Kursteil 2: Nukleinsäure II

Kursteil 2: Nukleinsäure II
Lerninhalt: Restriktionsverdau, Ligation, Transformation von Bakterien
Hintergrund:
Im Praktikumsbeispiel in Teil 1 haben Sie aus einer Bakterienkultur den Plasmidvektor
pTNT-Bet v 1 gereinigt und die Konzentration Ihrer DNA-Probe bestimmt. Nun wird mit den
2 Restriktionsenzymen EcoRI und SalI das Insert (Bet v 1) herausgeschnitten. Der Verdau
wird anschließend auf ein 1%-iges Agarosegel aufgetragen, um Vektor von Insert zu trennen.
Nach der Elektrophorese schneiden Sie die entsprechenden Banden aus dem Gel aus und
reinigen Sie mit Hilfe eines Kits (GenUP Gel Extraction Kit, biotechrabbit) die DNA aus dem
Gel. Anschließend werden in einem Ligationsansatz die beiden DNA Proben wieder vereint.
Als Kontrolle dient eine Ligation ohne Insert. Chemisch kompetente Bakterien vom Stamm
E.coli XL1-blue werden mit den Ligationsansätzen transformiert und auf Ampicillin-hältigen
LB-Agarplatten ausplattiert. Nach einer Übernacht-Inkubation der Platten auf 37°C kann man
die Bildung von Bakterienklonen auf den Platten beobachten.
Aufgabenstellung der Versuche:
A. Restriktionsverdau eines Plasmid-Vektors (pTNT-Bet v 1)
B. Agarosegel zur Trennung von Vektor und Insert
C. Reinigung der DNA aus dem Agarosegel
D. Ligation
E. Transformation des Ligationsansatzes in kompetente Bakterien
Durchführung:
A. Restriktionsverdau von pTNT-Bet v 1:
Verwendet man Standard Restriktionsenzyme, so entspricht ein Unit (U) der Menge an
Enzym, die 1 µg DNA des Bakteriophagen λ in 1 Stunde bei 37°C in einem
Reaktionsvolumen von 50 µL verdaut. In der Regel verwendet man jedoch 5-10 U pro µg
Plasmid DNA. Während früher für unterschiedliche Enzyme unterschiedliche Puffer
verwendet wurden, gibt es heute von den meisten Firmen optimierte Puffersysteme, die mit
(fast) allen Enzymen funktionieren. Durch diese optimierten Puffer ist eine Inkubationszeit
von 5-15 Minuten oft ausreichend. Zuviel Glyzerin im Reaktionsansatz kann Star-Aktivität
(star activity; das Enzym spaltet an einer anderen Stelle als der Standarderkennungssequenz)
begünstigen. Da Restriktionsenzyme in Glyzerin gelagert werden, sollte der Anteil an
Enzym(en) maximal 10% des Reaktionsansatzes ausmachen (max. 4 µL Enzym auf 40 µL).
 Setzen Sie in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß folgenden Restriktionsverdau an:
2 µg Plasmid DNA (pTNT-Bet v 1)
1 µL EcoRI (10U/µL)
1 µL SalI (10U/µL)
4 µL 10x Fast Digest Green Puffer
Mit H2O auf 40 µL Gesamtvolumen auffüllen
 Der Verdau wird für 15 Minuten bei 37°C in einem Heizblock oder Wasserbad
inkubiert.
 Vor dem Auftrag auf das Agarosegel wird das Eppendorf-Reaktionsgefäß kurz
abzentrifugiert, um evtl. Kondensat aus dem Deckel zu entfernen.
B. Agarose-Gelelektrophorese:
Sie verwenden ein 1%iges Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Agarosegel und tragen Ihren gesamten
Restriktionsverdau sowie einen Größenstandard auf. Um die DNA zu färben, verwenden wir
Midori Green DNA Stain (Nippon Genetics), ein Farbstoff, der bereits vor dem Gießen direkt
in die Gellösung gegeben wird. Dadurch kann auf ein Färben nach dem Gellauf verzichtet
werden. Auf 50 mL Agaroselösung kommen 2 µL Midori Green Farbstoff. Im Gegensatz zu
Ethidiumbromid ist Midori Green weitgehend ungiftig und kann mit dem Restmüll entsorgt
werden.
Der Fast Digest Green Puffer sowie der Größenstandard enthalten bereits einen Ladepuffer
und können direkt auf das Gel aufgetragen werden. Der Gelladepuffer ist notwendig, damit
die Probe in den Probenslot absinken kann. Normalerweise bestehen solche Ladepuffer aus
TAE Puffer, Glyzerin oder Ficoll (um die Dichte zu erhöhen) und verschiedenen Farbstoffen,
damit der Fortschritt der Elektrophorese leichter beobachtet werden kann. Typische Farbstoffe
sind Bromphenolblau (blau), Xylencyanol-Blau (violett) und Orange G (gelb).
 Da im Slot nur ca. 20 µL Platz haben, wird der Verdau auf 2 x 20 µL aufgeteilt. Vom
Größenstandard (GeneRuler 1kB ladder, Fermentas) werden 5 µL aufgetragen.
 Das Gel läuft bei 100 Volt für ca. 15 Minuten.
 Da das Gel bereits den DNA-Farbstoff (Midori Green) enthält, muss hinterher nicht
mehr gefärbt werden.
C. Reinigung der DNA aus dem Agarosegel mittels GenUP Gel Extraction Kit
(biotechrabbit):
Nach der Elektrophorese werden die Vektor- und die Insert-Banden aus dem Agarosegel
ausgeschnitten und die DNA mittels einer Mini-Filter-Präparation gereinigt. Das verwendete
System nutzt die Tatsache, dass DNA in der Gegenwart chaotroper Salze wie Guanidin
Isothiocyanat über hydrophobe Interaktionen an Glasfasern bindet. Durch Zentrifugation der
gelösten Gelstücke durch den Glasfaserfilter erfolgt die Bindung der DNA an den Filter.
Anschließend wird die DNA gewaschen und mit einem Elutionspuffer eluiert. Mit Hilfe des
verwendeten Kits können DNA Fragmente zwischen 100 bp und 30 kB aus TAE oder TBE
Agarosegelen gereinigt werden. Die maximale Bindungskapazität der Säulchen beträgt etwa
20 µg.
 Heizen Sie einen Heizblock oder ein Wasserbad auf 50°C auf.
 Beschriften Sie 2 Eppendorf-Reaktionsgefäße mit „Vektor“ bzw. „Insert“.
 Schneiden Sie mit Hilfe einer Skalpellklinge die DNA Banden möglichst knapp aus
dem Agarosegel aus.
 Um zu verhindern, dass die DNA degradiert (Strangbrüche), sollte das Gel nur kurz
mit UV-Licht (Schutzbrille!) beleuchtet werden.
 Pipettieren Sie 650 µL Puffer „DISSOLVING“ zu den beiden Proben.
 Vortexen Sie die Proben und inkubieren Sie sie für 10 Minuten auf 50°C. Dazwischen
wird immer wieder gevortext, bis sich die Gelstücke vollständig aufgelöst haben.
 Um zu verhindern, dass ein Teil der Probe am Deckel klebt, werden die
Reaktionsgefäße anschließend kurz abzentrifugiert.
 Fügen Sie 50 µL „OPTIMIZATION“ Puffer hinzu und mischen Sie durch Auf- und
Abpipettieren.
 Setzen Sie einen Minifilter pro Probe in ein 2 mL „Collection Tube“.
 Pipettieren Sie Ihre Proben auf die Minifilter.
 Zentrifugieren Sie die Säulchen für 1 Minute bei 10,000 x g.
 Verwerfen Sie die durchzentrifugierte Flüssigkeit und verwenden Sie das „Collection
Tube“ nochmals.
 Pipettieren Sie jeweils 700 µL Puffer „Wash B“ auf den Filter im „Collection Tube“
und zentrifugieren Sie bei 10,000xg für 1 Minute.
 Verwerfen Sie wiederum die durchzentrifugierte Flüssigkeit.
 Wiederholen Sie diesen Waschschritt mit 700 µL Puffer „Wash B“.
 Verwerfen Sie die durchzentrifugierte Flüssigkeit und verwenden Sie das „Collection
Tube“ nochmals.
 Zentrifugieren Sie den leeren Filter im „Collection Tube“ nochmals für 2 Minuten bei
maximaler Geschwindigkeit, um Reste von EtOH zu entfernen.
 Platzieren Sie die Säulchen in frische 1,5 ml „Elution Tubes“.
 Pipettieren Sie zum Eluieren der DNA 20 µL „ELUTION“ Puffer direkt auf die Mitte
des Filters.
 Inkubieren sie 1 Minute bei RT und zentrifugieren sie anschließend 1 Minute bei
8,000 x g.
 Bestimmen Sie die Konzentration Ihrer DNA Proben im Photometer.
D. Ligation:
Bei einer sticky end Ligation wird normalerweise ein molares Verhältnis Insert:Vektor von
3:1 gewählt. In dsDNA beträgt das durchschnittliche Molekulargewicht pro Nukleotid 607.4
Dalton. Daraus können wir das Molekulargewicht des Vektors (2847 bp) und des Inserts (495
bp) berechnen. Pro Ligationsansatz werden in der Regel 100–200 ng Gesamt-DNA eingesetzt.
In dem folgenden Excel Sheet können sie den Ligationsansatz einfach berechnen (Aktivieren
durch Doppelklick).
Gesamtmenge (ng)
Vektorlänge (bp)
Insertlänge (bp)
Konz. Vektor (ng/µl)
Konz Insert (ng/µl)
Insert:Vektor
200
2847
495
65
35
3 : 1
benötigte DNA
Vektor
Insert
76,0 fMol
228,0 fMol
1729267,8 g/mol
300663 g/mol
entspricht
entspricht
Ligationsansatz
4 µl
1 µl
2,0 µl
2,0 µl
11,0 µl
131,4 ng
68,6 ng
5 x Rapid Ligation Buffer
T4 Ligase
Vektor
Insert
Wasser
Pipettieren Sie folgende beiden Ligationsansätze:
Ansatz A
4 µL 5 x Rapid Ligation Buffer
1 µL T4 Ligase
x µL Vektor (laut Kalkulation)
y µL Insert (laut Kalkulation)
auf 20 µL mit H2O auffüllen
Ansatz B (Kontrolle)
Wie Ansatz A, jedoch statt dem Insert H2O
Inkubieren Sie die beiden Ansätze für 15 Minuten bei Raumtemperatur und stellen Sie sie
dann auf Eis.
E. Transformation:
Die beiden Ligationsansätze werden in chemisch kompetente Bakterien vom Stamm E.coli
XL1-blue transformiert.
 Heizen Sie einen Heizblock oder ein Wasserbad auf 42°C auf.
 Lassen Sie die Bakterien langsam auf Eis auftauen.
 Geben Sie jeweils 100 µL Bakterien zu den beiden Ligationsansätzen. Vermeiden Sie
dabei, die Bakterien auf- und abzupipettieren!
 Inkubieren Sie die Proben für 5 min auf Eis.
 Inkubieren Sie die beiden Proben für 90 Sekunden auf 42°C (Hitzeschock).
 Stellen Sie die Proben danach sofort wieder auf Eis.
 Mischen Sie die Bakterien in 12 mL Röhrchen mit jeweils 1 mL LB-Medium (ohne
Ampicillin!)
 Stellen Sie die Kulturen für 20 Minuten auf 37° in einen Bakterienschüttler (Bakterien
exprimieren β-Lactamase und werden dadurch resistent gegen Ampicillin).
 Plattieren Sie jeweils 100 µL Kultur mit Hilfe eines Drigalski-Spatels auf Ampicillinhältigen (100 µg/mL) LB-Agarplatten aus.
Nach einer Übernacht-Inkubation der Kulturplatten auf 37°C sollten theoretisch nur auf der
Platte mit dem „echten“ Ligationsansatz Klone zu sehen sein, nicht aber auf der
Kontrollplatte. Da ein Restriktionsverdau aber nie 100% vollständig ist und zudem auch eine
Ligation zweier Vektormoleküle stattgefunden haben könnte, erwarten wir uns lediglich
signifikant weniger Klone auf der Kontrollplatte!