microfluidics for studying cellular signaling and - ETH E

DISS. ETH No. 21524
MICROFLUIDICS FOR STUDYING CELLULAR SIGNALING
AND PERFORMING MICROSCALE TISSUE ANALYSIS
A dissertation submitted to
ETH ZURICH
For the degree of
Doctor of Sciences
presented by
ROBERT DEAN LOVCHIK
M. Sc., Fachhochschule Vorarlberg
born on September 21,1976
Citizen of Egnach (TG)
accepted on recommendation of
Prof. Dr. Viola Vogel
Dr. Emmanuel Delamarche
Prof. Dr. Martin E. Schwab
Prof. Dr. Petra Dittrich
2013
ABSTRACT
Microfluidics, the manipulation of liquids using small structures in the tens of micrometers, is
an emerging field of research and development that serves as a continuously growing toolbox
for researchers in life sciences and medicine. The broad range of applications, where
microfluidics have been applied, spans from nanoliter-volume chemical synthesis to
microscale capillary-driven diagnostics, single cell analysis, high-throughput drug screening,
electrophoretical separation of DNA, protein crystallization and many more. These
applications take advantage of some useful capabilities of microfluidics, such as the small
size of the devices, the ability to perform separations and detection with high resolution and
selectivity, fast response, low costs, high precision and the possibility of performing
experiments/analyses which can hardly been done using conventional methods. Such
applications include, for example, single cell handling, electro-osmotic flow manipulation or
confining liquids hydrodynamically over surfaces.
In the work presented here, microfluidic systems have been developed as tools to address
specific biomedical challenges in the context of brain cell signaling and for local analysis of
tissue samples in pathology. Understanding the pathways of inflammatory signaling cascades
for unraveling the complex mechanisms of diseases such as Parkinson's or Alzheimer's is
highly challenging. The major mediators are still unknown and the sequential flux of
molecular information between different cell types of the brain is undefined. Microfluidic
networks (MFNs) were used to plate precisely populations of primary brain cells and study
their response in the context of neuroinflammation. The developed MFNs comprised
chambers to accommodate either microglia, astrocytes or neurons, microchannels for
bringing the cells in fluidic connection and user-chip interfaces for manipulating the fluid
flow using external pumps and valves. For use with primary brain cells, the MFNs were
equipped with features that allowed the incubation of the cells in an “open” MFN using
standard cell culture techniques and closing of the MFN for subsequent microfluidic
experiments. In addition to testing the device performance in terms of handling, microfluidic
functionality and reliability, biological experiments were performed to examine the
neuroprotective capability of astrocytes derived from different regions of the brain. For
example, hippocampal neurons were cultured in one chamber of a MFN, while either
hippocampal or cortical astrocytes were grown in an adjacent chamber. An oxygen-glucose
deprivation (OGD) protocol was applied to the cells being either in fluidic communication or
isolated. After a recovery period of 24 h, the cells were subject to viability assays. The results
of this study showed a significant neuroprotective role played by cortical astrocytes (2.9 %
propidium iodide (PI) positive neurons), whereas neurons in fluidic communication with
hippocampal astrocytes did not show significant differences in viability compared to isolated
neurons (both ~19 % PI positive neurons). Similar results were found when the cells were
exposed to another neuroinflammatory stress, namely the exposure to amyloid β fibrils. The
developed MFNs and the method shown proved to be a valuable, versatile and flexible
analytical solution to unravel how different cell types of the brain contribute to the crosstalk
events leading to neurodegeneration.
The amount of information received from pathological staining procedures (immunohistochemistry, IHC) is most often crucial for the best possible treatment of cancer patients.
There is a critical need for a flexible method to extract more high-quality information from
tissue sections for both drug discovery and clinical pathology. We developed a microfluidic
technology called the microfluidic probe (MFP), which allows local (bio)chemical processing
of samples in a non-contact scanning mode and hypothesize that this tool may be of great
value for pathologist to analyze tissue samples, allowing multiplexed, local and fast staining
for markers, while being conservative with reagents and tissue. The main component of the
MFP is a microfabricated head comprising at least two microchannels, one to inject and the
other to aspirate liquid at the apex of the head. The MFP head is brought close to the sample
to be processed and simultaneous injection and aspiration of a processing liquid within
immersion liquid, results in hydrodynamic confinement (~100 μm diameter) of the
processing liquid on the sample. This work demonstrates the capability of the MFP to
perform microscale immunohistochemistry (μIHC) on cancerous tissue thyroid and breast
tissue sections in a multiplexed and adaptive manner. Within the standard workflow of IHC,
the MFP was used to deliver locally antibodies against specific cancer markers to tissue
sections. Subsequent conventional processing of the tissue sections with secondary antibodies
and chromogen solutions then revealed the staining results. By varying the residence time of
the MFP on the tissue, different staining intensities were achieved within a single experiment.
This allows for easy adaption of staining conditions using only one tissue section, even for
multiple antibodies, because the processing liquid can be exchanged during an experiment.
Good staining contrasts were found at 5 to 20 s residence time, which is considerably shorter
than the 30 min recommended by the supplier of the antibodies. The capability of the MFP to
stain for multiple markers on a single tissue section was exemplified by delivering 3 different
antibodies to invasive ductal carcinoma breast tissue and in addition multiplexed staining was
performed on individual cores of tissue microarrays including the formation of 100 μm wide
hematoxylin lines for counterstaining. Performing μIHC with the MFP proved to be useful in
several aspects. (1) It allows for staining specific regions of a tissue, interpret the results and
reprocess another region with adapted conditions, (2) the non-processed areas of a tissue
remain unchanged, which improves the contrast for histological analysis, (3) very low
volumes of agents are needed (e.g. only a few nanoliters of antibody solution per staining
spot), (4) multiple processing solutions can be used, including counterstain agents, and (5)
due to the possibility of scanning the hydrodynamic flow confinement, even gradients can be
performed, which can be particularly useful for fundamental cancer/tissue research.
ZUSAMMENFASSUNG
Die Manipulation von Flüssigkeiten mittels kleiner Strukturen im Bereich von wenigen zehn
Mikrometern, die sogenannte Mikrofluidik, ist ein wachsender Bereich in der Forschung und
Entwicklung, welcher Wissenschaftlern und Ärzten kontinuierlich neue Werkzeuge für ihre
Arbeit zur Verfügung stellt. Eine Auswahl von Anwendungen sind: Chemische Synthesen im
Nanoliterbereich, kapillar-betriebene Diagnostik im Mikrometer-Maßstab, EinzelzellAnalytik, Hochdurchsatztesten von Wirkstoffen, elektrophoretische Separierung von DNS,
Protein-Kristallisation und viele mehr. Alle diese Anwendungen nutzen Vorzüge der
Mikrofluidik, wie beispielsweise die kleine Größe der Geräte und Strukturen, die Fähigkeit
Separationen und Detektionen mit hoher Auflösung und Selektivität durchführen zu können,
die Präzision und die Möglichkeit Experimente/Analysen zu verrichten, welche mit konventionellen Methoden fast nicht durchzuführen sind. Einige Beispiele solcher Methoden wären:
das Hantieren von einzelnen Zellen, die Manipulation von Flüssigkeiten mittels elektroosmotischem Fluss oder das hydrodynamische Einbetten von Flüssigkeiten auf Oberflächen.
In der vorliegenden Arbeit wurden Mikrofluidik-Systeme entwickelt, um spezifische
biochemische Herausforderungen im Bereich der chemischen Kommunikation von
Hirnzellen und der lokalen Analyse von Gewebeproben in der Pathologie anzugehen. Es ist
eine große Herausforderung, die Signalwege von Entzündungs-Kaskaden zu untersuchen, um
ein besseres Verständnis der komplexen Mechanismen von Krankheiten wie Parkinson's oder
Alzheimer's zu erhalten. Der sequentielle Fluss von molekularen Informationen zwischen
verschiedenen Typen von Hirnzellen ist noch immer unklar. Mikrofluidische Netzwerke
(MFNs) wurden eingesetzt, um Populationen von primären Hirnzellen präzise zu platzieren
und deren Reaktion unter Neuroinflammations-Bedingungen zu studieren. Die entwickelten
MFNs enthalten Kammern um entweder Mikroglia, Astrozyten oder Neuronen aufzunehmen,
Mikrokanäle um die Zellen in fluidischen Kontakt zu bringen, sowie Anschlüsse um
Flüssigkeiten mittels externer Pumpen und Ventile zu lenken. Für Versuche mit primären
Hirnzellen, wurden die MFNs mit Strukturen versehen, welche die Inkubation der Zellen in
einem offenen MFN zulassen, wie es in der konventionellen Zellkulturtechnik üblich ist, und
welche ein dichtes Verschließen für spätere Mikrofluidik Experimente ermöglichen.
Zusätzlich zum Testen der Funktionalität der MFNs bezüglich Handhabung, fluidischer
Funktion und Zuverlässigkeit, wurden biologische Experimente durchgeführt um die
Schutzfunktion von Astrozyten aus verschiedenen Regionen des Hirns gegenüber Neuronen
zu untersuchen. Ein Beispiel dafür ist, dass Neuronen vom Hippocampus in der einen
Kammer eines MFNs kultiviert wurden und in der danebenliegenden Kammer Astrozyten
entweder vom Hippocampus oder Cortex kultiviert wurden. Die Zellen wurden einem Entzug
von Sauerstoff und Glukose (oxygen-glucose deprivation Protokoll, OGD) ausgesetzt,
entweder wenn sie in fluidischem Kontakt oder voneinander separiert waren. Nach 24
Stunden Erholungsphase, wurden die Zellen auf Ihre Vitalität hin untersucht. Die Resultate
dieser Studie zeigten eine signifikante Schutzfunktion der Astrozyten vom Cortex (2.9 %
Propidiumiodide (PI) positive Neuronen), wogegen Neuronen in fluidischem Kontakt mit
Astrozyten vom Hippocampus keine signifikanten Unterschiede gegenüber isolierten
Neuronen zeigten (beide ~19 % PI positive Neuronen). Wenn die Zellen einem anderen
Neuroinflammations-Stress, der Behandlung mit Amyloid β Fibrillen, ausgesetzt wurden,
ergaben sich vergleichbare Resultate. Die entwickelten MFNs und die gezeigte Methode
erwiesen sich als wertvolle, vielseitige und flexible analytische Lösung um Klarheit zu
verschaffen, wie verschiedene Typen von Hirnzellen zu Ereignissen, welche zur
Neurodegeneration führen, beitragen.
Die Menge an Information, welche von pathologischen Färbemethoden (Immunhistochemie,
IHC) erhalten wird, ist oftmals ausschlaggebend für die bestmögliche Behandlung von
Krebspatienten. Es besteht ein kritischer Bedarf für eine flexible Methode um mehr qualitativ
hochwertige Informationen von Gewebeschnitten zu gewinnen. Wir haben eine MikrofluidikSonde (microfluidic probe, MFP) entwickelt, welche es ermöglicht, lokal (bio)chemische
Prozesse auf Proben durchzuführen und glauben daran, dass dieses Gerät für Pathologen von
großem Wert sein könnte, um Gewebeproben lokal und schnell auf verschiedene Marker hin
zu untersuchen und dabei Reagenzien und Gewebe zu sparen. Die Hauptkomponente der
MFP ist ein mikro-fabrizierter Kopf, welcher mindestens zwei Mikrokanäle hat, welche an
der Spitze (Apex) des Kopfes ins Freie führen. Einer der Kanäle dient dazu Flüssigkeit
einzuspritzen und der zweite dazu, Flüssigkeit abzusaugen. Der MFP-Kopf wird nahe an die
zu prozessierende Probe geführt und das simultane Einspritzen und Absaugen von
Prozessflüssigkeit in wässriger Umgebung resultiert in der lokalen hydrodynamischen
Einbettung der Prozessflüssigkeit auf der Probe (~100 μm Durchmesser). Vorliegende Arbeit
demonstriert die Möglichkeit der MFP, mikro-Immunhistochemie (μIHC) auf krebsartigen
Schilddrüsen- und Brust-Gewebeschnitten auf adaptive Weise und mit Mehrfachfärbungen
durchzuführen. Innerhalb des gebräuchlichen Arbeitsflusses der IHC, wurde die MFP
eingesetzt um lokal Antikörper gegen spezifische Marker auf Gewebeschnitte zu applizieren.
Darauffolgendes, klassisches Behandeln der Schnitte mit Chromogen-Lösung brachte
anschliessend die Färberesultate zu Tage. Durch variieren der Aufenthaltsdauer der MFP auf
der Probe, konnten innerhalb eines Experiments verschiedene Intensitäten der Färbung
erreicht werden. Dies ermöglicht eine einfache Anpassung der Färbekonditionen auf nur
einem Gewebeschnitt, sogar mit verschiedenen Antikörpern, da die Prozessflüssigkeit
während eines Experiments einfach ausgetauscht werden kann. Gute Kontraste der Färbung
wurden bei einer Aufenthaltsdauer zwischen 5 und 20 Sekunden erreicht, was gegenüber den
30 Minuten, welche die Antikörper-Lieferanten empfehlen, wesentlich kürzer ist. Drei
verschiedene Antikörper wurden auf invasives duktiles Brustgewebe appliziert und zusätzlich
wurden Mehrfachfärbungen, inklusive Gegenfärbungen mit Hämatoxylin (100 μm Linien),
auf einzelnen Sektionen von Gewebe-Mikro-Feldern durchgeführt. Die Anwendung von
μIHC mittels der MFP, erwies sich als nützlich in mehreren Aspekten. (1) Sie ermöglicht das
Färben von spezifischen Regionen eines Gewebes, das Interpretieren der Resultate und das
Nachbehandeln von weiteren Regionen mit angepassten Konditionen, (2) die nicht
behandelten Regionen eines Gewebes bleiben unverändert, was den Kontrast für
histologische Untersuchungen verbessert, (3) sehr kleine Mengen an Reagenzien werden
benötigt (z.B. nur einige wenige Nanoliter Antikörperlösung pro Färbepunkt), (4) mehrere
Prozesslösungen können verwendet werden, inklusive Reagenzien zur Gegenfärbung, und (5)
durch die Möglichkeit des Scannens der MFP, können sogar Gradienten erzeugt werden, was
im Bereich der Krebs- und Gewebe-Grundlagenforschung sehr hilfreich sein kann.