PR Nucleinsäure 2

Kursteil 3: Nucleinsäure II
Lerninhalt: Restriktionsverdau, Ligation, Transformation von Bakterien
Hintergrund:
Im Praktikumsbeispiel der Vorwoche haben Sie aus einer Bakterienkultur den Plasmid Vektor
pTNT-Bet v 1 gereinigt und die Konzentration Ihrer DNA-Probe bestimmt. Nun wird mit den
2 Restriktionsenzymen EcoRI und SalI das Insert (Bet v 1) herausgeschnitten. Der Verdau
wird anschließend auf ein 1%-iges Agarosegel aufgetragen, um Vektor von Insert zu trennen.
Nach der Elektrophorese schneiden Sie die entsprechenden Banden aus dem Gel aus und
reinigen Sie mit Hilfe eines Kits (Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System, Promega) die
DNA aus dem Gel. Anschließend werden in einem Ligationsansatz die beiden DNA Proben
wieder vereint. Als Kontrolle dient eine Ligation ohne Insert. Chemisch kompetente Bakterien
vom Stamm E.coli XL1-blue werden mit den Ligationsansätzen transformiert und auf
Ampicillin-hältigen LB-Agarplatten ausplattiert. Nach einer über Nacht Inkubation der
Platten auf 37°C kann man die Bildung von Bakterienklonen auf den Platten beobachten.
Aufgabenstellung der Versuche:
A. Restriktionsverdau eines Plasmid-Vektors (pTNT-Bet v 1)
B. Agarosegel zur Trennung von Vektor und Insert
C. Reinigung der DNA aus dem Agarosegel
D. Ligation
E. Transformation des Ligationsansatzes in kompetente Bakterien
Durchführung:
A. Restriktionsverdau von pTNT-Bet v 1:
Verwendet man Standard Restriktionsenzyme, so entspricht ein Unit (U) der Menge an
Enzym, die 1µg DNA des Bakteriophagen λ in 1 Stunde bei 37°C in einem
Reaktionsvolumen von 50µL verdaut. In der Regel verwendet man jedoch 5-10U pro µg
Plasmid DNA. Während früher für unterschiedliche Enzyme unterschiedliche Puffer
verwendet wurden, gibt es heute von den meisten Firmen optimierte Puffersysteme, die mit
(fast) allen Enzymen funktionieren. Durch diese optimierten Puffer ist eine Inkubationszeit
von 5-15 Minuten oft ausreichend. Zuviel Glyzerin im Reaktionsansatz kann Star-Aktivität
(star activity; das Enzym spaltet an einer anderen Stelle als der Standarderkennungssequenz)
begünstigen. Da Restriktionsenzyme in Glyzerin gelagert werden, sollte der Anteil an
Enzym(en) maximal 10% des Reaktionsansatzes ausmachen (max. 4µL Enzym auf 40µL).
 Setzen Sie in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß folgenden Restriktionsverdau an:
2µg Plasmid DNA (pTNT-Bet v 1)
1µL EcoRI (10U/µL)
1µL SalI (10U/µL)
4µL 10x Fast Digest Green Puffer
Mit H2O auf 40µL Gesamtvolumen auffüllen
 Der Verdau wird für 15 Minuten bei 37°C in einem Heizblock oder Wasserbad
inkubiert.
 Vor dem Auftrag auf das Agarosegel wird das Eppendorf-Reaktionsgefäß kurz
abzentrifugiert, um evtl. Kondensat aus dem Deckel zu entfernen.
B. Agarose-Gelelektrophorese:
Sie verwenden ein 1%iges Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Agarosegel und tragen Ihren gesamten
Restriktionsverdau sowie einen Größenstandard auf. Um die DNA zu färben verwenden wir
Midori Green DNA Stain (Nippon Genetics), ein Farbstoff der bereits vor dem Gießen direkt
in die Gellösung gegeben wird. Dadurch kann auf ein Färben nach dem Gellauf verzichtet
werden. Auf 50mL Agaroselösung kommen 2µL Midori Green Farbstoff. Im Gegensatz zu
Ethidiumbromid ist Midori Green weitgehend ungiftig und kann mit dem Restmüll entsorgt
werden.
Der Fast Digest Green Puffer sowie der Größenstandard enthalten bereits einen Ladepuffer
und können direkt auf das Gel aufgetragen werden. Der Gelladepuffer ist notwendig, damit
die Probe in den Probenslot absinken kann. Normalerweise bestehen solche Ladepuffer aus
TAE Puffer, Glyzerin oder Ficoll (um die Dichte zu erhöhen) und verschiedenen Farbstoffen,
damit der Fortschritt der Elektrophorese leichter beobachtet werden kann. Typische Farbstoffe
sind Bromphenolblau (blau), Xylencyanol-Blau (violett) und Orange G (gelb).
 Da im Slot nur ca. 20µL Platz haben, wird der Verdau auf 2 x 20µL aufgeteilt. Vom
Größenstandard (GeneRuler 1kB ladder, Fermentas) werden 5µL aufgetragen.
 Das Gel läuft bei 100 Volt für ca. 15 Minuten.
 Da das Gel bereits den DNA-Farbstoff (Midori Green) enthält, muss hinterher nicht
mehr gefärbt werden.
C. Reinigung der DNA aus dem Agarosegel mittels Wizard SV Gel and PCR Clean-Up
System:
Nach der Elektrophorese werden die Vektor- und die Insert-Banden aus dem Agarosegel
ausgeschnitten und die DNA mittels einer Mini-Säulchen-Präparation gereinigt. Das
verwendete System nutzt die Tatsache, dass DNA in der Gegenwart chaotroper Salze wie
Guanidin Isothiocyanat über hydrophobe Interaktionen an Silica-Membranen bindet. Durch
Zentrifugation der gelösten Gelstücke durch die Membran erfolgt die Bindung der DNA an
die Membran. Anschließend wird die DNA gewaschen und mit H2O eluiert. Mit Hilfe des
verwendeten Kits können DNA Fragmente zwischen 100bp und 10kB aus TAE oder TBE
Agarosegelen gereinigt werden. Die maximale Bindungskapazität der Säulchen beträgt etwa
40µg.
 Heizen Sie einen Heizblock auf 50°C auf.
 Beschriften Sie 2 Eppendorf-Reaktionsgefäße mit „Vektor“ bzw. „Insert“, wiegen Sie
die beiden ab, und notieren Sie das Gewicht.
 Schneiden Sie mit Hilfe einer Skalpellklinge die DNA Banden möglichst knapp aus
dem Agarosegel aus.
 Um zu verhindern, dass die DNA degradiert (Strangbrüche), sollte das Gel nur kurz
mit UV-Licht (Schutzbrille!) beleuchtet werden.
 Bestimmen Sie das Gewicht der ausgeschnittenen Agarosestücke.
 Pipettieren Sie 10µL Membrane Binding Solution pro 10mg Gelgewicht zu den beiden
Proben.
 Vortexen Sie die Proben und inkubieren Sie sie für 10 Minuten auf 50°C. Dazwischen
wird immer wieder gevortext, bis sich die Gelstücke vollständig aufgelöst haben.
 Um zu verhindern, dass ein Teil der Probe am Deckel klebt, werden die
Reaktionsgefäße anschließend kurz abzentrifugiert.
 Setzen Sie eine Minisäule pro Probe in ein frisches 2mL Eppendorf-Reaktionsgefäß
ohne Deckel.
 Pipettieren Sie Ihre Proben (maximal 700µL!) auf die Säulchen und inkubieren Sie
diese für 1 Minute bei Raumtemperatur. Sollte das Volumen an Membran Binding
Solution, das Sie zugegeben haben, größer als 350µL sein, müssen Sie die Säulchen
nochmals beladen!
 Zentrifugieren Sie die Säulchen für 1 Minute bei 16,000xg.
 Verwerfen Sie die durchzentrifugierte Flüssigkeit.
 Beladen Sie die Säulchen evtl. nochmals.
 Pipettieren Sie jeweils 700µL Membrane Wash Solution auf die Säulchen und
zentrifugieren Sie bei 16,000xg für 1 Minute.
 Verwerfen Sie wiederum die durchzentrifugierte Flüssigkeit.
 Wiederholen Sie diesen Waschschritt mit 500µL Membrane Wash Solution – diesmal
mit 5 Minuten Zentrifugation!
 Zentrifugieren Sie nach Entleeren der Eppendorf-Reaktionsgefäße die leeren Säulchen
nochmals für 1 Minute bei 16,000xg, um Reste von EtOH zu entfernen.
 Platzieren Sie die Säulchen in frische Eppendorf-Gefäße ohne Deckel.
 Pipettieren Sie zum Eluieren der DNA 20µL Nuclease-freies H2O direkt auf die Mitte
der Säulchen.
 Inkubieren sie 1 Minute bei RT und zentrifugieren sie anschließend 1 Minute bei
16,000 x g.
 Bestimmen Sie die Konzentration Ihrer beiden DNA Proben im Photometer:
Pipettieren Sie jeweils 4µL Eluat zu 76µL TE Puffer (1:20 Verdünnung) und messen
Sie die Absorption bei 260nm (Zur Erinnerung: A260 von 1 entspricht einer
Konzentration von 50µg/mL dsDNA).
D. Ligation:
Bei einer sticky end Ligation wird normalerweise ein molares Verhältnis Insert:Vektor von
3:1 gewählt (bei blunt end Ligationen 1:1). In dsDNA beträgt das durchschnittliche
Molekulargewicht pro Nukleotid 607.4 Dalton. Daraus können wir das Molekulargewicht des
Vektors (2847bp) und des Inserts (495bp) berechnen. Pro Ligationsansatz werden in der
Regel 100–200ng Gesamt-DNA eingesetzt. In dem folgenden Excel Sheet können sie den
Ligationsansatz einfach berechnen (Aktivieren durch Doppelklick).
Gesamtmenge (ng)
Vektorlänge (bp)
Insertlänge (bp)
Konz. Vektor (ng/µl)
Konz Insert (ng/µl)
Insert:Vektor
200
2847
495
65
35
3 : 1
benötigte DNA
Vektor
Insert
76.0 fMol
228.0 fMol
1729267.8 g/mol
300663 g/mol
entspricht
entspricht
Ligationsansatz
4 µl
1 µl
2.0 µl
2.0 µl
11.0 µl
131.4 ng
68.6 ng
5 x Rapid Ligation Buffer
T4 Ligase
Vektor
Insert
Wasser
Pipettieren Sie folgende beiden Ligationsansätze:
Ansatz A
4µL 5 x Rapid Ligation Buffer
1µL T4 Ligase
xµL Vektor (laut Kalkulation)
yµL Insert (laut Kalkulation)
auf 20µL mit H2O auffüllen
Ansatz B (Kontrolle)
Wie Ansatz A, jedoch statt dem Insert H2O
Inkubieren Sie die beiden Ansätze für 15 Minuten bei Raumtemperatur und stellen Sie sie
dann auf Eis.
E. Transformation:
Die beiden Ligationsansätze werden in chemisch kompetente Bakterien vom Stamm E.coli
XL1-blue transformiert.
 Heizen Sie einen Heizblock oder ein Wasserbad auf 42°C auf.
 Lassen Sie die Bakterien langsam auf Eis auftauen.
 Geben Sie jeweils 100µL Bakterien zu den beiden Ligationsansätzen. Vermeiden Sie
dabei, die Bakterien auf- und abzupipettieren!




Inkubieren Sie die Proben für 5min auf Eis.
Inkubieren Sie die beiden Proben für 90 Sekunden auf 42°C (Hitzeschock).
Stellen Sie die Proben danach sofort wieder auf Eis.
Mischen Sie die Bakterien in 12mL Röhrchen mit jeweils 1mL LB-Medium (ohne
Ampicillin!)
 Stellen Sie die Kulturen für 20 Minuten auf 37° in einen Bakterienschüttler (Bakterien
exprimieren -Lactamase und werden dadurch resistent gegen Ampicillin).
 Plattieren Sie jeweils 100µL Kultur mit Hilfe eines Drigalski-Spatels auf Ampicillinhältigen (100µg/mL) LB-Agarplatten aus.
Nach einer über Nacht Inkubation der Kulturplatten auf 37°C sollten theoretisch nur auf der
Platte mit dem „echten“ Ligationsansatz Klone zu sehen sein, nicht aber auf der
Kontrollplatte. Da ein Restriktionsverdau aber nie 100% vollständig ist, erwarten wir uns
lediglich signifikant weniger Klone auf der Kontrollplatte!