock 4 Tage) über Öl zum Nachreifen bei 32°C gestellt. Durch diese Prozedur können Larven ohne Defekt normal schlüpfen und durch das Sieb fallen. Die Larven, welche durch einen Entwicklungs-Defekt nicht zum Schlupf fähig sind verbleiben auf dem Sieb. Diese werden dann in ein 200μm Schraub-Siebchen überführt, und zwei mal drei Minuten in 50% Klorix/Wasser Gemisch dechorionisiert und am Ende gut mit Wasser gespült. Mit Hilfe eines Pinsels können die Embryonen dann auf den Objektträger in Hoyers/Milchsäure überführt werden. Um die Larven aus der Eihülle heraus zu strecken, können die Deckgläschen zudem noch leicht gequetscht werden. Die Präparate werden über 28 Material und Methoden Nacht bei 60°C im Wärmeschrank geklärt. Durch die Autofluoreszenz der Kutikulas können die Präparate am Fluoreszenz-Mikroskop ausgewertet werden. 2.15 Fresh-Preps Die Herstellung von Lebend-Präparaten, sogenannten "Fresh-Preps", wird in dieser Arbeit dafür genutzt, Embryonen auf eine eventuelle GFP-Expression hin zu analysieren. Hierfür wird für frühe embryonale Stadien eine 0-6h Ablage, bzw. für spätere Stadien eine ÜberNach-Ablage (32°C) genommen. Die Embryonen werden in 200µm Schraub-Siebchen überführt und in 50% Klorix/Wasser Gemisch dechorionisiert. Die Einbettung erfolgt in Voltalef 10S Öl (Lehmann und Voss & Co., Hamburg). Am Fluoreszenz-Mikroskop sollten die Präparate dann möglichst zeitnah analysiert werden. 2.16 Dokumentation Die Dokumentation aller Kutikula-Präparate und Einzel-Färbungen erfolgte am Zeiss Axiophot Mikroskop mit angeschlossener schwarz/weiß Kamera. AnalySIS (Soft Imaging Systems) wurde dabei als Software genutzt. Die Doppelfärbungen wurden am Zeiss ApoTome Fluoreszenz Mikroskop mit der dazugehöriger Axiovision Software dokumentiert. Nachbearbeitet wurden die Bilder mit Photoshop CS5 (Adobe). 29 Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1 Ein maternales Misexpressionssystem in Tribolium castaneum Zur Analyse spezifischer Genfunktionen werden Systeme benötigt, um die Genexpression im Organismus zu verändern. In Tribolium castaneum ist die am besten etablierte Methode hierfür, der gezielte Knockdown von Genen mittels RNA Interferenz (Hammond et al., 2001). Für eine zeitliche und räumliche Misexpression von Genen ist die Auswahl an methodischen Ansätzen jedoch stärker begrenzt. Bisher besteht die Möglichkeit Gene mit Hilfe von endogenen Hitzeschock-Konstrukten zu misexprimieren (Schinko et al., 2012). Außerdem existiert ein UAS/Gal4-System, welches über einen Hitzeschock-Promoter getrieben wird (Schinko et al., 2010). Für beide Ansätze gilt jedoch bislang die Einschränkung, dass es nicht möglich ist eine maternale Gen-Misexpression zu generieren, da der Hitzeschock-Promoter nicht maternal induzierbar ist. Zudem ist es auch nicht möglich, mittels des Hitzeschock-Promoters eine lokal begrenzte Misexpression zu erzeugen. Aufgrund dieser Einschränkungen ist es wichtig neue Ansätze zu generieren um die Genexpression in Tribolium castaneum auch in sehr frühen Stadien zu manipulieren. Ziel ist es ein modulares Misexpressionssystem zu etablieren, welches über einen endogenen maternalen Promoter getrieben wird. 3.1.1 Strategie zur Etablierung eines maternalen Misexpressionssystems Grundlage der folgenden Arbeiten war ein de novo klonierter und modular aufgebauter piggyBac (pBac) Transformations-Vektor (pRed[eagle-upstream-nls-eGFP-eagle3’UTR]) (T. Merkel, 2010) (Abbildung 1). Dieser basiert auf einem piggyBac Grundvektor (pBac[3xP3-dsRed]; Horn et al., 2002), welcher neben den flankierenden Sequenzen pBacR und pBacL auch den Transformationsmarker dsRed enthält. Die Regulation des Transformationsmarkers über den augenspezifischen 3xP3 Promoter ermöglicht später die einfache Erkennung transgener Tiere. Für Tribolium castaneum konnte schon mehrfach gezeigt werden, dass sich mit den Transposon Sequenzen des piggyBac Vektors, welche von der Transposase gebunden werden, eine stabile und effiziente Keimbahntransformation erreichen lässt (Lorenzen et al., 2003). Somit ist es prinzipiell möglich Konstrukte aller Art sequenzunabhängig in das Käfergenom zu integrieren. Die maternale Misexpression soll mit Hilfe regulatorischer Sequenzen des Tc'eagle (Tc'eg) Gens erreicht werden. Hierfür enthält der Ausgangsvektor pRed[eagle-upstream-nls-eGFP30 Ergebnisse eagle3’UTR] zum einen, ein etwa 6kb großes Stück der nicht codierenden Tc'eg 5'Region, womit gewährleistet werden soll, dass neben dem minimal Promotor und der 5'UTR auch weitere regulatorische Elemente wie zum Beispiel Enhancer enthalten sind. Tc'eg ist neben Tc'pangolin (Tc'pan) und Tc'axin eines der wenigen maternal exprimierten Gene, welche zusätzlich anterior im Ei lokalisiert werden (Bucher et al., 2005; Fu et al., 2012; vgl. Abbildung 2 und Abbildung 6). Da Sequenzen für die mRNA Lokalisation oft in der 3' untranslatierten Region (UTR) liegen enthält der Vektor zudem die Tc'eg 3'UTR (Kloc et al. 2002). Als Reportergen wurde eGFP einkloniert um die Funktionalität der regulatorischen Tc'eg Elemente zu testen. Es ist an eine NLS-Sequenz (nuclear localization signal) gekoppelt und könnte somit als kernlokalisiertes Protein nachgewiesen werden. Abbildung 1: Schematische Darstellung des Ausgangsvektors pRed[eagle-upstream-nls-eGFP-eagle 3’UTR] Die regulatorischen Sequenzen von Tc'eg werden in diesem Fall genutzt um eine maternale Misexpression spezifischer Gene zu erreichen. Wie bereits erwähnt, soll das System jedoch durch den modular aufgebauten Vektor auch für andere Misexpressions-Ansätze einfach genutzt werden können. Hierfür sind im Vektor spezifische Enzym-Schnittstellen vorhanden um die einzelnen Bereiche einfach und gerichtet auszutauschen (Abbildung 1). Die 5'UTR zusammen mit den upstream gelegenen, regulatorischen Sequenzen kann mit Hilfe von FseI (5') und NotI (3') ausgetauscht werden. Auf dieses folgt das Reportergen, welches mit Hilfe der Schnittstellen NotI (5') und AsiSI (3') 31 Ergebnisse durch jede gewünschte codierende Sequenz ersetzt werden kann. Ein Austausch der 3'UTR ist mit Hilfe von AsiSI (5') und AscI (3') möglich. 3.1.2 Maternale Misexpression mittels regulatorischer Sequenzen von Tc'eagle Nachdem der Ausgangsvektor bereits vorhanden war, sollten durch embryonale Injektionen transgene Tiere generiert werden, welche das Konstrukt pRed[eagle-upstream-nls-eGFPeagle3’UTR] enthalten. Mit Hilfe von In-Situ Hybridisierungen und Antikörper-Färbungen gegen eGFP sollte dann getestet werden, ob die maternale Misexpression mit Hilfe der regulatorischen Sequenzen von Tc'eg möglich ist. Es wurden insgesamt 531 vw- Eier injiziert, aus welchen 63 Larven geschlüpft sind (Überlebensrate: 12%). Diese wurden inter se verpaart. Aus 24 Kreuzungen konnten dann 2 unabhängige transgene Linien gewonnen werden. Dies entspricht einer Transformationsrate von 8%. Um die Funktionalität der regulatorischen Tc'eg Sequenzen zu testen wurden frühe Embryonen dieser Linien auf die Expression von eGFP hin untersucht. Hierfür wurden die adulten transgenen Tiere der Linien zunächst mit Hilfe des Transformationsmarkers dsRed, in den Augen, selektiert. Anschließend wurden 0-5 h Ablagen fixiert und die eGFP mRNA bzw. das Protein mittels In-Situ Hybridisierung und AK-Färbung nachgewiesen. Tatsächlich zeigte sich in Linie1 ("eg up L1") eGFP Expression in frisch abgelegten Eiern und frühen Blastodermstadien (Abbildung 2). Wie in Abbildung 2 A gezeigt, ist die Tc'eg mRNA im Wildtyp maternal exprimiert und als anteriore Kappe im frisch abgelegten Ei lokalisiert. In transgene Embryonen von "eg up L1" findet sich eGFP mRNA Expression, welche ebenfalls anterior lokalisiert ist (Abbildung 2 B). Dies bestätigt, dass die maternale Misexpression des Reportergens sowie die Lokalisation der mRNA mittels der regulatorischen Tc'eg Sequenzen funktioniert. Die Antikörperfärbung gegen eGFP zeigt ebenfalls eine maternale Expression des Proteins am anterioren Pol des frisch abgelegten Eis (Abbildung 2 C). Später in undifferenzierten Blastodermstadien nach der Zellularisierung des Embryos kann das eGFP Protein in den Zellkernen nachgewiesen werden (Abbildung 2 D). Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die maternale Misexpression, mittels der regulatorischen Sequenzen von Tc'eagle, prinzipiell funktioniert. Zudem kann durch die Tc'eg 3'UTR eine Lokalisation der mRNA am anterioren Pol erreicht werden. Außerdem wird die misexprimierte mRNA erfolgreich zum funktionalen Protein translatiert. Auch die spätere Lokalisation des eGFP Proteins in die Zellkerne funktioniert tadellos. 32 Ergebnisse Diese ersten Versuche liefern somit eine vielversprechende Aussicht auf ein funktionierendes maternales Misexpressionssystem für Tribolium castaneum. Jedoch war die eGFP Expression oft nicht sehr stark und somit auch nur in einigen Embryonen deutlich zu erkennen. Dies könnte zum einen am Tc'eagle Promoter selbst, oder an fehlenden Enhancern bzw. einer zu kurzen 5'upstream Region liegen. Deshalb wurden auf Grundlage des Ausgangsvektors weitere Konstrukte kloniert und getestet. Abbildung 2: In-Situ Hybridisierung gegen Tc'eagle im WT (A). In-Situ Hybridisierung und Antikörperfärbung gegen eGFP in transgenen pRed[eagle-upstream-nls-eGFP-eagle3’UTR] Embryonen der Linie1 (eg up L1) (B-D). A-D Hellfeldaufnahmen von frühen Stadien. A'-D' Hoechstfärbung der Zellkerne der Embryonen aus A-D. Anterior befindet sich in allen Abbildungen links. A) Die Tc'eagle mRNA ist im WT maternal exprimiert und wird im frisch abgelegten Ei anterior in einer Art Kappe lokalisiert (Pfeile). B) Die eGFP mRNA wird in transgenen Embryonen der Linie1 pRed[eagle-upstream-nlseGFP-eagle3’UTR] maternal exprimiert und am anterioren Pol lokalisiert (Pfeile). C) Das eGFP Protein ist in transgenen Embryonen der Linie1 pRed[eagle-upstream-nls-eGFP-eagle3’UTR] ebenfalls maternal am anterioren Pol zu finden (Pfeile). D) Im undifferenzierten Blastoderm der transgenen Embryonen der Linie1 pRed[eagle- 33 Ergebnisse upstream-nls-eGFP-eagle3’UTR] ist das eGFP Protein auf Grund der NLS (nuclear localization signal) in den Kernen lokalisiert. 3.1.3 Klonierung weiterer Misexpressionskonstrukte Um eine Optimierung der maternalen Misexpression zu erreichen, sollten weitere 5'upstream Regionen einkloniert und getestet werden. Die Tc'eg 3'UTR wurde jedoch beibehalten, da die Lokalisation der misexprimierten mRNA gut funktioniert. Mit den neuen Konstrukten sollte einerseits getestet werden ob die Tc'eg 5'upstream Region zu kurz gewählt war und so eventuell Enhancer fehlen, die eine bessere Aktivierung des Tc'eg Promoters ermöglichen. Andererseits sollten auch neue Promotoren und 5'upstream Bereiche von anderen ebenfalls maternal exprimierten Genen getestet werden. Insgesamt wurden drei neue Vektoren erzeugt. Durch den modularen Aufbau des Vektors konnten die 5'Regionen einfach mit Hilfe der Schnittstellen FseI (5') und NotI (3') ausgetauscht werden. Die neuen Bereiche wurden in silico definiert und auf genomischer DNA amplifiziert. Mittels der spezifischen, an die Primer gekoppelten Enzymschnittstellen konnten sie dann gerichtet in den Vektor ligiert werden. Um zu überprüfen ob die 6 kb große 5'upstream Region des ersten Vektors zu kurz gewählt war wurde ein neuer Vektor (pRed[Tc'eg-8kb-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR]) erzeugt, der eine 8 kb große Tc'eg 5'upstream Region enthält (Abbildung 3). Ziel ist es, durch eventuell enthaltene zusätzliche Enhancer-Elemente die Expression des Reportergens zu verstärken. Wie bereits erwähnt, sollten zudem auch regulatorische Sequenzen von anderen, ebenfalls maternal exprimierten Genen getestet werden. Die Wahl fiel hierbei auf Tc'pangolin (Tc'pan) und Tc'exuperantia (Tc'exu). Für Tc'pan wurde gezeigt, dass es wie auch Tc'eagle maternal exprimiert und als mRNA am anterioren Pol lokalisiert wird (Bucher et al., 2005). Der neu generierte Vektor pRed[Tc'panupstream+5'UTR_nls-eGFp_Tc'eg-3'UTR] ist in Abbildung 4 dargestellt. Die einklonierte upstream Region inklusive der Tc'pan 5'UTR ist etwa 5,5 kb groß. Der zweite neu generierte Vektor pRed[Tc'exu-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] (Abbildung 5) enthält die upstream Region und die 5'UTR von Tc'exu. Auch hier wurde ein etwa 5 kb großes Stück gewählt. Über Tc'exu ist bisher nur bekannt, dass es in Tribolium maternal exprimiert wird (Pridöhl und Schoppmeier, nicht publiziert). In Drosophila ist das EXU Protein für die Lokalisierung der bicoid mRNA am anterioren Pol von Bedeutung (Berleth et al., 1988). 34 Ergebnisse Abbildung 3: pRed[Tc'eg-8kb-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] Abbildung 4: pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] 35 Ergebnisse Abbildung 5: pRed[Tc'exu-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] Auch diese Konstrukte wurden embryonal in den vw- Stamm injiziert. Für pRed[Tc'eg-8kbupstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] wurden 408 Embryonen injiziert, von diesen entwickelten sich 73 bis zur Larve, was einer Überlebensrate von 18% entspricht. Aus 36 Inter-se-Kreuzungen konnte jedoch keine einzige transgene Linie gewonnen werden. Auch für pRed[Tc'exu-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] wurden in insgesamt 49 Inter-seKreuzungen keine transgenen Linien gefunden. Hier wurden 607 Eier injiziert und 112 Larven abgesammelt (Überlebensrate: 18,5%). Die Injektion von 404 Embryonen mit pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg3'UTR] führte zu 115 Larven (Überlebensrate: 28,5%). Aus den folgenden 48 Inter-seKreuzungen konnten 7 unabhängige transgene Linien gewonnen werden. Dies entspricht einer Transformationsrate von 14,6%. Offen bleibt die Frage, warum trotz mehrfacher Injektionen für pRed[Tc'eg-8kbupstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] und pRed[Tc'exu-upstream+5'UTR_nls- eGFP_Tc'eg-3'UTR] keine transgenen Linien generiert werden konnten. Ein Einfluss der Transposon-Größe auf die Transformationsrate kann im Prinzip ausgeschlossen werden. Lorenzen et al., 2003 konnten zeigen, dass die Transformationsrate mit der wachsenden Größe des Transposons zwar abnimmt, jedoch bei einem 12,4 kb großen Transposon immer 36 Ergebnisse noch bei 22% liegt. Das größte, hier genutzte Transposon pRed[Tc'eg-8kb- upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] ist nur etwa 10,3 kb groß. Zudem sind die Transposonelemente von pRed[Tc'exu-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] und pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] mit jeweils etwa 8,5 kb gleich groß, wobei für pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] eine Transformationsrate von 14,6% erzielt werden konnte. Eine weitere Vermutung ist, dass der Grundvektor pBac[3xP3-dsRed] generell keine guten Transformationsraten erzeugt. Vergleiche mit Injektionen des pBac[3xP3-GFP] Vektors zeigen eine deutlich verringerte Rate aller Transposonelemente, die auf dem pBac[3xP3-dsRed] Vektor beruhen (siehe Abschnitt 3.2.3). Jedoch bleibt ungeklärt was der Grund für diese verringerte Fähigkeit zur KeimbahnTransformation sein könnte. 3.1.4 Maternale Misexpression mittels regulatorischer Sequenzen von Tc'pangolin Die adulten Tiere der 7 unabhängigen transgenen Linien von pRed[Tc'pan- upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] (im Folgenden "pan up L1-7" genannt) sollten nun ebenfalls auf die Expression von eGFP hin untersucht werden. Auch hier wurden die adulten transgenen Tiere mit Hilfe das augenspezifischen Transformationsmarkers dsRed selektiert. Für In-Situ Hybridisierungen und AK-Färbungen gegen eGFP wurden dann 0-5h Ablagen von diesen Tieren fixiert. Es zeigt sich, dass die maternale Misexpression von eGFP, mit Hilfe der regulatorischen 5' Elemente von Tc'pan, deutlich besser funktioniert als mit den Elementen von Tc'eg. In allen 7 Linien konnte maternale eGFP Expression nachgewiesen werden. Abbildung 6 A zeigt die Expression der Tc'pangolin mRNA in frisch abgelegten Wildtyp-Eiern. Sie ist maternal exprimiert und wie Tc'eg in einer anterioren Kappe lokalisiert. Die eGFP mRNA ist in den "pan up" Linien ebenfalls maternal vorhanden und am anterioren Pol lokalisiert (Abbildung 6 B). Diese mRNA wird dann zum eGFP Protein translatiert, welches in ganz jungen Eiern ebenfalls anterior zu finden ist (Abbildung 6 C). Im undifferenzierten Blastodermstadium wird es dann in den einzelnen Kernen lokalisiert (Abbildung 6 D). Die Funktionalität des eGFP Proteins konnte mit Hilfe von Lebendpräparaten, sogenannten "Fresh-Preps" (vgl. Material und Methoden, 2.15), dieser Embryonen nachgewiesen werden. Unter dem Fluoreszenz Mikroskop zeigte sich eGFP Expression in den Kernen von undifferenzierten Blastodermen (Daten nicht gezeigt). 37 Ergebnisse Abbildung 6: In-Situ Hybridisierung gegen Tc'pangolin im WT (A). In-Situ Hybridisierung und Antikörperfärbung gegen eGFP in transgenen pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] Embryonen (pan up L1/6) (B-D). A-D Hellfeldaufnahmen von frühen Stadien. A'-D' Hoechstfärbung der Zellkerne der Embryonen aus A-D. Anterior befindet sich in allen Abbildungen links. A) Die Tc'pangolin mRNA ist im WT maternal exprimiert und wird im frisch abgelegten Ei anterior in einer Art Kappe lokalisiert (Pfeile). B) Die eGFP mRNA wird in transgenen pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_nlseGFP_Tc'eg-3'UTR] Embryonen maternal exprimiert und am anterioren Pol lokalisiert (Pfeile). C) Das eGFP Protein ist in transgenen pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] Embryonen ebenfalls maternal am anterioren Pol zu finden (Pfeile). D) Im undifferenzierten Blastoderm der transgenen pRed[Tc'panupstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] Embryonen ist das eGFP Protein auf Grund der NLS (nuclear localization signal) in den Kernen lokalisiert. Mit Hilfe der regulatorischen Sequenzen von Tc'pan (5') und Tc'eg (3') kann also eine maternale und zudem lokalisierte Misexpression der Reportergen mRNA erzielt werden. Um nun die Funktion bestimmter Gene zu untersuchen, müsste das eGFP gegen die kodierende Sequenz (CDS) spezifischer Gene ausgetauscht werden. Jedoch wäre die Haltung dieser transgenen Stämme nur über die Männchen möglich. In Weibchen dieser 38 Ergebnisse Linien würde das Gen kontinuierlich, maternal in den Nachkommen überexprimiert werden, was sehr wahrscheinlich zu einem Entwicklungsdefekt und somit zu nicht lebensfähigem Nachwuchs führt. Die transgenen Männchen, welche das Konstrukt zwar tragen aber nicht maternal misexprimieren müssten also ständig selektiert und mit vw- Weibchen gekreuzt werden um einen lebensfähigen Stamm aufrechtzuerhalten. Für Versuche und Analysen wäre es dann erforderlich, die transgenen Tiere abermals durch Selektion auszusortieren. Diese Methode ist sehr aufwändig weshalb entschieden wurde, das maternale Misexpressionssystem in Tribolium im Folgenden auf einem binären UAS/Gal4-System aufzubauen (Band und Perrimon, 1993). 3.1.5 Generierung eines maternalen UAS/Gal4-Systems in Tribolium castaneum Das UAS/Gal4-System beruht auf der Aktivierung des Zielgens durch den bakteriellen Transkriptionsaktivator Gal4 und wurde für Drosophila zuerst von Brand und Perrimon (1993) beschrieben. Wie bereits erwähnt, handelt es sich hierbei um ein binäres System. Dies bedeutet, dass zwei verschiedene transgene Linien benötigt werden, welche zunächst gekreuzt werden müssen um eine Misexpression des Zielgens zu erreichen. Die Gal4Treiberlinie enthält ein Konstrukt, in dem der Transkriptionsaktivator Gal4 unter der Kontrolle eines gewünschten Promoters steht. Somit kann genau definiert werden wann und wo Gal4 exprimiert wird. Die zweite Linie wird als UAS-Linie bezeichnet und enthält die codierende Sequenz des gewünschten Zielgens, hinter 5 optimierten Gal4 Bindestellen (UAS = upstream activation sequence) (Brand und Perrimon, 1993). Durch dieses System kann gewährleistet werden, dass es erst zur Misexpression des Zielgens kommt wenn beide Konstrukte im Genom vorhanden sind. Die beiden Linien sind somit einzeln ganz normal lebensfähig (Brand und Perrimon, 1993). Ein weiterer Vorteil dieses Systems ist die Möglichkeit genau zu definieren in welchen Zellen oder Geweben es zu einer Misexpression kommen soll. Dies geschieht durch die Wahl des Promotors, welcher die Gal4 Expression treibt, denn nur dort wo Gal4 vorhanden ist wird es zur Aktivierung des Zielgens kommen (Brand und Perrimon, 1993). Auch für Tribolium wurde ein solches UAS/Gal4-System bereits beschrieben. Hier wird die Gal4 Expression jedoch über den endogenen Hitzeschock-Promoter HSP68 getrieben (Schinko et al., 2010). Dies bedeutet, dass auch hier Gene nur zygotisch misexprimiert werden können, da der Hitzeschock-Promoter in früheren Stadien nicht aktiviert werden kann. Zur Etablierung eines maternalen UAS/Gal4-Misexpressionssystems muss die Gal4 Expression über einen endogenen maternalen Promotor getrieben werden. Die Vorversuche 39 Ergebnisse zeigen, dass mittels der regulatorischen Sequenzen von Tc'pan (5') und Tc'eg (3') eine starke maternale Expression von Genen zu erreichen ist. Zur Generierung des Gal4-TreiberVektors wurde also der pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] Vektor genutzt. Die codierende Sequenz des Reportergens eGFP wurde durch die CDS des Gal4∆Gens ersetzt (Ma und Ptashne, 1987). Durch den modularen Aufbau des Vektors konnte dies problemlos durch einen NotI/AsiSI Doppelverdau und eine anschließende gerichtete Ligation geschehen. Der Endvektor ist in Abbildung 7 gezeigt. Wie auch pRed[Tc'panupstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] besitzt der Vektor dsRed als Transformationsmarker. Abbildung 7: pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_Gal4∆_Tc'eg-3'UTR] Für spätere funktionale Analysen wurden zudem zwei UAS-Konstrukte generiert. Die Zielgene welche misexprimiert werden sollen sind Tc'Mex3 und Tc'orthodenticle (Tc'otd). Für Tc'Mex3 ist bekannt, dass es in Tribolium im differenzierten Blastoderm die Tc'caudal Translation im anterioren Kopf reprimiert (Schoppmeier et al., 2009). Durch eine maternale Misexpression wäre es vielleicht möglich die Auswirkungen des Tc'CAD Verlustes zu untersuchen, ohne dabei auf Tc'cad RNAi zurückgreifen zu müssen. Parentale RNAi gegen Tc'cad führt neben embryonalen Phänotypen auch zu einem sehr starken Ovar-Phänotyp und somit zu einer stark reduzierten Eiablage. Dies könnte mit Hilfe maternaler Tc'Mex3 40 Ergebnisse Misexpression umgangen werden. Zudem könnte die Misexpression natürlich auch klären ob Tc'Mex3 noch weitere Funktionen in der Käferentwicklung ausübt. Tc'otd ist maternal ubiquitär exprimiert, bildet dann einen Gradienten von anterior nach posterior, um letztendlich eine Expressionsdomäne im anterioren Kopf der differenzierten Blastoderme zu bilden (Li et al., 1996; Schinko et al., 2008). Eine Misexpression von Tc'otd könnte Aufschluss darüber geben ob die Expression als Gradient eine spezifische Funktion besitzt oder nur den Übergang der maternalen ubiquitären Expression zur definierten Kopf Domäne darstellt. Die UAS-Konstrukte für beide Gene enthalten jeweils 5 hintereinander gesetzte UASSequenzen, den Tc'pan Minimal-Promoter, die Tc'eg 5'UTR gefolgt von den codierenden Sequenzen von Tc'Mex3 bzw. Tc'otd. 3' folgt dann die Tc'eg 3'UTR um eine Lokalisation der mRNA zu erreichen (Abbildung 8 und Abbildung 9). Als Backbone diente der pBac[3xP3-eGFP, UAS-hb] Vektor, welcher von M. Klingler zur Verfügung gestellt wurde. Dieser enthält als Transformationsmarker eGFP welches über den augenspezifischen 3xP3 Promoter getrieben wird. Das ebenfalls enthaltene UAS-hbeg3'UTR Konstrukt ist so aufgebaut, dass die UAS-hb Sequenz durch einen Doppelverdau mit FseI und AsiSI aus dem Vektor ausverdaut werden konnte. Die neuen Inserts "UAS_pan-minPromoter_eg5'UTR_Mex3ORF_eg3'UTR" und "UAS_panminPromoter_eg5'UTR_otdORF" wurden nicht selbst kloniert. Die Sequenzen wurden digital am Computer zusammengesetzt und an die Firma GeneCust (Dudelange, Luxemburg) übermittelt, welche dann die Konstrukte synthetisiert hat. Auch hier sind die Sequenzen 5' von einer FseI und 3' von einer AsiSI Schnittstelle flankiert. Die bestellten Konstrukte wurden dann von GeneCust, in pBluscript-Vektoren einkloniert, ausgeliefert (#177 pBluescript[UAS_Tc'panmin_Tc'eg5’UTR_Tc'Mex3longCDS] und #178 pBluescript[UAS_panmin_eg5’UTR_otdCDS]). Um das Konstrukt zu erhalten wurden diese Vektoren mit FseI und AsiSI doppelverdaut. Anschließend konnte das aufgereinigte Insert dann gerichtet in das Backbone einligiert werden. 41 Ergebnisse Abbildung 8: pBac[UAS_pan-minPromoter_eg5'UTR_Mex3ORF_eg3'UTR] Abbildung 9: pBac[UAS_pan-minPromoter_eg5'UTR_otdORF_eg3'UTR] 42 Ergebnisse Alle drei Konstrukte wurde embryonal in vw- injiziert um transgene Stämme zu generieren. Für pBac[UAS_pan-minPromoter_eg5'UTR_Mex3ORF_eg3'UTR] wurden 475 Eier injiziert und 107 Larven abgesammelt, was einer Überlebensrate von 22.5 % entspricht. Daraus konnten 43 Inter-se-Kreuzungen angesetzt werden, aus welchen 8 unabhängige transgene Linien hervor gingen (Transformationsrate: 18,6%). Die Injektion von pBac[UAS_pan-minPromoter_eg5'UTR_otdORF_eg3'UTR] erfolgte in 416 Eier, aus welchen sich 85 Larven entwickelten (Überlebensrate: 20,4%). Diese wurden in 36 Inter-se-Kreuzungen verpaart. Die Auswertung erbrachte 11 unabhängige transgene Linien, was einer Transformationsrate von 30,6% entspricht. Die Generierung transgener Stämme mit pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_Gal4∆_Tc'eg3'UTR] erwies sich als deutlich komplizierter. Zunächst wurden 447 Eier injiziert von denen 63 Larven abgesammelt werden konnten (Überlebensrate: 14,1 %). Aus den daraus angesetzten 22 Inter-se-Kreuzungen konnte nur eine einzige transgene Linie gewonnen werden (Transformationsrate: 4,5%). Deshalb wurde eine zweite Injektionsrunde durchgeführt. Um auszuschließen, dass die Transformationsrate eventuell von der Zusammensetzung des Injektionsgemisches abhängig ist, wurden verschiedene Ansätze getestet. Zum einen wurde der Farbstoff variiert und neben Phenolrot auch grüne Lebensmittelfarbe getestet. Zum anderen wurde getestet, ob die Verwendung von Injektionspuffer anstatt Wasser einen Einfluss auf das Ergebnis der Injektion hat. Die Ansätze und Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Ansatz Injizierte Eier Abgesammelte Larven Überlebensrate Transgene Linien/Inter-se Kreuzungen Transformationsrate DNA + Phenolrot 1:20 + 0/9 275 35 12,7 % H2O DNA + Phenolrot 1:20 + 0/5 286 21 7,3 % Injektionspuffer DNA+ grüne Lebensmittelfarbe 1/20 283 43 15,2 % 1:50 + H2O DNA + grüne Lebensmittelfarbe 0/17 253 41 16,2 % 1:50 + Injektionspuffer Tabelle 5: Zweite embryonale Injektion von pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_Gal4∆_Tc'eg-3'UTR] 0% 0% 5% 0% 43 Ergebnisse Die Ergebnisse zeigen, dass das Injektionsgemisch keinen Einfluss auf die Überlebens- und Transformationsrate zu haben scheint. Lediglich die Überlebensrate für die Kombination aus Phenolrot und Injektionspuffer ist leicht erniedrigt. Dies kann jedoch auch an anderen Faktoren, wie zum Beispiel einer "schlechten" Injektionsnadel liegen. Grundsätzlich bleibt das Problem bestehen, dass die Transformationsrate bei Injektionen von Konstrukten, die auf pBac[3xP3-dsRed] beruhen, deutlich niedriger ist als bei Konstrukten mit eGFP als Transformationsmarker. Ob dies tatsächlich am Vektor selbst liegt, an der Sichtbarkeit des Transformationsmarkers oder aber vielleicht sogar die einklonierten Sequenzen einen Einfluss haben bleibt zu klären. 3.1.6 Erste Analysen der UAS/Gal4-Linien Die generierten Gal4-Treiberlinien wurden zunächst mittels In-Situ Hybridisierung gegen Gal4 auf ihre Funktionalität hin überprüft. Hierfür wurden transgene adulte Tiere mit Hilfe des Augen-Transformationsmarkers selektiert. Die von diesen Tieren genommenen 0-5h und Übernacht-Ablagen wurden dann gegen Gal4 gefärbt. Leider konnte für keine der beiden Linien Gal4-Expression nachgewiesen werden. Auch erste Kreuzungsversuche ergaben kein spezifisches Ergebnis. Transgene, jungfräuliche Weibchen der ersten Gal4-Treiberlinie wurden mit transgenen, jungfräulichen Männchen der einzelnen UAS-Linien gekreuzt. Als zusätzliche Kontrolle diente eine UAS_tGFP Linie (bereitgestellt von M. Klingler). Die Auswertung der Kutikula-Präparate dieser Kreuzungen ist in Tabelle 6 dargestellt. Ein spezifischer Phänotyp konnte für keine der Linien gefunden werden. Zwar ist in manchen Kreuzungen der Anteil von nicht entwickelten Eiern erhöht, was auf einen frühen embryonalen Phänotyp hindeuten könnte, allerdings ist dieser Wert auch in der Kontrolle leicht erhöht. Färbungen von 0-18h Ablagen dieser Embryonen gegen das Segmentpolaritätsgen Tc'wingless (Tc'wg) zeigten zwar einen geringen Anteil von morphologisch gestörten Keimstreifen, jedoch waren diese Störungen in etwa zum gleichen Anteil auch in der Kontrolle zu finden. Somit kann keine sichere Aussage darüber getroffen werden, ob eine maternale Misexpression von Tc'Mex3 bzw. Tc'otd zu diesem erhöhten Prozentsatz von nicht entwickelten Eiern führt. Um zu überprüfen ob die maternale Misexpression von Tc'MEX3, Tc'OTD und GFP über das UAS/Gal4-System funktioniert, wurden die Embryonen der einzelnen Kreuzungen mittels AKFärbung auf die Expression der Proteine hin überprüft. Für Tc'MEX3 und Tc'OTD konnte kein verändertes Expressionsmuster gegenüber der wildtypischen Expression festgestellt werden. 44 Ergebnisse Der Test auf GFP Expression in den Embryonen der Kreuzung UAS_tGFP ♂ x panup_Gal4♀ blieb ebenfalls ergebnislos. Dieses Resultat konnte außerdem mittels FreshPreps bestätigt werden. Auch hier zeigte sich bei der Analyse am Fluoreszenz-Mikroskop keine GFP Expression. UAS_Mex3 ♂ x panup_Gal4♀ UAS_Mex3 L1 UAS_Mex3 L2 UAS_Mex3 L3 WT ohne Kutikula unspezifisch gesamt 407 60,2% 267 39,5% 2 0,3% 676 100,0% 609 53,3% 524 45,9% 9 0,8% 1142 100,0% 792 62,2% 474 37,2% 7 0,5% 1273 100,0% UAS_Mex3 L4 WT ohne Kutikula unspezifisch gesamt UAS_Mex3 L5 258 76,8% 76 22,6% 2 0,6% 336 100,0% UAS_Mex3 L6 336 40,5% 485 58,4% 9 1,1% 830 100,0% UAS_Mex3 L8 323 39,4% 491 60,0% 5 0,6% 819 100,0% WT ohne Kutikula unspezifisch gesamt UAS_otd L1 283 59,7% 190 40,1% 1 0,2% 474 100,0% UAS_otd L2 810 58,7% 558 40,4% 12 0,9% 1380 100,0% UAS_otd L3 758 57,7% 548 41,7% 7 0,5% 1313 100,0% UAS_otd L4 380 85,2% 64 14,3% 2 0,4% 446 100,0% WT ohne Kutikula unspezifisch gesamt UAS_otd L7 679 50,4% 655 48,7% 12 0,9% 1346 100,0% UAS_otd L8 548 47,1% 605 52,0% 10 0,9% 1163 100,0% UAS_otd L9 532 52,9% 470 46,7% 4 0,4% 1006 100,0% UAS_otd L10 UAS_otd L11 367 39,6% 369 51,0% 556 60,0% 351 48,5% 3 0,3% 3 0,4% 926 100,0% 723 100,0% 312 81 2 395 79,0% 20,5% 0,5% 100,0% UAS_otd ♂ x panup_Gal4♀ UAS_otd L5 217 90,8% 20 8,4% 2 0,8% 239 100,0% UAS_otd L6 376 41,5% 527 58,2% 2 0,2% 905 100,0% UAS_tGFP ♂ x panup_Gal4♀ WT 1302 68,0% ohne Kutikula 598 31,2% unspezifisch 14 0,7% gesamt 1914 100,0% Tabelle 6: Auswertung der Kutikula-Präparate der Kreuzungen von ♀ der ersten Gal4-Treiberlinie (pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_Gal4∆_Tc'eg-3'UTR]) minPromoter_eg5'UTR_Mex3ORF_eg3'UTR], mit ♂ den UAS-Linien pBac[UAS_pan- pBac[UAS_pan-minPromoter_eg5'UTR_otdORF_eg3'UTR] und UAS_tGFP. (UAS_Mex3 L7 fehlt aufgrund des Verlusts der Linie) Zusammenfassend lässt sich sagen, dass noch einiges an Tests und Analysen erbracht werden muss um ein funktionierendes maternales Misexpressionssystem für Tribolium castaneum zu generieren. Eine maternale Misexpression mittels der regulatorischen Sequenzen von Tc'pan scheint prinzipiell zu funktionieren. Warum keine Gal4-Expression induziert werden konnte bleibt jedoch zu klären. Durch die Generierung weiterer pRed[Tc'pan45 Ergebnisse upstream+5'UTR_Gal4∆_Tc'eg-3'UTR] Linien könnte die Wahrscheinlichkeit erhöht werden eine funktionierende Gal4-Treiberlinie zu erhalten. Zudem könnte die Funktionalität der UAS-Linien durch Kreuzungen mit einer bereits funktionierenden Gal4-Treiberlinie überprüft werden. Ein weiterer wichtiger Punkt, der zu klären bleibt ist die Frage, in welcher Generation die maternale Misexpression über das UAS/Gal4-System überhaupt induzierbar ist. Hierfür sollten auch Ablagen der Nachfolgegeneration, welche beide Konstrukte im Genom trägt, analysiert werden. Durch die Verwendung der zwei verschiedenen Transformationsmarker können diese Tiere einfach selektiert werden. Bis ein funktionierendes maternales Misexpressionssystem für Tribolium etabliert ist, bleibt somit nur die Möglichkeit mit Hilfe des Hitzeschock-Systems Gene von Interesse zygotisch zu manipulieren. Auf dieser Methodik wird im Folgenden das Hauptaugenmerk dieser Arbeit liegen. 3.2 Analyse des Tc'zen2/Tc'Mex3/Tc'cad Systems Wie in der Einleitung bereits erwähnt, sind die genauen Faktoren und Interaktionen der frühen blastodermalen Musterbildung in Tribolium castaneum noch nicht im Detail verstanden. Um neue Erkenntnisse über das Tc'zen2/Tc'Mex3/Tc'cad-System zu erlangen, sollten im Folgenden die Interaktionen dieser Komponenten mit Hilfe von Hitzeschock-Linien für die einzelnen Gene untersucht werden. Die zygotische Misexpression von Tc'Mex3, Tc'cad und Tc'zen2 soll vor allem Aufschluss darüber geben, ob die Interaktionen direkt oder indirekt ablaufen und ein besseres Bild des ganzen Systems liefern. Zu diesem Zweck wurden zum einen Hitzeschock-Linien hergestellt. Zum anderen wurden polyklonale Peptid-Antikörper gegen Tc'MEX3, Tc'ZEN1 und Tc'ZEN2 generiert, um die genauen Interaktionen von mRNA und Proteinen untersuchen zu können. 3.2.1 Generierung von Peptid-Antikörpern gegen Tc'ZEN1, Tc'ZEN2 und Tc'MEX3 Die polyklonalen Peptid-Antikörper wurden in Zusammenarbeit mit der Firma "Pineda Antikörper-Service" (Berlin) hergestellt. Es wurde eine Epitop-Analyse aller drei Gene durchgeführt um mögliche Kreuzreaktionen der späteren Antikörper zu vermeiden. Die Peptid-Sequenzen welche für die Immunisierung ausgewählt wurden sind in Tabelle 7 aufgelistet. 46 Ergebnisse Gen Tc'zen1 Tc'zen2 Tc'Mex3 Name der Peptidsequenz Tc-zen1 - Cterm Tc-zen2 - 1 Tc-Mex3-2 Peptidsequenz NH2- CFYQEGWNGQSFDVSQ -CONH2 NH2- SKDSLEIVKNEEFDSDSKLC -CONH2 NH2- CSEPLTAVSEPDAPADLAPF -CONH2 Tabelle 7: Peptid-Sequenzen zur Herstellung der Antikörper gegen Tc'ZEN1, Tc'ZEN2 und Tc'MEX3 Durch die Wahl dieser Sequenzen soll vor allem auch eine Kreuzreaktion der Antikörper gegen Tc'ZEN1 und Tc'ZEN2 ausgeschlossen werden. Um die Interaktionen aller Gene analysieren zu können, sollte die Möglichkeit für Doppel-Antikörper-Färbungen gegeben sein. Deshalb wurde entschieden für alle Gene Antikörper in Kaninchen (Rb) und Meerschweinchen (GP) herzustellen. Zunächst wurden Prä-Immunseren von jeweils 12 Tieren auf Hintergrundfärbung im Embryo und auch im Westernblot getestet (Daten nicht gezeigt). Auf Grundlage dieser Ergebnisse konnten jeweils zwei Kaninchen und zwei Meerschweinchen für die Immunisierung mit den verschiedenen Peptiden ausgewählt werden. Nach 120 Tagen Immunisierung wurden die Antikörper bei Pineda mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt. Für Tc'ZEN1 und Tc'ZEN2 wurden alle 4 Antikörper aufgereinigt, für Tc'MEX3 nur Rb2, da Testfärbungen der Immunseren nur für diesen Antikörper eine spezifische Expression gezeigt haben. Die somit zur Verfügung stehenden Antikörper sind in Tabelle 8, zusammen mit den optimalen Verdünnungen für AK-Färbungen, aufgeführt. Antikörper Tc'ZEN1 Rb1 Tc'ZEN1 Rb2 Tc'ZEN1 GP1 Tc'ZEN1 GP2 Tc'ZEN2 Rb1 Tc'ZEN2 Rb2 Tc'ZEN2 GP1 Tc'ZEN2 GP2 Tc'MEX3 Rb2 Verdünnung 1:2000 1:2000 1:500 1:500 1:2000 1:2000 1:500 1:500 1:2000 Tabelle 8: Antikörperverdünnungen der generierten AK gegen Tc'ZEN1, Tc'ZEN2 und Tc'MEX3 Als bester Antikörper erwies sich für Tc'ZEN1 und Tc'ZEN2 jeweils Rb2. Bei der Verwendung des Antikörpers gegen Tc'MEX3 ist die spezielle Fixierung der Embryonen zu beachten, die unter Material und Methoden beschrieben ist (vgl. 2.9). 47 Ergebnisse 3.2.2 Expression der generierten Antikörper gegen Tc'ZEN1, Tc'ZEN2 und Tc'MEX3 Die aufgereinigten Antikörper konnten nun für Färbungen genutzt werden um Aufschluss über die wildtypische Protein-Expression von Tc'ZEN1, Tc'ZEN2 und Tc'MEX3 zu geben. Zum Vergleich sind im Folgenden auch die Expressionen der jeweiligen mRNAs gezeigt. Wie bereits erwähnt, ist Tc'zen1 für die Bildung der extraembryonalen Serosa von essentieller Bedeutung (van der Zee et al., 2005). Diese Funktion geht einher mit seiner Expression. Die erste Tc'zen1 mRNA Expression zeigt sich in undifferenzierten Blastodermen in einer schrägen, anterioren Kappe (Abbildung 10 A; Falciani et al. 1996). Diese Zellen werden später zu Zellen der extraembryonalen Serosa. Nach der Differenzierung des Embryos bleibt die mRNA von Tc'zen1 in der Serosa exprimiert. Anhand der Färbung kann gut die typische abgeschrägte Grenze zwischen extraembryonaler Serosa und embryonalem Gewebe erkannt werden (Abbildung 10 B). Wie zu erwarten zeigt sich die Färbung der mRNA im Zytoplasma der Tc'zen1 positiven Zellen. Im Gegensatz dazu ist das Tc'ZEN1 Protein in den Zellkernen lokalisiert (Abbildung 10 C F). Wie auch die mRNA, ist das Protein in undifferenzierten Blastodermen anterior in den Zellen der zukünftigen Serosa exprimiert (Abbildung 10 C). Diese spezifische Expression bleibt auch nach der Differenzierung der Blastoderme in den Serosa-Zellen bestehen (Abbildung 10 D). In späten Stadien der Invagination, wenn die Serosa den Embryo zu umschließen beginnt, ist das Tc'ZEN1 Protein nur noch entlang des Serosa-Randes zu erkennen (Abbildung 10 E, Pfeilspitze). Die restliche Serosa ist frei von Tc'ZEN1 Expression. Auch in Keimrudiment-Stadien bleibt diese Expression erhalten. Wie in Abbildung 10 F zu sehen ist die Protein-Expression von Tc'ZEN1 auf die Zellkerne, rund um das SerosaFenster begrenzt. 48 Ergebnisse Abbildung 10: In-Situ Hybridisierung gegen Tc'zen1 im WT (A-B). Antikörperfärbung gegen Tc'ZEN1 im WT (C-F). A-F Hellfeldaufnahmen A'-F' Hoechstfärbung der Zellkerne der korrespondierenden Embryonen. A-E laterale Ansicht. F ventrale Ansicht eines Keimrudiments. Anterior befindet sich in allen Abbildungen links. A) Die Tc'zen1 mRNA zeigt sich in undifferenzierten Blastodermen als anteriore Kappe in Zellen, welche später die extraembryonale Serosa bilden. B) In differenzierten Blastodermen ist Tc'zen1 anterior in der gesamten extraembryonalen Serosa exprimiert. C) Das Tc'ZEN1 Protein ist in undifferenzierten Blastodermen anterior in den Zellkernen der Zellen exprimiert, die später die Serosa bilden. D) Im differenzierten Blastoderm ist Tc'ZEN1 in den Zellkernen der Serosa lokalisiert. E) In späteren Stadien, der Invagination zeigt sich Tc'ZEN1 nur noch in 49 Ergebnisse Serosa-Zellen am Rand des Serosa-Fensters (Pfeilspitze). F) Auch in Keimrudiment-Stadien bleibt die ProteinExpression von Tc'ZEN1 rund um das Serosa-Fenster bestehen (Pfeilspitze). Ähnlich wie Tc'zen1 ist auch Tc'zen2 in der Serosa exprimiert (Abbildung 11; van der Zee et al., 2005). Durch In-Situ Hybridisierungen kann die Tc'zen2 mRNA im Zytoplasma des extraembryonalen Gewebes, in differenzierten Blastodermen sichtbar gemacht werden (Abbildung 11 A). Auch in Keimrudiment-Stadien, wenn der Embryo beinahe komplett von der extraembryonalen Membran umschlossen ist, bleibt die Tc'zen2 mRNA in der gesamten Serosa exprimiert (Abbildung 11 B + B*). Wie die mRNA, ist auch das Tc'ZEN2 Protein in differenzierten Blastodermen ausschließlich in den Zellen der Serosa exprimiert, jedoch wird es hier im Zellkern lokalisiert (Abbildung 11 C). In allen weiteren Stadien, wenn die Serosa den Embryo umschließt, bleibt die Expression von Tc'ZEN2 in allen Zellen der extraembryonalen Membran erhalten (Abbildung 11 D + D*). Betrachtet man das Serosa-Fenster in Keimrudiment-Stadien genauer, entsteht der Eindruck als wenn die Zellen am Rand des Serosa-Fensters frei von Tc'ZEN2 Protein-Expression sind (Abbildung 11 D*, Pfeilspitze). Es wäre denkbar, dass es sich hierbei genau um die Zellen handelt, welche positiv für das Tc'ZEN1 Protein sind (vgl. Abbildung 10 F). 50 Ergebnisse Abbildung 11: In-Situ Hybridisierung gegen Tc'zen2 im WT (A-B*). Antikörperfärbung gegen Tc'ZEN2 im WT (C-D*). A-D, B*, D* Hellfeldaufnahmen A'-D', B*', D*' Hoechstfärbung der Zellkerne der korrespondierenden Embryonen. A-D laterale Ansicht. B* + D* ventrale Ansicht der Embryonen aus B + D. Anterior befindet sich in allen Abbildungen links. A) Die Tc'zen2 mRNA ist in differenzierten Blastodermen im Zytoplasma der SerosaZellen exprimiert. B + B*) Auch nach der Invagination bleibt Tc'zen2 in der gesamten Serosa exprimiert, welche den Embryo umschließt. C) Das Tc'ZEN2 Protein ist ebenfalls in der extraembryonalen Serosa exprimiert. Jedoch ist es in den Zellkernen lokalisiert. D) Nach der Invagination ist Tc'ZEN2 weiterhin in den Zellkernen der ganzen 51 Ergebnisse Serosa exprimiert. D*) Die Ansicht von ventral erweckt den Eindruck als wären die Zellen rund um das SerosaFenster frei von Tc'ZEN2 Protein-Expression (Pfeilspitze). In-Situ Hybridisierungen gegen Tc'Mex3 zeigen in späten undifferenzierten Blastodermen eine ubiquitäre Expression der mRNA im embryonalen Gewebe (Abbildung 12; Schoppmeier et al., 2009). Die anterior gelegene Serosa bleibt frei von Expression (Abbildung 12 A). Im Lauf der Entwicklung, mit Einsetzen der Invagination, spaltet sich die Expression in zwei Domänen auf. Anterior ist die Tc'Mex3 mRNA nun im Bereich des anterioren Kopfes exprimiert. Diese Domäne zeigt zudem eine verstärkte Expression an ihren anterioren und posterioren Rändern. Eine zweite Domäne der Tc'Mex3 mRNA befindet sich am posterioren Ende der Embryos rund um den Bereich der Invagination (Abbildung 12 B + B*). Ein wenig später spaltet sich die anteriore Kopfdomäne in zwei getrennte Streifen auf, sodass sich am Ende des Blastoderm-Stadiums die Expression der Tc'Mex3 mRNA als drei separate Streifen darstellt (Abbildung 12 C + C*). Die Färbung mit dem neu generierten Antikörper zeigt eine ähnliche Expression des Tc'MEX3 Proteins in blastodermalen Stadien. In frühen differenzierten Blastodermen ist das Protein, wie auch die mRNA, ubiquitär im embryonalen Gewebe exprimiert. Auch hier bleibt die Serosa frei von Expression (Abbildung 12 D). Mit Beginn der Invagination spaltet sich auch die Protein-Expression in eine anteriore Domäne im Kopf und eine posteriore Domäne um den Invaginations-Bereich auf (Abbildung 12 E + E*). Die drei separaten ExpressionsStreifen, welche die mRNA am Ende des Blastoderm-Stadiums zeigt, sind auch für die Protein-Expression zu finden (Abbildung 12 F + F*). Zu allen Zeitpunkten ist das Tc'MEX3 Protein im Zytoplasma lokalisiert. Dies macht Sinn, da das KH-Domänen Protein Tc'MEX3, als Translationsfaktor genau in diesem Bereich seine Aufgaben erfüllt (Draper et al., 1996). Die übereinstimmenden Expressionsmuster der mRNA-Sonden und der neu hergestellten Antikörper zeigen deutlich, dass die Generierung spezifischer Antikörper gegen Tc'ZEN1, Tc'ZEN2 und Tc'MEX3 erfolgreich war. Aufgrund der unterschiedlichen Expressionsmuster von Tc'ZEN1 und Tc'ZEN2 in späten Stadien kann außerdem ausgeschlossen werden, dass die Antikörper gegen die zwei doch sehr ähnlichen zerknüllt-Gene in irgendeiner Weise kreuzreagieren. 52 Ergebnisse Abbildung 12: In-Situ Hybridisierung gegen Tc'Mex3 im WT Blastoderm (A-D). Antikörperfärbung gegen Tc'MEX3 im WT Blastoderm (E-F). A-F, B*, C*, E*, F* Hellfeldaufnahmen Blastodermstadien. A'-F', B*`, C*`, E*`, F*` Hoechstfärbung der Zellkerne der korrespondierenden Embryonen. A-F laterale Ansicht. B*`, C*`, E*`, F*` ventrale Ansicht der Embryonen in B,C,E,F. Anterior befindet sich in allen Abbildungen links. A) Tc'Mex3 mRNA ist in frühen differenzierten Blastodermstadien im embryonalen Gewebe (e) ubiquitär exprimiert. B + B*) Zu Beginn der Invagination spaltet sich die Tc'Mex3 Expression in zwei Domänen auf (Balken). Die anteriore Domäne, welche im späteren Kopfgewebe liegt, zeigt dabei anterior und posterior eine verstärkte Expression. C + C*) Während der fortschreitenden Entwicklung spaltet sich die anteriore Kopfdomäne von Tc'Mex3 in zwei einzelne Streifen auf, wodurch ein Muster von drei Tc'Mex3 Streifen im Blastoderm entsteht (Balken). D) Im frühen differenzierten Blastoderm ist das Tc'MEX3 Protein ubiquitär im embryonalen Gewebe (e) verteilt. E + E*) Zu Beginn der Invagination zeigt sich eine anteriore Tc'MEX3 Domäne im Kopfgewebe und eine zweite am posterioren Ende des Embryos (Balken). F + F*) Die anteriore Kopfdomäne von Tc'MEX3 spaltet sich während der weiteren Entwicklung in zwei Domänen auf (Balken). Tc'MEX3 zeigt also, wie die mRNA auch, ein Muster von drei Streifen im differenzierten Blastoderm. e: embryonales Gewebe 53 Ergebnisse 3.2.3 Misexpression von Tc'ZEN2, Tc'MEX3 und Tc'CAD mittels Hitzeschock Für die Analyse der Interaktionen zwischen Tc'zen2, Tc'Mex3 und Tc'cad sollten diese Gene möglichst früh in der Entwicklung misexprimiert werden. Da ein funktionales, maternales Misexpressionssystem für Tribolium castaneum noch nicht existiert, wurde in diesem Fall auf den embryonalen Hitzeschock zurück gegriffen. Die Verwendung von Hitzeschock-Konstrukten bietet die Möglichkeit jedes gewünschte Gen, mittels Hitzeschock, zu allen gewünschten Zeitpunkten der Entwicklung zu induzieren. Das Prinzip beruht auf der Nutzung des endogenen Hitzeschock-Promoters Tc'hsp68 (Schinko et al., 2012). Abbildung 13 zeigt exemplarisch den Aufbau eines solchen HitzeschockKonstrukts. Zur Generierung transgener Stämme mittels Keimbahntransformation, ist das Konstrukt 5' und 3' von piggyBac-Sequenzen flankiert, welche von der Transposase erkannt werden können (Lorenzen et al., 2003). Das Hitzeschock-Konstrukt selbst enthält den Open reading frame (ORF) des Gens, welches misexprimiert werden soll, flankiert von der 5' und 3' UTR des Hitzeschock-Gens Tc'hsp68. Als interne Kontrolle ist zudem die kodierende Sequenz von dsRed enthalten, welche ebenfalls über die regulatorischen Sequenzen von Tc'hsp68 gesteuert wird. Mit Hilfe dieser Kontrolle kann später die Funktionalität des Hitzeschocks nachgewiesen werden, selbst wenn kein phänotypischer Defekt zu sehen ist. Als Transformationsmarker enthält das Konstrukt zudem eGFP, welches über den augenspezifischen 3xP3-Promoter getrieben wird. Die Konstrukte pBac[Tc'hsp5'-dsRedEx-3'UTR;5'Tc-hsp68-Tc-zen2-Tc-hsp68-3'] pBac[Tc'hsp5'-dsRedEx-3'UTR;5'Tc-hsp68-Tc-Mex3-Tc-hsp68-3'] wurden von und Dorothea Musazzi kloniert (persönliche Mitteilung M. Schoppmeier) und waren somit bereits vorhanden. Für die Generierung transgener Hitzeschock-Linien wurden die Konstrukte embryonal in vw- Eier injiziert. Eine funktionale HScad-Linie war bereits im Labor vorhanden (generiert von D. Musazzi; persönliche Mitteilung M. Schoppmeier). Für pBac[Tc'hsp5'-dsRedEx-3'UTR;5'Tc-hsp68-Tc-zen2-Tc-hsp68-3'] wurden 658 Eier injiziert, wovon 106 Larven abgesammelt werden konnten (Überlebensrate: 16,1%). Die 42 Kreuzungen, welche draus angesetzt wurden ergaben 10 unabhängige, transgene Linien. Dies entspricht einer Transformationsrate von 23,8%. Die Injektion von pBac[Tc'hsp5'-dsRedEx-3'UTR;5'Tc-hsp68-Tc-Mex3-Tc-hsp68-3'] in 361 Eier, erbrachte 127 Larven (Überlebensrate: 32,2%) und in Folge dessen 72 Kreuzungen. Aus diesen konnten 20 unabhängige, transgene Linien gewonnen werden (Transformationsrate: 27,8%). 54 Ergebnisse Abbildung 13: Schema des Hitzeschock-Vektors. Um die Funktionalität des Hitzeschock-Konstrukts in den einzelnen Linien zu überprüfen, sollte zunächst die Protein-Misexpression mit Hilfe von Antikörper-Färbungen nachgewiesen werden. Hierfür wurden die Linien expandiert und transgene Tieren mit Hilfe des Augenmarkers eGFP selektiert. Für die Färbung wurde dann für jede Linie eine 20h-Eiablage genommen und diese bei 48°C für 5 Minuten im Wasserbad geschockt. Diese HitzeschockBedingungen erwiesen sich nach Schinko et al., 2012, bezüglich der Misexpressions-Stärke, unerwünschten unspezifischen Defekten und Überlebensrate als optimal für den embryonalen Hitzeschock. Eine weitere Stunde Nachreifezeit bei 32°C sollte garantieren, dass die Proteine möglichst stark in den hitzegeschockten Embryonen misexprimiert sind. Nach dieser Nachreifezeit wurden die Embryonen der vw-, der HScad Linie und der HSzen2 Linien ganz normal fixiert. Für die Färbung mit dem Tc'MEX3 Antikörper mussten die Embryonen, wie im Material und Methoden Teil beschrieben, nach einer speziellen Prozedur fixiert werden (vgl. 2.9). 55 Ergebnisse Die Ergebnisse dieser Färbungen sind in Abbildung 14, für Blastoderme und in Abbildung 15, für Keimstreifen zu sehen. Für die Misexpression durch Hitzeschock gilt generell, dass die Aktivierung in blastodermalen Stadien erst möglich ist wenn bereits das zygotische Genom aktiv ist. Dies bedeutet, dass es frühestens im späten undifferenzierten bzw. frühen differenzierten Blastoderm-Stadium zu einer Misexpression von Genen kommen kann. Abbildung 14 A zeigte einen hitzegeschockten vw- Kontrollembryo im späten undifferenzierten Blastoderm-Stadium. Die Zellkerne der späteren extraembryonalen Serosa zeigen die wildtypische Expression des Tc'ZEN2 Proteins in einer anterioren Kappe (Pfeilspitzen). In Blastodermen der HSzen2 Linien kann eine Stunde nach Hitzeschock eine starke Misexpression des Proteins auch in Zellkernen des embryonalen Gewebes ausgemacht werden (Abbildung 14 B). Wie für den Hitzeschock üblich zeigen nicht alle Zellen eine Misexpression des Proteins, was das Expressionsmuster ungleichmäßig wirken lässt. Anterior ist weiterhin die wildtypische Expression von Tc'ZEN2 in der Serosa zu sehen (Pfeilspitzen; Abbildung 14 B). Das Tc'MEX3 Protein ist in vw- Blastodermen im typischen Streifenmuster im embryonalen Gewebe exprimiert (Balken; Abbildung 14 C). Blastoderme der HSMex3 Linien zeigen eine sehr starke Misexpression des Proteins in der Serosa. Aber auch im embryonalen Gewebe sind ubiquitär verteilt Zellen mit Tc'MEX3 Expression zu finden (Abbildung 14 D). Auch wenn das Muster des misexprimierten Tc'MEX3 Proteins relativ gepunktet wirkt kann bei genauerer Betrachtung festgestellt werden, dass sich auch das ektopische Protein im Zytoplasma befindet. Die Färbung der ektopischen Expression von Tc'MEX3 ging im Vergleich mit der Wildtypfärbung relativ schnell. Dies liegt vermutlich an der enormen Menge, in der das Protein misexprimiert wird. Dies kann auch erklären warum in HSMex3 Blastodermen die wildtypische Expression nicht wirklich zu sehen ist. Diese würde erst viel später sichtbar werden. Zu diesem Zeitpunkt wären die Embryonen jedoch aufgrund der starken Färbung des ektopischen Proteins bereits überfärbt. Die wildtypische Tc'CAD Expression innerhalb der Zellkerne des posterioren Bereich des Blastoderms zeigt sich, eine Stunde nach Hitzeschock, auch in den vw- Embryonen (Abbildung 14 E). Abbildung 14 F zeigt die Tc'CAD Misexpression in HScad. Zusätzlich zur posterioren Wildtyp-Expression sind im anterioren Bereich ebenfalls viele Zellkerne positiv für das Tc'CAD Protein. Das Muster wirkt insgesamt etwas unregelmäßig, da es sich hier um ein relativ frühes differenziertes Blastoderm handelt. Wie bereits erwähnt, ist die Aktivierung des Hitzeschock-Konstrukts in diesen Stadien noch nicht immer vollständig möglich. Für die Hoechstfärbung aller Hitzeschock-Embryonen muss außerdem erwähnt werden, dass die Fluoreszenz des DNA-Markers Hoechst durch die starke Färbung der 56 Ergebnisse misexprimierten Proteine deutlich reduziert erscheint (Abbildung 14 B', D', F'). Die ungleichmäßig wirkende Hoechst-Färbung hat also nichts mit etwaigen Defekten in den embryonalen Zellen zu tun. Abbildung 14: Hitzeschock induzierte Misexpression blastodermalen Stadien 1h nach Hitzeschock. von Tc'ZEN2, Tc'MEX3 und Tc'CAD in A-F Hellfeldaufnahmen A'-F' Hoechstfärbung der Zellkerne der korrespondierenden Embryonen. Durch die starke Proteinexpression wirkt das Hoechst-Signal in einigen 57 Ergebnisse Zellen extrem abgeschwächt. A-F laterale Ansicht. Anterior befindet sich in allen Abbildungen links. A) Das - Tc'ZEN2 Protein bildet in hitzegeschockten vw Kontrollembryonen die wildtypische, anteriore Expressionskappe in den Zellen der zukünftigen Serosa (Pfeile). B) In HSzen2 Embryonen wird die Tc'ZEN2 Expression nicht nur in den Zellen der Serosa (Pfeile) induziert, sondern auch ektopisch in den Zellkernen des embryonalen Gewebes. - C) Wildtypische Tc'MEX3 Expression in vw HS Embryonen. Die Balken markieren die zwei typischen embryonalen Expressions-Streifen. D) In HSMex3 Embryonen zeigt sich 1h nach Hitzeschock starke ektopische Expression von Tc'MEX3, anterior in der extraembryonalen Serosa. E) Tc'CAD ist in den Kontrollembryonen, wie im Wildtyp, posterior im embryonalen Gewebe exprimiert (Balken). F) 1h nach dem Hitzeschock zeigt sich in HScad Blastodermen nicht nur die wildtypische, posteriore Expression, sondern auch ektopische Protein- Expression in der anterioren Hälfte des Embryos. Die Aktivierung der Hitzeschock-Konstrukte in Keimstreifen funktioniert deutlich homogener als in frühen Blastodermen. Dies ist in Abbildung 15 zu sehen. Tc'ZEN2 ist in Keimstreifen der vw- Kontrolle wie zu erwarten nicht im embryonalen Gewebe exprimiert. Nicht abpräparierte Reste der extraembryonalen Serosa zeigen jedoch die wildtypische Proteinexpression in den Zellkernen (Pfeilkopf; Abbildung 15 A). Keimstreifen der HSzen2 Linien zeigen eine Stunde nach Hitzeschock eine homogene zelluläre Misexpression des Tc'ZEN2 Proteins in den embryonalen Zellen (Abbildung 15 D). Tc'MEX3 ist in Keimrudimenten der hitzegeschockten Wildtyp-Kontrolle in drei Domänen exprimiert (Pfeilspitzen und Balken; Abbildung 15 B). Anterior in den Kopflappen (Pfeilspitzen), in einem Streifen innerhalb der gnathalen Segmente und in einer posterioren Domäne. Nach dem Hitzeschock ist das Tc'MEX3 Protein in HSMex3 Keimrudimenten ubiquitär in fast allen Zellen misexprimiert (Abbildung 15 E). Wie auch im Blastoderm wirkt die Expression hier, aufgrund der starken Misexpression rund um den Zellkern, gepunktet. Das Protein ist jedoch weiterhin wie zu erwarten im Zytoplasma lokalisiert. Die vw- Kontrolle für die Tc'CAD Färbung zeigt die typische Protein-Expression posterior in der Wachstumszone der Keimstreifen (Abbildung 15 C). In HScad Keimstreifen ist eine Stunde nach Hitzeschock eine ubiquitäre Misexpression des Tc'CAD Proteins in den Zellkernen zu erkennen (Abbildung 15 F). Die Misexpression der einzelnen Proteine, mittels der Hitzeschock-Konstrukte funktioniert somit zufriedenstellend. Wie zu erwarten, ist die Expression in den Blastodermen der Hitzeschock-Linien in frühen Stadien etwas inhomogener als in den Keimstreif-Stadien (Schinko et al., 2012). Diese Ergebnisse zeigen jedoch, dass es möglich ist die Misexpression zu unterschiedlichsten Zeitpunkten der Entwicklung zu induzieren. Somit kann nun die Auswirkung dieser Misexpression, in den gewünschten Entwicklungsstadien, untersucht werden. 58 Ergebnisse Abbildung 15: Hitzeschock induzierte Misexpression von Tc'ZEN2, Tc'MEX3 und Tc'CAD in Keimstreifen 1h nach Hitzeschock. A-F Hellfeldaufnahmen. Anterior befindet sich in allen Abbildungen links. A) Tc'ZEN2 ist in den Keimstreifen der vw - Kontrollembryonen nicht exprimiert. Reste der Serosa zeigen jedoch Proteinexpression in den Zellkernen (Pfeilspitze). B) Tc'MEX3 ist wildtypisch im Keimrudiment in drei Domänen exprimiert. Anterior in den Kopflappen (Pfeilspitzen), in einem Streifen innerhalb der gnathalen Segmente und in - einer posterioren Domäne (Balken). C) Tc'CAD Expression findet sich in der vw Kontrolle in der posterioren Wachstumszone des Keimstreifs. D) Eine Stunde nach Hitzeschock ist das Tc'ZEN2 Protein ubiquitär in den Zellkernen des Keimstreifs der HSzen2 Linien exprimiert. E) Das Tc'MEX3 Protein ist HSMex3 Keimrudimenten stark im Zytoplasma der Zellen misexprimiert. F) Eine Stunde nach Hitzeschock zeigt sich in den Keimstreifen der HScad Linie eine starke ubiquitäre Misexpression des Tc'CAD Proteins in den Zellkernen. 59 Ergebnisse 3.2.4 Tc'ZEN2- Misexpression verursacht starke Defekte auf Kutikula-Ebene Zur Analyse der Auswirkungen einer Tc'ZEN2 Misexpression auf die Entwicklung, wurden die 10 transgenen HSzen2 Linien zunächst, auf Grundlage der Antikörper-Färbung gegen Tc'ZEN2, auf 5 Linien reduziert. Es wurden nur die Linien weiter bearbeitet, die eine möglichst starke und homogene Misexpression des Proteins nach dem Hitzeschock zeigen. Um mögliche Entwicklungsdefekte aufgrund der Tc'ZEN2 Misexpression zu erkennen, sollten Kutikula-Präparate von hitzegeschockten Embryonen analysiert werden. Es wurden zunächst zwei relativ lange Ablagefenster gewählt, um vorab zu klären ob und ab welchen Entwicklungsstadien überhaupt ein Phänotyp durch den Hitzeschock induzierbar ist. Die gewählten Zeitpunkte waren ein Hitzeschock von 4-9h alten Embryonen (5h ablegen, 4h nachreifen) und einer von 8-12h alten Embryonen (4h ablegen, 8h nachreifen). Diese Ablagefenster wurden gewählt um eine möglichst frühe Misexpression zu erzielen und somit die Interaktionen der Gene im frühen Blastoderm-Patterning studieren zu können. Wie bereits erwähnt, funktioniert die Aktivierung der Hitzeschock-Konstrukte erst im späten undifferenzierten Blastoderm bis frühes differenziertes Blastoderm. Dies sind genau die Entwicklungsstadien, in welchen sich die Embryonen der 4-9h Ablage zum Zeitpunkt des Hitzeschocks befinden. Somit ist dies der früheste Zeitpunkt an dem eventuell ein KutikulaPhänotyp zu erwarten wäre. Als Kontrolle wurde stets eine vw- Ablage in der selben Art und Weise behandelt wie die HSzen2 Linien. Tabelle 9 zeigt die Verteilung von Kutikula-Defekten in den fünf getesteten HSzen2 Linien und der vw- Kontrolle nach dem Hitzeschock auf 4-9h alte Embryonen. Im Vergleich zur Kontrolle kann für keine der HSzen2 Linien ein spezifischer Kutikula-Defekt gefunden werden. In allen fünf HSzen2 Linien ist jedoch der Anteil von nichtentwickelten Embryonen, die keine Kutikula bilden deutlich erhöht (47,8 - 73,3%). Allerdings kann dieser Effekt auch in der Wildtyp-Kontrolle beobachtet werden (45,8%). Somit kann darauf geschlossen werden, dass es sich hierbei um einen unspezifischen Entwicklungsdefekt handelt, der nicht durch die Misexpression von Tc'ZEN2 ausgelöst wurde sondern durch den Hitzeschock selbst. Es ist durchaus denkbar, dass ein Hitzeschock in so frühen Stadien zu einem kompletten Abbruch der Entwicklung führt und somit auch zu Eiern ohne Kutikula. Zudem muss weiterhin der Aspekt bedacht werden, dass die Aktivierung der HitzeschockKonstrukte zu solch frühen Zeitpunkten, wenn überhaupt nur sehr schwach bzw. inhomogen funktioniert. 60 Ergebnisse HSzen2 L1 HSzen2 L2 HSzen2 L4 HSzen2 L6 HSzen2 L9 WT 33 30,8% 23 22,8% 6 16,2% 25 26,9% 44 47,8% ohne Kutikula 70 65,4% 74 73,3% 26 70,3% 62 66,7% 44 47,8% Kopf reduziert 1 0,9% 0 0,0% 0 0,0% 2 2,2% 0 0,0% Kopf + Thorax reduziert 1 0,9% 1 1,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 1,1% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,9% 0 0,0% 1 2,7% 0 0,0% 0 0,0% Abdomen reduziert 0 0,0% 0 0,0% 1 2,7% 1 1,1% 0 0,0% dorsal offen 0 0,0% 2 2,0% 3 8,1% 1 1,1% 2 2,2% unspezifisch 1 0,9% 1 1,0% 0 0,0% 2 2,2% 1 1,1% Kopf + Abdomen reduziert Kopf + Thorax + Abdomen reduziert gesamt 107 100,0% 101 100,0% 37 100,0% 93 100,0% 92 100,0% - vw Kontrolle WT 435 50,9% ohne Kutikula 391 45,8% Kopf reduziert 14 1,6% Kopf + Thorax reduziert 4 0,5% Thorax reduziert 1 0,1% 1 0,1% 0 0,0% Abdomen reduziert 2 0,2% dorsal offen 1 0,1% unspezifisch 5 0,6% Thorax + Abdomen reduziert Kopf + Thorax + Abdomen reduziert gesamt 854 100,0% Tabelle 9: HSzen2 Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 4-9h alte Embryonen. Anzahl und prozentualer Anteil der verschiedenen Phänotyp-Klassen. Benannt sind jeweils die betroffenen Körperbereiche (Kopf, Thorax, Abdomen). reduziert: Verkleinerung bzw. teilweiser oder auch kompletter Verlust von Strukturen - und Segmenten. unspezifisch: Defekte, welche als Hintergrund auch in der vw Kontrolle auftreten. Im zweiten getesteten Ablagefenster sind die Embryonen zum Zeitpunkt des Hitzeschocks 812h alt. Zu diesem Zeitpunkt befinden sich die meisten Embryonen bereits im differenzierten Blastoderm-Stadium. Somit sollte eine ausreichende Aktivierung der Hitzeschock-Konstrukte und damit der Tc'ZEN2 Misexpression möglich sein. Dies schlägt sich in den KutikulaPhänotypen nieder. Tatsächlich zeigen sich nach dieser Hitzeschock-Prozedur spezifische Kutikula-Phänotypen in den HSzen2 Linien, welche nicht in der vw- Kontrolle zu finden sind (Tabelle 10). Dies deutet darauf hin, dass es sich um Entwicklungsdefekte handelt, die durch die Misexpression von Tc'ZEN2 entstanden sind. Der prozentuale Anteil der wildtypischen Larven ist in den HSzen2 Linien mit 61,5 - 29,7%, gegenüber der Kontrolle (82,2%) deutlich reduziert. Im Gegensatz zum früheren Hitzeschock (4-9h) findet man hier jedoch weniger Embryonen, die überhaupt keine Kutikula zeigen sondern vor allem spezifische Kutikula-Defekte. Diese 61 Ergebnisse zeigen sich vornehmlich als Defekte und Deletionen im Kopf, Kopf und Thorax und auch in Larven mit Deletionen und Defekten die Kopf, Thorax und Abdomen gleichzeitig betreffen (vgl. Abbildung 17 und Abbildung 18). Die Analyse der vw- Kontrolle dieses Hitzeschock-Fensters stützt zudem die These, dass der Hitzeschock in sehr frühen Zeitpunkten (4-9h) zu einem kompletten Abbruch der Entwicklung führen kann. Sind die ersten kritischen Entwicklungsprozesse bereits passiert, wie hier in der 8-12h Ablage, zeigen sich in der Kontrolle keine unspezifischen Defekte mehr, die durch den Hitzeschock an sich ausgelöst werden. Der Anteil von Wildtypen (82,2%) und nicht entwickelten Eiern (14,1%) liegt im normalen Bereich einer wildtypischen Ablage. HSzen2 L1 HSzen2 L2 HSzen2 L4 HSzen2 L6 HSzen2 L9 WT 59 50,4% 29 37,7% 8 61,5% 22 52,4% 19 29,7% ohne Kutikula 27 23,1% 22 28,6% 2 15,4% 13 31,0% 11 17,2% Kopf reduziert 10 8,5% 13 16,9% 0 0,0% 2 4,8% 10 15,6% 7 6,0% 4 5,2% 0 0,0% 1 2,4% 7 10,9% 5 4,3% 0 0,0% 1 7,7% 1 2,4% 3 4,7% 4 3,4% 3 3,9% 0 0,0% 1 2,4% 10 15,6% Abdomen reduziert 1 0,9% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% dorsal offen 3 2,6% 4 5,2% 1 7,7% 0 0,0% 3 4,7% 1 0,9% 2 2,6% 1 7,7% 2 4,8% 1 1,6% 117 100,0% 77 100,0% Kopf + Thorax reduziert Kopf + Abdomen reduziert Kopf + Thorax + Abdomen reduziert unspezifisch gesamt 13 100,0% 42 100,0% 64 100,0% - vw Kontrolle WT 912 82,2% ohne Kutikula 156 14,1% Kopf reduziert 17 1,5% 3 0,3% 0 0,0% 3 0,3% 5 0,5% 14 1,3% Kopf + Thorax reduziert Kopf + Abdomen reduziert Kopf + Thorax + Abdomen reduziert Abdomen reduziert unspezifisch gesamt 1110 100,0% Tabelle 10: HSzen2 Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 8-12h alte Embryonen. Anzahl und prozentualer Anteil der verschiedenen Phänotyp-Klassen. Benannt sind jeweils die betroffenen Körperbereiche (Kopf, Thorax, Abdomen). reduziert: Verkleinerung bzw. teilweiser oder auch kompletter Verlust von Strukturen - und Segmenten. unspezifisch: Defekte, welche als Hintergrund auch in der vw Kontrolle auftreten. Somit konnten die ersten Tests zeigen, dass die Misexpression von Tc'ZEN2 einen deutlichen Effekt auf die Entwicklung zu haben scheint, welcher eingehender untersucht werden muss. Hierfür war es jedoch nötig die Linien weiter zu reduzieren. 62 Ergebnisse Aufgrund der oben gezeigten Daten, wurden die zwei Linien mit dem größten Anteil an Kutikula-Phänotypen ausgewählt (HSzen2 L2 und L9). Die Auswertung einer größeren Ablage dieser beiden Linien zeigt nochmals deutlich die Auswirkung der Tc'ZEN2 Misexpression auf die embryonale Entwicklung (Tabelle 11). Der Anteil der wildtypischen Larven ist auf 38,1% bzw. 25,5% reduziert und die spezifischen Deletionen und Defekte in Kopf, Thorax und Abdomen machen einen Gesamtanteil von 29,9%, bis hin zu 48,7% aus. Um den Effekt der Tc'ZEN2 Misexpression eventuell noch zu verstärken und auch für eine leichtere Handhabung der Käferstämme wurden diese beiden Linien jeweils zu homozygoten Stämmen gemacht (vgl. Material und Methoden, 2.7). Für weitere Analysen wurde zudem nur noch Linie 9 herangezogen, da diese den größten Anteil an Phänotypen zeigt. HSzen2 L2 HSzen2 L9 WT 93 38,1% 69 25,5% ohne Kutikula 68 27,9% 63 23,2% Kopf reduziert (z.T. mit Transformation zur Antenne) 10 4,1% 39 14,4% Kopf + Thorax reduziert 11 4,5% 8 3,0% 8 3,3% 6 2,2% 44 18,0% 76 28,0% 0 0,0% 3 1,1% dorsal offen 5 2,0% 5 1,8% unspezifisch 5 2,0% 2 0,7% 244 100,0% 271 100,0% Kopf + Abdomen reduziert Kopf + Thorax + Abdomen reduziert (z.T. mit Beinstummel) Abdomen reduziert/defekt (z.T. mit Beinstummel) gesamt Tabelle 11: Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 8-12h alte Embryonen in HSzen2 L2 und L9. Anzahl und prozentualer Anteil der verschiedenen Phänotyp-Klassen. Benannt sind jeweils die betroffenen Körperbereiche (Kopf, Thorax, Abdomen). reduziert: Verkleinerung bzw. teilweiser oder auch kompletter Verlust - von Strukturen und Segmenten. unspezifisch: Defekte, welche als Hintergrund auch in der vw Kontrolle auftreten. 3.2.5 Die zeitlich veränderte Misexpression von Tc'ZEN2 führt zu einer Verschiebung der Kutikula-Defekte innerhalb der Larven Wie bereits erwähnt, bietet die Methode der Hitzeschock-Konstrukte die Möglichkeit das Gen von Interesse beinahe zu allen gewünschten Zeitpunkten der Entwicklung zu misexprimieren. Die ersten Analysen der Kutikula-Phänotypen bezogen sich auf ein relativ langes Ablagefenster von 4 Stunden. Um nun genauer zu untersuchen in welchem Entwicklungsstadium die Misexpression von Tc'ZEN2 zu welchen Kutikulas-Defekten führt, wurden nun kürzere Ablagefenster von nur 2 Stunden gewählt und die Embryonen zu unterschiedlichen Zeitpunkten geschockt. Insgesamt wurden 4 verschiedene Zeitpunkte 63 Ergebnisse untersucht. Diese sind, zusammen mit den Stadien, in welchen sich die Embryonen zum Zeitpunkt des Hitzeschocks befinden in Tabelle 12 aufgeführt. Hitzeschock-Zeitpunkt 8-10h alt 10-12h alt 12-14h alt 14-16h alt Stadium der Embryonen spätes undifferenziertes Blastoderm frühes differenziertes Blastoderm differenziertes Blastoderm Serosa-Ring kurzer Keimstreif U-Stadium U-Stadium elongierter Keimstreif Tabelle 12: 2h Ablagen für den Hitzeschock und die korrespondierenden embryonalen Stadien. Zum einen wurde die lange Ablage aus den Vorversuchen in zwei einzelne Ablagefenster von 8-10h und 10-12h aufgeteilt. Zum anderen wurden zwei zusätzliche, spätere Ablagefenster (12-14h und 14-16h) untersucht um zu sehen ob und wenn ja welchen Effekt eine Misexpression des Tc'ZEN2 Proteins in diesen Stadien hat. Wie in den Vorversuchen auch wurden Kutikula-Präparate für jedes Hitzeschock-Fenster angefertigt. Eine kurze statistische Auswertung der einzelnen Zeitpunkte ist in Tabelle 13 dargestellt. Die detaillierten Statistiken sind im Anhang zu finden (Tabelle 23). 64 Ergebnisse HSzen2 L9 homozygot WT ohne Kutikula Kopf reduziert Kopf + Thorax reduziert Kopf + Abdomen reduziert Kopf + Thorax + Abdomen reduziert Thorax + Abdomen reduziert Abdomen reduziert unspezifisch gesamt 8-10h-HS 10-12h-HS 242 393 338 214 15,8% 25,7% 22,1% 14,0% 7 131 6 2 1,6% 30,2% 1,4% 0,5% 36 225 0 1 4,8% 29,9% 0,0% 0,1% 125 310 2 0 12,3% 30,4% 0,2% 0,0% 25 1,6% 14 3,2% 15 2,0% 50 4,9% 271 17,7% 258 59,4% 159 21,1% 5 0,5% 0 0,0% 2 0,5% 133 17,7% 8 0,8% 2 0,5% 12 2,8% 434 100,0% 159 24 752 21,1% 3,2% 100,0% 510 9 1019 50,0% 0,9% 100,0% 23 1,5% 23 1,5% 1529 100,0% 12-14h-HS 14-16h-HS - vw Kontrolle 8-10h-HS 10-12h-HS 12-14h-HS 14-16h-HS WT 559 80,3% 287 81,1% 750 82,2% 265 81,0% ohne Kutikula 123 17,7% 66 18,6% 142 15,6% 57 17,4% Kopf reduziert/ 8 1,1% 0 0,0% 3 0,3% 0 0,0% deformiert Kopf + Thorax reduziert 2 0,3% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% Abdomen reduziert 2 0,3% 1 0,3% 16 1,8% 4 1,2% unspezifisch 2 0,3% 0 0,0% 1 0,1% 1 0,3% gesamt 696 100,0% 354 100,0% 912 100,0% 327 100,0% Tabelle 13: HSzen2 Kutikula-Phänotypen der 2h Ablagefenster Anzahl und prozentualer Anteil der verschiedenen Phänotyp-Klassen. Benannt sind jeweils die betroffenen Körperbereiche (Kopf, Thorax, Abdomen). reduziert: Verkleinerung bzw. teilweiser oder auch kompletter Verlust von Strukturen und Segmenten. - unspezifisch: Defekte, welche als Hintergrund auch in der vw Kontrolle auftreten. Zunächst kann wiederum festgestellt werden, dass der Hitzeschock selbst zu diesen Entwicklungszeitpunkten keinen unspezifischen Kutikula-Defekt auslöst. Die Raten für wildtypische Larven und Eier ohne Kutikula bleiben in der vw- Kontrolle zu allen Zeitpunkten konstant bei normalen Werten. Im Gegensatz dazu, zeigen sich in den Kutikulas der HSzen2 Linie extrem hohe Werte an Kutikula-Defekten. Die Werte für wildtypische Larven reduzieren sich zum Teil bis auf 1,6%. Anscheinend kann der Phänotyp also tatsächlich im homozygoten Stamm nochmals verstärkt werden. Wie bereits in den Vorversuchen, sind auch hier Kopf, Thorax und Abdomen durch Defekte und Deletionen betroffen. Eine genauere Analyse der Werte zeigt, dass sich die betroffenen Bereiche nach posterior verschieben, je später in der Entwicklung die Misexpression von Tc'ZEN2 durch den Hitzeschock induziert wird. Dies ist auch nochmal in Abbildung 16 dargestellt. Im 8-10h-Hitzeschock finden sich vor allem Larven mit Kopfdefekten (22,1%), gleichzeitigen Defekten in Kopf und Thorax (14,0%) und Defekten in Kopf, Thorax und Abdomen (17,7%). Im nächst späteren HitzeschockFenster (10-12h) zeigen sich kaum noch Larven mit Defekten, die ausschließlich Kopf bzw. 65 Ergebnisse Kopf + Thorax betreffen. Fast 60% der Larven zeigen hier eine Kombination aus Defekten in Kopf, Thorax und Abdomen. Induziert man die Misexpression von Tc'ZEN2 in noch späteren Stadien, kann man eine fortschreitende Verschiebung der Defekte nach posterior beobachten. Der 12-14h Hitzeschock zeigt zunächst eine Verschiebung zu Thorax + Abdomen Defekten (17,7%) und Larven, die lediglich Deletionen im Abdomen zeigen (21,1%). Induziert man die Misexpression in 14-16h alten Embryonen, also in späteren Keimstreifstadien resultiert dies in 50% abdominalen Defekten. Diese Verschiebung der Phänotypen nach posterior macht durchaus Sinn. Aufgrund der Kurzkeim-Entwicklung werden in Tribolium die Segmente sukzessive während der Entwicklung gebildet und spezifiziert. Anteriore Segmente können z.B. zum Zeitpunkt des 12-14h-Hitzeschocks schon stabil vorhanden sein, während weiter posteriore Segmente gerade gebildet werden und somit durch die Misexpression von Tc'ZEN2 getroffen und auch gestört werden können. Abbildung 16: Statistische Verteilung der Kutikula-Phänotypen der 2h Ablagen von HSzen2 L9 homozygot. Gezeigt sind nur die prozentualen Anteile der verschiedenen Klassen innerhalb des Anteils spezifischer Phänotypen. Die häufigsten Phänotypen eines Hitzeschock-Fensters sind in den folgenden Abbildungen auch als Kutikula-Bilder dargestellt. Abbildung 17 zeigt das Hitzeschock-Fenster von 8-10h. Die häufigsten Phänotypen in diesem Zeitfenster sind mit 22,1% Larven mit reduzierten Köpfen. Eine solche Larve ist in Abbildung 17 B + B' zu sehen. Thorax, Abdomen und die terminalen Anhänge Urogomphi (Ug) und Pygopodien (Py) sind in diesem Fall, wie im Wildtyp (Abbildung 17 A + A'), normal vorhanden, der Kopf ist jedoch stark reduziert (Abbildung 17 B'). Die prägnathalen Kopfanhänge Labrum (Lr) und Antennen (An) und auch die gnathalen Maxillen (Mx) sind vorhanden. Die restlichen gnathalen Anhänge wie Mandibeln (Md) und Labium (Lb) fehlen. Zudem ist die Kopfkapsel in ihrer Größe reduziert. 66 Ergebnisse Ein weiterer großer Anteil an Larven in diesem Zeitfenster zeigt gleichzeitig Defekte in Kopf und Thorax (Abbildung 17 C + C'). Diese Larve besitzt, wie der Wildtyp auch, 8 abdominale Segmente und die terminalen Strukturen. Der Thorax ist jedoch zum Teil fusioniert und reduziert. Das zweite thorakale Segment (T2) kann anhand des Stigmas (Abbildung 17 C, Stern) noch identifiziert werden, allerdings fehlt am letzten thorakalen Segment ein Bein (Pfeilspitze). Die Kopfkapsel ist stark reduziert und auch hier sind nur die prägnathalen Strukturen Antenne und Labrum und eine gnathale Maxille zu erkennen. Die restlichen Kopfanhänge fehlen. Die dritte große Gruppe an Defekten (17,7%) sind Larven mit reduziertem Kopf, Thorax und Abdomen. Ein Beispiel für diese Kategorie ist in Abbildung 17 D + D' dargestellt. T1+2 scheinen fusioniert zu sein, zudem fehlt am ersten thorakalen Segment ein Bein (Abbildung 17 D, Pfeilspitze). Das Abdomen besitzt anstatt acht, nur noch sieben Segmente. Urogomphi und Pygopodien sind in diesem Zeitfenster jedoch nie betroffen. Abbildung 17 D' zeigt den stark reduzierten Kopf der Larve aus Abbildung 17 D. Die Kopfkapsel ist extrem reduziert und kaum mehr morphologisch vom Thorax zu trennen. Das Labrum ist zwar vorhanden, jedoch auch sehr klein. Alle anderen Kopfanhänge, außer den Antennen, fehlen. Wie bereits erwähnt verschiebt sich der Bereich betroffener Segmente, bei einem späteren Hitzeschock, in Richtung posterior. Dies ist auch in den Kutikulas des nächsten Zeitfensters zu erkennen (Abbildung 18). Die Defekte gleichen ein wenig denen des 8-10h-HS-Fensters. Jedoch sind sie bei 10-12h sehr viel stärker und es treten auch kaum noch Larven auf, die nur Defekte im Kopf zeigen (1,4%). Mit 59,4% liegt der größte Anteil an Defekten gleichzeitig im Kopf, Thorax und Abdomen. Diese Defekte zeigen sich zum einen in Larven, die noch eindeutig als solche zu erkennen sind. Ein solches Beispiel zeigt Abbildung 18 B + B'. Der Kopf ist kaum noch vorhanden und Kopfanhänge sind wenn nur noch als unförmige Kutikula-Reste zu erkennen (Abbildung 18 B'). Der Thorax ist teilweise fusioniert und reduziert. An T2 ist nur noch ein verkürztes Bein vorhanden. Zudem fehlen dem Abdomen drei Segmente, sodass nur noch fünf vorhanden sind. Die Urogomphi und Pygopodien sind normal ausgebildet (Abbildung 18 B). Eine Larve die in die gleiche Kategorie fällt, jedoch sehr viel stärker betroffen ist, ist in Abbildung 18 C dargestellt. Es sind kaum noch einzelne Segmente zu erkennen. Der Kopf ist komplett reduziert und auch der Thorax ist, außer einiger Bein-Reste (Pfeilspitzen), kaum noch auszumachen. Abdominale Segmente sind vorhanden aber stark in ihrer Anzahl reduziert und zum Teil deutlich fusioniert. Posterior sind jedoch die Urogomphi immer noch zu erkennen (Pfeil). 67 Ergebnisse Durch die homogenere Aktivierung der Misexpression von Tc'ZEN2 in vollständig differenzierten Blastodermen macht es durchaus Sinn, dass der Phänotyp im 10-12h Fenster, gegenüber dem früheren Hitzeschock, deutlich verstärkt wird. Anzumerken ist für beide Zeitfenster, dass die posterioren Strukturen Urogomphi und Pygopodien nicht betroffen sind und immer ausgebildet werden. Abbildung 17: HSzen2 Kutikula-Phänotypen nach 8-10h - Hitzeschock Fluoreszenzaufnahmen. Ganze Larve 10x, Kopf 20x. Anterior befindet sich links. A) Wildtyp (WT) Larve mit drei thorakalen Segmenten (T1-3; T2 erkennbar am lateralen Stigma (Stern)), acht abdominalen Segmenten (A1-8) und den posterioren Strukturen Urogomphi (Ug) und Pygopodien (Py). A') Vergrößerter Kopf der WT-Larve aus A, mit den prägnathalen Segmenten Labrum (Lr) und Antennen (An) und den gnathalen Segmenten Mandibeln (Md), Maxillen (Mx) und Labium (Lb). B) HSzen2 Larve mit fehlenden Kopfanhängen. Thorax und Abdomen sind nicht betroffen. B') Kopf 68 Ergebnisse der Larve aus B. Die Kopfkapsel ist reduziert und es sind nur noch die prägnathalen Segmente Lr und An, und Mx vorhanden. Die restlichen gnathalen Segmente fehlen. C) HSzen2 Larve mit reduziertem Kopf und fusioniertem Thorax. Das Stigma an T2 ist noch zu erkennen (Stern), jedoch sind die Segmente des Thorax zum Teil fusioniert. Außerdem ist am letzten thorakalen Segment nur noch ein Bein vorhanden (Pfeilspitze). Das Abdomen ist nicht reduziert. C') Kopf der Larve aus C. Die Kopfkapsel ist stark reduziert und deformiert. Es sind nur noch Lr, An und Mx auszumachen. D) HSzen2 Larve mit reduziertem Kopf, fusioniertem Thorax und fehlenden abdominalen Segmenten. T1 und T2 scheinen zum Teil fusioniert, zudem fehlt am ersten thorakalen Segment ein Bein (Pfeilspitze). Das Abdomen besitzt nur noch sieben Segmente. Die posterioren Strukturen sind nicht betroffen. D') Kopf der Larve aus D. Die Kopfkapsel ist extrem reduziert und eventuell auch mit dem Thorax fusioniert. Alle gnathalen Segmente fehlen. Es sind nur noch Lr und An sichtbar. Abbildung 18: HSzen2 Kutikula-Phänotypen nach 10-12h - Hitzeschock Fluoreszenzaufnahmen. Ganze Larve 10x, Kopf 20x. Anterior befindet sich links. A) Wildtyp (WT) Larve mit drei thorakalen Segmenten (T1-3), acht abdominalen Segmenten (A1-8) und den posterioren Strukturen Urogomphi (Ug) und Pygopodien (Py). A') Vergrößerter Kopf der WT-Larve aus A mit den prägnathalen Segmenten Labrum (Lr) und Antennen (An), und den gnathalen Segmenten Mandibeln (Md), Maxillen (Mx) und Labium (Lb). B) HSzen2 Larve nach 10-12hHitzeschock. Der Kopf ist extrem reduziert. Die Segmente des Thorax sind zum Teil fusioniert und reduziert. An T2 ist nur noch ein verkürztes Bein vorhanden (Pfeilspitze). Das Abdomen ist stark reduziert und besitzt nur noch 5 Segmente. Die posterioren Strukturen sind nicht betroffen. B') Kopf der Larve aus B. Die Kopfkapsel ist extrem reduziert und lässt sich morphologisch kaum noch vom Thorax trennen. Es sind nur noch eventuelle Reste von Kopfanhängen zu erkennen (Pfeilspitze). C) Stark betroffene HSzen2 Larve. Der Kopf fehlt komplett und auch der 69 Ergebnisse Thorax ist kaum auszumachen. Zum Teil sind einige Klauen bzw. Beinreste zu erkennen (Pfeilspitzen). Die Segmente des Abdomen sind in ihrer Zahl stark reduziert und zum Teil fusioniert. Posterior sind noch Strukturen wie z.B. Urogomphi zu erkennen (Pfeil). Die Statistik zeigt, dass eine Aktivierung der Misexpression nach 12-14h Entwicklungszeit, die Defekte deutlich nach posterior verschiebt. 38,8% der Larven zeigen Veränderungen in Thorax und Abdomen oder nur im Abdomen. Durch die Misexpression von Tc'ZEN2 in Keimstreifstadien sind außerdem nun auch zum Teil die posterioren Urogomphi und Pygopodien betroffen. Abbildung 19 B zeigt eine Larve, bei der Thorax und Abdomen durch die Misexpression betroffen sind. Am dritten thorakalen Segment fehlt ein Bein (Pfeilspitze) und das Abdomen besteht nur noch aus 7 Segmenten. Zudem sind hier die posterioren Strukturen deletiert. Die Larven in Abbildung 19 C und D scheinen zum Zeitpunkt des Hitzeschocks in ihrer Entwicklung bereits weiter gewesen zu sein als der Embryo in Abbildung 19 B, da sich die Deletionen und Defekte hier nur auf das Abdomen beschränken. Die Larve in Abbildung 19 C erscheint zunächst ziemlich wildtypisch, jedoch fehlt ein abdominales Segment. Die Urogomphi und Pygopodien sind allerdings wieder vorhanden. Im Gegensatz dazu fehlen diese in Abbildung 19 D. Auch hier ist zusätzlich das Abdomen stark betroffen. Die Segmente sind zum Teil fusioniert oder fehlen komplett, sodass nur noch etwa sechs abdominale Segmente zu erkennen sind (Abbildung 19 D). Die Defekte und Deletionen, welche sich nur im Abdomen zeigen sind der Hauptbestandteil der Phänotypen im letzten getesteten Hitzeschock-Zeitraum (14-16h). 50% der Larven zeigen eine Reduktion der abdominalen Segmente. Wie im 12-14h Hitzeschock auch, finden sich hier Larven mit und ohne deletierten posteriore Strukturen. In Abbildung 20 B sind die Urogomphi und Pygopodien vorhanden und nur das Abdomen ist reduziert. Abbildung 20 C dagegen zeigt eine Larve, bei der das Abdomen durch Deletionen und Fusionen reduziert ist und zusätzlich posterior die wildtypischen Anhänge nicht vorhanden sind (Pfeilspitze). Bei beiden Larven sind Kopf und Thorax normal ausgebildet. 70 Ergebnisse Abbildung 19: HSzen2 Kutikula-Phänotypen nach 12-14h - Hitzeschock Fluoreszenzaufnahmen, 10x. Anterior befindet sich links. A) Wildtyp (WT) Larve mit drei thorakalen Segmenten (T1-3), acht abdominalen Segmenten (A1-8) und den posterioren Strukturen Urogomphi (Ug) und Pygopodien (Py). B) HSzen2 Larve. Der Thorax ist reduziert und zeigt an T3 nur noch ein Bein (Pfeilspitze). Das Abdomen besitzt nur noch 7 Segmente und die posterioren Strukturen Ug und Py fehlen. C) HSzen2 Larve mit reduziertem Abdomen. Es sind nur 7 abdominale Segmente vorhanden. Die posterioren Strukturen sind jedoch, wie Kopf und Thorax, nicht reduziert. D) HSzen2 Larve mit stark reduziertem Abdomen (nur noch A1 bis A6 sind vorhanden) und fehlenden posterioren Strukturen (Pfeilspitze). 71 Ergebnisse Abbildung 20: HSzen2 Kutikula-Phänotypen nach 14-16h - Hitzeschock Fluoreszenzaufnahmen, 10x. Anterior befindet sich links. A) Wildtyp (WT) Larve mit drei thorakalen Segmenten (T1-3), acht abdominalen Segmenten (A1-8) und den posterioren Strukturen Urogomphi (Ug) und Pygopodien (Py). B) HSzen2 Larve. Kopf und Thorax sind nicht betroffen. Das Abdomen ist reduziert und zeigt nur noch 7 Segmente. Die posterioren Strukturen Ug und Py sind vorhanden. C) HSzen2 Larve. Kopf und Thorax sind nicht reduziert. Dem Abdomen fehlen jedoch Segmente (nur noch sechs Segmente sind vorhanden). Die posterioren Strukturen fehlen (Pfeilspitze). Anhand der Kutikula-Bilder kann deutlich die Verschiebung der Defekte nach posterior aufgezeigt werden. Durch die zeitliche Kontrolle der Misexpression von Tc'ZEN2 können unterschiedliche Entwicklungsstadien und somit unterschiedliche Bereiche des Embryos getroffen werden. 72 Ergebnisse Da der Fokus dieser Arbeit auf den Interaktionen der Proteine während der embryonalen Musterbildung früh liegt, wurden alle weiteren Untersuchungen mit Embryonen durchgeführt, die einem 10-12h Hitzeschock ausgesetzt wurden. Aufgrund des "geschockten" Entwicklungsstadiums, einhergehend mit der möglichst homogenen Aktivierung der Tc'ZEN2 Misexpression und dem hohen Prozentsatz an sehr starken Phänotypen erschien dieses Hitzeschock-Fenster am geeignetsten für weitere Analysen. 3.2.6 Tc'wg Streifen gehen nach der Misexpression von Tc'ZEN2 verloren Um einen genaueren Einblick in die Entstehung des larvalen Phänotyps zu bekommen müssen embryonale Stadien auf frühe Entwicklungs-Störungen hin analysiert werden. Zu diesem Zweck wurde zunächst eine In-Situ gegen das Segmentpolaritätsgen Tc'wingless (Tc'wg) auf HSzen2 Embryonen gemacht. Die Embryonen wurden einem 10-12hHitzeschock ausgesetzt und dann 6 bzw. 12h zum Nachreifen gestellt. Somit kann nachvollzogen werden, welche Defekte durch die Misexpression ausgelöst werden und wie sie sich eventuell während der weiteren Entwicklung verändern. Abbildung 21 zeigt die Ergebnisse dieser Färbung. In der ebenfalls geschockten vwKontrolle zeigt Tc'wg sein wildtypisches, segmentales Muster (Nagy und Carroll, 1994). 6h nach dem Hitzeschock zeigen sich in den Kopflappen deutlich die okularen Domänen (Oc), und im Keimstreif selbst, sieben segmentale Streifen (Abbildung 21 A). Die ersten drei Streifen markieren die gnathalen Segmente Mandibel (Md), Maxille (Mx) und Labium (Lb), darauf folgen die thorakalen Segmente, beginnend mit T1. Die Misexpression von Tc'ZEN2 bewirkt in diesen Stadien erste Defekte in der Segmentierung (Abbildung 21 B). Die okularen Domänen in den Kopflappen wirken normal, jedoch sind die segmentalen Streifen des Keimbands anterior stark reduziert und posterior eher unregelmäßig. Die Zuordnung welcher Streifen genau T1 darstellt ist deshalb schwer. Weitere 6h danach, also 12h nach Hitzeschock, hat sich der Effekt der Tc'ZEN2 Misexpression auf die Segmentierung bzw. die Ausbildung des Tc'wg Musters verstärkt. Abbildung 21 E und F zeigen zwei Beispiele dieser Embryonen. Die segmentalen Tc'wg Domänen der gnathalen Segmente sind vollständig verloren gegangen, wobei das Gewebe selbst noch vorhanden ist (Balken, Abbildung 21 E). Die Zuordnung von T2 erfolgte lediglich aufgrund des Abstandes zum Kopf. Auf den Bereich vollständig fehlender Tc'wg Streifen folgt nach posterior ein Bereich, in welchem die Streifen unregelmäßig und zum Teil reduziert aussehen. Ganz posterior erscheint das segmentale Muster wieder regulär wie im Wildtyp. Neben Defekten im Keimband können auch Veränderungen in den Kopflappen ausgemacht werden. Im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 21 B), ist das Gewebe zwischen den 73 Ergebnisse Kopflappen des Embryos in Abbildung 21 E, im Bereich des Labrums, stark reduziert (Pfeilspitze) und auf einer Seite fehlt die antennale Domäne (Stern). Durch die fehlenden Tc'wg Streifen ist es für alle HSzen2 Embryonen schwer, das genaue Stadium (Streifenanzahl) festzustellen. Eine Zuordnung zu den vw- Kontrollen erfolgte deshalb aufgrund der Form der okularen Domänen. Abbildung 21 F zeigt einen etwas älteren Keimstreif. Die okularen Domänen haben sich hier schon aufgespalten. Im Keimband ist ebenfalls ein Bereich zu erkennen, in dem die Tc'wg Streifen komplett fehlen (Balken). Allerdings ist ganz anterior noch ein Streifen zu erkennen, welcher auf Grund seiner Lage die Mandibel sein könnte. Richtung posterior sind wiederum erst unregelmäßige Domänen und dann ein wildtypisches, segmentales Muster zu erkennen. Auch im Kopf zeigen sich Veränderungen gegenüber der Kontrolle (Abbildung 21 C). Die antennalen Streifen sind im HSzen2 Embryo deutlich reduziert bzw. fast vollständig abhanden. Außerdem fehlen ganz anterior die Domänen des Labrums (Pfeilspitzen, Abbildung 21 F). Diese sind in der Wildtyp-Kontrolle zu diesem Zeitpunkt der Entwicklung schon deutlich zu sehen (Abbildung 21 C). - Abbildung 21: Tc'wg In-Situ Hybridisierung auf 10-12h vw und HSzen2 Embryonen A-F Hellfeldaufnahmen. - Anterior befindet sich in allen Abbildungen links. A-C vw Embryonen. D-E korrespondierende HSzen2 - Embryonen A) vw Embryo 6h nach dem Hitzeschock (HS). Der Keimstreif zeigt bereits sieben segmentale Tc'wg Streifen. Die ersten vier Streifen markieren die gnathalen Segmente Mandibel (Md), Maxille (Mx) und Labium (Lb) und das erste thorakale Segment (T1). In den Kopflappen kann man deutlich die okularen (Oc) Domänen - erkennen. B) vw Embryo 12h nach dem HS. Der Keimstreif zeigt 14 Tc'wg Streifen. In den Kopflappen sind - neben den okularen (Oc), inzwischen auch deutlich die antennalen Streifen (An) zu erkennen. C) vw Embryo 12h nach dem HS. Der Keimstreif ist vollständig elongiert und zeigt 16 Tc'wg Streifen. Ganz anterior in den 74 Ergebnisse Kopflappen sind inzwischen auch die Domänen, welche das Labrum (Lr), markieren zu sehen. D) HSzen2 Embryo 6h nach dem HS. Die anterioren Streifen von Tc'wg im Keimstreif sind deutlich reduziert. Ein genaue Zuordnung von T1 fällt deshalb schwer. Auch posterior von T1 erscheint das segmentale Muster deformiert. E) HSzen2 Embryo 12h nach dem HS. Das segmentale Tc'wg Muster im Keimstreif ist stark gestört, wodurch eine genaue Bestimmung des Entwicklungs-Stadiums schwer fällt. In anterioren Regionen des Keimstreifs fehlt Tc'wg komplett (Balken). Das Gewebe ist jedoch vorhanden. Weiter posterior sind Streifen vorhanden, jedoch deformiert und zum Teil deletiert. Die Lage des zweiten thorakalen Segments (T2) kann deshalb nur geschätzt werden. Ganz posterior erscheint das Muster wieder wildtypisch. In den Kopflappen sind auch die antennalen Domänen teilweise verschwunden (Stern). Außerdem ist das Gewebe zwischen den Kopflappen, im Bereich des Labrums, deutlich reduziert (Pfeilspitze). F) HSzen2 Embryo 12h nach dem HS. Auch hier kann das Alter aufgrund der Störungen im Tc'wg Muster höchstens auf Grund der Form der okularen Domänen geschätzt werden. Anterior im Keimstreif fehlen Tc'wg Streifen vollständig (Balken). Eventuell ist noch das Segment der Mandibel (Md) zu erkennen. Weiter posterior ist das Muster erst unregelmäßig, zeigt schließlich aber doch wieder regelmäßige Streifen. Ganz anterior in den Kopflappen fehlen die Domänen des Labrum (Pfeilspitzen). Aufgrund dieser Färbung lässt sich somit sagen, dass eine Misexpression von Tc'ZEN2 in späten differenzierten Blastodermen, in der weiteren Entwicklung einen starken Defekt in der Segmentierung auslöst. 6h nach dem Hitzeschock zeigen sich erste Unregelmäßigkeiten im Tc'wg Muster in Form von reduzierten Streifen der gnathalen Segmente (Abbildung 21 D). Im weiteren Verlauf der Entwicklung gehen diese segmentalen Domänen vollständig verloren (Abbildung 21 E und F). Außerdem zeigt sich auch ein Fehlen von Tc'wg Domänen im Kopfbereich. Diese Ergebnisse korrelieren sehr gut mit den larvalen Phänotypen für dieses HitzeschockFenster. Die Kutikula-Präparate zeigen genau in diesen Bereichen Deletionen von Segmenten (Abbildung 18). Die Reetablierung eines wildtypischen Tc'wg Musters in den posterioren Bereichen älterer Keimstreifen zeigt deutlich die Auswirkungen des Hitzeschocks. Durch die relativ kurze zeitliche Misexpression von Tc'ZEN2 sind nur die Bereiche betroffen, welche gerade gebildet werden. Später, ohne weitere Misexpression, erholt sich die Segmentierung wieder und aus der Wachstumszone werden wildtypische Segmente gebildet. Auch dies stimmt mit den Kutikula-Präparaten überein, da auch dort posteriore Strukturen normal ausgebildet sind. 3.2.7 Tc'ZEN2 Misexpression verursacht auch homeotische Transformationen Neben den bereits erwähnten und beschriebenen Defekten, Fusionen und Deletionen, die durch eine Misexpression von Tc'ZEN2 auf Kutikula-Ebene ausgelöst werden, zeigten sich zu einem gewissen Anteil auch homeotische Transformationen in den Kutikula-Präparaten. Abbildung 22 B + B' zeigt eine HSzen2 Larve, deren Kopf stark reduziert ist. Gnathale Segmente fehlen fast vollständig, nur das Labrum und die Antennen sind noch zu 75 Ergebnisse identifizieren. Es zeigt sich jedoch eine dritte Antenne, die wahrscheinlich durch eine homeotische Transformation von gnathalen Segmenten entstanden ist. Neben Transformationen zu zusätzlichen Antennen zeigten sich zum Teil auch Larven mit schwachen homeotischen Transformationen im Abdomen. Abbildung 22 C + C' zeigt eine solche Larve. Der HSzen2 typische Phänotyp ist auch hier vorhanden. Der Kopf ist stark reduziert, sodass nur noch das Labrum und einige wenige gnathale Segmente auszumachen sind. Der Thorax ist teilweise fusioniert und das Abdomen erscheint ebenfalls reduziert. Zusätzlich zu diesen Defekten zeigt sich aber auch der Ansatz eines Beinstummels an A1 (Pfeilspitze, Abbildung 22 C). Diese Phänotypen lassen darauf schließen, dass nach einer Misexpression von Tc'ZEN2 nicht nur die Segmentierung betroffen ist, sondern auch die Hoxgene betroffen sein könnten, was zu diesen homeotischen Transformationen führen würde. Abbildung 22: Homeotische Transformationen in HSzen2 Kutikulas Fluoreszenzaufnahmen. Ganze Larve 10x, Kopf 20x. Anterior befindet sich links. A) Wildtyp (WT) Larve mit drei thorakalen Segmenten (T1-3), acht abdominalen Segmenten (A1-8) und den posterioren Strukturen Urogomphi (Ug) und Pygopodien (Py). A') Vergrößerter Kopf der WT-Larve aus A mit den prägnathalen Segmenten Labrum (Lr) und Antennen (An) und den gnathalen Segmenten Mandibeln (Md), Maxillen (Mx) und Labium (Lb). B) HSzen2 Larve mit fehlenden 76 Ergebnisse Kopfanhängen und homeotischer Transformation von gnathalen Segmenten in eine zusätzliche Antenne. B') Kopf der Larve aus B. Einige gnathale Kopfanhänge fehlen, außerdem zeigt sich eine homeotische Transformation von gnathalen Segmenten in eine zusätzliche Antenne (Pfeilspitze). C) HSzen2 Larve mit reduziertem Kopf, fusioniertem Thorax und einem Beinstummel an A1 (Pfeilspitze). C') Kopf, Thorax und A1+A2 der Larve aus C. Der Kopf ist stark reduziert und nur noch einige Kopfanhänge sind zu erkennen. Der Thorax ist z.T. fusioniert. An A1 zeigt sich ein Beinstummel. Die detaillierte Analyse, der durch die Tc'ZEN2 Misexpression hervorgerufenen Phänotypen und Defekte ist ab Abschnitt 3.2.10 dargestellt. Zunächst soll jedoch weiter auf die verschiedenen Hitzeschock-Konstrukte eingegangen werden. 3.2.8 Tc'CAD - Misexpression verursacht starke anteriore Defekte Wie für HSzen2 wurden auch für die homozygote HScad Linie zunächst Kutikula-Präparate für die oben aufgeführten vier verschiedenen Hitzeschock-Fenster angefertigt. Damit sollte überprüft werden, ob es durch die Misexpression von Tc'CAD zu Defekten in der Entwicklung kommt und wenn ja wie sich der Zeitpunkt der Misexpression auf die Ausprägung der Defekte auswirkt. Tabelle 14 zeigt die statistische Auswertung dieser Kutikula-Präparate für HScad und die dazugehörige vw- Kontrolle. In Abbildung 23 ist außerdem die statistische Verteilung der Phänotypen in den einzelnen Hitzeschock-Fenstern zu sehen. Zunächst kann festgestellt werden, dass sich auch für HScad ein Kutikula-Phänotyp induzieren lässt. Im Vergleich zu HSzen2 ist der prozentuale Anteil von Larven mit Phänotyp deutlich kleiner. Der maximale Anteil an Phänotypen zeigt sich im 12-14h-Hitzeschock und liegt hier bei etwa 14%. Betroffen sind nach einer Misexpression von Tc'CAD der Kopf, der Thorax und zum Teil auch das Abdomen. Jedoch ist aus Abbildung 23 klar ersichtlich, dass sich der überwiegende Anteil an Defekten auf den Kopf und den Thorax begrenzt. Trotz des relativ geringen Anteils an Phänotypen in den Kutikulas kann trotzdem davon ausgegangen werden, dass es sich hierbei um Defekte handelt, die spezifisch durch die Misexpression des Tc'CAD Proteins entstehen, da diese nicht in der Kontrolle auftreten. Zudem ist der Prozentsatz an nicht-entwickelten Larven, also Eiern ohne Kutikula, in den HScad Ablagen mit 18,9- 28,3% gegenüber der Kontrolle (14,5-23,1%) ebenfalls leicht erhöht. Nicht entwickelte Kutikulas lassen häufig auf einen sehr frühen Defekt schließen, wodurch es vorzeitig zum Abbruch der embryonalen Entwicklung kommt (Kotkamp et al., 2010). Ein weiterer Unterschied, welcher sich zu HSzen2 erkennen lässt, ist die Verteilung der Phänotypen innerhalb der verschiedenen Hitzeschock-Zeiträume. Durch die spätere 77 Ergebnisse Misexpression von Tc'ZEN2 konnte eine deutliche Verschiebung der Defekte nach posterior beobachtet werden. In den HScad Ablagen zeigt sich dagegen nur eine leichte Verschiebung, wodurch bei 12-14h-HS und 14-16h-HS auch das Abdomen teilweise betroffen ist (Abbildung 23). Der Hauptanteil an Phänotypen zeigt sich jedoch weiterhin im Kopf und Thorax. Aufgrund dieser Tatsache werden im Folgenden nur beispielhafte Kutikulas für jede Kategorie gezeigt, aber nicht zwischen den einzelnen Hitzeschock-Fenstern unterschieden. HScad homozygot 8-10h-HS WT ohne Kutikula Kopf defekt Kopf + Thorax defekt Kopf + Thorax defekt + Abdomen defekt Abdomen defekt unspezifisch gesamt 10-12h-HS 12-14h-HS 14-16h-HS 187 61 35 4 64,0% 20,9% 12,0% 1,4% 335 93 42 21 68,1% 18,9% 8,5% 4,3% 126 66 12 11 54,1% 28,3% 5,2% 4,7% 326 130 29 5 64,6% 25,7% 5,7% 1,0% 0 0,0% 0 0,0% 9 3,9% 7 1,4% 0 0,0% 5 1,7% 292 100,0% 0 0,0% 1 0,2% 492 100,0% 4 1,7% 5 2,1% 233 100,0% 3 0,6% 5 1,0% 505 100,0% - vw Kontrolle 8-10h-HS 10-12h-HS 12-14h-HS 14-16h-HS WT 92 78,0% 417 83,1% 345 72,5% 235 83,3% ohne Kutikula 20 16,9% 73 14,5% 110 23,1% 42 14,9% Kopf defekt 2 1,7% 6 1,2% 1 0,2% 0 0,0% Thorax + Abdomen 1 0,8% 1 0,2% 0 0,0% 0 0,0% defekt Abdomen defekt 0 0,0% 3 0,6% 15 3,2% 3 1,1% unspezifisch 3 2,5% 2 0,4% 5 1,1% 2 0,7% gesamt 118 100,0% 502 100,0% 476 100,0% 282 100,0% Tabelle 14: HScad Kutikula-Phänotypen der 2h Ablagefenster Anzahl und prozentualer Anteil der verschiedenen Phänotyp-Klassen. Benannt sind jeweils die betroffenen Körperbereiche (Kopf, Thorax, Abdomen). defekt: gestörte Orientierung bzw. teilweiser oder auch kompletter Verlust von Strukturen und - Segmenten. unspezifisch: Defekte, welche als Hintergrund auch in der vw Kontrolle auftreten. 78 Ergebnisse Abbildung 23: Statistische Verteilung der Kutikula-Phänotypen der 2h Ablagen von HScad homozygot Gezeigt sind nur die prozentualen Anteile der verschiedenen Klassen innerhalb des Anteils spezifischer Phänotypen. Die Kopfdefekte, welche durch eine Misexpression von Tc'CAD hervorgerufen werden äußern sich vor allem in reduzierten Kopfkapseln und deformierten, reduzierten bis hin zu fehlenden Kopfanhängen. Wie in Abbildung 24 B + B' zu sehen, ist der Kopf sehr stark betroffen, wohingegen der Thorax und das Abdomen völlig normal entwickelt sind. Die Kopfkapsel ist stark reduziert und die prägnathalen und gnathalen Kopfanhänge sind relativ ungeordnet an der Kopfkapsel positioniert. Außerdem fehlen diverse Strukturen bzw. sind bis zur Unkenntlichkeit reduziert, sodass nur noch die beiden Antennen (An) eine Mandibel (Md) und eventuell eine Maxille (Mx) auszumachen sind (Abbildung 24 B'). Abbildung 24 C + C' zeigt eine Larve der Kategorie "Kopf + Thorax defekt". Der Kopf ist extrem reduziert und die Kopfanhänge sind stark deformiert oder fehlen ganz. Eine Antenne (An) und eine Maxille (Mx) sind noch zu erkennen (Abbildung 24 C'). Im Thorax sind die ersten zwei thorakalen Segmente so stark fusioniert, dass sie kaum morphologisch zu trennen sind. Zudem fehlen Beine und ein Bein ist außerdem gespalten (Pfeilspitze). Ob dies durch die Fusion von zwei Beinen oder durch eine ektopische Spaltung entstanden ist, lässt sich nicht mit Sicherheit sagen. Das Abdomen dieser Larve sieht jedoch wildtypisch aus. Die nächst stärkerer Kategorie an Phänotypen, welche jedoch eher in kleinen Prozentsätzen auftritt (vgl. Tabelle 14), ist in Abbildung 24 D + D' dargestellt. Hier sind der Kopf, der Thorax und auch das Abdomen deutlich reduziert. Die Kopfkapsel ist kaum noch vorhanden und mit dem Thorax fusioniert. Auch die meisten Kopfanhänge fehlen oder sind soweit deformiert, dass sie außer einer Mandibel (Md) nicht mehr benannt werden können (Abbildung 24 D'). Der Thorax ist ebenfalls stark reduziert bzw. fusioniert, sodass Beine zum Teil komplett fehlen. Wie in Abbildung 24 C, zeigt sich auch hier ein gespaltenes Bein (Pfeilspitze, Abbildung 24 D). Im Abdomen sind nur noch 5 bis 6 Segmente zu sehen, wobei die posterioren Strukturen, die Urogomphi und die Pygopodien, normal ausgebildet sind. 79 Ergebnisse Die Defekte im Kopf und anterioren Thorax machen für HScad durchaus Sinn. Wie bereits erwähnt, wird Tc'CAD im anterioren Kopf von Tc'Mex3 inhibiert (Schoppmeier et al., 2009). Nach einem RNAi Knockdown von Tc'Mex3 breitet sich die Tc'CAD Expression in das gesamte embryonale Gewebe aus und verursacht einen Kutikula-Phänotyp, der sich in reduzierten bis hin zu komplett fehlenden Köpfen zeigt (Schoppmeier et al., 2009). Da es durch die Hitzeschock induzierte Misexpression von Tc'CAD ebenfalls zur Expression des Proteins in anterioren Bereichen des Embryos kommt ist es durchaus möglich, dass ein Tc'Mex3 RNAi ähnlicher Phänotyp entsteht. Abbildung 24: HScad Kutikula-Phänotypen nach Hitzeschock Fluoreszenzaufnahmen. Ganze Larve 10x, Kopf 20x. Anterior befindet sich links. A) Wildtyp (WT) Larve mit drei thorakalen Segmenten (T1-3), acht 80 Ergebnisse abdominalen Segmenten (A1-8) und den posterioren Strukturen Urogomphi (Ug) und Pygopodien (Py). A') Vergrößerter Kopf der WT-Larve aus A mit den prägnathalen Segmenten Labrum (Lr) und Antennen (An), und den gnathalen Segmenten Mandibeln (Md), Maxillen (Mx) und Labium (Lb). B) HScad Larve mit fehlenden Kopfanhängen. Thorax und Abdomen sind nicht betroffen. B') Kopf der Larve aus B. Die Kopfkapsel ist reduziert und es sind nur noch einige Kopfanhänge wie Antennen (An) eine Mandibel (Md) und eventuell eine Maxilla (Mx) zu erkennen. C) HScad Larve mit stark reduziertem Kopf und fusioniertem Thorax. T1 und T2 sind morphologisch kaum getrennt zu erkennen. Die Beine sind reduziert und zum Teil fusioniert bzw. zeigen sich als "Spaltbein" (Pfeilspitze) C') Kopf der Larve aus C. Die Kopfkapsel ist stark reduziert und die Kopfanhänge deformiert bzw. fehlen ganz. Deutlich zu erkennen ist nur noch eine Antenne (An) und eine Maxille (Mx). D) HScad Larve mit stark reduziertem Kopf, fusioniertem Thorax und fehlenden abdominalen Segmenten. Die einzelnen thorakalen Segmente sind kaum auszumachen. Die Beine fehlen, sind reduziert und zum Teil distal gespalten (Pfeilspitze). Das Abdomen besitzt nur noch 5 bis 6 Segmente, allerdings sind die posterioren Strukturen vorhanden. D') Kopf der Larve aus D. Die Kopfkapsel ist extrem reduziert und mit dem Thorax fusioniert. Die Kopfanhänge sind reduziert, deformiert und kaum noch zu erkennen. Um die Entstehung er Kutikula-Defekte auf embryonaler Ebene nachzuvollziehen, wurde wie auch für HSzen2 das Tc'wg Muster in HScad Keimstreifen analysiert. Die Embryonen wurden einem "10-12h"-Hitzeschock ausgesetzt, 6 bzw. 12h nach diesem Hitzeschock fixiert und anschließend gefärbt. 6h nach dem Hitzeschock zeigt sich eine deutliche Reduzierung der Tc'wg Expressionsstärke in den Keimstreifen (Abbildung 25). Richtung posterior wirkt das segmentale Muster im Keimband außerdem stark irregulär und die Streifen sind kaum noch als solche zu bezeichnen. Ob das als T1 markierte Segment tatsächlich T1 oder eventuell ein fusioniertes Segment ist, lässt sich nicht mit Sicherheit sagen (Abbildung 25 D). 12h nach dem Hitzeschock zeigen sich die Defekte im Tc'wg Muster vor allem in den Kopflappen, wo die Domänen der Antennen stark reduziert oder abwesend sind (Pfeilspitzen, Abbildung 25 E + F). Dem Embryo in Abbildung 25 F fehlen zudem die Domänen des Labrums (Stern), welche zu diesem Zeitpunkt der Entwicklung in der Wildtyp Kontrolle bereits zu sehen sind (Abbildung 25 C). Die Veränderungen im Keimband betreffen vor allem die gnathalen Segmente bis hin zum Thorax. Zum Teil fehlen Streifen bzw. sind partiell stark reduziert (Balken, Abbildung 25 E). Wenn segmentale Streifen in diesem Bereich vorhanden sind zeigen sie ein stark irreguläres Muster, sodass es schwer fällt dieses als Streifen zu bezeichnen oder auch einzelne Segmente genau zu benennen (Balken, Abbildung 25 F). In einigen Domänen wirkt es, als wäre der Tc'wg Streifen nicht einfach ein Streifen sondern eventuell "kreisförmig" exprimiert bzw. aufgespalten (T1, Abbildung 25 F). Es wäre denkbar, dass diese scheinbare Verdopplung bzw. Aufspaltung der segmentalen Tc'wg Streifen im Thorax letztendlich in den Kutikula-Präparaten die, in Abbildung 24 C + D, gezeigten "Spaltbeinen" verursacht. Posterior wird das segmentale Tc'wg Muster wieder regulär und wildtypisch (Abbildung 25 E + F). Dies stimmt mit den larvalen Phänotypen 81 Ergebnisse überein, die in den Kutikula-Präparaten ebenfalls wildtypische, posteriore Segmente zeigen (Abbildung 24). - Abbildung 25: Tc'wg In-Situ Hybridisierung auf 10-12h vw und HScad Embryonen A-F Hellfeldaufnahmen. - Anterior befindet sich in allen Abbildungen links. A-C vw Embryonen. D-F korrespondierende HScad Embryonen - A) vw Embryo 6h nach dem Hitzeschock (HS). Der Keimstreif zeigt bereits sechs segmentale Tc'wg Streifen. Die ersten vier Streifen markieren die gnathalen Segmente Mandibel (Md), Maxille (Mx) und Labium (Lb) und das - erste thorakale Segment (T1). B) vw Embryo 12h nach dem HS. Der Keimstreif zeigt 15 Tc'wg Streifen. In den - Kopflappen kann man inzwischen die antennalen Domänen (An) erkennen. C) vw Embryo 12h nach dem HS. Der Keimstreif ist vollständig elongiert. Ganz anterior in den Kopflappen sind die Domänen des Labrums (Lr) zu sehen. D) HScad Embryo 6h nach dem HS. Das segmentale Tc'wg Muster ist irregulär und reduziert. Die Position von T1 kann nur vermutet werden. E) HScad Embryo 12h nach dem HS. Die antennalen Domänen in den Kopflappen sind stark reduziert (Pfeilspitzen) und in den gnathalen Segmenten ist das Tc'wg Muster irregulär und zum Teil reduziert (Balken). F) HScad Embryo 12h nach dem HS. In den Kopflappen fehlen die Domänen des Labrums (Stern) und der Antennen (Pfeilspitzen). Die anterioren segmentalen Tc'wg Streifen sind stark irregulär und die Lage von T1 kann nur auf Grund der Form des Gewebes vermutet werden. 3.2.9 Tc'MEX3 - Misexpression verursacht keinen Defekt auf Kutikula-Ebene Wie unter Punkt 3.2.3 erwähnt, konnten 20 unabhängige transgene Linien für HSMex3 generiert werden. Diese wurden, aufgrund der Misexpressions-Stärke des Tc'MEX3 Proteins nach dem Hitzeschock, auf fünf reduziert (L1, L12, L15, L18, L20). Wie für die HSzen2 Linien auch sollte zunächst überprüft werden, ob sich ein KutikulaPhänotyp durch die Misexpression von Tc'MEX3 induzieren lässt. 82 Ergebnisse Zu diesem Zweck wurden auch hier zunächst die zwei langen Ablagefenster für den Hitzeschock genommen (4-9h alte Embryonen und 8-12h alte Embryonen). Somit soll die Misexpression zum einen möglichst früh in undifferenzierten Blastodermen und zum anderen etwas später in vollständig differenzierten Blastodermen und kurzen Keimstreifen aktiviert werden. Die statistischen Auswertungen der Kutikula-Präparate der zwei Hitzeschock-Ablagen sind in Tabelle 15 und Tabelle 16 aufgeführt. Wie sich zeigt, konnte überraschenderweise in keinem der beiden Zeitfenster ein spezifischer Kutikula-Phänotyp gefunden werden obwohl sich die Misexpression des Tc'MEX3 Proteins, wie oben bereits gezeigt, sehr gut induzieren lässt. Für Tc'Mex3 ist bekannt, dass es die Translation von Tc'CAD im anterioren Kopf des Embryos inhibiert (Schoppmeier et al., 2009). Durch eine ubiquitäre Misexpression des Tc'MEX3 Proteins hätte man somit erwarten können, dass Tc'CAD eventuell reduziert wird, was in einem Tc'cad RNAi ähnlichen Phänotyp resultieren könnte. Dieser würde sich in nicht entwickelten Kutikulas bzw. in einem geringen Anteil von Larven äußern, die nur noch anteriore Reste vom Kopf zeigen (Copf et al., 2004; Schoppmeier et al., 2009). Leider konnte ein solcher Phänotyp für den HSMex3 nicht gefunden werden. Im frühen Hitzeschock-Fenster (4-9h alte Embryonen) ist der Anteil von nicht-entwickelten Kutikulas, mit bis zu 42,6%, zwar sehr hoch, jedoch kann in der vw- Kontrolle ebenfalls ein Anteil von 45,8% ausgemacht werden (Tabelle 15). Somit ist dieser Effekt wohl auf den Hitzeschock selbst zurück zu führen, der scheinbar einen generellen Entwicklungsabbruch in sehr frühen Stadien hervorruft. Im späteren Zeitfenster (8-12h alte Embryonen) bewegt sich der Anteil von Eiern ohne Kutikulas zwischen 19,8 und 24,9% (Tabelle 16). Im Gegensatz zur vw- Kontrolle, mit nur 14% nicht entwickelten Kutikulas, ist dieser Wert also leicht erhöht. Es ist somit eventuell denkbar, dass doch ein früher Entwicklungsdefekt aufgrund der Tc'MEX3 Misexpression entsteht. Allerdings sind neben den nicht entwickelten Kutikulas keine weiteren spezifischen Phänotypen zu sehen. Dies erschwert eine definitive Aussage dazu, ob die Misexpression von Tc'MEX3 zu Defekten in der Embryonalentwicklung führt. Dies könnte durch Untersuchungen von Markergenen auf embryonaler Ebene geklärt werden. Färbungen gegen Tc'CAD auf HSMex3 Embryonen zeigten keine deutliche Veränderung der Expression des Tc'CAD Proteins (Daten nicht gezeigt). Aufgrund dieser Tatsache und den nicht vorhandenen Kutikula-Phänotypen wurde beschlossen auf eine weitere Analyse der HSMex3 Linien zu verzichten und das Hauptaugenmerk auf den Tc'zen2 Hitzeschock zu legen. 83 Ergebnisse HSMex3 L1 WT ohne Kutikula Kopf defekt Abdomen defekt unspezifisch gesamt 27 23 0 0 4 54 50,0% 42,6% 0,0% 0,0% 7,4% 100,0% HSMex3 L12 47 64,4% 23 31,5% 0 0,0% 1 1,4% 2 2,7% 73 100,0% HSMex3 L15 45 31 0 0 2 78 57,7% 39,7% 0,0% 0,0% 2,6% 100,0% HSMex3 L18 HSMex3 L20 100 67 2 3 3 175 70 51 2 0 7 130 57,1% 38,3% 1,1% 1,7% 1,7% 100,0% 53,8% 39,2% 1,5% 0,0% 5,4% 100,0% - vw Kontrolle WT 435 50,9% ohne Kutikula 391 45,8% Kopf reduziert 14 1,6% Kopf + Thorax 4 0,5% reduziert Thorax reduziert 1 0,1% Thorax + Abdomen 1 0,1% reduziert Kopf + Thorax + 0 0,0% Abdomen reduziert Abdomen reduziert 2 0,2% dorsal offen 1 0,1% unspezifisch 5 0,6% gesamt 854 100,0% Tabelle 15: HSMex3 Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 4-9h alte Embryonen. Anzahl und prozentualer Anteil der verschiedenen Phänotyp-Klassen. Benannt sind jeweils die betroffenen Körperbereiche (Kopf, Thorax, Abdomen). reduziert/defekt: Verkleinerung bzw. teilweiser oder auch kompletter Verlust von - Strukturen und Segmenten. unspezifisch: Defekte, welche als Hintergrund auch in der vw Kontrolle auftreten. 84 Ergebnisse HSMex3 L1 WT ohne Kutikula Kopf defekt Kopf + Thorax reduziert Thorax defekt Kopf - Gap Abdomenrest nur Kopf Abdomen defekt unspezifisch gesamt HSMex3 L15 HSMex3 L18 HSMex3 L20 86 29 1 73,5% 24,8% 0,9% HSMex3 L12 198 53 7 74,2% 19,9% 2,6% 265 68 3 77,3% 19,8% 0,9% 137 55 0 67,2% 27,0% 0,0% 187 65 4 71,4% 24,8% 1,5% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 2 1,0% 1 0,4% 0 0,0% 1 0,4% 1 0,3% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,4% 0 0,0% 1 0,5% 0 0,0% 0 0 1 117 0,0% 0,0% 0,9% 100,0% 1 0,4% 1 0,4% 5 1,9% 267 100,0% 0 1 5 343 0,0% 0,3% 1,5% 100,0% 1 2 6 204 0,5% 1,0% 2,9% 100,0% 0 1 4 262 0,0% 0,4% 1,5% 100,0% - vw Kontrolle 470 82,0% 80 14,0% 6 1,0% WT ohne Kutikula Kopf defekt Kopf + Thorax 2 0,3% reduziert Thorax defekt 1 0,2% Kopf + Thorax + 2 0,3% Abdomen defekt nur Kopf 0 0,0% Abdomen defekt 4 0,7% unspezifisch 8 1,4% gesamt 573 100,0% Tabelle 16: HSMex3 Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 8-12h alte Embryonen. Anzahl und prozentualer Anteil der verschiedenen Phänotyp-Klassen. Benannt sind jeweils die betroffenen Körperbereiche (Kopf, Thorax, Abdomen). reduzier/defekt: Verkleinerung bzw. teilweiser oder auch kompletter Verlust von - Strukturen und Segmenten. unspezifisch: Defekte, welche als Hintergrund auch in der vw Kontrolle auftreten. 3.2.10 Tc'ZEN2 reguliert die Tc'CAD Expression Für Tc'ZEN2 ist bekannt, dass es die Translation von Tc'CAD in der anterior gelegenen extraembryonalen Serosa inhibiert und somit zusammen mit Tc'Mex3 dafür sorgt, dass Tc'CAD nur in posterioren embryonalen Bereichen exprimiert wird (Schoppmeier et al., 2009). Dadurch wird die korrekte Ausbildung der anterior-posterioren Achse des Embryos gewährleistet. Um die Vorgänge und Interaktionen während dieses frühen Patternings genauer zu verstehen, wurden die HSzen2 Linien etabliert. Die erste und grundlegendste Frage, die sich für das System stellt, ist zunächst die Frage nach der Interaktion zwischen Tc'ZEN2 und Tc'cad. Bindet Tc'ZEN2 beispielsweise direkt an die Tc'cad mRNA um seine Translation zu inhibieren? Benötigt es weitere Faktoren um dies zu bewirken oder wirkt es eventuell sogar zuerst als Transkriptionsaktivator auf weitere Translationsfaktoren? Fragen dieser Art sollten mit Hilfe der Hitzeschock-Linien näher untersucht werden. 85 Ergebnisse Ist die Interaktion beispielsweise direkt würde man erwarten, dass allein die Misexpression von Tc'ZEN2 im embryonalen Gewebe ausreichend ist um die Expression des Tc'CAD Proteins zu reduzieren oder gar komplett zu inhibieren. Um dies zu klären wurde eine Doppel-Fluoreszenz-Antikörper-Färbungen gegen Tc'ZEN2 und Tc'CAD genutzt. Um das System möglichst früh zu stören und die Auswirkungen in den Blastodermen untersuchen zu können, wurden die Embryonen der vw- Kontrolle und der HSzen2 Linie in einem Alter von 8-10h geschockt und nach einer Nachreifezeit von weiteren zwei Stunden fixiert. Somit soll gewährleistet sein, dass genug Zeit vorhanden ist das Protein zu misexprimieren und die Auswirkungen auf die Tc'CAD Expression zu untersuchen. Wie in Abbildung 26 zu sehen, zeigt sich zwei Stunden nach dem Hitzeschock tatsächlich eine deutliche Veränderung der Tc'CAD Expression in HSzen2 Embryonen. Die vw- Kontrolle zeigt die wildtypische Expression des Tc'ZEN2 Proteins in den Zellkernen der extraembryonalen Serosa (Abbildung 26 A, rot; Abbildung 26 B). Tc'CAD ist hingegen stark in den Zellkernen des posterioren embryonalen Gewebes exprimiert (Abbildung 26 A, grün; Abbildung 26 C). In den Embryonen der HSzen2 Linie hingegen, zeigt sich 2h nach dem Hitzeschock eine starke ektopische Expression von Tc'ZEN2 auch in den Zellkernen des embryonalen Gewebes (Abbildung 26 D, rot; Abbildung 26 E). Die Expression von Tc'CAD ist im Vergleich zur Kontrolle jedoch extrem stark reduziert, sodass kaum noch Zellen zu erkennen sind, die positiv für das Protein sind (Abbildung 26 D, grün; Abbildung 26 F). Dieses Experiment zeigt deutlich, dass die, durch Hitzeschock induzierte, Misexpression von Tc'ZEN2 in posterioren Bereichen ausreichend ist um eine Reduktion der Tc'CAD Expression zu erzielen. Somit kann die Tatsache bestätigt werden, dass Tc'ZEN2 die Translation von Tc'CAD in Tribolium castaneum reguliert. Allein anhand dieser Ergebnisse lässt sich jedoch nicht eindeutig sagen, ob die Interaktion direkt stattfindet oder weitere Faktoren durch die Anwesenheit von Tc'ZEN2 aktiviert werden, welche dann indirekt zur Reduktion der Tc'cad Translation führen. Mit Hilfe des HSzen2 kann also eine Situation im Embryo geschaffen werden, die einem zeitlich und lokal begrenzten Tc'cad Knockdown entspricht. 86 Ergebnisse - Abbildung 26: Doppel-AK-Färbung gegen Tc'ZEN2 (rot) und Tc'CAD (grün) in vw und HSzen2 Embryonen - 2h nach HS. Fluoreszenzaufnahmen. Anterior befindet sich in allen Abbildungen links. A-C vw Kontrolle D-F - HSzen2 Embryo. A) vw Embryo 2h nach HS. Tc'ZEN2 ist anterior in den Zellkernen der extraembryonalen Serosa exprimiert (rot). Tc'CAD ist deutlich in den Zellkernen des posterioren embryonalen Gewebes zu erkennen (grün). B) Einzelkanal der Tc'ZEN2 Expression des Embryos aus A. Die Expression ist auf die Zellkerne der Serosa beschränkt. C) Einzelkanal der Tc'CAD Expression des Embryos aus A. Posterior im Embryo zeigen die Zellkerne eine starke wildtypische Tc'CAD Expression. D) HSzen2 Embryo 2h nach HS. Tc'ZEN2 ist nun auch in Zellkernen des embryonalen Gewebes exprimiert (rot). Die Tc'CAD Expression posterior im Embryo ist nur noch schwach vorhanden (grün). E) Einzelkanal der Tc'ZEN2 Expression des Embryos aus D. Durch den Hitzeschock wird Tc'ZEN2 nun auch in den Zellkernen des embryonalen Gewebes stark exprimiert. F) Einzelkanal der Tc'CAD Expression des Embryos aus D. Die Tc'CAD Expression im Embryo ist stark reduziert und nur noch in wenigen Zellkernen zu sehen. Die Frage ob Tc'ZEN2 ausreichend ist um die Tc'CAD Expression zu regulieren scheint nun geklärt zu sein. Jedoch bleibt die Frage, wie genau die embryonalen Defekte nach dem HSzen2 entstehen. In den Kutikula-Präparaten zeigen sich Deletionen aber auch homeotische Transformationen (vgl. Abbildung 22). Aufgrund des Entwicklungsmodus von Tribolium castaneum kann dies verschiedene Gründe haben. Zum einen weisen die homeotischen Transformationen auf einen Defekt in den Hox-Genen hin, welche in Tribolium hauptsächlich von den Gap-Genen reguliert werden. Sind die Gap-Gene selbst gestört, kann ebenfalls ein HSzen2 ähnlicher Phänotyp entstehen. Es wurde gezeigt, dass der Knockdown verschiedener Gap-Gene in 87 Ergebnisse Tribolium zu Kombinationen aus Gap-Phänotypen, also fehlenden Segmenten und homeotischen Transformationen, führt (Bucher und Klingler, 2004; Cerny et al., 2005; Savard et al., 2006; Marques-Souza et al., 2008). Zum anderen kann eine Deletion ganzer Segmente jedoch auch durch Veränderungen der Paarregel-Gene entstehen. Der Verlust von Tc'even-skipped (Tc'eve) führt beispielsweise zu Kutikulas, die nur noch aus Labrum und Antennen bestehen (Choe, et al. 2006). An beiden Systemen, also der Regulation von Gap-Genen bzw. der der Paarregel-Gene scheint Tc'cad beteiligt zu sein (Liu und Kaufmann, 2005; El-Sherif et al., 2014). Deshalb wurden die HSzen2 Embryonen auf beide Thesen hin untersucht. 3.2.11 Tc'eve Streifen sind nach Tc'ZEN2 Misexpression gestört Wie erst kürzlich gezeigt werden konnte, ist der Tc'CAD Gradient, seine maximale Ausbreitung nach anterior sowie seine Expressions-Steilheit, für die korrekte Ausbildung der Tc'eve Streifen verantwortlich (El-Sherif et al., 2014). Ist weniger Tc'CAD vorhanden, also z.B. in milden Tc'cad RNAi Embryonen, und somit der Gradient flacher und die anteriore Expressionsgrenze weiter posterior, werden die Tc'eve Streifen breiter und gleichzeitig rutscht die Position des ersten Streifens ebenfalls nach posterior (El-Sherif et al., 2014). Da durch den HSzen2 eine Reduktion der Tc'CAD Expression erzielt werden kann sollte überprüft werden, ob es auch hier Veränderungen in der Tc'eve Expression gibt. Um die Tc'eve Expression im Blastoderm zu analysieren, wurden die Embryonen deshalb einem 810h-Hitzeschock ausgesetzt und 2 bzw. 4 Stunden danach fixiert. Zunächst soll die Expansion der frühen Tc'eve Domäne in undifferenzierten Blastodermen untersucht werden. Auf Grundlage der Ergebnisse von El-Sherif et al., 2014 würde man erwarten, dass durch die Reduktion der Tc'CAD Expression, in Folge der Misexpression von Tc'ZEN2, die Tc'eve Expressionsdomäne weiter nach posterior verschoben ist. Abbildung 27 zeigt die frühe blastodermale Tc'eve Expression in vw- Kontrollembryonen (Abbildung 27 A - H) und HSzen2 Embryonen (Abbildung 27 I - Q). Der prozentuale Anteil des Embryos, welcher durch die Expression von Tc'eve eingenommen wird ist jeweils angegeben. Um zu klären ob es eine signifikante Verschiebung der Domäne nach posterior gibt, wurde für beide Gruppen der Mittelwert und die Standardabweichung berechnet. Tabelle 17 zeigt die Ergebnisse in Zahlen und als Diagramm. Wie zu erkennen ist, zeigt sich für die HSzen2 Embryonen tatsächlich eine leichte Verschiebung der Domäne nach posterior. Zudem ergibt der t-Test einen p-Wert von 0,0018 und somit eine statistische Signifikanz für dieses Ergebnis. 88 Ergebnisse Auch die spätere blastodermale Tc'eve Expression wurde in HSzen2 Embryonen untersucht. Die Resultate sind in Abbildung 28 gezeigt. Eine deutliche Verschiebung der Domänen, in HSzen2 Embryonen, nach posterior kann nicht ausgemacht werden. Jedoch zeigen sich andere deutliche Veränderungen in der Expression der anterioren Tc'eve Streifen. In späten undifferenzierten Blastodermen zeigen sich im Wildtyp zwei Tc'eve Streifen, welche zunächst breiter sind, sich dann verschmälern und definierte Streifen bilden (Abbildung 28 A + B). Nach der Misexpression von Tc'zen2 fehlt der zweite Tc'eve Streifen in den späten undifferenzierten Blastodermen zunächst komplett und nur Streifen 1 ist zu erkennen (Abbildung 28 E). Etwas später, wenn sich Streifen 1 schon leicht verschmälert hat, ist Streifen 2 noch immer kaum auszumachen (Abbildung 28 F). Bei Einsetzen der Invagination ist Tc'eve im Wildtyp in vier Streifen exprimiert (Abbildung 28 C + D). Streifen 1 hat sich bereits in die segmentalen Streifen 1a und 1b aufgespalten, darauf folgt der nun stark verschmälerte Streifen 2 und ganz posterior in der Wachstumszone Streifen 3. Betrachtet man die gleichen Stadien der HSzen2 Embryonen fällt auf, dass inzwischen Streifen 2 zwar vorhanden ist aber generell die Expression von Tc'eve stark reduziert erscheint (Balken, Abbildung 28 G + H). Die Streifen 1a und 1b sind zum Teil kaum zu erkennen und auch Streifen 2 ist nur schwach vorhanden, was eine genaue Benennung der noch zu erkennenden Streifen unmöglich macht. Streifen 3 wirkt zumindest in sehr späten Blastodermstadien normal. 89 Ergebnisse - Abbildung 27: Vergleich der frühen Tc'eve Expansion in Blastodermen von vw und HSzen2. (8-10h-HS - +2h) A-Q Hellfeldaufnahmen. A-H vw Embryonen I-Q HSzen2 Embryonen. Anterior befindet sich in allen Aufnahmen links. Der prozentuale Anteil jedes Embryos, den die frühe Tc'eve Domäne einnimmt, ist dargestellt. 90 Ergebnisse - vw HSzen2 47,2% 40,8% 51,4% 43,1% 50,7% 45,2% 47,9% 44,4% 51,4% 47,9% 50,0% 49,3% 51,4% 47,3% 50,0% 47,3% 47,2% Mittelwert 50,0% 45,7% Standardabweichung 0,01630951 0,02818783 - Tabelle 17: Prozentuale Expansion der Tc'eve Expressionsdomänen in vw und HSzen2 Blastodermen (810h-HS+2h). - Abbildung 28: In-Situ Hybridisierung gegen Tc'even-skipped (Tc'eve) auf vw und HSzen2 Embryonen. A-H Hellfeldaufnahmen. A'-H' Hoechstfärbung der Zellkerne der korrespondierenden Embryonen. Anterior befindet - sich in allen Abbildungen links. A-D vw Embryonen. E-H korrespondierende HSzen2 Embryonen A) Spätes - undifferenziertes vw Blastoderm, das bereits zwei Tc'eve Streifen zeigt. B) Die zwei Tc'eve Streifen haben sich - im frühen differenzierten vw Blastoderm deutlicher voneinander getrennt und sich verschmälert. C) Zum - Zeitpunkt der Invagination hat sich der erste Tc'eve Streifen im vw Embryo bereits in 1a und 1b aufgespalten. - Darauf folgt Streifen 2 und ganz posterior entwickelt sich Tc'eve Streifen 3. D) Sehr spätes differenziertes vw Blastoderm mit den Tc'eve Streifen 1a, 1b, 2 und, nun auch sehr deutlich, Streifen 3 ganz posterior. E) Undifferenziertes HSzen2 Blastoderm. Tc'eve Streifen 1 ist klar zu erkennen, Streifen 2 scheint zu fehlen. F) 91 Ergebnisse Frühes differenziertes HSzen2 Blastoderm mit einem Tc'eve Streifen. Streifen 2 fehlt oder ist nur sehr schwach am posterioren Ende zu erkennen. G) Differenziertes HSzen2 Blastoderm. Die Tc'eve Streifen 1a und 1b und auch 2 sind stark reduziert und zum Teil kaum zu erkennen (Balken). H) Spätes differenziertes HSzen2 Blastoderm. Die anterioren Tc'eve Streifen sind abhanden bzw. reduziert wodurch eine genaue Zuordnung nicht möglich ist (Balken). Die Misexpression von Tc'zen2 scheint also tatsächlich einen Einfluss auf die Expression des Paarregelgens Tc'eve zu haben. Eine leichte Verschiebung der Expression nach posterior konnte nachgewiesen werden, was eventuell durch die Reduktion von Tc'CAD und den daraus resultierenden Veränderungen seines Expressionsgradienten verursacht wird. Dies würde die Ergebnisse von El-Sherif et al., 2014 stützen, dass der Tc'CAD-Gradient durch seine Expressionsstärke die Oszillationsgeschwindigkeit der Tc'eve positiven Zellen beeinflusst und somit die Ausbildung der einzelnen Tc'eve Streifen reguliert (El-Sherif et al., 2014). In differenzierten Blastodermen zeigt sich jedoch keine deutliche Verschiebung der Tc'eve Streifen nach posterior. Die Expression des zweiten Tc'eve Streifens scheint zunächst verzögert zu sein. Außerdem gehen die anterioren Streifen im weiteren Verlauf der Entwicklung verloren bzw. sind reduziert. Dies könnte auf eine Streifen-spezifische Regulation hinweisen, wie sie in Schoppmeier et al., 2009 diskutiert wird, und gegen eine Gradienten-Funktion. Die in HSzen2 Embryonen gefundenen Deletionen könnten also eventuell durch eine Misregulation des Paarregel-Gens Tc'eve verursacht werden. Wie bereits erwähnt, besteht jedoch auch die Möglichkeit, dass Deletionen und homeotische Transformationen durch Störungen in der Gap- und Hox-Gen-Expression hervorgerufen werden (Bucher und Klingler, 2004; Cerny et al., 2005; Savard et al., 2006; Marques-Souza et al., 2008). Dieser Theorie soll in den folgenden Abschnitten nachgegangen werden. 3.2.12 Die anterioren Hox-Gene Tc'Scr und Tc'Dfd sind nach Tc'ZEN2 Misexpression stark reduziert Wie unter Abschnitt 3.2.7 bereits beschrieben, zeigen sich in den Kutikulas der HSzen2 Embryonen nicht nur Deletionen von Segmenten sondern auch homeotische Transformationen. Dies deutet meist auf eine Störung in der Expression der Hox-Gene hin, welche die Identität der einzelnen Segmente festlegen (Hughes und Kaufmann, 2002). Die Veränderung, welche in den HSzen2 Embryonen am meisten gefunden wurde waren Transformationen von gnathalen Segmenten in zusätzliche Antennen. 92 Ergebnisse Solche Defekte wurden bereits für Mutanten der anterioren Hox-Gene Tc'Sex comb reduced (Tc'Scr) und Tc'Deformed (Tc'Dfd) beschrieben (Brown et al., 2000; Curtis et al., 2001). Die Mutanten von Tc'Scr und auch die RNAi zeigen eine homeotische Transformation des Labiums hin zu Antennen (Brown et al., 2000). Ist Tc'Dfd mutiert, werden die Maxillen zu zusätzlichen Antennen transformiert (Curtis et al., 2001). Auf Grund dieser veröffentlichten Ergebnisse sollten die HSzen2 Embryonen auf die Expression dieser anterioren Hox-Gene hin untersucht werden. Da die homeotischen Gene meist relativ spät in der Entwicklung exprimiert werden, wurden die Embryonen einem 1012h-Hitzeschock ausgesetzt und 6 Stunden nachgereift, sodass sie sich zum Zeitpunkt der Fixierung in der Keimstreif-Streckung befinden. Für Tc'Scr wurde eine Einzel-In-Situ und auch eine Doppel-In-Situ Hybridisierung, zusammen mit Tc'wg gemacht. Abbildung 29 zeigt die Ergebnisse. Wie die Doppel-Färbung mit Tc'wg in Abbildung 29 B zeigt, beginnt die Tc'Scr Expression (lila) im Wildtyp posterior des Tc'wg Streifens der Maxille, also im labialen Segment und streckt sich nach posterior bis ins dritte thorakale Segment aus. Abbildung 29 A zeigt diese Expressionsdomäne nochmals deutlicher als Einzel-Färbung. Dort kann man zudem gut sehen, dass die Expression im Labium deutlich stärker ist als in den thorakalen Segmenten. Nach der Misexpression von Tc'ZEN2 durch den Hitzeschock, zeigt sich eine starke Reduktion des Tc'Scr Expression in den Keimstreifen. Im labialen Segment ist teilweise noch punktuelle Expression zu erkennen (Pfeilspitze, Abbildung 29 C + D). In den thorakalen Segmenten kann kaum noch Tc'Scr Expression ausgemacht werden. Die Doppel-Färbung mit Tc'wg zeigt außerdem, dass die Tc'Scr Domäne genau den Bereich markiert, in dem auch die segmentale Tc'wg Expression durch die Tc'ZEN2 Misexpression gestört und irregulär wird (Balken, Abbildung 29 D). Die Färbung gegen Tc'Dfd zeigt ähnliche Resultate (Abbildung 30). In der vw- HitzeschockKontrolle ist Tc'Dfd, wie im Wildtyp zu erwarten, im Keimstreif in einer anterioren Domäne exprimiert, die die Mandibel (Md) und die Maxille (Mx) markiert (Abbildung 30 A + B). Nach der Misexpression von Tc'ZEN2 in den HSzen2 Embryonen ist die Tc'Dfd Expression stark reduziert (Abbildung 30 C) oder zum Teil sogar komplett verschwunden (Abbildung 30 D). Die anterioren Hox-Gene welche Transformationen von gnathalen Segmenten zu Antennen verursachen sind also tatsächlich nach der Misexpression von Tc'ZEN2 reduziert. Somit können die homeotischen Transformationen der HSzen2 Larven erklärt werden. Es bleibt 93 Ergebnisse jedoch die Frage was genau die Reduktion der Hox-Gen-Expression auslöst. In Tribolium ist bekannt, dass vor allem die Gap-Gene die Expression der Hox-Gene aktivieren und steuern. Deshalb sollte im Folgenden untersucht werden, ob sich in HSzen2 Embryonen auch Defekte in der Gap-Gen Expression zeigen. Abbildung 29: Tc'Scr In-Situ Hybridisierung und Tc'Scr + Tc'wg Doppel-In-Situ Hybridisierung auf 10-12h - - vw und HSzen2 Embryonen A-D Hellfeldaufnahmen. Anterior befindet sich in allen Abbildungen links. A+B vw - Embryonen. C+D korrespondierende HSzen2 Embryonen A) vw Embryo 6h nach dem Hitzeschock (HS). Die Tc'Scr Expression ist an ihrer anterioren Grenze, im Segment des Labiums, am stärksten und markiert posterior - auch noch die thorakalen Segmente. B) vw Embryo 6h nach dem HS. Tc'wg zeigt das wildtypische segmentale Muster (blau). Die Tc'Scr Expression startet posterior des Streifens der Maxille (Mx), im Labial-Segment (Lb) und setzt sich bis in den Thorax fort. C) HSzen2 Embryo 6h nach dem HS. Die Tc'Scr Expression ist stark reduziert. Im Labium zeigen sich noch einzelne Bereiche, die Tc'Scr stärker exprimieren (Pfeilspitze). Posterior ist die Expression teilweise komplett verschwunden. D) HSzen2 Embryo 6h nach dem HS. Das Tc'wg Muster ist reduziert und irregulär (Balken). Im gleichen Bereich ist die Tc'Scr Expression stark reduziert. Im labialen Segment kann noch schwache Tc'Scr Expression ausgemacht werden (Pfeilspitze). Abbildung 30: Tc'Dfd Hellfeldaufnahmen. In-Situ Anterior Hybridisierung befindet sich in auf allen 10-12h - vw Abbildungen und links. HSzen2 Embryonen A-D - Embryonen. C+D A+B vw - korrespondierende HSzen2 Embryonen A) vw Embryo 6h nach dem Hitzeschock (HS). Die wildtypische 94 Ergebnisse - Expressionsdomäne von Tc'Dfd markiert die Segmente der Mandibel (Md) und der Maxille (Mx). B) vw Embryo 6h nach dem HS. Der Embryo ist etwas älter als in A. Tc'Dfd markiert auch hier Md und Mx. C) HSzen2 Embryo 6h nach dem HS. Die Tc'Dfd Expression ist stark reduziert (Pfeilspitze). D) HSzen2 Embryo 6h nach dem HS. Der Embryo ist etwas älter als in C. Die Tc'Dfd Expression ist stark reduziert und teilweise komplett abwesend (Pfeilspitze). 3.2.13 Die Gap-Gene Tc'Kr und Tc'hb sind nach Tc'ZEN2 Misexpression stark reduziert In Tribolium castaneum sind vor allem die Gap-Gene für die korrekte Expression und Lokalisation der Hox-Gen-Domänen verantwortlich. So zeigen sich nach einem Knock-down von Gap-Genen in Tribolium, nicht nur Verluste von Segmenten sondern auch homeotische Transformationen (Bucher und Klingler, 2004; Cerny et al., 2005; Savard et al., 2006; Marques-Souza et al., 2008). Diese Eigenschaften machen sie zu vielversprechenden Kandidaten zur Klärung der Defekte nach einer Tc'ZEN2 Misexpression. Ausgehend vom Verlust der anterioren Hox-Gene in HSzen2 Embryonen, wurde zunächst die Expression von Tc'Krüppel (Tc'Kr) untersucht. Für dieses Gap-Gen wurde gezeigt, dass es die posterioren Expressions-Grenzen von Tc'Dfd und Tc'Scr definiert (Cerny et al., 2005). Eine Expansion der Tc'Krüppel-Domäne nach anterior, könnte somit den Verlust der HoxGen-Expression erklären. Um diese These zu untersuchen, wurden die Embryonen einem 10-12h-Hitzeschock unterzogen und vor dem Fixieren 4 Stunden nachgereift. In den Keimstreifen der Wildtyp-Kontrolle ist Tc'Kr in einer zentralen Domäne im Keimband exprimiert. Diese markiert die thorakalen Segmente (Abbildung 31 A + B; Cerny et al., 2005). Überraschenderweise findet sich nach der Misexpression von Tc'ZEN2 keine Expansion der Tc'Kr Domäne sondern eine Reduktion der Expression. Abbildung 31 C zeigt ein Keimrudiment in dem beinahe alle Tc'Kr Expression verloren gegangen und nur noch als schwacher Schimmer zu erkennen ist (Pfeilspitze). In nicht so stark betroffenen Keimstreifen kann man die Domäne noch gut erkennen, jedoch ist die Expression nur noch punktuell vorhanden (gestrichelter Balken, Abbildung 31 D). Dieses Ergebnis ist unerwartet und wirft zugleich die Frage auf, wie es zu dieser Reduktion der Tc'Kr Expression kommt. Für Tribolium und auch Drosophila ist bekannt, dass sich GapGene untereinander selbst regulieren und die frühe Krüppel-Domäne von hunchback kontrolliert wird (Marques-Souza et al., 2008; Struhl et al., 1992; Hülskamp et al., 1990). Somit war der nächste Schritt zur Klärung des HSzen2 Phänotyps, die Analyse der Tc'hunchback (Tc'hb) Expression in Hitzeschock-Embryonen. Erneut wurden Embryonen im 10-12h-Stadium geschockt und diesmal zwei Stunden zum Nachreifen gestellt. 95 Ergebnisse - Abbildung 31: Tc'Kr In-Situ Hybridisierung auf 10-12h vw und HSzen2 Embryonen A-D Hellfeldaufnahmen. - Anterior befindet sich in allen Abbildungen links. A+B vw Embryonen. C+D korrespondierende HSzen2 - Embryonen A) vw Embryo 4h nach dem Hitzeschock (HS). Tc'Kr ist wildtypisch im Keimrudiment in den - thorakalen Segmenten exprimiert. B) vw Embryo 4h nach dem HS. Tc'Kr markiert die thorakalen Segmente im Keimstreif (Balken). C) HSzen2 Embryo 4h nach dem HS. Die Tc'Kr Expression im Keimrudiment ist extrem reduziert (Pfeilspitze). D) HSzen2 Embryo 4h nach dem HS. Im Vergleich zum Wildtyp, ist die Tc'Kr Expression reduziert und zeigt ein punktuelles Muster (gestrichelter Balken). Die Tc'hb Expression wurde in kurzen Keimstreifen und auch in blastodermalen Stadien untersucht. Dies ist in Abbildung 32 und Abbildung 33 dargestellt. Im Wildtyp Keimstreif ist Tc'hunchback, Gap-Gen typisch, in einer zentral gelegenen Domäne exprimiert. Außerdem zeigt sich leichte Färbung entlang der Mittellinie (Abbildung 32 A + B; Wolff et al., 1995). Nach der Misexpression von Tc'ZEN2 zeigt sich eine deutliche Reduktion der zentralen Expressions-Domäne von Tc'hb (Pfeilspitzen, Abbildung 32 C + D). Auch in Blastodermen kann dieser Rückgang an mRNA Expression beobachtet werden. In der vw- Kontrolle ist die Tc'hb mRNA wildtypisch anterior in der extraembryonalen Serosa (Pfeile, Abbildung 33 A) und im embryonalen Gewebe in einer zentralen Domäne (Balken, Abbildung 33 A) exprimiert. Diese embryonale Domäne bildet später die zentrale Expressions-Domäne im Keimstreif. Die Blastoderme der HSzen2 Linie zeigen nach der Aktivierung der Misexpression, genau wie die Keimstreifen, einen Verlust der Tc'hb Expression. In schwächer betroffenen Embryonen kann noch Expression in der Serosa erkannt werden (Pfeile, Abbildung 33 B), die embryonale Domäne ist jedoch deutlich abgeschwächt (gestrichelter Balken, Abbildung 33 B). Es finden sich jedoch auch Embryonen, in welchen die Tc'hb mRNA fast vollständig verschwunden ist (Abbildung 33 C). Die extraembryonale Domäne in der Serosa ist kaum noch auszumachen (Pfeile, Abbildung 33 C) und auch im embryonalen Gewebe sind nur noch schwache Reste der Tc'hb Färbung zu erahnen (Pfeilspitze, Abbildung 33 C). 96 Ergebnisse Die Reduktion der Tc'Kr mRNA schein also durch den Verlust der Tc'hb Expression hervorgerufen zu werden. Abbildung 32: Tc'hb Hellfeldaufnahmen. In-Situ Anterior Hybridisierung befindet sich in auf allen 10-12h - vw Abbildungen und links. HSzen2 A+B - vw Keimstreifen A-D Embryonen. C+D - korrespondierende HSzen2 Embryonen A) vw Embryo 2h nach dem Hitzeschock (HS). Tc'hb markiert im - Keimrudiment eine zentrale, segmentale Domäne und einen leichten Streifen entlang der Mittellinie. B) vw Embryo 2h nach dem HS. Tc'hb ist im frühen Keimstreif weiterhin in einer zentralen Domäne und entlang der Mittellinie aktiv. C) HSzen2 Embryo 2h nach dem HS. Die Tc'hb Expression der zentralen Domäne ist im Keimrudiment extrem reduziert (Pfeilspitze). D) HSzen2 Embryo 2h nach dem HS. Im Vergleich zum Wildtyp, ist die zentrale Tc'hb Domäne auch im Keimstreif reduziert (Pfeilspitze). 97 Ergebnisse Abbildung 33: Tc'hb In-Situ Hybridisierung auf 10-12h - vw und HSzen2 Blastoderme A-C Hellfeldaufnahmen. A'-C' Hoechstfärbung der Zellkerne der korrespondierenden Embryonen. Anterior befindet - - sich in allen Abbildungen links. A vw Embryo. B-C korrespondierende HSzen2 Embryonen A) vw Embryo 2h nach dem Hitzeschock (HS). Tc'hb ist im differenzierten Blastoderm anterior in der extraembryonalen Serosa (Pfeile) und im embryonalen Gewebe in einer zentralen Domäne (Balken) exprimiert. B) HSzen2 Embryo 2h nach dem HS. Die Tc'hb Expression in der Serosa (Pfeile) und auch im embryonalen Gewebe (gestrichelter Balken) sind nach dem Hitzeschock reduziert. C) HSzen2 Embryo 2h nach dem HS. Tc'hb ist in diesem Blastoderm in der Serosa kaum noch zu erkennen (Pfeile). Auch die Domäne im embryonalen Gewebe ist fast vollständig verschwunden (Pfeilspitze). Es ist also durchaus denkbar, dass die Entwicklungs-Defekte, welche nach einem HSzen2 auftreten grundsätzlich durch den sehr frühen Verlust von Tc'hb hervorgerufen werden. Wie genau die Tc'hb Expression reguliert wird ist bis heute nicht genau geklärt. Es finden sich jedoch Hinweise, dass zumindest die embryonale Domäne durch caudal aktiviert werden könnte (Wolff et al., 1998). Wie hier bereits gezeigt wurde, wird die Tc'CAD Expression durch den HSzen2 inhibiert, was somit in Folge durchaus eine Reduktion von Tc'hb hervorrufen könnte (vgl. Diskussion 4.3.2). 98 Diskussion 4. Diskussion In Drosophila ist der Hauptfaktor für die früh-embryonale Musterbildung bicoid (Frohnhöfer et al., 1986; Frohnhöfer und Lehmann, 1987). Bicoid wird als mRNA anterior im Ei lokalisiert und bildet nach der Translation einen Protein-Gradienten von anterior nach posterior, welcher als Morphogen-Gradient konzentrationsabhängig diverse zygotische Gene reguliert (Berleth et al., 1988; Driever und Nüsslein-Volhard, 1988; Driever und Nüsslein-Volhard, 1989; Rivera-Pomar et al., 1996). Für Tribolium castaneum und auch für alle anderen Insekten außerhalb der höheren Dipteren konnte bis heute kein bicoid Ortholog nachgewiesen werden (Stauber et al., 1999; Brown et al., 2001). Zudem ist unklar ob es Faktoren gibt, die eine bicoid ähnliche Funktion erfüllen und wenn ja welche das sind. Um ein besseres Verständnis der frühen anteriorposterioren Musterbildungs-Prozesse in Tribolium zu erlangen, besteht somit die Möglichkeit neue noch unbekannte Faktoren dieser Abläufe zu suchen oder die Interaktionen und Funktionen von bereits bekannten Faktoren näher zu analysieren. Letzteres war das Hauptziel dieser Arbeit. Durch die Manipulation der Expressionsdomänen und der Expressionszeitpunkte von früh aktiven Faktoren sollte die Auswirkung auf die embryonale Entwicklung untersucht werden. Hierzu diente zum einen der embryonale Hitzeschock (Schinko et al., 2012). Mit diesem sollten die Interaktionen innerhalb des "Tc'zen2/Tc'Mex3/Tc'cad - Systems" im Detail analysiert werden (Schoppmeier et al., 2009; vgl. 4.2). Wie bereits erwähnt, ist die Methode des Hitzeschocks in soweit begrenzt, als dass hiermit keine maternale Misexpression induziert werden kann. Aufgrund dieser Tatsache war ein weiteres Ziel dieser Arbeit, die Etablierung eines maternalen Misexpressionssystems für Tribolium castaneum. 4.1 Ein maternales Misexpressionssystem in Tribolium castaneum Die Analysen der maternalen Misexpressions-Konstrukte zeigen, dass durch die Kombination der regulatorischen Elemente von Tc'pangolin und Tc'eagle eine zuverlässige maternale Misexpression des Reportergens eGFP in Tribolium erreicht werden konnte. Zudem ist es möglich eine Lokalisation der mRNA am anterioren Pol des Eis zu erzielen. Diese Lokalisation erfolgt sehr wahrscheinlich durch die Tc'eagle 3'UTR. Für diese Genbereiche wurde generell gezeigt, dass sie regulatorische Elemente besitzen, welche zur gezielten Lokalisation von mRNAs führen können (Kloc et al., 2002). Wie bereits erwähnt, ist es jedoch kompliziert eine transgene Linie auf längere Sicht zu halten, welche kontinuierlich ein Gen von Interesse maternal misexprimiert. In Eiern 99 Diskussion transgener Weibchen wäre das Gen maternal aktiv. Durch den davon ausgelösten Phänotyp bzw. durch die daraus resultierenden Entwicklungsstörungen wären die Nachkommen vermutlich nicht lebensfähig und somit der Stamm nicht zu halten. Eine mögliche Lösung wäre, die Linie über die transgenen Männchen zu halten. Eine Kreuzung der transgenen Männchen mit vw- Weibchen sollte lebensfähigen Nachwuchs produzieren. Diese Methode ist jedoch extrem umständlich, da für die Haltung und auch eventuelle Versuche immer eine Selektion der transgenen Tiere nach Geschlecht und Transformationsmarker nötig wäre. Auch aufgrund dieser Tatsache sollte das Misexpressionssystem auf dem UAS/Gal4-System aufgebaut werden für das bereits gezeigt wurde, dass es in Tribolium prinzipiell funktioniert (Schinko et al., 2010). Durch den modularen Aufbau des maternalen Misexpressions-Vektors pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] war es leicht möglich, die kodierende Sequenz des Reportergen eGFP durch die von Gal4∆ zu ersetzen. Da auch die 5' und 3' Regionen leicht ersetzt werden können bietet dieses System zusätzlich die Möglichkeit, sehr einfach neue Gal4∆-Treiberlinien zu kreieren und so Gal4∆ über diverse andere Promotoren in anderen Geweben bzw. zu anderen Entwicklungszeitpunkten zu exprimieren. Die UAS-Vektoren sind auf gleiche Weise modular aufgebaut, sodass auch hier in Zukunft der Austausch kodierender Sequenzen einfach möglich ist, wodurch prinzipiell die Misexpression jedes Gens von Interesse erreicht werden kann. Mit einem Austausch der 3'UTR könnte zudem eine Lokalisation der mRNA in anderen Bereichen des Embryos erzielt werden (Kloc et al., 2002). Durch diesen modularen Aufbau ist das System somit vielseitig einsetzbar. Die Versuche zum maternalen UAS/Gal4-System in dieser Arbeit zeigen jedoch, dass es noch einige Hürden zu überwinden gibt um eine funktionale Misexpression zu erreichen. Besonders die Gal4-Linien müssen noch optimiert werden. Bis zum Ende der Arbeit konnte keine Gal4-Misexpression mittels des pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_Gal4∆_Tc'eg-3'UTR] Vektors nachgewiesen werden. Außerdem war die Ausbeute an transgenen Linien, nach embryonaler Injektion dieses Vektors, extrem gering. Bezüglich der geringen Transformationsrate besteht zum einen die Möglichkeit, dass es mit dem Vektor selbst ein Problem gibt, wodurch die Rate stark erniedrigt wird. Hinweise hierfür liefert ein Vergleich der in dieser Arbeit erzielten Transformationsraten mit verschiedenen Vektoren (vgl. Ergebnisse 3.1.5). Wurde der pBac[3xP3-GFP] verwendet, welcher eGFP als Transformationsmarker trägt war die Rate an transgenen Linien durchgehend höher als mit dem pBac[3xP3-dsRed]-Vektor (pRed). Die Injektionen von pBac[UAS_pan-minPromoter_eg5'UTR_Mex3ORF_eg3'UTR] 100 Diskussion und pBac[UAS_pan-minPromoter_eg5'UTR_otdORF_eg3'UTR] erbrachten eine Transformationsrate von 18,6% bzw. 30,6%, gegenüber einer Rate von 4,5 - 5% bei der Injektion von pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_Gal4∆_Tc'eg-3'UTR]. Auch die Injektionen der pRed-Vektoren, in welchen noch das Reportergen eGFP enthalten war, zeigten deutlich verringerte Transformationsraten. So konnte für pRed[Tc'eg-8kb-upstream+5'UTR_nlseGFP_Tc'eg-3'UTR] und pRed[Tc'exu-upstream+5'UTR_nls-eGFP_Tc'eg-3'UTR] beispielweise keine einzige transgene Linie erzeugt werden. Es wäre also durchaus denkbar, dass der Transformationsvektor (pRed) selbst nicht gut in die Keimbahn integriert und so diese niedrigen Transformationsraten erzeugt. Ein Test mit weiteren Transformationsvektoren, wie sie beispielsweise in Horn et al., 2002 beschrieben sind, könnte zeigen ob es sich tatsächlich um ein Problem mit dem hier gewählten Transformations-Vektor handelt und ob mit anderen Vektoren bessere Raten erzielt werden können. Auf der anderen Seite wäre es jedoch auch möglich, dass das maternal exprimierte Gal4 einen Entwicklungsdefekt auslöst und somit die transgenen Käfer erst gar nicht überleben. Für transgene Drosophila-Linien wurde gezeigt, dass die Expression von Gal4 alleine ausreicht um zu Entwicklungsstörungen und Apoptose in den Augen bzw. in Neuronen zu führen (Kramer und Staveley, 2003; Rezával et al., 2007). Da das Drosophila-Genom kein Ortholog des Gal4-Gens und auch keine UAS-Elemente besitzt an die der, aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae stammende, Transkriptionsfaktor Gal4 binden könnte, wurde bis dahin allgemein angenommen, dass die ektopische Expression von Gal4 in Drosophila keine Auswirkungen auf die Entwicklung hat (Klar und Halvorson, 1974; Giniger et al., 1985; Xie et al., 2010). Diese Annahme wurde jedoch von Xie et al., 2010 wiederlegt. Sie erbrachten den Nachweis, dass bereits eine Kopie des Gal4Gens im Genom ausreichend ist, um die Expression verschiedener Gene zu verändern, darunter auch pro-apoptotische Gene (Xie et al., 2010). Die Veränderungen in der Genexpression weisen auf eine Stressantwort auf Grund der hohen Gal4-Expression hin (Xie et al., 2010). Die Apoptose und Entwicklungsstörungen zeigten sich in Drosophila stets in den Geweben, in welchen Gal4 exprimiert wurde (Kramer und Staveley, 2003; Rezával et al., 2007). Überträgt man diese Erkenntnisse auf Tribolium und das vorliegende Misexpressionssystem ist es durchaus denkbar, dass die maternale Expression von Gal4 zu frühen Defekten in der Embryonalentwicklung führt. Ist dies der Fall, wären transgene Embryonen durch diese frühen Defekte wohl nicht überlebensfähig, wodurch sich die vorliegende sehr niedrige Transformationsrate ergeben würde. 101 Diskussion Eventuell wird die Expression des Gal4-Gens in den zwei transgenen Linien, welche in dieser Arbeit erzeugt wurden durch seine Lage im Genom und die umliegenden genetischen Sequenzen herunter reguliert, wodurch es den Nachkommen ermöglicht wird zu überleben. Ein solches Gen-Silencing könnte auch erklären, warum in diesen Linien keine Gal4Expression nachgewiesen werden konnte. Natürlich ist es ebenso denkbar, dass die genutzte Gal4-Sequenz Mutationen beinhaltet und es somit nicht zur Expression eines funktionellen Gal4-Proteins kommt. Gegen diese These spricht jedoch zum einen die Sequenzierung des klonierten Konstrukts. Digital wurde überprüft, ob eine Translation der klonierten kodierenden Gal4∆-Sequenz zu einem funktionalen Gal4-Protein führen sollte. Die Ergebnisse zeigen, dass es nicht zu einem vorzeitigen Translationsstopp kommen sollte und auch die erhaltene Aminosäure-Sequenz ist korrekt. Zum anderen konnte selbst die Gal4∆ mRNA nicht nachgewiesen werden. Die mRNA würde trotz Mutationen in der CDS transkribiert werden und ihre Detektion mittels antisense Sonden sollte funktionieren, selbst wenn in der Sequenz einzelne Punktmutationen oder ähnliches existieren, da es bereits ausreicht wenn nur eine sehr kurze Sequenz der genutzten antisense-Sonde an die mRNA binden kann. Neben der Generierung einer funktionalen Gal4-Linie, ist es ebenfalls wichtig die generierten UAS-Linien auf ihre Funktion hin zu testen. Hierfür könnten sie in zukünftige Experimenten mit einer bereits getesteten funktionalen Gal4-Linie gekreuzt und auf die Misexpression von Tc'otd bzw. Tc'Mex3 hin analysiert werden. Die einzige bisher bekannte funktionale Gal4Linie für Tribolium wurde in Schinko et al., 2005 beschrieben. Hier wird Gal4 über den Tc'hsp-68 Promoter getrieben und durch Hitzeschock aktiviert (Schinko et al., 2010). In Drosophila konnte gezeigt werden, dass die Fusion eines Teils des Herpes-simplex-VirusProteins VP16 an das Gal4 zu einer noch verbesserten Aktivierung der UAS-Konstrukte, auch in der Keimbahn, führen kann (Triezenberg et al., 1988; Sadowski et al., 1988; Rørth, 1998). Sollte die maternale Misexpression grundsätzlich funktionieren, könnte auch diese Möglichkeit in Betracht gezogen werden um die Expression der gewünschten Gene zu optimieren. Die Entwicklung eines funktionalen UAS/Gal4-Systems in Tribolium castaneum steht noch immer am Anfang. Zu diesem Zeitpunkt lässt sich sagen, dass noch einige Analysen nötig sind um ein maternales Misexpressionssystem zu etablieren. Die Grundlagen hierfür sind jedoch durch die Ergebnisse dieser Arbeit gelegt. Zum ersten Mal ist es gelungen einen maternalen Promoter zu charakterisieren und mit diesem die 102 Diskussion Expression eines Reportergens zu induzieren. Zudem konnte durch die Verwendung einer spezifischen 3'UTR die Lokalisation der Reportergen-mRNA erreicht werden. Aufgrund dieser Erfolge sollte es möglich sein in naher Zukunft ein zuverlässiges und funktionierendes maternales UAS/Gal4-System für Tribolium zu entwickeln. Für frühe Manipulationen der Genexpressionen muss bis dahin jedoch auf andere Methoden, wie beispielsweise den embryonalen Hitzeschock, zurückgegriffen werden (Schinko et al., 2012). 4.2 Analyse des "Tc'zen2/Tc'Mex3/Tc'cad-Systems" mittels embryonalem Hitzeschock Das "Tc'zen2/Tc'Mex3/Tc'cad - System" scheint in Tribolium von besonderer Bedeutung für die früh-embryonalen Musterbildungsprozesse zu sein. Bekannt ist bereits, dass die Tc'cad Translation durch Tc'ZEN2 und Tc'MEX3 reprimiert wird (Schoppmeier et al., 2009). Ein noch genaueres Verständnis dieses Systems ist jedoch von entscheidender Bedeutung. Auch im Hinblick auf die Evolution der caudal Regulation und Funktion innerhalb der Insekten. Mit Hilfe der gewonnenen Ergebnisse dieser Arbeit lassen sich nun tatsächlich Antworten bezüglich der Regulations-Mechanismen während der Tc'cad Inhibition finden. Außerdem liefern sie Einblicke in die Tc'CAUDAL Funktion während der früh-embryonalen Musterbildung. 4.2.1 Tc'ZEN2 - ein weiteres homeotisches Gen mit der Fähigkeit RNA zu binden Tc'ZEN2 wird im Tribolium Wildtyp für die Inhibition der Tc'cad Translation in der extraembryonalen Serosa benötigt (Schoppmeier et al., 2009). Wie genau die Interaktionen zwischen Tc'ZEN2 und Tc'cad während der Inhibition der Tc'cad Translation in Tribolium aussehen, ob direkt oder indirekt, ist bisher noch nicht geklärt. Durch den Einsatz des embryonalen Hitzeschocks und der dadurch induzierten frühen Misexpression von Tc'ZEN2, sollten deshalb in dieser Arbeit die Zusammenhänge und möglichen Interaktionsmodelle der blastodermalen Tc'cad Regulation genauer untersucht werden. Wie sich mit Hilfe fluoreszenter Doppelfärbungen zeigen lässt, ist es tatsächlich möglich durch die frühe Hitzeschock induzierte Misexpression von Tc'ZEN2 eine Reduktion der Tc'CAD Expression auch im posterioren Bereich der Blastoderme zu erreichen. Zwei Stunden nach dem Hitzeschock ist die Tc'CAD Proteinexpression in HSzen2 Blastodermen deutlich reduziert (vgl. Abbildung 26). Tc'ZEN2 hat also auch nach einer ektopischen 103 Diskussion Expression in sonst Tc'ZEN2-freien Geweben des Embryos eine inhibierende Wirkung auf die Translation von Tc'cad. Eine Aussage darüber wie genau die Interaktionen ablaufen kann allein durch diese Ergebnisse zwar nicht getroffen werden, jedoch liefern sie Hinweise auf verschiedene Szenarien. Zum einen wäre es möglich, dass Tc'ZEN2 die Tc'cad Translation indirekt beeinflusst. Als homeobox Gen könnte Tc'ZEN2 wildtypisch in der Serosa als Transkriptionsfaktor wirken und zunächst weitere Faktoren aktivieren, die dann als Translationsrepressor Tc'CAD inhibieren (Falciani et al., 1996; Schoppmeier et al., 2009). Wenn dies der Fall ist würde man erwarten, dass es nach der Hitzeschock induzierten Misexpression von Tc'ZEN2 im gesamten Embryo zu diesen Prozessen kommt. Eventuelle Translationsrepressoren würden somit durch Tc'ZEN2 nicht nur in der Serosa, sondern auch im embryonalen Gewebe aktiviert werden, was dann zur Inhibierung der Tc'CAD Expression auch in posterioren Blastoderm-Regionen führt wie es nach HSzen2 zu beobachten ist (Falciani et al., 1996; Schoppmeier et al., 2009). Andererseits wäre jedoch auch eine direkte Interaktion des Proteins, wie im Fall von Dm'BCD (Dubnau und Struhl, 1996), mit der Tc'cad mRNA denkbar. Dm'BCD bindet über seine Homeodomäne an Bicoid response elements in der 3'UTR der Dm'cad mRNA, wobei ein spezifisches Arginin an Position 54 der Homeodomäne essenziell für seine Funktion als Translationsinhibitor ist (Dubnau und Struhl, 1996; Niessing et al., 2000). Im Gegensatz zu Dm'BCD fehlt Tc'ZEN2 jedoch dieses Arginin (Schoppmeier et al., 2009). Somit ist es eher unwahrscheinlich, dass Tc'ZEN2 über den gleichen Mechanismus an die Tc'cad mRNA bindet wie Dm'BCD. Dass es offenbar trotzdem zu einer direkten Bindung zwischen Protein und mRNA kommt, belegen jedoch Ergebnisse aus in vitro RNA-Protein Interaktions-Assays nach Nabel-Rosen et al. 1999 aus unserem Labor welche zeigen, dass das Tc'ZEN2 Protein offenbar die Tc'cad mRNA binden kann (M. Teuscher, 2013). Da ein Bindungsmechanismus wie in Drosophila wohl ausgeschlossen werden kann, sollte in zukünftigen Arbeiten geklärt werden, wie genau die Protein/RNA-Interaktion im Fall von Tc'ZEN2 und Tc'cad funktioniert. Für Translationsrepressoren ist bekannt, dass sie zur Erfüllung ihrer Funktion oft CoFaktoren benötigen (Sonoda und Wharton, 1999; Macdonald, 2004; Lasko, 2011; SchmittEngel et al., 2012). Deshalb sollte ebenfalls geklärt werden, ob Tc'ZEN2 trotz direkter Interaktion mit der Tc'cad mRNA weitere Faktoren für die Translationsreprimierung benötigt. Dm'BCD bindet zusammen mit seinem Co-Faktor d4EHP an die Dm'cad mRNA und inhibiert so dessen Translation (Cho et al., 2005). Ein Knockdown des Tribolium Homologs 4EHP 104 Diskussion führt jedoch zu keiner Veränderung der Tc'CAD Expression (Schoppmeier et al., 2009). Es wäre also möglich, dass schon das Tc'ZEN2 Protein alleine ausreicht um die Translation von Tc'cad zu regulieren. Andererseits könnte es aber auch mit anderen, bisher noch unbekannten Co-Faktoren interagieren. Diese müssten dann jedoch wildtypisch nicht nur in der Serosa, in welcher Tc'ZEN2 exprimiert ist, sondern auch in den embryonalen Bereichen des Blastoderms exprimiert sein. Die Induktion des Hitzeschocks führt lediglich zur Misexpression von Tc'ZEN2, nicht aber seiner möglichen Co-Faktoren. Wären diese also nicht endogen im gesamten Blastoderm vorhanden, wäre die alleinige Anwesenheit des Tc'ZEN2 Proteins nach Hitzeschock nicht ausreichend um die Tc'cad Translation zu unterdrücken, wie es die Doppel-Färbungen zeigen (vgl. Ergebnisse 3.2.10). Auch der BICOID Co-Faktor d4EHP ist in frühen embryonalen Stadien ubiquitär exprimiert obwohl sein Partner Dm'BICOID hauptsächlich in anterioren Bereichen Funktionen übernimmt (Driever und Nüsslein-Volhard, 1988; Cho et al., 2005). Eine ähnliche Situation wäre also auch für Tribolium denkbar. Die genauen Abläufe der Interaktionen zwischen Tc'ZEN2 und der Tc'cad mRNA können hier nicht abschließend geklärt werden. Jedoch bleibt festzuhalten, dass die Ergebnisse gute Hinweise darauf liefern, dass Tc'ZEN2 neben Dm'BCD als ein weiteres homeotisches Gen identifiziert werden konnte, welches an mRNA binden und so dessen Translation inhibieren kann (Dubnau und Struhl, 1996). Sowohl Dm'bcd als auch Tc'zen2 gehen evolutionär auf ein Hox3 Gen zurück (Falciani et al., 1996; Stauber et al., 1999). Dieses Gen verlor bereits innerhalb der Crustaceen oder der basalen Insekten seine ursprüngliche Hox-Gen-Funktion (Hughes und Kaufmann, 2002) und ist nun in Insekten als zerknüllt-Gen hauptsächlich für die Spezifizierung von extraembryonalen Membranen verantwortlich (Panfilio et al., 2006; Panfilio et al. 2007). In Drosophila als auch Tribolium kam es dann unabhängig von einander zu einer weiteren Duplikation dieses Gens, wodurch Dm'bcd beziehungsweise Tc'zen2 entstanden sind (Stauber et al., 1999; Brown et al., 2001). Zukünftige Untersuchungen von weiteren ZENProteinen auch in anderen Spezies könnten Aufschluss darüber geben, ob die Bindung von RNA eventuell eine ursprüngliche Funktion von Hox3/zen Genen darstellt. Dies schließt auch eine eingehende Analyse des zweiten Tribolium zerknüllt Gens Tc'ZEN1 mit ein um zu klären, ob auch dieses Gen eventuell ähnliche Fähigkeiten besitzt und so einen zusätzlichen Einfluss auf die frühen Musterbilungsprozesse in Tribolium hat, welcher bis heute noch unbekannt ist. Andererseits wäre es jedoch auch möglich, dass die Fähigkeit RNA zu binden in Drosophila und Tribolium unabhängig voneinander während der erneuten Duplikation des zerknülltGens entstanden ist (Stauber et al., 1999; Brown et al., 2001). Das ursprüngliche zen-Gen 105 Diskussion hätte in beiden Spezies seine Funktion in den extraembryonalen Membranen behalten (Wakimoto et al., 1984; van der Zee et al., 2005), wohingegen Dm'bcd und Tc'zen2 mit Hilfe der Fähigkeit RNA zu binden neue Funktionen während der embryonalen Musterbildung erworben hätten (Driever und Nüsslein-Volhard, 1988; Dubnau und Struhl, 1996). Für eine unabhängige Entwicklung spricht auch, dass Tc'ZEN2 über einen anderen Mechanismus an die Tc'cad mRNA binden muss als Dm'BCD, da ihm das essentielle Arginin in der Homeodomäne fehlt (Niessing et al., 2000; Schoppmeier et al., 2009). 4.2.2 Translationsreprimierung durch Tc'MEX3 mit Hilfe von Co-Faktoren Neben Tc'ZEN2 wird in Tribolium auch Tc'MEX3 für die frühe Regulation der Tc'CAD Expression benötigt (Schoppmeier et al. 2009). Das KH-Domänen Protein übernimmt dabei die Aufgabe die Translation von Tc'cad in den blastodermalen Kopfbereichen zu inhibieren (Schoppmeier et al., 2009). Zuerst beschrieben wurde es im Fadenwurm Caenorhabditis elegans (Draper et al., 1996). Auch hier in der Nematoden-Entwicklung wird es für die korrekte Ausbildung der frühen anterior-posterioren Polarität benötigt, indem es die Translation des caudal-Homologs pal-1 in anterioren Blastomeren inhibiert (Draper et al., 1996; Hunter und Kenyon, 1996). Durch die Hitzeschock induzierte Misexpression von Tc'MEX3 sollte untersucht werden, ob sich ein vollständiger oder teilweiser Verlust von Tc'CAD in verschiedenen Stadien erreichen lässt (Draper et al., 1996; Hunter und Kenyon, 1996; Schoppmeier 2009). Dies würde einer Tc'cad RNAi ähnlichen Situation gleichen. Eine Induktion des Hitzeschocks in blastodermalen Stadien sollte somit zur Folge haben, dass Strukturen wie Gnathum, Thorax und die Wachstumszone nicht etabliert werden und diese dann in larvalen Phänotypen fehlen (Wolff et al., 1998; Copf et al., 2004; Schoppmeier et al., 2009). Die genaue Regulation der zygotische Tc'CAD Expression in der Wachstumszone älterer embryonaler Stadien ist noch unklar (Schoppmeier et al., 2009). Sollte Tc'MEX3 auch hier eine regulatorische Funktion besitzen, könnten sich nach seiner Misexpression in späteren Entwicklungsstadien Segmentierungsabbrüche oder fehlende Segmente in larvalen Stadien zeigen. Wie in Abschnitt 3.2.9 gezeigt, konnte jedoch zu keinem Hitzeschock-Zeitpunkt ein Phänotyp in HSMex3 Embryonen gefunden werden (vgl. Tabelle 15 und Tabelle 16). Auch eine Reduktion der Tc'CAD Expression konnte durch AK-Färbungen gegen Tc'CAD in HSMex3 Embryonen nicht nachgewiesen werden. 106 Diskussion Die Antikörperfärbungen gegen Tc'MEX3 1h nach Hitzeschock zeigen allerdings, dass die Misexpression prinzipiell funktioniert. Somit kann ausgeschlossen werden, dass das Ausbleiben von Kutikula-Phänotypen an der "Funktionalität" des Hitzeschocks liegt. Aufgrund veröffentlichter Daten zu MEX3 im Fadenwurm ist es sehr wahrscheinlich, dass Tc'Mex3 für die Inhibierung der Tc'cad Translation weitere Faktoren benötigen könnte. In C. elegans benötigt Mex3 die Faktoren Mex5 und Mex6 um eine effektive Inhibierung der pal-1 Translation zu erreichen (Huang et al., 2002). Die Funktion von MEX5 und MEX6 hierbei ist es, die aktive Form von MEX3 zu erhalten und vor Degradation zu schützen, welche dann die pal-1 Translation in anterioren Blastomeren reprimiert (Draper et al., 1996; Hunter und Kenyon, 1996; Huang et al., 2002). Nach Mex6 RNAi kommt es in C. elegans, trotz vorhandenem Mex3, zur Expansion von pal-1 in anteriore Blastoderme, was zeigt, dass Mex3 alleine nicht ausreicht seine Translation zu verhindern (Huang et al., 2002). Benötigt Tc'Mex3 im Käfer ebenso weitere Faktoren, zum Beispiel um seine aktive Form und Stabilität zu gewährleisten, könnte dies eine Erklärung für das Ausbleiben von Phänotypen nach HSMex3 sein. Da es nach dem Hitzeschock nur zur Misexpression von Tc'MEX3 kommt, müssten diese Faktoren wildtypisch im gesamten Blastoderm exprimiert und als limitierende Faktoren in ausreichender Menge vorhanden sein um das ektopische Tc'MEX3 im ganzen Embryo in seiner aktiven Form zu halten und somit eine Inhibierung der Tc'cad Translation zu gewährleisten. Es scheint also sehr wahrscheinlich, dass das Tribolium MEX3 Protein zur erfolgreichen Inhibierung der Tc'cad Translation Co-Faktoren benötigt. Welche dies sind und ob sie für den Erhalt der Tc'MEX3 Aktivität und Stabilität wie in C. elegans (Huang et al., 2002), oder für eine Komplexbildung wie in D. melanogaster (Niessing et al., 2002; Cho et al., 2005; Rödel et al., 2013) benötigt werden müssen zukünftige Arbeiten klären. 4.3 Tc'CAD Funktion während der früh-embryonalen Musterbildung in Tribolium castaneum Neben Interaktions- und Regulationsmechanismen innerhalb des "Tc'zen2/Tc'Mex3/Tc'cadSystems", liefern die Ergebnisse des embryonalen Hitzeschocks auch Einblicke in die genaue Funktion von Tc'CAD während der früh-embryonalen Musterbildung in Tribolium. Dies ist von entscheidender Bedeutung um die ursprüngliche Rolle von caudal während dieser Prozesse in der Insektenentwicklung genauer zu verstehen und einzuordnen. Mit Hilfe der HScad und HSzen2 Linien ist es zum einen möglich die Auswirkungen einer Überexpression bzw. eines Verlusts an Tc'CAD während der Tribolium 107 Diskussion Embryonalentwicklung zu untersuchen. Zum anderen bietet der embryonale Hitzeschock, durch die Wahl des Hitzeschock-Zeitpunktes, den Vorteil die Misexpression der Proteine auf spezifische Entwicklungsstadien zu begrenzen und so die einzelnen Tc'CAD Funktionen während der verschiedenen Entwicklungsstadien deutlich zu trennen und ihre Auswirkungen zu analysieren. 4.3.1 Die Misexpression von Tc'CAD zeigt Ähnlichkeiten zu Tc'Mex3 RNAi Die Misexpression des Tc'CAD Proteins mittels der HScad Linie schafft eine sogenannte "gain of function" Situation, in der das Protein anterior auch in sonst CAUDAL-freien Bereichen des Blastoderms exprimiert wird und zudem posterior ektopisch sehr viel stärker als im Wildtyp. Die dabei auftretenden larvalen Phänotypen zeigen Verluste von anterioren Strukturen und ähneln dabei larvalen Tc'Mex3 RNAi Phänotypen (Schoppmeier et al., 2009). Nach dem Knockdown von Tc'Mex3 kommt es zu einer Expansion des Tc'CAD Proteins in blastodermale Kopfbereiche, da seine Translation dort nicht mehr inhibiert werden kann (Schoppmeier et al., 2009). Das Vorhandensein des posterioren Faktors Tc'CAD in diesen Strukturen hat zur Folge, dass diese nicht mehr korrekt definiert und ausgebildet werden können, da die Musterbildungsprozesse zu stark gestört werden. Dies resultiert in Larven, welchen die anterioren prägnathalen Kopfanhänge Labrum und Antennen fehlen. In sehr stark betroffenen Fällen kann sogar die gesamte Kopfkapsel verloren gehen (Schoppmeier et al., 2009). Auch in den HScad Blastodermen breitet sich das Tc'CAD Protein nach einem frühen Hitzeschock in anteriore Bereiche aus. Es ist also durchaus nachvollziehbar, dass ähnliche larvale Defekte auch in HScad Embryonen entstehen. Da Tc'Mex3 in Blastodermen dieser Linie jedoch weiterhin endogen in den Kopfbereichen vorhanden ist, könnte dies erklären warum die Defekte nach HScad weniger stark ausgeprägt sind als in Tc'Mex3 RNAi Larven (Schoppmeier et al., 2009). So kommt es nach HScad nur zu Reduktionen der Kopfstrukturen, jedoch niemals zum kompletten Verlust des Kopfes (vgl. Abbildung 24). Die Translation der Tc'cad mRNA könnte also zum einen immer noch zu einem gewissen Teil reprimiert werden (Schoppmeier et al., 2009). Zum anderen wäre es auch denkbar, dass Tc'Mex3 die Entstehung von Kopfstrukturen nicht nur durch die Reprimierung von Tc'CAD gewährleitet, sondern vielleicht auch selbst, über weitere Faktoren, Signale für die Kopfentstehung liefert. Diese Funktion wäre in HScad Blastodermen durch das endogene Tc'MEX3 weiterhin vorhanden und könnte den larvalen Phänotyp auf diese Weise ebenfalls abschwächen. Ob das Vorhandensein von Tc'MEX3 in den HScad Blastodermen tatsächlich zu den schwächeren larvalen Phänotypen führt, könnte beispielsweise durch RNAi gegen 108 Diskussion Tc'Mex3 in HScad Embryonen überprüft werden. Der Knockdown des Tc'CAD TranslationsRepressors Tc'Mex3 und die gleichzeitige Misexpression von Tc'CAD durch embryonalen Hitzeschock sollte dann zu stärkeren anterioren Defekten führen. In der Wachstumszone ist zygotisches Tc'CAD wichtig, um diese aufrecht zu erhalten und somit die korrekte Segmentierung zu gewährleisten (Schulz et al. 1998; Copf et al., 2004). Auch in diversen anderen Spezies ist eine posteriore caudal Expression für das Auswachsen und die Segmentierung der Embryonen von Nöten (Copf et al., 2004; Shinmyo et al., 2005; Olesnicky et al., 2006). Wie genau diese Expressionsdomäne in Tribolium reguliert wird, ist bis heute nicht vollständig verstanden, an seiner Aktivierung scheinen jedoch Wnt-Signale beteiligt zu sein (Fu et al., 2012; Oberhofer et al., 2014). Dies konnte auch in anderen Spezies gezeigt werden. Für Gryllus bimaculatus wurde beschrieben, dass die posteriore caudal Expression über Gb'wingless und Gb'armadillo reguliert wird und auch in der Maus scheint die Cdx1 Expression von Wnt abhängig zu sein (Lohnes, 2003; Shinmyo et al., 2005). Die örtliche Begrenzung der Tc'CAD Expressionsdomäne scheint sich in späten Stadien jedoch deutlich von der Situation in Blastodermen zu unterscheiden, da ein Knockdown von Tc'Mex3 zum Beispiel kaum einen Einfluss auf die Tc'CAD Domäne zeigt (Schoppmeier et al., 2009). Zudem kommt es nach Tc'Mex3 RNAi nicht zu Veränderungen von larvalen posterioren Segmenten und Strukturen (Schoppmeier et al., 2009). Dies deckt sich mit den Ergebnissen des HScad. Auch hier finden sich nach der Überexpression von Tc'CAD in späteren Stadien (bis 16h nach Eiablage) keine posterioren Defekte in Larven (vgl. Abbildung 24). Eventuell spielt die Konzentration des Tc'CAD Proteins hier keine Rolle und die bloße Anwesenheit von Tc'CAD in der Wachstumszone von Tribolium ist ausreichend um die Segmentierung zu gewährleisten, wodurch die Überexpression und die Expansion des Proteins in sonst Tc'CAD-freie Gewebe, ausgelöst durch den Hitzeschock, nicht zu posterioren Defekten führt. 4.3.2 Der HSzen2 offenbart mögliche Tc'CAD-Funktionsmodelle Einen sehr viel genaueren Einblick in die Funktionen von Tc'CAD während der Embryonalentwicklung liefert die Auswertung der HSzen2 Phänotypen. Aufgrund der, in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse, kann die Tc'ZEN2 Überexpression dazu genutzt werden eine kurzzeitige lokal begrenzte Situation zu schaffen, welche einer Tc'cad RNAi entspricht. Dies ist von entscheidender Bedeutung für eine genauere Klärung der einzelnen Tc'CAD Funktionen. Bisher war es aufgrund der starken Defekte nach Tc'cad RNAi kaum möglich die einzelnen Funktionen voneinander zu trennen und die Interaktionen bzw. Auswirkungen eines Knockdowns zu untersuchen (Copf et al., 2004; Schoppmeier et al., 2009; Benton et al., 109 Diskussion 2013). So kommt es nach Tc'cad RNAi in injizierten Weibchen oftmals zu Ovar-Defekten und somit zu einer stark verringerten Eiablage. Außerdem ist es durch den frühen Segmentierungsabbruch kaum möglich, Expressionsveränderungen von möglichen Tc'CAD Zielgenen auf embryonaler Ebene zu analysieren (Copf et al., 2004; Schoppmeier et al., 2009). Durch den HSzen2 und die dadurch ausgelöste zeitlich begrenzte Reduktion von Tc'CAD ist dies nun möglich. Aufgrund der Wahl des Hitzeschock-Fensters von 10-12 Stunden nach Eiablage können sich die Analysen in dieser Arbeit hauptsächlich auf die frühe blastodermale Funktion von Tc'CAD konzentrieren. Hierbei werden die Auswirkungen einer Veränderung im Tc'CAD Gradienten auf die früh-embryonalen Musterbildungsprozesse untersucht. Die bisher erzielten Ergebnisse liefern die Grundlage für zwei denkbare Modelle, wie Tc'CAD diese Prozesse regulieren könnte. a) Der Tc'CAD Gradient beeinflusst direkt die Paarregel-Gen-Expression Erst kürzlich wurde beschrieben, dass Veränderungen des Tc'CAD Gradient im Blastoderm zu einer gestörten Expression des Paarregel-Gens Tc'eve führen (El-Sherif et al., 2014). Die Ausbreitung des Tc'CAD Proteins innerhalb des Blastoderms scheint die Position des ersten Tc'eve Streifens zu definieren (El-Sherif et al., 2014). Wird die Tc'CAD Expression z.B. durch eine schwache Tc'cad RNAi reprimiert, verschiebt sich die anteriore Tc'CAD Grenze nach posterior, wodurch auch die frühe Tc'eve Expression nach posterior verschoben wird (ElSherif et al., 2014). Dies ist durchaus mit der Situation nach HSzen2 vergleichbar. Durch die Repression der Tc'CAD Expression ist seine Ausbreitung nach anterior deutlich reduziert. Und in undifferenzierten Blastodermen zeigt sich, dass die anteriore Grenze der frühen Tc'eve Domäne im Vergleich mit der vw- Kontrolle ebenfalls leicht nach posterior verschoben ist (vgl. Abbildung 27). Der frühe Einfluss von Tc'CAD auf Tc'eve kann inzwischen zudem, durch weitere in unserem Labor durchgeführte Analysen von HScad Embryonen gestützt werden. Nach der frühen Überexpression von Tc'CAD und der damit ausgelösten Expansion seiner Domäne nach anterior, zeigt sich auch hier eine Verschiebung der frühen Tc'eve Domäne diesmal nach anterior (A. Sulzmaier, 2015). Die Ausbreitung des Tc'CAD Gradienten innerhalb des Tribolium Blastoderms könnte also tatsächlich Störungen der frühen Tc'eve Expression hervorrufen. Allerdings bleibt zu klären, warum es in HSzen2 Blastodermen nicht zu einer sehr viel stärkeren posterioren Verschiebung der frühen Tc'eve Domäne kommt, da die Tc'CAD Expression in einigen Blastodermen doch extrem stark reduziert und manchmal fast vollständig verschwunden ist (vgl. 3.2.10). 110 Diskussion Neben der Expansion des Tc'CAD Gradienten soll auch seine Steilheit für die korrekte Ausbildung der Tc'eve Streifen von Bedeutung sein (El-Sherif et al., 2014). Die Menge an Tc'CAD scheint laut El-Sherif et al., 2014, die Oszillationsgeschwindigkeit der Tc'eve exprimierenden Zellen zu beeinflussen und so die Breite der einzelnen Tc'eve Streifen zu regulieren. Ist die Menge an Tc'CAD geringer und der Gradient somit flacher verringert sich die Oszillationsgeschwindigkeit, wodurch letztendlich breitere Tc'eve Streifen entstehen (ElSherif et al., 2014). Nach diesem Modell sollten auch in HSzen2 Embryonen breitere Tc'eve Streifen zu finden sein, da die Tc'CAD Expression deutlich reduziert ist. Die Analyse von differenzierten HSzen2 Blastodermen zeigt jedoch keine Veränderung der Tc'eve Streifenbreite (vgl. Abbildung 28). Zudem kann in diesen Stadien auch keine Verschiebung der Streifen nach posterior beobachtet werden, was laut El-Sherif et al., 2014 zu erwarten wäre. Somit sprechen die Ergebnisse aus differenzierten HSzen2 Blastodermen eher gegen die These einer Gradienten-Funktion von Tc'CAD (El-Sherif et al., 2014). Die Reduktion der Tc'eve Expressionsstärke, die nach HSzen2 in differenzierten Blastodermen beobachtet werden kann (vgl. Abbildung 34 B) spricht vielmehr für eine streifenspezifische Aktivierung der Tc'eve Expression durch Tc'CAD, wie sie in Schoppmeier et al., 2009 erwähnt wird. Dies würde der Situation in Drosophila ähneln. In der Fliege besitzt CAUDAL wahrscheinlich keine Morphogen-Funktion, sondern muss ein grundsätzliches Level an Protein bereit stellen um dann zusammen mit weiteren Faktoren wie beispielsweise Dm'BCD oder Dm'knirps die Aktivierung von Segmentierungs-Genen zu gewährleisten (Mlodzik et al., 1990; Häder et al., 1998). Hierbei scheint Dm'CAD weniger die Gap-Gene als vielmehr Paarregel-Gene wie Dm'eve, Dm'ftz oder auch Dm'hairy zu beeinflussen und sein Einfluss beschränkt sich meist auf spezifische Streifen, welche jeweils durch eine Kombination aus Dm'CAD mit unterschiedlichen Partnern aktiviert werden (MacDonald und Struhl, 1986; Schulz und Tautz, 1995; Häder et al., 1998; Olesnicky et al., 2006). Beispielsweise beinhalten die regulatorischen Sequenzen der Dm'eve Streifen 3+7 und 4+6 CAUDAL-Bindestellen und der Verlust von maternalem und zygotischem Dm'CAD führt zu starken Veränderungen des Dm'eve Musters, welche sich als Reduktionen, Verbreiterungen oder auch dem vollständigen Verlust dieser Dm'eve Streifen zeigen (Häder et al., 1998; Schroeder et al., 2004; Olesnicky et al., 2006). Und auch Dm'hairy Streifen 6 wird durch Dm'CAD in Kombination mit Dm'kni reguliert, wobei außerdem eine Mindestanzahl an Dm'CAD Bindestellen in den regulatorischen Bereichen des Dm'hairy Gens vorhanden sein muss, da sonst seine Expression nur sehr viel schwächer aktiviert wird (Häder et al., 1998). 111 Diskussion Eventuell wird auch in Tribolium ein solch grundsätzliches Level an Tc'CAD Protein benötigt, um eine Mindestanzahl an CAD-Bindestellen in den regulatorischen Elementen der einzelnen Tc'eve Streifen zu binden und diese dadurch zu aktivieren. Eine Reduktion der CAD-Expressionsstärke hätte dann auf Grund des Gradienten die Folge, dass dieses Grundlevel zuerst an der anterioren CAD-Expressionsgrenze nicht mehr erreicht wird. Somit wäre zunächst der Verlust des ersten Tc'eve Streifens zu erwarten. Genau dies ist in HSzen2 Blastodermen der Fall. Auch hier ist meist der erste Streifen am stärksten reduziert. Auch in Tc'cad RNAi Versuchen kommt es zum Verlust von anterioren Tc'eve Streifen im differenzierten Blastoderm (Schoppmeier et al., 2009). In El-Sherif et al., 2014 wird beschrieben, dass sich in milden Tc'cad RNAi Embryonen nicht alle drei primären Tc'eve Streifen im Blastoderm ausbilden, sondern aufgrund des veränderten Tc'CAD Gradienten zeitlich verzögert auftreten. Eventuell handelt es sich beim "verzögerten ersten Tc'eve Streifen" jedoch nicht wirklich um den ersten Streifen, sondern bereits um Tc'eve Streifen 2, da Streifen 1 aufgrund des benötigten Tc'CAD Levels erst gar nicht aktiviert wird. Nach der grundsätzlichen Aktivierung könnte dann auch die Konzentration des CAD-Proteins die Expressionsstärke der Tc'eve Streifen beeinflussen. Wenn Tc'CAD mehrere Bindestellen in den regulatorischen Elementen der einzelnen Streifen binden muss, wie dies bei Dm'hairy Streifen 6 der Fall ist, wäre es möglich, dass eine Reduktion der Tc'CAD Expressionsstärke zu einer abgeschwächten Aktivierung und/oder Aufrechterhaltung der Tc'eve Streifen 2 und 3 führt, wie es in differenzierten Blastodermen der HSzen2 Linie zu beobachten ist (vgl. Abbildung 27), da nicht genug Bindestellen besetzt werden können. Somit würde Tc'CAD als Transkriptionsfaktor, Tc'eve nicht nur streifenspezifisch aktivieren sondern die Tc'eve Expressionsstärke auch durch seine Konzentration beeinflussen. Bisher konnte in Tribolium jedoch lediglich für Tc'hairy eine streifenspezifische Regulation postuliert werden (Eckert et al., 2004) und auch in Gryllus führt die Gb'cad RNAi nicht zum Verlust von spezifischen Gb'eve Streifen sondern zum kompletten Ausbleiben der Gb'eve Expression (Shinmyo et al., 2005). Zudem müssen sich die Mechanismen, aufgrund der zellulären Umgebung während der späteren Entwicklung von Tribolium, von denen in Drosophila grundsätzlich Konzentrationsgradienten unterscheiden. der Gap-Gene In eine Drosophila spielen entscheidende Rolle auch die bei der streifenspezifischen Aktivierung der Paarregel-Gene (Pankratz und Jäckle, 1990). Diese Diffusions-Gradienten können jedoch nur aufgrund des synzytialen Blastoderms entstehen (Pankratz und Jäckle, 1990), welches in Tribolium während des Auswachsens des Keimstreifs nicht gegeben ist (Davis und Patel, 2002; Eckert et al., 2004). Somit ist es eher unwahrscheinlich, dass in Tribolium die gleiche streifenspezifische Aktivierung wie in Drosophila existiert. 112 Diskussion Denkbar wäre eine Kombination aus beiden Theorien, einem Einfluss des Tc'CAD Gradienten (El-Sherif et al., 2014) im undifferenzierten Blastoderm und einer Art streifenspezifischer Regulation in späteren Stadien (Schoppmeier et al. 2009). Im undifferenzierten Blastoderm würde die anteriore Grenze des Tc'CAD Gradienten die anteriore Grenze der Tc'eve Expression festlegen, wie es in El-Sherif et al., 2014 beschrieben ist. Durch die Hitzeschock induzierte Expression von Tc'ZEN2 in posterioren Bereichen der Blastoderme verringert sich der Tc'CAD Proteingradient, wodurch auch die anteriore Grenze der Tc'eve Expression nach posterior verschoben wird (Abbildung 34 A). Dieser Aspekt deckt sich zudem mit den Ergebnissen des HScad. Hier verschiebt sich die anteriore Tc'eve Grenze nach einer Überexpression von Tc'CAD nach anterior (A. Sulzmaier, 2015). Eine Art streifenspezifische Regulation könnte dann im differenzierten Blastoderm eine Rolle spielen, indem zunächst ein Grundlevel an Tc'CAD Protein benötigt wird um die einzelnen Tc'eve Streifen zu aktivieren und aufrecht zu erhalten. Wird dieses nicht erreicht wäre der erste Tc'eve Streifen zuerst betroffen und würde durch den Verlust von CAUDAL an dieser Stelle nicht oder nur schwach aktiviert werden. Ein solcher Effekt auf den ersten Tc'eve Streifen konnte auch für Tc'cad RNAi gezeigt werden (Schoppmeier et al., 2009). Hat die Konzentration des Tc'CAD Proteins dann noch Einfluss auf die Expressionsstärke der einzelnen Tc'eve Streifen, würde weniger Tc'CAD zusätzlich zu schwächer ausgebildeten Tc'eve Streifen 2 und 3 führen (Abbildung 34 B). 113 Diskussion Abbildung 34: Einfluss des Tc'CAD Proteingradienten auf die Tc'even-skipped Expression (modifiziert nach Schoppmeier et al., 2009 und El-Sherif et al., 2014). links jeweils die Wildtyp-, rechts die HitzeschockTc'zen2-Situation. A) Im undifferenzierten Blastoderm wird die anteriore Tc'eve Grenze durch die anteriore Tc'CAD Grenze festgelegt. Nach der Misexpression von Tc'ZEN2 nimmt der Tc'CAD Gradient ab und die Tc'eve Grenze verschiebt sich nach posterior. B) Durch den verringerten Tc'CAD Gradient in HSzen2 Embryonen könnte eine korrekte Ausbildung und Aufrechterhaltung der ersten drei Tc'eve Streifen im differenzierten Blastoderm gestört sein. gelb: Repression von Tc'CAD durch Tc'ZEN2; grün: Repression von Tc'CAD durch Tc'MEX3; rot: Tc'CAD Gradient; grau: Tc'eve Expression. Abschließend kann nicht im Detail geklärt werden, wie Tc'CAD die Expression von Paarregel-Genen im Tribolium Blastoderm reguliert. Allerdings lassen die Ergebnisse die These zu, dass Tc'CAD im Mehlkäfer generell für die Regulation des Paarregel-Gens Tc'eve benötigt wird und eine durch den Hitzeschock ausgelöste Misregulation zu den larvalen Phänotypen nach HSzen2 führt. Ein zweites mögliches Regulationsmodell ergibt sich aus den Analysen der Hox- und GapGene nach HSzen2. Eventuell wirkt Tc'CAD bereits auf die Klasse der Gap-Gene und die 114 Diskussion Störung der Paarregel-Gene wird erst indirekt durch diese vorangegangenen ExpressionsÄnderungen verursacht. Diese Hypothese soll im Folgenden Abschnitt diskutiert werden. b) Tc'CAD aktiviert Tc'hb und somit die Gap-Gen-Kaskade Die Reduktion der Tc'hb Expression ist, neben der Inhibition der Tc'CAD Translation, einer der frühesten nachweisbaren Defekte nach HSzen2. Hunchback steht in Tribolium an der Spitze einer Kaskade, in welcher sich die Gap-Gene untereinander regulieren und im weiteren Verlauf wohl auch für die korrekte Expression der Paarregel-Gene sorgen (Sommer und Tautz, 1993; A. Cerny, 2005; Marques-Souza et al., 2008). Im differenzierten Blastoderm ist Tc'hb in zwei Domänen exprimiert (Wolff et al., 1995). Anterior in einer Kappe in der extraembryonalen Serosa und in einer zentral gelegenen Domäne im embryonalen Gewebe (Wolff et al., 1995). Im Jahr 1998 konnten Wolff et al. zeigen, dass die posteriore blastodermale Tc'hb Domäne scheinbar durch CAUDAL aktiviert wird. Hierfür wurden Tc'hb-lacZ Reportergen-Konstrukte in den Wildtyp und verschiedenste Mutanten von Drosophila eingebracht und ihre Expression analysiert (Wolff et al., 1998). Es zeigte sich, dass die posteriore Tc'hb-lacZ Domäne in Dm'cad Mutanten nicht aktiviert wird und somit CAUDAL abhängig zu sein scheint (Wolff et al., 1998). Eine Analyse der Tc'hb P2 Promoter Region, welche diese Tc'hb Domäne reguliert, ergab, dass sie mehrere Dm'CAD Bindedomänen besitzt, was darauf hin deutet, dass CAUDAL die embryonale Tc'hb Domäne durch direkte Bindung aktivieren könnte (Wolff et al., 1995; Wolff et al., 1998). Auch die überlappenden Expressionsdomänen von Tc'cad und Tc'hb im Blastoderm sprechen für ein solches Modell (Wolff et al., 1998). Der HSzen2 kann nun ebenfalls bestätigen, dass Tc'CAD Tc'hb aktiviert, da eine Reduktion der blastodermalen Tc'CAD Expression den Verlust von Tc'hb zur Folge hat (vgl. Abbildung 33). Der Einfluss von Tc'hb auf die Expression von Segmentierungs-Genen konnte bereits durch Tc'hb RNAi und mit Hilfe von Misexpressions-Experimenten nachgewiesen werden, in welchen Tc'hb ektopisch durch Hitzeschock im gesamten Embryo aktiviert wurde (A. Cerny, 2007; Marques-Souza et al., 2008; J. Distler, 2012). Vergleicht man die HSzen2 Ergebnisse mit diesen Daten offenbart dies viele Übereinstimmungen. In Tc'hb RNAi Embryonen ist die zentralen Tc'Kr Domäne in kurzen Keimstreifen deutlich reduziert, wie es auch für HSzen2 Embryonen beobachtet werden konnte (A. Cerny, 2007; Marques-Souza et al., 2008; vgl. Abbildung 31). Wird Tc'hb misexprimiert kommt es zu einer erneuten Aktivierung von Tc'Kr und so zu einer ektopischen Expressions-Domäne in der 115 Diskussion posterioren Wachstumszone von gestreckten Keimstreifen (J. Distler, 2012). Dies zeigt, dass Tc'hb einen deutlichen Einfluss auf zumindest ein Gap-Gen besitzt. Die blastodermale Expression des Paarregel-Gens Tc'eve ist nach Tc'hb RNAi, wie auch in HSzen2 Blastodermen, zeitlich verzögert, sodass zunächst nur ein Tc'eve Streifen später dann zwei zu erkennen sind (A. Cerny, 2007). Ob es sich hierbei um Streifen eins und zwei oder zwei und drei handelt konnte noch nicht abschließend geklärt werden (A. Cerny, 2007). Die Misexpression von Tc'hunchback führt ebenfalls zu Veränderungen im Paarregel-GenMuster (J. Distler 2012). Die Tc'eve Domänen scheinen nach HShb verstärkt bzw. verbreitert zu sein, wobei jedoch keine Aussage darüber getroffen werden kann ob es sich um Verbreiterungen bzw. Fusionen von wildtypischen Streifen oder um zusätzliche Tc'eve Streifen handelt (J. Distler, 2012). Nach HSzen2 zeigt sich ein kompletter Verlust von anterioren Tc'wg Streifen. Dieses Segmentpolaritäts-Gen scheint hauptsächlich über die sekundären Paarregel-Gene Tc'prd und Tc'slp aktiviert zu werden (Choe et al., 2009). Nach der Misexpression von Tc'hb durch Hitzeschock konnte ein stark gestörtes Tc'slp Muster beobachtet werden, in dem einzelne Streifen kaum klar zu trennen waren, außerdem wurde ein Einfluss dieser Störungen auf die späteren Veränderungen im Tc'wg Muster postuliert (J. Distler, 20012). Für weitere Untersuchungen an HSzen2 Embryonen wäre es somit eventuell sinnvoll die Expression von Tc'slp zu analysieren. Noch ist die genaue Aktivierung der sekundären Paarregel-Gene in Tribolium nicht vollständig geklärt. Deshalb wäre es durchaus denkbar, dass Tc'hb oder auch weitere GapGene an der Regulation dieser Gen-Klasse beteiligt sind. Ein Verlust von Tc'hb, wie nach HSzen2, würde dann zum Verlust von sekundären Paarregel-Genen und dadurch zum Verlust der Tc'wg Expression führen. Das Modell einer solchen Kaskade wird durch die Tatsache gestützt, dass es erst zeitlich verzögert zum Verlust von Tc'wg Domänen kommt. Zwischen der initialen Reprimierung von Tc'hb und dem Verlust von Tc'wg Streifen scheinen also mehrere Gen-Interaktionen zwischengeschaltet zu sein. Auch auf Ebene der Hox-Gene zeigen sich Übereinstimmungen. Sowohl nach HSzen2, als auch in Tc'hb RNAi Embryonen zeigt sich eine Reduktion bzw. der Verlust der anterioren Hox-Gene Tc'Scr und Tc'Dfd (A. Cerny, 2007; Marques-Souza et al., 2008). Neben der Aktivierung von Gap-Genen wie Tc'Kr scheint Tc'hb im Wildtyp also zudem auch an der Regulation verschiedenster Hox-Gene beteiligt zu sein (A. Cerny, 2007; MarquesSouza et al., 2008). Die genaue Aktivierung der Hox-Gene in Tribolium ist jedoch noch nicht vollständig verstanden. Es ist also möglich, dass die Reduktion von Tc'hb entweder direkt oder indirekt 116 Diskussion über weitere Gap-Gene die korrekte Aktivierung der anterioren Hox-Gene Tc'Scr und Tc'Dfd verhindert. Dies würde auch erklären, warum es nach der Reduktion von Tc'Kr in HSzen2 Embryonen nicht zu einer Expansion dieser beiden Hox-Gen-Domänen nach posterior kommt, obwohl Tc'Kr im WT ihre posterioren Grenzen reprimiert (Cerny et al., 2005). Werden die homeotischen Gene durch Tc'hb erst gar nicht richtig aktiviert, würde auch eine Expansion ihrer Domänen ausbleiben. Um den Einfluss von Tc'hb auf den embryonalen HSzen2 Phänotyp nochmals zu überprüfen, wäre auch die Analyse eines weiteren Hox-Gens, nämlich Tc'Abdominal-A (Tc'Abd-A), sinnvoll. Nach Tc'hb RNAi wird Tc'Abd-A deutlich früher aktiviert und seine Expressionsdomäne in Keimstreifen ist nach anterior verschoben (A. Cerny, 2007). Findet sich auch in HSzen2 Embryonen eine verfrühte Tc'Abd-A Expression, könnte dies nochmals die Rolle von Tc'hb bei der Entstehung des embryonalen HSzen2 Phänotyps unterstreichen. Aus diesen Daten ergibt sich neben dem direkten Einfluss von Tc'CAD auf die PaarregelGene (4.3.2 a)) ein weiteres denkbares Regulationsmodell, in dem Tc'CAD einen direkten Einfluss auf die Gap-Gen-Kaskade besitzt, indem es regulierend auf die Tc'hb Expression wirkt. Eine schematische Darstellung dieses Modells ist in Abbildung 35 gezeigt (modifiziert nach Cerny et al., 2005; Marques-Souza et al., 2008; J. Distler, 2012). Abbildung 35: Regulation der Gen-Kaskaden durch Tc'CAD (modifiziert nach Cerny et al., 2005; MarquesSouza et al., 2008; J. Distler, 2012). Tc'CAD könnte die Gap-Gen-Kaskade über Tc'hb aktivieren und so die korrekte Segmentierung initiieren. 117 Diskussion Die Aktivierung von Tc'hb durch Tc'CAD im posterioren Bereich des Blastoderms führt zur Aktivierung der Gap-Gen-Interaktionen, welche ihrerseits regulatorisch auf die Hox- und Paarregel-Gene wirken und somit letztendlich die korrekte Segmentierung der Embryonen gewährleisten (Cerny et al., 2005; Marques-Souza et al., 2008; J. Distler, 2012). Dass die Musterbildungs-Defekte nach HSzen2 auf Störungen der Gap- und Paarregel-Gene zurückzuführen sind, scheint also offensichtlich. Zudem ist es sehr wahrscheinlich, dass all diese Veränderungen letztendlich durch die Reduktion von Tc'CAD nach HSzen2 ausgelöst werden. Um die Funktionen und regulatorischen Eigenschaften von Tc'CAD während der früh embryonalen Musterbildung noch genauer zu verstehen, wäre es sicher aufschlussreich die Expression von Gap-Genen, wie Tc'hb oder Paarregel-Genen, wie Tc'eve auch in HScad Embryonen zu untersuchen. Dieser genetische Hintergrund sollte dem von HSzen2 genau entgegengesetzt sein, da es hier zur ektopischen Expression von Tc'CAD kommt. 4.4 CAUDAL steht in basalen Insekten an der Spitze der frühen Musterbildungsprozesse Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse geben nun Hinweise darauf, wie Tc'CAD als ein Schlüsselfaktor und Hauptinitiator der Segmentierung agieren und schon sehr früh die embryonale Musterbildung in Tribolium regulieren könnte. Grundsätzlich scheinen zu diesem Zeitpunkt zwei Modelle denkbar, welche in Abbildung 36 zusammengefasst sind. Die frühe Musterbildung durch Tc'CAD könnte zum einen über seinen direkten Einfluss auf die Paarregel-Gene (Tc'eve) beeinflusst werden (Abbildung 36, grün; El-Sherif et al., 2014). Zum anderen ist jedoch auch die Aktivierung von Tc'hb und damit aller weiteren Segmentierungs-Gene über Tc'CAD möglich (Abbildung 36, blau). Auch eine Kombination beider Modelle wäre durchaus denkbar, da es für Tribolium castaneum bisher nur in wenigen Fällen Hinweise darauf gibt, dass Gap-Gene spezifische Paarregel-Gen-Streifen aktivieren (Lynch et al., 2012). Somit würde Tc'CAD indirekt über Tc'hb vor allem Gap- und Hox-Gene beeinflussen, jedoch die Expression von Paarregel-Genen, wie Tc'eve direkt regulieren. Ob eine solche Kombination tatsächlich existiert oder welches Modell am wahrscheinlichsten ist müssen weitere Untersuchungen zeigen. Jedoch lassen sich auf Grund dieser Ergebnisse, kombiniert mit bereits veröffentlichten Daten zu caudal in anderen Spezies, weitere Rückschlüsse auf die ursprüngliche Funktion von CAUDAL in der Insektenentwicklung ziehen. 118 Diskussion Abbildung 36: Regulations-Modelle ausgelöst durch Tc'CAD. Tc'CAD steht am Anfang der embryonalen Segmentierung indem es zum einen zur Aktivierung der Gap-Gen-Kaskade benötigt wird (blau), oder aber auch direkt auf die Regulation der Paarregel-Gene wirkt (grün). Dass caudal prinzipiell in Insekten ein wichtiger Faktor für die embryonale Musterbildung ist, wurde bereits mehrfach gezeigt (Schulz et al., 1998; Copf et al., 2004; Shinmyo et al., 2005; Olesnicky et al., 2006; Stauber et al., 2008). Vergleicht man seine Rolle in höheren Dipteren und basaleren Insekten, wie Tribolium, zeigen sich einerseits ähnliche Aspekte, andererseits scheint es jedoch auch grundlegende Unterschiede zu geben. Für die korrekte Musterbildung scheint es allgemein von entscheidender Bedeutung zu sein, dass die CAUDAL Expression in anterioren Bereichen des Embryos inhibiert wird (Mlodzik et al.,1990; Schoppmeier et al., 2009). Dies geschieht in unterschiedlichen Spezies auf verschiedene Weise. In Drosophila hemmt Dm'BICOID die Dm'cad Translation, in der Wespe Nasonia baut sich der CAUDAL Gradient durch die Lokalisation der Nv'cad mRNA am posterioren Pol auf und in Tribolium sind es Tc'ZEN2 und Tc'MEX3, die die Translation des CAUDAL Proteins hemmen (Rivera-Pomar et al., 1996; Olesnicky et al., 2006; Schoppmeier et al., 2009). Wird CAUDAL in anterioren Bereichen von Drosophila Blastodermen misexprimiert, kommt es zu schwerwiegenden Defekten in der Kopf-Segmentierung und der Kopf-Involution (Mlodzik et al., 1990). Dies deckt sich mit den hier gezeigten Ergebnissen des HScad (vgl. 3.2.8) und auch mit den larvalen Defekten nach Tc'Mex3 RNAi (Schoppmeier et al., 2009). In beiden Fällen kommt es nach der ektopischen Tc'CAD Expression in anterioren embryonalen Geweben zu starken Kopf-Defekten. Im Wildtyp ist Tc'CAD nicht im anterioren Kopf vorhanden, Gnathum und Thorax scheinen jedoch über gewisse Einflüsse des Tc'CAD Protein-Gradienten definiert zu werden (Schulz et al., 1998; El-Sherif et al., 2014). Dies könnte eine Erklärung dafür sein, dass der anteriore Kopf nach einer Misexpression von Tc'CAD meist am stärksten betroffen ist, da er hoch sensitiv auf das plötzliche Vorhandensein von Tc'CAD reagiert. Im Gegensatz dazu, führt die 119 Diskussion Veränderung des Proteingradienten in mehr posterioren Bereichen zwar zu Defekten, jedoch sind diese nicht so stark wie im anterioren Kopf, da hier bereits im Wildtyp ein Einfluss von Tc'CAD vorhanden ist (vgl. Abbildung 24; Wolff et al., 1998; El-Sherif et al., 2014). Die Notwendigkeit von CAUDAL-freien Geweben für die korrekte Segmentierung anteriorer Strukturen scheint also in Drosophila als auch in basaleren Insekten, wie Tribolium, gegeben zu sein. Für die posterioren Musterbildungs-Prozesse wurde hingegen jedoch bereits postuliert, dass caudal während der früh-embryonalen Entwicklung eine sehr viel wichtiger Bedeutung in anzestralen Insekten hat, als dies in Drosophila der Fall ist (Wolff et al., 1998; Shinmyo et al., 2005; Olesnicky et al., 2006). Aufgrund der in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse kann nun auch für die Tribolium-Entwicklung eine solch entscheidende Rolle von CAUDAL nachgewiesen werden. In der Fliege ist Dm'CAD lediglich im Abdomen exprimiert und in Dm'caudal Mutanten kommt es vor allem zu Defekten in posterioren Bereichen, ohne dass Kopf oder Thorax betroffen sind (MacDonald und Struhl, 1986). Im Gegensatz dazu ist caudal sowohl in Tribolium als auch in der Grille Gryllus bimaculatus bis in Bereiche des Thorax und Gnathums exprimiert und auch in Nasonia reicht seine Expression weiter nach anterior und ein Knockdown verursacht sehr viel stärkere larvale Phänotypen als in der Fliege (Schulz et al., 1998; Shinmyo et al., 2005; Olesnicky et al., 2006). Nach Gb'cad RNAi kommt es, wie auch in Tribolium, zum Verlust von fast allen Segmenten posterior des anterioren Kopfes, somit scheint cad nicht nur für die Bildung des Abdomen sondern auch für die Spezifizierung von thorakalen und gnathalen Segmenten verantwortlich zu sein (Copf et al., 2004; Shinmyo et al., 2005; Schoppmeier et al., 2009). Dies deckt sich mit den larvalen Phänotypen nach einem frühen HSzen2. Auch hier kommt es nach der Reduktion von Tc'CAD zum Verlust von gnathalen und thorakalen Strukturen (vgl. Abbildung 17 und Abbildung 18). Diese starken Segmentierungsdefekte könnten durch den direkten Einfluss von CAUDAL auf die Expression der Paarregel-Gene ausgelöst werden, wie er hier unter 4.3.2 a) für Tribolium gezeigt ist. Nach dem Verlust von CAD kommt es zur Reduktion von eve und so zu Segmentverlusten, wie es auch für Tc'eve RNAi beschrieben wurde (Choe et al., 2006). Auch in Gryllus verschwindet die Gb'eve Expression nach Gb'cad RNAi vollständig (Shinmyo et al., 2005) und in Nasonia sind oft ebenfalls beinahe alle eve-Streifen nach einem caudal Knockdown verschwunden (Olesnicky et al., 2006). Im Gegensatz dazu finden sich in Drosophila cad-Mutanten nur Reduktionen und Verluste von einigen eve-Streifen (Olesnicky et al., 2006), was die wichtigere Funktion von CAUDAL in basalen Insekten unterstreicht. 120 Diskussion Das in dieser Arbeit aufgezeigte Modell in dem CAUDAL über die Aktivierung von hunchback die Segmentierungskaskade beeinflusst, scheint ebenfalls eine sehr ursprüngliche Funktion von CAUDAL darzustellen, welche in den Kurzkeim-Insekten Tribolium und Gryllus noch immer besteht (vgl. 4.3.2 b); Shinmyo et al., 2005). In beiden Spezies führt eine Reduktion von CAD zum Verlust von Gap-Genen wie hb und Kr, von Paarregel-Genen wie eve und Segmentpolaritäts-Genen wie wingless (vgl. 4.3.2 b); Shinmyo et al., 2005). In Nasonia, welches schon der Langkeim-Entwicklung entspricht, scheint CAUDAL keine aktivierende Wirkung auf hunchback zu haben, jedoch wird es für die Aktivierung von Nv'kni und Nv'gt benötigt, wodurch es auch in der Wespe noch immer an die Spitze der Segmentierungskaskade gestellt werden kann (Olesnicky et al., 2006) In Drosophila ist diese wichtige Musterbildungs-Funktion von CAUDAL dann durch die Entstehung des Morphogens Dm'BICOID scheinbar vollständig verloren gegangen (Olesnicky et al., 2006), wodurch es nun nur noch einen untergeordneten Einfluss auf die Musterbildungsprozesse besitzt (Mlodzik et al., 1990; Rivera-Pomar et al., 1995; Häder et al., 1998). An der Regulation von Gap-Genen wie Dm'giant und Dm'knirps ist Dm'CAD, ähnlich wie in Nasonia, zwar beteiligt, jedoch nur in Kombination mit Dm'BCD, welches zudem einen Verlust von Dm'cad kompensieren kann (Rivera-Pomar et al., 1995). Die alleinige Anwesenheit von Dm'CAD ohne weitere frühe Patterning-Proteine reicht nicht für eine korrekte Bildung posteriorer Segmente aus (Häder et al., 1998). Durch die Ergebnisse dieser Arbeit kann somit das Modell weiter untermauert werden, dass CAUDAL ursprünglich an der Spitze der Segmentierungskaskade steht und einen Hauptinitiator der frühen embryonalen Musterbildungs-Prozesse in basalen Insekten darstellt. 121 Anhang Anhang Anhang A - Sequenzier-Primer Name Sequenz Konstrukt Beschreibung 427-Tc-exu-up-seqfw1 5’-TAGGCAGAAACGAGGAGGAA-3’ 428-Tc-exu-up-seqbw1 5’-GATGTCGCCCCATATCAGAA-3’ 429-Tc-exu-up-seqfw2 5’-TTTGTTTGATTTGGCGTTTG-3’ 430-Tc-exu-up-seqbw2 5’-TTGAAAACAAAAAGGCACCA-3’ 431-Tc-exu-up-seqfw3 5’-GCCCGTAAACTGCATAGAGG-3’ 432-Tc-exu-up-seqbw3 5’-TTTCTTGTGCAGATGATAAGTCA-3’ 437-Tc-exu-up-seqfw4 5’-TGCACTTGCAACAACCATAA-3’ 438-Tc-exu-up-seqbw4 5’-GCTCGAACCGTACCAGAAAG-3’ 443-Tc-exu-up-seqfw5 5’-CTCTGGAACGTGGTGGAAAT-3’ 444-Tc-exu-up-seqbw5 5’-CGCGCCATTGTATGAAAATA-3’ 449-Tc-exu-up-seqbw6 5’-TGCTGTGAGCAAATAATGTATGAA-3’ 433-Tcegup8kb-seqfw1 5‘-CAGAGGCAATTCTCAGGTCA-3‘ pRed[Tc-exu-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #9) pRed[Tc-exu-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #9) pRed[Tc-exu-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #9) pRed[Tc-exu-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #9) pRed[Tc-exu-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #9) pRed[Tc-exu-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #9) pRed[Tc-exu-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #9) pRed[Tc-exu-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #9) pRed[Tc-exu-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #9) pRed[Tc-exu-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #9) pRed[Tc-exu-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #9) pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg3’UTR] (Klon #1) pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg3’UTR] (Klon #1) pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg3’UTR] (Klon #1) pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg3’UTR] (Klon #1) pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg3’UTR] (Klon #1) pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg3’UTR] (Klon #1) pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg3’UTR] (Klon #1) pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg3’UTR] (Klon #1) pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg3’UTR] (Klon #1) Pos. 926 bis 945 in „exu_contig_short“; Sequenziert in Richtung 3’ weiter in exuup. 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Für Seq. von pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #1) Pos. 5562 – 5583 in „contig_5_von_eg_mit_egfp“; Sequenziert in Richtung 3’ weiter in eg-up. Für Seq. von pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #1) 434-Tcegup8kb-seqbw1 5‘-TGCTGCTTAAAAACGCAAA-3‘ 439-Tcegup8kb-seqfw2 5‘- GCGTCAGTCTAAAGAAATCAGTCA-3‘ 440-Tcegup8kb-seqbw2 5‘-CGCATTTGAATTTGTTGGAG-3‘ 445-Tcegup8kb-seqfw3 5‘-TACACGGTGTGCGAAAACTC-3‘ 446-Tcegup8kb-seqbw3 5‘-TGGCAAAACAAAGGTGAAAA-3‘ 450-Tcegup8kb-seqfw4 5‘-CGCTGAAACAGGGGAGTTAG-3‘ 451-Tcegup8kb-seqbw4 5‘-AATCTGCCTGACGAAACGAG-3‘ 454-Tcegup8kb-seqfw5 5‘-TGCAGATCACATCTTCTCAGTC-3‘ 122 Anhang 455-Tcegup8kb-seqbw5 5‘-AACCTATACGAAAACGCTGATT-3‘ 461-Tcegup8kb-seqfw6 5‘-CCTACTACAAGGAAGTTCTCCGAAT-3‘ 462-Tcegup8kb-seqbw6 5‘-GGTTCAAACAATGCAACGA -3‘ 465-Tcegup8kb-seqfw7 5‘-TCATGTGAGGTCAGGTCAGG-3‘ 466-Tcegup8kb-seqbw7 5‘-CAAAAACGAAGTCGAAATGGA-3‘ 435-Tc-pan-up-seqfw1 5’-GCCGCATGGAGTTTTATCTT-3’ 436-Tc-pan-up-seqbw1 5’-TGACACGAATGGTGAAATGAG -3’ 441-Tc-pan-up-seqfw2 5’-CGACCTCACAGACTTGTTGC-3’ 442-Tc-pan-up-seqbw2 5’-AGGGAATGCTAACACAAATCG-3’ 447-Tc-pan-up-seqfw3 5’-AACCGCACATTAGAAGTGGTG-3’ 448-Tc-pan-up-seqbw3 5’-TTGTTGAATGGTTGCTAACTGG-3’ 452-Tc-pan-up-seqfw4 5’-AGGTGATTTGATGAACAACCATT-3’ 453-Tc-pan-up-seqbw4 5’-GCAACAAGTCTGTGAGGTCGT-3’ 456-Tc-pan-up-seqfw5 5’-CAGCTTTGCGAACACCTGTA-3’ 457-Tc-pan-up-seqbw5 5’-AGATTGAGTGGTTGGCGATT-3’ #9 pRed pBac L fw 5'-GCTTGTTGGTGAGGATTCTG-3' 252-NLS-EGFP-bw-seq1 5'-TGCGGGCAGAAAATAGAGATGT-3' 475_seqfw_pan5’UTR 5’-TGTACGTGTACGCAGTGACG-3’ 476_seqbw_eg3’UTR 5’-CGATCAAGAAAACTTCGAAAGG -3’ 477_seqfw_pBacL 5’-CCGAGTCTCTGCACTGAACA -3’ pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg3’UTR] (Klon #1) pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg3’UTR] (Klon #1) pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg3’UTR] (Klon #1) pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg3’UTR] (Klon #1) pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg3’UTR] (Klon #1) pRed[Tc’pan-upstream-nls-egfpTc’eg 3’UTR] (Klon #3) pRed[Tc’pan-upstream-nls-egfpTc’eg 3’UTR] (Klon #3) pRed[Tc’pan-upstream-nls-egfpTc’eg 3’UTR] (Klon #3) pRed[Tc’pan-upstream-nls-egfpTc’eg 3’UTR] (Klon #3) pRed[Tc’pan-upstream-nls-egfpTc’eg 3’UTR] (Klon #3) pRed[Tc’pan-upstream-nls-egfpTc’eg 3’UTR] (Klon #3) pRed[Tc’pan-upstream-nls-egfpTc’eg 3’UTR] (Klon #3) pRed[Tc’pan-upstream-nls-egfpTc’eg 3’UTR] (Klon #3) pRed[Tc’pan-upstream-nls-egfpTc’eg 3’UTR] (Klon #3) pRed[Tc’pan-upstream-nls-egfpTc’eg 3’UTR] (Klon #3) pRed[Tc'panupstream+5'UTR_Gal4delta_Tc'eg3'UTR] pRed[Tc'panupstream+5'UTR_Gal4delta_Tc'eg3'UTR] #352 (MK) „UAS-hb-eg3’UTR“ Pos. 3426 – 3447 in „contig_5_von_eg_mit_egfp“; Sequenziert in Richtung 5’ weiter in eg-up. Für Seq. von pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #1) Pos. 6547 – 6571 in „contig_5_von_eg_mit_egfp“; Sequenziert in Richtung 3’ weiter in eg-up. Für Seq. von pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #1) Pos. 2406 – 2425 in „contig_5_von_eg_mit_egfp“; Sequenziert in Richtung 5’ weiter in eg-up. Für Seq. von pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #1) Pos. 7433–7452 in „contig_5_von_eg_mit_egfp“; Sequenziert in Richtung 3’ weiter in eg-up. Für Seq. von pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #1) Pos. 1535–1555 in „contig_5_von_eg_mit_egfp“; Sequenziert in Richtung 5’ weiter in eg-up. Für Seq. von pRed[Tc-eg-up-8kb-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #1) Pos. 19208 bis 19227 in „pan contig 5’“; Sequenziert in Richtung 3’ weiter in panup. Für Seq. von pRed[Tc-pan-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #3) Pos. 22557 bis 22577 in „pan contig 5’“; Sequenziert in Richtung 5’ weiter in panup. Für Seq. von pRed[Tc-pan-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #3) Pos. 19951 - 19970 in „pan contig 5’“; Sequenziert in Richtung 3’ weiter in pan-up. Für Seq. von pRed[Tc-pan-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #3) Pos. 21540 - 21560 in „pan contig 5’“; Sequenziert in Richtung 5’ weiter in pan-up. Für Seq. von pRed[Tc-pan-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #3) Pos. 20928 – 20948 in „pan contig 5’“; Sequenziert in Richtung 3’ weiter in panup. Für Seq. von pRed[Tc-pan-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #3) Pos. 20698 – 20719 in „pan contig 5’“; Sequenziert in Richtung 5’ weiter in panup. Für Seq. von pRed[Tc-pan-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #3) Pos. 21922 – 21944 in „pan contig 5’“; Sequenziert in Richtung 3’ weiter in panup. Für Seq. von pRed[Tc-pan-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #3) Pos. 19950 – 19970 in „pan contig 5’“; Sequenziert in Richtung 5’ weiter in panup. Für Seq. von pRed[Tc-pan-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #3) Pos. 22730 – 22749 in „pan contig 5’“; Sequenziert in Richtung 3’ weiter in panup. Für Seq. von pRed[Tc-pan-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #3) Pos. 19057 – 19076 in „pan contig 5’“; Sequenziert in Richtung 5’ weiter in panup. Für Seq. von pRed[Tc-pan-up-nls-egfp-eg-3’UTR] (Klon #3) von Tina Loy; Liegt im pBacL etwa 300bp vor FseI-Site. Sequenziert in Richtung 3’ ins Intron. (noch 300bp pBacL) Sequenzier-Primer ok (bei Klon #345) von T. Merkel; Pos. 139 bis 118 in „NLS und EGFP aus pSLfa[5'UTR-nls-egfp3'UTR]fa“); Sequenziert in Richtung 5’ aus EGFP in pBac oder später eg 5’UTR. Ergibt noch 52bp NLS 7903-7922 in pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_Gal4delta_Tc'eg-3'UTR]; SeqFw aus pan 5’UTR raus über NotI 73bp bis NotI 8934 – 8955 in pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_Gal4delta_Tc'eg-3'UTR]; SeqBw aus eg 3’UTR raus über AsiSI 80 bp bis AsiSI 3052-3071 in Klon #352 (MK) UAS-hb-eg3’UTR; SeqPrimer fw aus pBacL über FseI ins UAS Konstrukt, 96 bp bis FseI Tabelle 18: Sequenzier-Primer der klonierten Konstrukte 123 Anhang Anhang B - Detaillierte Statistiken zu Kutikula-Auswertungen UAS_Mex3 ♂ x panup_Gal4♀ UAS_Mex3 L1 ohne Kutikula WT (davon durchgeschlüpft) dorsal offen Kutikula-Schlauch kaum Strukturen Stigma an T3 gestaucht posteriore abdominale Segmente fehlen Lb verformt Lr verformt Abd z.T. fusioniert Lr + Ant fehlen z.T. MWZ teilweise verdreht Kutikula-Rest gesamt 267 407 (347) 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 676 39,5% 60,2% 0,1% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 100,0% UAS_Mex3 L5 ohne Kutikula WT (davon durchgeschlüpft) dorsal offen Kutikula-Schlauch kaum Strukturen Stigma an T3 gestaucht posteriore abdominale Segmente fehlen Lb verformt Lr verformt Abd z.T. fusioniert Lr + Ant fehlen z.T. MWZ teilweise verdreht Kutikula-Rest gesamt 76 258 (227) 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 336 22,6% 76,8% 0,0% 0,0% 0,0% 0,3% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,3% 100,0% UAS_Mex3 L2 524 609 (494) 0 3 2 1 2 0 0 0 0 0 1 1142 45,9% 53,3% 0,0% 0,3% 0,2% 0,1% 0,2% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 100,0% UAS_Mex3 L6 485 336 (245) 0 3 0 4 0 0 0 1 1 0 830 58,4% 40,5% 0,0% 0,4% 0,0% 0,5% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,1% 0,0% 0,0% 100,0% UAS_Mex3 L3 474 792 (657) 0 2 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1273 37,2% 62,2% 0,0% 0,2% 0,0% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 100,0% UAS_Mex3 L4 81 312 (276) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 395 20,5% 79,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,5% 0,0% 100,0% UAS_Mex3 L8 491 323 (136) 0 1 0 2 0 0 0 1 0 0 1 819 60,0% 39,4% 0,0% 0,1% 0,0% 0,2% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0% 0,1% 100,0% 124 Anhang UAS_otd ♂ x panup_Gal4♀ ohne Kutikula WT (davon durchgeschlüpft) Kutikula-Rest Lr fehlt Ant kleiner Ant fehlen + T3 reduziert MWZ verdreht K + Th reduziert + dorsal offen K reduziert + Abd fehlen Segmente T3 + Abd reduziert Abd dünn/Schlauch Abd fehlen Segmente K + Th + A reduziert Kutikula-Schlauch (kaum Strukturen) Beine reduziert/gestaucht dorsal offen gesamte Kutikula gestaucht Kutikula faltig posteriore abdominale Segmente fehlen gesamt UAS_otd L1 190 40,1% 283 (270) 59,7% 1 0,2% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% UAS_otd L2 558 40,4% 810 (643) 58,7% 2 0,1% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,1% 0 0,0% 0 0,0% UAS_otd L3 548 41,7% 758 (595) 57,7% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,1% 0 0,0% 1 0,1% 0 0,0% UAS_otd L4 64 14,3% 380 (341) 85,2% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% UAS_otd L5 20 8,4% 217 (201) 90,8% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% UAS_otd L6 527 58,2% 376 (240) 41,5% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 2 0,8% 0 0,0% 0 0 0 0 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 1 0 0 0 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0 0 0 0 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0 0 0 0 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0 0 0 0 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0 1 1 0 0,0% 0,1% 0,1% 0,0% 0 0,0% 3 0,2% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0 0 0 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0 0 2 0 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 2 0 3 0 0,2% 0,0% 0,2% 0,0% 0 0 2 0 0,0% 0,0% 0,4% 0,0% 0 0 0 0 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0 0 0 0 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0 0,0% 3 0,2% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 474 100,0% 1380 100,0% 1313 100,0% 446 100,0% 239 100,0% 905 100,0% 125 Anhang ohne Kutikula WT (davon durchgeschlüpft) Kutikula-Rest Lr fehlt Ant kleiner Ant fehlen + T3 reduziert MWZ verdreht K + Th reduziert + dorsal offen K reduziert + Abd fehlen Segmente T3 + Abd reduziert Abd dünn/Schlauch Abd fehlen Segmente K + Th + A reduziert Kutikula-Schlauch (kaum Strukturen) Beine reduziert/gestaucht dorsal offen gesamte Kutikula gestaucht Kutikula faltig posteriore abdominale Segmente fehlen gesamt UAS_otd L7 655 48,7% 679 (477) 50,4% 2 0,1% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% UAS_otd L8 605 52,0% 548 (387) 47,1% 1 0,1% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% UAS_otd L9 470 46,7% 532 (432) 52,9% 0 0,0% 1 0,1% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,1% UAS_otd L10 556 60,0% 367 (297) 39,6% 2 0,2% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% UAS_otd L11 351 48,5% 369 (395) 51,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 5 0 0 0,0% 0,4% 0,0% 0,0% 0 2 0 0 0,0% 0,2% 0,0% 0,0% 0 0 0 0 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0 0 1 0 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 0 0 0 0 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 1 1 2 0,0% 0,1% 0,1% 0,1% 0 0 0 5 0,0% 0,0% 0,0% 0,4% 0 0 0 2 0,0% 0,0% 0,0% 0,2% 0 0 0 0 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0 0 1 2 0,0% 0,0% 0,1% 0,3% 1 0,1% 2 0,2% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1346 100,0% 1163 100,0% 1006 100,0% 926 100,0% 723 100,0% 126 Anhang UAS_tGFP ♂ x panup_Gal4♀ UAS-tGFP x panup Gal4 leer 598 31,2% WT (davon durchgeschlüpft) 1302 (1102) 68,0% Kutikula-Schlauch (kaum Strukturen) 4 0,2% Stigma an T3 1 0,1% gesamte Kutikula gestaucht 0 0,0% posteriore abdominale Segmente fehlen 0 0,0% Kutikula faltig 2 0,1% K + T1 Fusion + Stummelbeine 2 0,1% Ant groß 1 0,1% K + Th + Abd reduziert 2 0,1% Kutikula-Rest 2 0,1% gesamt 1914 100,0% Tabelle 19: Auswertung der Kutikula-Präparate der Kreuzungen von ♀ der ersten Gal4-Treiberlinie (pRed[Tc'pan-upstream+5'UTR_Gal4∆_Tc'eg-3'UTR]) mit ♂ den UAS-Linien pBac[UAS_pan-minPromoter_eg5'UTR_Mex3ORF_eg3'UTR], pBac[UAS_pan-minPromoter_eg5'UTR_otdORF_eg3'UTR] und UAS_tGFP. (UAS_Mex3 L7 fehlt aufgrund des Verlusts der Linie) K: Kopf, Th/T: Thorax, Abd: Abdomen, MWZ: Mundwerkzeuge, Lr: Labrum, Ant: Antenne reduziert: Verkleinerung bzw. teilweiser oder auch kompletter Verlust von Strukturen und Segmenten. HSzen2 L1 ohne Kutikula WT (davon durchgeschlüpft) Kutikula-Rest (z.T. mit Struktur) Kopf reduziert Abd reduziert (Fusion?) dorsal offen K + Th reduziert + dorsal offen K + Th + Abd reduziert + dorsal offen Bein reduziert gestaucht und komplett reduziert (z.T. dorsal offen) gesamt HSzen2 L2 HSzen2 L4 HSzen2 L6 HSzen2 L9 70 33 (3) 1 1 0 0 1 1 0 65,4% 30,8% 0,9% 0,9% 0,0% 0,0% 0,9% 0,9% 0,0% 74 23 (2) 0 0 0 2 1 0 1 73,3% 22,8% 0,0% 0,0% 0,0% 2,0% 1,0% 0,0% 1,0% 26 6 (2) 0 0 1 3 0 1 0 70,3% 16,2% 0,0% 0,0% 2,7% 8,1% 0,0% 2,7% 0,0% 62 25 (6) 1 2 1 1 0 0 0 66,7% 26,9% 1,1% 2,2% 1,1% 1,1% 0,0% 0,0% 0,0% 44 44 (12) 0 0 0 2 1 0 0 47,8% 47,8% 0,0% 0,0% 0,0% 2,2% 1,1% 0,0% 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 1,1% 1 1,1% 107 100,0% 101 100,0% 37 100,0% 93 100,0% 92 100,0% 127 Anhang - vw Kontrolle ohne Kutikula WT (davon durchgeschlüpft) Kutikula-Rest (evtl. mit Struktur) nur Kopf nur Kopf + T1 Kopfanhänge fehlen Kopf reduziert Th reduziert Abd reduziert (Fusion?) K + Th reduziert Th + Abd reduziert dorsal offen K + Th reduziert + dorsal offen Inside Out gestaucht und komplett reduziert (z.T. dorsal offen) 391 435 (128) 1 2 1 3 9 1 2 1 1 1 2 1 45,8% 50,9% 0,1% 0,2% 0,1% 0,4% 1,1% 0,1% 0,2% 0,1% 0,1% 0,1% 0,2% 0,1% 3 0,4% gesamt 854 100,0% Tabelle 20: Ausführliche HSzen2 Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 4-9h alte Embryonen. (vgl. Tabelle 9) Anzahl und prozentualer Anteil der verschiedenen Phänotyp-Klassen. K: Kopf, Th/T: Thorax, Abd: Abdomen, reduziert: Verkleinerung bzw. teilweiser oder auch kompletter Verlust von Strukturen und Segmenten. 128 Anhang ohne Kutikula WT (davon durchgeschlüpft) Kutikula-Rest (evtl. mit Struktur) Kopf reduziert K + Th reduziert K + Th + Abd reduziert dorsal offen K reduziert + dorsal offen K + Th reduziert + dorsal offen K + Abd reduziert + dorsal offen Abd reduziert + dorsal offen K + Th + Abd reduziert + dorsal offen K + Bein reduziert Kutikula zwischen K + Th schmal ("Hals") gestaucht und komplett reduziert (z.T. dorsal offen) gesamt HSzen2 L1 27 23,1% 59 (48) 50,4% 0 0,0% 4 3,4% 0 0,0% 1 0,9% 3 2,6% 6 5,1% 4 3,4% 5 4,3% 1 0,9% 3 2,6% 1 0,9% HSzen2 L2 22 28,6% 29 (18) 37,7% 0 0,0% 3 3,9% 3 3,9% 0 0,0% 4 5,2% 10 13,0% 1 1,3% 0 0,0% 0 0,0% 3 3,9% 0 0,0% HSzen2 L4 2 15,4% 8 (4) 61,5% 1 7,7% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 7,7% 0 0,0% 0 0,0% 1 7,7% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% HSzen2 L6 13 31,0% 22 (17) 52,4% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 2 4,8% 1 2,4% 1 2,4% 0 0,0% 1 2,4% 0 0,0% HSzen2 L9 11 17,2% 19 (16) 29,7% 0 0,0% 2 3,1% 1 1,6% 0 0,0% 3 4,7% 8 12,5% 6 9,4% 3 4,7% 0 0,0% 10 15,6% 0 0,0% 2 1,7% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,9% 2 2,6% 0 0,0% 2 4,8% 1 1,6% 117 100,0% 77 100,0% 13 100,0% 42 100,0% 64 100,0% 129 Anhang - vw Kontrolle ohne Kutikula WT (davon durchgeschlüpft) Kutikula-Rest (evtl. mit Struktur) Kopf reduziert K + Th reduziert + dorsal offen K + Th reduziert K + Th + Abd reduziert Abd reduziert T3 mit 1 zusätzliches Bein posteriore abdominale Segmente fehlen gestaucht und komplett reduziert (z.T. dorsal offen) 156 912 (865) 5 17 1 2 3 5 1 1 14,1% 82,2% 0,5% 1,5% 0,1% 0,2% 0,3% 0,5% 0,1% 0,1% 7 0,6% gesamt 1110 100,0% Tabelle 21: Ausführliche HSzen2 Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 8-12h alte Embryonen. (vgl. Tabelle 10) Anzahl und prozentualer Anteil der verschiedenen Phänotyp-Klassen. K: Kopf, Th: Thorax, Abd: Abdomen, reduziert: Verkleinerung bzw. teilweiser oder auch kompletter Verlust von Strukturen und Segmenten. 130 Anhang ohne Kutikula WT (davon durchgeschlüpft) Kutikula-Rest (evtl. mit Struktur) Beinstummel an A1 Kopf reduziert K + Th reduziert K + Th + Abd reduziert dorsal offen K reduziert + dorsal offen K + Th reduziert + dorsal offen K + Abd reduziert + dorsal offen Abd reduziert + dorsal offen K + Th + Abd reduziert + dorsal offen K + Th + Abd reduziert + dorsal offen + Beinstummel an A1 HSzen2 L2 68 27,9% 93 (73) 38,1% 3 1,2% 0 0,0% 3 1,2% 5 2,0% 13 5,3% 5 2,0% 7 2,9% 6 2,5% 8 3,3% 0 0,0% 23 9,4% 8 3,3% HSzen2 L9 63 23,2% 69 (53) 25,5% 1 0,4% 2 0,7% 27 (7x 3Ant) 10,0% 0 0,0% 12 4,4% 5 1,8% 12 4,4% 8 3,0% 6 2,2% 1 0,4% 47 17,3% 17 6,3% gestaucht und komplett reduziert (z.T. dorsal offen) 2 0,8% 1 0,4% gesamt 244 100,0% 271 100,0% Tabelle 22: Ausführliche Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 8-12h alte Embryonen in HSzen2 L2 und L9. (vgl. Tabelle 11) Anzahl und prozentualer Anteil der verschiedenen Phänotyp-Klassen. K: Kopf, Th: Thorax, Abd/A: Abdomen, reduziert: Verkleinerung bzw. teilweiser oder auch kompletter Verlust von Strukturen und Segmenten. 131 Anhang HSzen2 L9 homozygot ohne Kutikula WT (davon durchgeschlüpft) Kutikula-Rest dorsal offen reduziert MIT posterioren Strukturen K reduziert K + Th reduziert Th + Abd reduziert K + Abd reduziert K + Abd reduziert + zusätzl. Beinstummel K + Th + Abd reduziert K defekt + Th mehr Klauen/Fusion + Abd reduziert Th reduziert Abd reduziert dorsal offen + K reduziert dorsal offen + Th reduziert dorsal offen + Abd reduziert dorsal offen + K + Th reduziert dorsal offen + K + Abd reduziert dorsal offen + K + Th + Abd reduziert "Kutikula-Ball": K kaum da + Th + Abd reduziert Beinstummel an A1 reduziert OHNE posteriore Strukturen Abd reduziert K + Abd reduziert Th + Abd reduziert K + Th + Abd reduziert gestaucht und komplett reduziert (z.T. dorsal offen) gesamt 8-10h-HS 393 25,7% 242 (188) 15,8% 2 0,1% 10 0,7% 10-12h-HS 131 30,2% 7 (6) 1,6% 12 2,8% 0 0,0% 12-14h-HS 225 29,9% 36 (34) 4,8% 17 2,3% 4 0,5% 14-16h-HS 310 30,4% 125 (82) 12,3% 3 0,3% 4 0,4% 282 116 0 14 0 28 0 1 9 56 1 14 98 11 234 9 3 18,4% 7,6% 0,0% 0,9% 0,0% 1,8% 0,0% 0,1% 0,6% 3,7% 0,1% 0,9% 6,4% 0,7% 15,3% 0,6% 0,2% 6 2 2 0 14 63 5 0 2 0 0 0 0 0 100 90 0 1,4% 0,5% 0,5% 0,0% 3,2% 14,5% 1,2% 0,0% 0,5% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 23,0% 20,7% 0,0% 0 1 7 0 5 32 0 0 35 0 0 0 0 0 15 5 0 0,0% 0,1% 0,9% 0,0% 0,7% 4,3% 0,0% 0,0% 4,7% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 2,0% 0,7% 0,0% 0 0 1 3 0 0 0 0 119 2 0 0 0 0 0 0 0 0,0% 0,0% 0,1% 0,3% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 11,7% 0,2% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0 0 0 0 6 1529 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,4% 100,0% 0 0 0 0 0 434 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 100,0% 124 10 126 107 3 752 16,5% 1,3% 16,8% 14,2% 0,4% 100,0% 391 47 7 5 2 1019 38,4% 4,6% 0,7% 0,5% 0,2% 100,0% 132 Anhang - vw Kontrolle 8-10h-HS 10-12h-HS 12-14h-HS 14-16h-HS ohne Kutikula 123 17,7% 66 18,6% 142 15,6% 57 17,4% WT (davon durchgeschlüpft) 559 (509) 80,3% 287 (272) 81,1% 750 (668) 82,2% 265 (240) 81,0% Kutikula-Rest 1 0,1% 0 0,0% 1 0,1% 0 0,0% K reduziert/ deformiert 8 1,1% 0 0,0% 3 0,3% 0 0,0% K + Th reduziert 2 0,3% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% A reduziert 2 0,3% 1 0,3% 16 1,8% 4 1,2% gestaucht und komplett reduziert (z.T. dorsal offen) 1 0,1% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,3% gesamt 696 100,0% 354 100,0% 912 100,0% 327 100,0% Tabelle 23: Ausführliche HSzen2 Kutikula-Phänotypen der 2h Ablagefenster. (vgl. Tabelle 13) Anzahl und prozentualer Anteil der verschiedenen Phänotyp-Klassen. K: Kopf, Th: Thorax, Abd: Abdomen, posteriore Strukturen: Urogomphi und Pygopodien, reduziert: Verkleinerung bzw. teilweiser oder auch kompletter Verlust von Strukturen und Segmenten. 133 Anhang HScad homozygot ohne Kutikula WT (davon durchgeschlüpft) Kutikula-Rest Kopfdefekt Lr gespalten Lr reduziert/deformiert Lr + Ant defekt Lr + Md defekt Lr + Ant + Md defekt / Kopfanhänge z.T. fusioniert Kopf komplett reduziert Kopf- + Thorax-Defekt + meist mit "Spaltbein" Lr reduziert + Spaltbein an T2/3 Lr + Ant defekt + Beine reduziert K + T1 Fusion K reduziert + T1+T2 Fusion K reduziert + T1 fehlt K reduziert + (Segment zw. K+T1?) K reduziert + Th eingeschnürt + Beine ohne Klauen K reduziert + Th defekt + Abd reduziert + dorsal offen Abd weniger Segmente (z.T. dorsal offen) gestaucht und komplett reduziert (z.T. dorsal offen) gesamt 8-10h-HS 61 20,9% 187 (163) 64,0% 1 0,3% 10-12h-HS 93 18,9% 335 (296) 68,1% 1 0,2% 12-14h-HS 66 28,3% 126 (114) 54,1% 1 0,4% 14-16h-HS 130 25,7% 326 (237) 64,6% 1 0,2% 7 15 4 3 6 0 2,4% 5,1% 1,4% 1,0% 2,1% 0,0% 3 12 8 8 9 2 0,6% 2,4% 1,6% 1,6% 1,8% 0,4% 0 7 2 2 0 1 0,0% 3,0% 0,9% 0,9% 0,0% 0,4% 4 10 6 0 8 1 0,8% 2,0% 1,2% 0,0% 1,6% 0,2% 0 1 0 1 0 0 2 0 0 4 292 0,0% 0,3% 0,0% 0,3% 0,0% 0,0% 0,7% 0,0% 0,0% 1,4% 100,0% 0 3 2 11 3 2 0 0 0 0 492 0,0% 0,6% 0,4% 2,2% 0,6% 0,4% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 100,0% 1 2 1 5 0 2 0 9 4 4 233 0,4% 0,9% 0,4% 2,1% 0,0% 0,9% 0,0% 3,9% 1,7% 1,7% 100,0% 4 0 0 1 0 0 0 7 3 4 505 0,8% 0,0% 0,0% 0,2% 0,0% 0,0% 0,0% 1,4% 0,6% 0,8% 100,0% 134 Anhang - vw Kontrolle 8-10h-HS 10-12h-HS 12-14h-HS 14-16h-HS ohne Kutikula 20 16,9% 73 14,5% 110 23,1% 42 14,9% WT (davon durchgeschlüpft) 92 (90) 78,0% 417 (353) 83,1% 345 (325) 72,5% 235 (231) 83,3% Kutikula-Rest 1 0,8% 2 0,4% 1 0,2% 1 0,4% Kopfdefekt Lr gespalten 1 0,8% 2 0,4% 0 0,0% 0 0,0% Lr defekt 0 0,0% 1 0,2% 1 0,2% 0 0,0% Lr + Md defekt 0 0,0% 2 0,4% 0 0,0% 0 0,0% KK reduziert 0 0,0% 1 0,2% 0 0,0% 0 0,0% Lb mit 1 Klaue? (Transformation?) 1 0,8% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% Lr defekt + Abd weniger Segmente (Fusion?) 0 0,0% 0 0,0% 1 0,2% 0 0,0% Abd weniger Segmente (Fusion?) 0 0,0% 0 0,0% 12 2,5% 2 0,7% dorsal offen 1 0,8% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% dorsal offen + Abd weniger Segmente (Fusion?) 0 0,0% 1 0,2% 1 0,2% 0 0,0% dorsal offen + T1 fehlt halb + Abd weniger Segmente 1 0,8% 1 0,2% 0 0,0% 0 0,0% Segmente gestaucht 1 0,8% 0 0,0% 4 0,8% 1 0,4% posteriore abdominale Segmente fehlen 0 0,0% 2 0,4% 1 0,2% 0 0,0% Abdomen eingeschnürt 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,4% gesamt 118 100,0% 502 100,0% 476 100,0% 282 100,0% Tabelle 24: Ausführliche HScad Kutikula-Phänotypen der 2h Ablagefenster (vgl. Tabelle 14) Anzahl und prozentualer Anteil der verschiedenen Phänotyp-Klassen. K: Kopf, Th/T: Thorax, Abd: Abdomen, Ant: Antenne, Lr: Labrum, Md: Mandibel, KK: Kopfkapsel 135 Anhang HSMex3 L1 HSMex3 L12 HSMex3 L15 HSMex3 L18 HSMex3 L20 leer 23 42,6% 23 31,5% 31 39,7% 67 38,3% 51 39,2% WT (davon durchgeschlüpft) 27 (15) 50,0% 47 (29) 64,4% 45 (26) 57,7% 100 (58) 57,1% 70 (35) 53,8% Kutikula-Rest 4 7,4% 1 1,4% 0 0,0% 2 1,1% 3 2,3% Kopf defekt 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,6% 1 0,8% Lr fehlt 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,6% 0 0,0% anteriorer Kopf fehlt 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,8% Abd eingeschnürt 0 0,0% 1 1,4% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% Abd dünn/Schlauch 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,6% 0 0,0% posteriore abdominale Segmente fehlen 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 2 1,1% 0 0,0% Beindefekte (Fusion, fehlende Strukturen) 0 0,0% 0 0,0% 2 2,6% 0 0,0% 2 1,5% gestaucht und komplett reduziert 0 0,0% 1 1,4% 0 0,0% 1 0,6% 2 1,5% gesamt 54 100,0% 73 100,0% 78 100,0% 175 100,0% 130 100,0% Tabelle 25: Ausführliche HSMex3 Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 4-9h alte Embryonen. (vgl. Tabelle 15) Anzahl und prozentualer Anteil der verschiedenen Phänotyp-Klassen. K: Kopf, Abd: Abdomen, Lr: Labrum. 136 Anhang HSMex3 L1 HSMex3 L12 HSMex3 L15 HSMex3 L18 HSMex3 L20 ohne Kutikula 29 24,8% 53 19,9% 68 19,8% 55 27,0% 65 24,8% WT (davon durchgeschlüpft) 86 (71) 73,5% 198 (179) 74,2% 265 (233) 77,3% 137(125) 67,2% 187 (170) 71,4% Kutikula-Rest 0 0,0% 1 0,4% 1 0,3% 2 1,0% 1 0,4% Lr gespalten + verformt 1 0,9% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,4% Lr + Ant verformt 0 0,0% 2 0,7% 2 0,6% 0 0,0% 0 0,0% Lr + Ant + Md verformt 0 0,0% 1 0,4% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% Ant fehlt 0 0,0% 1 0,4% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,4% Kopfkapsel klein 0 0,0% 3 1,1% 1 0,3% 0 0,0% 2 0,8% K bis T2 fehlt 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,5% 0 0,0% K bis A2 fehlt 0 0,0% 1 0,4% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% nur Kopf und posterior etwas Kutikula 0 0,0% 1 0,4% 0 0,0% 1 0,5% 0 0,0% K - Gap - Abdomenrest 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,5% 0 0,0% dorsal offen 1 0,9% 1 0,4% 1 0,3% 1 0,5% 0 0,0% dorsal offen + gestaucht 0 0,0% 1 0,4% 2 0,6% 1 0,5% 2 0,8% dorsal offen + T1 fehlt 0 0,0% 1 0,4% 1 0,3% 0 0,0% 0 0,0% dorsal offen + K reduziert + T1 fehlt 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,5% 1 0,4% Bein an A1 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,5% 0 0,0% Abd z.T. fusioniert 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,5% 1 0,4% Abd eingeschnürt 0 0,0% 1 0,4% 1 0,3% 1 0,5% 0 0,0% gestaucht und komplett reduziert 0 0,0% 2 0,7% 1 0,3% 1 0,5% 1 0,4% gesamt 117 100,0% 267 100,0% 343 100,0% 204 100,0% 262 100,0% Tabelle 26: HSMex3 Kutikula-Phänotypen des Hitzeschocks auf 8-12h alte Embryonen. (vgl. Tabelle 16) Anzahl und prozentualer Anteil der verschiedenen PhänotypKlassen. K: Kopf, T: Thorax, Abd/A: Abdomen, Lr: Labrum. 137 Literaturverzeichnis Literaturverzeichnis Adams, M. D. (2000). The Genome Sequence of Drosophila melanogaster. Science, 287(5461), 2185–2195. Akam, M. (1989). Hox and HOM: homologous gene clusters in insects and vertebrates. Cell, 57(3), 347–9. Aranda, M., Marques-Souza, H., Bayer, T., & Tautz, D. (2008). The role of the segmentation gene hairy in Tribolium. Development Genes and Evolution, 218(9), 465–77. Baird-Titus, J. M., Clark-Baldwin, K., Dave, V., Caperelli, C. a., Ma, J., & Rance, M. (2006). The solution structure of the native K50 Bicoid homeodomain bound to the consensus TAATCC DNA-binding site. Journal of Molecular Biology, 356(5), 1137–1151. Beeman, R. W., Stuart, J. J., Brown, S. J., & Denell, R. E. (1993). Structure and function of the homeotic gene complex (HOM-C) in the beetle, Tribolium castaneum. BioEssays, 15, 439–44. 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Alle aus Quellen wörtlich oder sinngemäß entnommene Stellen sind als solche kenntlich gemacht. Ich erkläre weiterhin, dass ich nie versucht habe die vorliegende Dissertation in gleicher oder ähnlicher Form in einem Prüfungsverfahren vorzulegen. Erlangen, _________________________________ Denise Mackrodt 155 Danksagung Danksagung So...nun ist die Arbeit also geschafft und es folgt der Teil, auf den ich mich am meisten gefreut habe, der jedoch auch einer der schwersten war da ich manchmal gern mehr geschrieben hätte und sowieso sicher irgendetwas vergessen habe. Aber ich versuch's mal: Mein erster Dank geht natürlich an PD Dr. Michael Schoppmeier. Dafür, dass er mich nochmal von der Entwicklungsbiologie überzeugt und mir letztendlich diese Arbeit ermöglicht hat. Michael, danke für deine immerwährende Unterstützung und Hilfe, das super Arbeitsklima und auch für die Möglichkeit mich mit diversen "Laborverschönerungen" kreativ entfalten zu dürfen. :) Danken möchte ich auch Prof. Dr. Martin Klingler für das Erstellen des Zweitgutachtens und Prof. Dr. Petra Dietrich und Prof. Dr. Benedikt Kost für die Abnahme meiner mündlichen Prüfung. Ein erfolgreiches Überleben im Labor wäre niemals möglich gewesen ohne Dr. Irene Schnellhammer und Dr. Jutta Distler. Irene, danke für deine unendliche Geduld als ich als Laborfrischling alle fünf Minuten mit einer neuen (oder auch alten) Frage zu dir kam, für den Spaß bei unserer Kategorie "Täglich etwas Neues lernen" und danke für die Überlassung des besten Laborarbeitsplatzes! Jutta - Hitzeschockqueen - danke, dass du mir deine Geheimnisse des embryonalen Injizierens verraten hast und mir sooo viel beigebracht hast, was ich für diese Arbeit benötigt habe. Danke für unsere Mittagskaffees, die Gespräche und dein offenes Ohr. Ganz besonders möchte ich mich bei meinen Lab-Jungs bedanken - Matthias Teuscher, Tobias Richter und Fabian Pridöhl - ohne euch geht's nicht! Danke für ganz viel Spaß, Verständnis, Streiche, offene Ohren, Laborquatsch und die viele gute Zeit auch abseits des Labors. Matze - kleiner-großer Professor - danke für Klassik-Stunden, für die Schokoschublade, für viel neuen Arbeits-Input und die Übernahme des "Blotkrams" und ganz besonders fürs immer Da-Sein! Tobi - bester Chili-Koch und Grillkönig - danke, dass du mein Labor-Fußballkumpel warst und meine Karriere im Hockern stets gefördert hast. Und Fabi, du warst einfach der beste Laborpartner! Ich könnte wahrscheinlich eine ganze Seite für dich schreiben aber ich versuch's mal in kurz: Danke, dass du für mich immer das Internet nach dem wirklich Wichtigen vorsortiert hast, danke für deinen Optimismus und deine Faszination für unzählige Dinge, für ganz viele Gespräche und Diskussionen, für deine Unterstützung, fürs Zuhören und dafür, dass du mich ausgehalten hast. Woher soll ich jetzt nur so viel Neues lernen?? Aus allergrößtem Herzen möchte ich der oft übersehenen Fee des Lehrstuhls Claudia Obermeier danken. Nicht nur dafür, dass sie alle benötigten Dinge sofort herbeizaubert und 156 Danksagung so zusammen mit ihrem Engagement die Arbeit am Laufen hält, sondern auch weil sie einfach ein toller Mensch ist! Claudia, danke für deine Herzlichkeit, deinen Zuspruch, für ganz viel Freude, für deine Meinung, für Umarmungen wenn sie nötig waren und dafür, dass ich einfach immer über alles mit dir reden kann. Ein extra Dank geht außerdem an Claudias Kaffeemaschine fürs Da-Sein. :) Meine Arbeitstage wären außerdem oft eintönig geworden ohne Angela Bruns, Tina Loy und Maria Ricca. Angela, danke für gute Gespräche und unsere kurzen Ausflüge nach draußen. Tina - danke, dass man mit dir so gut Schabernack treiben kann! Maria, danke für deine einfühlsame und herzliche Art und, dass du immer ein Lächeln auf den Lippen hast! Für die wöchentliche Unterstützung meiner medialen Freizeitgestaltung möchte ich Klaus Griebel danken. Klaus, vielen Dank auch für viele fachliche, nicht-fachliche, lustige und ernste Gespräche. Barbara Fischer, Matthias Weißkopf und Andreas Sulzmaier gebührt zum einen natürlich Dank für die schöne und angenehme Zusammenarbeit im Labor, aber ganz besonders dafür, dass sie als fleißige Helferlein mit mir das Leid des Käfer-Sortierens in Mordor geteilt und mir somit unendlich geholfen und meine Arbeit erleichtert haben. Danke! Allen Kollegen der anderen Arbeitsgruppen danke ich für die gute Zusammenarbeit und die Unterstützung wann immer sie nötig war. Besonders Dr. Ralph Rübsam für seinen fachlichen Rat und all die inspirierenden Gespräche, Carolin Schille und Verena Rauschenberger für ihre große Hilfe bei meinem Ausflug in die Welt der Blots und Dr. Jochen Trauner und Dr. Christoph Schaub, die mir immer mit Rat und Tat zur Seite standen v.a. wenn es um Dinge in Richtung Fliegenlabor ging. Danke auch an alle Studis, die ein und aus gegangen sind und so den Laboralltag lebendig gehalten haben. Meiner Familie und Freunden: Danke, dass ihr mich die Uni auch mal vergessen lasst - Ich bin froh euch zu haben! Ein Extra-Dank geht hierbei an das kleine Engelchen Doro. Danke, dass du einfach immer für mich da bist! DANKE an meine Eltern - für alles!! Und zum Schluss: Danke an alle, die mich stets mit kleiner und großer Knibbel-BläschenFolie versorgt haben! - Ich werde euch vermissen - 157
