Untersuchung von chemischen und genetischen Mausmodellen des

Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
II
Abkürzungsverzeichnis
1.
Einleitung
1
1.1
Morbus Parkinson
1
1.2
Behandlungsmöglichkeiten
1
1.3
Ätiologie
2
1.3.1
Sporadische Formen
2
1.3.2
Genetische Formen
2
1.3.2.1
α-Synuklein
3
1.3.2.2
Parkin
3
1.3.2.3
UCHL-1
4
1.3.2.4
PINK1
4
1.3.2.5
DJ-1
4
1.3.2.6
LRRK2
5
1.4
Pathogenesewege
5
1.4.1
Störungen des Energie-Metabolismus
5
1.4.2
Störungen des Protein-Abbaus
7
1.4.3
Konvergierende Pathogenesewege
8
1.5
Tiermodelle des Morbus Parkinson
9
1.5.1
Chemische Intoxikation
10
1.5.2
Genetische Modelle
10
1.6
Ziel der Dissertation
12
2.
Versuchstiere, Material und Methoden
13
2.1
Versuchstiere
13
2.1.1
Versuchstiere für chemische Modelle
13
2.1.2
Genetische Modelle
13
2.1.2.1
PaKO-Tiere
13
2.1.2.2
α-Synuklein transgene Tiere
13
2.1.2.3
Das bigene Tiermodell
15
2.1.2.4
SOD1 transgene Tiere
15
2.2
MPTP-Injektionen
15
2.3
Histologische Methoden
16
2.3.1
Transkardiale Perfusion
16
2.3.2
Gewebeaufarbeitung
16
1
Inhaltsverzeichnis
2.3.3
Herstellung von histologischen Schnitten und
Vorbereitungen der Analysen
17
2.3.4
Humane Paraffinschnitte
17
2.3.5
FluoroJade-Färbungen
17
2.3.6
Immunhistochemische Färbungen
18
2.3.7
Lösungen histologischer Methoden
18
2.4
Elektronenmikroskopische Methoden
2.4.1
Anfertigung von Semidünn- und Ultradünnschnitten
2.4.2
Immunhistochemische Färbungen für die
Elektronenmikroskopie
2.5
2.5.1
20
20
21
Western-Blot
22
Western-Blot Durchführung
35
22
2.5.2
Detektion mittels S-markierten Sekundärantikörpern
22
2.5.3
Subzelluläre Fraktionierung
23
2.5.4
Lösungen für Western-Blot
23
Molekularbiologische Methoden
25
2.6
2.6.1
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
25
2.6.2
Klonierung von PCR-Produkten
25
2.6.3
Ligation
26
2.6.4
Herstellung chemokompetenter Zellen
26
2.6.5
Transformation von DNA in E. coli
27
2.6.6
Restriktion von DNA
27
2.6.7
Sequenzierung der DNA-Proben
27
2.6.8
DNA-Gelelektrophorese
28
2.6.9
DNA- und RNA-Konzentrationsbestimmung
28
2.6.10
Nährmedien
28
2.6.11
Plasmidpräparation nach der Methode der
alkalischen Lyse
28
2.6.12
Gesamt RNA-Isolierung
29
2.6.13
cDNA Synthese durch Reverse Transkription
29
2.6.14
Herstellung Digoxgenin-markierter Sonden
30
2.6.15
Sonden-Test mittels RNA-Blot
30
2.6.16
Lösungen für molekularbiologische Methoden
31
2.6.17
In-situ Hybridisierung
32
2.6.18
Lösungen der In-situ Hybridisierung
33
2.6.19
Überexpression des Fusionsproteins in E. coli
34
2
Inhaltsverzeichnis
2.6.20
Aufreinigung des Fusionsproteins
34
2.6.21
Herstellung des DJ-1 Antikörpers
35
2.6.22
Affinitätsreinigung des Antikörpers
35
2.7
Auswertungsverfahren
35
2.7.1
Analyse lichtmikroskopischer Präparate
35
2.7.2
Zelluntersuchung mittels Diskus-Software
36
2.8
Statistische Untersuchungen
36
2.9
Verwendete Oligonukleotide
36
2.9
Verwendete Antikörper
37
3.
Ergebnisse
38
3.1
Genetische und chemische Modelle des Morbus Parkinson
38
Expression des humanen und endogenen α-Synukleins
38
3.1.1.1
Immunhistochemische Untersuchungen
38
3.1.1.2
Proteinbiochemische Untersuchungen
41
3.1.1
3.1.2
Histopathologische Untersuchungen der bigenen Tiere
42
3.1.2.1
Das dopaminerge System
43
3.1.2.2
Gliazell-Aktivierung
44
3.1.2.3
Die lysosomale Zystein-Proteasen Cathepsin S
und Cathepsin X
3.1.3
3.1.3.1
3.2
3.2.1
46
Histopathologische Untersuchung des MPTP-Modells
Die lysosomale Zystein-Proteasen Cathepsin S
und Cathepsin X
47
Elektronenmikroskopishe Untersuchungen
49
Ultrastrukturelle Auffälligkeiten in Neuronen
bigener Tiere
3.2.2
47
49
Analyse der neuronalen Mitochondrienpopulation in
12-14 m alten bigenen Tiere
54
3.2.3
Mitochondriale Veränderungen in dopaminergen Zellen
56
3.2.4
Mitochondrien und Lipofuszine in Neuronen
bigener Tieren
58
3.2.4.1
Analyse der Neurone der SN
58
3.2.4.2
Analyse der Neurone des Striatum
62
3.2.4.3
Analyse der Neurone des Kortex
62
3.2.5
Analyse der neuronalen Mitochondrienpopulation in
12-14 m alten monogenen Tieren
3
62
Inhaltsverzeichnis
3.2.6
Statistische Erfassung ultrastruktureller Parameter
in Neuronen monogener Tieren
3.2.7
Vergleich mitochondrialer Veränderungen in monound bigenen Tieren
3.2.8
64
Ultrastrukturelle Veränderungen
in jungen bigenen Tieren
3.3
3.4
64
65
Freisetzung pro-apoptotischer Proteine aus
Mitochondrien bigener Tiere
67
Herstellung des DJ-1 Antikörpers
71
3.4.1
Klonierung der DJ-1 cDNA
3.4.2
Induktion der DJ-1 Expression und Aufreinigung
72
des Fusionsproteins
74
3.4.3
Vorversuche zur Immunisierung
75
3.4.4
Titerbestimmung und Aufreinigung des Antikörpers
75
3.5
Validierung der DJ-1 Antikörper-Spezifität
76
3.5.1
Präabsorption mittels Western-Blot
76
3.5.2
Etablierung des DJ-1 Antikörpers
77
3.6
Expression des DJ-1 Transkripts
3.6.1
Herstellung und Validierung der DJ-1 cRNA-Sonde
3.6.2
Regionale und zelluläre Verteilung des DJ-1 Transkripts
im ZNS adulter Mäuse
3.7
3.7.1
79
79
80
Expression des DJ-1 Proteins
82
Regionale und zelluläre Verteilung des DJ-1 Proteins
im ZNS adulter Mäuse
82
3.7.2
Expression von DJ-1 in humanem PD-Gewebe
85
3.7.3
Expression in neuronalen Subpopulationen
85
3.7.4
Expression von DJ-1 in verschiedenen Gliazelltypen
87
3.8
DJ-1 in pathologischen Mausmodellen
des Morbus Parkinson
88
3.8.1
Analyse von DJ-1 in MPTP-behandelten Mäusen
88
3.8.2
DJ-1 Expression in genetischen Tiermodellen
89
3.8.3
DJ-1 Expression in LPS-stimulierten primären Astrozyten
90
3.9
Zusammenfassung der Ergebnisse
91
4.
Diskussion
93
4.1
Untersuchung genetischer und chemischer
Mausmodelle
93
4
Inhaltsverzeichnis
4.1.1
4.1.2
hm2 α-Synuklein Expression in mono- und
bigenen Tieren
93
Histopathologie der bigenen Mausmodelle
95
4.1.2.1
Das dopaminerge System
95
4.1.2.3
Verteilung und Morphologie der Gliazellen
96
4.1.2.3
Das endo/lysosomale System
97
4.1.3
Histopathologische Veränderungen im MPTP-Modell
97
4.2
Die Maus als Tiermodell für Morbus Parkinson
99
4.3
Elektronenmikroskopie
100
4.3.1
Ultrastrukturelle Auffälligkeiten in bigenen Tieren
4.3.1.1
Protein-Akkumulationen und Aggregationen
4.3.1.2
Vakuolisierung, Endoplasmatisches Retikulum
und Golgi-Apparat
4.3.2
4.3.2.1
Altersabhängigkeit
4.3.2.2
Abhängigkeit der Veränderungen von der
der Modifikationen
Expression humanpathogener Proteine
103
104
105
Promotor-Spezifität der mitochondrialen
Auffälligkeiten
4.3.2.4
107
Regions-Spezifität der morphologischen
4.3.2.5
4.4
100
101
Morphologische Veränderungen der Mitochondrien
4.3.2.3
100
Veränderungen
107
Weitere mitochondriale Interaktionen
109
Konvergierende Pathogensemechanismen
und Proteininteraktionen
110
4.5
Freisetzung pro-apoptotischer Proteine
112
4.6
Expression von DJ-1 im humanen und murinen ZNS
113
4.6.1
Quantitative DJ-Veränderungen
in Mausmodellen
116
4.7
Der genetische Hintergrund
117
5.
Ausblick
118
6.
Zusammenfassung
120
7.
Literaturverzeichnis
122
Danksagung
137
Lebenslauf
138
Erklärung
140
5