Zum Ablauf der Invasion von Virusnucleinsäure in Gewebekulturzellen

INVASION VON VIRUSNUCLEINSAURE IN GEWEBEKULTURZELLEN
899
Z u m Ablauf der Invasion v o n Virusnucleinsäure in G ew eb ek u ltu rzellen *
Von G.
K och
Aus den Laboratorien der Stiftung zur Erforschung der spinalen Kinderlähmung und der
Multiplen Sklerose (Prof. Dr. H. P e t t e ) , Universitätskrankenhaus Hamburg-Eppendorf
(Z. Naturforschg. 18 b, 899— 902 [1963] ; eingegangen am 8. März 1963)
The adsorption and penetration of poliovirus-RNA in tissue culture cells are two processes which
can be separated experimentally. The process of adsorption can be interrupted by diluting the
RNA at certain times after seeding whereas the process of penetration can be followed by tthe
application of RNase. The experimental results reported lead to the following conclusions:
1. The cells are sensitized for uptake of RNA by hypertonic saline.
2. As long as the cells are in hypertonic saline the majority of RNA remains in a state susceptible
to RNase.
3. At the time the cell environment is changed from hypertonicity to isotonicity the adsorbed RNA
enters the cells and is no longer sensitive to the action of external RNase even when the RNase
is now applied in hypertonic solution.
Über die Kinetik der A dsorption von Virus-RNS
an Wirtszellen in Einschicht-Zellkulturen wurde in
einer vorausgegangenen Arbeit berichtet1. Die Ad­
sorption der RNS an Amnionzellen wurde durch
V erdünnung der RNS und Waschen der Zellen zu
verschiedenen Zeiten nach der Beimpfung von P etri­
schalenkulturen gestoppt. Als Maß für die A dsorp­
tion der RNS diente dabei die Anzahl der induzier­
ten Plaques, die bei dieser Versuchsanordnung bis
zur 8. —12. min nach der Infektion gleichmäßig zu­
nimmt und das Maximum nach 20 —25 min Inkuba­
tion erreicht. Die mitgeteilten Untersuchungen 1 lie­
ferten jedoch nur vorläufige Hinweise über den Me­
chanismus der RNS-Penetration oder der RNS-Aufnahme durch die Zellen. Um einen Einblick in den
Ablauf der Nucleinsäure-Invasion zu gewinnen,
haben wir die Zellkulturen 2, 4, 8, 10, 12 und
15 min nach der RNS-Beimpfung unter verschiede­
nen experimentellen Bedingungen mit RNase behan­
delt. Die gewonnenen Ergebnisse werden hier m it­
geteilt.
die angewandten Methoden wurden bereits mitgeteilt 3.
Lösungen: Als Standard-Lösung verwenden wir eine
mit 0,01-m. Tris gepufferte Salzlösung, die alle Salze
aus E a g l e s Medium (ausgenommen NaHC03) in den
entsprechenden Konzentrationen enthält (TBS). Durch
Erhöhung der NaCl-Konzentrationen auf 1,1-m. und
des ph auf 7,8 wird hypertone TBS hergestellt.
Einwirkung von RNase auf RNS-beimpfte Zellkul­
turen: Zu den Einschicht-Zellkulturen wurde RNase in
den angegebenen Konzentrationen in 1 ml TBS oder
hypertoner TBS 2, 4, 8, 10, 12 und 15 min nach der
RNS-Beimpfung zugegeben. 1 min später wurde die
RNase-Lösung wieder abgesaugt und nach Beendigung
des Experimentes wurden alle Kulturen mit Agar­
medium überschichtet. Als Kontrolle wurden zu Paral­
lelkulturen zu gleichen Teilen 1 ml TBS oder 1 ml
hypertoner TBS zugegeben und ebenfalls nach 1 min
abgesaugt. In einigen Experimenten wurden die Kul­
turen vor der RNase-Zugabe mit TBS gewaschen.
Ergebnisse
Einfluß von Ribonuclease in hypertoner Salzlösung
Die Untersuchungen wurden mit der isolierten RNS
von Poliovirus Typ I, Stamm Mahoney, durchgeführt.
Die infektiöse RNS wurde aus infizierten Amnionzellen
gewonnen und durch Säulenchromatographie an methyliertem Serumalbumin weitgehend von zellulärer RNS
gereinigt2. Als Wirtszellen für den Plaquetest und die
Virusvermehrung verwenden wir den permanenten
Amnionzellstamm von Fernandes. Einzelheiten über
Das Ausmaß der Infektion von Gewebekulturzel­
len durch isolierte Virus-RNS ist von verschiedenen
Faktoren abhängig, insbesondere von der Salzkon­
zentration der Beimpfungsflüssigkeit. So wird ein
nahezu optimaler Plaquetiter in dem von uns be­
schriebenen System 3,4 bei 1,1-m. NaCl-Konzentration der RNS-Lösung erreicht. Bis zu 16 min nach
der RNS-Beimpfung läßt sich die Plaque-Induktion
noch teilweise verhindern durch Verdünnen oder
Abwaschen der noch nicht adsorbierten RNS mit
* Uber einen Teil der Befunde wurde auf dem „VIlPh
European Symposium of poliomyelitis and allied diseases
in Prag“ berichtet.
1 G. K o c h , Experientia [Basel] 16 ,4 9 0 [I960],
2 G. K o c h , O . D r e e s u . H. K u b i n s k i (in Vorbereitung).
3 G. K o c h , Z. Naturforschg. 1 5b , 656 [I960].
4 G. K o c h , S. K o e n i g u . H. E. A l e x a n d e r , Virology 10. 329
[I960].
M aterial und Methoden
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G. KOCH
900
TBS oder hypertoner TBS (Abb. 1). W ird nun
RNase (30 «g) zu den Gewebekulturen in der glei­
chen Lösung (hypertone TBS) wie die RNS zugege­
ben, so wird bis zu 15 min nach der Beimpfung
nahezu die gesamte in den Kontrollen gefundene
RNS-Infektiosität (bis zu 95%) zerstört. Das W a­
schen der Zellkulturen mit hypertoner TBS ohne
RNase, im Vergleich zum Waschen mit TBS ohne
RNase, verursacht keine Verminderung, sondern
eher eine leichte Erhöhung in der Anzahl induzier­
ter Plaques (Abb. 1).
liche Ausmaß in der inaktivierenden W irkung der
RNase in den frühen und späten Zeiten nach der
RNS-Beimpfung werden wir später eingehen.
Minuten — ►
Abb. 2. Einwirkung von RNase in isotoner Salzlösung auf
die Plaqueinduktion durch RNS in Einschicht-Zellkulturen.
30 /ug RNase in 1 ml isotoner TBS wurde zu den angegebenen
Zeiten nach der RNS-Beimpfung den Einschicht-Zellkulturen
zugegeben • ---------• . In Parallelkulturen wurde gleichzeitig
die weitere RNS-Adsorption durch Zugabe von 1 ml TBS
gestoppt x---------- x.
Minuten — ►
Abb. 1. Einwirkung von RNase in hypertoner Salzlösung auf
die Plaqueinduktion durch RNS in Einschicht-Zellkulturen.
30 jug RNase in 1 ml hypertoner TBS wurden zu den angege­
benen Zeiten nach der RNS-Beimpfung den Einschicht-Zell­
kulturen zugegeben, x ---------x: In Parallelkulturen wurde
gleichzeitig die weitere RNS-Adsorption durch Zugabe von
1 ml TBS einerseits x---------- x und Zugabe von 1 ml hyper­
toner TBS andererseits • ---------• gestoppt.
Das Eindringen der RNS in die Zellen kann dem­
nach in hypertonen Salzlösungen nicht oder nur so
weit ablaufen, daß die RNS noch durch RNase inak­
tiviert werden kann, wobei offenbleibt, ob die RNS
durch RNase extrazellulär zerstört wird oder ob die
RNase in hypertoner TBS der RNS in die Zellen zu
folgen und dort die RNS zu inaktivieren vermag.
Einfluß von Ribonuclease in isotoner Salzlösung
In weiteren Experimenten wurden zu EinschichtZellkulturen zu verschiedenen Zeiten nach der RNSBeimpfung 1 ml TBS (Kontrolle) und 30 ug RNase
in 1 ml TBS zugegeben.
Die gewonnenen Ergebnisse sind in der Abb. 2
wiedergegeben. Die Anzahl der induzierten Plaques
wird hier nur in den ersten 4 —8 min nach der Be­
impfung stark reduziert. Zu späteren Zeiten vermag
die RNase nur noch einen bestimmten Anteil der
RNS-Infektiosität zu zerstören. Auf das unterschied­
Da RNase-Zugabe in 1,1-ra. Salzlösung (Abb. 1)
nahezu alle RNS-Infektiosität bis zu 20 min nach
der RNS-Beimpfung der Zellen zerstört, dagegen die
gleiche Menge an RNase in isotoner Salzlösung nur
zu einer geringen Reduktion der Anzahl induzierter
Plaques führt, wird die RNS ab 8 min nach der Be­
impfung, vermutlich im Augenblick des Wechsels
der Zellen vom hypertonen Zellmilieu (RNS-Beimp­
fung) zu isotonem Zellmilieu (RNase-Zugabe). dem
Eingriff der RNase-W irkung entzogen. Für diesen
Befund bieten sich mehrere Deutungsmöglichkeiten
an:
1. In hypertoner Salzlösung ist die Zellwand­
permeabilität erhöht und die RNase gelangt wie die
infizierende RNS ins Zellcytoplasma, wo sie die
RNS-Infektiosität zerstört.
2. Beim Übergang von hypertoner zu isotoner
Salzlösung wird die RNS so an Zellwandbausteine
gebunden, daß die RNase die RNS nicht mehr zu in­
aktivieren vermag.
3. Im Augenblick des Wechsels von hypertoner
zu isotoner Zellumgebungslösung wird durch die ins
Zellinnere nun einströmende Flüssigkeit die bereits
an die Zellwand angelagerte RNS ins Zellcytoplasma
eingeschleust.
Gegen die unter 1. beschriebene Deutung spricht
die Beobachtung, daß RNase keinen Einfluß auf die
Infektion von Zellen durch intakte Yiren ausübt,
wenn sie vor, während oder nach der Beimpfung
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INVASION VON VIRUSNUCLEINSÄURE IN GEWEBEKULTURZELLEN
zugegeben wird a. Es darf somit angenommen wer­
den, daß auch bei der Infektion von Zellen mit RNS
die RNase nur so lange eine Infektion verhindern
kann, wie die RNS sich zumindest noch teilweise
außerhalb der Zellen befindet. Die nach Punkt 2 an­
genommene Bindung von RNS an Zellwandbausteine
in isotoner TBS sollte durch hypertone TBS rück­
gängig gemacht werden können. Eine Vorbehand­
lung infizierter K ulturen mit isotoner Salzlösung
dürfte demnach keinen Einfluß auf die RNase-Wirkung in hypertoner TBS ausüben, während beim
Vorliegen des unter 3 beschriebenen Mechanismus
gerade durch diese Vorbehandlung die RNase-Wirkung in hypertoner TBS verhindert wird.
(An dieser Stelle sei darauf hingewiesen, daß
hypertone Salzlösungen die RNase-Wirkung hem­
men. Diese Hemmwirkung ist jedoch nur bei sehr
niederen RNase-Konzentrationen deutlich erkennbar
und braucht daher bei der Deutung unserer Unter­
suchungen nicht berücksichtigt zu werden.)
ausgesetzt. W ird RNase danach zugegeben, so wer­
den die in Abb. 3 wiedergegebenen Befunde erhal­
ten. RNase in hypertoner TBJ vermag nunm ehr die
Anzahl der induzierten Plasques nicht mehr signifi­
kant zu reduzieren.
Auch die bis zu 8 min nach der Beimpfung noch
nachweisbare RNase-Wirksamkeit in isotoner Salz­
lösung wird nach dem Waschen der Zellen nur noch
bis zu 4 min nach der Beimpfung beobachtet. Daraus
könnte geschlossen werden, daß die RNS-Penetration schon in hypertoner Salzlösung abzulaufen be­
ginnt, und zwar bis zu 10 min nach der Zugabe so
weit, daß sie dann beim Übergang zu isotoner Salz­
lösung momentan ablaufen kann, während sie bis zu
8 min nur so weit abgelaufen ist, daß sie beim
Übergang zu isotoner Lösung für die Penetration
noch m eßbare Zeit benötigt.
Die hier beschriebenen Befunde sprechen ganz
eindeutig für eine schnelle RNS-Invasion beim
Übergang von hypertoner zu isotoner Zellumgebung,
wie oben unter Punkt 3 aufgeführt wurde.
Auswirkungen einer Vorbehandlung RNS-infizierter
Zellkulturen mit isotoner Salzlösung auf die RNaseSensitivität der Plaqueinduktion
Um weitere Anhaltspunkte über den Medianismus
des Eindringens von RNS in Gewebekulturen zu er­
halten, wurden die RNS-beimpften Zellkulturen vor
Zugabe von RNase in hypertoner oder isotoner TBS
kurzzeitig der Einw irkung einer isotonen Salzlösung
Minuten —►
Abb. 3. Einwirkung von RNase in hypertoner und isotoner
Salzlösung auf die Plaqueinduktion durch RNS in EinschichtZellkulturen nach Vorbehandlung der beimpften Kulturen
mit isotoner Salzlösung. 30 jug RNase in 1 ml isotoner TBS
• ----------• oder 1 ml hypertoner TBS • --------- • wurde zu
den Kulturen 30 sec nach einer Behandlung mit isotoner Salz­
lösung zugegeben. In Parallelkulturen wurde zweimal 1 ml
TBS zugegeben x----------x.
5 G.
l e x a n d e r , J. M . M o u n t a in , K . S p r u n t
Federat. Proc. 17, 256 [1958].
6 K. A. O. E l l e m , J. S . C o l t e r , Virology 15, 113 [1961].
O.
K
och,
van
D
H.
E. A
u
.
Diskussion
In vorangegangenen Arbeiten haben andere Auto­
ren 6’ 7 und wir 3’ 4 bereits darauf hingewiesen, daß
die Erhöhung der RNS-Infektiosität durch hyper­
tone Salzlösungen in erster Linie durch Verände­
rung der Zellaufnahmefähigkeit für RNS bedingt ist.
Diese Annahme wird auch durch die hier mitgeteil­
ten Befunde bestätigt. D arüber hinaus konnte in der
vorliegenden Arbeit gezeigt werden, daß die RNSAdsorption und die RNS-Penetration zwei trennbare
Vorgänge sind, wobei für die RNS-Adsorption und
die RNS-Penetration bestimmte, jedoch verschiedene
Zellumgebungsfaktoren von Bedeutung sind.
In diesem Zusammenhang sind experimentelle
Befunde von B orris und K och 8 von Bedeutung, die
zeigen, daß die RNS-Adsorption an in isotoner Salz­
lösung suspendierten Zellen schneller und zu einem
wesentlich höheren Maße stattfindet als an Zellen in
hypertoner Salzlösung, und daß die Bindung der
RNS in isotoner Salzlösung an die Zellwand nicht
ausreicht, um die RNS der RNase-W irkung zu ent­
ziehen. Wenn nun trotz geringer RNS-Adsorption
in hypertonen Lösungen eine höhere RNS-Infektiosität erzielt wird und weiterhin in hypertoner Salz7
J. J.
ton,
am m e,
8
E.
H o l l a n d , B . H . H o y e r , L . C. M c L a r e n
J. exp. Medicine 112, 821 [1960].
B o r r is s
u
.
G.
K och,
u
.
J. T.
Z. Naturforschg., im Druck.
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S yv er-
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INVASION VON VIRUSNUCLEINSÄURE IN GEWEBEKULTURZELLEN
lösung eine vollständige RNS-Penetration nicht statt­
findet. die RNS vielmehr erst in isotoner Lösung in
die Zelle penetriert, dann ist es unwahrscheinlich,
daß die in hvpertoner Salzlösung vorliegende RNSKonfiguration für die RNS-Penetration von Bedeu­
tung ist.
Bei der Infektion mit intakten Viren kann durch
RNase zu keiner Zeit die Infektion von Gewebe­
kulturzellen m eßbar verhindert w erd en 5. Bei der
Infektion mit RNS gelingt eine Infektiositäts-Inaktivierung auch n u r so lange, wie noch zumindest ein
Teil der RNS sich außerhalb der Zellen befindet.
Erwähnenswert erscheinen in diesem Zusammen­
hang weiterhin Untersuchungen von G o l d b e r g und
G r e e n 9, K u b i n s k i 10 und P a l a c i o s 11, in denen ge­
zeigt wird, daß ein großer Anteil der zellulären RNS
die Zellen nach Behandlung mit spezifischen Anti­
körpern in Gegenwart von Komplement verläßt, ohne
dabei die Integrität der Zellen zu zerstören. G o l d ­
b e r g und G r e e n weisen darauf hin, daß diese Aus­
schleusung von RNS durch eine Störung des osmoti­
schen Gleichgewichtes der Zellen ermöglicht und be­
dingt wird. Eine solche Störung wird sicher auch
durch eine Behandlung der Zellen mit hypertonen
Lösungen und einen folgenden raschen Übergang zu
isotonem Zellmilieu hervorgerufen. Wie wir bereits
früher mitgeteilt h a b e n 3’ 4, schrumpfen Zellen in
hypertonen Lösungen beträchtlich und geben intra­
zelluläre Flüssigkeit nach außen ab. Beim Übergang
von hyperton zu isoton nehmen die Zellen Flüssig­
keit auf. und dabei kommt es möglicherweise — wie
nach Antiserum-Behandlung — zu einer Steigerung
der Zellwandpermeabilität, und mit dem Einströ­
men der Flüssigkeit gelangt die RNS in das Zell­
cytoplasma.
Aus den vorliegenden Befunden geht hervor, daß
die Adsorptionskinetik der RNS an Gewebekultur­
zellen nur verfolgt werden kann, wenn die RNS-Adsorption zu gegebenen Zeiten durch Zugabe von
RNase-freien Lösungen unterbrochen wird.
9 B. G o l d b e r g u . H. G r e e n , J. exp. Medicine 109, 505 [1959],
und J. biophysic. biochem. Cytol. 7, 645 [I960].
10 H. K u b i n s k i , Z. Immunitätsforschg., im Druck.
11 O. P a l a c o i s , Z. Immunitätsforschg., im Druck.
12 K . S p r u n t , S . K o e n ig u . W. E. A l e x a n d e r , Proc. Soc. exp.
Biol. Med. 108, 755 [1961],
Weitere Untersuchungen mit niederen RNaseKonzentrationen haben ergeben, daß bereits 3 'IO -1
und 3 • 10“ 2 jug RNase/ml in hvpertoner TBS 40 bis
50 bzw. 20 —30% der in Kontrollen gemessenen
Infektiosität zerstören. Bei Zugabe von RNase-haltigen Medien muß deshalb ein falsches Bild der RNSAdsorptionsrate gewonnen w erden6’ 9> 12, da bei
einer solchen Versuchsanordnung nicht der Anteil
an adsorbierter, sondern vielmehr der an bereits
penetrierter RNS gemessen wird und ein Teil der
adsorbierten RNS durch RNase-Wirkung wieder ent­
fernt wird. Somit werden auch Unterschiede in der
Kinetik der Adsorption, wie sie von u n s 1 und
S p r u n t und M itarbb.12 gefunden wurden, verständ­
lich.
Fräulein M. S i c h a r t sei für gewissenhafte Assistenz
bei der Durchführung der Experimente gedankt.
Die Arbeit wurde durchgeführt mit Unterstützung
der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t
und des V e r e i n s z u r F ö r d e r u n g d e r Er f o r s c h u n g und B e k ä m p f u n g der s p i n a ­
l e n K i n d e r l ä h m u n g e. V., Bielefeld.
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