Prognostische Bedeutung von KRAS- und BRAF
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Aus der Medizinischen Klinik des Knappschaftskrankenhauses Bochum Langendreer - Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. Wolff Schmiegel Prognostische Bedeutung von KRAS- und BRAF-Mutationen in der Erstlinien-Chemotherapie des metastasierten kolorektalen Karzinoms mit Oxaliplatin und Fluoropyrimidinen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Nina Mareike Bruns aus Dortmund 2012 Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla Referent: Prof. Dr. med. A. Reinacher-Schick Korreferent: PD Dr. med. K.-H. Bauer Tag der Mündlichen Prüfung: 11.12.2012 Abstract Bruns, Nina Mareike Prognostische Bedeutung von KRAS- und BRAF-Mutationen in der Erstlinien-Chemotherapie des metastasierten kolorektalen Karzinoms mit Oxaliplatin und Fluoropyrimidinen Problem: Das kolorektale Karzinom (KRK) ist derzeit in Europa die zweithäufigste tumorbedingte Todesursache. Bei Erstdiagnose weisen etwa 25% der Patienten eine Fernmetastasierung auf. Durch die Einführung neuer Chemotherapeutika konnte die Prognose des mKRK deutlich verbessert werden. Dabei kommt der Identifikation von Biomarkern eine entscheidende Bedeutung zu. Methode: Die hier untersuchten Gewebeproben stammen von Patienten aus einer prospektiv randomisierten Phase-III-Studie der AIO zur Erstlinientherapie des mKRK mit Oxaliplatin und Fluoropyrimidinen (Oxaliplatin und Capecitabin (CAPOX) oder Oxaliplatin und infusionales 5-Fluorouracil (5-FU, FUFOX)). Das untersuchte Teilkollektiv unterschied sich in Bezug auf Alter, Geschlecht und Therapie nicht vom Gesamtkollektiv aller Studienpatienten. Die DNA wurde aus pseudonymisierten, formalinfixierten, Paraffin-eingebetteten Tumorgewebeproben (FFPE) extrahiert. Mit Hilfe des QIAmp DNA Mini Kits wurden 7 KRAS-Mutationen in den Kodons 12 und 13 detektiert. Im BRAF-Gen wurde gezielt die Hotspot-Mutation V600E analysiert. Nur Tumoren mit Wildtyp-KRAS-Status wurden auf eine BRAF-Mutation hin untersucht. Der Mutationsstatus der Gene wurde mit dem Remissionsverhalten, progressionsfreien Überleben und Gesamtüberleben korreliert. Ergebnis: Eine KRAS-Mutation wurde in 75 der 205 (36,6%) verfügbaren Tumoren nachgewiesen. Eine BRAF V600E-Mutation wurde in 13 von 130 (10,0%) Tumoren mit Wildtyp-KRAS detektiert. 87 der 205 Patienten (42,4%) wiesen entweder eine KRAS- oder eine BRAF-Mutation auf. Patienten mit KRAS-Mutationen zeigten eine signifikant geringere Remissionsrate als Patienten mit KRAS-Wildtyp-Status (44,4% vs. 63,0%, p=0,012). Patienten mit KRAS-Wildtyp zeigten ein tendenziell besseres medianes Gesamtüberleben (18,9 Monate, 95%-KI: 14,7-23,2) als Patienten mit einer KRAS-Mutation (16,1 Monate, 95%-KI: 14,7-17,6). War eine KRASoder BRAF-Mutation vorhanden, fiel das Gesamtüberleben signifikant kürzer aus (15,6 Monate, 95%-KI: 12,418,8; p=0,013). Das mediane PFS war bei Patienten mit KRAS- und BRAF-Wildtyp (7,6 Monate, 95%-KI: 6,58,6) und Patienten mit KRAS- oder BRAF-Mutation (7,5 Monate, 95%-KI: 4,9-10,0) nicht unterschiedlich (p=0,89). 136 der 205 Patienten erhielten eine Folgetherapie. 80% der Patienten wurden mit einer Irinotecanhaltigen Zweitlinientherapie behandelt. 30% der Patienten erhielten den Anti-EGFR-Antikörper Cetuximab. Bei Patienten ohne Folgetherapie zeigte sich bzgl. des Postprogressionsüberlebens kein wesentlicher Unterschied. Bei den mit Irinotecan behandelten Patienten zeigte sich ein Trend zu einem günstigeren Postprogressionsüberleben in der KRAS-Wildtyp-Gruppe (p=0,072). Insbesondere KRAS-Wildtyp-Patienten mit einer Cetuximab-haltigen Folgetherapie profitierten erwartungsgemäß hinsichtlich des Gesamtüberlebens (p=0,087). Diskussion: Patienten mit einer KRAS- oder einer BRAF-Mutation weisen unter einer Oxaliplatin- und Fluoropyrimidin-haltigen Erstlinientherapie eine signifikant geringere Ansprechrate auf als Patienten mit Wildtyp-Tumoren. Auch das Gesamtüberleben der Patienten mit Mutation ist signifikant kürzer. Beim PFS zeigt sich hingegen kein Unterschied. Die potenzielle Oxaliplatin-Resistenz bei der Ansprechrate von mutierten Tumoren ist für die weitere Therapie von KRK von großer Bedeutung. Möglicherweise könnte dies mit der Expression des Reparaturproteins ERCC-1 zusammenhängen, das eine Platinresistenz bei verschiedenen Tumoren vermitteln kann. In Bezug auf eine Folgetherapie und das Gesamtüberleben profitierten Patienten besonders von einer Cetuximab-haltigen Therapie, wenn ein KRAS-Wildtyp vorlag, was den bekannten prädiktiven Wert einer KRAS-Mutation für eine Anti-EGFR-Therapie bestätigt. Meiner Familie, Else und Heinz Adamik und Dominik Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung .............................................................................................. - 6 1.1. Epidemiologie und Risikofaktoren des kolorektalen Karzinoms........... - 6 1.2. Pathologie und Klassifikation ............................................................... - 7 1.3. Molekulares Progressionsmodell des kolorektalen Karzinoms ............ - 9 1.4. Klinik, Diagnostik und Früherkennung ............................................... - 10 1.5. Therapie ............................................................................................ - 10 1.6. Etablierte und potenzielle Biomarker beim kolorektalen Karzinom .... - 15 1.6.1. Mikrosatelliteninstabilität ............................................................. - 15 1.6.2. p53 .............................................................................................. - 16 1.6.3. SMAD4........................................................................................ - 16 1.6.4. Die Rolle der KRAS- und BRAF-Mutationen beim kolorektalen Karzinom ............................................................................................... - 17 1.6.4.1. KRAS und Prognose ............................................................. - 19 1.6.4.2. BRAF und Prognose ............................................................. - 23 2. Zielsetzung ......................................................................................... - 26 3. Material und Methoden ................................................................... - 27 3.1. Material .............................................................................................. - 27 3.2. Methodik ............................................................................................ - 29 3.3. Statistik .............................................................................................. - 30 4. Ergebnisse .......................................................................................... - 31 4.1. Beschreibung des Patientenkollektivs ............................................... - 31 4.2. Häufigkeit von KRAS- und BRAF-Mutationen.................................... - 31 4.3. Korrelation mit klinischen Variablen ................................................... - 32 4.4. Korrelation mit dem Therapieansprechen .......................................... - 32 4.5. Korrelation mit dem Überleben .......................................................... - 34 4.5.1. Progressionsfreies Überleben ..................................................... - 34 4.5.2. Gesamtüberleben........................................................................ - 36 4.5.3. Möglicher Einfluss von Folgetherapien ....................................... - 37 5. Diskussion .......................................................................................... - 41 6. Zusammenfassung .......................................................................... - 54 7. Literaturverzeichnis ......................................................................... - 56 - 8. Danksagung 9. Lebenslauf -1- Verzeichnis der Abkürzungen AAPC attenuierte adenomatöse Polyposis coli AIO Arbeitsgemeinschaft Internistische Onkologie APC Adenomatosis polyposis coli AS Aminosäure BMI Body-mass-index BRAF Rapidly growing fibrosarcoma type B CAPOX Capecitabin + Oxaliplatin CEA Carcino-embryonales Antigen CIMP CpG-Island-Methylatorphänotyp CIN Chromosomale Instabilität DALMs Dysplasia associated lesion or mass DNA Desoxyribonukleinsäure EGFR Epidermal-Growth-Factor-Receptor ELK-1 Ets Like gene 1 ERCC-1 Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 1 Et al. Et alii FAP Familiäre Adenomatosis polyposis Koli FFPE Formalin-fixierte, Paraffin eingebettete Gewebeproben FOLFIRI Folinsäure + Fluorouracil + Irinotecan, 14-tägiges Protokoll FOLFOXIRI Folinsäure + Fluorouracil + Irinotecan + Oxaliplatin FOLFOX Folinsäure + Fluorouracil + Oxaliplatin, 14-tägiges Protokoll FOS FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog FS Folinsäure 5-FU Fluorouracil FUFIRI Fluorouracil + Irinotecan + Folinsäure, wöchentliches Protokoll FUFOX Fluorouracil + Folinsäure + Oxaliplatin, wöchentliches Protokoll HNPCC Hereditäres nicht-polypöses kolorektales Krebssyndrom (Lynch-Syndrom) HR Hazard ratio IFL Irinotecan + Fluorouracil + Leucovorin -2- ILCT International Lung Cancer Trial kDa Kilodalton KI Konfidenzintervall KRAS Kirsten Rat Sarcoma KRK Kolorektales Karzinom LOH Loss of heterozygosity LV Leukovorin MAP Mitogen-activated protein MEK MAP-Kinase-Kinase MIN Mikrosatelliteninstabilität MSI Mikrosatelliteninstabilität N Numerus/Anzahl NSCLC non-small cell lung carcinoma N-Kategorie Lymphknoten-Kategorie M Männlich Meta Metachrone Metastasierung mKRK Metastasiertes kolorektales Karzinom MMR-System Mismatch repair system M-Kategorie Metastasenkategorie Mut Mutation OS Overall Survival P Probability-value P53 Protein 53 PFS Progressionsfreies Überleben SMAD Sma and Mad related protein S-Phase Synthesephase Syn Synchrone Metastasierung T-Kategorie Tumor-Kategorie ÜLR Überlebensrate UICC Union internationale contre le cancer VEGF Vascular Endothelial Growth Factor Vs. Versus W Weiblich WT Wildtyp -3- Verzeichnis der Tabellen Tab. 1 Stadieneinteilung nach UICC modifiziert nach Wittekind et al., 2003. Prognose: O’Connell, J Natl Cancer Inst. 2004………- 8 - Tab. 2 Geräte und Materialien ………………………………………………- 28 - Tab. 3 Korrelation mit klinischen Variablen ………………………………..- 32 - Tab. 4 Darstellung des Therapieansprechens …………………………….- 33 - Tab. 5 Korrelation zwischen Remissionsverhalten und KRAS- und BRAF-Mutation ……………………………………………………….- 34 - -4- Verzeichnis der Abbildungen Abb. 1 Progressionsfreies Überleben nach KRAS-Mutations-Status …...- 35 - Abb. 2 Progressionsfreies Überleben nach KRAS-/BRAF-Status ………- 35 - Abb. 3 Gesamtüberleben nach KRAS-Mutationsstatus ………………….- 36 - Abb. 4 Gesamtüberleben nach KRAS-/BRAF-Mutationsstatus …………- 37 - Abb. 5 Postprogressionsüberleben nach KRAS-Mutationsstatus bei Patienten, die keine Zweitlinientherapie erhielten (n=82) ……………………………………………………….- 38 - Abb. 6 Postprogressionsüberleben nach KRAS-Mutationsstatus bei Patienten, die eine Irinotecan-haltige Zweitlinientherapie erhielten (n=116) ……………………………………………………..- 39 - Abb. 7 Postprogressionsüberleben nach KRAS-Mutationsstatus bei Patienten, die eine Cetuximab-haltige Folgetherapie erhielten (n=41) ……………………………………………………….- 40 - Abb. 8 Postprogressionsüberleben nach KRAS-Mutationsstatus bei Patienten, die eine Irinotecan-haltige Zweitlinientherapie ohne eine Cetuximab-Gabe erhielten (n=75) ……………………..- 40 - -5- 1. Einleitung 1.1. Epidemiologie und Risikofaktoren des kolorektalen Karzinoms Das kolorektale Karzinom (KRK) ist der häufigste maligne Tumor des Gastrointestinaltraktes. Mit mehr als 73000 Neuerkrankungen pro Jahr in Deutschland gilt es bei Männern nach dem Prostata- und bei Frauen nach dem Mammakarzinom (www.rki.de, als das 30.09.2008). am Das zweithäufigsten KRK ist bei diagnostizierte beiden Karzinom Geschlechtern die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache. Insgesamt versterben pro Jahr in Deutschland circa 28000 Patienten an den Folgen eines KRKs. Die relative 5Jahres-Überlebensrate liegt für Männer bei 52% und für Frauen bei 55% (Krebs in Deutschland, 2008). Das individuelle Lebenszeitrisiko für die Erkrankung an einem KRK liegt in Deutschland bei 4-6% (Nelson et al., 1999). Das mittlere Erkrankungsalter beträgt für Männer 69 Jahre und für Frauen 79 Jahre. Nach dem 50. Lebensjahr ist eine Verdopplung der Neuerkrankungen und Mortalität pro Lebensdekade zu beobachten (Nelson et al., 1999). Ein deutlich erhöhtes Erkrankungsrisiko besteht bei der familiären Adenomatosis polyposis Koli (FAP) und dem hereditären nicht-polypösen kolorektalen Krebssyndrom (HNPCC; Lynch-Syndrom). Circa 90-95% der KRK sind sporadischen Ursprungs und entstehen vermutlich multifaktoriell. Entscheidend bei den Risikofaktoren ist insbesondere ein „westlicher“ Lebensstil (Fuchs et al., 1999; Almendingen et al, 2001; Bingham et al., 2003; Kim JH et al, 2007; Zandonai et al., 2012). Das Risiko für ein KRK ist ebenso durch regelmäßigen Alkohol- und Nikotinkonsum erhöht (Takeshita et al., 2000; Almendingen et al., 2001; Pedersen et al., 2003; Tiemersma et al., 2003). Des Weiteren zählen Bewegungsmangel und Übergewicht (BMI über 25 kg/m²) zu den Risikofaktoren (Giacosa et al., 1999; Friedenreich et al., 2002; Giovannucci et al., 2003; Wei et al., 2004). Verwandte ersten Grades von KRK-Patienten über bzw. unter 50 Jahren gehören ebenfalls einer Risikogruppe an, da sie mit einem Karzinomrisiko von 10% bzw. 30% überdurchschnittlich häufig erkranken (Fuchs et al., 1994). Zudem sind Patienten mit einer Colitis ulcerosa gefährdet, an einem KRK zu erkranken. Das Risiko beträgt 18% nach 30 Jahren Erkrankungsdauer (Eaden, 2004). -6- Ebenfalls ist bei einem Morbus Crohn von einem erhöhten Risiko auszugehen. Allerdings ist die Datenlage noch spärlich und die Meinungen schwanken zwischen keinem erhöhten Risiko und einem erhöhten Risiko für ein KRK von 3,5bis 7-fach (Greenstein et al., 1981; Persson et al., 1994; Rubio et al., 2008). 1.2. Pathologie und Klassifikation Als KRK werden alle malignen epithelialen Primärtumoren des Kolons und des Rektums bezeichnet. Fast ausschließlich handelt es sich um eine drüsige Differenzierung im Sinne eines Adeno-Karzinoms. Nichtepitheliale Tumoren im Kolon sind selten. Ungefähr die Hälfte aller Fälle hat ihren Ursprung im Rektum und circa 25% der Fälle treten im Sigma auf. Die übrigen Karzinome entstehen annähernd ähnlichen Anteils im Caecum, Colon ascendens, Transversum und Descendens. Zudem können Mehrfachkarzinome auftreten, wobei metachrone von synchronen Karzinomen unterschieden werden. Unter einer metachronen Metastasierung versteht man Metastasen, die später als 4 Monate nach der Diagnosestellung des Primärtumors auftreten. In etwa 70% liegt ein Adenokarzinom intestinalen Typs vor, wobei verschiedene Differenzierungsgrade (G1-G3) unterschieden werden. In etwa 20% der Adenokarzinome liegt ein muzinöses Karzinom und in weniger als 10% liegen seltenere histologische Varianten vor. Basis der Entstehung eines KRKs ist in weit über 90% der Fälle die sog. AdenomKarzinom-Sequenz mit der sukzessiven Akkumulation genetischer Abberationen. Aufgrund einer mehrstufigen Sequenz genetischer Ereignisse, bei der Tumorsuppressorgene inaktiviert und Onkogene aktiviert werden, entsteht aus einem Mikroadenom über ein makroskopisch erkennbares Adenom das Karzinom. Ein erhöhtes Entartungsrisiko weisen Adenome größer 1 cm, villöse Adenome und Adenome mit höhergradigen Epitheldysplasien auf. Aus diesem Grund werden diese Polypen als „advanced adenoma“ bezeichnet. Allgemein wird akzeptiert, dass die Tumorprogression entlang der Adenom-Karzinom-Sequenz mehr als 10 Jahre dauert. Weitere präkanzeröse Vorläuferläsionen stellen flache Adenome („flat adenomas“) (Soetikno et al., 2008) und flach-erhabene und flache Epitheldysplasien bei Kolitis- -7- assoziierten Karzinomen dar, die aber mittels moderner Endoskopietechniken zunehmend besser erkennbar werden. Die Prognose von Patienten mit KRK ist wesentlich abhängig von der Eindringtiefe des Tumors in die Darmwand (T-Kategorie), dem Befall regionaler Lymphknoten (N-Kategorie) und dem Vorhandensein von Fernmetastasen (M-Kategorie). Die klinische Einteilung und die Beschreibung der anatomischen Tumorausbreitung (Staging) erfolgt nach der TNM-Klassifikation (Wittekind et al., 2003) und der daraus abgeleiteten Stadieneinteilung der UICC. In der unten aufgeführten Tabelle 1 sieht man die TNM-Klassifikation der 6. Auflage, wie sie bisher verwendet wurde. Aktuell wurde die 7. Auflage der TNM-Klassifikation eingeführt, in welcher einige Änderungen vorgenommen wurden. Überlebensraten sind bei der neuen Klassifikation allerdings noch nicht vorhanden (www.uicc.org). Tabelle 1: Stadieneinteilung nach UICC modifiziert nach Wittekind et al., 2003. Prognose: O’Connell, J Natl Cancer Inst. 2004 UICC-Stadium TNM-System Anteil 5-Jahres-Überlebensrate UICC 0 Tis, N0, M0 UICC I T1-2, N0, M0 15% 80-100% UICC II A T3, N0, M0 UICC II B T4, N0, M0 UICC III A T1-2, N1, M0 83% UICC III B T3-4, N1, M0 30-40% 64% UICC III C jedes T, N2, M0 UICC IV jedes T, jedes N, M1 20-30% 85% 72% 44% 20-25% 5-7%; bei resektablen Leber-/ Lungenmetastasen 25-40% Bereits bei Diagnosestellung finden sich bei ungefähr 25% der Patienten Metastasen, die insbesondere in der Leber lokalisiert sind. Bei Lebermetastasen liegt in 80-90% eine nicht-resektable Situation vor. 50% aller Patienten mit einem kurativ resezierten KRK der Stadien I bis III entwickeln im Laufe ihrer Erkrankung Metastasen (Geoghegan, 1999). Bei Patienten eines resezierten Karzinoms mit dem Stadium II treten in 15-30% der Fälle Metastasen auf und bei einem Stadium III-Karzinom entwickeln sich in 16-60% Metastasen. Bei dem UICC-Stadium I sind Metastasen in der Folge selten. -8- 1.3. Molekulares Progressionsmodell des kolorektalen Karzinoms Die Basis der Entstehung des KRKs ist entlang der sog. molekularen AdenomKarzinom-Sequenz, auch genannt das Progressions-Modell. Hiernach entsteht die Neoplasie nicht aufgrund einer einzelnen genetischen Veränderung, sondern resultiert aus einer sukzessiven Akkumulation unterschiedlicher Alterationen verschiedener Tumorsuppressor- bzw. Onkogene (Kinzler und Vogelstein, 1998). Der Karzinomentstehung liegt eine genetische Instabilität zugrunde. Unterschieden werden heute hierbei die chromosomale Instabilität (CIN) und die Mikrosatelliteninstabilität (MIN). Bei 85% aller sporadischen KRK lässt sich ein CIN-Phänotyp nachweisen. Dies bedeutet, dass chromosomale Verluste oder ein Zugewinn genetischen Materials vorliegen. Am Anfang der Kaskade der genetischen Alterationen beim KRK beim CIN-Typ steht die biallelische Inaktivierung des APC-Gens. Durch diese Inaktivierung werden über verschiedene Zwischenstationen die Zellproliferation, Zellzykluskontrolle und Apoptoseinhibition beeinflusst (Heppner und Groden, 2000). Nachfolgend sind aktivierende Mutationen des KRAS-Onkogens und Alterationen auf dem Chromosom 18, auf welchem sich insbesondere die Gene SMAD4, SMAD2 und DCC befinden, nachweisbar. Für die Progression zu einem Karzinom sind letztendlich Mutationen im Gen des Tumorsuppressorgens p53 auf dem Chromosom 17p verantwortlich. In 15% der KRK findet man hingegen keinen CIN-Phänotyp, sondern eine Mikrosatelliteninstabilität (MIN/MSI) (Aaltonen et al., 1993). Neben der chromosomalen Instabilität und der Mikrosatelliteninstabilität kann als weiterer Phänotyp der CpG-Island-Methylatorphänotyp (CIMP) auftreten. Dieser zeigt eine epigenetische Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen, welche bei familiären Karzinomsyndromen typischerweise Keimbahnmutationen aufweisen wie Rb, BRCA, VHL oder p16. Häufig gehen CIMP-positive KRK mit einer MSI einher, was auf eine Promotormethylierung des Mismatch-Reparatur-Gens MLH1 zurückzuführen ist (Issa, 2008). Die Entstehung einer Mikrosatelliteninstabilität beruht auf einem Defekt im MMRSystem. Dieser geht entweder aus einer somatischen/ hereditären Mutation in einem MMR-Gen oder einer Hypermethylierung des MLH1-Promotors hervor (Grandy, 2004). Ein Expressionsverlust des MLH1-Gens liegt in 70% aller sporadischen KRK vor (Cunningham et al., 1998). Bei HNPCC-Fällen liegt mit einer Häufigkeit von 90% eine Mikrosatelliteninstabilität vor, somit kann bei einer -9- unauffälligen Mikrosatellitenanalyse eine HNPCC weitestgehend ausgeschlossen werden. 1.4. Klinik, Diagnostik und Früherkennung Aufgrund der unspezifischen Symptome und seines oft langen klinisch stummen Vorhandenseins bleibt das KRK häufig zunächst unbemerkt. Da es keine zuverlässigen Frühsymptome gibt, wird eine Krebsfrüherkennung empfohlen. Diese ist seit 2002 in das gesetzliche Vorsorgeprogramm aufgenommen. Als Warnzeichen gelten Stuhlunregelmäßigkeiten, Ileus und Blut im Stuhl. Jede plötzliche Änderung der Stuhlgewohnheit im Alter von über 40 Jahren, beispielsweise eine veränderte Stuhlbeschaffenheit, Wechsel von Obstipation und Diarrhö, Ileuserscheinungen oder Blutbeimischung zum Stuhl sowie eine ungeklärte Gewichtsabnahme, Anämie und Schmerzsymptome können einen Hinweis auf ein KRK darstellen. Im Rahmen der Krebsfrüherkennung wird ab dem 50. Lebensjahr für NichtRisikopersonen ein fäkaler Okkultblut-Test (FOBT/ Guaiak-Test) mit einer digitalrektalen Untersuchung empfohlen. Zudem sollte ab dem 55. Lebensjahr eine Koloskopie durchgeführt werden, die bei unauffälligem Befund und fehlenden Risikofaktoren im Abstand von zehn Jahren wiederholt wird. Im Vergleich zu allen anderen Maßnahmen der Früherkennung besitzt die Koloskopie die höchste Sensitivität und Spezifität und wird somit als Goldstandard angesehen. Studien zeigten, dass durch eine Polypektomie bei einer Koloskopie die Inzidenz von kolorektalen Karzinomen um 66-90% gesenkt wird (Winawer et al., 1993; Citarda et al., 2001). Bei unklarer Symptomatik mit Tumorverdacht ist eine Koloskopie unerlässlich. 1.5. Therapie Die Therapie beim KRK erfolgt nach histologischer Sicherung stadienabhängig. Anzustreben ist grundsätzlich die kurative Resektion. Das Standardverfahren in der Chirurgie ist die elektive radikale En-bloc-Resektion des befallenen Darmabschnittes mit systematischer Entfernung des Lymphabflussgebietes. - 10 - Perikolische Lymphknotenmetastasen treten in der Regel maximal circa zehn Zentimeter entfernt vom Tumorrand auf, die Lymphknotendissektion sollte bis zum zentralen Gefäßabgang erfolgen. Eine adjuvante Chemotherapie ist bei Patienten mit einem Tumor im UICC-Stadium I nicht indiziert. Im Stadium II kann eine adjuvante 5-FU-basierte Chemotherapie nach Beratung und Aufklärung des Patienten empfohlen werden („Kann“-Empfehlung) (Schmiegel et al., 2008), da durch Studien ein Überlebensvorteil bei dieser Therapie von 3-5% belegt wurde (Quasar Collaborative G., 2007). Bei Hochrisikopatienten (T4, Tumor-Perforation, Ileus, <10 Lymphknoten) sollte eine adjuvante Chemotherapie erwogen werden (Schmiegel et al., 2008). Im UICC-Stadium III soll eine adjuvante Chemotherapie durchgeführt werden („Soll“-Empfehlung) (Schmiegel et al., 2008). Empfohlen wird derzeit das FOLFOX-Schema (LV5FU2+Oxaliplatin) aufgrund einer Studie, welche eine signifikante Überlegenheit für die FOLFOX-Chemotherapie gegenüber einer 5-FUChemotherapie zeigte (Andre et al., 2004; DeGramont et al., 2007; Andre et al., 2009). Besteht eine Unverträglichkeit gegenüber Oxaliplatin oder ist der Allgemeinzustand reduziert, soll eine Monotherapie mit oralen Fluoropyrimidinen durchgeführt werden. Neoadjuvante Therapieverfahren spielen in erster Linie bei Rektumkarzinomen eine Rolle. Insbesondere bei den UICC-Stadien II und III soll eine neoadjuvante Radio- oder Radiochemotherapie durchgeführt werden. In Studien konnte gezeigt werden, dass eine präoperative Radiotherapie eine bessere Wirksamkeit erzielt als eine postoperative Therapie (Sauer et al., 2004). In Bezug auf das therapeutische Vorgehen werden die Patienten mit einem metastasierten KRK nach der klinischen Situation und dem Therapieziel in drei klinische Gruppen eingeteilt. Zu der Gruppe 1 gehören die Patienten mit primär resektablen Leber- und/oder Lungenmetastasen. Bei Patienten der zweiten Gruppe wird eine intensivierte systemische Therapie angestrebt. Zu dieser Gruppe gehören operable Patienten mit potenziell resektablen Metastasen nach einer Konversionstherapie sowie Patienten mit tumorbedingten Symptomen, raschem Progress oder Organkomplikationen. Bei der Gruppe 3 kann eine weniger intensive Therapie appliziert werden, welche bei Patienten mit multiplen Metastasen ohne Option für Resektion nach Metastasenrückbildung, ohne tumorbezogene Symptome oder Organkomplikation und/oder schwerer Komorbidität angewandt wird. Auch bei Patienten über 75 Jahren kann mit einer Monotherapie begonnen werden. - 11 - Eine Resektion von Metastasen (Gruppe 1) ist nur bei 10-20% aller Patienten möglich (Adson, 1987; Goldberg et al., 1998). Durch die erfolgreiche Entfernung von Lebermetastasen ist eine 5-Jahres-Überlebensrate von 25-40% zu erreichen (Nagorney, 1987). Die Datenlage für eine perioperative Therapie bei resektablen Lebermetastasen ist nicht eindeutig. Vermutlich verbessert die perioperative Therapie mit FOLFOX das rezidivfreie Überleben. Eine Verbesserung des Gesamtüberlebens konnte bislang nicht gezeigt werden (Wieser et al., 2010). Bei Patienten der zweiten Gruppe wird eine intensivierte systemische Therapie angestrebt. Bei Leber- und/oder Lungenmetastasen und im Einzelfall auch bei anderen Lokalisationen ist daher bei Diagnose und im Verlauf zu überprüfen, ob eine Resektion technisch möglich ist. Bei primärer Irresektabilität der Metastasen soll mit einer neoadjuvanten systemischen Chemotherapie begonnen werden, um ggf. eine sekundäre Metastasenresektion zu erreichen (Konversionstherapie). Derzeit stehen mehrere Erstlinientherapien mit hohen Remissionsraten zur palliativen Behandlung des metastasierten KRKs zur Verfügung. Dabei ist das orale Capecitabine dem intravenösen 5-FU/Folinsäure gleichzusetzen. Die Kombinationen von 5-FU/FS mit Oxaliplatin als auch mit Irinotecan sind einer Monotherapie mit 5-FU überlegen. (De Gramont et al., 2000; Douillard et al., 2000; Seymour et al., 2007). Oxaliplatin ist ein Dritt-Generations-Platinanalogon, welches durch Derivate, die bei der Biotransformation von Oxaliplatin entstehen, zu Inter- und Intrastrang-Quervernetzungen in der DNA führt. Die Folge ist ein Abbruch der DNA-Synthese und somit eine antitumorale Wirkung. Irinotecan ist ein Camptothecinderivat, welches die Topoisomerase 1 hemmt. Dadurch kommt es zu einem Abbruch der DNA-Replikation und damit letztendlich zur Apoptose. Somit ist Irinotecan pharmakologisch ein Zytostatikum. Durch die synergistische Wirkung von 5-FU/FS und Oxaliplatin beispielsweise werden Remissionsraten von bis zu 50% erreicht (Giacchetti et al., 2000). Somit sollte aufgrund der höheren Ansprechrate bei der Gruppe 2 eine Kombinationstherapie (2-fach Chemotherapie + monoklonaler Antikörper oder 3fach Chemotherapie (FOLFOXIRI)) gewählt werden. Als monokolonale Antikörper können beispielsweise Cetuximab oder Bevacizumab zum Einsatz kommen. Cetuximab bindet an den EGF-Rezeptor, welcher auf den Tumorzellen vermehrt exprimiert wird. Cetuximab führt in einer Kombinationstherapie vor allem zu einer Erhöhung der Remissionsraten, während das progressionsfreie Überleben nur moderat verbessert wird (van Cutsem et al., 2009; Bokemeyer et al., 2009). - 12 - Cetuximab scheint ferner das Gesamtüberleben zu verbessern (van Cutsem, 2010). Bei Patienten der Gruppe 3 mit Metastasen ohne Aussicht auf Rückbildung kann als Erstlinientherapie auch eine Monotherapie eingesetzt werden. Bei Progress unter einer Monotherapie sollte eine weitere Substanz hinzu genommen werden. Bei einem Großteil der Patienten wird im Verlauf der Erkrankung Irinotecan oder Oxaliplatin eingesetzt. Ob eine Irinotecan- oder OxaliplatinKombination gewählt wird, sollte anhand des Toxizitätsspektrums festgemacht werden. Bei den Irinotecan-Kombinationen sollten insbesondere Diarrhön Beachtung finden und bei der Oxaliplatin-Kombination muss an die kumulative Neurotoxizität (PNP) gedacht werden. Vergleicht man die 5-FU-Protokolle, ist ein Vorteil bei den 14-tägigen FOLFIRI- und FOLFOX-Therapien gegenüber den wöchentlichen FUFIRI- und FUFOX-Protokollen erkennbar. Ebenfalls Anwendung in der Erstlinientherapie finden antiangiogenetische Substanzen. Bei Bevacizumab handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper gegen den Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). In Studien konnte gezeigt werden, dass Bevacizumab in Kombination mit einer Chemotherapie das progressionsfreie Überleben und zum Teil auch das Gesamtüberleben der Patienten verbessern kann (Hurwitz et al., 2003; Kabbinavar et al., 2005; Saltz et al., 2008). Die Ansprechrate wird weniger deutlich verbessert (Hurwitz et al., 2003; Saltz et al., 2008). Bevacizumab kann sowohl in Kombination mit Oxaliplatin als auch in Irinotecan-haltigen Protokollen eingesetzt werden. Ebenfalls für die Erstlinien-Chemotherapie zugelassen ist die Integration von Cetuximab in eine Kombinationschemotherapie. In der so genannten CRYSTALStudie wurde der Effekt der Zugabe von Cetuximab zum FOLFIRI-Protokoll untersucht. Es wurden 599 Patienten mit einem mKRK mit dem FOLFIRI-Protokoll behandelt und weitere 599 Patienten erhielten FOLFIRI plus Cetuximab (van Cutsem et al., 2009). Es zeigte sich bei der alleinigen Gabe von FOLFIRI ein signifikant kürzeres PFS (8,0 vs. 8,9 Monate, p=0,048). Zu der EGFR-AntikörperTherapie liegt bereits eine randomisierte Phase III Studie vor. Es wurde gezeigt, dass bei einer Vortherapie mit Fluoropyrimidinen, Irinotecan oder Oxaliplatin oder einer Kontrainidikation gegen diese Medikamente bei Patienten mit immunhistochemisch nachweisbarem EGFR durch Cetuximab eine Verbesserung des Gesamt- oder PFS erreicht werden kann (Jonker et al., 2007). - 13 - Bei Patienten mit Wildtyp-KRAS zeigte sich ein verlängertes PFS (9,9 vs. 8,7 Monate; HR=0,68; 95%-Konfidenzintervall (KI): 0,50-0,94) und ein verlängertes Gesamtüberleben (24,9 vs. 21,0 Monate, HR=0,84; 95%-KI: 0,64-1,11) bei der Zugabe von Cetuximab im Vergleich zu Patienten mit KRAS-Mutationen (PFS: FOLFIRI+Cetuximab vs. FOLFIRI=7,6 vs. 8,1 Monate; p=0,07; OS: FOLFIRI +Cetuximab vs. FOLFIRI=17,5 vs. 17,7 Monate; p=0,44). In der sogenannten OPUS-Studie wurde der Effekt von Cetuximab in Kombination mit einer FOLFOX-Therapie betrachtet (FOLFOX, n=168 vs. FOLFOX+Cetuximab, n=169) (Bokemeyer et al., 2009). Es zeigte sich bei der Zugabe von Cetuximab zur FOLFOX-Therapie eine Verbesserung der Ansprechrate (61% vs. 37%, p=0.011) und des PFS (7,7 Monate vs. 7,2 Monate, HR=0,57; p=0,163) bei KRASWildtyp-Tumoren. Bei den Karzinomen mit einer KRAS-Mutation hingegen zeigte sich im Therapiearm mit Cetuximab+FOLFOX ein tendenziell schlechteres Ansprechen (33% vs. 49%, p=0,106) und ein verringertes PFS (5,5 vs. 8,6 Monate; HR=1,830; p=0,192). Wie aus den beiden Studien ersichtlich wird, kommt es durch den monoklonalen Antikörper Cetuximab nur bei KRAS-Wildtyp-Tumoren zu einem gewünschten positiven Effekt. Aus diesem Grund ist die Zulassung beschränkt auf Patienten mit einem KRAS-Wildtyp-Status des Tumorgewebes. Hingegen konnte die Verbesserung des Überlebens durch Cetuximab bei Patienten mit Wildtyp-KRAS exprimierendem Tumor sowohl in der COIN-Studie (Maughan et al., 2010) als auch in der Nordic-Studie (Tveit et al., 2011) nicht bestätigt werden. Eine Ursache dafür können verschiedene Chemotherapiekombinationen sein. Cetuximab scheint mit infusionalem 5-FU und mit Irinotecan besser synergistisch zu wirken als mit oralem 5-FU und/oder Oxaliplatin (Maughan et al., 2010; Tveit et al., 2011). Zudem wurde die Addition von Cetuximab zu einer Kombination aus Capecitabine, Oxaliplatin und Bevacizumab als Erstlinientherapie beim KRK untersucht. Die Kombination beider Antikörper hat in der CAIRO2-Studie (CAPOX/Bevacizumab±Cetuximab) zu einer signifikanten Verschlechterung des PFS geführt (Punt et al., 2008), so dass die Kombination zweier monoklonaler Antikörper beim KRK derzeit nicht zu empfehlen ist. Bei Progress unter einer Erstlinientherapie sollte zu einem alternativen Therapieprotokoll gewechselt werden. Für die Auswahl der Zweitlinientherapie sind die chemotherapeutische Vorbehandlung, die therapiefreie Zeit, das - 14 - Therapieziel sowie die individuelle Patientensituation entscheidend. Grundsätzlich stehen aufgrund der zunehmenden Vielfalt an Medikamenten mehrere Optionen zur Auswahl. Die Therapie sollte bis zum Progress der Erkrankung durchgeführt werden. Infolge einer Erstlinientherapie gemäß dem Irinotecan-haltigen Protokoll kann im Anschluss mit einer Oxaliplatin-haltigen Therapie behandelt werden und umgekehrt (Wong et al., 1999). Durch dieses Verfahren kann in 30-70% eine Wachstumskontrolle erreicht werden (Grothey et al., 2004; Tournigand et al., 2004). Auf eine 5-FU-Monotherapie sollte eine Irinotecan-Monotherapie oder die FOLFOX- Therapie folgen (Cunningham et al., 1998; Rothenberg et al., 2003). Die Zweitlinientherapie mit Irinotecan nach Versagen einer Fluorouracil-Monotherapie erbrachte im Vergleich mit BSC oder 5FU/FS einen deutlichen Vorteil im Gesamtüberleben (Cunningham et al., 1998; Rougier et al., 1998). Ebenfalls von den Vorläufertherapien bestimmt werden die Drittlinientherapien. 1.6. Etablierte und potenzielle Biomarker beim kolorektalen Karzinom 1.6.1. Mikrosatelliteninstabilität Wie bereits erwähnt, kann in 15% der KRK eine Mikrosatelliteninstabilität aufgefunden werden, zu welcher es aufgrund einer Schädigung des zellulären DNA-Mismatch-Reparatur-Systems gekommen ist. In Bezug auf die Prognose bei Vorliegen einer Mikrosatelliteninstabilität ist die Datenlage divergent. Einige zunächst publizierte Studien konnten zeigen, dass bei Patienten mit einer MSI im Stadium II und III die Prognose nach einer 5-FU-basierten Chemotherapie besser war als bei mikrosatellitenstabilen Tumoren (Hemminiki et al., 2000; Watanabe et al., 2001). In anderen Studien jedoch wiesen Patienten mit MSI-positiven Tumoren keinen Benefit von einer 5-FU-basierten Chemotherapie auf (Carethers et al., 2004). So untersuchten auch Ribic et al. den Benefit einer 5-FU-basierten adjuvanten Chemotherapie bei Patienten mit einem KRK im Stadium II oder III. Insgesamt wurden 570 Patienten in die Studie eingeschlossen, von denen 287 Patienten keine adjuvante Therapie erhielten. Patienten mit einer hochfrequenten MSI zeigten eine bessere 5-Jahres-Überlebensrate als Patienten mit einer niedrigfrequenten MSI bzw. ohne MSI (hazard ratio for death 0,31; 95%-KI: 0,140,72; p=0,004). In Bezug auf eine adjuvante 5-FU-basierte Chemotherapie wurde das Gesamtüberleben bei Patienten mit einer niedrigfrequenten MSI bzw. ohne - 15 - eine MSI verlängert (hazard ratio for death 0,72; 95%-KI: 0,53-0,99; p=0,04), bei Patienten mit einer hochfrequenten MSI zeigte sich jedoch kein Benefit (Ribic et al., 2003). In der sogenannten FOCUS-Studie von Braun et al., welche die größte Studie zu dieser Fragestellung darstellt, wurden 1628 Patienten, die adjuvant mit Irinotecan behandelt wurden, bezüglich progressionsfreiem und Gesamtüberleben untersucht. Eine MSI konnte nur selten nachgewiesen werden (4,4%). Es zeigte sich keine prognostische Relevanz bezüglich der Veränderungen der Mikrosatelliten (Braun et al., 2008). 1.6.2. p53 Das Tumorsuppressorprotein p53 ist als Transkriptionsfaktor an der Expression von Genen beteiligt, die für die Kontrolle des Zellzyklus, der Induktion der Apoptose oder der DNA-Reparatur verantwortlich sind. Auf diese Weise inhibiert es das Wachstum genetisch alterierter und somit potentiell neoplastischer Zellen. Es hat eine Molekularmasse von 53 kDa. Das zugehörige TP-53- Tumorsuppressorgen ist auf Chromosom 17p13.1 lokalisiert. Ein Verlust der Heterozygotät (loss of heterozygosity; LOH) dieses Chromosoms kann in 75% aller KRK nachgewiesen werden, eine somatische Mutation ist in 40-60% vorhanden (Cunningham et al., 1992; Forslund et al., 2001). Bezüglich der Prognose bei einer Mutation oder einer LOH ist die Datenlage in der Literatur kontrovers. Morrin et al. wiesen nach, dass eine Korrelation zwischen einer Mutation in p53 weder mit dem UICC-Stadium, noch der Tumordifferenzierung oder dem 5-Jahres-Überleben besteht (Morrin et al., 1994). In anderen Studien hingegen wurde belegt, dass eine p53-Mutation einen negativen Effekt auf die Prognose beim KRK erzielt. In der Untersuchung von Pricolo et al. beispielsweise betrug das 5-Jahres-Überleben bei Patienten ohne Mutation 75% und bei einer vorhandenen TP53-Mutation 21% (p=0.01) (Pricolo et al., 1996). 1.6.3. SMAD4 Wie bereits erwähnt, ist ein weiteres wichtiges Tumorsuppressorgen das SMAD4, welches auf dem langen Arm des Chromosoms 18 an der Stelle 18q21.1 lokalisiert ist. Es sind acht verschiedene SMAD-Gene und Proteine bekannt, - 16 - welche in drei verschiedenen funktionellen Gruppen klassifiziert werden: Die Rezeptor regulierten R-SMADs, die inhibitorischen I-SMADs sowie die ‚commonmediator‘ Co-SMADs, dessen einziger Vertreter das SMAD4 ist. Dieses spielt eine zentrale Rolle im TGF-beta-Signalweg. SMAD4 hat so einen Einfluss auf Zellproliferation, Zelldifferenzierung, Zellmigration, Zellzykluskontrolle, Apoptose, Angiogenese, Immunmodulation sowie Zell-Zell-Kontakte und die extrazelluläre Matrix. Eine Reihe von genetischen und zellbiologischen Arbeiten konnten SMAD4 als Tumorsuppressorprotein im Kolon etablieren (Schwarte-Waldhoff, 2003). Einer Studie von Salovaara et al. zufolge war keine SMAD4-Expression in 20 von 53 unselektierten KRK auffindbar (38%). Eine reduzierte Expression fand in weiteren 15 KRK statt (28%). Somit liegt der Schluss nahe, dass eine Abwesenheit von SMAD4 bzw. eine reduzierte Expression eine entscheidende Rolle bei der Entstehung von KRK spielt (Salovaara et al., 2002). Auch im menschlichen Kolongewebe konnte gezeigt werden, dass der SMAD4-Verlust entlang der Progression hin zu invasiven und metastasierten Stadien zunimmt (Miyaki et al., 1999; Maitra et al., 2000; Reinacher-Schick et al., 2004). Alazzouzi et al. untersuchten 86 Patienten mit einem KRK im Stadium UICC III. Patienten mit einer hohen SMAD4-Expressionsrate zeigten ein signifikant längeres Überleben als Patienten mit einer niedrigen Expression (p˂0,025) (Alazzouzi et al., 2005). In Bezug auf die adjuvante Therapie konnte gezeigt werden, dass Patienten mit einer normalen SMAD4-Expression bei einer 5-Fluorouracilbasierten Chemotherapie sowohl beim Gesamtüberleben als auch beim progressionsfreien Überleben mehr profitierten (Boulay et al., 2002). 1.6.4. Die Rolle der KRAS- und BRAF-Mutationen beim kolorektalen Karzinom Zu der Familie der RAS-Protoonkogene gehören KRAS, NRAS und HRAS. Die RAS-Protoonkogene kodieren für kleine, monomere Guaninnucleotid-bindende Proteine (G-Proteine) mit einem Molekulargewicht von 21 kDa. RAS-Onkogene sind wichtig für das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung (Wittinghofer und Pai, 1991; Bazan et al., 2002). Die RAS-Proteine sind eine zentrale Komponente bestimmter mitogener Signalkaskaden, besonders für die Zellproliferation, die an Rezeptoren (insbesondere EGFR) zur Wachstumsstimulation beginnen und im Zellkern ihr Ende finden (Egan et - 17 - al., 1993). Zunächst wird nach Aktivierungsschritten durch Wachstumsfaktoren RAS in einen aktiven Zustand gewandelt. Das aktive GTP-RAS aktiviert die MAP-Kaskade: Die RAF-Kinase wird durch Bindung an das GTP-RAS aktiv und aktiviert durch Phosphorylierung die MAP-Kinase-Kinase (MEK). Diese wiederum phosphoryliert die MAP-Kinase, welche in dem nun aktiven Zustand für den Übergang in den Zellkern verantwortlich ist. ELK-1, ein Transkriptionsfaktor, wird aktiviert und das FOS-Gen transkribiert, wodurch das FOS-Protein entsteht. Dieses bildet mit dem JUNProtein einen Komplex, der als AP1 bezeichnet wird. Durch den AP1-Komplex können weitere Gene, die für die Zellproliferation wichtig sind, aktiviert werden. In erster Linie sind diese in der Mitose bei dem Übergang der G1- in die S-Phase von Bedeutung. Im Allgemeinen treten Mutationen im RAS-Gen bei circa 30% aller humanen Tumoren auf, jedoch mit einer ziemlich variablen Inzidenz bei den verschiedenen Krebsarten. Im KRK liegt eine KRAS-Gen-Mutation mit einer Häufigkeit von circa 30-40% vor (Kampman et al., 2000; Bleeker et al., 2001; Esteller et al., 2001; Bazan et al., 2002; Di Nicolantonio et al., 2008). Bei Adenomen unter einem Zentimeter treten in weniger als 10% KRAS-Mutationen auf und bei größeren Adenomen und Karzinomen konnten in bis zu 50% der Fälle Veränderungen im RAS-Gen nachgewiesen werden (Vogelstein et al., 1988). Über 90% der Mutationen wurden im Kodon 12 und 13 gefunden, seltener sind Mutationen im Kodon 61 (Bazan et al., 2002). Die Mutationen haben eine Veränderung des Proteins mit einer reduzierten GTPase-Aktivität und einer verringerten Interaktion mit GTPase-aktivierendem Protein (GAP) zur Folge, was zu einer vermehrten Aktivität der Signalkaskade führt. In Bezug auf die Adenom-Karzinom-Sequenz wird die RAS-Mutation in die frühe Phase der Adenomentstehung eingeordnet und ist in erster Linie für die Progression zum größeren Adenom verantwortlich (Vogelstein et al., 1988). Eine weitere wichtige Rolle in dem RAS/RAF/MEK/MAP-Signalweg kommt beim KRK dem BRAF-Gen zu. Bei den RAF-Proteinen (rapidly growing fibrosarcoma) handelt es sich um Serin-Threonin-Proteinkinasen. Es gibt die Isoformen ARAF, BRAF und CRAF. Davies hat als Erstbeschreiber 2002 berichtet, dass eine BRAFmissense-Mutation mit einer Häufigkeit von 66% in malignen Melanomen und mit einer geringeren Häufigkeit in einer Vielzahl anderer Tumoren vorkommt (Davies et al., 2002). - 18 - In der Literatur wird das Vorkommen einer BRAF-Mutation mit einer Häufigkeit von circa 5-10% beschrieben (Davies et al., 2002; Fransen et al., 2004; Di Nicolantonio et al., 2008; Lièvre et al., 2010). So explorierten Fransen et al. in einer Studie das Vorkommen einer BRAF-Mutation in 130 kolorektalen Tumoren. Es zeigte sich eine Häufigkeit von 11,5% (Fransen et al., 2004). In der Studie von Di Nicolantonio et al. wurden 113 Patienten mit einem mKRK untersucht. Mit einer Häufigkeit von 9,7% aller 113 Patienten konnte eine BRAF-Mutation nachgewiesen werden. Ein mutiertes BRAF trat in 11 von 79 Patienten mit einem KRAS-Wildtyp auf (13,9%) (Di Nicolantonio et al., 2008). Es konnte gezeigt werden, dass eine Mutation im BRAF- und KRAS-Gen nicht gleichzeitig vorkommt (Fransen et al., 2004). So fand man in einer Studie in 4 von 43 Tumoren (9,3%) eine BRAF-Mutation und in 13 weiteren Tumoren (30,2%) eine KRAS-Mutation (Yoshitake et al., 2007). Ebenso scheint es eine Korrelation mit einer Mikrosatelliteninstabilität zu geben. Samowitz et al. zeigten, dass in 5% mikrosatellitenstabiler Tumoren und in 51,8% mikrosatelliteninstabiler Karzinome eine BRAF-Mutation vorhanden war. Auch Fransen et al. fanden eine signifikante Korrelation zwischen einer BRAF-Mutation und einer Mikrosatelliteninstabilität (Fransen et al., 2004). In mikrosatellitenstabilen Tumoren korreliert diese BRAFMutation mit einem schlechten Gesamtüberleben und dem Hyperme- thylierungsphänotyp (CIMP, CpG Island Methylator Phenotype) (Samowitz et al., 2005). Bezugnehmend auf den Hypermethylierungsphänotypen konnte auch in einer anderen Untersuchung gezeigt werden, dass CIMP mit einer hohen Rate an Mikrosatelliteninstabilität sowie BRAF-Mutationen assoziiert ist (Ogino et al., 2007). 1.6.4.1. KRAS und Prognose Ob KRAS-Mutationen mit einer schlechten Prognose, der Invasionstiefe, dem Tumorstadium, der Lokalisation und dem Gesamtüberleben bei Patienten mit KRK korreliert sind, ist nicht vollständig geklärt (Finkelstein et al., 1993; Troungos et al., 1997; Cerottini et al., 1998; Samowitz et al., 2000). Der Zusammenhang von Tumorstadium und KRAS-Mutation wurde schon zu früher Zeit untersucht. So führten Oliva et al. beispielsweise bereits 1990 eine Studie bei 58 Patienten mit einem KRK durch. Es wurde eine KRAS-Mutation in 24,1% (14 Fälle) - 19 - nachgewiesen. Ein Zusammenhang zwischen einer Mutation und dem Tumorstadium konnte nicht gezeigt werden (Oliva et al., 1990). 1997 wurde in einer Studie von Troungos et al. zwar eine positive Korrelation zwischen dem Vorhandensein einer KRAS-Mutation und der Invasionstiefe des Tumors nachgewiesen, zwischen der Mutation und den regionalen Lymphknotenmetastasen aber kein Zusammenhang gefunden (Troungos et al., 1997). Bezüglich der Prognose kamen viele Studien zu dem Ergebnis, dass das Vorhandensein einer KRAS-Mutation mit einem verkürzten Überleben verbunden ist und somit der KRAS-Status ein möglicher Prognosefaktor sein könnte. In einer Studie von Lee et al. wiesen Patienten mit mutierten KRAS-Genen im UICC-Stadium I und II ein verkürztes Gesamtüberleben im Vergleich zu Patienten ohne Mutationen auf. Das relative Mortalitätsrisiko bei diesen Stadien betrug ungefähr 95%. Aus diesem Grund ist möglicherweise besonders in den frühen Stadien das Vorliegen einer KRAS-Mutation ein Prognosefaktor bezüglich des Überlebens (Lee et al., 1996). Auch Ahnen et al. konnten nachweisen, dass KRAS-Mutationen im UICC-Stadium II mit einer schlechten Prognose einhergehen. So betrug das 7-Jahres-Überleben in dieser Studie bei Patienten mit Mutationen 58% und bei der Kontrollgruppe 86%. Die Hazard ratio (HR) in Bezug auf das Sterben betrug 4,5 (95%-KI: 1,7-12,1; p=0,012) (Ahnen et al., 1998). Samowitz et al. untersuchten in einer großen Studie 1413 Patienten mit einem kolorektalen Karzinom und konnten in 32% der Tumoren eine KRAS-Mutation nachweisen. Eine KRAS-Mutation im Kodon 13 war verbunden mit einer erhöhten Mortaliät von 40% (95%-KI: 0,95-2,0) (Samowitz et al., 2000). Winder et al. untersuchten 342 Patienten mit einem KRK. Eine KRAS-Mutation wurde mit einer Häufigkeit von 28% nachgewiesen und es konnte gezeigt werden, dass Patienten mit einer Mutation im Kodon 12 (G12V-Mutation) ein signifikant kürzeres Gesamtüberleben aufwiesen als Patienten mit einem Wildtypen (HR=2,56 (1,155,69)). Bei Nachweis anderer Mutationen hingegen zeigte sich ein verbessertes Gesamtüberleben im Vergleich zu Wildtyppatienten (HR=0,44-0,99) (Winder et al., 2009). Auch in Hinblick auf den Einfluss von KRAS auf den Therapieerfolg gehen die Meinungen in der Literatur auseinander. Interessanterweise profitieren sowohl Patienten mit Tumoren im Stadium II als auch Patienten mit einer KRAS-Mutation im Stadium III gemäß einer Studie von - 20 - Ahnen et al. nicht von einer adjuvanten 5-FU-basierten Chemotherapie (Ahnen et al., 1998). In einer neueren Arbeit der Quasar Collaborative Group hingegen wurde bei 3239 Patienten mit einem KRK im Stadium II, die entweder mit Fluorouracil und Folinsäure (n=1622) behandelt oder der reinen Beobachtung (n=1617) unterzogen wurden, eine signifikant höhere Sterberate bei der reinen Beobachtung gesehen (370 Todesfälle vs. 311 Todesfälle, 95%-KI: 0,70-0,95, p=0,008). Auch die Rezidivrate war bei den Patienten, die keine Chemotherapie erhielten, signifikant höher (359 Rezidive vs. 293 Rezidive, 95%-KI: 0,67-0,91, p=0,001) (Quasar Collaborative Group, 2007). In der Studie von Ahnen et al. wurde als Weiteres die Prognose in Abhängigkeit von dem KRAS-Status untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass das 7-Jahres-Überleben beim WildtypKRAS im Stadium III allerdings durch die 5-FU-basierte Chemotherapie positiv im Vergleich zu KRAS-mutierten Tumoren beeinflusst wird. In anderen Studien wurde hingegen kein Zusammenhang zwischen dem klinischen Benefit und einer KRASMutation bei adjuvant behandelten KRK gezeigt (Westra et al., 2005; Fuchs et al., 2009). Bezüglich des Zusammenhangs einer adjuvanten FOLFOX-Therapie und der Prognose bei KRAS-Mutationen sind derzeit keine Studien publiziert. Beim mKRK ist die Datenlage bei der Frage der Korrelation des KRAS-Status und des Therapieansprechens ebenso nicht eindeutig. Während in der Studie von Rosty et al. keine signifikante Korrelation zwischen einem Ansprechen auf die palliative Chemotherapie mit 5-FU und KRAS-Mutationen gesehen wurde (Rosty et al., 2001) und ebenso in der Studie von Ince et al. bei Mutationen im KRAS-Gen beim mKRK keine Lebensverlängerung durch die Zugabe von Bevacizumab zu IFL (Irinotecan+5-FU+Leucovorin) erreicht wurde (Ince et al., 2005) und auch in einer Studie von Ogino et al. keine signifikante Korrelation zwischen dem KRASStatus und dem Ansprechen auf eine Therapie mit Gefitinib gezeigt werden konnte (Ogino et al., 2005), war in einer anderen Studie hingegen bei Patienten, die eine palliative Therapie mit CPT-11 (Irinotecan) nach Therapieversagen von 5-FUKombinationen erhielten, bei KRAS-positiven Tumoren eine signifikant schlechtere Prognose zu beobachten (Nemunaitis et al., 1997). Einen wichtigen Beitrag zum Therapieverhalten bei KRAS-Mutationen konnten die OPUS- und die CRYSTAL-Studie leisten, welche ebenfalls zeigen, dass eine KRAS-Mutation mit einem schlechteren Therapieansprechen assoziiert ist. - 21 - In der OPUS-Studie wurde der Effekt von Cetuximab in Kombination mit einer FOLFOX-Therapie betrachtet (FOLFOX, n=168 vs. FOLFOX+Cetuximab, n=169) (Bokemeyer et al., 2009). Bei Kombination von FOLFOX und Cetuximab zeigte sich bei KRAS-Wildtyp-Tumoren eine Verbesserung der Ansprechrate (61% vs. 37%, p=0,011) und des PFS (7,7 Monate vs. 7,2 Monate, HR=0,57; p=0,163) im Vergleich zur alleinigen FOLFOX-Therapie. Bei Karzinomen mit einer KRASMutation hingegen zeigte sich im Therapiearm mit Cetuximab+FOLFOX ein tendenziell schlechteres Ansprechen im Vergleich zur alleinigen Chemotherapie (33% vs. 49%, p=0,106). Ein gleiches Ergebnis zeigte sich in der neueren OPUSStudie, bei der neue Gewebeproben untersucht wurden (Bokemeyer et al., 2011). Durch die Zugabe von Cetuximab zu FOLFOX-4 ergab sich bei Patienten mit KRAS-Wildtyp ein verlängertes progressionsfreies Überleben (HR=0,567; p=0,0064) und eine Verbesserung der Ansprechrate (OR=2,551, p=0,0027). In der CRYSTAL-Studie wurden 599 Patienten mit einem mKRK mit dem FOLFIRI-Protokoll behandelt und 599 Patienten mit FOLFIRI plus Cetuximab (van Cutsem et al., 2009). Bei Patienten mit einem Wildtyp-KRAS zeigte sich ein verlängertes progressionsfreies Überleben bei der Zugabe von Cetuximab (9,9 vs. 8,7 Monate; HR=0,68; 95%-KI: 0,50-0,94) und ein tendentiell verlängertes Gesamtüberleben (24,9 vs. 21,0 Monate, HR=0,84; 95%-KI: 0,64-1,11). Werden nur Patienten mit KRAS-Mutationen betrachtet, besteht sowohl beim progressionsfreien Überleben (FOLFIRI+Cetuximab: 7,6 vs. FOLFIRI: 8,1 Monate; p=0,07) als auch bei dem Gesamtüberleben (17,5 vs. 17,7 Monate bei FOLFIRI alleine; p=0,44) kein Vorteil durch die Addition von Cetuximab. Zu einem ähnlichen Ergebnis kam auch die wesentlich kleinere Studie von Lièvre et al., in welcher bei 13 von 30 Patienten mit einem mKRK Mutationen im KRAS-Gen gefunden werden konnten. Es erfolgte eine Therapie mit Cetuximab, wobei bei den 11 Respondern bei keinem Patienten eine KRAS-Mutation vorhanden war. Bei 19 Patienten mit einer Resistenz gegen Cetuximab hingegen konnte in 68,4% der Fälle eine Mutation nachgewiesen werden (Lièvre et al., 2006). Es wurde ebenso in den nächsten beiden genannten Studien gezeigt, dass bei Vorhandensein einer KRAS-Mutation das Therapieansprechen oder die Prognose schlechter sind. In der Studie von Di Nicolantonio et al. wiesen 30% von 113 untersuchten Patienten eine KRAS-Mutation auf. Eine Resistenz bezüglich der Therapie mit Cetuximab oder Panitumumab konnte signifikant nachgewiesen werden (p=0,011) (Di Nicolantonio et al., 2008). In der Studie von Amado et al. wurde eine - 22 - Panitumumab-Therapie in Abhängigkeit von dem KRAS-Status untersucht. Es stellte sich heraus, dass das progressionsfreie Überleben bei Patienten mit einem KRAS-Wildtyp-Status signifikant besser war als bei einem mutierten KRAS (95%KI: 0,34-0,59 vs. 95%-KI: 0,73-1,36, p˂0,0001) (Amado et al., 2008). Studien, die den Zusammenhang zwischen dem KRAS-Status und dem Ansprechen auf eine oxaliplatinhaltige Therapie bei einem KRK im UICC Stadium IV untersuchen, waren bislang rar. Im Verlauf der Erstellung dieser Arbeit wurde die MRC FOCUS Studie publiziert. Diese zeigte, dass eine KRAS- oder BRAFMutation zwar mit einem schlechteren Gesamtüberleben (95%-KI: 1,20-1,65, p˂0,0001) und einem verringerten progressionsfreien Überleben (95%-KI: 1,001,36, p=0,05) zusammenhänge, durch eine Mutation das Ansprechen auf eine Irinotecan- oder Oxaliplatintherapie allerdings nicht beeinflusst werde. Somit profitierten Patienten mit einem mutierten KRAS oder BRAF ebenso von einer solchen Therapie (Richman et al., 2009). Eine weitere Studie zu einer Oxaliplatintherapie ist die CAIRO-Studie, welche untersuchte, ob es bei einer sequentiellen oder kombinierten Gabe von Capecitabine, Irinotecan und Oxaliplatin einen Unterschied im Therapieansprechen gibt. Es konnte gezeigt werden, dass die Art der Gabe das Gesamtüberleben nicht wesentlich beeinflusst (Koopman et al., 2007). 1.6.4.2. BRAF und Prognose In Bezug auf die Prognose eines KRK liegen bisher weniger Studienergebnisse in Korrelation mit BRAF als für KRAS vor, die verschiedenen Ergebnisse divergieren jedoch auch hier. Hinsichtlich der Inzidenz und dem prognostischen Einfluss von Biomarkern beim KRK untersuchten Roth et al. 1564 Gewebeproben der adjuvanten PETACC 3-Studie von Van Cutsem et al. mit 3278 Patienten. Für den Tumormarker BRAF wurden keine signifikanten Unterschiede bezüglich des Vorkommens in den einzelnen Tumorstadien gefunden. Eine Mutation in BRAF wurde sowohl im Stadium II als auch im Stadium III mit 8% evaluiert. Auch in Bezug auf die Prognose zeigte sich kein signifikanter Unterschied (BRAF: St. II: p=0,89, St. III: p=0,26) (Roth et al., 2010). Demgegenüber ist allerdings eine Studie publiziert, in welcher Patienten mit einer BRAF-Mutation ein signifikant schlechteres Gesamtüberleben hatten als Patienten mit BRAF-Wildtyp (median - 23 - 10,4 Monate vs. 34,7 Monate, p˂0,0001). Eine BRAF-Mutation wurde in 11% (57/524) nachgewiesen (Tran et al., 2010). In einer anderen Studie wird eine signifikante Korrelation einer BRAF-Mutation sowohl mit dem T-Stadium (p=0,016) als auch mit dem Grading (p=0,002) beschrieben (Aust et al., 2010). Material von 493 Patienten aus der PETACC2-Studie wurde retrospektiv untersucht. Dabei konnte eine BRAF-Mutation kein Mal in dem T1-Stadium (0/13, 0%) und zwei Mal in dem T2-Stadium (2/39, 5,1%) nachgewiesen werden. Die Anzahl der BRAFMutationen nahm im T3- und T4-Stadium zu (T3: 32/347, 9,2%, T4: 17/84, 20,2%). Ebenfalls konnte eine zunehmende Anzahl der BRAF-Mutationen mit ansteigendem Grading-Stadium nachgewiesen werden (G1: 1/35, 1,9%, G2: 26/316, 8,2%; G3: 24/128, 18,8%). Bezüglich des Profits einer 5-FU-haltigen Chemotherapie je nach BRAF-Status konnte jedoch keine Korrelation nachgewiesen werden. Nach drei Jahren unter einer adjuvanten Therapie mit 5FU/FA lebten noch 68% der Patienten mit KRAS/BRAF-Wildtyp (HR=0,89) und 65% der Patienten mit einer BRAF-Mutation (HR=1,08) (Aust et al., 2010). In einer Studie von Ince et al. konnte ebenfalls keine signifikante Beziehung zwischen Mutationen im BRAF-Gen und dem medianen Überleben bei einer Addition von Bevacizumab zu IFL beim mKRK gezeigt werden (Ince et al., 2005). In einigen Studien wurden BRAF-Mutationen mit Resistenzen gegenüber antiEGFR-Strategien in Verbindung gebracht. Die Meinungen in der Literatur gehen jedoch auseinander. In einer Studie von Finocchiaro et al. wurden 85 Patienten mit einem mit Cetuximab therapierten metastasierten kolorektalen Karzinom, bei denen der EGFR- und KRAS-Status bekannt war, unter anderem auf eine Mutation des BRAF untersucht. Eine BRAF-Mutation wurde bei 5% der Patienten gefunden und keiner dieser Patienten profitierte von der Therapie mit Cetuximab im Vergleich zum Wildtyp (Progressionszeit 1,2 vs. 4,6 Monate, p=0,09; OS 5,4 vs. 9,8 Monate, p=0,3) (Finocchiaro et al., 2008). In einer Studie von Di Nicolantonio et al. sprach keiner der Patienten mit einer BRAF-Mutation auf eine Therapie mit Cetuximab oder Panitumumab an, im Vergleich dazu befand sich unter den Therapierespondern kein Patient mit einer BRAF-Mutation (p=0,029). Patienten mit einer BRAF-Mutation zeigten ein signifikant kürzeres progressionsfreies Überleben (p=0,011) und ein signifikant kürzeres Gesamtüberleben (p<0,0001) (Di Nicolantonio et al., 2008). Ebenso sprach keiner der Patienten mit einer BRAFMutation (8 von 50) in der Studie von Weickhardt et al. auf eine Cetuximab-haltige Therapie an (Weickhardt et al., 2010). - 24 - In einer relativ neuen Studie von Maughan et al. wurden 1630 Patienten entweder mit Oxaliplatin und Fluoropyrimidinen oder noch zusätzlich mit Cetuximab behandelt. Eine BRAF-Mutation wurde bei 102 Patienten nachgewiesen (8%). Es konnte jedoch kein signifikanter Unterschied bei der Addition von Cetuximab aufgezeigt werden (OS: HR 1,04, 95%-KI: 0,87-1,23, p=0,67; PFS: HR: 0,96, 95%KI: 0,82-1,12, p=0,60) (Maughan et al., 2010). Zu einem ähnlichen Ergebnis kam es in der Analyse der OPUS- und CRYSTAL-Studien von Bokemeyer et al., nach welcher der BRAF-Status kein entscheidender prädiktiver Marker bezüglich des Ansprechens auf Cetuximab sei. Diese Aussage wird jedoch in dem Artikel insofern eingeschränkt, als dass die Anzahl der BRAF-Mutationen für eine definitive Aussage möglicherweise zu gering sei (Bokemeyer et al., 2010). Auch gemäß den Ergebnissen der CAIRO2-Studie sei eine BRAF-Mutation zwar korreliert mit einem verringerten progressionsfreien Überleben, ein besseres oder schlechteres Ergebnis bei Cetuximab-Gabe konnte jedoch nicht aufgezeigt werden (PFS: 5,9 vs. 12,2 Monate in dem Arm Chemotherapie+Bevacizumab, p=0,003; 6,6 vs. 10,4 Monate in dem Bevacizumab+Cetuximab, p=0,010) (Tol et al., 2009). - 25 - Arm Chemotherapie+ 2. Zielsetzung Das KRK ist in Europa die zweithäufigste tumorbedingte Todesursache. Bei Erstdiagnose weisen etwa 25% der Patienten eine Fernmetastasierung und 3060% der Patienten eine Metastasierung im Verlauf auf. Durch die Einführung neuer Chemotherapeutika konnte die Prognose des mKRK deutlich verbessert werden. Allerdings ist das Ansprechen auf die Therapie nicht vorhersagbar, zudem können schwerwiegende Toxizitäten bei der Therapie auftreten und die Behandlungskosten nehmen durch die Einführung neuer Substanzen zu. Daher kommt der Identifikation von Biomarkern zur Prädiktion des Therapieansprechens und zur Prognoseabschätzung eine entscheidende Bedeutung zu. Der am besten etablierte Biomarker bei KRK ist der Nachweis von KRASMutationen hinsichtlich der Prädiktion eines Ansprechens auf eine anti-EGFRTherapie mit monoklonalen Antikörpern alleine oder in Kombination mit einer konventionellen Chemotherapie. Ein weiterer potenzieller prädiktiver oder prognostischer Marker bei KRK sind BRAF-Mutationen. Bei KRK liegt eine KRASMutation in circa 30-40% vor. Eine BRAF-Mutation kommt mit einer Häufigkeit von 5-10% vor. Dabei konnte gezeigt werden, dass Mutationen im BRAF- und KRASGen nicht gleichzeitig vorkommen. KRAS hat sich mittlerweile als ein wichtiger prognostischer Marker beim KRK etabliert, Ergebnisse divergieren jedoch noch immer. Insbesondere in Bezug auf das Ansprechen Zusammenhang auf zu eine bestehen. anti-EGFR-Antikörpertherapie Mutationen in BRAF scheint scheinen ein ähnliche Auswirkungen zu haben, der genaue prognostische und prädiktive Nutzen ist jedoch noch nicht geklärt. Insbesondere der Effekt von KRAS- oder BRAFMutationen auf eine Oxaliplatin-Therapie ist derzeit noch unklar. Aus diesem Grund sind weitere Nachforschungen auf diesem Gebiet unerlässlich. In dieser Promotionsarbeit soll die prognostische Bedeutung von KRAS- und BRAF-Mutationen bei Patienten mit mKRK unter einer Kombinations- chemotherapie mit Fluoropyrimidinen und Oxaliplatin evaluiert werden. Die Gewebeproben sowie die klinischen Verlaufsdaten entstammen einer Subpopulation von 205 Patienten mit verfügbaren Gewebeproben aus einer bereits abgeschlossenen prospektiven, randomisierten, Therapiestudie mit insgesamt 474 Patienten. - 26 - multizentrischen Phase-III- 3. Material und Methoden 3.1. Material Die untersuchten Gewebeproben stammen von Patienten aus einer prospektiv randomisierten zweiarmigen Phase-III-Studie (FUFOX versus CAPOX) der AIO zur Erstlinientherapie des metastasierten KRK. Die Patienten des Armes A wurden mit 5-Fluorouracil/Folinsäure plus Oxaliplatin (FUFOX) therapiert und die Patienten des Armes B erhielten Capecitabin plus Oxaliplatin (CAPOX). Die Details zu den Ein- und Ausschlusskriterien, der Behandlungsprotokolle und der Ergebnisse der klinischen Studie mit 474 Patienten sind publiziert (Porschen et al., 2007). Hauptendpunkt war die Nicht-Unterlegenheit im progressionsfreien Überleben (PFS). Als Hauptergebnis konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass eine Erstlinientherapie mit CAPOX bei Patienten mit einem mKRK der Gabe von FUFOX in Bezug auf das progressionsfreie Überleben gleichwertig ist. Die sekundären Endpunkte beinhalteten den Vergleich der Remissionsraten, der Gesamtüberlebenszeiten, der Toxizitäten sowie die Beurteilung der Lebensqualität. Es waren Gewebeproben von 207 Patienten verfügbar, wobei der KRAS- und BRAF-Status erfolgreich in 205 Tumoren analysiert werden konnte. Das untersuchte Teilkollektiv unterscheidet sich in Bezug auf Alter, Geschlecht, Therapie (FUFOX bzw. CAPOX) nicht vom Gesamtkollektiv aller Studienpatienten. Es wurde bei der Ethik-Kommission der Ruhr-Universität Bochum am 8. Juli 2002 der Antrag mit dem Thema „5-Fluorouracil/Folinsäure plus Oxaliplatin (FUFOX) versus Oxaliplatin/Capecitabin (CAPOX) beim fortgeschrittenen kolorektalen Karzinom“ vorgelegt. Es wurde diesem Antrag am 12. Juli 2002 unter der Registrier-Nr. 1923 durch ein positives Votum der Ethik-Kommission zugestimmt. Das translationale Begleitforschungsprogramm (die u.a. die Analyse von KRAS und BRAF in diesem Kollektiv beinhaltet) wurde im Studienprotokoll erläutert und in der Patientenaufklärung aufgeführt. Es fand eine freiwillige Teilnahme am translationalen Forschungsprogramm von Seiten der Patienten statt. Es wurde von jedem Patienten zur Analyse der Proben und Teilnahme an der Studie eine Einwilligung eingeholt. - 27 - In der nachfolgenden Tabelle sind die Geräte und Materialien aufgelistet, die für die Aufbereitung und Auswertung der in dieser Promotionsarbeit untersuchten Gewebeproben verwendet wurden. Tabelle 2: Geräte und Materialien Artikel Hersteller CFX96™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Laboratories, Deutschland Eppendorf Research Pipetten Eppendorf, Deutschland Mikrotom-Klingen R35 pfm AG, Köln, Deutschland Beckman Microfuge E Beckman Coulter, Deutschland Objektträger M7620, 76x26 mm mit Mattrand 20 mm Süsse GmbH Labortechnik, Deutschland Präzisonswaage Sartorius Mechatronics, Deutschland Schüttler Sartorius Mechatronics, Deutschland Pipettenspitzen TipOne Starlab, Deutschland Deckgläser, 24x50 mm Diagonal GmbH & Co KG, Deutschland UV-Transilluminator TI3 Biometra, Deutschland Leitfähigkeitsmessgerät EC3000-90 E-C apparatus corporation, USA Kühlplatte CP 60 Microm International GmbH, Deutschland Statistikprogramm SPSS 16.0 SPSS GmbH Software, Deutschland Textverarbeitungsprogramm ® Microsoft Word 2007 Microsoft Deutschland GmbH, Deutschland Tabellenkalkulationsprogramm ® Microsoft Excel 2007 Microsoft Deutschland GmbH, Deutschland QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Deutschland Xylol Quadflieg GmbH, Deutschland Alkohol 70%, 90%, 100% Quadflieg GmbH, Deutschland Aqua destillata aus eigener Destillationsanlage Tris-/EDTA-Pufferlösung Dako Target Retrieval Solution pH 9 Dako Deutschland GmbH, Deutschland Borsäure Dako Deutschland GmbH, Deutschland Ethidiumbromid Dako Deutschland GmbH, Deutschland Biozym Sieve 3:1 Agarose Biozym, Deutschland KRAS- bzw. BRAF-Mutations Kits DxS Ltd., UK Mayers Hämalaun Fa. Merck,Deutschland TM Eindeckmedium Cytoseal Eosin Y, wässrig 2% XYL Microm International GmbH, Deutschland Microm International GmbH, Walldorf, Deutschland - 28 - 3.2. Methodik Die DNA wurde aus pseudoanonymisierten Formalin-fixierten, Paraffin eingebetteten Gewebeproben (FFPE) extrahiert. Pro Patient wurden fünf 10 µm dicke Schnitte angefertigt. Ein zusätzlicher 1 µm dicker Schnitt wurde in H&EFärbung gefärbt. Regionen mit mehr als 70% Tumorgewebe wurden markiert und makrodisseziiert. Für die DNA-Extraktion wurde der QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) nach den Herstellerangaben verwandt. Die Makrodissektion erfolgte im Institut für Pathologie der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil. Für die real-time PCR, welche ebenfalls in den Räumen des Instituts für Pathologie der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil durchgeführt wurde, wurden 20 ng DNA eingesetzt. Für die Analytik wurden kommerzielle Kits der DxS Ltd. (Manchester, UK) nach den Herstellerangaben eingesetzt. Mit Hilfe des KRAS-Mutations-Kits wurden sieben KRAS-Mutationen detektiert: Mutationen an den Aminosäuren 12Aspartat, 13Aspartat, 12Valin, 12Alanin, 12Cystein, 12Serin und 12Arginin. Durch dieses Verfahren wurden mehr als 95% der bekannten KRAS-Mutationen nachgewiesen. Generell dient die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) dazu, die DNA zu vervielfältigen und auf diesem Wege die o.g. Mutationen detektieren zu können. Die PCR besteht aus mehreren Zyklen, welche in einem Thermocycler durchgeführt werden. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten. Zunächst werden durch eine Erhitzung der DNA auf 94-96 Grad Celcius die Wasserstoffbrückenbindungen gelöst und die DNA somit denaturiert, bis nur noch Einzelstränge vorliegen. Der nächste Schritt ist die Primerhybridisierung, welche die Anlagerung der zugegebenen Primer an den gewünschten DNA-Abschnitt darstellt. Darauf folgt die Elongation durch die zugegebenen DNA-Polymerasen. Durch die Zugabe von verschiedenen Primern kann somit bestimmt werden, welcher DNA-Abschnitt aufgefunden und somit amplifiziert wird, beispielsweise die oben beschriebenen KRAS-Mutationen. Bzgl. BRAF wurde gezielt die Hotspot-Mutation V600E-Mutation detektiert. Da gezeigt wurde, dass KRAS- und BRAF-Mutationen nicht gleichzeitig in einem Tumor vorkommen (Yoshitake et al., 2007), untersuchten wir nur diejenigen Tumoren auf eine BRAF V600E-Mutation, in denen keine KRAS-Mutation nachgewiesen werden konnte. Es fand eine Verblindung zwischen dem Laborpersonal und den klinischen Daten statt. - 29 - 3.3. Statistik Für die statistische Auswertung wurden der Fisher’s-Exact-Test für den Zusammenhang zwischen KRAS bzw. BRAF und anderen dichotomen Variablen, der Student-T-Test für die Prüfung der Signifikanz der Beziehung zwischen kontinuierlichen Variablen sowie der Kruskal-Wallis-Test für die Identifikation der signifikanten Unterschiede einer kontinuierlichen Variable zwischen verschiedenen Gruppen angewandt. Des Weiteren wurde der Mann-Withney-U-Test verwendet, um intervallskalierte Variablen zwischen zwei verschiedenen Gruppen zu vergleichen. Das Gesamtüberleben und das progressionsfreie Überleben wurden mit Hilfe von Kaplan-Meier-Kurven graphisch dargestellt (Kaplan und Meier, 1958) und das Gesamtüberleben sowie das progressionsfreie Überleben der Subgruppen mittels Log-Rank-Test verglichen. Als statistisch signifikant wurden p-Werte kleiner als 0,05 in 2-seitigen Tests bewertet. Als Remissionsrate sei der prozentuale Anteil erfolgreich behandelter Patienten zu verstehen, bei denen eine Tumorverkleinerung (partielle Remission) oder die vollständige Rückbildung des Tumors (komplette Remission) erzielt wurde. Unter der Krankheitskontrollrate versteht man den Prozentsatz der Patienten mit komplettem bzw. partiellem Ansprechen oder Stabilisierung der Erkrankung. - 30 - 4. Ergebnisse 4.1. Beschreibung des Patientenkollektivs Bei den 205 Patienten mit verfügbaren und erfolgreich analysierbaren Gewebeproben handelte es sich um 124 (60,5%) männliche und 81 (39,5%) weibliche Patienten mit einem mittleren Alter von 64,2 ± 8,6 Jahren mit einer unteren Grenze von 35 Jahren und einem maximalen Alter von 82 Jahren. 105 (51,2%) Patienten wurden im FUFOX-Arm und 99 (48,3%) Patienten im CAPOX-Arm der Studie therapiert. Die Therapie eines Patienten konnte nicht nachvollzogen werden. Bei 134 (65,4%) Personen war das Kolon befallen und bei 61 (29,8%) Patienten das Rektum. Bei 10 (4,9%) Patienten war die Lokalisation nicht bekannt. 104 (50,7%) Tumoren wiesen synchrone und 82 (40,0%) Karzinome metachrone Metastasen auf. Bei 19 (9,3%) Patienten war dies nicht bekannt. Das hier analysierte Subkollektiv unterschied sich bzgl. der o.g. Variablen nicht vom Gesamtkollektiv aller 474 Patienten. 4.2. Häufigkeit von KRAS- und BRAF-Mutationen Der KRAS-Wildtyp wurde in 130 (63,4%) der 205 verfügbaren Tumoren nachgewiesen und eine KRAS-Mutation lag in 75 Fällen vor (36,6%). Die häufigste Mutation mit 25 Fällen (12,2%) wurde im Kodon 12 nachgewiesen und führte zu einem Aminosäure (AS)-Austausch zu Aspartat. 15 Mutationen (7,3%) führten in Kodon 13 zu einem AS-Austausch zu Aspartat und 13 Mutationen (6,3%) in Kodon 12 zu einem AS-Austausch zu Valin. 7 Mutationen (3,4%) führten in Kodon 12 zu einem AS-Austausch zu Alanin und mit einer Häufigkeit von jeweils 6 Mutationen (jeweils 2,9%) traten Mutationen in Kodon 12 auf, die zu einem AS-Austausch zu Cystein und Serin führten. 1 Mutation (0,5%) führte in Kodon 12 zu einem ASAustausch zu Arginin. Ein Tumor (0.5%) wies zwei verschiedene KRASMutationen auf. Die BRAF V600E-Mutation wurde in 13 Tumoren von 130 Tumoren (10,0%) mit Wildtyp-KRAS nachgewiesen, entsprechend 6,3% der gesamten untersuchten 205 - 31 - Tumorpatienten. 88 der 205 Patienten (42,9%) wiesen entweder eine KRAS- oder eine BRAF-Mutation auf. 4.3. Korrelation mit klinischen Variablen Es bestand keine signifikante Korrelation zwischen einer KRAS-Mutation und dem Geschlecht. Der Mittelwert des Alters betrug bei dem KRAS- und dem BRAFWildtyp 64,5 ± 8,7 Jahre, während das mittlere Alter bei den KRAS- und BRAFMutationen bei 64,0 ± 8,5 Jahren lag (p=0,94). Ebenso bestand kein signifikanter Unterschied hinsichtlich des Therapiearms, der Lokalisation und der Art der Metastasierung (s. Tabelle 3). Tabelle 3: Korrelation mit klinischen Variablen Geschlecht Therapiearm Lokalisation Metastasierung KRAS- KRAS- WT Mut M 82/124 42/124 W 48/81 33/81 FUFOX 65/105 40/105 CAPOX 64/99 35/99 Kolon 49/134 85/134 Rektum 35/61 26/61 Syn 69/104 35/104 Meta 48/82 34/82 p 0,37 0,69 0,42 0,27 BRAF- BRAF- WT Mut 72/78 5/78 36/44 8/44 53/62 9/62 54/59 4/59 70/78 7/78 29/34 5 /34 54/60 6/60 44/49 4/49 p 0,1 0,24 0,55 0,52 4.4. Korrelation mit dem Therapieansprechen Die Evaluation des Therapieansprechens war bei 199 Patienten möglich. Bei Patienten mit KRAS-Wildtyp-Tumoren wurden 6 komplette Remissionen, 74 Patienten mit partiellen Remissionen, 31 stabile Erkrankungen und 16 progrediente Erkrankungen beobachtet. Bei den Patienten mit KRAS-Mutationen wurden 3 komplette Remissionen, 29 partielle Remissionen, 25 stabile Erkrankungen und 15 progrediente Tumoren festgestellt. Beim BRAF-Wildtyp lagen - 32 - 5 komplette Remissionen, 60 partielle Remissionen, 26 stabile Erkrankungen und 14 progrediente Erkrankungen vor. Bei der BRAF-Mutation hatte kein Patient eine komplette Remission. Bei 8 Patienten wurde eine partielle Remission und bei 4 Patienten eine Stabilisierung beobachtet. Ein Patient mit BRAF-Mutation war progredient. Die Unterschiede in der globalen Verteilung waren statistisch nicht signifikant (p=0,68). Tabelle 4: Darstellung des Therapieansprechens KRAS-WT KRAS-Mut BRAF-WT BRAF-Mut Komplette Remission 6 3 5 0 Partielle Remission 74 29 60 8 Stabile Erkrankung 31 25 29 4 Progrediente Erkrankung 16 15 14 1 Nicht evaluierbar 3 3 0 0 130 75 108 13 Summe Tumoren mit KRAS-Mutationen wiesen eine signifikant geringere Remissionsrate als Tumoren ohne KRAS-Mutation auf (44,4% vs. 63,0%, p=0,012) (Tabelle 5). Bei Hinzunahme der BRAF-Mutationen wurde der signifikante Unterschied beim Vergleich von Tumoren mit einer KRAS- oder BRAF-Mutation gegenüber Tumoren mit einem KRAS- und BRAF-Wildtyp beibehalten (46,4% vs. 63,5%, p=0,021). Bei der Krankheitskontrollrate konnte kein signifikanter Unterschied zwischen Tumoren mit einer KRAS- oder BRAF-Mutation im Vergleich zu Tumoren mit Wildtyp für beide Gene festgestellt werden (80.9 vs. 87,0, p=0,323). KRASMutationen allein betrachtet zeigten ebenfalls keinen statistisch signifikanten Unterschied bezüglich des Stabilisierungsgrades (p=0,155). BRAF-Mutationen allein waren weder mit einer unterschiedlichen Remission noch mit einer unterschiedlichen Krankheitskontrollrate im Vergleich zu BRAF-Wildtyp-Tumoren assoziiert. Hier muss bei der Interpretation jedoch die geringe Zahl von BRAFMutationen berücksichtigt werden. - 33 - Im globalen Vergleich ergibt sich ein Trend ohne statistische Signifikanz (p=0,084). Tabelle 5: Korrelation zwischen Remissionsverhalten und KRAS- und BRAFMutation Remission (komplette+partielle Remission) n KRAS BRAF* KRAS/BRAF % WT 80/127 63.0 Mut 32/72 44.4 WT 65/105 61.9 Mut 8/13 61.5 WT 73/115 63.5 Mut 39/84 46.4 p 0.012 0.44 0.021 Stabilisierung (komplette+partielle Remission+Stabilisierung) n % 111/127 87.4 57/72 79.2 91/105 86.7 12/13 92.3 100/115 87.0 68/84 80.9 p 0.15 0.79 0.30 * Es wurden nur Tumoren ohne KRAS-Mutation auf BRAF-Mutationen untersucht. 4.5. Korrelation mit dem Überleben 4.5.1. Progressionsfreies Überleben Während des Follow-ups entwickelten 171 von 204 Patienten einen Progress der Erkrankung. Die progressionsfreie Überlebenszeit bei Patienten mit KRAS-Wildtyp betrug im Median 7,5 Monate (95%-KI: 6,3-8,6 Monate) gegenüber 8,4 Monate (95%-KI: 5,9-10,8 Monate) bei Patienten mit KRAS-Mutation. Der Unterschied war nicht signifikant (p=0,735) (s. Abb. 1). - 34 - Abbildung 1: Progressionsfreies Überleben nach KRAS-Mutations-Status Patienten mit einem KRAS- und BRAF-Wildtyp hatten ein medianes progressionsfreies Überleben von 7,6 Monaten (95%-KI: 6,5-8,6 Monate) gegenüber 7,5 Monaten (95%-KI: 4,9-10,0 Monate) für Patienten mit KRAS- oder BRAF-Mutation (p=0,89) (s. Abb. 2). Abbildung 2: Progressionsfreies Überleben nach KRAS-/BRAF-Status - 35 - 4.5.2. Gesamtüberleben Im Follow-up verstarben 136 der 204 evaluierbaren Patienten. Patienten mit KRAS-Wildtyp wiesen ein wesentlich besseres medianes Überleben (18,9 Monate, 95%-KI: 14,7-23,2 Monate) auf als Patienten mit KRAS-Mutation (16,1 Monate, 95%-KI: 14,7-17,6 Monate). Der beobachtete Trend war mit einem p von 0,085 jedoch nicht signifikant (s. Abb. 3). Abbildung 3: Gesamtüberleben nach KRAS-Mutationsstatus Bei der Betrachtung der Abbildung 3 fällt auf, dass der Kurvenverlauf für KRASWildtyp und KRAS-Mutation in den ersten 15 Monaten etwa gleich verläuft und dass sich erst dann die Kurven separieren. Dies legt den Schluss nahe, dass der wesentliche prognostische Effekt durch Folgetherapien verursacht wurde. Das Gesamtüberleben der Patienten mit KRAS- oder BRAF-Wildtyp betrug 20,8 Monate (95%-KI: 15,6-26,1 Monate). War eine der beiden Mutationen vorhanden, war das Gesamtüberleben kürzer (15,6 Monate, 95%-KI: 12,4-18,8 Monate). Der Unterschied war statistisch signifikant (p=0,013) (s. Abb. 4). - 36 - Abbildung 4: Gesamtüberleben nach KRAS-/BRAF-Mutationsstatus Zusammenfassend zeigte sich, dass KRAS-Mutationen oder die Kombination von KRAS- und BRAF-Mutationen mit einem schlechteren Therapieansprechen und einem schlechteren Gesamtüberleben assoziiert sind, während sich beim progressionsfreien Überleben kein Unterschied beobachten ließ. 4.5.3. Möglicher Einfluss von Folgetherapien 136 der 205 Patienten erhielten eine Folgetherapie. Von diesen wiesen 83 Patienten einen KRAS-Wildtyp und 53 Patienten eine KRAS-Mutation auf. 80% der Patienten erhielten eine Zweitlinientherapie mit Irinotecan, 30% der Patienten wurden mit einer Drittlinientherapie mit Cetuximab behandelt. Bei Patienten ohne Folgetherapie (n=82) zeigte sich bezüglich Gesamtüberlebens ab Progress kein wesentlicher Unterschied (s. Abb. 5). - 37 - des Abbildung 5: Postprogressionsüberleben nach KRAS-Mutationsstatus bei Patienten, die keine Zweitlinientherapie erhielten (n=82) 116 Patienten erhielten eine Irinotecan-haltige Zweitlinientherapie. In dieser Gruppe zeigte sich ein Trend zu einem günstigeren Postprogressionsüberleben in der KRAS-Wildtyp-Gruppe (p=0,072) (s. Abb. 6). - 38 - Abbildung 6: Postprogressionsüberleben nach KRAS-Mutationsstatus bei Patienten, die eine Irinotecan-haltige Zweitlinientherapie erhielten (n=116) Insbesondere die Subgruppe der Patienten mit KRAS-Wildtyp und einer Folgetherapie mit Cetuximab (n=41) profitierten beim Gesamtüberleben von dieser Therapie, während Patienten ohne Cetuximab-haltige Folgetherapie keinen Unterschied im Postprogressionsüberleben in Abhängigkeit vom KRAS-Status aufwiesen (s. Abb. 7 und 8) . - 39 - Abbildung 7: Postprogressionsüberleben nach KRAS-Mutationsstatus bei Patienten, die eine Cetuximab-haltige Folgetherapie erhielten (n=41) Abbildung 8: Postprogressionsüberleben nach KRAS-Mutationsstatus bei Patienten, die eine Irinotecan-haltige Zweitlinientherapie ohne eine Cetuximab-Gabe erhielten (n=75) - 40 - 5. Diskussion In den vergangenen Jahren konnte die Behandlung und die Prognose der Patienten mit einem KRK aufgrund neuer Chemotherapeutika und zielgerichteter Substanzen deutlich verbessert werden. In erster Linie profitieren Patienten mit einem metastasierten Karzinom von neuen Kombinationen der Medikamente, da dadurch das mediane Überleben von nur sechs Monaten durch beste supportive Behandlung auf über zwei Jahre verlängert werden kann, wenn alle Mittel ausgeschöpft werden. Allerdings ist das Ansprechen auf die Therapie derzeit nicht vorhersagbar, d.h. nicht alle Patienten profitieren gleichermaßen von den verschiedenen Medikamenten, das Auftreten schwerwiegender Toxizitäten ist möglich und nur bedingt vorhersagbar. Da bereits circa 25% der Patienten bei Erstdiagnose eine Fernmetastasierung aufweisen und bei 30-60% der Patienten das KRK im Verlauf metastasiert und die Behandlungskosten durch die Einführung neuer Substanzen erheblich steigen, besteht eine deutliche gesundheitsökonomische Dimension bzgl. der Identifikation von prädiktiven Biomarkern, die eine Individualisierung der Therapie hinsichtlich Therapieansprechen und Toxizitäten erlauben. In der vorliegenden Promotionsarbeit wurden Proben von 207 der 474 Patienten, die in eine prospektive randomisierte zweiarmige Phase-II/III-Studie (FUFOX versus CAPOX) der AIO zur Erstlinientherapie des mKRK eingeschlossen wurden (Porschen et al., 2007), auf das Vorliegen von KRAS- und BRAF-Mutationen untersucht. Für die Untersuchung lagen Formalin-fixierte paraffin-eingebettete Gewebeproben vor. Damit wurde ein Subkollektiv von 43,2% des Gesamtkollektivs der klinischen Studie retrospektiv evaluiert, womit für eine multizentrische Studie mit vielen beteiligten Studienzentren und Primärpathologien eine gute Quote erreicht wurde. Die Patientenpopulation mit verfügbaren Gewebeproben war repräsentativ in Bezug auf das Gesamtpatientenkollektiv aller 474 Patienten. 205 der vorliegenden 207 Gewebeproben konnten erfolgreich analysiert werden (99%). Die technische Durchführbarkeit erbrachte ein sehr gutes Ergebnis, wenn man bedenkt, dass die Proben der Primärtumoren zum Teil bis zu zehn Jahre alt waren. In 75 Fällen konnte eine KRAS-Mutation nachgewiesen werden (36,6%), wobei die häufigste Mutation mit 25 Fällen im Kodon 12 gefunden wurde, welche zu - 41 - einem Aminosäurewechsel zu Aspartat führte (33,3% der KRAS-Mutationen). Dieses Ergebnis entspricht der publizierten Literatur, wonach bei KRK eine KRASGen-Mutation mit einer Häufigkeit von circa 30-40% vorliegt (Bleeker et al., 2001; Esteller et al., 2001; Bazan et al., 2002; Fransen et al., 2004). Auch in der Studie von Roth et al. mit 1564 Patienten mit einem KRK wurde eine KRAS-Mutation im Stadium II mit einer Häufigkeit von 36% und im Stadium III mit einer Häufigkeit von 37% nachgewiesen (Roth et al., 2010). Zudem sind bei KRK über 90% der KRASMutationen im Kodon 12 und 13 lokalisiert (Bazan et al., 2002). Bei der Frage, ob eine KRAS-Mutation mit dem Tumorstadium, der Lokalisation oder dem Grading korreliert ist, ist die Datenlage kontrovers (Cerottini et al., 1998; Samowitz et al., 2000). In einer frühen Studie von Oliva et al. wurde kein Zusammenhang zwischen einer Mutation und dem Tumorstadium gesehen (Oliva et al., 1990). Troungos et al. wiesen hingegen eine Korrelation zwischen einer vorhandenen KRAS-Mutation und der Invasionstiefe des Tumors nach. Ein Zusammenhang zwischen einer Mutation und regionalen Lymphknotenmetastasen wurde aber auch nicht gesehen (Troungos et al., 1997). In einer relativ neuen Studie von Roth et al. wurden wiederum keine signifikanten Unterschiede bezüglich des Vorkommens in den einzelnen Tumorstadien gefunden. Ein mutiertes KRAS kam im Stadium II mit einer Häufigkeit von 36% und im Stadium III mit 37% bei 1564 Gewebeproben der adjuvanten PETACC3-Studie von van Cutsem et al. mit 3278 Patienten vor (Roth et al., 2010). Eine Reihe von Studien deuten auf einen negativen prognostischen Wert einer KRAS-Mutation hin. So untersuchten Ahnen et al. 66 Patienten mit einem Karzinom im UICC-Stadium II und 163 Patienten mit einem UICC-Stadium IIIKarzinom. Sie wiesen ein verkürztes 7-Jahres-Gesamtüberleben bei vorhandenen KRAS-Mutationen im UICC-Stadium II nach (58% bei KRAS-Mutationen vs. 86% in der KRAS-Wildtyp-Gruppe). Die Hazard ratio (HR) bezüglich des Sterbens lag bei 4,5 (95%-KI: 1,7-12,1; p=0,012) (Ahnen et al., 1998). Samowitz et al. untersuchten 1413 Patienten mit einem KRK und wiesen in 32% der Tumoren eine KRAS-Mutation nach. Eine KRAS-Mutation im Kodon 13 war verbunden mit einer erhöhten Mortalität von 40% (95%-KI: 0,95-2,0) (Samowitz et al., 2000). Cerottini et al. analysierten bei 98 Patienten den Zusammenhang einer KRAS-Mutation und der Prognose. Sowohl das progressionsfreie - 42 - (p=0,02) als auch das Gesamtüberleben (p=0,03) waren signifikant kürzer bei Vorhandensein einer KRAS-Mutation. Im Vergleich zu den oben genannten Studien liegen jedoch auch Studien vor, die keinen oder nur teilweise einen Zusammenhang zwischen dem KRAS-Status und der Prognose sehen. Beispielsweise wurden in einer Studie von Bouzourene et al. 122 Patienten mit einem sporadischen KRK des Stadiums UICC II auf das Vorliegen einer KRAS- oder p53-Mutation untersucht (Bouzourene et al., 2000). 57 Patienten (38%) wiesen eine KRAS-Mutation im Kodon 12 oder 13 auf. Das Vorliegen oder die Abwesenheit einer KRAS-Mutation war nicht mit der Prognose korreliert (p=0,703). In einer Studie von Winder et al. wurden 342 Patienten mit einem KRK untersucht. Eine KRAS-Mutation wurde mit einer Häufigkeit von 28% nachgewiesen und es konnte gezeigt werden, dass Patienten mit einer Mutation im Kodon 12 (G12V-Mutation) ein signifikant kürzeres Gesamtüberleben aufwiesen als Patienten mit einem Wildtyp (HR=2,56 (1,15-5,69)). Bei Nachweis anderer Mutationen als der Mutation G12V hingegen zeigte sich ein verbessertes Gesamtüberleben im Vergleich zu Wildtyp-Patienten (HR=0,44 (0-0,99)) (Winder et al., 2009). Lee et al. untersuchten 64 Patienten mit einem KRK. 4 dieser Patienten hatten ein Karzinom im UICC Stadium I, 34 Patienten wiesen das UICC Stadium II auf, 21 Patienten das Stadium III und in 5 KRK wurde das Stadium IV nachgewiesen. 13 Tumoren (20%) zeigten eine KRAS-Mutation. In dieser Studie konnte ein Zusammenhang bei den Stadien I und II zwischen einer KRASMutation und einem verkürzten Gesamtüberleben aufgezeigt werden (p=0,003). Das relative Mortalitätsrisiko bei den Stadien I und II betrug 7,74 (95%-KI: 1,7234,89). Bei den UICC-Stadien III und IV war hingegen keine Korrelation zum Gesamtüberleben nachzuweisen (Lee et al., 1996). In Bezug auf den prädiktiven Nutzen einer KRAS-Mutation gibt es in der Literatur ebenfalls unterschiedliche Meinungen. In der vorliegenden Promotionsarbeit konnte das Therapieansprechen in Bezug auf FUFOX oder CAPOX bei 199 Patienten evaluiert werden. Da in dem klinischen Teil der zugrunde liegenden Studie von Porschen et al. als Hauptergebnis gezeigt werden konnte, dass eine Erstlinientherapie mit CAPOX bei Patienten mit einem mKRK der Gabe von FUFOX in Bezug auf das progressionsfreie Überleben nicht unterlegen ist, konnten für die vorliegende Auswertung beide Therapiearme zusammen ausgewertet werden. - 43 - So gibt es in der Literatur kontroverse Ergebnisse bezüglich des Ansprechens auf eine adjuvante 5-FU-basierte Chemotherapie bei Vorliegen einer KRAS-Mutation. Während in einigen Studien keine Assoziation zwischen dem klinischen Benefit und einer KRAS-Mutation bei adjuvant behandelten KRK gefunden wurde (Bleeker et al., 2001; Westra et al., 2005; Fuchs et al., 2009), zeigten andere Autoren einen deutlich besseren Profit der Tumoren mit KRAS-Wildtyp im Vergleich zu einer KRAS-Mutation (Ahnen et al., 1998), was auch dem Ergebnis dieser Promotionsarbeit entspricht. So untersuchten Ahnen et al. 66 KRK des Stadiums II und 163 Stadium III-Tumoren, welche mit Levamisol oder 5-FU plus Levamisol adjuvant therapiert wurden. In 41% der Tumoren konnte eine KRAS-Mutation gefunden werden. Im Tumorstadium III beeinflusste eine adjuvante Therapie mit Levamisol und 5-FU das 7-Jahres-Überleben bei Patienten mit Wildtyp-KRAS positiv im Vergleich zu KRAS-mutierten Tumoren (76 vs. 44%, HR: 0,4; 95%-KI: 0,2-0,8). Patienten mit einer KRAS-Mutation sowie Patienten mit einem Tumor im Stadium II profitierten nicht von einer adjuvanten Therapie. In einer neueren Arbeit der Quasar Collaborative Group wurden 3239 Patienten mit einem KRK im Stadium II generell in Hinblick auf das Ansprechen einer Therapie mit Fluorouracil und Folinsäure untersucht. Sie erhielten entweder Fluorouracil und Folinsäure (n=1622) oder wurden der reinen Beobachtung (n=1617) unterzogen. Es zeigte sich eine signifikant höhere Sterberate bei der reinen Beobachtung (370 Todesfälle vs. 311 Todesfälle, 95%-KI: 0,70-0,95, p=0,008) sowie eine signifikant höhere Rezidivrate bei den Patienten, die keine Chemotherapie erhielten (359 Rezidive vs. 293 Rezidive, 95%-KI: 0,67-0,91, p=0,001) im Vergleich zu Patienten, die mit Fluorouracil und Folinsäure behandelt wurden (Quasar Collaborative Group, 2007). Wird in der CRYSTAL-Studie das Gesamtüberleben betrachtet, sieht man einen ähnlichen Tenor wie in der Studie von Ahnen et al. Es zeigte sich bei einer KRAS-Mutation und einer alleinigen FOLFIRI-Therapie ein verkürztes Gesamtüberleben im Vergleich zu Patienten mit KRAS-Wildtyp (17,7 vs. 21,0 Monate) (van Cutsem et al., 2009). Zhang et al. führten eine Studie mit 173 Patienten durch, die in einer Phase II-Studie mit Oxaliplatin und 5-FU behandelt wurden. Patienten mit einem Wildtyp-KRAS-Status wiesen eine Ansprechrate von 27% auf, Patienten mit einer KRAS-Mutation zeigten nur eine Ansprechrate von 7% (p=0,26). Das mediane progressionsfreie Überleben betrug bei den Patienten mit KRAS-Wildtyp 5,2 Monate und bei Patienten mit KRAS-Mutation 3,1 Monate (p=0,007). Eine Korrelation zwischen dem KRAS-Mutationsstatus und dem - 44 - Gesamtüberleben bestand hingegen nicht (p=0,18) (Zhang et al., 2009). In dieser Promotionsarbeit konnte bei den Tumoren mit KRAS-Mutation ebenfalls eine signifikant geringere Ansprechrate als bei Tumoren ohne eine KRAS-Mutation nachgewiesen werden (44,4% vs. 63,0%, p=0,012). Auch wenn die BRAFMutationen zusammen mit den KRAS-Mutationen betrachtet werden, bleibt der signifikante Unterschied etwas abgeschwächt weiterhin erhalten (46,4% vs. 63,5%, p=0,021). Jedoch sollte man berücksichtigen, dass eine BRAF V600EMutation nur in 13 Tumoren von 130 Tumoren (10,0%) mit Wildtyp-KRAS nachgewiesen werden konnte. Gemäß der CRYSTAL-Studie, allerdings entgegen der Studie von Zhang et al., zeigte sich in dieser Promotionsarbeit auch ein tendenziell besseres medianes Gesamtüberleben bei Patienten mit KRAS-Wildtyp (18,9 Monate, 95%-KI: 14,7-17,6 Monate; p=0,085). Bei allen Patienten, deren Tumoren weder eine KRAS- noch eine BRAF-Mutation aufzeigten, betrug das Gesamtüberleben 20,8 Monate (95%-KI: 15,6-26,1). War eine der beiden Mutationen vorhanden, fiel das Gesamtüberleben signifikant kürzer aus (15,6 Monate, 95%-KI: 12,4-18,8; p=0,013). Somit zeigte sich, dass sowohl in den oben genannten Studien als auch in dieser Promotionsarbeit der KRAS-Status als ein wichtiger prognostischer Marker in Bezug auf eine Fluoropyrimidin-haltige bzw. Oxaliplatin-haltige Therapie heraus gearbeitet werden konnte. Die sog. OPUS-Studie spiegelt ein anderes Ergebnis als diese Promotionsarbeit wider. Wird in der OPUS-Studie nur der Therapiearm mit FOLFOX betrachtet (73 Patienten der 134 KRAS-Wildtyp-Patienten und 47 Patienten mit einer KRASMutation erhielten eine FOLFOX-Therapie), profitierten Patienten mit einer KRASMutation bezüglich des progressionsfreien Überlebens mehr von der alleinigen Therapie als Patienten mit KRAS-Wildtyp (KRAS mutiert: 8,6 Monate vs. KRAS Wildtyp: 7,2 Monate) (Bokemeyer et al., 2009). Auch das Therapieansprechen zeigte bei Patienten mit einer KRAS-Mutation mit 49% (95%-KI: 34-64%) einen besseren Trend als bei Patienten mit KRAS-Wildtyp (37%; 95%-KI: 26-49%). Jedoch muss man auch bei dieser Studie, genau wie bei den Untersuchungen dieser Promotionsarbeit, die relativ geringe Anzahl an untersuchten Fällen berücksichtigen. Mögliche Ursachen für die heterogenen Ergebnisse könnten die Größe der Studien, die verschiedenen Patientenpopulationen bei Einschluss und unterschiedliche Folgetherapien sein. - 45 - 136 der 205 Patienten dieser Promotionsarbeit erhielten eine Folgetherapie, wovon 83 Patienten einen KRAS-Wildtyp und 53 Patienten eine KRAS-Mutation aufwiesen. 80% der Patienten erhielten eine Irinotecan-haltige Folgetherapie und 30% der Patienten erhielten eine Cetuximab-haltige Drittlinientherapie. Es fiel auf, dass das Gesamtüberleben zunächst sowohl bei KRAS-Wildtyp-Patienten und der Patientengruppe mit mutiertem KRAS annähernd ähnlich war, sich jedoch nach circa 15 Monaten zugunsten der KRAS-Wildtyp-Tumoren separierte. Durch diese Ergebnisse liegt der Schluss nahe, dass der wesentliche prognostische Effekt der KRAS- und BRAF-Mutationen durch Folgetherapien verursacht wird und das Vorhandensein- bzw. Nichtvorhandensein einer KRAS-Mutation einen Einfluss auf die Folgetherapie nehmen könnte. Bei Patienten ohne eine Folgetherapie zeigte sich bezüglich des Gesamtüberlebens ab Progress der Erstlinientherapie innerhalb der Studie kein wesentlicher Unterschied. Bei Patienten, die mit der Irinotecan-haltigen Zweitlinientherapie behandelt wurden, zeigte sich ein Trend zu einem günstigeren Postprogressionsüberleben in der KRAS-Wildtyp-Gruppe (p=0,072). Ein signifikanter Unterschied konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. In der PETACC 3-Studie von van Cutsem et al. wurde der Effekt von der Zugabe von Irinotecan zu der adjuvanten Therapie mit Fluorouracil und Leucovorin (LV5FU2) bei 2094 Patienten mit KRK des Stadiums III untersucht. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied beim 5-Jahres-progressionsfreien Überleben (Irinotecan/LV5FU2: 56,7%, LV5FU2 alleine: 54,3%; p=0,106). Bezüglich des 5Jahres-Gesamtüberlebens zeigten sich ebenfalls keine signifikanten Unterschiede (Irinotecan/LV5FU2: 73,6%, LV5FU2 alleine: 71,3%; p=0,94) (Van Cutsem et al., 2009). Zahlreiche neuere Studien nutzten molekularbiologische Verfahren, um verschiedene Gene und ihre Rolle als prognostische und prädiktive Marker in mKRK zu evaluieren. Hierdurch konnte der Mutationsstatus von KRAS als wichtiger prädiktiver Marker für das Ansprechverhalten auf eine anti-EGFRAntikörper-Behandlung retrospektiv ermittelt werden (Amado et al., 2008; van Cutsem et al., 2009; Bokemeyer et al., 2009). Dies konnte auch im Rahmen dieser Promotionsarbeit, wie im Ergebnisteil beschrieben, bestätigt werden, da sich zeigte, dass insbesondere Patienten mit KRAS-Wildtyp im Rahmen einer Drittlinientherapie von der anti-EGFR-Antikörper-Behandlung mit Cetuximab profi- 46 - tierten. 30% der Patienten erhielten vermutlich aufgrund eines Nichtansprechens auf eine Irinotecan-haltige Therapie im Rahmen einer Drittlinientherapie Cetuximab. Bei Patienten ohne eine Folgetherapie zeigte sich bezüglich des Gesamtüberlebens ab Progress der Erstlinientherapie innerhalb der Studie kein wesentlicher Unterschied. Insbesondere Patienten mit KRAS-Wildtyp und einer Cetuximab-haltigen Folgetherapie profitierten hinsichtlich des Gesamtüberlebens (p=0,087). So wiesen Amado et al. in ihrer Studie eine 0%ige Ansprechrate auf eine antiEGFR-Antikörper-Behandlung mit Panitumumab bei Patienten mit einem mutierten KRAS-Status nach, während beim KRAS-Wildtyp eine Ansprechrate von 17% zu beobachten war. Patienten mit einem KRAS-Wildtyp profitierten auch in Bezug auf das progressionsfreie Überleben bei einer Behandlung mit Panitumumab gegenüber Patienten mit einem mutierten KRAS (p<0,000199) (Amado et al., 2008). In der OPUS-Studie zeigte sich sowohl eine Verbesserung der Ansprechrate (61% vs. 37%, p=0,011) als auch eine Verbesserung des progressionsfreien Überlebens (7,7 Monate vs. 7,2 Monate, HR=0,57; p=0,163) bei KRAS-Wildtyp-Tumoren, wenn Cetuximab zu der FOLFOX-Therapie hinzugefügt wurde (FOLFOX, n=168 vs. FOLFOX+Cetuximab, n=169) (Bokemeyer et al., 2009). Bei den Karzinomen mit einer KRAS-Mutation hingegen zeigte sich im Therapiearm mit Cetuximab+FOLFOX ein tendenziell schlechteres Ansprechen im Vergleich zur alleinigen Chemotherapie (33% vs. 49%, p=0,106). Zu einem ähnlichen Ergebnis gelangte man in der CRYSTAL-Studie, in welcher 599 Patienten mit einem mKRK mit dem FOLFIRI-Protokoll und weitere 599 Patienten mit FOLFIRI plus Cetuximab behandelt wurden (van Cutsem et al., 2009). Die Patienten profitierten auch hier von der Gabe von Cetuximab. So zeigte sich bei der alleinigen Gabe von FOLFIRI ein signifikant kürzeres progressionsfreies Überleben gegenüber dem FOLFIRI plus Cetuximab-Arm (8,0 vs. 8,9 Monate, p=0,048). In Bezug auf das Gesamtüberleben ergab sich kein signifikanter Unterschied (19,9 vs. 18,6 Monate, p=0,31). Auch in dieser Studie war der Therapieerfolg abhängig von dem KRAS-Status. Bei Patienten mit einem Wildtyp-KRAS zeigte sich ein verlängertes progressionsfreies Überleben bei der Zugabe von Cetuximab (9,9 vs. 8,7 Monate; HR=0,68; 95%-KI: 0,50-0,94). Auch bezüglich des Gesamtüberlebens profitierten Patienten mit einem KRAS-WildtypTumor tendenziell von der Therapie FOLFIRI plus Cetuximab (24,9 vs. 21,0 - 47 - Monate, HR=0,84; 95%-KI: 0,64-1,11). Werden nur Patienten mit KRASMutationen betrachtet, bestand sowohl beim progressionsfreien Überleben (FOLFIRI+Cetuximab: 7,6 Monate vs. FOLFIRI: 8,1 Monate; p=0,07) als auch bei dem Gesamtüberleben (17,5 vs. 17,7 Monate bei FOLFIRI alleine; p=0,44) kein Vorteil durch die Addition von Cetuximab. Wird das progressionsfreie und Gesamtüberleben in Bezug auf den KRAS-Status verglichen, fällt auf, dass Patienten mit einem KRAS-Wildtyp mehr von der Zugabe von Cetuximab profitierten als Patienten mit einer KRAS-Mutation (PFS: KRAS-mutiert: 7,6 Monate vs. KRAS-Wildtyp: 9,9 Monate; OS: KRAS mutiert: 17,5 Monate vs. KRAS-Wildtyp: 24,9 Monate). Aus diesen Studien wird ersichtlich, dass nur KRAS-Wildtyp-Patienten von einer zusätzlichen Therapie mit einem anti-EGFR-Antikörper profitieren (Dempke et al., 2010). Hingegen besteht bei einer vorhandenen KRAS-Mutation kein Vorteil in Bezug auf das progressionsfreie oder Gesamtüberleben durch die Zugabe von Cetuximab oder Panitumumab. In neueren Studien allerdings konnten die bisher aufgeführten Ergebnisse und somit der nachgewiesene Profit von der Drittlinientherapie der Patienten dieser Promotionsarbeit nicht bestätigt werden. Sowohl in der COIN-Studie (Maughan et al., 2010) als auch in der Nordic-Studie (Tveit et al., 2011) wurde keine Verbesserung des Überlebens durch die Zugabe von Cetuximab bei Patienten mit Wildtyp-KRAS erreicht. Eine Ursache dafür können verschiedene Chemotherapiekombinationen sein. Cetuximab scheint mit infusionalem 5-FU und mit Irinotecan besser synergistisch zu wirken als mit oralem 5-FU und/oder Oxaliplatin (Maughan et al., 2010; Tveit et al., 2011). Dieses sehr aktuelle Thema wird derzeit von einer Reihe von Studien adressiert. Neben dem KRAS-Mutationsstatus wurden die Tumoren auf BRAF-Mutationen untersucht. In dieser Doktorarbeit wurden ausschließlich BRAF V600E-Mutationen untersucht, da in Studien gezeigt werden konnte, dass die V600E-Mutation eine sogenannte Hotspot-Mutation ist, d.h., dass das BRAF in der überwiegenden Zahl der Fälle an dieser Stelle mutiert ist (Kadiyska et al., 2007; Tan et al., 2008). Es wurden ausschließlich Tumoren mit einem KRAS-Wildtyp auf eine BRAF V600E-Mutation untersucht, da nachgewiesen werden konnte, dass eine KRASund BRAF-Mutation nicht gleichzeitig vorkommen (Yoshitake et al., 2007). Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurde in 13 Tumoren von 130 Tumoren (10,0%) mit Wildtyp-KRAS eine V600E-BRAF-Mutation nachgewiesen, somit trat eine - 48 - V600E-BRAF-Mutation mit einer Häufigkeit von 6,3% aller 205 Patienten auf. Dieses Ergebnis ist mit den bisherigen veröffentlichten Ergebnissen, die ein ähnliches Patientenkollektiv untersuchten, zu vergleichen. In der Literatur wird ein Vorkommen einer BRAF-Mutation bei KRK von 5 bis 10% beschrieben (Davies et al., 2002; Fransen et al., 2004; Di Nicolantonio et al., 2008; Roth et al., 2010). In der Studie von Di Nicolantonio et al. wurde bei 113 Patienten mit einem mKRK in 9,7% eine BRAF-Mutation nachgewiesen (Di Nicolantonio et al., 2008). Ein mutiertes BRAF trat in 11 von 79 Patienten mit einem KRAS-Wildtyp auf (13,9%). In einer Studie von Yoshitake et al. wurde eine BRAF-Mutation in 9,3% (4 von 43) der Tumoren nachgewiesen. 87 der 205 Patienten (42,4%) wiesen entweder eine KRAS- oder eine BRAF-Mutation auf (Yoshitake et al., 2007). Bezüglich des BRAF-Status zeigte sich in dieser Promotionsarbeit keine Korrelation mit der Remission oder der Krankheitskontrollrate. Allerdings wurden Studien veröffentlicht, bei denen eine Beziehung zwischen einem mutierten BRAF und einem schlechteren Gesamtüberleben (Tran et al., 2010) oder einem höheren T-Stadium oder Grading-Stadium (Aust et al., 2010) dargestellt wurde. Auch gemäß den Ergebnissen der CAIRO2-Studie sei eine BRAF-Mutation mit einem verringerten progressionsfreien Überleben korreliert (Tol et al., 2009). In der FOCUS-Studie zeigte sich, dass eine KRAS- oder BRAF-Mutation zwar mit einem schlechteren Gesamtüberleben (95%-KI: 1,20-1,65, p˂0,0001) und einem verringerten progressionsfreien Überleben (95%-KI: 1,00-1,36, p=0,05) zusammen hänge, durch eine Mutation das Ansprechen auf eine Irinotecan- oder Oxaliplatintherapie allerdings nicht beeinflusst werde. Somit profitierten Patienten mit einem mutierten KRAS oder BRAF ebenso von einer solchen Therapie (Richman et al., 2009). Auch in der Studie von Aust et al. konnte keine Korrelation zwischen dem Profit einer 5-FU-haltigen Chemotherapie und dem BRAF-Status nachgewiesen werden (Aust et al., 2010). Zu derart unterschiedlichen Ergebnissen kann es aufgrund verschieden großer Kollektive in den Studien und unterschiedlicher Arbeitsbedingungen kommen. BRAF hat sich mittlerweile als ein bedeutender Prognosefaktor bezüglich des Gesamtüberlebens im Stadium IV etabliert. Dass wir in dieser Promotionsarbeit zu einem anderen Ergebnis kommen, hängt mit den geringen Zahlen zusammen. Da die BRAF-Mutation, wie bereits erwähnt, in der Regel mit einer Häufigkeit von 510% vorkommt, ist es erstrebenswert, insbesondere Studien mit vielen Patienten durchzuführen, um die Aussagekraft der Ergebnisse weiter zu verbessern. Dass - 49 - Ergebnisse bezüglich einer BRAF-Mutation und der Prognose in eine ähnliche Richtung gehen wie bei KRAS-Mutationen, ist durchaus erklärbar, da mutiertes BRAF ebenso den onkogenen Weg RAS/RAF/MEK/ERK aktiviert. In einigen Studien wurden BRAF-Mutationen mit Resistenzen gegenüber antiEGFR-Strategien in Verbindung gebracht. Finocchiaro et al. untersuchten Tumoren von 85 Patienten mit einem mit Cetuximab behandelten mKRK, bei denen der EGFR- und KRAS-Status bekannt war, unter anderem auf eine BRAFMutation. Eine BRAF-Mutation wurde bei 5% der Patienten nachgewiesen und keiner dieser Patienten profitierte von der Therapie mit Cetuximab im Vergleich zum Wildtyp (Progressionszeit 1,2 vs. 4,6 Monate, p=0,09; OS 5,4 vs. 9,8 Monate, p=0,3) (Finocchiaro et al., 2008). Nicolantonio et al. untersuchten 113 Patienten, die mit Cetuximab oder Panitumumab behandelt wurden. Keiner der Patienten mit einer BRAF-Mutation sprach auf eine Therapie mit Cetuximab oder Panitumumab an, im Vergleich dazu befand sich unter den Therapierespondern kein Patient mit einer BRAF-Mutation (p=0,029). Patienten mit einer BRAF-Mutation zeigten ein signifikant kürzeres progressionsfreies Überleben (p=0,011) und ein signifikant kürzeres Gesamtüberleben (p<0,0001) (Di Nicolantonio et al., 2008). Allerdings sollte berücksichtigt werden, dass in der Studie nur wenige Fälle untersucht wurden und dass keine Randomisierung statt fand. Zu einem anderen Ergebnis gelangten Maughan et al., Bokemeyer et al. und Tol et al., nach welchen der BRAF-Status kein entscheidender prädiktiver Marker bezüglich des Ansprechens auf Cetuximab sei (Tol et al., 2009; Bokemeyer at al., 2010; Maughan et al., 2010). Diese Aussage wird jedoch in dem Artikel von Bokemeyer et al. insofern eingeschränkt, als dass die Anzahl der BRAF-Mutationen für eine definitive Aussage möglicherweise zu gering sei. Im Vergleich zu Di Nicolantonio wurde allerdings eine Randomisierung durchgeführt. Da sich Mutationen im KRAS-Gen und im BRAF-Gen ausschließen, wird bei Patienten mit schlechtem ausgeschlossener Benefit einer anti-EGFR-Therapie und bereits KRAS-Mutation derzeit eine BRAF-Mutationsanalyse empfohlen, um die Prognose eines Therapieansprechens auf eine anti-EGFRAntikörpertherapie beim KRK zu verbessern. - 50 - Die potenzielle, in der vorliegenden Arbeit berichtete Oxaliplatin-Resistenz von KRAS- und BRAF-mutierten Tumoren ist bei Bestätigung für weitere adjuvante und palliative Therapien von KRK von weitreichender Bedeutung. Oxaliplatin gehört in die Gruppe der Platin-Derivate. Metabolite der Platin-Derivate interagieren mit der DNA und bilden Quervernetzungen. Die Platin-DNAVerbindungen inhibieren die DNA-Polymerase und wirken somit antineoplastisch. Es konnte gezeigt werden, dass das ‚Nucleotide Excision Repair Protein‘ ERCC-1 durch mutiertes Ras hochreguliert werden kann. Hochreguliertes ERCC-1 kann Platin-induzierte DNA-Schädigungen reparieren und die antineoplastische Wirkung von Platin-Präparaten abschwächen (Youn et al, 2004). Viguier et al. untersuchten in ihrer Studie von 2005 bei 91 Patienten die Mechanismen des ERCC-1 und zeigten, dass die Ansprechrate von mKRK auf Oxaliplatin bei einem herunterregulierten ERCC-1 höher ist als bei einem normal funktionierenden ERCC-1. Die Ansprechrate auf eine Kombination aus Oxaliplatin und 5-FU war bei Patienten mit herunter reguliertem ERCC-1 signifikant höher als bei den anderen Patientengruppen (61,9% vs. 42,3% und 21,4%; p=0,018). Hingegen zeigte sich kein signifikanter Unterschied bei Patienten, die nur mit 5-FU oder in Kombination mit Irinotecan behandelt wurden (Viguier et al., 2005). Ebenso konnten Shirota et al. zeigen, dass das Protein ERCC-1 einen entscheidenden Einfluss auf das Ansprechen einer Oxaliplatin-Therapie nimmt. Für die Studie wurden die Patienten mit einer 5-FU/Oxaliplatin-haltigen Zweitlinientherapie therapiert. Patienten mit einer ERCC-1-Expression ≤4,9*0,001 (40 von 50 Patienten) hatten ein medianes Überleben von 10,2 Monaten. Patienten mit einer ERCC-1-Expression ≥4,9*0,001 zeigten ein medianes Überleben von 1,9 Monaten (p˂0,001) (Shirota et al., 2001). Im International Lung Cancer Trial (ILCT) wurden retrospektiv verschiedene prognostische und prädiktive Biomarker in der adjuvanten Therapie des NSCLC mit einer Platin-basierten 2er-Kombinationstherapie analysiert. 1867 Patienten mit einem Zustand nach Resektion eines nichtkleinzelligen Lungenkarzinoms wurden entweder mit einer Kombination aus Cisplatin und einem anderen Chemotherapeutikum behandelt (932 Patienten) oder der reinen therapeutischen Beobachtung unterzogen. Patienten, die eine Chemotherapie erhielten, hatten ein signifikant längeres 5-Jahres-Überleben (44,5% vs. 40,4%, 95%-KI: 0,76- 0,98, p˂0,03) und ein höheres progressionsfreies Überleben (39,4% vs. 34,3%, 95%-KI: 0,74-0,94, p=0,003) als Patienten ohne eine Chemotherapie (ILCT, 2004). In einer - 51 - darauf folgenden Studie von Olaussen et al. (Olaussen et al., 2006) wurde als Grundlage die zuvor genannte Studie verwendet, um den Einfluss der Expression von ERCC-1 auf die Prognose beim resezierten nichtkleinzelligen Lungenkarzinom zu evaluieren. In 335 von 761 untersuchten Tumoren (44%) wurde eine ERCC-1-Produktion nachgewiesen. Ein Benefit einer Cisplatinbasierten Chemotherapie korrelierte mit einer Abwesenheit von ERCC-1 (Olaussen et al., 2006). In weiteren Studien wurde ebenfalls gezeigt, dass bei Patienten mit einem nichtkleinzelligen Bronchialkarzinom und einer erfolgten Therapie mit Cisplatin oder anderen Platin-Derivaten das Gesamtüberleben oder das mediane progressionsfreie Überleben bei ERCC1-positiven Tumoren im Vergleich zu ERCC1-negativen Tumoren verringert ist (Lord et al., 2002; Ceppi et al., 2006; Hwang et al., 2008; Schettino et al., 2008; Ota et al., 2009; Azuma et al., 2009; Lee et al., 2009). Die vorliegenden Ergebnisse sind die Basis für weitere Untersuchungen, die den Mechanismus der potenziellen Oxaliplatinresistenz weiter untersuchen sollten. Es wurde daher eine immunhistochemische Analyse der ERCC1-Expression an einem Pilotkollektiv durchgeführt. Ein Unterschied bezüglich der ERCC1Expression und des Therapieansprechens wurde jedoch nicht gesehen. Interessant wäre darüber hinaus der Vergleich von mit Irinotecan-behandelten Patienten (z.B. FOLFIRI), um zu klären, ob der beobachtete Effekt Oxaliplatinspezifisch oder Ausdruck einer höheren biologischen Aggressivität von KRASmutierten KRK ist. KRAS und BRAF sind mittlerweile wichtige prognostische Marker beim KRK. BRAF hat sich inzwischen als ein bedeutender Prognosefaktor bezüglich des Gesamtüberlebens im Stadium IV beim KRK etabliert. Der Stellungswert von KRAS als Prognosefaktor unter einer reinen Kombinationschemotherapie ist noch nicht abschließend geklärt. Insbesondere bei einer anti-EGFR-Antikörpertherapie scheint eine Korrelation zwischen mutiertem KRAS und einem schlechteren Ansprechen zu bestehen. Ergebnisse divergieren jedoch noch immer. Es stellt sich insbesondere die Frage, ob es bezüglich verschiedener Mutationen in KRAS Unterschiede gibt bzw. wodurch es zu verschiedenen Interaktionen mit den Chemotherapien kommt. - 52 - Es wird ersichtlich, dass die Forschung bezüglich des KRK und dessen Therapie noch lange nicht abgeschlossen und von großer Bedeutung ist. Um sowohl die Studiendurchführbarkeit zu erleichtern als auch die Ergebnisse zu verbessern, ist für zukünftige Studien die standardisierte, sorgfältige und umfassende Sammlung von Gewebe- und Blutproben aller Studienpatienten in sog. Biobanken eine wesentliche Anforderung. Um eine qualitativ hochwertige translationale Forschung zu ermöglichen, die Kosten für die Durchführung von Studien senken zu können und um eine bessere Versorgung der Krebspatienten zu gewährleisten, sind gut geführte Biobanken das wesentliche Werkzeug in der zukünftigen Gegenwart. Auf diesem Wege kann eine individualisierte Krebsmedizin erreicht werden. - 53 - 6. Zusammenfassung Das kolorektale Karzinom ist in Europa die zweithäufigste tumorbedingte Todesursache. Bei Erstdiagnose weisen etwa 25% der Patienten eine Fernmetastasierung und 30-60% eine Metastasierung im Verlauf auf. Die Prognose des mKRK konnte durch die Einführung neuer Chemotherapeutika deutlich gebessert werden. Eine große Bedeutung hat dabei die Identifikation von Biomarkern. Die hier untersuchten Gewebeproben stammen von Patienten aus einer prospektiv randomisierten zweiarmigen Phase-III-Studie der AIO zur Erstlinientherapie des mKRK. Es wurde die Gabe eines oralen Fluoropyrimidins (Capecitabin) in Kombination mit Oxaliplatin mit der Applikation von infusionalem 5-FU verglichen und eine Nicht-Unterlegenheit aufgezeigt. Das untersuchte Teilkollektiv unterschied sich in Bezug auf Alter, Geschlecht, Therapie (FUFOX bzw. CAPOX) nicht vom Gesamtkollektiv aller Studienpatienten. Es erfolgte eine Extraktion von DNA aus pseudonymisierten, formalinfixierten, Paraffin-eingebetteten Tumorgewebeproben (FFPE). Mit Hilfe des QIAmp DNA Mini Kits wurden sieben KRAS-Mutationen in den Kodons 12 und 13 detektiert. Im BRAF-Gen wurde gezielt die Hotspot-Mutation V600E-Mutation nachgewiesen. Da in Studien gezeigt wurde, dass KRAS- und BRAF-Mutationen nicht gleichzeitig in einem Tumor vorkommen, wurden nur Tumoren ohne eine KRAS-Mutation auf eine BRAF-Mutation hin untersucht. Es erfolgte eine Korrelation von Mutationsstatus mit Remissionsverhalten, progressionsfreiem Überleben und Gesamtüberleben. Eine KRAS-Mutation war in 75 der 205 (36,6%) verfügbaren Tumoren vorhanden. Eine BRAF V600E-Mutation wurde in 13 von 130 (10,0%) Tumoren mit WildtypKRAS nachgewiesen. 87 der 205 Patienten (42,4%) wiesen entweder eine KRASoder eine BRAF-Mutation auf. Patienten mit KRAS-Mutationen zeigten eine signifikant geringere Remissionsrate als Tumoren ohne KRAS-Mutation (44,4% vs. 63,0%, p=0,012). Patienten mit KRAS-Wildtyp wiesen ein tendenziell besseres medianes Gesamtüberleben (18,9 Monate, 95%-KI: 14,7-23,2 Monate) als Patienten mit einer KRAS-Mutation (16,1 Monate, 95%-KI: 14,7-17,6 Monate) (p=0,085) auf. Das Gesamtüberleben der Patienten mit KRAS- oder BRAF-Wildtyp betrug 20,8 Monate (95%-KI: 15,6-26,1). War eine KRAS- oder BRAF-Mutation vorhanden, war das Gesamtüberleben signifikant kürzer (15,6 Monate, 95%-KI: 12,4-18,8; p=0,013). Das mediane PFS zeigte bei Patienten mit KRAS- und - 54 - BRAF-Wildtyp (7,6 Monate, 95%-KI: 6,5-8,6) und Patienten mit KRAS- oder BRAF-Mutation (7,5 Monate, 95%-KI: 4,9-10,0) keinen signifikanten Unterschied (p=0,89). 136 der 205 Patienten erhielten eine Folgetherapie. 80% der Patienten wurden mit einer Irinotecan-haltigen Zweitlinientherapie behandelt und 30% der Patienten erhielten im Rahmen einer Drittlinientherapie Cetuximab. Bei Patienten ohne Folgetherapie zeigte sich bezüglich des Postprogressionsüberlebens kein wesentlicher Unterschied. Bei den mit Irinotecan behandelten Patienten zeigte sich ein Trend zu einem günstigeren Postprogressionsüberleben in der KRASWildtyp-Gruppe (p=0,072). Insbesondere KRAS-Wildtyp-Patienten mit einer Cetuximab-haltigen Folgetherapie profitierten hinsichtlich des Gesamtüberlebens (p=0,087). Patienten mit einer KRAS- oder einer BRAF-Mutation wiesen unter einer Oxaliplatin- und Fluoropyrimidin-haltigen Erstlinientherapie eine signifikant geringere Ansprechrate als Patienten mit Wildtyp-Tumoren auf. Auch das Gesamtüberleben der Patienten mit Mutation war signifikant kürzer. Beim progressionsfreien Überleben zeigte sich hingegen kein Unterschied. Die potenzielle Oxaliplatin-Resistenz bei der Ansprechrate von mutierten Tumoren ist für die weitere Therapie von KRK von großer Bedeutung. Möglicherweise könnte dies mit der Expression des Reparaturproteins ERCC-1 zusammenhängen, das eine Platinresistenz bei verschiedenen Tumoren vermitteln kann. In Bezug auf eine Folgetherapie und das Gesamtüberleben profitierten Patienten insbesondere von einer Cetuximab-haltigen Therapie, wenn ein KRAS-Wildtyp vorlag. Dies bestätigt den bekannten prädiktiven Wert einer KRAS-Mutation für eine Anti-EGFR Therapie. - 55 - 7. Literaturverzeichnis Aaltonen, L.A., Peltomäki, P., Leach, F.S., Sistonen, P., Pylkkänen, L., Mecklin, J.P., Järvinen, H., Powell, S.M., Jen, J., Hamilton, S.R. (1993). Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science 260(5109), 812-816 Adson, M.A. (1987). Resection of liver metastases: when is it worth-while? World J Surg 11(4), 511-520 Ahnen, D.J., Feigl, P., Quan, G., Fenoglio-Preiser, C., Lovato, L.C., Bunn, P.A. Jr., Stemmerman, G., Wells, J.D., Macdonald, J.S., Meyskens, F.L. Jr. (1998). Ki-ras mutation and p53 overexpression predict the clinical behaviour of colorectal cancer: a Southwest Oncology Group study. Cancer Res 58(6), 1149-1158 Alazzouzi, H., Alhopuro, P., Salovaara, R., Sammalkorpi, H., Järvinen, H., Mecklin, J.P., Hemminki, A., Schwartz, S. Jr., Aaltonen, L.A., Arango, D. (2005). SMAD4 as a prognostic marker in colorectal cancer. 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Karsten Schulmann für die gesamte Betreuung der Doktorarbeit, für die vielen Treffen, die Ratschläge und Korrekturen. Aus dem Institut für Pathologie der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil gilt mein Dank Frau Prof. Dr. med. Andrea Tannapfel für die Möglichkeit, uneingeschränkt in den Räumen des Instituts für Pathologie arbeiten und die Materialien für die Versuche nutzen zu dürfen. Des Weiteren danke ich Frau Dr. rer. nat. Malgorzata Jaworska und Herrn Dipl. Biol. Markus Vogt für die gute Betreuung und die Hilfe im Labor sowie Frau Dr. rer. nat. Berenike FlottRahmel für die Betreuung im Rahmen der Doktorandengruppe. Mein weiterer Dank gilt Frau Dipl.-Stat. Renate Klaaßen-Mielke für das Kontrollieren meiner statistischen Auswertung sowie die Beantwortung meiner vielen Fragen. Vielmals möchte ich mich bei den Patientinnen und Patienten bedanken, die in die Verwendung der Daten und Materialien für die Studie eingewilligt haben. Mein weiterer Dank ist an die zuständigen Prüfärzte sowie an die Arbeitsgemeinschaft Internistische Onkologie gerichtet. Danken möchte ich auch Frank Zurmühlen, Petra Fischer, Nikolai Senekowitch und Jutta Dreier für das Durchsehen meiner Promotionsarbeit in Hinblick auf grammatikalische Fehler sowie Frau Ulrike Eberhardt für das Hinweisen auf formelle Fehler. Von ganzem Herzen danken möchte ich meinen Eltern, meiner Schwester Alessa und Heinz und Else Adamik für die liebevolle und immer vorhandene Unterstützung bei meinem Studium, der Promotionsarbeit und in allen Lebenslagen. Ebenso möchte ich Dominik Meier für den nicht endenden Rückhalt, das viele Aufmuntern und den Austausch von Ratschlägen und Tipps danken. Natürlich möchte ich mich auch ganz herzlich bei meinen engsten Freunden für die Hilfe und Nachsicht aber auch für das gelegentliche Ablenken bedanken. 9. Lebenslauf Nina Mareike Bruns _________________________________________________________________ Geburtsdatum/ -ort: 23. April 1985 in Dortmund Konfession: evangelisch Familienstand: ledig Staatsangehörigkeit: deutsch Schulausbildung: 1991-1995: Grundschule im Sande, Bramsche 1995-1997: Orientierungsstufe Gartenstadt, Bramsche 1997-2004: Greselius-Gymnasium, Bramsche Abschluss: Abitur (1,8) 1999: zweiwöchiger Schüleraustausch nach Harfleur, Frankreich Studium: 2004-2010: Ruhr-Universität Bochum, Humanmedizin 2004-2006: Vorklinik Abschluss: 1. Staatsexamen (2,5) 2006-2010: Klinik Abschluss: 2. Staatsexamen (2,0) Gesamtnote Ärztliche Prüfung: 2,17 08/09-12/09: 1. PJ-Tertial: Innere Medizin, Marienhospital Herne 12/09-04/10: 2. PJ-Tertial: Chirurgie, Bürgerspital Solothurn, Schweiz 04/10-08/10: 3. PJ-Tertial: Dermatologie St. Josef-Hospital Bochum Beruflicher Werdegang: seit 04/11: Assistenzärztin in der Derma- tologischen Abteilung des St. JosefHospitals, Klinikum der Ruhr-Universität Bochum Bisherige Praktika: 09/2001: 2-wöchiges der Betriebspraktikum Zahnarztpraxis Dr. in Simon, Bramsche 03/2005-04/2005: Krankenpflegepraktikum, Johanniter-Krankenhaus, Bramsche 08/2005-09/2005: Krankenpflegepraktikum, Johanniter-Krankenhaus, Bramsche 02/2007-03/2007: Famulatur, Chirurgische Notfallambulanz, Johanniter-Krankenhaus, Bramsche 08/2007-09/2007: Famulatur, Kinderchirurgie, Hopital Lenval, Nizza, Frankreich 09/2007-10/2007: Famulatur, Innere Medizin, Knappschaftskrankenhaus Bochum 03/2008: Famulatur, Gynäkologie, Bezirkskrankenhaus Schwaz, Österreich 09/2008: Famulatur, Gynäkologie, AugustaKranken-Anstalt, Bochum Besondere Leistungen: Diplôme d'Etudes en langue française 1 (DELF 1) Diplôme d'Etudes en langue française 2 (DELF 2) Stipendium des Bildungsfonds der RUB im Rahmen des NRW-Stipendienprogramms (2009/2010) 1999-2004: ehrenamtliche Mitarbeiterin in der St. Johannis-Kirche Bramsche
