Aus dem Institut für Neuropathologie
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3. ERGEBNISSE 3.1 LOH bei astrozytären Tumoren Es wurden insgesamt 153 astrozytäre Tumoren untersucht. Dabei handelte es sich um 52 Astrozytome WHO Grad II (A II), 70 anaplastische Astrozytome WHO Grad III (AIII), und 31 Glioblastome WHO Grad IV (GBM). Mit 11 Mikrosatellitenmarkern konnte bei 49 von 153 untersuchten astrozytären Gliomen (32%) ein LOH auf dem chromosomalen Arm 22q festgestellt werden. Davon hatten 32 der 49 LOHFälle eine interstitielle Deletion (65%) und 17 Fälle (35%) zeigten einen Verlust des gesamten chromosomalen Arms (siehe Tabelle 5). Bei den A II zeigte nur einer von 52 untersuchten Tumoren den kompletten Verlust eines chromosomalen Arms, 13 dagegen wiesen einen interstitiellen Verlust auf. Bei den A III erhöhte sich die Anzahl der Verluste des ganzen Arms. Hier waren 9 von 70 (13%) Tumoren betroffen. Bei den GBM zeigte sich jedoch die höchste Anzahl an Verlusten des gesamten Arms mit 7 von 31 Tumoren (23%). Bei den höhergradigen A III und den GBM kamen dagegen weniger interstitielle Deletionen vor: 14 von 70 (20%) bei den A III und 5 von 31 (16%) bei den GBM. Tab. 5) Ergebnis der Allelverluststudie 22q aufgeschlüsselt nach Tumorgrad. Tumor LOH LOH partiell 27% (14/52) LOH alle Marker 2% (1/52) A II A III 33% (23/70) 13% (9/70) 20% (14/70) GBM 39% (12/31) 23% (7/31) 16% (5/31) Total 32% (49/153) 35% (17/49) 65% (32/49) 25% (13/52) Bei der Analyse (siehe Abbildungen 6 und 7) konnten zwei unterschiedliche Regionen identifiziert werden. Einerseits eine centromere Deletionsregion (C-Region) zwischen den 46 Markern D22S533 und D22S689 mit einer Größe von etwa 3 Mb. Bei 18 Fällen, die eine interstitielle Deletion aufwiesen, kam es zu Allelverlust im Bereich der C-Region. Andererseits fand sich eine telomere Region (T Region), in der 17 der Fälle mit einer interstitiellen Deletion einen LOH aufwiesen. Sie befindet sich zwischen den Markern D22S530 und D22S417 mit einer Größe von etwa 2,7 Mb. Bei insgesamt 7 Tumoren konnte ein kombinierter Verlust beider Deletionszonen nachgewiesen werden. Drei davon (A II 25646, A III 4882, A III 25618) hatten sowohl einen Verlust in der C-Region als auch in der T-Region. Dazwischen waren beide Allele vorhanden. Zusätzlich zeigten drei Gliome (A III 25474, GBM 21601, GBM 20990) Deletionen, die oberhalb der C-Region lagen. Ein astrozytärer Tumor (A II 3166) verlor den chromosomalen 16 6 I3 AI 56 82 56 36 I2 AI 57 06 II 2 II 2 AI AI 64 45 84 II 2 AI 2 218 GB M 6 40 6 53 4 41 2 AI I2 AI I2 AI I3 14 2 36 4 24 0 M AI I2 GB 38 6 31 84 II 2 AI 39 48 IIr 2 AI 44 92 II 2 AI 56 18 II 2 I2 AI AI 88 2 56 46 II 4 I2 AI AI 56 78 50 24 I2 AI AI II 2 23 6 24 92 II 2 I2 AI AI 44 44 85 2 II 2 I3 AI AI 56 62 20 97 2 M II 2 GB AI 22 66 32 40 I2 AI 98 4 II 2 I4 AI AI 02 90 20 9 GB M 21 6 II 2 AI GB M 547 4 Arm telomer zur T-Region (siehe Abbildung 6). D22S446 D22S686 D22S536 D22S533 C D22S689 D22S685 D22S683 D22S530 T D22S534 D22S417 D22S532 Abb. 6) Minimale Verlustzonen auf 22q bei Astrozytomen. Insgesamt 32 Tumoren zeigten eine interstitielle Deletion und wurden in die Analyse einbezogen. C bezeichnet die centromere Region und T die telomere Region. Die schwarzen Kreise symbolisieren, dass kein Allelverlust vorliegt. Graue Kreise stehen für einen nicht informativen Marker. Die weißen Kreise stehen für einen Allelverlust. Die gestreift unterlegte Region kennzeichnet Tumoren, welche in beiden Regionen Allelverluste aufweisen. 47 GBM 20972 A III 23948 B T B T (ni) (ni) 22p11.1 D22S446 22q11.1 11 D22S686 (ni) (1,2) 22q11.21 D22S536 (ni) 22q11.22 9 10 C (ni) hSNF5/INI1 D22S533 22q11.23 8 22q12.1 hCHK2 NF2 (LOH) (1,2) D22S689 (ni) (1,2) 22q12.2 14 1 D22S685 (1,2) 22q12.3 (ni) 3 D22S683 8 T 22q13.1 (LOH) 6 (1,2) 12 13 2 22q13.2 (1,2) 11 1 D22S530 (ni) D22S534 22q13.31 (ni) 4+5 7 8 22q13.32 (ni) D22S417 (ni) (1,2) 22q13.33 D22S532 (ni) (1,2) Abb. 7) Übersichtsabbildung mit den bereits identifizierten Zonen bei verschiedenen Tumorentitäten (siehe Abbildung 4 zum Vergleich) und den neu identifizierten minimalen Verlustzonen, welche mit C für die centromere Region und T für die telomere Region bezeichnet sind. Auf der rechten Seite der Abbildung sind exemplarisch zwei Tumoren mit interstitiellen Deletionen dargestellt. B steht für Blut (aus Leukozyten isolierte DNS des Patienten) und T für Tumor-DNS, 1,2 bedeutet, dass beide Allele vorhanden sind, ni steht für nicht informativ und LOH für den Verlust der Heterozygotie. 48 3.2 Resultat der Genidentifizierung in den Deletionsregionen auf Chromosom 22 und computerbasierte Analyse In der C-Region, die 3 Mb umfasst, konnten 11 RefSeq-Gene und 11 mRNS identifiziert werden (siehe Abbildung 9A). Zwei zusätzliche mRNS wurden ausgeschlossen, da sie als „single exon genes“ erschienen und keine korrespondierenden hEST zu finden waren. Die T-Region umfasst 2,7 Mb und beinhaltet 39 RefSeq-Gene und 10 mRNS basierte Gene (siehe Abbildung 9B). Hier wurden 4 mRNS von der Kandidatenanalyse aus den genannten Gründen ausgeschlossen. Um die Kandidatengene weiter einzugrenzen, wurden diese Gene einer computerbasierten Analyse mittels BLAST auf Ähnlichkeiten mit bekannten Tumorsuppressorgenen unterzogen. Zusätzlich wurde mit Hilfe der PubMed-Datenbank versucht, mehr über die Funktion der Gene und eine mögliche Involvierung in bekannte Tumorregelkreise zu erfahren. In der C-Region erschien von den charakterisierten Genen MYO18B am interessantesten, da Mutationen dieses Gens bei Lungenkrebs gefunden werden konnten [67]. Dagegen konnten 9 von 22 Genen nicht weiter charakterisiert werden. In der T-Region fanden sich drei Gene, die als TumorsuppressorgenKandidaten in Frage kamen. Zum einen das Gen DJ1042K10.2 aufgrund der in der BLASTAnalyse identifizierten RUN-Domäne, die hauptsächlich in Rab und Rap GTPasen vorkommt (Abbildung 8). Zusätzlich MKL1, das für ein Protein kodiert, welches eine Rolle bei der megakaryozytischen Leukämie spielt und EP300, ein in den p53 Regelkreis involviertes Tumorsuppressorgen. In der T-Region konnten 14 Gene nicht weiter charakterisiert werden. Abb.8) Identifizierte Protein Domänen nach Translation der Sequenz für das DJ1042K10.2-Gen mittels BLAST Programm. Die RUN-Domäne wird vor allem in Proteinen gefunden, die in den Ras-Regelkreis involviert sind. Die TBC-Domäne ist weit verbreitet und gibt den Hinweis, dass es sich um eine GTP-ase aktivierende Domäne handelt. Die SH3-Domäne bindet an Zielproteine durch Sequenzen, die Prolin oder hydrophobe Aminosäuren enthalten. Zusätzlich wurde der gesamte chromosomale Arm 22q einer Analyse mittels BLAST und PubMed unterzogen, um Gene zu identifizieren, die aufgrund ihrer Funktion als Tumorsuppressorgen-Kandidaten in Frage kommen. Diese Gene wurden dann mit in die Mikroarray-Analyse eingeschlossen. Eine Übersicht über die zusätzlich identifizierten Kandidaten bieten Tabellen 6 und 7. 49 D22S284 IMAGE:3542716 Centromer 100 200 300 100 ADRBK2 FLJ31125 400 500 GRAP2 D22S530 MYO18B 600 Centromer D22S533 D22S299 300 400 * 700 500 KIAA1093 ADSL DJ1042K10.2 600 MKL1 KIAA1659 700 D22S534 800 900 1000 1100 1200 SEZ6L ASPH HPS4 TFIP11 FLJ32881 TPST2 T-Region FLJ31418 1600 1000 LOC63929 RBX1 1300 1400 1500 1700 1800 1900 1900 2000 2000 2100 2100 2200 2200 MN1 2300 PITPNB 2400 KIAA1043 2700 Telomer SLC25A17 ST13 HSC3 1800 2600 2800 2500 2600 2700 D22S417 2800 2900 2900 3000 3000 * EP300 L3MBTL2 IMAGE:4153436 RANGAP1 RoXaN KIAA1655 TEF DKFZp434F0217 TOB2 PHF5A ACO2 FLJ22871 PIPPin PMM1 clone 23674 G22P1 NHP2L1 FLJ23584 IMAGE:4827116 FLJ22349 FLJ30141 SREBF2 TNFRSF13C MGC861 SEPT3 IMAGE:4815849 NAGA LOC91689 NDUFA6 CYP2D TCF20 NFAM1 Al365513 CGI-96 SERHL CGI-96 KIAA1649 DIA1 A4GALT ARFGAP1 PACSIN2 TTLL1 BIK * BZRP 3100 3100 A) 900 1600 DKFZp686K1629 IMAGE:3885734 2500 D22S689 GPR24 1200 Telomer C-Region 1500 2400 FLJ21503 1100 CRYBB1 CRYBA4 DKFZp564O163 FLJ22849 1400 2300 * * D22S279 1300 1700 LOC113828 B) Abb. 9) Die Abbildung zeigt eine Übersicht der Gene, die in der centromeren (A) und telomeren (B) minimalen Verlustzone liegen. Die mit einem Stern gekennzeichneten Gene wurden einer Mutationsanalyse unterzogen. Die Nummern auf der linken Seite korrespondieren mit der KbDNS-Sequenz. 50 Tab.6) Übersicht über die Gene auf dem chromosomalen Arm 22q, die mittels BLAST-Analyse als potentielle Kandidatengene identifiziert wurden. Nr. Gen Name 1 2 3 4 5 6 7 BID GSCL HIRA CDC45L PNUTL1 RANBP1 CRKL BH3 interacting domain death agonist Goosecoid-like Histone cell cycle regulation defective CDC45-like Septin 5 RAN binding protein 1 V-crk sarcoma virus CT10 oncogene 8 9 10 LZTR1 MAPK1 KIAA0015 Leucine-zipper-like transcription regulator Mitogen-activated protein kinase KIAA0015 11 12 13 14 15 16 GANZ RTDR1 RAB36 BCR MMP11 SEC14L2 Guanine nucleotide binding protein Rhabdoid tumor deletion region protein RAB36, member RAS oncogene family Breakpoint cluster region Matrix metalloproteinase 11 SEC14-like 2 17 18 19 20 PES1 SMTN ZNF278 YWHAH Pescadillo homolog Smoothelin Zinc finger protein 278 Tyrosine 3/tryptophan 5 -monooxygenase 21 22 23 RAYL RAC2 CARD10 Member of RAS oncogene family-like 4 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2 Caspase recruitment domain protein 10 24 25 MAFF ATF4 transcription factor MAFF activating transcription factor 4 vermutete Funktion aufgrund der BLASTAnalyse Proapoptotisches Protein Transkriptionelle Regulation Zellzyklusregulation Zellzyklusregulation Zellzyklusregulation GTPase aktivierndes Protein Ähnlichkeiten mit dem epidermal growth factorreceptor-binding protein GRB-3 Transkriptionelle Regulation Familie der Protein Kinasen Calcium/Calmodulin abhängige Proteikinase, Apoptose Ras Homolog Rab Familie Ras Familie Rho/Rac/Cdc42-like GTPases Metalloprotease Ähnlichkeit mit dem S. cerevisiae phosphatidylinositol transfer protein (Sec14p) und mit den RhoGAPs, RhoGEFs und RasGEF Ähnlichkeit mit der BRCA1 c-terminalen Domäne p53 Target Ähnlichkeit Transkriptionsfaktor Domäne die in die Growth factor Regeglkreis involviert ist Ras Familie Ras Familie CARD Familie, die Apotose reguliert und den NFkappaB Regelkreis reguliert Homologie zum Fibrosarkoma Onkogen Transkriptionsfaktor Tab. 7) Übersicht über die Gene auf dem chromosomalen Arm 22q, die durch die Literaturrecherche als potentielle Kandidatengene identifiziert wurden. Nr. 1 Gen Name SMARCB1 SWI/SNF related, matrix associated 2 EWSR1 Ewing sarcoma breakpoint region 1 3 4 RRP22 NF2 RAS-related on chromosome 22 Neurofibromin 2 5 6 7 DRG1 MCM5 PDGFB Developmentally regulated GTP binding protein 1 Minichromosome maintenance deficient protein 5 platelet-derived growth factor beta Literaturrecherche Tumorsuppressorgen in Sarkomen Translokationspartner bei verschiedenen Sarkomen Potentielles Tumorsuppressorgen aus der RAS Familie Tumorsuppressorgen spielt eine Rolle bei der Gehirnentwicklung bei Mäusen DNS Replikationsfaktor Mitogen 51 3.3 Mutationsanalyse mittels SSCP Insgesamt wurden fünf Gene mit unterschiedlichen Funktionen aufgrund der oben genannten Kriterien mittels SSC- Analyse auf Mutationen untersucht. Eine schematische Übersicht über die untersuchten Gene und Exone gibt Abbildung 10. 3.3.1 DJ1042K10.2 Das Gen DJ1042K10.2 besteht aus 20 Exonen und es waren 25 Primerpaare notwendig, um die gesamte genomische Sequenz des Gens zu untersuchen. Es wurden 35 Tumoren untersucht, davon waren 9 A II, 10 A III, 12 GBM, 2 pleomorphe Xantroastrozytome WHO Grad II (PXA II) und 2 Oligoastrozytome WHO Grad II (OA II). In 8 Fällen waren beide Allele des Chromosom 22q vorhanden und in 27 Fällen lag ein LOH 22q vor. Es wurden keine Mutationen, aber Polymorphismen gefunden. Bei folgenden Tumoren wurde ein Polymorphismus gefunden: ID 22088 (OA II) zeigte einen Polymorphismus im Exon 2, ID 2386 (A III) in Exon 8, ID 20892 (A III) in Exon 10 und die Tumoren ID 2392 und 4882 (beide A III) in Exon 11. 3.3.2 MKL1 Insgesamt wurden 35 Tumoren auf Mutationen untersucht. Dabei handelte es sich um: 8 A II, 12 A III, 11 GBM, 2 PXA II und 2 OA II. Ein LOH 22q lag bei 29 Tumoren vor, bei 6 Tumoren waren beide Allele des Chromosom 22q vorhanden. Die 15 Exone des Gens wurden mit 31 Primerpaaren untersucht. Es wurden keine Mutationen, aber wiederum Polymorphismen gefunden. Das Exon 12 zeigte sich sehr polymorph und auch im Exon 10 zeigten sich viele Polymorphismen: ID 20980 (PXA II), ID 20990 (GBM), ID 21804 (GBM), 22266 (A III), ID 22912 (A III), ID 24004 (GBM). Im Exon 11 dagegen zeigte nur ein einzelner Tumor ID 4948 (A II) einen Polymorphismus. 3.3.3 EP300 Das gesamte Gen besteht aus 32 Exonen. Aufgrund der großen Zahl an Exonen wurden nur Exone untersucht, in denen bereits Mutationen beschrieben wurden [66]. Folgende Exone wurden untersucht: 8, 14, 16, 17, 18, 25, 26, 30 und 31. Dabei ist das Exon 31 so groß ist, dass es mit 14 Primerpaaren untersucht werden musste, um das gesamte Exon abzudecken. Insgesamt wurden 27 Primerpaare verwendet. Es wurden wieder 35 Tumoren untersucht: 11 A II, 10 A III, 11 GBM, 2 PXA II und 1 OA II. Von den 35 Tumoren hatten 7 keinen Allelverlust des 52 Chromosom 22q und bei 28 Fällen lag ein LOH 22q vor. Das Exon 17 zeigte sich polymorph und abgesehen davon hatten zwei Tumoren, ID 20990 (GBM) und 22176 (A II), einen Polymorphismus in Exon 31. Es konnten in den untersuchten Exonen keine Mutationen festgestellt werden. A.) DJ1042K10.2 9.5 kb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 B.) MKL1 25 kb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 C.) MYO18B 289 kb 1 20 4 31 43 D.) EP300 88 kb 8 14 16 17 18 25 26 30 E.) BIK 0,9 kb 2 3 4 5 Abb. 10) Schematische Abbildung der mittels SSCP untersuchten Gene DJ1042K10.2, MKL1, MYO18B, EP300 und BIK. Die senkrechten schwarzen Kästen symbolisieren die einzelnen Exone. Nur die Exone, die untersucht wurden, sind mit einer Zahl versehen. Die genomischen Distanzen sind in den einzelnen Bildteilen nicht maßstabsgerecht eingezeichnet. 3.3.4 MYO18B Bei dem Gen MYO18B wurden auch wieder nur selektiv ausgesuchte Exone untersucht, da das Gen mit 289 kb sehr groß ist. Folgende Exone, in denen Mutationen beschrieben sind [67], wurden mit 15 Primerpaaren auf Mutationen untersucht: 4, 8, 20 und 43. Es wurden 36 astrozytäre Tumoren untersucht: 2 A II, 18 A III und 16 GBM, davon hatten die Hälfte ein Allel auf 22q verloren und die andere Hälfte hatte beide Allele 22q vorhanden. Erneut wurden in den untersuchten Exonen keine Mutationen, sondern nur Polymorphismen gefunden. In Exon 4 fand sich bei 4 Tumoren ein Polymorphismus: ID 21864 (GBM), 23120 (GBM), welcher auch im Exon 8 polymoph war, ID 23158 (GBM) und ID 23252 (GBM). Auch in Exon 43 zeigten 4 53 Tumore einen Polymorphismus: ID 21820 (GBM), ID 25618 (A III), ID 25626 (AIII) und ID 25632 (A III). 3.3.5 BIK Da Mutationen des BIK Gens bei B-Zell Lymphomen gezeigt werden konnten, wurde es in der vorliegenden Arbeit analysiert [52]. Eine Mutationsanalyse von Exon 2 bis 5 mit 4 Primerpaaren in Astrozytomen ergab keine Mutation. Es wurden insgesamt 35 Tumoren mit LOH 22q untersucht: 13 GBM, 8 A II, 14 A III. Es fanden sich lediglich Polymorphismen in den Exonen 2 und 3 in dem Tumor mit der ID 24004 (GBM). Das Exon 4 zeigte sich hochpolymorph. Eine Auswahl der gefundenen Polymorphismen in den Genen DJ1042K10.2, MKL, MYO18B, Ep300 und BIK, zeigt Abbildung 11. a.) DJ1042K10.2 Exon 2 K K B b.) MKL1 Exon 10 T K K B c.) MYO18B Exon 43 T K K K B B T e.) BIK Exon 2 d.) EP300 Exon 31 K K T B T K K K Abb. 11) Typische Polymorphismen der untersuchten Gene. Dabei steht K für Kontrolle (Leukozyten-DNS aus einer Vergleichspopulation) B für Blut (aus Leukozyten isolierte DNS des Patienten) und T für Tumor-DNS. Die aberranten Banden sind mit einem Pfeil gekennzeichnet. Nur wenn Leukozyten-DNS und Tumor-DNS ein unterschiedliches Laufverhalten zeigen, liegt eine Mutation im Tumor vor (hier nicht abgebildet). 54 3.4 Mikroarray 3.4.1 RNS-Qualität und Markierungseffizienz Die Qualitätskontrolle der einzelnen RNS-Proben, die aus den verschiedenen Tumoren extrahiert wurden, erfolgte durch die Analyse eines Aliquots mittels eines Agilent Bioanalyzer. Die RNSProben zeigten größtenteils Profile, die auf eine gute RNS-Qualität schließen lassen. In der Abbildung 12 sind exemplarisch ein Gelbild und zwei Elekropherogramme abgebildet. RNS Proben, bei denen die Qualität nicht ausreichend war, wurden von dem Hybridisierungsexperiment ausgeschlossen. 18 S rRNS 28 S rRNS 28 S rRNS 18 S rRNS 18 S rRNS 28 S rRNS A.) Gelbild der RNS-Analyse. B) Elektropherogramme einzelner RNS-Proben Abb.12) Überprüfung der RNS-Qualität mittels Agilent Bioanalyzer. Die Abbildung 12.A) zeigt ein Gelbild der RNS-Analyse. Die isolierte RNS sollte im Gel distinkte ribosomale Banden der 18 und 28 S RNS aufweisen. Die obere Bande ist die 28 S rRNS-Bande, die ungefähr doppelt so dick, wie die darunter gelegene 18 S rRNS-Bande sein sollte. Die Abbildung 12.B) zeigt das Elektropherogramm der Proben 25668 und 25686. Das Intensitätenverhältniss 28:18 S rRNS sollte nahe 2:1 liegen. 55 Ausgehend von den RNS-Proben ließen sich in allen Fällen durch die Aminoallylmodifikation und die anschließende Markierung cDNS-Targets von sehr guter Qualität generieren. Sämtliche fluoreszenz-markierte cDNS-Targets zeigten nach der gelelekrophoretischen Analyse durchweg eine sehr gute Größenverteilung über den gesamten Trennbereich und eine hohe Markierungseffizienz. 3.4.2 Auswertung der gescannten Bilder Durch die Hybridisierung konnten starke Signalintensitäten erzeugt werden, die den zur Verfügung stehenden dynamischen Bereich völlig ausschöpften. In Abbildung 13 ist exemplarisch ein Mikroarray als Falschfarbendarstellung abgebildet. Abb. 13) Mikroarray nach der Hybridisierung als Falschfarbendarstellung. Das hybridisierte cDNS-Target 22528 wurde mit Cy5 markiert und ist rot dargestellt, die Referenz ist grün (Cy3). Spots, die mit beiden cDNS gleichermaßen hybridisieren, erscheinen gelb. 3.4.3 Normalisierung In der vorliegenden Arbeit wurden nur wenige Gene mittels Mikroarrays untersucht. Daher kann davon ausgegangen werden, dass nur wenige Gene unter den gewählten experimentellen Konditionen verändert sind. Dadurch ist die Normalisierung gegen den Mittelwert eine einfache Methode der Wahl. Um zuvor aber abzuklären, ob die Daten aus einer normalverteilten Population stammen, kann man die so genannte graphische „Scatter-Plot“-Darstellung verwenden. Von der Annahme ausgehend, dass die meisten Gene keine großen Fluktuationen 56 aufweisen, sollten die meisten Punkte auf einer Geraden liegen. Idealerweise ist diese Gerade als Winkelhalbierende in Form des „Scatter-Plots“ dargestellt. Die Linearität kann dann als ein Indiz für die Normalverteilung verwendet werden [112]. Exemplarisch ist ein solcher Scatter-Plot für die Tumorprobe 22528 in Abbildung 14 dargestellt. Auch die Daten für die anderen hybridisierten Proben zeigten weitgehend eine Normalverteilung der Werte, weshalb die Normalisierung gegen den Mittelwert durchgeführt werden konnte. Signal bei 532 nm-Hintergrund bei 532nm 100000 10000 1000 100 10 1 1 10 100 1000 10000 100000 Signal bei 635nm-Hintergrund bei 635nm Abb. 14) Graphische Darstellung mittels „Scatter-Plot“. Ohne Anwendung der in Text beschriebenen Normalisierungsmethode. Der Datensatz wurde anhand der gescannten und analysiereten Hybridisierungsbilder erzeugt. Die Probe 22528 wurde mit Cy5 markiert, im 635 nm Kanal detektiert und auf der Abszisse dargestellt. Die Referenz, welche mit Cy3 (532 nm) markiert wurde, ist auf der Ordinate aufgetragen. Es sind jeweils die hintergrundkorrigierten Signalintensitäten in einer doppeltlogarithmischen Darstellung aufgeführt. 3.4.1 Cluster-Analyse Eine nicht-hierarchische Cluster-Analyse zeigte verschiedene Gruppenbildung (Abbildung 15). Es konnte keine Korrelation zwischen LOH Status 22q und der Gruppenbildung gefunden werden. 57 3.4.2 Statistische Auswertung Eine erste Auswertung mit den gängigen Computerprogrammen ANOVA und SAM ergab keine differentielle Genexpression zwischen den beiden Gruppen. Es ergaben sich keine statistisch signifikanten Unterschiede, wenn man die Gliome mit Allelverlusten 22q mit der Gruppe ohne Allelverluste 22q verglich. 5.0 4.0 3.0 2.5 2.0 1.5 Expression 1.2 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 21754 25696 24584 25636 22528 25962 23642 25646 25660 22522 24492 25690 23982 25668 25666 25686 22266 23184 22912 0.2 0.1 0.0 Abb. 15) Cluster-Analyse mit „ Heat-Map“ zur Darstellung relativer Expressionsstärken. Hierbei werden relative Transkriptionsmengen in verschiedenen Farben dargestellt (rot: sehr hohe Expression; dunkelblaue Farbe: sehr geringe Expression). 58
