embryonen, die mit Encephalitis-Virus infiziert wurden

Eigenschaften einer infektiösen Nucleinsäure-Fraktion aus Hühnerembryonen, die mit Encephalitis-Virus infiziert wurden
I I . M i t t . : Biologische Eigenschaften
V o n
EBERHARD
WECKER
Aus dem Max-Planck-Institut für Virusforschung, Abteilung für tierpathogene Virusarten, Tübingen *
( Z . N a t u r f o r s c h g . 15 b , 7 1 — 7 8 [ 1 9 6 0 ] ; e i n g e g a n g e n a m 5 . N o v e m b e r 1 9 5 9 )
Durch Nucleinsäure-Fraktionen, die aus infizierten Hühnerembryonen gewonnen wurden, wird im
bebrüteten, befruchteten Hühnerei die Vermehrung von normalem Eastern-Equine-Encephalomyelitis
(EEE)-Virus angeregt. In Gewebekulturen aus embryonalen Hühnerzellen lassen sich mit Nucleinsäure-Fraktionen Plaques erzeugen. Die Infektiosität der Nucleinsäure-Fraktionen unterliegt verschiedenen inhibitorischen Einflüssen durch Substanzen, die neben der infektiösen hochmolekularen
Ribonucleinsäure (RNS) in ihnen enthalten sind. Diese Inhibitoren können durch Alkohol-Präzipitation der RNS und durch Behandlung mit Desoxyribonuklease teilweise entfernt bzw. inaktiviert werden. Die infektiöse RNS in den Nucleinsäure-Fraktionen stammt nicht von den EEE-Virus Elementarteilchen, sondern von einem ribonuklease-empfindlichen virusspezifischen Material, welches in den
infizierten Zellen vorliegen muß.
In einer vorhergehenden Mitteilung
wurde über
R N S - P r ä p a r a t e n . Diese Autoren konnten aber wahr-
die physikalischen und chemischen Eigenschaften von
scheinlich machen, daß ihre RNS-Präparate nicht aus
1
infektiösen Nucleinsäure ( N S ) - F r a k t i o n e n berichtet,
den betreffenden Virus-Elementarteilchen selbst, son-
die aus Hühnerembryonen isoliert werden
können,
dern aus einem anderen virusspezifischen
welche mit dem Virus der amerikanischen
Pferde-
Encephalomyelitis
Typ
Ost
(EEE-Virus)
infiziert
worden waren.
D i e vorliegende II. Mitteilung beschäftigt sich mit
NS-Fraktio-
schnittlich
der
nur
Hühnerembryonen
etwa
0 , 1 Promille
korrespondierenden
besitzen
der
Infektiosität
von
Ribonucleinsäure
(RNS)-
EEEdurch-
Infektiosität
Viruspräparate.
lichen Ergebnissen waren wir schon bei
nen.
Die
D i e hier beschriebenen NS-Fraktionen aus
Virus-infizierten
den biologischen Eigenschaften solcher
Material
extrahiert wurden.
Zu
ähn-
Versuchen
g e k o m m e n , bei denen die NS-Fraktionen aus infizier-
Präparaten, die nach der Phenolmethode von GIERER
ten
und SCHRAMM
Mäusegehirnen
hergestellt
worden
waren10.
aus verschiedenen Virusarten gewon-
Einige Gründe für die relativ niedrige Infektiosität
nen werden konnten, beträgt gewöhnlich etwa 0 , 1 bis
unserer NS-Fraktionen werden im folgenden unter-
1% derjenigen der ursprünglichen V i r u s p r ä p a r a t e 2 - 6 .
sucht und diskutiert **.
2
In allen diesen Fällen stammt die infektiöse
sicher2-4
oder
zumindest
sehr
RNS
Material und Methoden
wahrscheinlich5-7
aus den betreffenden Virus-Elementarteilchen selbst.
Später
berichteten
BROWN
und
HUPPERT
STEWART
schiede zwischen
und
über
noch
SANDERS
größere
Unter-
EEE-Virus***:
11 — 12-tägige Hühnerembryonen,
die mit etwa 10 Ei-LD 5 0 infiziert waren, wurden mög-
* Jetzige Anschrift: The Wistar Institute, Philadelphia, Pa.
USA.
1
E . W E C K E R , Z . Naturforschg. 14 b, 3 7 0
[1959].
2 A. GIERER
u. G . SCHRAMM, Nature [London] 177, 702
[ 1 9 5 6 ] ; Z. Naturforschg. I I b , 138 [1956].
J. HUPPERT U. F. K. SANDERS, Nature [London] 182, 515
[1958].
9 F. B R O W N U. D. L. S T E W A R T , Virology 7, 408 [1959].
10 E. W E C K E R U. W. SCHÄFER, Z . Naturforschg. 12 b, 415 [1957].
*** Die EEE- und WEE-Stämme wurden uns freundlicherweise von Herrn Professor Dr. E . T R A U B , Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere, Tübingen, zur Verfügung gestellt.
** Über die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurde bereits
von E. W E C K E R auf dem IV. Int. Kongreß für Biochemie in
Wien, 1958; (Pergamon Press, London, New York, Paris,
Los Angeles) und W. SCHÄFER auf dem Symposion „Virus
Growth and Variation", London 1959 (University Press,
Cambridge) berichtet.
O . VAN D A M M E ,
4
5
6
7
G . KOCH,
Virology
J . M . MOUNTAIN,
5, 172
Virus-
a)
lichst unmittelbar nach dem Tode bei — 4 0 ° C eingefro-
H . E . ALEXANDER,
Infektiosität v o n
1. V i r u s p r ä p a r a t e
sowie
8
und
3
der
9
K . SPRUNT
U.
[1958].
R. M . FRANKLIN, E . W E C K E R U . C . H E N R Y , Virology 7 , 2 2 0
[1959],
J. S. COLTER, H. H. B I R D U. R. A. B R O W N , Nature [London]
179, 859 [1957].
J. S. COLTER, H. H. B I R D , A. W. M O Y E R U. R. A. B R O W N , Virology 4, 522 [1957].
F . B R O W N , R. F . SELTERS U . D . L. S T E W A R T , Nature [London]
182, 535 [1958].
8
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ren. Ein gefrorener Embryo wurde jeweils mit 3 ml
0,02-m. Phosphatpuffer pn 7,0 für 5 Min. unter Eiskühlung homogenisiert und das Homogenat 10 Min. bei
3000 Umdrehungen pro Minute (U/Min.) zentrifugiert.
Der Überstand stellt das EEE-Viruspräparat dar.
b) Western-Equine-Encephalomyelitis (WEE) -Virus:
Gewebekulturen von embryonalen Hühnerzellen wurden
in Petrischalen angesetzt. Das Medium bestand aus
E a r 1 e s Lösung, die 0,5% Laktalbumin-Hydrolysat,
0,1% Hefeextrakt und 10% Kälberserum enthielt. Einen
Tag nach Aussaat der Zellen wurden die Platten mit
etwa 107 plaquebildenden Einheiten (PBE) infiziert.
Wenn die Zellen einen ausgeprägten cytopathogenen
Effekt zeigten (meist nach etwa 24 Stdn.), wurde das
Medium abgezogen und nach Abzentrifugieren restlicher
Zellbestandteile bei —40 °C eingefroren. Aus insgesamt
2 l solcher WEE-haltiger Medien wurde durch mehrere
Zyklen hoch- und niedertouriger Zentrifugation sowie
durch Behandlung mit Ribo- und Desoxyribonuklease
ein gereinigtes Viruskonzentrat hergestellt.
2. I s o l i e r u n g
der
NS-Fraktionen
Die Gewinnung der NS-Fraktionen aus infizierten und
normalen Hühnerembryonen erfolgte wie in Mitteilung 1 1 beschrieben.
3.
5. H e r s t e l l u n g d e r y - G l o b u l i n F r a k t i o n e n ***
Die Präzipitation der Globuline erfolgte durch 50-proz.
Sättigung des betreffenden Serums mit Ammoniumsulfat. Die abgeschleuderten Fällungen wurden in dest.
Wasser gelöst und 2 Tage lang gegen Wasser dialysiert,
dessen pn auf etwa 7 eingestellt war. Die fertigen Dialysate wurden dann mit Wasser bis zu einer gesamten
Protein-Konzentration von etwa 1% verdünnt und anschließend die /^-Globuline bei pn 4,9 isoelektrisch gefällt. Nach Abschleudern der Präzipitate wurden die
Überstände mit NaOH wieder neutralisiert, durch Verdunsten im Dialyseschlauch auf das ursprüngliche
Serum-Volumen eingeengt und schließlich NaCl bis zur
physiologischen Konzentration zugesetzt.
6. E i n w i r k u n g v o n S e r e n a u f
N S - F r a k t i o n e n oder V i r u s p r ä p a r a te
Die Viruspräparate oder NS-Fraktionen wurden in
0.1-m. Phosphatpuffer (PH 7,5) nach Potenzen von
10 verdünnt. Zu jeder Verdünnung wurde dann ein
gleiches Volumen einer Serum- oder y-Globulin-Verdünnung im gleichen Puffer zugesetzt. Die Ansätze wurden
30 Min. bei + 4 °C gehalten. Die Austestung erfolgte
im Eitest.
Infektionsteste
7. D e s o x y r i b o n u c l e a s e (DNase)
und R i b o n u c l e a s e
(RNase)
a) Im bebrüteten, befruchteten Hühnerei
Jeweils 0,2 ml der NS-Fraktions- bzw. Virusverdünnung in 0,l-/n. Phosphatpuffer (ph 7,5) wurden in die
Amnionhöhle von 11 Tage lang bebrüteten Hühnereiern injiziert. Pro Verdünnung wurden jeweils 10 Eier
verwendet; die Verdünnungen erfolgten nach Potenzen
von 5 oder 10. Die Titer wurden nach REED und
MUENCH
11
ermittelt.
b) Im Plaque-Test
Die Plaque-Teste nach DULBECCO 12 wurden in der
früher für das Virus der klassischen Geflügelpest beschriebenen Weise auf Gewebekulturen von embryonalen
Hühnerzellen durchgeführt13.
4.
Seren**
Bei dem verwendeten EEE-Antiserum handelt es sich
um ein Kaninchenserum gegen den Stamm ..Princeton"
mit einem angegebenen Neutralisations-Index von 0,5
log. Wir bezogen dieses Serum vom Department of
Public Health, Berkeley, California.
u. H. M U E N C H , Amer. J. Hyg. 2 7 , 493 [1938].
12
R . DULBECCO, Proc. nat. Acad. Sei. USA 3 8 , 7 4 7
[1952],
13
E . W E C K E R u. W . S C H Ä F E R , Z . Naturforschg. 11 b, 1 8 1 [ 1 9 5 6 ] .
** Für die freundliche Überlassung von weiteren EEE-Antiseren sei den Herren Prof. Dr. E. T R A U B , Tübingen, Prof.
Dr. W . H E N L E , Philadelphia, Dr. M . M U S S G A Y , Tübingen,
Dr. W . McD. H A M M O N , Pittsburgh und Dr. H. R . Cox, Lederle Lab., herzlich gedankt.
*** Herrn Dr. H. D. M A T H E K A , Bundesforschungsanstalt für
Viruskrankheiten der Tiere, Tübingen, danke ich für die
Unterweisung in dieser Methode,
11
L.
J.
REED
Es handelt sich um kristallisierte Präparate der Firma
Worthington, Freehold, N. J.
8. B e s t i m m u n g d e r N u c l e i n s ä u r e Konzentration
Die Bestimmung des gesamten NS-Gehaltes (RNS
und DNS) der Fraktionen wurde uv-spektrophotometrisch nach der in der I. Mitteilung beschriebenen
Methode durchgeführt1.
9.
Ultrazentrifugation
Die Versuche wurden in einer präparativen Ultrazentrifuge der Firma Beckman Instruments, Ltd., Spinco
Modell L, durchgeführt. Die NS-Fraktionen bzw. die
Viruspräparate wurden dazu in 0,05-m. Phosphatpuffer
PH 7,0 gelöst.
Ergebnisse
1. D i e I n f e k t i o s i t ä t v o n
Sämtliche
aus
NS-Fraktionen
EEE-Virus-infizierten
Hühner-
embryonen gewonnenen NS-Fraktionen besaßen eine
nachweisbare Infektiosität für das 1 0 — 11 Tage lang
bebrütete,
befruchtete
Hühnerei.
Die
Embryonen
starben durchschnittlich innerhalb 2 4 — 4 8 Stdn. post
infectionem wie nach einer Infektion mit EEE-Virus
selbst.
Der
Infektionstiter
der NS-Fraktionen
lag
dabei im Durchschnitt um etwa 4 Potenzen nach 1 0
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unter
aus
ergibt, wurde auch bei den jetzigen Versuchen wie-
einem gleichen Ausgangsmaterial hergestellt und im
demjenigen
von
der beobachtet. Bei Viruspräparaten ist eine solche
gleichen
lineare Beziehung jedoch vorhanden (s. Tab. 2 ) . Ein
Volumen
Viruspräparaten,
aufgenommen
die
worden
waren
(s. Tab. 1 ) .
genauer Titer in PBE/ml ist deshalb nur für Viruspräparate, nicht aber für NS-Fraktionen anzugeben.
NS-Fraktion
[LD 5 0 /ml]
Viruspräparat
[LD 5 0 /ml]
Nr.
Es scheint allerdings, als läge bei den letzteren eine
annähernd lineare Proportion zwischen Verdünnung
und Plaque-Zahl bei den Verdünnungen 1 : 1 0 und
1
2
3*
4*
5*
8,1
7,3
6,5
7,7
6,3
2,9
3,3
3,1
3,7
3,2
Durchschnitt:
7,2 ± 0,9
3,3 ± 0,4
1 : 1 0 0 vor und verhielte sich nur bei unverdünnten
NS-Fraktionen die Zahl der Plaques irregulär. Aus
diesem Grunde beziehen sich in der vorliegenden
Arbeit alle Infektionstiter von NS-Fraktionen, die in
PBE/ml angegeben sind, auf die Anzahl der Plaques,
Tab. 1. Infektiosität von Viruspräparaten und NS-Fraktionen
für das 10 —11 Tage lang bebrütete, befruchtete Hühnerei.
* Die NS-Fraktionen sind durch Alkohol-Präzipitation
gereinigt.
die bei der Verdünnung 1 : 10 des betreffenden Präparates ermittelt wurden.
Auch in Gewebekulturen von embryonalen Hühnerzellen ließ sich mit Hilfe des Plaque-Testes
die
Infektiosität der NS-Fraktionen nachweisen. Ihr Infektionstiter
war
jedoch
bei
Verwendung
dieses
Systems stets geringer als im Eitest. Gerade umgekehrt verhielt sich das Virus selbst: sein Titer war
im Plaque-Test um etwa 2 Potenzen nach 1 0 höher
3
als im Eitest. Der Unterschied der Infektiosität zwischen NS-Fraktionen und korrespondierenden Viruspräparaten stieg deshalb im Plaque-Test auf etwa
7 Potenzen
nach
10
oder
mehr
an
(s.
Tab. 2 ) .
Die Geschwindigkeit der Plaque-Entstehung sowie
die Plaque-Größe waren für Virus- und NS-Fraktionen nahezu identisch.
a
b
Verdünnung
io-6
Virus
nicht
auszählbar
NS-Fraktion
10°
1
20
2
4
3
4
16
2
a
b
10 -7
127
5
3
47
9
a
b
PBE/ml**
10 -8
148
Abb. 1. Dosis-Effekt-Kurven. Kurve 1: rohe NS-Fraktion.
Kurven 2 und 3: Alkohol-präzipitierte NS-Fraktionen.
Kurve 4: intaktes EEE-Virus.re0= Zahl der geimpften
Embryonen. n = Zahl der EEE-infizierten Embryonen.
Die beschriebene Irregularität der Dosis-Effekt-
13 12
fektiosität von rohen NS-Fraktionen im bebrüteten
und befruchteten Hühnerei beobachten (s. Abb. 1 ) .
Hier war ebenfalls der Infektionserfolg bei geringe-
2,75 • 109
rer Konzentration größer als bei höherer Konzentration.
Es bestand der Verdacht, daß diese Irregularität
10- l
4
0
6
Beziehung ließ sich auch bei der Austestung der In-
6
4
5
log Verdünnung -
io-2
2
3
32
1
3
0
3
1
auf Beimengungen zurückgeht, die neben dem in-
0
7 • 101
fektiösen Prinzip in den Präparaten enthalten sind
0
101
und in höheren Konzentrationen die Einleitung der
6
0
7 •
7,9 •
1 •
102
Infektion stören.
102
Tab. 2. Plaque-Zahlen bei einem Viruspräparat und NS-Fraktionen in Abhängigkeit von der Verdünnung. ** Die PBE/ml
für die NS-Fraktionen wurden nach den Plaquezahlen bei den
Verdünnungen 1 0 - 1 ermittelt.
2. D i e
10,
in
den
wirksamen
NS-Fraktionen
W i e die Untersuchungen über die physikalischen
und
Das schon früher beschriebene Phänomen
inhibitorisch
Substanzen
chemischen
Eigenschaften
der
NS-Fraktionen
daß
ergeben hatten 1 , enthalten diese neben den infektiö-
sich mit NS-Fraktionen im Plaque-Test keine lineare
sen RNS-Molekülen mit einem Mol.-Gew. von ca.
Proportion zwischen Plaque-Zahl und Verdünnung
2 • 1 0 6 noch verschiedene Beimengungen:
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a)
kleinmolekulare Ribonucleotide,
b)
hochmolekulare D N S ,
c)
hochmolekulare Polysaccharide,
d)
kleinmolekulare Peptide oder Aminosäuren.
EnzymKonzentration
[y/ml]
RNase
1:5
1,0
0,1
0,01
0
0
0
1:10
1,0
0,1
0,01
0
0
0
10/10
10/10
9/10
9/10
1:100
1,0
0,1
0,01
0
0
0
9/10
8/10
9/10
5/10
1:1000
1,0
0,1
0,01
0
0
0
4/10
1/10
4/10
3/10
Verdünnung
NS-Fraktion
Die kleinmolekularen Beimengungen a und d können
beide dadurch entfernt werden, daß die hochmolekularen Verbindungen mittels Alkohol ausgefällt und
dadurch von ihnen getrennt werden.
Hierzu wurden ein Volumen NS-Fraktion mit 2 Volumen reinem, gekühltem Äthanol versetzt. Nach A b schleudern der meist sofort auftretenden Präzipitate
(5 M i n . 3 0 0 0 U / M i n . ) wurden diese noch zweimal mit
einem Gemisch von 0,02-m. Phosphatpuffer pn 7,0 und
Äthanol im Verhältnis 1 : 2 gewaschen. Die gewaschenen
Präzipitate wurden dann im ursprünglichen Volumen
0,02-/n. Phosphatpuffer gelöst.
W i e T a b . 3 ausweist, erhöht sich die Infektiosität
der NS-Fraktionen
ren.
Der
Verlauf
durch dieses
der
Reinigungsverfah-
Dosis-Effekt-Kurven
gleicht
Infektionserfolg
DNase
Kontrolle
7/10**
8/10
9/10
7/10
Tab. 4. Infektions-Erfolg einer alkohol-präzipitierten NSFraktion in Abhängigkeit von der Verdünnung vor und nach
der Inkubation mit DNase. ** Zähler: Zahl der gestorbenen
Embryonen. Nenner: Zahl der geimpften Embryonen.
demjenigen, der mit intaktem Virus erhalten wurde
aus den beschriebenen Versuchen hervorgeht, trifft
(s. A b b . 1 : Kurve 2 und 3 ) .
dies
Nr.
GesamtNS
Präparat
[mg/
ml]
Infektiosität
Spezifische
Infektiosität
[LD 5 0 /ml]
[LD50E**/
mg NS]
1
roh
präzipitiert
1,07
0,66
1,7
2,2
47
231
2
roh
präzipitiert
1,31
0,96
2,9
3,6
832
3550
alkohol-präzipitierte
NS-Fraktionen
weit-
dagegen
ist diese Art der Auswertung nicht zuverlässig und
Faktor
kann nur Näherungswerte geben.
3.
Das
Verhalten
der
gegenüber
4,9
Mit
4,25
Tab. 3. Zunahme der spezifischen Infektiosität von NS-Fraktionen durch Alkohol-Präzipitation. ** LD 50 -Einheiten.
A u s diesen Versuchen war zu entnehmen, daß die
niedermolekularen
für
gehend zu. Bei den rohen NS-Fraktionen
Ribonucleotide oder die nieder-
der
NS-Fraktionen
Seren
;'-Globulin-Fraktion
gegen Tabakmosaik-Virus
eines
(TMV)
Antiserums
konnten GIERER
und SCHRAMM 2 zeigen, daß intaktes T M V durch Verdünnungen des /-Globulins noch neutralisiert wurde,
welche
die
Infektiosität
einer
korrespondierenden
R N S nicht beeinflußten. Daraus konnte geschlossen
werden,
daß
die
infektiösen
RNS-Moleküle
nicht
molekularen Peptide bzw. Aminosäuren eine inhibi-
mehr über antigene Proteine verfügen, die für ihre
torische Wirkung auf die Infektiosität der Virus-RNS
Infektiosität essentiell sind.
ausüben.
Von
Leider waren die Ergebnisse, die bei derartigen
den nicht durch Präzipitation mit
entfernbaren Verunreinigungen
der
Alkohol
NS-Fraktionen
scheint die hochmolekulare D N S ebenfalls über eine
inhibitorische Aktivität zu verfügen, da die Behandlung
einer
NS-Fraktion
mit
1 y
DNase/ml
für
1 5 Min. bei Raumtemperatur die Infektiosität ebenfalls
erhöhte.
Der
irreguläre
Verlauf
der
Versuchen an unseren NS-Fraktionen gewonnen werden konnten, keineswegs ebenso schlüssig.
D i e Schwierigkeit liegt in der anscheinend außerordentlich
hohen
Labilität
der
infektiösen
RNS
gegenüber Seren schlechthin.
W i e in T a b . 5 gezeigt ist, werden NS-Fraktionen
Dosis-
durch Normalseren oder Normal-y-Globulin-Fraktio-
Effektkurven blieb in diesem Fall praktisch unver-
nen inaktiviert. Es besteht dabei ein deutlicher Zu-
ändert (s. T a b . 4 ) .
sammenhang
D i e A n g a b e der Infektiosität von NS-Fraktionen
zwischen
Protein-Konzentration
und
Inaktivierungseffekt. D i e Infektiosität der Virusprä-
in L D 5 0 / m l , berechnet nach der Methode von REED
parate wird dagegen durch Normalserum
und MUENCH n ,
kann nur dann korrekt sein, wenn
erwarten — nicht beeinflußt. Da wir die uns zur Ver-
der Verlauf der Dosis-Effektkurven regulär ist. W i e
fügung stehenden Antiseren nicht ausreichend ver-
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— wie zu
Viruspräparat
Verdünnung
Serum
NSFraktion
[LD 5 0 /ml] [LD 5 0 /ml]
SerumproteinKonzentration
[y/ml]
Diese
hervor.
Verhaltensunterschiede
Die
1:50
1:100
1:200
1:400
6,1
6,2
6,4
6,0
0,6
0,9
1,3
1,2
1230
615
307
153
Normales
KaninchenSerum
(y-GlobulinFraktion)
1:16
1:128
7,0
6,9
0
1,1
584
73
mäßig.
2"'
dieser Art.
Durch die Versuche mit Normalseren konnte noch
einem
Protein-
Effekt als solchem beruht oder auf der Gegenwart
einer Serum-RNase, wie dies von ALEXANDER und
Mitarb. angenommen wird 3 . Eine völlige Inaktivierung
1
einer
NS-Fraktion
konnten
wir
auch
nach
/2-stdg. Inkubation mit 2 0 y DNase/ml bei Raum-
temperatur beobachten, obwohl
3"
— wie vorher be-
schrieben — DNase in Konzentrationen von 1 yjml
oder weniger die Infektiosität sogar zu steigern vermag. Audi in diesem Fall ist es noch unbekannt, ob
die 2 0 y DNase-Protein/ml oder eine Verunreinigung
des Enzyms mit RNase für die Inaktivierung verantwortlich sind.
4. D a s
nach
NS-Fraktionen
Infektion
produzierte
bleiben dagegen
4"'
Material
ziert und an dieser Infektion zugrunde
NS-Frak
tionen
[LD^/ml]
log
0
9,5
1,3
3,0
3,5
7,7
9,1
0*
6,7
9,0
0
2,9
0
3,5
7,4
7.7
0
Ausgang
55 Min. 40000 U/Min.
25 y RNase
20 Min. bei 20° C
25 y DNase
20 Min. bei 20° C
Normalserum 1:100
EEE-Antiserum 1:100
3,7**
1,0
3,8
3,6
3,6
0
3.8
0
6,2
6,4
0
2,0
Tab. 6. Die Unterschiede zwischen Viruspräparaten und NSFraktionen bei verschiedenen Behandlungsverfahren. * 0 =
keine Infektiosität nachweisbar. ** Das Virus ist in NS-Fraktion aus normalen Hühnerembryonen verdünnt. *** NS-Fraktionen mit Alkohol präzipitiert.
Einfluß auf unverdünnte oder verdünnte Virusprä-
mit
die mit NS-Fraktionen
8,1
regelRNase
nachteiligen
Ausgang
0,01 y RNase
15 Min. bei 10° C
0,01 y DNase
15 Min. bei 10° C
parate, während NS-Fraktionen mit vergleichbarer
Ausgangs-Infektiosität
Hühnerembryonen,
ohne
von
Viruspräparate
[LD W /
[ P B E/
ml]
ml]
log
log
Material
Ausgang
20 y RNase
15 Min. bei 20°C
alkoholpräzipitiert
nicht entschieden werden, ob die unspezifische Inakauf
vernichtet
— wie vorher
hohe Konzentrationen
Ausgang
alkoholpräzipitiert
25 y RNase
30 Min. bei 37° C
25 y RNase
4 Stdn. bei 37° C
Fraktionen kritische Protein-Konzentration zu kom-
NS-Fraktionen
Relativ
Nr.
tralisierung von intaktem Virus unter die für NS-
von
aus Tab. 6
— diejenige von NS-Fraktionen
(20 — 25 7 / m 0
dünnen konnten, um bei noch nachweisbarer Neu-
tivierung
gehen
Alkohol
tiosität vollständig, steigert dagegen
Tab. 5. Einfluß von Normal-Serum und normalem /-Globulin
auf die Infektiosität von Viruspräparaten und NS-Fraktionen.
men, verzichteten wir zunächst auf weitere Studien
mit
selbst bei unverdünnten Viruspräparaten die Infekausgeführt
Normales
PferdeSerum
Präzipitation
infi-
geringere
schon durch eine
RNase-Konzentration
2000-mal
vollständig
inakti-
gegangen
viert werden (s. Tab. 6, Nr. 2 ) . Hochtouriges Zen-
waren, enthielten selbst wieder ein infektiöses Prin-
trifugieren in der Ultrazentrifuge verminderte die
zip. Es war die Frage zu klären, ob dieses sich von
Infektiosität von Viruspräparaten immer um einen
normalem EEE-Virus unterscheidet und z. B. Eigen-
vielfach höheren Betrag als diejenige von NS-Frak-
schaften besitzt, die denjenigen der infektiösen RNS
tionen. Dies kann nicht auf die unterschiedliche Vis-
in den NS-Fraktionen entsprechen.
kosität
Die Infektiosität von Viruspräparaten
und
NS-
der
Lösungen
zurückgeführt
werden.
In
einem Versuch (Tab. 6, Nr. 3 ) wurde ein Virusprä-
Fraktionen wird durch verschiedene Behandlungen
parat in einer NS-Fraktion aus normalen, nicht infi-
auch verschieden — häufig sogar gegenläufig — be-
zierten Hühnerembryonen
einflußt.
Ausgangs-Infektiosität gleich derjenigen einer infek-
Unauthenticated
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so verdünnt, daß
seine
tiösen NS-Fraktion war. A u d i die gesamte NS-Kon-
mittels Phenol nur dann eine infektiöse NS-Fraktion
zentration wurde auf gleiche Werte eingestellt und
gewonnen werden konnte, wenn schon beim H o m o -
beide Präparate wurden dann parallel 5 5 Min. bei
genisieren der gefrorenen Gehirne Phenol anwesend
4 0 000 U/Min.
war
zentrifugiert.
Die
Infektiosität
Viruspräparates sank dadurch um > 9 9 % ,
des
diejenige
Im Gegensatz dazu stehen die Erfahrungen von
COLTER und Mitarb. 5 ' 6 , welche die infizierten Zellen
der NS-Fraktion nur um ~ 4 0 Prozent.
Bei den Versuchen zur Identifizierung des durch
Infektion mit NS-Fraktionen in
10.
oder Gewebe in gefrorenem Zustand zunächst in der
Hühnerembryonen
Reibschale zerrieben, anschließend mit Puffer homo-
gebildeten infektiösen Prinzips beschränkten wir uns
genisierten, die Zelltrümmer abschleuderten und dann
darauf, sein Verhalten gegenüber RNase und Alko-
noch aus den Überständen durch Behandlung
hol-Präzipitation
Phenol
sowie spezifischem
Antiserum
zu
die
infektiösen
RNS-Präparate
mit
isolieren
konnten.
prüfen.
Pro Ansatz wurde jeweils ein an Infektion mit NSFraktion gestorbener Hühnerembryo in gefrorenem Zustand mit 4 ml 0,1-m. Phosphatpuffer pH 7,5 homogenisiert. Die Zelltrümmer wurden wie üblich abgeschleudert. Die betreffenden Überstände wurden in zwei Hälften geteilt, von denen jeweils die eine als Kontrolle
diente.
W i e in Tab. 7 gezeigt wird, war das infektiöse
Prinzip in solchen Hühnerembryonen nicht RNasesensibel, wurde aber durch die Behandlung mit Alkohol restlos inaktiviert. Die Infektiosität der KontrolNr.
Behandlung
[LD 50 /ml]
1
Normalserum 1:4 = Kontrolle
EEE-Antiserum 1 : 4
7,4
5,3
2
Puffer 15 Min. 20° C = Kontrolle
25 y RNase 15 Min. 20° C
7,4
8,4
3
Kontrolle
Alkohol-Präzipitation
8,0
0
Unsere bei
der Extraktion
von
EEE-infizierten
Mäusegehirnen gemachte Beobachtung ließ sich jetzt
weitgehend bei der Verwendung infizierter Hühnerembryonen bestätigen:
4 gefrorene EEE-infizierte Hühnerembryonen wurden
mit 12 ml 0,02 m. Phosphatpuffer pH 7,0 unter Eiskühlung 5 Min. lang homogenisiert. Vom Homogenat wurden 2 ml 10 Min. lang mit 3000 U/Min. bei + 4 ° C zentrifugiert. Der Überstand ist als Viruspräparat bezeichnet. Das restliche Homogenat wurde 3 Min. lang mit
13 000 U/Min. bei + 4 ° C zentrifugiert, der Uberstand
mit 20 ml 80-proz. Phenol versetzt, 8 Min. unter Kühlung kräftig geschüttelt und wieder zentrifugiert. Die
Wasserphase wurde abgezogen und dann noch 2-mal in
derselben Weise mit Phenol geschüttelt. Die weitere Aufarbeitung einschließlich der Alkohol-Präzipitation erfolgte in der üblichen Weise (s. Material und Methoden) . Bei allen Versuchen wurde das durch Alkohol gefällte Material in 0,02-m. Phosphatpuffer ph 7,0 gelöst.
Das Volumen entsprach dem des Ausgangsmaterials.
Das Viruspräparat
enthielt 7 , 2 5 L D 5 0 / m l .
Seine
Infektiosität lag also in der bei den anderen Ver-
Tab. 7. Das Verhalten des nach Infektion mit NS-Fraktion
im Hühnerembryo gebildeten infektiösen Materials.
suchen ermittelten durchschnittlichen Höhe. Die NS-
len entsprach derjenigen von Viruspräparaten,
gesamten NS-Konzentration von 9 4 0 y/ml oder eine
die
Fraktion dagegen hatte nur 2 , 0 2 L D 5 0 / m l bei einer
auf die gleiche Weise aus virusinfizierten Hühner-
spezifische
embryonen gewonnen werden können. Die Inkuba-
N S = 1 1 2 LD 5 0 -Einheiten/mg N S ( L D 5 0 E / m g N S ) .
tion von verschiedenen Virusverdünnungen mit einer
jeweils gleichen Konzentration von
EEE-Antiserum
Infektiosität
von
2 , 0 5 (log)
LD50/mg
Die durchschnittliche Infektiosität für alkohol-präzipitierte
NS-Fraktionen
beträgt
bei
der
üblichen
über Nacht bei + 4 ° C verringerte die Infektiosität
Extraktion aber 3 , 2 — 3 , 3 L D 5 0 / m l bei einer durch-
auf 1 % der Kontrolle, die auf die gleiche Weise mit
schnittlichen
Normalserum inkubiert worden war.
1,6 m g / m l . Dies entspricht einer spezifischen Infek-
Das infektiöse Prinzip aus Hühnerembryonen, die
mit NS-Fraktionen infiziert worden waren, verhielt
Gesamt-Konzentration
tiosität von 9 9 0 L D 5 0 E / m g
NS.
an
NS
von
Das ohne Phenol
homogenisierte Präparat besaß also nur etwa 7 % der
sich demnach in den genannten Richtungen ganz wie
üblichen durchschnittlichen Infektiosität bei einer ge-
intaktes EEE-Virus.
samten NS-Konzentration,
5. D a s
Ausgangsmaterial
infektiöse
für
die
RNS
daß
aus
EEE-infizierten
durchschnittlichen
die immerhin
betrug.
Seine
60%
der
spezifisdie
Infektiosität wurde dadurch auf 1 1 % des sonst durchschnittlichen Wertes herabgesetzt.
In einer vorhergehenden Arbeit hatten wir schon
berichtet,
sonst
Mäusegehirnen
Zur weiteren Klärung dieser Befunde wurde folgender Versuch angestellt:
Unauthenticated
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Die wie vorher beschrieben hergestellten Überstände
von Homogenaten wurden vor der Behandlung mit Phenol noch für 15 Min. bei Raumtemperatur mit 10 y
RNase/ml inkubiert. Die daraus gewonnene rohe und
alkohol-präzipitierte NS-Fraktion wurde dann im Ei-Test
auf Infektiosität geprüft.
In keinem der beiden Präparate war eine Infektiosität nachweisbar, obwohl die gesamte
NS-Kon-
zentration der alkohol-präzipitierten Fraktion
47%
bryonalen Hühnerzellen erzeugt werden. Der Unterschied im Infektionstiter zwischen NS-Fraktion und
korrespondierendem
Virus-Präparat, der im
Eitest
schon 1 0 4 ausmacht, erhöht sich im Plaque-Test auf
107 — 108.
In den meisten bisher veröffentlichten Arbeiten
über infektiöse V i r u s - R N S - P r ä p a r a t e 2 - 6
wird
ein
Unterschied von 2 — 3 Potenzen nach 1 0 zwischen der
Infektiosität von R N S und Virus-Präparaten angege-
des sonst üblichen Durchschnittswertes betrug.
A u s diesen Befunden ging hervor, daß schon das
ben.
In
diesen
Fällen
konnte
jedoch
mit
daß
großer
extrahierbare Ausgangsmaterial für die infektiösen
Wahrscheinlichkeit gezeigt werden,
NS-Fraktionen in einer RNase sensiblen Form vor-
tiöse R N S aus den infektiösen Virus-Elementarteil-
liegt. Im Gegensatz dazu stehen die Befunde von
chen selbst extrahiert wurde.
COLTER u n d
Bei den
die infekinfektiösen
FRANKLIN
und
NS-Fraktionen aus mit EEE-Virus infizierten Hüh-
Mengo-
bzw.
nerembryonen ist dies nicht der Fall. Homogenisiert
ge-
man nämlich die infizierten Embryonen ohne An-
zeigt werden, daß eine Behandlung der Homogenat-
wesenheit von Phenol und behandelt man erst die
Uberstände mit RNase vor der
virushaltigen Homogenat-Uberstände nach Abschleu-
Mitarb.4.
Mitarb.6
In
sowie
diesen
die von
Arbeiten
Mäuseencephalomyelitis-Virus
mit
konnte
nämlich
Phenolbehandlung
dern der Zelltrümmer mit Phenol, so sinkt die spezi-
die Infektiosität der Endprodukte nicht beeinflußt.
W e n n also im Fall der EEE-infizierten Zellen eine
RNase-Empfindlichkeit des Ausgangsmaterials nachgewiesen werden konnte, so bedeutete das zwangsläufig, daß dieses Ausgangsmaterial nicht die EEEVirus-Elementarteilchen selbst sein können, da diese
resistent
gegenüber
RNase
sind.
Gleichzeitig
war
aber dann zu vermuten, daß aus den Virus-Elementarteilchen
der
amerikanischen
Pferde-Encephalo-
myelitis mit der hier beschriebenen Methode infektiöse R N S nicht extrahiert werden kann. Eindeutig
nachgewiesen
wurde
dies
bei
einem
gereinigten
Virus-Präparat des Typs West der amerikanischen
Pferde-Encephalomyelitis ( W E E ) . Das Präparat, das
2 , 7 • 1 0 1 0 P B E / m l enthielt, wurde 3-mal mit Phenol
behandelt. Das Endprodukt enthielt keine nachweis-
fische Infektiosität (LD 5 0 -Einheiten pro mg GesamtNucleinsäure)
der Endprodukte auf
ca.
10%
der
sonst durchschnittlichen Höhe ab. COLTER und Mitarb. 5 ' 6 benützen aber grundsätzlich dieses Verfahren. Sie konnten sogar die Homogenat-Uberstände
vor der Behandlung mit Phenol noch mit RNase inkubieren, ohne daß dadurch die Infektiosität ihrer
RNS-Präparate herabgesetzt wurde 5 . Diese Feststellung wurde inzwischen bei der Herstellung
tiöser
RNS-Fraktionen
aus
mit
infek-
Mäuse-Encephalo-
myelitis-Virus infiziertem Gewebe von FRANKLIN und
Mitarb.
4
bestätigt. Wendet man aber diese Technik
im Fall von mit EEE-Virus infizierten Hühnerembryonen an,
so sind die gewonnenen
NS-Fraktionen
ohne jede nachweisbare Infektiosität.
bare N S und besaß auch keinerlei Infektiosität. Aus
Das Ausgangsmaterial für die infektiöse R N S in
WEE-infizierten Zellen lassen sich dagegen durch die
diesen NS-Fraktionen ist also gegen RNase empfind-
gleiche Methode ebenso wie bei E E E infektiöse NS-
lich. Die Anwesenheit
Fraktionen gewinnen.
Homogenisation des Gewebes bewirkt offenbar, daß
die zelleigenen RNasen,
aktiviert
Diskussion
Homogenisiert
man
werden,
von
Phenol
die beim
rasch wieder
schon bei
der
Homogenisieren
inaktiviert
werden
und so das extrahierbare, gegen RNase empfindliche
Hühnerembryonen,
die
an
Virusmaterial vor der Zerstörung bewahrt bleibt.
gegangen
Die EEE-Virus Elementarteilchen selbst sind resi-
sind, in Gegenwart von 8 0 % Phenol, und extrahiert
stent gegenüber dem Enzym. Im Fall des Typs West
einer Infektion mit EEE-Virus zugrunde
man die Proteine in 3 weiteren Zyklen mit Phenol,
der amerikanischen Pferde-Encephalomyelitis ( W E E )
so sind die resultierenden NS-Fraktionen für 1 0 bis
konnten wir schließlich nachweisen, daß aus gerei-
11 Tage
nigten Virus-Konzentraten ( 2 , 7 • 1 0 1 0 P B E / m l ) nach
lang
bebrütete Hühnereier
infektiös.
Sie
regen dort die Vermehrung von — soweit geprüft —
d e r P h e n o l m e t h o d e v o n GIERER u n d SCHRAMM
normalem EEE-Virus an. Auch Plaques können mit
nachweisbare R N S extrahiert wird, und daß solche
solchen NS-Fraktionen auf Gewebekulturen von em-
Präparate auch keinerlei Infektiosität besitzen. Bei
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2
keine
der Extraktion der mit W E E infizierten Gewebe er-
DNase-Konzentrationen ( 2 0 y/ml) zerstören dagegen
hält man jedoch wie bei E E E eine infektiöse NS-
die Infektiosität vollständig. Ob dies auf einem rei-
Fraktion.
nen Protein-Effekt beruht oder auf einer eventuellen
Kürzlich gelang die Herstellung von infektiöser
RNS
aus
den
Virus-Elementarteilchen
von
WEE
Verunreinigung
durch die Extraktion mit Phenol bei höheren Temperaturen
u
.
des DNase-Präparates
mit
RNase,
ist nicht geklärt.
Ebenso ist noch unbekannt, warum Normalseren
eine starke inhibitorische Wirkung auf die Infektiosi-
Die beschriebenen Befunde lassen sich nur so deu-
tät der NS-Fraktionen besitzen. Auch hier muß nach
ten, daß im Fall von mit E E E und W E E infizierten
der Arbeit von ALEXANDER und Mitarb.
Geweben nicht die Virus-Elementarteilchen selbst das
rechnet werden, daß das Vorhandensein von RNase
Ausgangsmaterial
damit ge-
darstellen,
in den Seren der Grund dafür ist. O b das allerdings
sondern daß hier die R N S aus einem anderen virus-
auch für die y-Globulin-Fraktion von Seren zutrifft,
spezifischen Material extrahiert wird, das diese in
bleibt noch zu untersuchen.
bereits
biologisch
der infektiösen R N S
3
aktiver Form
enthält. Ein
Ver-
gleich zwischen der Infektiosität von NS-Fraktionen
und korrespondierenden Viruspräparaten ist also in
diesem
Fall
nicht
ohne
weiteres
möglich.
Dazu
kommt noch, daß die nach der hier beschriebenen
Methode
gewonnenen
NS-Fraktionen
neben
eigentlichen infektiösen hochmolekularen R N S
der
mit
einem wahrscheinlichen Mol.-Gew. von 2 * 1 0 6 auch
noch kleinere Polyribonucleotide, D N S , hochmolekurare Polysaccharide und Aminosäuren oder kleinere
Peptide enthalten
W e n n auch das Arbeiten mit infektiösen NS-Fraktionen, die nach der hier beschriebenen Technik aus
virusinfiziertem Gewebe gewonnen werden können,
auf Grund ihrer komplexen Zusammensetzung
zu-
sätzliche Schwierigkeiten mit sich bringt, scheint es
doch von Interesse zu sein, solche Arbeiten durchzuführen. Es ist auf diese Weise möglich, infektiöse
Virus-RNS auch dann zu erhalten, wenn die Extraktion der R N S aus den Virus-Elementarteilchen selbst
mit den üblichen Methoden nicht gelingt. Darüber
hinaus dürfte es lohnend sein, das Vorkommen von
Einige dieser Begleitsubstanzen scheinen inhibito-
infektiöser V i r u s - R N S außerhalb der Virus-Elemen-
risch wirksam zu sein. Das ergibt sich aus der Tat-
tarteilchen weiter qualitativ und quantitativ zu unter-
sache, daß die Infektiosität von rohen NS-Fraktionen
suchen.
durch Alkohol-Präzipitation gesteigert wird.
W i e in der ersten Mitteilung gezeigt wurde 1 , können durch diesen Reinigungsschritt die kleinen Polyribonucleotide sowie die Aminosäuren oder kleinen
Peptide entfernt werden.
Eine weitere Infektiositäts-Steigerung bringt dann
noch eine vorsichtige Behandlung der Präparate mit
DNase
(1 y
DNase/ml
oder
weniger).
Größere
Herrn Professor Dr. W . SCHÄFER danke ich für seine
wertvollen Anregungen und seine Förderung der Arbeit,
Herrn Dr. R. M. FRANKLIN für wichtige und hilfreiche
Diskussionen, Frau I. MUSSGAY für ihre unentbehrliche
Mitarbeit. Die Arbeit wurde mit Mitteln der D e u t schen
Forschungsgemeinschaft
durchgeführt.
14
E . WECKER,
Virology
Unauthenticated
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7, 2 4 1
[1959].