larvaeby electroretinography(ERG) - ETH E

DISS.ETHNO.16191
Assessmentof outer retinal functionin genetically modified zebrafish
larvae by electroretinography(ERG)
A dissertationsubmitted to the
Swiss Federal Institute of TechnologyZürich
For the degree of
Doctor of Sciences
Presented by
YURI V. MAKHANKOV
Diploma in Human and Animal Physiology
M.V.LomonosovMoscow State University, Moscow
Born March 20, 1972
Citizen of the Russian Federation
Aeeeptedon the recommendationof
Prof. Martin E. Schwab, examiner
Prof. Kevan A.C. Martin, co-examiner
Prof. Stephan C.F. Neuhauss, co-examiner
2005
Summary
The zebrafish is
increasingly used to study the genetics of vision. Although our knowledge of
visual system development is increasing
genetics of visual System function.
rapidly,
we
know considerable little about the
experimental tool to study visual function by
recording electroretinograms (ERG). The electroretinogram measures the sum field potential
of the retina in response to changes in light Stimulation. This experimental approach was then
applied to a number of genetically modified (by random mutagenesis or antisense nucleotide
mediated gene knockdown) mutant strains to probe the physiological properties of the outer
In the present studies, I have
developed
an
retina.
introductory chapter, I first summarize our current knowledge of electrophysiological
properties of the vertebrate retina, with an emphasis on the outer retina and properties of the
zebrafish retina. The second chapterdescribes a simple ERG setup for measuring outer retinal
activity in intact both larval and adult aquatic vertebrates, followed by a chapter on the hands
on use of this instrument. This chapter is aimed to be used as a manual for future researchers
In
an
to
use
The
the ERG set-up.
following chapters
describe the
application
of this
powerful electrophysiological
techniqueon a numberof selected zebrafish strains with visual defects.
In chapter 4, the function of protocadherin15 is studied. A mutation of this gene causes Usher
Syndrome, congenital hearing and vision loss, in humans. In the zebrafish two paralogous
exist, with one being essentialin hearing, while the other paralogue is involved in outer retina
morphology. Consequently, the functional inactivation of only paralogue leads to an unaltered
ERG, while knocking down the other version leads to disrupted outer retina function.
In chapter 5,1 describe the function of the cone specific kinase GRK7. Functionalinactivation
of this enzyme leads to a delayed recovery of b-wave amplitude in a double flash paradigm.
This defect is also apparent at the behavioral level, since dark adaptation and temporal
contrast sensitivity
was
affected.
Finally, in chapter 6,1 present a brief overview
of my work and discuss the relevanceof the
obtainedresults.
In summary, I present a useful electrophysiological technique to study visual system function,
particularly of cone photoreceptors. The role of pcdl5 and GRK7 in cone photoreceptor
function is discussed.
Zusammenfassung
Der Zebrafischwird vermehrt dazu verwendet die Genetik des Sehens
zu
erforschen. Obwohl
voranschreitet, wissen wir doch
vergleichsweisewenig über genetische Faktoren, die die Funktion des Sehsystemsteuern.
In der vorliegenden Arbeit stelle ich eine Methode vor, mit der die Sehfunktion über
Elektroretinographie gemessen werden kann. Das Elektroretinogramm misst die Veränderung
des Summenpotentials des Auges in Abhängigkeit von Licht. Dieser experimentelleAnsatz
wurde im folgenden zur Untersuchung der Funktion der äusseren Retina in einer Reihe von
unser Wissen
genetisch
über die Entwicklung des
Sehsystems
schnell
veränderten Zebrafischlarven angewandt. Diese Larven wurden entweder durch
Mutagenese oder Injektion von Gegensinn-Nukleotiden erzeugt.
einem einführenden Kapitel fasse ich den Stand des Wissen
chemische
In
über
die
elektrophysiologisehenEigenschaften der Wirbeltierretina zusammen. Dabei betone ich
besonders die Eigenschaften der äusseren Retina und Eigenschaften der Zebrafischretina.
Im zweiten Kapitel beschreibe ich ein einfaches Gerät zur Messung der äusseren
Retinafunktion in lebenden Larven und erwachsenen aquatischen Tieren mittels
Elektroretinographie. Das folgende Kapitel enthält eine detaillierte Bedienungsanleitung,die
es zukünftigen Forschern ermöglichen soll das Gerät selbstständig zu bedienen.
Die beiden folgenden Kapitel beschreiben die Anwendungen dieser Technik auf zwei
genetisch manipulierteStämme mit Sehdefekten.
Im vierten Kapitel wird eine Funktionsstudievon Protocadherin 15
vorgestellt. Mutationen in
diesem Gen lösen beim Menschen das Usher Syndrom, einer angeborenen Taubblindheit, aus.
Im Zebrafisch wurden zwei Paraloge dieses Gens gefunden. Mutationen in dem einen führen
zu Taubheit, während Mutationen im anderen Defekte der äusseren Retina bedingen. Daher
führt die Mutationen im einen Paralog zu einem veränderten Elektroretinogramm, während
die andere zu keiner Veränderungführt.
Kapitel beschreibe ich die Funktion der zapfenspezifischen Kinase GRK7.
Inaktivierung dieses Enzyms führt zu einer verzögerten Wiederherstellung der bWellenamplitude in einem Doppelblitzversuch.Dieser Defekt spiegelt sich auch im Verhalten
wieder, da Dunkeladaptation und die zeitliche Kontrastsensitivitätbetroffen ist.
Im fünften
In Kapitel 6
gebe ich einen kurzen Überblick über meine Arbeit und diskutiere die Bedeutung
der erzielten Ergebnisse.
Zusammenfassung
8
elektrophysiologische Methode zur Untersuchung
der Sehsystemfunktion, vor allem die der Zapfenphotorezeptoren, vor. Die Bedeutung von
pcd!5 und GRK7 für die Zapfenfunktion wird duskutiert.
Zusammenfassend stelle ich eine nützliche