Kursteil 2: Nukleinsäure II Lerninhalt: Restriktionsverdau, Ligation, Transformation von Bakterien Hintergrund: Im Praktikumsbeispiel in Teil 1 haben Sie aus einer Bakterienkultur den Plasmidvektor pTNT-Bet v 1 gereinigt und die Konzentration Ihrer DNA-Probe bestimmt. Nun wird mit den 2 Restriktionsenzymen EcoRI und SalI das Insert (Bet v 1) herausgeschnitten. Der Verdau wird anschließend auf ein 1%-iges Agarosegel aufgetragen, um Vektor von Insert zu trennen. Nach der Elektrophorese schneiden Sie die entsprechenden Banden aus dem Gel aus und reinigen Sie mit Hilfe eines Kits (GenUP Gel Extraction Kit, biotechrabbit) die DNA aus dem Gel. Anschließend werden in einem Ligationsansatz die beiden DNA Proben wieder vereint. Als Kontrolle dient eine Ligation ohne Insert. Chemisch kompetente Bakterien vom Stamm E.coli XL1-blue werden mit den Ligationsansätzen transformiert und auf Ampicillin-hältigen LB-Agarplatten ausplattiert. Nach einer Übernacht-Inkubation der Platten auf 37°C kann man die Bildung von Bakterienklonen auf den Platten beobachten. Aufgabenstellung der Versuche: A. Restriktionsverdau eines Plasmid-Vektors (pTNT-Bet v 1) B. Agarosegel zur Trennung von Vektor und Insert C. Reinigung der DNA aus dem Agarosegel D. Ligation E. Transformation des Ligationsansatzes in kompetente Bakterien Durchführung: A. Restriktionsverdau von pTNT-Bet v 1: Verwendet man Standard Restriktionsenzyme, so entspricht ein Unit (U) der Menge an Enzym, die 1 µg DNA des Bakteriophagen λ in 1 Stunde bei 37°C in einem Reaktionsvolumen von 50 µL verdaut. In der Regel verwendet man jedoch 5-10 U pro µg Plasmid DNA. Während früher für unterschiedliche Enzyme unterschiedliche Puffer verwendet wurden, gibt es heute von den meisten Firmen optimierte Puffersysteme, die mit (fast) allen Enzymen funktionieren. Durch diese optimierten Puffer ist eine Inkubationszeit von 5-15 Minuten oft ausreichend. Zuviel Glyzerin im Reaktionsansatz kann Star-Aktivität (star activity; das Enzym spaltet an einer anderen Stelle als der Standarderkennungssequenz) begünstigen. Da Restriktionsenzyme in Glyzerin gelagert werden, sollte der Anteil an Enzym(en) maximal 10% des Reaktionsansatzes ausmachen (max. 4 µL Enzym auf 40 µL). Setzen Sie in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß folgenden Restriktionsverdau an: 2 µg Plasmid DNA (pTNT-Bet v 1) 1 µL EcoRI (10U/µL) 1 µL SalI (10U/µL) 4 µL 10x Fast Digest Green Puffer Mit H2O auf 40 µL Gesamtvolumen auffüllen Der Verdau wird für 15 Minuten bei 37°C in einem Heizblock oder Wasserbad inkubiert. Vor dem Auftrag auf das Agarosegel wird das Eppendorf-Reaktionsgefäß kurz abzentrifugiert, um evtl. Kondensat aus dem Deckel zu entfernen. B. Agarose-Gelelektrophorese: Sie verwenden ein 1%iges Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Agarosegel und tragen Ihren gesamten Restriktionsverdau sowie einen Größenstandard auf. Um die DNA zu färben, verwenden wir Midori Green DNA Stain (Nippon Genetics), ein Farbstoff, der bereits vor dem Gießen direkt in die Gellösung gegeben wird. Dadurch kann auf ein Färben nach dem Gellauf verzichtet werden. Auf 50 mL Agaroselösung kommen 2 µL Midori Green Farbstoff. Im Gegensatz zu Ethidiumbromid ist Midori Green weitgehend ungiftig und kann mit dem Restmüll entsorgt werden. Der Fast Digest Green Puffer sowie der Größenstandard enthalten bereits einen Ladepuffer und können direkt auf das Gel aufgetragen werden. Der Gelladepuffer ist notwendig, damit die Probe in den Probenslot absinken kann. Normalerweise bestehen solche Ladepuffer aus TAE Puffer, Glyzerin oder Ficoll (um die Dichte zu erhöhen) und verschiedenen Farbstoffen, damit der Fortschritt der Elektrophorese leichter beobachtet werden kann. Typische Farbstoffe sind Bromphenolblau (blau), Xylencyanol-Blau (violett) und Orange G (gelb). Da im Slot nur ca. 20 µL Platz haben, wird der Verdau auf 2 x 20 µL aufgeteilt. Vom Größenstandard (GeneRuler 1kB ladder, Fermentas) werden 5 µL aufgetragen. Das Gel läuft bei 100 Volt für ca. 15 Minuten. Da das Gel bereits den DNA-Farbstoff (Midori Green) enthält, muss hinterher nicht mehr gefärbt werden. C. Reinigung der DNA aus dem Agarosegel mittels GenUP Gel Extraction Kit (biotechrabbit): Nach der Elektrophorese werden die Vektor- und die Insert-Banden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und die DNA mittels einer Mini-Filter-Präparation gereinigt. Das verwendete System nutzt die Tatsache, dass DNA in der Gegenwart chaotroper Salze wie Guanidin Isothiocyanat über hydrophobe Interaktionen an Glasfasern bindet. Durch Zentrifugation der gelösten Gelstücke durch den Glasfaserfilter erfolgt die Bindung der DNA an den Filter. Anschließend wird die DNA gewaschen und mit einem Elutionspuffer eluiert. Mit Hilfe des verwendeten Kits können DNA Fragmente zwischen 100 bp und 30 kB aus TAE oder TBE Agarosegelen gereinigt werden. Die maximale Bindungskapazität der Säulchen beträgt etwa 20 µg. Heizen Sie einen Heizblock oder ein Wasserbad auf 50°C auf. Beschriften Sie 2 Eppendorf-Reaktionsgefäße mit „Vektor“ bzw. „Insert“. Schneiden Sie mit Hilfe einer Skalpellklinge die DNA Banden möglichst knapp aus dem Agarosegel aus. Um zu verhindern, dass die DNA degradiert (Strangbrüche), sollte das Gel nur kurz mit UV-Licht (Schutzbrille!) beleuchtet werden. Pipettieren Sie 650 µL Puffer „DISSOLVING“ zu den beiden Proben. Vortexen Sie die Proben und inkubieren Sie sie für 10 Minuten auf 50°C. Dazwischen wird immer wieder gevortext, bis sich die Gelstücke vollständig aufgelöst haben. Um zu verhindern, dass ein Teil der Probe am Deckel klebt, werden die Reaktionsgefäße anschließend kurz abzentrifugiert. Fügen Sie 50 µL „OPTIMIZATION“ Puffer hinzu und mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren. Setzen Sie einen Minifilter pro Probe in ein 2 mL „Collection Tube“. Pipettieren Sie Ihre Proben auf die Minifilter. Zentrifugieren Sie die Säulchen für 1 Minute bei 10,000 x g. Verwerfen Sie die durchzentrifugierte Flüssigkeit und verwenden Sie das „Collection Tube“ nochmals. Pipettieren Sie jeweils 700 µL Puffer „Wash B“ auf den Filter im „Collection Tube“ und zentrifugieren Sie bei 10,000xg für 1 Minute. Verwerfen Sie wiederum die durchzentrifugierte Flüssigkeit. Wiederholen Sie diesen Waschschritt mit 700 µL Puffer „Wash B“. Verwerfen Sie die durchzentrifugierte Flüssigkeit und verwenden Sie das „Collection Tube“ nochmals. Zentrifugieren Sie den leeren Filter im „Collection Tube“ nochmals für 2 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit, um Reste von EtOH zu entfernen. Platzieren Sie die Säulchen in frische 1,5 ml „Elution Tubes“. Pipettieren Sie zum Eluieren der DNA 20 µL „ELUTION“ Puffer direkt auf die Mitte des Filters. Inkubieren sie 1 Minute bei RT und zentrifugieren sie anschließend 1 Minute bei 8,000 x g. Bestimmen Sie die Konzentration Ihrer DNA Proben im Photometer. D. Ligation: Bei einer sticky end Ligation wird normalerweise ein molares Verhältnis Insert:Vektor von 3:1 gewählt. In dsDNA beträgt das durchschnittliche Molekulargewicht pro Nukleotid 607.4 Dalton. Daraus können wir das Molekulargewicht des Vektors (2847 bp) und des Inserts (495 bp) berechnen. Pro Ligationsansatz werden in der Regel 100–200 ng Gesamt-DNA eingesetzt. In dem folgenden Excel Sheet können sie den Ligationsansatz einfach berechnen (Aktivieren durch Doppelklick). Gesamtmenge (ng) Vektorlänge (bp) Insertlänge (bp) Konz. Vektor (ng/µl) Konz Insert (ng/µl) Insert:Vektor 200 2847 495 65 35 3 : 1 benötigte DNA Vektor Insert 76,0 fMol 228,0 fMol 1729267,8 g/mol 300663 g/mol entspricht entspricht Ligationsansatz 4 µl 1 µl 2,0 µl 2,0 µl 11,0 µl 131,4 ng 68,6 ng 5 x Rapid Ligation Buffer T4 Ligase Vektor Insert Wasser Pipettieren Sie folgende beiden Ligationsansätze: Ansatz A 4 µL 5 x Rapid Ligation Buffer 1 µL T4 Ligase x µL Vektor (laut Kalkulation) y µL Insert (laut Kalkulation) auf 20 µL mit H2O auffüllen Ansatz B (Kontrolle) Wie Ansatz A, jedoch statt dem Insert H2O Inkubieren Sie die beiden Ansätze für 15 Minuten bei Raumtemperatur und stellen Sie sie dann auf Eis. E. Transformation: Die beiden Ligationsansätze werden in chemisch kompetente Bakterien vom Stamm E.coli XL1-blue transformiert. Heizen Sie einen Heizblock oder ein Wasserbad auf 42°C auf. Lassen Sie die Bakterien langsam auf Eis auftauen. Geben Sie jeweils 100 µL Bakterien zu den beiden Ligationsansätzen. Vermeiden Sie dabei, die Bakterien auf- und abzupipettieren! Inkubieren Sie die Proben für 5 min auf Eis. Inkubieren Sie die beiden Proben für 90 Sekunden auf 42°C (Hitzeschock). Stellen Sie die Proben danach sofort wieder auf Eis. Mischen Sie die Bakterien in 12 mL Röhrchen mit jeweils 1 mL LB-Medium (ohne Ampicillin!) Stellen Sie die Kulturen für 20 Minuten auf 37° in einen Bakterienschüttler (Bakterien exprimieren -Lactamase und werden dadurch resistent gegen Ampicillin). Plattieren Sie jeweils 100 µL Kultur mit Hilfe eines Drigalski-Spatels auf Ampicillinhältigen (100 µg/mL) LB-Agarplatten aus. Nach einer Übernacht-Inkubation der Kulturplatten auf 37°C sollten theoretisch nur auf der Platte mit dem „echten“ Ligationsansatz Klone zu sehen sein, nicht aber auf der Kontrollplatte. Da ein Restriktionsverdau aber nie 100% vollständig ist und zudem auch eine Ligation zweier Vektormoleküle stattgefunden haben könnte, erwarten wir uns lediglich signifikant weniger Klone auf der Kontrollplatte!