VL Nucleinsäure 2
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Nukleinsäure II Restriktionsverdau Ligation Transformation Dr. Sandra Scheiblhofer Nukleasen • Enzyme, die Nukleinsäuren abbauen • Phosphidoesterasen – hydrolytische Spaltung der Bindung zwischen Nukleotiden • Pankreas-Nukleasen: Rolle bei Verdauung von Nukleinsäuren in Nahrungsmitteln • Intrazellulär: Prozessierung verschiedener RNA-Spezies, DNAAbbau bei der Apoptose Nukleasen Angriffspunkt am Ende oder innerhalb der Nukleotidkette: Exo- oder Endonukleasen Spezifität für RNA oder DNA: Ribonukleasen oder Desoxyribonukleasen Proximale oder distale Spaltung zu dem Nukleotid, das an der 3‘-Position der attackierten Bindung liegt: p- bzw. d-Typ; dabei entsteht 5‘ oder 3‘ Phosphatende! © Löffler/Petrides: Biochemie und Pathobiochemie Restriktionsenzyme • Endonukleasen bakteriellen Ursprungs • fast 4000 verschiedene Restriktionsenzyme gereinigt + charakterisiert • > 330 Sequenzspezifitäten bekannt • besondere Rolle in der Gentechnologie (Klonierung, Mutagenese, PCR) • biologische Funktion: Schutz vor Infektion durch Viren oder Bakteriophagen • eingedrungene Fremd-DNA wird zerkleinert und inaktiviert • eigene DNA durch Modifikation (meist Methylierung) geschützt Restriktionsenzyme • Restriktions-/Modifikationssystem: spezifisch für Ursprungsorganismus – mikrobielles „Immunsystem“ • Besteht aus Restriktionsenzym in Kombination mit 1-2 modifizierenden Enzymen (DNA-Methyltransferasen) • Können separate Proteine oder Untereinheiten/Domänen eines Enzyms sein • Modifizierende Enzyme erkennen dieselbe DNA Sequenz wie das dazugehörige Restriktionsenzym, methylieren 1 Base in jedem der beiden DNA Stränge • Methylgruppen ragen an der Bindungsstelle in die Hauptkluft der DNA hinein und verhindern die Spaltung Restriktionsenzyme - Typen © Lottspeich: Bioanalytik Typ I: Restriktions- und Methylierungsaktivität; beide Stränge methyliert: keine Spaltung; ein Strang methyliert: Stelle wird erkannt und der zweite Strang methyliert; kein Strang methyliert: Stelle wird erkannt und DNA etwa 1000 bp entfernt gespalten Typ II: nur Restriktionsaktivität, produzieren Fragmente definierter Länge und mit definierten Enden; Einsatz in der Gentechnologie Typ III: Restriktions- und Methylierungsaktivität, spalten außerhalb der Erkennungssequenz an einer Stelle, die durch Abstand zur Erkennungsstelle definiert ist Typ IV: erkennen modifizierte (methylierte) DNA Restriktionsenzyme - Nomenklatur Typ II Restriktionsenzyme (= Restriktionsendonucleasen) Nomenklatur basiert auf Herkunftsorganismen Beispiele: EcoRI wurde aus Resistenzfaktor (R) des E.coli Stammes RY 13 isoliert; „I“, weil es das erste aus diesem Stamm isolierte Restriktionsenzym war BamHI als erstes Enzym aus B. amyloliquefaciens, Stamm H isoliert Restriktionsenzyme - Schnittstellen • Hohe Spezifität • Spaltung dsDNA in oder nahe der Erkennungssequenz • es entstehen 5‘-Phosphate und 3‘-OH-Enden • Schnittstelle aus mindestens 4 Basen • Meist palindromische Struktur – Sequenz der Einzelstränge vom 5‘-Ende her gelesen identisch (© Löffler/Petrides: Biochemie und Pathobiochemie) Restriktionsenzyme - Schnittstellen kohäsive Enden - sticky ends blunt ends kohäsive Enden - sticky ends © Lottspeich: Bioanalytik Restriktionsenzyme - Schnittstellen Isoschizomere = Restriktionsenzyme mit gleicher Erkennungssequenz, aber aus verschiedenen Organismen; Schnittstelle identisch oder verschieden © Lottspeich: Bioanalytik Restriktionsenzyme – spezifischer Komplex EcoRV mit passender und nicht-passender DNA © Stryer: Biochemie Praktischer Teil A. Restriktionsverdau des Plasmid-Vektors pTNT-Bet v 1 B. Agarosegel zur Trennung von Vektor und Insert C. Reinigung der DNA aus dem Agarosegel D. Ligation E. Transformation des Ligationsansatzes in kompetente Bakterien A. Restriktionsverdau 1 Unit (U) eines Restriktionsenzyms entspricht der Menge, die benötigt wird, um bei optimalen Reaktionsbedingungen 1µg der DNA des Bakteriophagen l in einem Reaktionsansatz von 50µL innerhalb einer Stunde zu spalten. Enzyme benötigen für Aktivität divalentes Kation (meist Mg2+), optimalen pH (meist 7,5-8), optimale Temperatur (meist 37°C) Restriktionspuffer enthält: Tris-Puffer MgCl2, NaCl oder KCl Sulfhydrylreagens (DTT, DTE, oder 2-ME) zum Schutz vor Oxidation Triton X-100 (reduziert Oberflächenspannung) Enzymlösung enthält DTT, Triton X-100, BSA, EDTA, 50% Glycerin A. Restriktionsverdau - Probleme Unvollständiger Restriktionsverdau • suboptimale Reaktionsbedingungen (zu wenig Enzym, zu kurze Inkubationszeit, falsche Pufferzusammensetzung (z.B. zu wenig MgCl2)) • Zu hohe Salzkonzentration in der DNA Probe (manche Enzyme sind sensitiv gegenüber Ionen wie Na+ oder K+): DNA sollte nicht mehr als 25% des Reaktionsansatzes ausmachen • Enzym ist durch Methylierung der DNA inhibiert Star Aktivität: das Enzym spaltet an einer anderen Stelle als der Standardsequenz • • • • Zu viel Enzym Zu hohe Glycerinkonzentration (>5% v/v) Zu lange Inkubationszeit Falscher Verdaupuffer A. Restriktionsverdau Eco RI (75) Bet v 1 (495 bp) SalI (570) pTNT-Bet v 1 3342 bp Beta-lactamase (Ampr) coding region B. Agarosegel • Nukleinsäuren sind innerhalb eines weiten pH Bereiches negativ geladen (Ladungsträger: negativ geladene Phosphatgruppen) • Im Gegensatz zu Proteinen ist bei Nukleinsäuren das Verhältnis von Molekulargewicht zu Ladung konstant • Unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten in der Gelmatrix durch Größenunterschiede der Moleküle • Zusätzliche Faktoren: Agarosekonzentration, Spannung, Laufpuffer, interkalierende Farbstoffe • Tris-Acetat-EDTA-Puffer: Vorteile: Fragmente können leichter aus Gel gereinigt werden, schärfere DNA-Banden, Nachteil: geringe Pufferkapazität • Tris-Borat-EDTA-Puffer: für lange Elektrophoresen oder bei hohen Feldstärken, bessere Auftrennung kleiner Fragmente (<2kb) B. Agarosegel • • • • DNA wird auf das Gel mit Hilfe von Auftragspuffern aufgetragen Erhöhen durch Glycerin, Ficoll, oder Saccharose die Dichte der Lösung Lassen dadurch die Lösung in die Geltaschen absinken Enthalten Farbstoffe (Bromphenolblau, Xylencyanol) – Anhaltspunkt für Wanderung der DNA • Bromphenolblau wandert ungefähr so schnell wie DNA-Fragment mit 300bp • Längenstandards zur Bestimmung der Fragmentgrößen – durch gezielte Spaltung bestimmter Plasmid- oder Phagen-DNA mit Restriktionsenzymen © Thermofisher Scientific B. Agarosegel - Färbemethoden • Ethidiumbromid: organischer Fluoreszenzfarbstoff, interkaliert (starkes Mutagen!) bevorzugt in dsDNA, schwächer in ssDNA oder RNA • Reduziert Mobilität der DNA um ca. 15% • Durch UV-Licht (254-366nm) anregbar, emittiert bei 590nm (orange-rot) • Bindung an DNA verstärkt Fluoreszenz, Färbung trotz freiem Ethidiumbromid im Gel gut sichtbar • Kann direkt dem Gel und dem Laufpuffer zugesetzt werden • Alternativ: Färbung des Gels nach dem Lauf • Ermöglicht Nachweis von bis zu 10ng dsDNA • Alternativen: Fluoreszenzfarbstoffe auf Basis unsymmetrischer Cyanine • SYBR-Green, TOTO, YOYO, JOJO,… • Weniger mutagen, teilweise sensitiver, mitunter Anregung durch Laser erforderlich C. Reinigung der DNA über Silica-Membran • hohe Konzentration des chaotropen Salzes Guanidin Isothiocyanat denaturiert Proteine (Nukleasen) und zerstört die Hydrathülle der DNA • Negativ geladene DNA bindet mit hoher Affinität über OH-Brücken an positiv geladene Silica Partikel • Verunreinigungen werden weggewaschen • Elution erfolgt in H2O oder Puffer mit niedrigem Salzgehalt © Promega Corp. D. Ligation • DNA Ligase ist ein Enzym, das Einzelstrangbrüche in der DNA repariert • In einer ATP-abhängigen Reaktion wird eine Phosphodiesterbrücke zwischen einer 3‘-Hydroxyl und einer 5‘-Phosphorylgruppe gebildet picture from MIT OpenCourseWare picture from UVM Genetics & Genomics Wiki D. Ligation • In der Molekularbiologie wird die T4 DNA Ligase z.B. verwendet, um ein Insert aus einem Vektor in einen anderen Vektor einzufügen (= klonieren) picture from www.addgene.org YGOI = your gene of interest D. Ligation • Im Praktikum werden wir das Insert Bet v 1 (cDNA, die für das HauptBirkenpollenallergen kodiert) aus dem Vektor pTNT-Bet v 1 herausschneiden und wieder in den gleichen Vektor zurückligieren. • Als Kontrolle setzen wir einen Ligationsansatz an, der nur den geöffneten Vektor enthält. Wenn der Restriktionsverdau vollständig war, sollte der Vektor nicht religieren. E. Transformation • Transformation: Veränderung der genetischen Eigenschaften einer Zelle durch Aufnahme von genetischem Material (in unserem Fall einer Plasmid DNA) • E.coli Stamm XL1-blue: 1. Derivat des E.coli Stammes K12 („Sicherheitsstamm“ – für die Pathogenität verantwortliche Gene für Adhäsionsfaktoren, Invasionsfaktoren, Toxine, Oberflächenstrukturen fehlen) 2. rekombinationsdefizient (recA-): keine unerwünschten Rekombinationen innerhalb der DNA • Kompetente Bakterien: Chemisch modifizierte Zellen, die leichter DNA über die Zellmembran aufnehmen können E. Transformation • Kompetenz kann durch zweiwertige Kationen (Ca, Mg, Mn, Rb) erzeugt werden • Negativ geladene DNA wird von negativ geladenen Molekülen in der Zellmembran abgestoßen – diese Ladungen werden durch die Zugabe der Kationen ausgeglichen • DNA kann an die Zellmembran binden E. Transformation • Durch Kühlung auf 4°C wird die Interaktion zwischen den zweiwertigen Kationen und der Zellmembran verstärkt und die Lipidmembran stabilisiert. • Durch einen anschließenden Hitzeschock (90 Sekunden bei 42°C) entsteht ein Temperaturgradient zwischen Umgebungsmedium und Innerem der Zelle, wodurch ein Flüssigkeitsstrom durch die sogenannten Adhäsionszonen ins Innere der Zelle entsteht. E. Transformation from http://pharmaxchange.info E. Transformation • Wir verwenden ein Protokoll von Inoue (Gene 96:23-28): • Zellen wachsen bis in die logarithmische Phase (viele Adhäsionszonen) und werden dann in Transformationspuffer gewaschen, gelöst und eingefroren • Enthält MnCl2 und CaCl2 • Zellen werden auf Eis aufgetaut und mit DNA auf Eis für 10min inkubiert • 90 Sekunden Heat Shock • Zugabe von LB Medium OHNE Antibiotikum • Inkubation für 20min, 37°C, 200rpm (Antibiotikaresistenz wird ausgebildet) • Ausplattieren auf Agaroseplatten mit Antibiotikum Ergebnis Geschnittener Vektor alleine Es erfolgt keine Ligation, da EcoRI und SalI keine kompatiblen Enden erzeugen Vektor + Insert Erfolgreiche Ligation
