ZIP - Universität Freiburg

Aus der Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik
Abteilung Pneumologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Einfluß körperlicher Ausdauerbelastung
auf Perforin und Granzyme-B
exprimierende Lymphozytenpopulationen
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
vorgelegt 2000
von Dieter Uhl
geboren in Haslach/Kinzigtal
2
Dekan: Prof Dr. rer.nat. M. Schumacher
1. Gutachter: PD Dr. J. Ch. Virchow jr.
2. Gutachter: Prof. Dr. A. Berg
Jahr der Promotion: 2002
3
Inhaltsverzeichnis:
1 EINLEITUNG
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
DIE PHYSIOLOGIE DER AEROBEN AUSDAUERLEISTUNG
KÖRPERLICHE BELASTUNG UND HORMONE
KÖRPERLICHE BELASTUNG UND IMMUNSYSTEM
LYMPHOZYTEN
NATÜRLICHE KILLERZELLEN
PERFORIN
GRANZYME-B
EINFLUßNEHMENDE ZYTOKINE
ZIELSETZUNG
6
6
7
7
8
10
12
13
13
15
2 MATERIALIEN UND METHODEN
16
2.1
GERÄTE UND VERBRAUCHSMATERIAL
2.1.1
GERÄTE
2.1.2
ARBEITSMATERIALIEN
2.1.3
CHEMIKALIEN
2.1.4
PUFFER UND LÖSUNGEN
2.1.5
ANTIKÖRPER
2.2
METHODEN
2.2.1
AUSWAHL DER PROBANDEN
2.2.2
CHRONOLOGISCHER ABLAUF DER UNTERSUCHUNGEN
2.2.3
SEPARATION MONONUKLEÄRER ZELLEN
2.2.4
KIMURA-FÄRBUNG
2.2.5
MARKIERUNG VON ZELLOBERFLÄCHENMOLEKÜLEN
2.2.6
FIXIERUNG UND PERMEABILISIERUNG DER SEPARIERTEN ZELLEN
2.2.7
INKUBATION DER PERMEABILISIERTEN ZELLEN MIT ANTI-PERFORIN-ANTIKÖRPER
2.2.8
DURCHFLUßZYTOMETRIE
2.2.9
AUSWERTUNG DER MESSUNGEN
2.2.10
STATISTIK
16
16
16
17
17
18
19
19
19
21
21
21
22
23
23
24
26
3 RESULTATE
27
3.1
ERGEBNISSE DER LAUF-GRUPPE
3.1.1
CHARAKTERISIERUNG DER T-ZELLSUBPOPULATIONEN IM VOLLBLUT
3.1.2
CHARAKTERISIERUNG DER T-ZELLSUBPOPULATIONEN
3.1.3
PERFORIN-POSITIVE ZELLEN IN LYMPHOZYTENSUBPOPULATIONEN
3.1.4
GRANZYME-B-POSITIVE ZELLEN IN LYMPHOZYTENSUBPOPULATIONEN
3.1.5
ABSOLUTWERTE PERFORIN UND GRANZYME-B POSITIVER ZELLEN
3.2
ERGEBNISSE DER TRIATHLON-GRUPPE
3.2.1
CHARAKTERISIERUNG DER T-ZELLSUBPOPULATIONEN IN MNC
3.2.2
PERFORIN-POSITIVE ZELLEN IN LYMPHOZYTENSUBPOPULATIONEN
3.2.3
WEITERE DIFFERENZIERUNG BESTIMMTER LYMPHOZYTENSUBPOPULATIONEN
3.2.3.1
Anteil der doppelt-positiven Zellen an Gesamtlymphozyten
3.2.3.2
Anteil der doppelt-positiven Zellen an den einzelnen Subpopulationen
3.2.3.3
Anteil perforinhaltiger doppelt-positiver Zellen am Gesamtlymphozytenpool
3.2.3.4
Anteile perforinhaltiger doppelt-positiver Zellen an den Subpopulationen
3.2.4
SPORTLER VERSUS NICHT SPORT TREIBENDE PERSONEN
3.2.4.1
Zusammensetzung der Lymhozytenpopulation
3.2.4.2
Vergleich Perforin-positiver Zellen bei Sportlern und Kontrollpersonen
27
27
28
28
30
33
34
34
34
37
37
38
38
39
41
41
42
4
3.2.4.3
Prozentuale Verteilung Perforin+ Zellen auf die jeweiligen Subpopulationen
43
4 DISKUSSION
45
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
45
48
51
52
53
LYMPHOZYTENSUBPOPULATIONEN UND SPORTLICHE BELASTUNG
PERFORIN IN LYMPHOZYTEN VON AUSDAUERSPORTLERN
GRANZYME-B IN LYMPHOZYTEN VON AUSDAUERSPORTLERN
KLASSIFIZIERUNG VON CD16/56+ ZELLEN UND T-ZELLEN
AUSDAUERSPORT: BENEFIT ODER IMMUNOLOGISCHES DEFIZIT?
5 ZUSAMMENFASSUNG
55
6 LITERATUR
56
7 DANKSAGUNG
69
8 PUPLIKATIONEN
70
9 LEBENSLAUF
71
5
Abkürzungsverzeichnis:
AK
Antikörper
APZ
Antigen präsentierende Zelle
AS
Aminosäure
bp
Basenpaare
C
Komplementfaktor
CD
Cluster of Differentiation
CTL
zytotoxischer T-Lymphozyt
Cy5
Cytochrom 5
DNA
Desoxyribonukleinsäure
FCS
fetales Kälberserum
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
g
9,81m/s2, Erdbeschleunigung
GrB
Granzyme-B
HLA
Human Leukocyte Antigen
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
D
Dalton
kg
Kilogramm
KG
Körpergewicht
LCMV
lymphozytäres Choriomenigitis-Virus
LPS
Lipopolysaccharid
M
molar
MNC
mononukleäre Zellen
mRNA
Messenger-Ribonukleinsäure
NK-Zellen
Natürliche-Killer-Zellen
nm
Nanometer
P
Perforin
PBMC
Peripheral Blood Mononuclear Cells
PBS
Phosphate-buffered Saline
PE
Phycoerythrin
Weniger häufig vewendete Abkürzungen werden im Text erläutert.
6
1 Einleitung
1.1 Die Physiologie der aeroben Ausdauerleistung
Körperliche Aktivität ist für viele Menschen ein wichtiger Bestandteil ihrer Freizeitgestaltung.
Während für die einen ein gesteigertes Wohlbefinden als Motivation zum Sport
ausschlaggebend ist, steht für andere eine erhöhte körperliche Leistungsfähigkeit bis hin zum
Hochleistungssport als Beruf im Vordergrund. Es gibt viele verschiedene Sportarten, mit
jeweils spezifischen Bewegungs bzw. Belastungsmustern und entsprechend unterschiedlichen
Auswirkungen auf den Körper des Sporttreibenden. Zur Charakterisierung einer Sportart
können sowohl Dauer als auch Intensität der Belastung als Parameter herangezogen werden.
Bei kurzen und intensiven Trainingseinheiten erfolgt die Bereitstellung der notwendigen
Energie hauptsächlich durch anaerobe extramitochondrale Stoffwechselvorgänge, wobei
vermehrt Laktat entsteht, während bei lang andauernden Tätigkeiten mit submaximaler
Intensität
aerobe
intramitochondrale
Stoffwechselvorgänge
dominieren
83
.
Durch
regelmäßiges Ausdauertraining erhöht sich unter anderem die maximal mögliche
Sauerstoffaufnahme/kgKG/Min (VO2max) und der Übergang von aerobem zu anaerobem
Stoffwechsel erfolgt erst bei höheren Leistungsstufen. Die Bestimmung der sogenannten
Laktatgrenze und von VO2max ermöglicht deshalb eine grobe Beurteilung der Leistungsfähigkeit des individuellen Sportlers
36;144
. Mit steigendem Energieumsatz nimmt neben
erhöhtem Herz und Atemzeitvolumen auch die relative Sauerstoffaufnahme des Sportlers zu 2.
Der Laktatspiegel steht bei gleichförmiger Belastung im Gleichgewicht zur konstant
erbrachten aeroben Leistung 100. Die Bestimmung der Sauerstoffaufnahme und des
Laktatspiegels können deshalb als Maß für momentan entstandene Belastungen herangezogen
werden
85
. In dieser Arbeit sollten die Auswirkungen von submaximalen, aeroben
Langzeitbelastungen (Laufen bzw. Triathlon) auf Lymphozyten des peripheren Bluts von
Ausdauersportlern mit regelmäßiger Trainingsanamnese und einem Vo2max > 55ml/kgKG/min
untersucht werden.
7
1.2 Körperliche Belastung und Hormone
Während einer Ausdauerbelastung verändern sich auf Grund des erhöhten Energiebedarfs die
Konzentrationen von verschiedenen stoffwechselaktiven Hormonen im Blut. In Ruhe
überwiegt der parasymphatische Teil des Vegetativums während bei körperlicher Betätigung
das symphatische Nervensystem dominiert. Demnach kommt es bei Streß zu einem Anstieg
der Hormone Adrenalin und Noradrenalin im Blut, der interessanterweise mit der
belastungsinduzierten
Laktatspiegelerhöhung
korreliert 68.
Eine
Verbesserung
des
Ausdauerzustandes führt auf submaximalen Belastungsstufen zu einer Reduktion der
Katecholaminausschüttung
113;155;162
. Kortisol nimmt mit steigender Belastungsintensität vor
allem in der Erholungsphase zu und fördert durch Aufbau größerer Glykogendepots die
aerobe Langzeitausdauer 60;94.
1.3 Körperliche Belastung und Immunsystem
Auf humoraler Ebene wurde bei kurzen anaeroben Bewegungsmustern eine Zunahme der IgG
und IgM Konzentrationen im Serum festgestellt 93. Intensive Langzeitbelastung hingegen
bewirkt eine Abnahme der Serumglobuline und IgA-Sekretion der Schleimhäute in den
oberen Luftwegen. Der IgA-Spiegel im Speichel ist nach allgemeiner sportlicher Belastung
signifikant erniedrigt 77;150. Bei ruhenden Sportlern wurden normale Werte für Immunglobuline aber verminderte Werte für die Komplimentfaktoren C3 und C4 festgestellt 95.
Auf zellulärer Ebene steigt zu Beginn erhöhter Muskeltätigkeit die Zahl der Lymphozyten,
insbesondere aber die Zahl der natürlichen Killerzellen im peripheren Blut bis um das
Fünffache an, gefolgt von einer Lymphopenie direkt nach der Belastung 6;8. Die Zahl der
Lymphozyten und NK-Zellen erreicht dabei nach circa drei Stunden ein Minimum, steigt
dann innerhalb mehrerer Stunden wieder an, allerdings ohne das Ausgangsniveau zu
erreichen 34. Die Zeit bis zur vollständigen Regeneration ist dabei abhängig von der Dauer der
vorausgegangenen Belastung 33;145. In vitro Untersuchungen wiesen in der lymphopenischen
Phase eine verringerte Funktion der NK-Zellen nach, der nach Pedersen und Mitarbeitern ein
von Monozyten über Prostaglandin E2 vermittelter Mechanismus zu Grunde liegt 109. Eine
andere Arbeitsgruppe führte die geringere Zytotoxizität der NK-Zellen nach Sport auf
Veränderungen in der Zusammensetzung von Leukozytensubpopulationen zurück. Die
Zytotoxizität sei durch die verminderte Anzahl an NK-Zellen nach körperlicher Belastung
bedingt, das Zelllysepotential der Einzelzelle sei dabei aber nicht vermindert 94.
8
Die Zellen des Immunsystems werden unter anderem durch sogenannte Zytokine beeinflußt.
Die Konzentrationen einzelner Zytokine im Blut werden durch körperliche Aktivität
verändert. Sowohl IL-6 als auch IL-1 sind nach intensivem Training erhöht, nicht aber IL-2
und IFN-γ 5. Der Anstieg von IL-6 wird mit dem trainingsbedingten Muskelzellschaden 111,
der durch Bestimmung von Myoglobin und Kreatinkinase im Blut quantifiziert werden
kann 10;43, in Verbindung gebracht 14. Der stimulatorische Reiz des IL-6 auf Blutlymphozyten
könnte den Anstieg von IL-1 bewirken 103. Die Zytokinantwort von Sportlern auf eine
Ausdauerbelastung ist der von polytraumatisierten Patienten sehr ähnlich 101;128.
Langfristig führt regelmäßige körperliche Aktivität zu einer Stimulation des Immunsystems.
Moderat ausgeübter Ausdauersport bewirkt eine Zunahme der antikörperabhängigen
Zytotoxizität von Lymphozyten und von Natürlichen Killerzellen 112. Personen, die
regelmäßig Sport treiben ohne sich zu verausgaben, haben seltener Infektionen des oberen
Respirationstrakts als Personen, die keinen Sport treiben 91. Leistungsorientierter Sport mit
extremen Belastungen kann im Gegensatz dazu das Immunsystem supprimieren. Studien bei
intensiv trainierten Sportlern zeigten eine Zunahme an Atemwegsinfekten nach körperlicher
Ausdauerbelastung, die direkt mit Intensität und Umfang des Trainings korrelierte 43;96;97. Es
scheint, als würde schwere körperliche Arbeit bzw. exzessiver Ausdauersport eine Art
vorübergehende Immunsuppression bewirken 112.
1.4 Lymphozyten
Lymphozyten sind 6 bis 10 µm große, runde Zellen, die sich durch wenig Zytoplasma und
geringe Granularität auszeichnen. Sie entwickeln sich aus pluripotenten Stammzellen des
Knochenmarks und ihre Ausreifung erfolgt in den primären lymphatischen Organen. Sie
werden täglich in hoher Zahl gebildet und machen etwa 20% der Leukozyten im peripheren
Blut aus, ihre Aufgabe besteht in der spezifischen Erkennung von Pathogenen und in der
Einleitung der erworbenen Immunantwort.
Man unterscheidet B- und T-Lymphozyten, wobei sich die B-Zellen im Knochenmark weiter
entwickeln, während die Ausreifung der T-Zellen im Thymus stattfindet 40;108. Jede B-Zelle
erkennt mit einem Oberflächenrezeptor sehr spezifisch ein Antigen. Durch eine Interaktion
mit diesem wird die Zelle aktiviert und differenziert sich zur Antikörper produzierenden und
sezernierenden Plasmazelle 18. Diese Antikörper binden einerseits an das ursächliche Antigen,
andererseits werden weitere Bestandteile des Immunsystems stimuliert, die daraufhin das
antigentragende Pathogen eliminieren. Die B-Zellen machen etwa 5 bis 15 % der
9
Lymphozyten im peripheren Blut aus 49.
Die T-Zellen bilden mit ca. 70 bis 80% die größte Lymphozytenpopulation im Blut. Der TZell-Rezeptor (TCR) ist ein Heterodimer der Immunglobulin Superfamilie der in zwei
Formen existiert 22. Der überwiegende Teil der reifen T-Lymphozyten exprimiert α- und βKetten (α/β-TCR), der Rest, ca. 5 bis 10%, γ- und δ-Ketten (γ/δ-TCR) 127. Das α/βHeterodimer erkennt Komplexe von prozessierten Peptiden, die aus fremden Proteinantigenen
entstanden und an körpereigene MHC-Moleküle antigenpräsentierender Zellen (APC)
gebunden sind. In enger Assoziation mit dem T-Zell-Rezeptor liegt der CD3-Komplex auf der
Zellmembran vor, der aus mehreren Ketten besteht und ausgeprägte extra- und intrazelluläre
Domänen besitzt 157;158;159. Wird ein Antigen an den TCR gebunden, gibt der assoziierte CD3Komplex ein Signal an das Zytoplasma der Zelle weiter, welches zu einer Aktivierung
derselben führt. Die transmembranären Glykoproteine CD4 und CD8 stabilisieren die
Antigenbindung und verstärken gleichzeitig das TCR-Signal 13;48;105.
Bei den T-Zellen unterscheidet man zytotoxische T-Zellen (TZ-Zellen, CTL) und THelferzellen (TH-Zellen), die trotz morphologischer Ähnlichkeit sehr unterschiedliche
Fähigkeiten und Funktionen haben. TH-Zellen sind CD3+/CD4+/CD8- Zellen, deren CD4Rezeptor eine hohe Affinität zu MHC-II-Molekülen besitzt, die sich hauptsächlich auf
immunkompetenten Zellen wie z.B. antigenpräsentierenden Phagozyten und B-Zellen
befinden. Durch eine Bindung von CD4 an MHC-II wird die Interaktion des TCR mit der
antigenpräsentierenden
Domäne
des
MHC-Moleküls
stabilisiert,
Signale
können
weitergeleitet und die Signaltransduktion anderer Rezeptoren erleichtert werden. Die THZellen spielen deshalb bei der zellvermittelten Immunreaktion über die Aktivierung der
Makrophagen eine entscheidende Rolle 17;89.
CD3+ zytotoxische T-Lymphozyten mit α/β-TCR werden durch das Oberflächenantigen CD8
charakterisiert, und haben eine wichtige Funktion bei der Eliminierung von bakteriell oder
viral infizierten Zellen sowie von Tumorzellen. Sie binden mit dem CD8-Rezeptor an MHC-IMoleküle, die sich auf fast allen Zellen des menschlichen Körpers befinden 54. Zellen mit
fremdem oder entartetem MHC-I oder mit antigenpräsentierenden MHC-I-Molekülen werden
erkannt und getötet. Die Bindung der CD8-Zellen an das MHC-I-Molekül führt zur Sekretion
von Perforin, was letztendlich, meist in Kombination mit Granzyme-B die Apoptose der
Zielzelle bewirkt 9;169. Kagi und Mitarbeiter konnten zeigen, daß CD8+-Lymphozyten durch
die Perforin-vermittelte Zytotoxizität den Organismus unter anderem vor intrazellulären
Bakterien schützen 52. Um autoreaktive Zellen zu eliminieren, bedient sich die CTL hingegen
des FasL/Fas-Mechanismus, bei dem die Einleitung des Zelltodes durch die Bindung des
10
Liganden FasL an den Apoptoserezeptor Fas (= CD95) ausgelöst wird 9;52;75. Die Bindung von
Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) an seinen Rezeptor p75 bewirkt ebenfalls einen lytischen
Effekt und dient der Beseitigung von CD8-Zellen selbst 168.
CTL mit γ/δ-TCR können Antigene auch ohne die Präsentation durch MHC-Moleküle
erkennen 28. Außerdem tragen sie auch CD94, ein NK-Zellmarker, auf ihrer Oberfläche und
exprimieren wie NK-Zellen zu 95 - 99% Perforin 4. Die genaue Funktion dieser Zellen ist
bisher unklar 41;61, sie werden aber mit immunologischen Erkrankungen wie rheumatoider
Arthritis, Zöliakie und Sarkoidose in Verbindung gebracht 125;129;143.
B-Zellen
NK-Zellen
CD4+
+
D8
+C
γδ
αβ-CD8+
CD3+ T-Zellen
Abb. 1.1: Die Verteilung der Lymphozytensubpopulationen im peripheren Blut.
Die Zusammensetzung der Lymphozyten ist in der Grafik dargestellt. Ca. 70 - 80% der Lymphozyten sind CD3+
T-Zellen, davon sind etwa 2/3 CD4+ und 1/3 CD8+, ca. 10% der T-Zellen sind γ/δ-Zellen. Sowohl B-Zellen als
auch NK-Zellen haben einen Anteil von ca. 5 - 15% an der Lymphozytenpopulation 49.
1.5 Natürliche Killerzellen
NK-Zellen sind große lymphatische Zellen mit gut erkennbaren Granula, die etwa 5 bis 15 %
der gesamten Lymphozytenpopulation im peripheren Blut ausmachen 49. Als spezifische NKZell-Marker dienen unter anderem CD56 (NKH-1, Leu-19), CD16 und CD94. Das CD56Antigen weist eine große Homologie zu NCAM (neural cell adhesion molecule) auf 67. NK-
11
Zellen verfügen im Gegensatz zu den Lymphozyten über keinerlei immunologisches
Gedächtnis und sind unabhängig vom adaptiven Immunsystem. Obwohl sie keine
spezifischen Antigenrezeptoren auf ihrer Oberfläche tragen, töten sie selektiv durch Erreger
geschädigte oder tumoröse Zellen. Besonders intrazelluläre Krankheitserreger wie z.B.
Listeria monocytogenes oder Herpesviren können eliminiert werden 153. Ein dynamisch
gesteuertes Gleichgewicht zwischen aktivierenden und hemmenden Einflüssen reguliert
diesen Vorgang 149. Das Auslösen der Zytolyse durch NK-Zellen wird von verschiedenen
Adhäsions- und Kostimulationsmolekülen mitbestimmt. Die dafür verantwortlichen
Mechanismen
sind
noch
weitgehend
unbekannt,
allerdings
sollen
sogenannte
"immunoreceptor tyrosine-based activation motifs" (ITAMs) dabei eine Rolle spielen 3;11.
Eine weiterer Mechanismus der Zytolyse durch NK-Zellen ist die Zerstörung von
antikörperbehafteten Zellen. Er wird ausgelöst wenn Antikörper, die an der Oberfläche der
Zielzelle gebunden sind, mit ihrem Fc-Teil an einen Fc-Rezeptor ( = CD16 ) der NK-Zelle
adhärieren. Etwa 90% der NK-Zellen tragen dieses CD16-Antigen auf ihrer Oberfläche und
sobald Immunglobuline daran binden findet eine Ausschüttung zytotoxischer Granula statt,
die unter anderem Perforin und Granzyme-B (GrB) enthalten. Perforin bildet Poren in der
Zellmembran der Zielzelle und GrB löst den Tod der Zellen durch Apoptose aus 13;137. Dieser
Vorgang wird als antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) bezeichnet.
Hemmende Einflüße werden über Rezeptoren vermittelt, die zur Gruppe der MHC-Ispezifischen Moleküle gehören. Es gibt 3 klar trennbare Rezeptorfamilien, die Ly49,
CD94/NKG2 und
KIR.
Diese
ansonsten
strukturell unterschiedlichen
Rezeptoren
funktionieren über dieselbe intrazelluläre Signaltransduktionskaskade ITIM (tyrosine based
inhibitory motifs). Sobald ein Ligand gebunden wird, werden die Rezeptoren phosphoryliert
und aktivieren Tyrosin-Phosphatasen wie SHP-1, eventuell auch SHP-2. Es wird vermutet,
daß hemmende NK-Zell-Rezeptoren, die ITIM beeinhalten, zu der sogenannten IRS
(inhibitory receptor superfamily) gehören 64. Durch Abnahme oder Strukturveränderungen
von MHC-I-Molekülen kann das Gleichgewicht zwischen hemmenden und aktivierenden
Einflüssen gestört werden, infolgedessen die NK-Zelle zytotoxische Granula ausschüttet und
so die in ihrer Umgebung befindlichen Zellen abtötet 49.
Neben den Natürlichen Killer-Zellen gibt es eine Population CD3+ Zellen, die auch den NKZell-Marker CD56 exprimiert. Hierbei handelt es sich um Zytokin-induzierte Killer-Zellen
(CIK), die eine hohe zytotoxische Aktivität aufweisen, die nicht MHC-abhängig ist. Sie
entstehen unter dem Einfluß von IFN-γ, IL-2, monoklonalen AK gegen CD3 und IL-1α aus
CD3+CD56- Zellen. Ihr Anteil an den Blutlymphozyten ist mit 1 - 5% jedoch sehr gering 74;78.
12
Auch CD8+ T-Zellen exprimieren zu 4 - 30% das NK-Zell-typische Oberflächenantigen
CD56, diese Zellen sind zu einem hohen Anteil sowohl Perforin- als auch GrB-haltig. Die
Anwesenheit
von
CD56
korreliert
dabei
mit
den
zytolytischen
Potential
der
Zellpopulation 117.
Drugarin und Mitarbeiter beschrieben bei Patienten mit Nephropathie eine T-Zell
Subpopulation, die neben CD3 auch CD16 und CD56 auf der Oberfläche trägt 25. γδ-T-Zellen
exprimieren zum einen wie NK-Zellen Perforin und GrB 57, zum anderen wurden CD56 und
HLA-DR-Rezeptoren auf deren Oberfläche nachgewiesen 84. Aktivierte NK-Zellen von
Erwachsenen exprimieren zytoplasmatisch CD3-ε-Proteine aber keine CD3-γδ-Ketten,
während in fetalem Leberblut hingegen alle 3 Proteine auf der Oberfläche von NK-Zellen
nachzuweisen waren 65;66.
1.6 Perforin
Perforin ist ein 534 Aminosäuren großes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 60
kD, im glykolysierten Zustand wiegt es 68 - 70 kD 70;132;133. Es besitzt eine große funktionelle
Ähnlichkeit mit den porenformenden Komplementkomponenten C6 - C9 165;166. Die läßt
vermuten, daß Perforin nach der Ausschüttung eine der C9-Komponente ähnliche
Konformationsänderung
vollzieht.
Durch
diese
Komformationsänderung
wird
eine
hydrophobe Domäne freigelegt, womit Perforin in der Lage ist, sich selbst in Membranen
einzulagern 118. Perforin wird zusammen mit GrB in sogenannten "dense core type I"-Granula
in zytotoxischen T-Lymphozyten, NK-Zellen und γ/δ-T-Zellen gespeichert 57;98;133;167. Durch
Exozytose wird der Inhalt der Granula in den Interzellularspalt ausgeschüttet. Perforin dringt
in die Membran der Zielzelle ein, polymerisiert und bildet Poren von bis zu 16 nm
Durchmesser 118. Die Bindung von Perforin an die Phospholipid-Doppelschicht sowie die
Polymerisation sind Ca2+-abhängige Prozesse. Die durch einen sauren pH-Wert in den
Granula stabilisierte Interaktion von Perforin mit Proteoglykanen verhindert eine spontane
Polymerisation und schützt damit vor Selbstzerstörung 38;80. Erst durch den höheren pH-Wert
und die erhöhte Ca2+-Konzentration im Interzellularspalt wird eine Porenformation
möglich 12;80;120.
13
1.7 Granzyme-B
Granzyme-B (GrB) wird neben Perforin in zytolytischen Granula von zytotoxischen TLymphozyten, NK-Zellen und γ/δ T-Zellen gespeichert 73;81. Das unglykosylierte GrB hat ein
Gewicht von 26 kD, glykosyliert wiegt es 32 kD 151. GrB ist ein apoptotisches Enzym und
gehört zur Familie neutraler Serin-Proteasen. Diese besitzen ein reaktives Serin im aktiven
Zentrum, welches die aspartatspezifische Proteolyse von Proteinen zu aktivierten Enzymen
katalysiert. Direkte Substrate für GrB sind Caspase-10 und Caspase-7, aber auch Caspase-3,
-6, -8 und -9 können durch GrB geschnitten werden. Der Begriff "Caspase" steht für cysteinedependent aspartate specific protease 141;142.
Nach Kontaktaufnahme mit der Zielzelle und Ausschüttung der Granula wird GrB über einen
hochaffinen Rezeptor auf der Oberfläche der Zielzelle aufgenommen 115 und in
unspezifischen Vesikeln im Zytoplasma gespeichert, während Perforin in der Membran
polymerisiert und Poren bildet. Erst wenn die GrB-Vesikel ihren Inhalt intrazellulär freisetzen
werden in einer Kettenreaktion verschiedene Caspasen aktiviert 30. Diese wiederum aktivieren
Endonukleasen, die eine schnelle Fragmentierung der DNA in 200 bp große Nukleosomen
bewirken 164 und schließlich im apoptotischen Tod der Zelle endet. Neben verschiedenen
Caspasen wurden sowohl im Zellkern 116;151 als auch im Zytoplasma 152 andere Substrate für
GrB gefunden. Diesen caspaseunabhängigen Apoptosewegen könnte bei der Eliminierung
virusinfizierter Zellen eine große Bedeutung zukommen, da einige Viren die Apoptose über
den Caspaseweg durch Produktion caspasehemmender Proteine behindern können 82;87;134;147.
1.8 Einflußnehmende Zytokine
Zytokine sind von Immunzellen produzierte Signalproteine, die lokal oder systemisch eine
Kommunikation zwischen den Zellen ermöglichen. Sie verursachen viele verschiedene
Effekte und können sich dabei sowohl synergistisch als auch gegensätzlich beeinflussen. Das
Zusammenspiel dieser Stoffe ist als komplexes Netzwerk ein wichtiges regulierendes Element
für ein funktionierendes Immunsystem.
IL-2 (Glykoprotein, 15,5 kDa, 133 AS) wird von aktivierten CD4- und CD8-Zellen produziert
und fungiert als autokriner und parakriner Wachstumsfaktor, dessen Wirkung über den IL-2Rezeptor vermittelt wird 135. Bei NK-Zellen verursacht IL-2 eine höhere Zytotoxizität und
induziert synergistisch mit IL-12, welches hauptsächlich von Monozyten und B-Zellen
exprimiert wird, die Synthese und Sekretion von IFN-γ
26
. Des weiteren bewirkt IL-12 eine
14
Erhöhung der Perforin mRNA in CTL und stimuliert CD8-Zellen zu aktiven zytotoxischen
Lymphozyten 47.
IFN-γ (Glykoprotein, 20 - 25 kDa, 143 AS) wird hauptsächlich von CD4+ und CD8+
Lymphozyten und NK-Zellen gebildet und freigesetzt 27;31;106. IFN-γ aktiviert mononukleäre
Phagozyten, steigert die Zytotoxizität von NK-Zellen 146, und erhöht die Expression der
Klasse-I- und II-MHC-Moleküle auf Makrophagen 163. IFN-γ ist notwendig für die
perforinunabhängige Eliminierung von Virusinfektionen in den Oligodendrozyten 107. Hohe
IFN-γ-Spiegel
haben
eventuell
einen
protektiven
Effekt
auf
die
Infektion
mit
Tuberkulosebakterien 161. Je nach Virus ist IFN-γ (Vaccinia) oder Perforin (nicht
zytopathischen
Virusinfektionen,
z.B.
LCMV
oder
Ectromelia)
essentiell
zur
Viruseliminierung 51;122. IL-2, IL-3 und IL-6 erhöhen die Perforinexpression um das 2- bis 14fache, TNF-α und IFN-γ verändern die Perforinexpression in geringerem Maße 71. Die
Eigenschaften dieser Zytokine münden schliesslich in der Förderung der Immunantwort in der
Erkennungsphase viraler Infektionen und sind deshalb wichtige Regulatoren der
Effektorphase der zellvermittelten Immunreaktion.
Nach körperlicher Belastung konnte ein Anstieg der Zytokine IL-1β, IL-6, IL-10 und TNF-α
im Serum nachgewiesen werden 102;156. Die Zytokinantwort auf Sport läßt sich vergleichen
mit der einer bakteriellen Entzündung 110 oder einem Trauma 101. Im Unterschied zur
bakteriellen Infektion ist bei Lymphozyten von Sportlern nach einer erschöpfenden Belastung
die durch LPS-Stimulierung induzierbare, zusätzliche Freisetzung von TNF-α, IL-1 und IL-6
in vitro geringer als bei Kontrollpersonen 156. Eine durch Sport bedingte Aktivierung des
Immunsystems scheint im Gegensatz zur Aktivierung durch Pathogene oder Traumen sofort
gegenreguliert zu werden.
15
1.9 Zielsetzung
Leistungssportler leiden nach körperlicher Ausdauerbelastung häufiger an Infektionen der
oberen Atemwege als Normalpersonen. Diese Infektionen sind oft viraler Genese.
Zytotoxische T-Zellen und NK-Zellen sind unter anderem für den Schutz vor solchen
Krankheitserregern
verantwortlich,
wobei
ein
wesentlicher
Mechanismus
der
Viruseliminierung durch TZ-Zellen und NK-Zellen die Ausschüttung von Perforin und
Granzyme-B ist.
In dieser Arbeit sollen folgende Fragen beantwortet werden:
•
Verändert
sich
die
prozentuale
Verteilung
der
Lymphozytensubpopulationen,
insbesondere der zytotoxischen T-Zellen und NK-Zellen durch sportliche Belastung?
•
Welchen Anteil haben Perforin- bzw. Granzyme-B-positive Zellen an den verschiedenen
Subpopulationen der Lymphozyten bei Sportlern? Verändern sich die Verhältnisse durch
körperliche Belastung?
•
In wie weit lassen sich NK-Zellen und zytotoxische T-Zellen durch Oberflächenmarker
genauer klassifizieren?
•
Unterscheiden sich die Ergebnisse der Triathlon-Gruppe im Vergleich zu einer
Kontrollgruppe ohne regelmäßige sportliche Aktivität?
16
2 Materialien und Methoden
2.1 Geräte und Verbrauchsmaterial
2.1.1 Geräte
FACS-Auswertungssoftware PC-Lysis II
Becton Dickenson, Heidelberg
FACS Gerät FACScan
Becton Dickenson, Heidelberg
Mikroskop Axiolab
Carl Zeiss, Oberkochem
Neubauer-Zählkammer
Brand, Wertheim/Main
pH-Meter pH 535 MultiCal
WTW, Weilheim
Pipetus-Akku
Hirschmann, Eberstadt
Sterilbank
Hereaus, Stuttgart
Vakuumkompressor und -pumpe
Neuberger, Freiburg
Waage: Sartorius Handy H5
Sartorius, Göttingen
Waage: Scaltec SBC 52
Scaltec GmbH, Heiligenstadt
Whirler REAX 2000
Heidolph, Kelheim
Zentrifuge: Centrifuge 5415 C
Eppendorf, Hamburg
Zentrifuge: LaboFuge 400R
Hereaus, Stuttgart
Zentrifuge: Rotixa/RP
Hettich, Tuttlingen
2.1.2 Arbeitsmaterialien
FACS-Röhrchen, 600µl
Greiner Labortechnik, Frickenhausen
Filter: Millex-HV
Millipore, Bedfort, USA
Monovetten (EDTA-Röhrchen)
Sarstedt, Nümbrecht
Pipetten: Biohit-Proline
Biohit, Helsinki, Finnland
Reagenzröhrchen (15 und 50 ml)
Falcon, Heidelberg
Reaktionsgefäße (0,5; 1,5 und 2ml)
Eppendorf, Hamburg
17
2.1.3 Chemikalien
Ammoniumchlorid
Merck, Darmstadt
Bromphenolblau
Sigma, Deisenhofen
Chloroform
Baker, Deventer, Niederlande
DEPC (Diethylpyrocarbonat)
Seromed, Biochrom, Berlin
EDTA
Sigma, Deisenhofen
Etidiumbromid
USB Cleveland, USA
FCS (fetal calf serum)
Seromed, Berlin
Ficoll
Seromed, Berlin
Isopropanol
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Light green SF Yellowisch
Sigma, Deisenhofen
Magnesiumchlorid
Perkin Elmer
Natriumazid
Merck, Darmstadt
Natriumchlorid
Baker, Deventer, Niederlande
Natronlauge
Riedel-de Haen AG, Seelze
Paraformaldehyd
Merck, Darmstadt
PBS w/o Ca2+Mg2+ (Phosphatpuffer)
BioConcept, Schweiz
Salzsäure
Riedel-de Haen AG, Seelze
Saponin
Sigma, Deisenhofen
Toluidinblau
Merck, Darmstadt
Tris-HCL
Sigma, Deisenhofen
2.1.4 Puffer und Lösungen
Antikörper-Verdünnungslösung
Die Antikörperverdünnungslösung besteht aus PBS mit 2% FCS und 0,1% NaN3.
Die Antikörper-Verdünnungslösung wird auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt.
Kimura-Färbelösung
Die verwendete Kimura-Färbelösung wurde aus folgenden Chemikalien hergestellt:
11 ml Toluidinblau-Lösung aus einer 0,05%igen Toluidinblau Gebrauchslösung (bestehend
aus 0,05 g Toluidinblau, 1,8% NaCl und 96% Ethanol ad 100 ml Wasser)
5 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers, pH 6,4
18
0,8 ml einer 0,03%igen Light green Lösung
0,5 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers, der mit Saponin abgesättigt ist
Nach gründlicher Durchmischung wird die Lösung durch einen 0,45 µm Filter filtriert und bei
4 °C gelagert.
10-fach NH4CL (Lysispuffer)
Die 10-fach konzentrierte NH4CL-Stammlösung zur Lyse von Erythrozyten setzt sich wie
folgt zusammen:
1,53 M NH4Cl
0,1 M KHCO3
1 mM EDTA
Der 10-fach Lysispuffer wird in H2O angesetzt.
Für den gebrauchsfertigen Lysispuffer wird die Stammlösung mit H2O im Verhältnis 1 zu 10
verdünnt.
Waschpuffer
PBS mit 1% FCS und 0,1% NaN3 (pH 7,4 -7,6).
Fixierlösung
Die Fixierlösung besteht aus 4%igem Paraformaldehyd in PBS gelöst.
Die Löslichkeit des Paraformaldehyds wird unter Verwendung von warmem PBS und einigen
Tropfen Natronlauge wesentlich verbessert. Die Fixierlösung sollte einen pH-Wert von 7,4 7,6 haben.
Permeabilisierungspuffer
PBS mit 1% FCS und 0,1% Saponin (pH 7,4 - 7,6).
2.1.5 Antikörper
Isotypkontrolle: IgG1- FITC
Klon: DAK-GO1
Dako, Hamburg
Isotypkontrolle: IgG1-PE
Klon: DAK-GO1
Dako, Hamburg
Anti-Human CD3-PE
Klon: UCHT1
Dako, Hamburg
Anti-Human CD4-PE
Klon: MT 3-10
Dako, Hamburg
Anti-Human CD8-PE
Klon: DK 25
Dako, Hamburg
19
Anti-Human CD16-PE
Klon: 3G8
Dako, Hamburg
Anti-Human CD56-PE
Klon: B-A19
Diaclone, Besancon, F
Anti-Human Perforin-FITC
Klon: δG9
Hölzel Diagnostika, Köln
Anti-Human-Granzyme-FITC
Klon: HC4
Hoelzel Diagrostika, Köln
Anti-Human CD3-Cy5
Klon: UCHT1
Dako, Hamburg
Anti-Human-CD8-Cy5
Klon: DK25
Dako, Hamburg
Bei den verwendeten Antikörpern handelt es sich ausschließlich um monoklonale Antikörper
aus der Maus vom Isotyp IgG1.
2.2 Methoden
2.2.1 Auswahl der Probanden
Es wurden männliche Ausdauersportler im Alter von 18 bis 45 Jahren mit regelmäßiger
Trainingsanamnese und erhöhter aerober Leistungsfähigkeit (VO2max > 55 ml/kgKG/min)
untersucht. Die Probanden wurden einer ärztlichen und laborchemischen Voruntersuchung
unterzogen. Als Ausschlußkriterien galten chronische, entzündliche oder konsumierende
Erkrankungen sowie chronischer Alkoholkonsum, chronische Medikamenteneinnahme oder
Zufuhr von Antioxidantien. Akute oder chronische Organerkrankungen, insbesondere der
Leber und der Bauchspeicheldrüse, führten ebenso zum Auschluß der Studie.
Außerdem wurden 10 gesunde, nicht Sport treibende Personen aus Labor und Klinikpersonal
untersucht. Diese Probanden hatten nach eigenen Angaben zum Zeitpunkt der Blutabnahme
keine akuten, chronischen oder konsumierenden Erkrankungen und waren nicht sportlich
aktiv. Als Ausschlußkriterium galt jede Art von Ausdauersport als auch Freizeitsportarten wie
Fußball Tennis, Kraftsport so wie jede andere Art erhöhter körperlicher Tätigkeit.
2.2.2 Chronologischer Ablauf der Untersuchungen
Die Untersuchungen fanden an zwei voneinander unabhängigen Gruppen statt. Das erste
Kollektiv, im weiteren Kontext als "Lauf-Gruppe" bezeichnet, bestand aus 11 Sportlern, die
an einem erschöpfenden, ca. 60 minütigen Dauerlauf teilnahmen. Es fanden insgesamt fünf
venöse Blutabnahmen statt, und zwar achtundvierzig (U1) und eine Stunde vor (U2) und eine
(U3), sechs (U4) bzw. zwanzig Stunden nach (U5) der Belastung.
20
Das zweite Kollektiv, im nachfolgenden Text "Triathlon-Gruppe" genannt, waren 31
Triathleten, die am Landwassertriathlon teilnahmen, wobei jeder Proband 400 m schwimmen,
25 km Rad fahren und 4 km laufen mußte. Die Blutabnahmen fanden eine Stunde vor (U1)
und eine (U2) bzw. zwanzig Stunden nach (U3) dem Wettkampf statt.
Das
entnommene
Blut
wurde
mit
Oberflächenantikörpern
inkubiert,
um
die
Lymphozytensubpopulationen semiquantitativ zu bestimmen. In einem weiteren Schritt
wurden die mononukleären Zellen aus dem Blut isoliert und diese mit Oberflächenantikörpern
und intrazellulären Antikörpern gegen Perforin oder Granzyme-B inkubiert, um den Perforinbzw. GrB-Gehalt der einzelnen Subpopulationen zu messen. Bei jeder EDTA-Blutabnahme
wurde zusätzlich ein Serumröhrchen Blut abgenommen, für 30 Minuten bei 4 °C
stehengelassen und anschließend abzentrifugiert (1000 g, 10 Minuten). Das so gewonnene
Serum wurde bei –20 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
Gruppe
Material
1. Antikörper
2. Antikörper
intrazellulärer
Oberfläche
Oberfläche
Antikörper
Lauf
Vollblut
IgG-PE
IgG-FITC
/
Lauf
Vollblut
CD4-PE
CD3-FITC
/
Lauf
Vollblut
CD8-PE
CD3-FITC
/
Lauf
Lauf
Lauf
Lauf
Lauf
Lauf
Lauf
Lauf
Lauf
Lauf
Triathlon
Triathlon
Triathlon
Triathlon
Triathlon
Triathlon
Vollblut
MNC
MNC
MNC
MNC
MNC
MNC
MNC
MNC
MNC
Vollblut
Vollblut
Vollblut
Vollblut
MNC
MNC
CD16/56-PE
IgG-PE
CD3-PE
CD4-PE
CD8-PE
CD16/56-PE
CD3-PE
CD4-PE
CD8-PE
CD16/56-PE
IgG-PE
CD4-PE
CD8-PE
CD16/56-PE
CD16/56-PE
CD16/56-PE
CD3-FITC
/
/
/
/
/
/
/
/
/
IgG-FITC
CD3-FITC
CD3-FITC
CD3-FITC
CD3-Cy5
CD8-Cy5
/
IgG-FITC
Perforin-FITC
Perforin-FITC
Perforin-FITC
Perforin-FITC
Granzyme-B-FITC
Granzyme-B-FITC
Granzyme-B-FITC
Granzyme-B-FITC
Perforin-FITC
Perforin-FITC
Tabelle 2.1: Auflistung der verwendeten Antikörper in der Lauf-Gruppe und der Triathlon-Gruppe.
21
2.2.3 Separation mononukleärer Zellen
Im Vollblut sind unterschiedliche Zelltypen, wie Erythrozyten, Thrombozyten, Granulozyten,
Monozyten/Makrophagen und Lymphozyten vorhanden. Unter dem Begriff “mononukleäre
Zellen” (MNC) faßt man die Monozyten und Lymphozyten zusammen. Die Trennung der
MNC von den restlichen Blutzellen erfolgt durch Zentrifugation über einen Ficoll-Gradienten
(1,077 g/cm3). Die MNC sammeln sich während der Zentrifugation in der Interphase an,
wohingegen die Erythrozyten und Granulozyten durch das Ficoll hindurch auf den Boden des
Zentrifugenröhrchens sedimentieren. Die Thrombozyten, Monozyten/Makrophagen und
Lymphozyten besitzen eine geringere Dichte als 1,077 g/cm3. Dieser Umstand wird bei der
Trennung der Erythrozyten und Granulozyten von den MNC genutzt.
In dieser Arbeit wurde durch Punktion einer Armvene den Probanden 9 ml Blut in EDTAhaltige Röhrchen abgenommen, mit 1/3 Volumen PBS verdünnt, auf 20 ml Ficoll geschichtet
und 20 min bei 1330 g zentrifugiert. Anschließend wurde die Interphase abgenommen und die
darin enthaltenen mononukleären Zellen wurden zweimal mit 640 g für 10 min bei 12 °C mit
PBS gewaschen, der entstandene Zellniederschlag wurde in 1000 µl PBS resuspendiert.
2.2.4 Kimura-Färbung
Die Bestimmung der Zellkonzentration erfolgte mittels Kimura-Färbung. Dazu wurden 90 µl
Kimura-Lösung mit 10 µl Zellsuspension vermischt und für etwa 60 sec inkubiert. Die
Auszählung der Zellen erfolgte in einer Neubauer-Kammer. Für die Inkubation der Zellen mit
fluoreszenzmarkierten Antikörpern wurden die Zellen auf eine Zellzahl von 2x106 Zellen pro
ml eingestellt. In der Zellsuspension befinden sich T- und B-Lymphozyten, Monozyten, NKZellen und Thrombozyten.
2.2.5 Markierung von Zelloberflächenmolekülen
Durch die Markierung von Oberflächenantigenen lassen sich verschiedene Zellpopulationen
mittels Durchflußzytometer optisch trennen und quantifizieren. So können eventuelle
Veränderungen in der Zusammensetzung der Lymphozytenpopulationen bei den untersuchten
Probanden erkannt werden. Es ist möglich, gleichzeitig mehrere unterschiedliche
Oberflächenantigene mit verschiedenen Fluoreszenzen zu markieren, wobei das in dieser
Arbeit benutze Durchflußzytometer in der Lage ist, maximal drei Fluoreszenzsignale zu
unterscheiden und zu analysieren.
Zur Markierung der Oberflächenantigene bei Vollblut wurden jeweils 10 µl eines
22
fluoreszenzmarkierten Antikörpers (anti-CD3, CD4, CD8, CD16 und CD56) und 10 µl
unverdünntes Vollblut in 600 µl FACS-Röhrchen pipettiert. Die Röhrchen wurden
zentrifugiert und das Blut mit dem Antikörper vermischt. Anschließend wurden die Proben
für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubation wurde in jedes
FACS-Röhrchen 200 µl Lysispuffer gegeben und wieder für 15 min inkubiert. Die
Ammoniumchloridlösung führt bei Erythrozyten zur hypotonen Lyse. Anschließend wurde
die Suspension 5 min bei 600 g zentrifugiert und der Überstand wurde abgesaugt. Die Lyse
der Erythrozyten ist notwendig, da sonst im Durchflußzytometer überwiegend Erythrozyten
an Stelle der Lymphozyten gezählt würden. Wenn das Zellsediment noch durch zu viele
Erythrozyten kontaminiert zu sein schien, was anhand der roten Farbe leicht abzuschätzen
war, wurde die Lyse wiederholt. Diesmal betrug der Zeitraum der Lyse nur 5 Minuten. Das
Zellsediment wurde anschließend zwei mal gewaschen und dann in 200 µl PBS/2% FCS
aufgenommen, und bis zur Messung bei 4 °C aufbewahrt.
Die Markierung der per Ficoll-Gradient isolierten MNC mit Oberflächen-Antikörpern
entspricht der Oberflächenmarkierung der Zellen aus dem Vollblut. Die Zellsuspension mit
einer Zellzahl von 2x106 Zellen/ml wurde in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und 5 min
bei 690 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, das Zellsediment mit 700 µl
Waschpuffer resuspendiert und erneut abzentrifugiert. Anschließend wurde der Waschpuffer
abgesaugt und die Zellen in 200 µl PBS resuspendiert. Jeweils 10 µl dieser Zellsuspension
und 10 µl des jeweiligen Antikörpers wurden in ein FACS-Röhrchen pipettiert und gut
durchmischt. Für die Zellcharakterisierung wurden Phycoerythrin (PE) markierte Antikörper,
die spezifisch CD3, CD4, CD8, CD16 oder CD56 binden, verwendet. Als Isotypkontrolle
diente der IgG1-PE markierte Antikörper, wobei die Isotypkontrolle zur Quantifizierung der
unspezifischen Bindung der verwendeten Antikörper diente. Nach 30 min Inkubation bei
Raumtemperatur (RT) und im Dunkeln wurden die Zellen zwei Mal mit 200 µl Waschpuffer
für 5 Minuten bei 690 g gereinigt.
2.2.6 Fixierung und Permeabilisierung der separierten Zellen
Die gewaschenen Zellen wurden in 200 µl 4%igem Paraformaldehyd kräftig resuspendiert.
Eine gute Durchmischung der Zellen war nötig, da sie sonst aneinanderkleben würden. Die
Zellen wurden anschließend für 15 min auf Eis fixiert und zweimal mit 200 µl Waschpuffer
bei 690 g für 5 min gewaschen. Ein dritter Waschgang erfolgte mit Permeabilisierungslösung,
die 0,1%iges Saponin enthielt. Dadurch wurde die Zellmembran duchlässig für FITCmarkierte Anti-Perforin-Antikörper, die an intrazelluläres Perforin binden sollten.
23
2.2.7 Inkubation der permeabilisierten Zellen mit Anti-Perforin-Antikörper
Die Inkubation der fixierten und gewaschenen Zellen mit den FITC-markierten Anti-Perforin
bzw. Anti-GrB-Antikörpern (je 10 µl) erfolgte für 20 - 30 min bei RT im Dunkeln. Außerdem
wurde für die intrazelluläre Isotypkontrolle ein Teil der Zellen mit IgG1-FITC inkubiert.
Danach wurden die Zellen zweimal mit 0,1%iger Saponinlösung bei 690 g für 5 min
gewaschen, um überschüssige Antikörper zu entfernen. Zum Schluß wurde das Zellsediment
in 150 µl PBS aufgenommen und bis zur FACS-Messung bei 4 °C aufbewahrt.
2.2.8 Durchflußzytometrie
Unter Durchflußzytometrie versteht man die Analyse einer Zellpopulation mittels eines
Laserstrahls hinsichtlich ihrer Größe, Granularität und Oberflächenmoleküle. Zur qualitativen
und
semiquantitativen
Untersuchung
von
Membranmolekülen
können
Zellen
mit
Fluoreszenzfarbstoffen, die an monoklonale Antikörper gegen Oberflächenantigene gekoppelt
sind, markiert werden. Bei dem verwendeten Gerät können bis zu drei Fluoreszenzen
gleichzeitig gemessen werden. Während der Messung werden die Zellen in eine dünne
Kapillare gesaugt, so daß ein Strom einzelner Zellen entsteht. Die Zellen werden von einem
Laserstrahl mit einer Wellenlänge von 488 nm erfaßt. Photodetektoren messen die
Lichtstreuung in Form von Vorwärtsstreuung FSC (Maß für die Größe) und Seitwärtsstreuung
SSC
(Maß
für
die
Fluoreszenzfarbstoffe.
Granularität),
Die
sowie
die
Fluoreszenzfarbstoffe
emittierten
Photoquanten
Fluoresceinisothiocyanat
der
(FITC),
Phycoerythrin (PE) und Cytochrom5 (Cy5) absorbieren Licht der Wellenlänge 488 nm. FITC
emittiert grünes Licht der Wellenlänge 530 nm, PE oranges Licht der Wellenlänge 585 nm
und Cy5 tiefrotes Licht der Wellenlänge 650 nm. Überlappende Signale der Fluoreszenzen
können nach individueller Einstellung vom Gerät kompensiert werden, so daß eine
Zellpopulation gleichzeitig auf drei Parameter untersucht werden kann. Die Daten werden im
Computer gespeichert und stehen der nachträglichen Auswertung zur Verfügung.
24
2.2.9 Auswertung der Messungen
Anhand der Zellgröße und Granularität einer Zelle können Zellpopulationen gegeneinander
abgegrenzt werden. Im sogenannten Dotplot werden jeder Zelle ihrem FSC und SSC
entsprechend zwei Koordinaten zugeordnet um als Punkt dort abgebildet zu werden.
Lymphozyten lassen sich als relativ kleine und wenig granulierte Zellen abgrenzen (Gate R1).
Abbildung 2.1: Lage der Leukozytenpopulationen im FSC-SSC-Dotplot.
Links ist die Position der verschiedenen Leukozytenpopulationen aus dem peripheren Blut im FSC
(lineare Achse) / SSC (logarithmische Achse) - Diagamm dargestellt, der rechte Dot-Plot zeigt die MNC
nach Ficollseparation. Der größte Anteil der Zellen in der rechten Grafik sind in der Region R1 liegende
Lymphozyten.
Die Software des Analysegerätes ermöglicht es, weitere Koordinatensysteme darzustellen, in
denen nur Zellen abgebildet werden, die sich in einem beliebig definierbaren Bereich (ein sog.
Gate) im FSC/SSC-Dotplot befinden. Die Koordinaten werden dabei durch die Fluoreszenzen
der in diesem Bereich befindlichen, antikörpermarkierten Zellen bestimmt.
Abb. 2.2: Darstellung der Regionen R1 bis R5.
In einem CD16/56 vs CD3-Dotplot sind die einzelnen
Subpopulationen, die sich aus einem Lymphozytengate
ergeben, abgebildet und eigenen Regionen zugeordnet.
25
In einem Histogramm wird jede Zelle eines bestimmten Bereichs ihrer Fluoreszenzintensität
entsprechend auf der Abszisse dargestellt, während auf der Ordinate die Anzahl der Zellen
mit derselben Fluoreszenzintensität dokumentiert wird. Daraus ergibt sich insgesamt eine
Kurve.
Events
512
256
M1
0
100
101
103
102
Perforin-FITC
104
Abbildung 2.3: Darstellung der Perforin-Fluoreszenz auf Lymphozyten im Histogramm.
Die spezifische Fluoreszenz ist mit dem Marker M1 gekennzeichnet, die unspezifische Fluoreszenz liegt im
Bereich 101.
Jede im zweidimensionalen Dotplot dargestellte Zellpopulation kann einer Region zugeordnet
und mit der Region der 3. Dimension (z.B. M1) verknüpft werden. Ein Statistikprogramm
errechnet sowohl prozentuale als auch absolute Anteile aller Fluoreszenzen bezüglich
definierter Regionen. So ist es zum Beispiel möglich, die in einem Dotplot dargestellten CD3+
und gleichzeitig CD16/56+ Zellen einer Region R2 zuzuordnen und diese mit einer in einem
Histogramm dargestellten Perforin-FITC-Fluoreszenz mit "UND" zu verknüpfen. Dadurch
kann man die in R2 befindlichen Zellen in perforinhaltige und nicht-perforinhaltige Zellen
trennen. Die Software des Analysegeräts errechnet daraus die prozentualen Anteile der
einzelnen definierten Regionen an der Lymphozytenpopulation.
In unserem Beispiel (Abb. 2.2, S. 24) stellt R1 die CD3+/CD16/56- T-Zellen, R2 die
CD3+/CD16/56+ und R3 die CD3-/CD16/56+ Zellen dar. R4 sind fluoreszenznegative Zellen
und R5 stellt Zellen dar, die nicht eindeutig zuzuordnen sind. Diesem Auswertungsmuster
26
liegen die Ergebnisse der Triathlon-Gruppe dieser Arbeit zugrunde. Bei der Lauf-Gruppe
wurden nur 2 Antikörper benutzt, deshalb konnten die Messungen dieser Gruppe mittels
Quadranten im zweidimensionalen Dotplot ausgewertet werden.
2.2.10 Statistik
Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± Standardfehler dargestellt. Die statistische Auswertung
erfolgte mit Hilfe der Software Sigmastat. Für die zeitkinetischen Messungen wurde der Test
One-Way-Anova for repeated measurements, für die Vergleiche zwischen Sportlern und
Kontrollpersonen der student t-test benutzt. Als signifikant wurde ein p < 0,05 angesehen.
27
3 Resultate
3.1 Ergebnisse der Lauf-Gruppe
Die Lauf-Gruppe bestand aus 11 Ausdauersportlern, denen zu den fünf Zeitpunkten U1 bis
U5
venöses
Blut
abgenommen
wurde,
um
die
prozentuale
Verteilung
der
Lymphozytenpopulationen und die Anteile Perforin- bzw. Granzyme-B-positiver Zellen an
den Lymphozytenfraktionen zu bestimmen.
3.1.1 Charakterisierung der T-Zellsubpopulationen im Vollblut
BLUT
U5
(U3/U2)-1
67,5±3,0%
+5,48%
36,8±2,0% 47,5±2,1% 43,6±2,4%
40,3±2,4%
+29,08%
CD8
37,3±2,7% 32,0±2,7% 24,8±1,8% 24,1±1,8%
32,8±2,4%
-22,5%
CD16/56
25,5±2,2% 22,7±2,4% 10,9±1,4% 14,7±2,0%
21,0±3,0%
-52,0%
CD3+/CD16/56+
6,2±1,8%
6,1±2,3%
-52,4%
CD3
CD4
U1
U2
U3
U4
67,5±2,0% 67,5±1,6% 71,2±1,5% 66,2±2,4%
41±2,5%
4,2±2,0%
2,0±0,8%
3,2±1,4%
Tab .3.1: Prozentuale Anteile der Lymphozytenfraktionen im peripheren Blut vor und nach Sport.
Untersucht wurden 11 Sportler zu den Zeitpunkten 48 (U1) und eine Stunde vor (U2) und eine (U3), 6 (U4) und
20 Stunden nach (U5) der Belastung, angegeben sind Mittelwerte ± SEM. Die Werte in der letzten Spalte der
Tabelle wurden mit der Formel (U3/U2)-1 errechnet und stellen die prozentuale Veränderung der jeweiligen
Population von U2 nach U3 dar.
Für CD3+ Lymphozyten ergab sich keine signifikante Veränderung. Die Population der CD4+
Zellen zeigte einen signifikanten Anstieg eine Stunde nach der Belastung und ging in der
Erholungsphase (U4 und U5) wieder in den Bereich der Ausgangslage zurück. Gegensätzlich
dazu verhielten sich die CD8+ und CD16/56+ Populationen als auch die Fraktion der CD3+
und gleichzeitig CD16/56+ Zellen, deren Anteil sich eine Stunde nach sportlicher Aktivität
signifikant verringerte und in der Erholungsphase auf das Ausgangsniveau erholte.
28
3.1.2 Charakterisierung der T-Zellsubpopulationen
MNC
U1
U2
U3
U4
U5
(U3/U2)-1
CD3
68,7±2,4% 65,2±2,5%
62,7±3,6%
73,4±1,8% 70,7±2,5%
-3,83%
CD4
37,6±1,9% 41,0±2,0%
55,3±2,4%
48,4±2,0% 41,1±3,1%
+34,88%
CD8
41,1±2,6% 35,8±2,9%
24,6±1,9%
31,3±2,2% 36,6±3,2%
-31,28%
CD16/56
34,2±2,5% 36,1±2,6%
23,0±4,1%
21,1±1,8% 27,1±3,2%
-36,29%
Tab. 3.2: Prozentuale Anteile der Lymphozytenfraktionen in der MNC-Fraktion vor und nach Sport.
Untersucht wurden 11 Sportler zu den Zeitpunkten U1 bis U5, angegeben sind Mittelwerte ± SEM. Die Werte in
der letzten Spalte der Tabelle wurden mit der Formel (U3/U2)-1 errechnet und stellen die prozentuale
Veränderung der jeweiligen Population von U2 nach U3 dar.
Die Oberflächenanalyse der MNC ergab für CD3+ Zellen keine signifikante Veränderung. Die
CD4+ Zellen stiegen nach der Belastung signifikant an, in der Erholungsphase fielen sie
wieder in den Bereich der Ausgangslage zurück. Sowohl CD8-Zellen als auch CD16/56Zellen fielen nach dem Lauf signifikant ab und stiegen in der Erholungsphase wieder an,
erreichten aber nicht das Ausgangsniveau von U1 bzw. U2.
3.1.3 Perforin-positive Zellen in Lymphozytensubpopulationen
MNC
U1
U2
U3
U4
U5
(U3/U2)-1
Perforin gesamt
43,6±3,3% 40,1±3,1% 20,5±2,3%
27,6±2,1% 40,4±4,1%
-48,88%
CD3+/Perforin+
22,1±4,0% 20,0±3,7%
8,7±1,7%
16,0±2,7% 21,3±4,0%
-56,5%
CD4+/Perforin+
2,4±0,7%
2,1±0,6%
2,1±0,3%
1,9±0,4%
CD8+/Perforin+
27,5±3,2%
25±3,1%
11,0±1,5%
17,4±2,1% 24,3±3,5%
-56,0%
CD16/56+/Perforin+ 31,5±2,3% 30,1±2,8% 14,1±1,7%
18,3±1,7% 26,0±3,2%
-53,16%
2,2±0,7%
0%
Tab. 3.3: Prozentuale Verteilung Perforin+ Zellen in Lymphozytenfraktionen in der MNC-Fraktion vor
und nach Sport. Untersucht wurden 11 Sportler zu den Zeitpunkten U1 bis U5, angegeben sind Mittelwerte ±
SEM. Der Gesamtanteil Perforin+ Zellen ist als Mittelwert aller Messungen dargestellt. Die Werte in der letzten
Spalte der Tabelle wurden mit der Formel (U3/U2)-1 errechnet und stellen die prozentuale Veränderung der
jeweiligen Population von U2 nach U3 dar.
29
*
40
*
Perforin+ Zellen in der
Lymphozytenpopulation [%]
35
*
*
30
CD3+ Perforin+
25
CD4+ Perforin+
20
CD8+ Perforin+
15
CD16/56+ Perforin+
10
5
0
U1
U2
U3
U4
U5
Abb. 3.1: Graphische Darstellung der Perforin+ Subpopulationen.
In der obigen Grafik sind die Anteile der verschiedenen Perforin-positiven Subpopulationen an den
Lymphozyten zu den 5 Meßzeitpunkten U1 bis U5 dargestellt. Eine Stunde nach dem Sport (U3) ist eine
deutliche Verminderung Perforin-positiver Zellen erkennbar. Innerhalb von 20 Stunden (U4 und U5) stellte sich
eine Erholung ein. Die beiden Messungen vor der Belastung (U1 und U2) hingegen ergaben keine Veränderung.
Das Diagramm bezieht sich auf die Daten der Tabelle 3.3, die Signifikanzmarkierungen gelten für CD3, CD8
und CD16/56, (n = 11, * = P < 0,05).
Aus der Grafik wird ersichtlich, daß der Anteil der CD3+, CD8+ und CD16/56+ Perforin+
Zellen nach sportlicher Belastung signifikant zurück geht und 20 Stunden danach fast wieder
das Ausgangsniveau erreicht. Die Verteilung der Populationen bei den Meßpunkten vor dem
Lauf (U1 und U2) unterscheiden sich hingegen nicht. Der geringe Prozentsatz der Perforin+
CD4-Zellen bleibt von der Belastung unbeeinflußt.
Um die Perforin+ Lymphozytenuntereinheiten besser beurteilen zu können wurden sie ins
Verhältnis zu ihrer eigenen Gesamtheit gesetzt. Daraus ergaben sich folgende Werte:
MNC
U1
U2
U3
U4
U5
(U3/U2)-1
CD3+P+ / CD3
31,2±5,0%
29,5±4,7%
14,0±2,7%
21,3±3,2%
29,7±5,0%
-52,54%
CD4+P+ / CD4
7,2±2,3%
6,2±1,8%
4,0±0,7%
4,1±0,9%
6,3±2,3%
-35,45%
CD8+P+ / CD8
64,8±3,9%
67,6±3,0%
43,3±4,4%
54,0±3,3%
63,4±3,9%
-35,95%
CD16/56+P+/CD16/56
92,0±1,0%
82,8±2,4%
68,3±6,0%
85,9±1,9%
95,1±1,0%
-17,51%
Tab. 3.4: Anteil Perforin+ Zellen innerhalb jeder Subpopulation in MNC vor und nach Sport.
Untersucht wurden 11 Sportler zu den Zeitpunkten U1 bis U5, angegeben sind Mittelwerte ± SEM. Die Werte in
der letzten Spalte der Tabelle wurden mit der Formel (U3/U2)-1 errechnet und stellen die prozentuale
Veränderung der jeweiligen Population von U2 nach U3 dar.
30
Perforin+ Zellen innerhalb
jeder Subpopulation [%]
*
*
100
*
80
CD3+ P+ / CD3
CD4+ P+ / CD4
60
CD8+ P+ / CD8
CD16/56+ P+ / CD16/56
40
20
0
U1
U2
U3
U4
U5
Abb. 3.2: Graphische Darstellung der Perforin+ Zellen innerhalb jeder Subpopulation.
Diese Grafik zeigt den Verlauf der perforinhaltigen Zellen innerhalb der einzelnen Subpopulationen zu den
Meßzeitpunkten U1 bis U5. Vor allem innerhalb der CD3, CD8 und CD16/56-Population ist der Anteil Perforinpositiver Zellen eine Stunde nach Sport (U3) vermindert. In der 20-stündigen Erholungsphase (U4 und U5) kehrt
die Verteilung in etwa auf die Ausgangslage zurück. Das Diagramm bezieht sich auf die Daten der Tabelle 3.4,
die Signifikanzmarkierungen gelten für CD3, CD8 und CD16/56, (n = 11, * = P < 0,05).
Die Fraktionen der Perforin+ CD3, CD8 und CD16/56-Zellen weisen innerhalb ihrer
Populationen einen signifikanten Abfall eine Stunde nach körperlicher Aktivität auf und
erreichen nach 20 Stunden Erholung wieder Werte im Bereich der Ausgangslage. Der geringe
Anteil der Perforin+ CD4-Zellen zeigte erneut keine signifikante Veränderung.
3.1.4 Granzyme-B-positive Zellen in Lymphozytensubpopulationen
MNC
U1
U2
U3
U4
U5
(U3/U2)-1
GrB gesamt
35,3±3,0% 33,1±2,7% 14,2±2,1%
21,8±2,3%
28,0±4,1%
-57,1%
CD3+/GrB+
16,9±3,6% 16,1±3,6%
6,0±1,5%
11,7±2,5%
14,6±4,0%
-62,73%
CD4+/GrB+
2,3±0,5%
2,7±0,6%
1,8±0,4%
1,5±0,4%
1,5±0,6%
-33,33%
CD8+/GrB+
Fehler
18,5±2,7%
8,4±1,5%
13,7±1,9%
16,9±3,3%
-54,59%
CD16/56+/GrB+ 24,1±2,4% 27,3±2,2% 10,0±1,6%
14,0±1,8%
18,4±3,2%
-63,37%
Tab. 3.5: prozentuale Verteilung der GrB+ Zellen in Lymphozytenfraktionen in MNC vor und nach Sport.
Untersucht wurden 11 Sportler zu den Zeitpunkten U1 bis U5, angegeben sind Mittelwerte ± SEM. Die Werte in
der letzten Spalte der Tabelle wurden mit der Formel (U3/U2)-1 errechnet und stellen die prozentuale
Veränderung der jeweiligen Population von U2 nach U3 dar.
31
35
*
*
*
30
GrB+ Zellen in der
Lymphozytenpopulation [%]
25
CD3+ GrB+
20
CD4+ GrB+
CD8+ GrB+
15
CD16/56+ GrB+
10
5
0
U1
U2
U3
U4
U5
Abb. 3.3: Graphische Darstellung der GrB+ Subpopulationen in MNC.
In der obigen Grafik sind die Anteile der verschiedenen GrB-positiven Subpopulationen an den Lymphozyten zu
den 5 Meßzeitpunkten U1 bis U5 dargestellt. Eine Stunde nach dem Sport ist eine deutliche Verminderung dieser
Zellen erkennbar. Innerhalb von 20 Stunden stellte sich eine Erholung ein. Das Diagramm bezieht sich auf die
Daten der Tabelle 3.5, die Signifikanzmarkierungen gelten für CD3, CD8 und CD16/56, (n = 11, * = P < 0,05).
Das obige Schaubild zeigt einen signifikanten Abfall der GrB+ Zellen eine Stunde nach der
Belastung in den CD3, CD8 und CD16/56-Fraktionen. In der Erholungsphase steigt der Anteil
GrB+ Zellen wieder an, erreicht aber nach 20 Stunden nicht den Ausgangswert vor der
Belastung. CD4-Zellen sind zu einem sehr geringen Teil GrB-haltig und verändern sich zu
den einzelnen Meßzeitpunkten nur unwesentlich. Durch einen technischen Fehler konnten die
Meßergebnisse der Untersuchung U1 für die CD8-Zellen bedauerlicherweise nicht verwertet
werden.
Um die GrB+ Lymphozytenuntereinheiten besser beurteilen zu können, wurden sie ins
Verhältnis zu ihrer eigenen Gesamtheit gesetzt. Daraus ergaben sich folgende Werte:
MNC
U1
U2
U3
U4
U5
(U3/U2)-1
CD3+GrB+ / CD3
23,9±4,5% 24,8±4,9% 10,7±3,1% 15,7±3,1% 19,7±5,2%
-56,85%
CD4+GrB+ / CD4
6,6±1,6%
4,6±2,0%
-53,42%
CD8+GrB+ / CD8
Fehler
49,7±4,3% 31,5±4,4% 41,7±3,5% 42,6±4,9%
-36,62%
71,1±3,5% 71,2±2,7% 49,6±5,0% 63,1±3,7% 66,5±3,9%
-30,33%
CD16/56+GrB+/CD16/56
7,3±1,8%
3,4±0,9%
3,4±1,0%
Tab. 3.6: Anteil GrB+ Zellen innerhalb jeder Subpopulation in MNC vor und nach Sport.
Untersucht wurden 11 Sportler zu den Zeitpunkten U1 bis U5, angegeben sind Mittelwerte ± SEM. Die Werte in
der letzten Spalte der Tabelle wurden mit der Formel (U3/U2)-1 errechnet und stellen die prozentuale
Veränderung der jeweiligen Population von U2 nach U3 dar.
32
*
80
*
*
GrB + Zellen innerhalb
jeder Subpopulation [%]
70
60
CD3+GrB+ / CD3
50
CD4+ GrB+ / CD4
CD8+ GrB+ / CD8
40
CD16/56+ GrB+ / CD16/56
30
20
10
0
U1
U2
U3
U4
U5
Abb. 3.4: Graphische Darstellung der GrB+ Zellen innerhalb jeder Subpopulation.
Diese Grafik zeigt den Verlauf der GrB-haltigen Zellen innerhalb der einzelnen Subpopulationen zu den
Meßzeitpunkten U1 bis U5. Vor allem innerhalb der CD3, CD8 und CD16/56-Population ist der Anteil GrBpositiver Zellen eine Stunde nach Sport (U3) vermindert. In der 20-stündigen Erholungsphase (U4 und U5) kehrt
die Verteilung in etwa auf die Ausgangslage zurück. Das Diagramm bezieht sich auf die Daten der Tabelle 3.6,
die Signifikanzmarkierungen gelten für CD3, CD8 und CD16/56, (n = 11, * = P < 0,05).
Die Abbildung 3.4 zeigt für die Fraktionen der GrB+ CD3, CD8 und CD16/56-Zellen einen
signifikanten Abfall eine Stunde nach dem Wettkampf und einen Anstieg in der
Erholungsphase. Die GrB+ CD4-Zellen zeigen hier im Unterschied zur Perforinmessung einen
signifikanten Abfall von U2 nach U3, nicht aber von U1 nach U3. Alle anderen Meßreihen
der CD4-Fraktion (U3,U4 und U5) unterscheiden sich statistisch nicht.
33
3.1.5 Absolutwerte Perforin und Granzyme-B positiver Zellen
MNC
U1
U2
U3
U4
U5
(U3/U2)-1
Perforin gesamt
43,6±3,3% 40,1±3,1% 20,5±2,3% 27,6±2,1% 40,4±4,1%
-48,9%
GrB gesamt
35,3±3,0% 33,1±2,7% 14,2±2,1% 21,8±2,3% 28,0±4,1%
-57,1%
Perforin bzw. GrB positive Zellen
in der Lymphozytenpopulation [%]
Tab.3.7: Ausschnitt aus Tab. 3.3 und Tab. 3.5
In diesem Tabellenausschnitt sind zur besseren Übersicht nochmals die Anteile aller Perforin+ bzw. GrB+ Zellen
bezüglich der gesamten Lymphozyten aufgeführt. Die Daten sind als Mittelwerte aus allen Meßansätzen (CD3,
CD4, CD8 und CD16/56) dargestellt. Die Werte in der letzten Spalte der Tabelle wurden mit der Formel
(U3/U2)-1 errechnet und stellen die prozentuale Veränderung der jeweiligen Population von U2 nach U3 dar.
60
50
*
*
*
*
40
Perforin+ Zellen
Granzyme-B+ Zellen
30
20
10
0
U1
U2
U3
U4
U5
Abb. 3.5: Anteil Perforin+ bzw. GrB+ Zellen an der gesamten Lymphozytenpopulation.
In dieser Grafik ist der Verlauf des Anteils aller Perforin bzw. Granzyme-B exprimierenden Zellen an
Lymphozyten innerhalb des Versuchsablaufs dargestellt. Während die Messungen vor der Belastung keine
Veränderung zeigen (U1 und U2), konnte eine Stunde nach Sport (U3) eine deutliche Verminderung des Anteils
dieser Zellen festgestellt werden, die sich in de Erholungsphase zurückbildete. Das Diagramm bezieht sich auf
die Daten der Tabelle 3.7, die Signifikanzmarkierungen gelten für beide Kurven, (n = 11, * = P < 0,05).
Die Grafik zeigt für den Anteil Perforin+ bzw. GrB+ Zellen an der gesamten
Lymphozytenpopulation einen signifikanten Abfall nach der Belastung und während der
20stündigen Ruhephase einen Anstieg fast bis auf Ausgangsniveau bei leichtgradig
unterschiedlicher Kinetik.
34
3.2 Ergebnisse der Triathlon-Gruppe
Die Triathlon-Gruppe bestand aus 31 Hobbysportlern, die an einem Triathlon teilnahmen und
denen zu den Zeitpunkten U1 bis U3 Blut abgenommen wurde. Die mittels Ficollgradient
gewonnenen MNC wurden gleichzeitig mit zwei Oberflächen-AK markiert und mit AK gegen
intrazelluläres
Perforin
inkubiert,
Lymphozytenfraktionen
auch
um
den
neben
Anteil
der
prozentualen
perforinhaltiger
Verteilung
Zellen
der
der
einzelnen
Subpopulationen bestimmen zu können.
3.2.1 Charakterisierung der T-Zellsubpopulationen in MNC
MNC
U1
U2
U3
(U2/U1)-1
CD3
70,6±1,8%
67,2±2,3%
70,6±1,9%
-4,82%
CD8
34,1±1,5%
30,3±1,4%
29,0±1,6%
-11,14%
CD16/56
29,5±1,7%
21,5±2,5%
27,9±1,7%
-27,12%
Tab. 3.9: prozentuale Anteile der Lymphozytenfraktionen in MNC vor und nach Sport
Untersucht wurden 31 Sportler zu den Zeitpunkten eine Stunde vor (U1) und eine (U2) bzw. 20 Stunden (U3)
nach der Belastung, angegeben sind Mittelwerte ± SEM. Die Werte in der letzten Spalte der Tabelle wurden mit
der Formel (U2/U1)-1 errechnet und stellen die prozentuale Veränderung der jeweiligen Population von U1 nach
U2 dar.
Bei allen Populationen wurde nach dem sportlichen Ereignis ein signifikanter Abfall
beobachtet. In der Erholungsphase stiegen die CD3 und CD16/56-Zellen wieder auf
Ausgangsniveau an während bei den CD8-Zellen kein Anstieg zu beobachten war.
3.2.2 Perforin-positive Zellen in Lymphozytensubpopulationen
MNC
U1
U2
U3
(U2/U1)-1
Perforin gesamt
38,9±1,7%
24,8±2,5%
39,2±1,9%
-36,25%
CD3+Perforin+
18,4±1,6%
5,2±0,9%
19,4±1,7%
-71,74%
CD8+Perforin+
24,0±1,4%
11,2±1,3%
18,6±1,4%
-53,33%
CD16/56+Perforin+
28,8±1,6%
20,4±2,5%
27,5±1,7%
-29,17%
Tab. 3.10: prozentuale Verteilung Perforin+ Zellen in MNC vor und nach Sport.
Untersucht wurden 31 Sportler zu drei Zeitpunkten U1 - U3, angegeben sind Mittelwerte ± SEM. Die Werte in
der letzten Spalte stellen wiederum die Veränderung von U1 nach U2 dar.
35
*
Perforin+ Zellen in der
Lymphozytenpopulation [%]
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
*
Perforin gesamt
CD3+ Perforin +
CD8+ Perforin+
CD16/56+ Perforin+
U1
U2
U3
Abb. 3.6: Graphische Darstellung der Perforin+ Subpopulationen in MNC.
Dieses Diagramm zeigt sowohl den Anteil aller Perforin-haltigen Zellen an Lymphozyten als auch die Anteile
der einzelnen Perforin-exprimierenden Subpopulationen in mononukleären Zellen vor und nach dem Triathlon.
Die Messungen fanden eine Stunde vor (U1) und eine Stunde (U2) bzw zwanzig Stunden nach (U3) der
Belastung statt. Es ergab sich eine Verminderung Perforin-positiver Zellen in allen dargestellten Populationen
und eine Erholung innerhalb der 20-stündigen Ruhephase. Das Diagramm bezieht sich auf die Daten der Tabelle
3.10, die Signifikanzmarkierungen gelten für alle 4 dargestellten Kurven, (n = 31, * = P < 0,05).
Die Grafik 3.6 zeigt eine Verminderung Perforin+ Zellen in MNC an der die Subpopulationen
CD3, CD8 und CD16/56 in unterschiedlichem Maße beteiligt sind. Um den Anteil
perforinhaltiger Zellen an den einzelnen Subpopulationen besser beurteilen zu können, wurde
auch hier der Anteil Perforin+ Zellen bezüglich der jeweiligen Population rechnerisch
ermittelt:
MNC
U1
U2
U3
(U2/U1)-1
CD3+P+/CD3
25,5±1,9%
7,6±1,2%
27,1±2,1%
-70,20%
CD8+P+/CD8
70,0±2,1%
35,6±3,1%
63,8±2,6%
-49,14%
CD16/56+P+/CD16/56
97,8±0,4%
93,2±0,8%
98,2±0,3%
-4,70%
Tab. 3.12: Anteil Perforin+ Zellen innerhalb jeder Subpopulation vor und nach Sport.
Untersucht wurden 31 Sportler zu den Zeitpunkten U1 bis U3, angegeben sind Mittelwerte ± SEM. Die Werte in
der letzten Spalte der Tabelle wurden mit der Formel (U2/U1)-1 errechnet und stellen die prozentuale
Veränderung der jeweiligen Population von U1 nach U2 dar.
Perforin+ Zellen innerhalb jeder
Subpopulation [%]
36
*
*
*
*
100
80
CD3+P+ / CD3
60
CD8+P+ / CD8
CD16/56+P+ / CD16/56
40
*
*
20
0
U1
U2
U3
Abb. 3.7: Grafische Darstellung der Perforin+ Zellen innerhalb jeder Subpopulation.
Diese Grafik zeigt den Verlauf der perforinpositiven Zellen innerhalb ihrer eigenen Subpopulation. In allen drei
dargestellten Zell-Populationen zeigt sich ein signifikanter Abfall der perforinpositiven Zellen eine Stunde nach
dem Triathlon. Das Diagramm bezieht sich auf die Daten der Tabelle 3.12, (n = 31, * = P < 0,05).
Die Grafik 3.7 zeigt für alle drei Populationen sowohl einen signifikanten Abfall eine Stunde
nach Sport als auch einen signifikanten Anstieg auf das Ausgangsniveau in der
Erholungsphase.
37
3.2.3 Weitere Differenzierung bestimmter Lymphozytensubpopulationen
In der Triathlon-Gruppe wurde zur weiteren Differenzierung der Lymphozytensubpopulationen mit 2 Oberflächenmarkierungen gleichzeitig gearbeitet um zu ermitteln, wieviel
Prozent der CD16/56-Zellen gleichzeitig auch CD3 bzw. CD8 auf ihrer Oberfläche
exprimieren.
CD8+CD16/56-
CD3+/CD16/56CD3+CD16/56+
CD8+CD16/56+
CD3-/CD16/56+
CD8-CD16/56+
fluoreszenz-negativ
fluoreszenz-negativ
Abb. 3.8: Darstellung der doppelt-positiven Zellen in Form von Dot-Plots.
links ist ein CD3 vs CD16/56, rechts ein CD8 vs CD16/56 Dotplot dargestellt. Die einzelnen Populationen sind
umrandet und entsprechend beschriftet. Die doppelt-positiven Zellpopulationen sind deutlich von den anderen
Gruppen abzugrenzen.
3.2.3.1
Anteil der doppelt-positiven Zellen an Gesamtlymphozyten
MNC
U1
U2
U3
(U2/U1)-1
CD3+/CD16/56+
9,1±1,1%
3,3±0,6%
8,3±1,1%
-63,74%
CD8+/CD16/56+
10,6±1,0%
8,0±1,3%
8,5±0,8%
-24,53%
Tab. 3.13: Anteil doppelt-positiven Zellen an der Gesamtlymphozytenpopulation zu den Zeitpunkten U1
bis U3.
Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM aus 31 unabhängigen Probanden, die an einem Triathlon teilnahmen.
Beschrieben sind 2 Populationen die jeweils einen Anteil von ca. 10% an der MNC-Fraktion ausmachen und
eine unterschiedliche Kinetik nach sportlicher Belastung aufweisen. Die Werte in der letzten Spalte der Tabelle
wurden mit der Formel (U2/U1)-1 errechnet und stellen die prozentuale Veränderung der jeweiligen Population
von U1 nach U2 dar.
38
3.2.3.2
Anteil der doppelt-positiven Zellen an den einzelnen Subpopulationen
MNCs
U1
U2
U3
(U2/U1)-1
CD3+/CD16/56+/CD3
12,6±1,4%
4,8±0,9%
11,3±1,4%
-61,90%
CD3+/CD16/56+/CD16/56
32,1±3,3%
19,2±2,7%
31,4±3,4%
-40,19%
CD8+/CD16/56+/CD8
32,2±2,9%
25,3±3,2%
30,5±2,8%
-21,43%
CD8+/CD16/56+/CD16/56
42,4±2,0%
42,3±2,2%
42,1±2,0%
-0,24%
Tab. 3.14: prozentuale Verteilung der doppelt-positiven Zellen auf die Lymphozytenfraktionen vor und
nach Sport.
Zur besseren Beurteilung wurden die in Tabelle 3.13. beschriebenen Populationen rechnerisch auf die einzelnen
Lymphozytenfraktionen bezogen, angegeben sind Mittelwerte ± SEM (n=31). Die Werte in der letzten Spalte
der Tabelle wurden mit der Formel (U2/U1)-1 errechnet und stellen die prozentuale Veränderung der jeweiligen
Population von U1 nach U2 dar.
Die obigen Tabellen 3.13 und 3.14 zeigen, daß von allen CD3+ Zellen 12,6% gleichzeitig
CD16/56 auf ihrer Oberfläche tragen, bei den CD8+ Zellen sind 32,2% gleichzeitig CD16/56+.
Innerhalb der CD16/56+ Zellen exprimieren 32,1% auch das CD3-Antigen, 42,4% das CD8Antigen. Die Fraktion der zusätzlich CD8+ CD16/56-Zellen verändert sich durch sportliche
Aktivität nur gering im Vergleich zu den anderen Populationen, die eine Stunde nach dem
Wettkampf signifikant abfallen und in der Erholungsphase in Bereiche der Ausgangswerte
zurückkehren.
3.2.3.3
Anteil perforinhaltiger doppelt-positiver Zellen am Gesamtlymphozytenpool
MNC
U1
U2
U3
(U2/U1)-1
CD3+CD16/56+P+
8,7±1,1%
2,7±0,6%
8,0±1,1%
-68,97%
CD8+CD16/56+P+
10,6±1,0%
7,7±1,2%
8,5±0,8%
-27,36%
Tab. 3.15: Anteil perforinhaltiger doppelt-postiver Zellen an der gesamten Lymphozytenpopulation.
Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM aus 31 unabhängigen Sportlern, die an einem Triathlon teilnahmen.
Beschrieben sind 2 Populationen mit einem Anteil von jeweils ca. 10% mit unterschiedlicher Kinetik nach
sportlicher Belastung. Die Werte in der letzten Spalte der Tabelle wurden mit der Formel (U2/U1)-1 errechnet
und stellen die prozentuale Veränderung der jeweiligen Population von U1 nach U2 dar.
Beide Populationen fallen nach der Belastung signifikant ab, in der Erholungsphase steigt die
Perforin+ CD3-Fraktion wieder signifikant an, die CD8-Fraktion hingegen bleibt nahezu
unverändert.
39
3.2.3.4
Anteile perforinhaltiger doppelt-positiver Zellen an den Subpopulationen
CD3+ und CD16/56+ Zellen
U1
U2
U3
(U2/U1)-1
CD3+CD16/56+P+/CD3
12,0±1,4%
3,9±0,9%
11,0±1,4%
-67,5%
CD3+CD16/56+P+/CD16/56
30,8±3,3%
15,3±2,4%
30,4±3,3%
-50,32%
CD3+CD16/56+P+/CD3+CD16/56+
94,5±1,3%
72,2±3,3%
95,8±1,0%
-23,6%
U1
U2
U3
(U2/U1)-1
CD8+CD16/56+P+/CD8
32,0±2,8%
24,4±3,1%
30,4±2,8%
-23,75%
CD8+CD16/56+P+/CD16/56
42,2±2,0%
40,6±2,1%
41,9±2,0%
-3,8%
CD8+CD16/56+P+/CD8+CD16/56+
99,5±0,1%
95,7±0,7%
99,7±0,2%
-3,82%
CD8+ und CD16/56+ Zellen
Tab. 3.16: Anteil der Perforin+ Lymphozyten an den einzelnen Subpopulationen.
In dieser Tabelle sind die perforinhaltigen doppelt-positiver Zellen bezüglich der Lymphozytenfraktionen CD3,
CD8 und CD16/56 zusammengefasst. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM (n=31). Die letzte Spalte beschreibt
die prozentuale Veränderung von U1 auf U2.
Mit Ausnahme der CD8+CD16/56+P+/CD16/56 fallen eine Stunde nach der Belastung in allen
Fraktionen die doppelt-positiver perforinhaltigen Zellen signifikant ab. Die CD3-Zellen
zeigen dabei eine deutlich stärkere Schwankung als die CD8-Zellen. Ca. 12 % der CD3+
Zellen und ca 32 % der CD8+ Zellen sind gleichzeitig auch CD16/56+. Von den CD16/56+
Zellen sind ca 32 % auch CD3+ und ca. 42 % auch CD8+. 95 bis 99% aller doppelt+ Zellen
sind zum Zeitpunkt U1 gleichzeitig auch Perforin+. Bei den CD8+CD16/56+ Zellen bleibt der
Prozentsatz Perforin+ Zellen nach Sport erhalten, bei CD3+CD16/56+ Zellen verringert er sich
auf ca. 72%. Die Daten der beiden Tabellen werden in den folgenden Grafiken noch einmal
dargestellt:
Perforin+ doppeltpositive Zellen
innerhalb jeder Subpopulation [%]
40
*
100
*
80
CD3+CD16/56+P+ / CD3
60
CD3+CD16/56+P+ / CD16/56
40
20
*
*
*
*
CD3+CD16/56+P+ / CD3+CD16/56+
0
U1
U2
U3
Abb. 3.9: Grafische Darstellung der CD3+CD16/56+P+ Zellen auf die jeweiligen Subpopulationen.
Die Grafik stellt den Verlauf der perforinhaltigen doppelt+ CD3-Zellen innerhalb der CD3, CD16/56 und der
CD3 und gleichzeitig CD16/56 positiven Population dar. Das Diagramm bezieht sich auf die Daten des oberen
Teils der Tabelle 3.16, (n = 31, * = P < 0,05).
Perforin+ doppeltpositive Zellen
innerhalb jederSubpopulation[%]
*
*
100
CD8+CD16/56+P+ / CD8
80
CD8+CD16/56+P+ / CD16/56
60
CD8+CD16/56+P+ / CD8+CD16/56+
40
*
*
20
0
U1
U2
U3
Abb. 3.10: grafische Darstellung der CD8+CD16/56+P+ Zellen auf die jeweiligen Subpopulationen.
Die Grafik stellt den Verlauf der perforinhaltigen doppelt+ CD8-Zellen innerhalb der CD8, CD16/56 und der
CD8 und gleichzeitig CD16/56 positiven Population dar Das Diagramm bezieht sich auf die Daten des unteren
Teils der Tabelle 3.16, (n = 31, * = P < 0,05).
Die Diagramme 3.9 und 3.10 zeigen einen signifikanten Abfall aller dargestellten
Populationen eine Stunde nach der Belastung mit Ausnahme der CD8+CD16/56+P+/CD16/56.
Die CD3-Zellen weisen dabei eine höhere Schwankungsbreite auf als die CD8-Population.
41
3.2.4 Sportler versus nicht Sport treibende Personen
Parallel zu den 31 Sportlern der Triathlon-Gruppe wurden zum Zeitpunkt U1 eine nicht
regelmäßig sporttreibende Kontrollgruppe untersucht. Es ergaben sich folgende Resultate:
3.2.4.1
Zusammensetzung der Lymhozytenpopulation
MNC
Kontrolle
Triathlon-Gruppe /U1
Triathlon-Gruppe /U2
CD3
78,6±1,2%
70,6±1,8%
67,2±2,3%
CD8
26,3±1,7%
34,1±1,5%
30,3±1,4%
CD16/56
16,9±1,7%
29,5±1,7%
21,5±2,5%
CD3+CD16/56+
7,7±1,4%
9,1±1,1%
3,3±0,6%
CD8+CD16/56+
3,3±0,5%
10,6±1,0%
8,0±1,3%
Tab. 3.17: Verteilung der T-Zell-Fraktionen bei Sportlern im Vergleich zu einer Kontrollgruppe.
Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM aus Untersuchungen von 10 Kontrollpersonen und 31 Sportlern. U1
repräsentiert die Werte der Sportler vor, U2 die Ergebnisse nach der Belastung.
Anteil an den Lymphozyten [%]
100
*
Kontrolle
Sportler U1
Sportler U2
80
60
*
40
20
0
*
CD3
CD8
CD16/56
CD3+CD16/56+
*
*
CD8+CD16/56+
Abb.3.11: Grafische Darstellung der Lymphozytensubpoulationen bei Sportlern und Kontrollpersonen.
Das obige Diagramm zeigt einen Vergleich der Anteile der einzelnen Subpopulationen an Lymhozyten bei einer
Kontrollgrupe und der Triathlon-Gruppe vor und nach dem Wettkampf. Das Diagramm bezieht sich auf Daten
der Tabelle 3.17, (Sportler n = 31, Kontrolle n = 10, * = P < 0,05).
Auf der Abbildung 3.11 ist zu erkennen, daß Sportler im Vergleich zur Kontrolle signifikant
mehr CD16/56-Zellen und doppelt+ CD8/CD16/56-Zellen haben, sich bezüglich der CD3Populationen aber nur geringfügig von nicht Sport-treibenden Personen unterscheiden.
42
3.2.4.2
Vergleich Perforin-positiver Zellen bei Sportlern und Kontrollpersonen
MNC
Kontrolle
Triathlon-Gruppe /U1
Triathlon-Gruppe /U2
Perforin gesamt
28,7±2,3%
38,9±1,7%
24,8±2,5%
CD3+P+
19,2±2,2%
18,4±1,6%
5,2±0,9%
CD8+P+
11,2±1,1%
24,0±1,4%
11,2±1,3%
CD16/56+P+
16,6±1,7%
28,8±1,6%
20,4±2,5%
CD3+CD16/56+P+
7,5±1,4%
8,7±1,1%
2,7±0,6%
CD8+CD16/56+P+
3,3±0,5%
10,6±1,0%
7,7±1,2%
Tab. 3.18: Verteilung der Perforin-positiven T-Zell-Fraktionen bei Sportlern im Vergleich zu einer
Kontrollgruppe. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM aus Untersuchungen von 10 Kontrollpersonen und 31
Sportlern.
% pe rforin+ Zelle n de r Lymphoz yte n
50
K ontrolle
S portler U1
*
S portler U2
40
*
30
*
20
*
10
0
P erforin
CD3+ P+
CD8+P +
CD16/56+P +
CD3+ CD16/56+ P+ CD8+CD16/56+P +
Abb. 3.12: Grafische Darstellung Perforin+ Zellen in Lymphozyten.
Das obige Diagramm zeigt einen Vergleich der Anteile Perforin+ Zellen an Lymhozyten bei einer Kontrollgrupe
und der Triathlon-Gruppe vor und nach dem Wettkampf. Das Diagramm bezieht sich auf Daten der Tabelle 3.18,
(Sportler n = 31, Kontrolle n = 10, * = P < 0,05).
Die Grafik 3.12 stellt die unterschiedlichen Anteile Perforin+ Zellen in MNC dar. Sportler
haben signifikant mehr Perforin-positive Zellen als nicht sportliche Kontrollen. Hierfür sind
vor allem die perforinhaltigen CD8, CD16/56 und doppelt+ CD8-Fraktionen ausschlaggebend.
Nach dem Sport (U2) fällt der Anteil Perforin+ Zellen in allen Populationen ab.
43
3.2.4.3
Prozentuale Verteilung Perforin+ Zellen auf die jeweiligen Subpopulationen
MNC
Kontrolle
Triathlon-Gruppe /U1 Triathlon-Gruppe /U2
CD3+P+/CD3
24,3±2,6%
25,5±1,9%
7,6±1,2%
CD8+P+/CD8
42,9±3,7%
70,0±2,1%
35,6±3,1%
CD16/56+P+/CD16/56
97,8±0,5%
97,8±0,4%
93,2±0,8%
doppelt+ CD3-Zellen
CD3+CD16/56+P+/CD3
9,6±1,9%
12,0±1,4%
3,9±0,9%
CD3+CD16/56+P+/CD16/56
40,9±4,3%
30,8±3,3%
15,3±2,4%
CD3+CD16/56+P+/CD3+CD16/56+
95,6±1,5%
94,5±1,3%
72,2±3,3%
doppelt+ CD8-Zellen
CD8+CD16/56+P+/CD8
12,9±2,1%
32,0±2,8%
24,4±3,1%
CD8+CD16/56+P+/CD16/56
44,2±6,2%
42,2±2,0%
40,6±2,1%
CD8+CD16/56+P+/CD8+CD16/56+
99,9±0,1%
99,5±0,1%
95,7±0,7%
Tab. 3.19: prozentuale Verteilung Perforin+ Zellen auf die jeweiligen Subpopulationen.
Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM aus Untersuchungen von 10 Kontrollpersonen und 31 Sportlern.
In der Tabelle 3.19 sind die Anteile Perforin+ und doppelt+ perforinexprimierender Zellen an
den verschiedenen Subpopulationen von Sportlern und Kontrollen dargstellt. Vor allem die
Perforin+ CD8-Zellen sind innerhalb der gesamten CD8-Population bei Sportlern erhöht,
während sich der Anteil Perforin+ Zellen in den CD3 und CD16/56-Untergruppen kaum
unterscheidet. Diese Ergebnisse sind in der Abbildung 3.13 noch einmal grafisch dargestellt:
perforin+ Zellen in
Subpopulationen [%]
*
100
80
60
40
Kontrolle
Sportler U1
Sportler U2
*
*
20
0
CD3+P+/CD3
CD8+P+/CD8
CD16/56+P+/CD16/56
Abb. 3.13: Vergleich des Anteils Perforin+ Zellen innerhalb der Subpopulationen bei Sportlern und einer
nicht Sport treibenden Kontrollgruppe. Das Diagramm bezieht sich auf Daten des oberen Teils der Tabelle
3.19, (Sportler n = 31, Kontrolle n = 10, * = P < 0,05).
44
Betrachtet man die perforinexprimierenden doppelt+ Zellen innerhalb der einzelnen
Lymphozytenuntergruppen, so stellt man fest, daß Sportler und Nichtsportler diesbezüglich
nur geringe Unterschiede aufweisen. Innerhalb der CD8-Population allerdings ist der Anteil
doppelt+ perforinexprimierender Zellen bei Sportlern deutlich höher als bei den Kontrollen.
Dies ist in den beiden folgenden Abbildungen 3.14 und 3.15 grafisch dargestellt:
*
perforin + Zellen in
Subpopulationen [%]
Kontrolle
100
Sportler U1
Sportler U2
80
*
60
40
*
20
0
CD3 +CD16/56 +P +/CD3
CD3 +CD16/56 +P +/CD16/56
CD3 +CD16/56 +P +/(CD3+CD16/56)
Abb. 3.14: Vergleich des Anteils perforinhaltiger doppelt+ CD3-Zellen innerhalb der Subpopulationen bei
Sportlern und einer Kontrollgruppe. Das Diagramm bezieht sich auf Daten des mittleren Teils der Tabelle
3.19, (Sportler n = 31, Kontrolle n = 10, * = P < 0,05).
Perforin+ Zellen in
Subpopulationen [%]
Kontrolle
Sportler U1
100
Sportler U2
80
60
*
*
*
40
20
0
CD8+CD16/56+P+/CD8
CD8+CD16/56+P/CD16/56
CD8+CD16/56+P+/(CD8+CD16/56+)
Abb. 3.15: Vergleich des Anteils perforinhaltiger doppelt+ CD8-Zellen innerhalb der Subpopulationen bei
Sportlern und nicht sportlichen Kontrollen. Das Diagramm bezieht sich auf Daten des unteren Teils der
Tabelle 3.19, (Sportler n = 31, Kontrolle n = 10, * = P < 0,05).
45
4 Diskussion
Die Auswirkungen körperlicher Belastung auf das Immunsystem werden seit Jahren
untersucht und kontrovers diskutiert. Die Ergebnisse lassen sich aber aufgrund zu großer
Unterschiede im Studiendesign der einzelnen Arbeitsgruppen nur unter Vorbehalt miteinander
vergleichen. Inwieweit Veränderungen der gemessenen immunologischen Parameter der
verschiedenen
Studien
kausal
mit
tatsächlich
klinisch
in
Erscheinung
tretenden
Veränderungen verknüpft sind läßt sich wegen der Komplexität des Immunsystems einerseits
und der multifaktoriellen Störgrößen andererseits nur bedingt nachvollziehen. So haben
Sportler eventuell andere Lebens- und Ernährungsgewohnheiten und sind möglicherweise
durch häufigeren Aufenthalt im Freien, das Benutzen von öffentlichen sanitären Anlagen und
Kontakt mit größeren Menschenmengen, zum Beispiel bei Sportveranstaltungen, häufiger
pathogenen Erregern ausgesetzt als Nichtsportler.
Schon
1976
beschrieb
Eva
Hedfors
belastungsinduzierte
Veränderungen
von
Lymphozytenpopulationen im peripheren Blut 45. Für Lymphozyten ist das zirkulierende Blut
in erster Linie Transportmedium zum Wirkort, in dem sich die Lymphozyten durchschnittlich
nur ca. 30 Minuten aufhalten
92
. Eine Blutprobe spiegelt die momentane Zusammensetzung
der Zellen zum Abnahmezeitpunkt wieder, die Verteilung der Anteile verschiedener
Subpopulationen (CD3, CD4, CD8 und CD16/56) an den Lymphozyten des peripheren Blutes
unterliegt recht großen Schwankungen. Deshalb können die ermittelten Ergebnisse im
Hinblick auf den aktuellen Immunstatus des Untersuchten nur als Orientierungshilfe
interpretiert werden 160.
4.1 Lymphozytensubpopulationen und sportliche Belastung
In dieser
Arbeit
konnte
gezeigt
werden,
daß
sich
die
Zusammensetzung
der
Lymphozytenpopulationen im peripheren Blut durch die ausgeübte Ausdauerleistung
signifikant verändert. In beiden Untersuchungsgruppen wurde eine Stunde nach der Belastung
ein Abfall der zytotoxischen CD8+ und CD16/56+ Zellen festgestellt, der sich im Verlauf einer
24 stündigen Ruhephase zurückbildete, den Ruhewert aber nicht erreichte. Die nur in der
Lauf-Gruppe gemessenen CD4+ TH-Zellen zeigten gegensätzlich zu den zytotoxischen CD8Zellen einen signifikanten prozentualen Anstieg, der nach 24 Stunden Erholung auf das
Ausgangsniveau zurückfiel. Die CD3-Population zeigte in der Lauf-Gruppe nur geringe
46
Schwankungen, bei der Triathlon-Gruppe wurde aber eine signifikante Verminderung nach
Sport festgestellt. Dieser Unterschied zwischen den beiden Probandengruppen wurde durch
einen ungewöhnlich starken Abfall der CD3-Population von eine Stunde vor (U1) auf eine
Stunde nach (U2) der Belastung bei zwei Sportlern der Triathlon-Gruppe verursacht. Die
statistisch errechnete signifikante Veränderung der CD3-Population in der Triathlon-Gruppe
ist deshalb anzuzweifeln. Auch die zytotoxischen CD8-Zellen wiesen in den beiden Gruppen
eine unterschiedliche Kinetik auf. Während sie in der Lauf-Gruppe nach der Belastung um ca.
30% fielen und sich nach 24 Stunden wieder auf Ausgangsniveau befanden, stellten wir in der
Triathlon-Gruppe nur einen Abfall von 11% fest, der sich innerhalb unserer Beobachtungszeit
nicht regenerierte. Im Gegensatz dazu verhielten sich die NK-Zellen in beiden Gruppen
nahezu gleich.
Mehrere Studien mit unterschiedlichen Sportarten als Belastungsparameter ergaben einen
Anstieg der zytotoxischen T-Zellen (CD8) bzw. NK-Zellen (CD16/56) während und einen
signifikanten Abfall ca. eine Stunde nach der körperlichen Tätigkeit 6;56;76;130;154. Diese
Ergebnisse stimmen weitgehend mit den von uns ermittelten Daten überein. Allerdings zeigte
sich in unserer Studie ein sehr hoher Anteil an NK-Zellen. Wir benutzten als Oberflächen-AK
eine Kombination aus CD16 und CD56 und erhielten so alle Zellen, die CD16- und/oder
CD56-Antigene exprimierten. Dies könnte eine Ursache für die relativ große NK-Population
sein. Differenzen in der Größe der einzelnen Lymphozytenpopulationen zwischen den beiden
Untersuchungsgruppen "Lauf" und "Triathlon" könnten auch, zumindest zum Teil, durch die
methodischen Unterschiede verursacht worden sein. Bei der Triathlon-Gruppe wurden drei
fluoreszenzmarkierte Antikörper benutzt, und die Messungen wurden nach einem anderen
Schema ausgewertet. Außerdem wurden die Sportler mit zwei unterschiedlichen Sportarten
belastet. Die Triathlon-Gruppe absolvierte einen realen Wettkampf während der Lauf der
anderen Gruppe im Rahmen eines kontrollierten Trainings stattfand. Einen Wettkampf
bestreitet man vermutlich mit mehr Motivation und Enthusiasmus und somit auch mit
erhöhter Belastungsbereitschaft und psychischer Anspannung als bei einem Training. Des
weiteren handelte es sich bei den beiden untersuchten Gruppen bezüglich des
Trainingszustands um unterschiedliche Kollektive. Während die Lauf-Gruppe überwiegend
aus sehr gut trainierten Triathleten bestand, nahmen am Triathlon-Wettkampf der zweiten
Gruppe auch weniger trainierte Hobbysportler teil.
Volumenverschiebungen und Veränderungen des Flüssigkeitshaushalts während körperlicher
Tätigkeit wirken sich auf alle Zellen gleichermaßen aus und können deshalb die veränderte
Zusammensetzung
der
Lymphozytensubpopulationen
nicht
erklären.
Aufgrund
der
47
gegensätzlichen Veränderungen der verschiedenen Zell-Typen und dem Ausmaß der
Schwankungen kann man von einer Beteiligung weiterer Faktoren ausgehen.
Mit dem Beginn einer körperlichen Aktivität wird vermehrt Adrenalin ausgeschüttet. Eine
einstündige Adrenalin-Infusion führt zu einer Mobilisierung von NK-Zellen, vom Gewebe in
den Blutkreislauf
7;139
. Körperliche und psychische Belastungen bewirken neben der
Katecholaminausschüttung sowohl einen Anstieg der NK-Zellen als auch einen Anstieg der
im Serum gelösten Adhäsionsmoleküle ICAM-1 (CD54) 16. Diese Effekte lassen sich durch
Beta-Blocker vermindern
16
. Dies läßt vermuten, daß ICAM-1 durch bisher unbekannte
adrenerge Mechanismen von NK-Zellen oder Endothelzellen gelöst wird und so die Zellen in
das zirkulierende Blut geschwemmt werden können. Eine Veränderung der Expression von
Adhäsionsmolekülen auf Lymphozyten oder Endothelzellen wurde nicht nachgewiesen 35;123.
Sofort nach Beendigung der körperlichen Aktivität fallen die Katecholamine durch schnellen
enzymatischen Abbau stark ab. Dies könnte eine überschießende Korrektur der
vorangegangenen Verschiebungen nach sich ziehen. Auch das Oberflächenmolekül CD11a
(LFA-1 = lymphocyte function-associated antigen-1) unterstützt die Adhäsion von
Lymphozyten an endothelialen Oberflächen 15. Bei einem Langzeitmarathon (8 h) wurde
festgestellt, daß CD3+CD8+ T-Zellen, CD3-CD16/56+ NK-Zellen und CD3+CD16/56+ Zellen
mit hoher CD11a Expression nach der Belastung eine signifikant stärkere Verminderung
zeigten als Zellen mit geringer CD11a-Expression wie CD4+ T-Zellen oder CD19+ BZellen 32.
Im Gegensatz zum Adrenalin und Noradrenalinspiegel steigt der Kortisolspiegel nach einer
Belastung noch mehrere Stunden weiter an
34
. Nach einem einstündigen Training auf dem
Fahrradergometer konnten 21 Probanden in Kortisol-Responder und Non-Responder unterteilt
werden. Letztere zeigten einen zügigen Rückgang der Lymphopenie, besonders der CD8Zellen, während bei den Cortisol-Respondern die Lymphozytenzahl noch 2,5 Stunden nach
dem Test unter dem Ausgangswert lag. Bei CD16+ Zellen jedoch wurde in beiden Gruppen
weiterhin eine anhaltende Verminderung nachgewiesen 131. Versuche mit radioaktiv
markierten Lymphozyten bei Kaninchen zeigten nach intravenöser Injektion von Kortison ein
Nachlassen der Strahlung im peripheren Blut, Knochenmark und in der Milz aber eine
Erhöhung der Radioaktivität in anderen lymphatischen Organen 148. Diese beiden Studien
weisen zum einen darauf hin, daß Kortison eine Migration von Lymphozyten aus dem
peripheren Blut in lymphatisches Gewebe unterstützt, zum anderen, daß die unterschiedlichen
Zell-Typen sich in ihrer Sensitivität für diesen Mechanismus unterscheiden.
Durch die körperliche Anstrengung wird das Muskelgewebe besonders beansprucht. Der
48
dadurch entstehende Muskelzellschaden erfordert das Einwandern von Makrophagen zum
Abräumen des nekrotischen Gewebes. Dieser chemotaktische Mechanismus könnte eventuell
auch Lymphozyten beeinflussen. Psychisch belastende Situationen, wie z.B. ein
Fallschirmsprung, führen ebenfalls zur Ausschüttung der Streßhormone Adrenalin und
Kortisol.
Obwohl
dabei
im
Gegensatz
zur
sportlichen
Anstrengung
keinerlei
Muskelzellschaden entsteht, kommt es auch hier zu Verschiebungen innerhalb der
Lymphozytenpopulationen 126. Die durch körperliche Belastung induzierten Veränderungen
der Verhältnisse der einzelnen Zell-Typen zueinander können also eher auf adrenerge und
kortikoide Mechanismen zurückgeführt werden. Im Gegensatz dazu scheinen die durch
Muskelzelldefekte ausgelösten chemotaktischen Einflüsse nur einen geringen oder gar keinen
Effekt auf die quantitativen Anteile der Lymphpozytensubpopulationen zu haben.
Bemerkenswert ist weiterhin, daß die während körperlicher Belastung entstehende
Neutrozytose, im Gegensatz zur Lymphopenie, in der Erholungsphase bestehen bleibt 131;145.
4.2 Perforin in Lymphozyten von Ausdauersportlern
In dieser Arbeit wurde die prozentuale Verteilung von Perforin und GrB exprimierenden
Lymphozyten bzw. NK-Zellen bei Sportlern gemessen. Sowohl in der Lauf-Gruppe als auch
in Triathlon-Gruppe waren ca 40% aller Zellen in der Ruhephase perforinhaltig. Innerhalb der
Subpopulationen waren in der Lauf-Gruppe ca. 30% der CD3, 65% der CD8 und 92% der
NK-Zellen Perforin+, in der Triathlon-Gruppe lagen die Werte für die CD3-Gruppe etwas
niedriger, für die CTL und NK-Zellen etwas höher. Die hohe Schwankungsbreite der
Subpopulationen einerseits und Unterschiede in der Methodik andererseits sind vermutlich für
diese Differenzen verantwortlich.
Eine Studie von Arnold et al untersuchte die Verteilung perforinhaltiger Zellen in
Lymphozytenpopulationen bei Patienten mit intrinsischem oder extrinsischem Asthma. Dabei
zeigten die intrinsischen Asthmatiker gegenüber Normalpersonen einen signifikant erhöhten
Anteil an Perforin+ Zellen. Der in unserer Arbeit nachgewiesene Anteil Perforin+
Lymphozyten bei Sportlern entspricht den Werten bei intrinsischen Asthmatikern 1. Auch die
von uns ermittelte prozentuale Verteilung der perforinhaltigen Zellen auf die einzelnen
Subpopulationen CD3, CD4, CD8, CD16/56 stimmt weitgehend mit den Ergebnissen von
Arnold und Mitarbeitern überein. Interessanterweise fiel der Anteil perforinexprimierender
Lymphozyten innerhalb der Subpopulationen CD3, CD8 und CD16/56 eine Stunde nach dem
Sport signifikant ab, und die daraus resultierende Verteilung entsprach nun den Werten der
Kontrollguppe in Arnold et. al. puplizierten Studie. Innerhalb von 24 Stunden nach der
49
sportlichen Belastung stellte sich wieder die Zusammensetzung der Subpopulationen des
Ausgangswertes ein. Es entsteht der Eindruck, als seien Ausdauersportler in Ruhe bezüglich
perforinhaltiger Lymphozyten in einem ähnlichen immunologischen Status wie intrinsische
Asthmatiker. Diese Patientengruppe ist durch ihre Krankheit erheblichem Streß ausgesetzt,
der in seinen Auswirkungen vergleichbar ist mit den chronischen Belastungen eines
regelmäßig Sport Treibenden.
Physische Aktivität der Ausdauersportler führt kurzzeitig zu einer "Normalisierung" der
Werte auf die Verhältnisse der Kontrollpersonen, langfristig scheint Ausdauersport das
Immunsystem zu aktivieren. Wir vermuten deshalb, daß unterschiedliche chronische
Streßbelastungen gleiche oder ähnliche Veränderungen im Immunsystem verursachen, die
unabhängig vom eigentlichen Auslöser der belastenden Situation sind. Eine Verminderung
der Belastung, sei es durch eine Trainingspause oder durch Linderung der Symptome durch
adäquate Behandlung hingegen bewirkt innerhalb kurzer Zeit einen Rückgang der
Veränderungen.
In der vorliegenden Arbeit wurde eine Stunde nach der körperlichen Belastung bei den
Sportlern der Lauf-Gruppe ein um ca. 52% verminderter Anteil perforinhaltiger Zellen an der
gesamten CD3-Population bestimmt. In der Triathlon-Gruppe sank der Perforin+ Anteil von
25,5 auf 7% was einer Abnahme um 70% entspricht. Der Anteil der CD3-Zellen an der
Gesamtlymphozytenpopulation nahm aber in beiden Gruppen nur unwesentlich ab. Etwas
anders sind die Verhältnisse bei CD8 Zellen. In beiden Sportgruppen wurde eine
Verminderung perforinhaltiger Zellen nach Sport innerhalb der CD8-Population festgestellt,
der Gesamtanteil an CD8-Zellen an den Lymphozyten ist aber auch vermindert. CD4 Zellen
hingegen stiegen im Verhältnis an. Es scheint, als würden von allen Lymphozyten die
perforinhaltigen CD8-Zellen bevorzugt
ins Gewebe abwandern. Die Kinetik der
perforinexprimierenden CD16/56-Zellen der Lauf-Gruppe entspricht in etwa dem Verlauf der
Perforin+ CD8-Zellen, wobei die Verminderung der Perforin+ Zellen innerhalb der NKPopulation mit 17% geringer ausfällt. In der Triathlon-Gruppe vermindert sich der Anteil
Perforin+ Zellen innerhalb der NK-Zellen zwar auch signifikant, aber nur um ca. 5%. In der
Triathlon-Gruppe war die Abnahme der NK-Zellen also eher gleichförmig, sowohl
perforinhaltige als auch nicht perforinexprimierende Zellen wurden prozentual weniger. Eine
vergleichbare Studie wurde kürzlich von Staats und Mitarbeitern veröffentlicht, in der die
Lymphozytenpopulationen von 11 Triathleten vor und nach sportlicher Belastung untersucht
wurden 140. Während die Anteile der Subpopulationen an den Lymphozyten unseren Zahlen
entsprechen, unterscheiden sich die Prozentangaben bezüglich Perforin+ Zellen innerhalb der
50
Subpopulationen erheblich. Dies liegt vermutlich daran, daß die Sportler in der Studie von
Staats et al vor dem eigentlichen Wettkampf eine Woche lang nicht trainieren durften und
innerhalb dieser
Woche sich der
Anteil perforinexprimierender Zellen in allen
Subpopulationen stark verminderte. So wie regelmäßiges Training zu einer Zunahme an
perforinhaltigen Zellen führt, scheint eine Trainingspause innerhalb relativ kurzer Zeit einen
Rückgang auf Normalwerte zu verursachen. Vergleicht man die Werte der Messungen vor der
Trainingspause stimmen die Angaben von Staats et al weitgehend mit den unseren überein. In
unserer Studie entstand eine Trainingspause von 24 Stunden zwischen den Meßpunkten U1
und U2. Es konnte zwar teilweise eine Tendenz zu geringfügig verminderten Anteilen
Perforin+ Zellen festgestellt werden, die Unterschiede waren aber nicht signifikant. Die
Ruhephase war vermutlich zu kurz um erkennbare Veränderungen zu verursachen.
Ausgehend von den durch Trainingsabstinenz verminderten Anteilen perforinexprimierender
Zellen in den jeweiligen Subpopulationen CD3, CD8 und CD16/56 stellten Staats et al. eine
weitere Verminderung dieser Zellen eine Stunde nach dem Triathlon fest. Dabei zeigten die
CD3 und CD8-Zellen die größten prozentualen Veränderungen und bestätigen somit die von
uns ermittelten Daten.
Weitere Studien befassen sich mit der Zytotoxizität von NK-Zellen und CTL, die
entscheidend durch Perforin und GrB mitbestimmt wird 51. So nimmt die Zytotoxizität
während einer sportlichen Tätigkeit zu, in der Erholungsphase dagegen ist sie
vermindert 91;112. Stimulatoren für eine Aktivierung zytotoxischer T-Zellen und NK-Zellen
sind die Zytokine IL-2, IL-6 und IL-12 sowie IFN-γ 23. Dabei beruht die durch IL-2 induzierte
Zytotoxizität der NK-Zellen jedoch nicht auf einem höheren Perforingehalt, sondern ist auf
eine erhöhte Expression von Adhäsionsmolekülen zurückzuführen. Der durch IL-2
verursachte Anstieg des Perforinanteils in MNC hingegen ist auf eine erhöhte
Perforinexpression der CTL zurückzuführen 59. Eine Neutralisation von IL-6 durch AK führt
zu einer Hemmung der Expression von mRNA für Perforin und GrB, dieser Hemmeffekt
kann durch Zugabe von IL-2 wieder aufgehoben werden 37. Die Zytokine IL-1β, IL-6 und
TNFα sind nach regelmäßigem Training erhöht, nicht aber IL-2 5;156, während die Expression
von IFNγ durch Sport herunterreguliert wird 99. Die bei regelmäßigem Training immer
wiederkehrende Stimulation von zytotoxischen Zellen durch IL-6 wäre eine mögliche
Ursache für die erhöhte Expression von Perforin in Ruhe, erklärt aber weder die gesteigerte
Zytotoxizität während der Belastung noch den steilen Abfall des Anteils Perforin+ Zellen nach
körperlicher Tätigkeit.
Es stellt sich die Frage, welche Mechanismen für die Verminderung des Anteils
51
perforinhaltiger Zellen direkt nach körperlicher Belastung verantwortlich sein könnten.
Sowohl eine bevorzugte Abwanderung Perforin+ Zellen aus dem peripheren Blut in das
Gewebe als auch die Exozytose perforinhaltiger Granula in die Umgebung kommen in
Betracht. Eine verminderte Produktion des porenformenden Proteins hingegen erscheint auf
Grund der schnellen Kinetik der Vorgänge eher unwahrscheinlich.
Die Regulierung der Ausschüttung zytotoxischer Granula der NK-Zellen erfolgt unter
anderem durch die Anwesenheit körpereigener MHC-Moleküle 63;88;149. Das Herauslösen von
Zellen aus dem Gewebeverband, also der Verlust von Kontakten zur Nachbarzelle, kann
Apoptose auslösen. Mars und Mitarbeiter stellten eine erhöhte Apoptoserate bei Lymphozyten
nach Sport fest 79. Es wäre denkbar, daß der oben beschriebene, adrenerge Mechanismus der
Mobilisierung von NK-Zellen und CTL aus dem Gewebe in den Blutkreislauf zumindest von
einen Teil der Zellen als Exozytosesignal interpretiert wird. Eine Ausschüttung von
Granulainhalt aktivierter NK-Zellen ins Blutplasma würde sowohl einen verminderten
Perforingehalt als auch die gesteigerte Apoptoserate erklären. Um diese unterschiedlichen
Erklärungsansätze zu prüfen scheint die Untersuchung der Perforinkonzentration im Serum
sowohl vor als auch nach sportlicher Belastung lohnenswert. Hierdurch ließe sich
möglicherweise eine Ausschüttung zytotoxischer Granula nachweisen.
4.3 Granzyme-B in Lymphozyten von Ausdauersportlern
Die Bestimmung des Anteils GrB-haltiger Zellen ergab sowohl bei den gesamten
Lymphozyten als auch in allen Subpopulationen zu allen Messzeitpunkten stets einen etwas
geringeren Anteil verglichen mit den Perforin exprimierenden Zellen. Im Verlauf der
Untersuchungen zeigte sich aber bei beiden Parametern im Prinzip dieselbe Kinetik der
belastungsinduzierten Veränderungen. Geht man davon aus, daß die festgestellte
Verminderung durch eine Abwanderung der Zellen ins Gewebe verursacht wird, wäre eine
parallel verlaufende Kinetik auch zu erwarten. Da die beide Proteine aber in den selben
Granula gespeichert und zusammen ausgeschüttet werden, besteht nach wie vor auch die
Möglichkeit einer Verminderung des Anteils Perforin und GrB exprimierender Zellen durch
Exozytose der zytotoxischen Granula.
Der in unserer Arbeit gemessene Anteil perforinexprimierender Zellen ist größer als der
Anteil GrB+ Zellen, obwohl beide Proteine in den selben Granula gespeichert werden. Hierfür
sind unterschiedliche Erklärungen denkbar. Da sowohl die Transkription der mRNA von
Perforin und GrB keiner gemeinsam koordinierten Regulation unterliegen 71;72, als auch die
dazugehörigen Gene sich in ihren Promotorelementen unterscheiden 69, wäre es möglich, daß
52
manche Zellen nur Perforin oder GrB exprimieren. Ebenso könnte die unterschiedliche
Expression der beiden Proteine zur Folge haben, daß GrB zwar produziert wird, die
Konzentration aber unterhalb der Nachweisgrenze liegt. Dafür würde auch die von Jenne et al
beschriebene Beobachtung sprechen, daß die zytotoxischen Granula immer beide
Apoptoseenzyme enthalten 50. Ein weiterer Grund für die konstant unterschiedlichen Werte
könnten verschieden starke Bindungsqualitäten der verwendeten Antikörper für Perforin und
Granzyme-B sein. Diese würden zu unterschiedlich hohen Nachweisgrenzen der beiden
Proteine führen.
4.4 Klassifizierung von CD16/56+ Zellen und T-Zellen
NK-Zellen werden als CD16/56+ und CD3- Zellen mit zytotoxischem Potential beschrieben.
Bei der genaueren Klassifizierung von NK-Zellen und Lymphozyten stellte sich in unserer
Studie heraus, daß ca. 10% der MNC neben CD16/56 auch CD3 bzw. CD8 exprimierten. Die
von uns beschriebenen Populationen unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Kinetik nach
körperlicher Belastung, CD3+CD16/56+ Zellen fallen stärker ab als CD8+CD16/56+ Zellen.
Beide Populationen waren zu fast 100% Perforin+. Während sich der Anteil perforinhaltiger
Zellen innerhalb der jeweiligen doppeltpositiven Population bei den CD3+/CD16/56+ Zellen
eine Stunde nach Sport um ca. ein Viertel verminderte, blieb er bei den CD8+/16/56+-Zellen
nahezu konstant. Dies läßt vermuten, daß es sich um zwei unabhängige Populationen handelt.
Außerdem legt die Verminderung des Anteils Perforin+ Zellen ausgehend von einer nahezu
100% positiven CD3+/CD16/56+-Population die Vermutung nahe, daß die Granula exozytiert
werden. Würde die Verminderung durch Auswanderung oder Adhäsion verursacht, müßte ein
sehr großer Anteil der CD3+CD16/56+ Zellen daran beteiligt sein. Auch dafür lassen sich
jedoch Hinweise finden, da sich der Anteil der CD3+CD16/56+ Zellen im Hinblick auf die
Gesamtlymphozyten um ca. 70% vermindert. Letztendlich kann in dieser Arbeit nicht
abschließend geklärt werden, welche Mechanismen den festgestellten Veränderungen
zugrunde liegen.
Es stellt sich die Frage, um welche Zellen es sich bei den doppeltpositiven Populationen
handelt. Möglicherweise sind es T-Zellen, die zusätzlich CD16 und/oder CD56 exprimieren,
oder NK-Zellen, die, z.B. durch Aktivierung, T-Zellmarker exprimieren. Dies könnten z.B.
die Zytokin-induzierten Killer-Zellen (CIK) sein. In der Literatur wird dieser Population ein
Anteil von 1-5% an den Blutlymphozyten zugeschrieben 74;78. Unsere Population
(CD3+CD16/56+) war aber in der Größenordnung um 10%. CIK entstehen unter dem Einfluß
verschiedener Zytokine, die teilweise auch durch Sport induziert werden wie z.B. IL-1 und
53
TNF-α. Eine Stimulation durch diese Zytokine könnte eine größere CIK-Population
verursachen. Dagegen spricht jedoch, daß auch bei unsportlichen Personen ähnlich große
CD3+CD16/56+ Populationen gefunden wurden. Die von uns nachgewiesene hohe
Perforinexpression von nahezu 100% unterstützt wiederum die These, daß es sich um CIK
handelt, da diese ein sehr hohes zytotoxisches Potential besitzen.
4.5 Ausdauersport: Benefit oder immunologisches Defizit?
Hinsichtlich der lymphozytären Zusammensetzung des peripheren Blutes lassen sich bei
Sportlern im Vergleich zu Normalpersonen einige signifikante Unterschiede feststellen.
Die in unseren Untersuchungen ermittelten Basiswerte (U1) bei Sportlern für CD3+ Zellen
liegen mit ca. 70% im Normbereich gesunder Personen, während der Quotient von CD4+ zu
CD8+ Zellen auf Grund des höheren Anteils CD8+ CTL im Vergleich zu Nichtsportlern
vermindert ist. Die Fraktion der CD16/56+ NK-Zellen ist mit 30% bei Trainierten deutlich
erhöht. Beide Probandenkollektive haben eine ähnlich große Population CD3+ und
gleichzeitig CD16/56+ Zellen, die Fraktion der CD8+ und gleichzeitig CD16/56+ Zellen ist
hingegen bei Sporttreibenden signifikant größer. Ungefähr 40% der MNC von Sportlern
exprimierten Perforin während der Anteil Perforin+ Lymphozyten im peripheren Blut bei
Normalpersonen nur ca. 25% beträgt 59. Der erhöhte Anteil zytotoxischer Zellen sowie eine
erhöhte Expression der in deren Granula gespeicherten Apoptoseenzyme bei Sportlern weist
auf einen aktivierten Immunstatus von Ausdauersportlern in Ruhe hin. Diesem erhöhten
Immunstatus steht eine vorübergehende Suppression der Abwehrkräfte nach einer Belastung
gegenüber. Das Ausmaß der Immunsuppression ist dabei abhängig von Umfang und Intensität
der Belastung. Nieman und Mitarbeiter sprechen in dem Zusammenhang von einer "J"förmigen Kurve, die die Korrelation zwischen Häufigkeit von Infektionen der oberen
Atemwege und Trainingsumfang ausdrückt 92. Moderate Aktivität ist demnach assoziiert mit
erhöhter Resistenz, wohingegen sowohl Inaktivität als auch Extremsport häufiger zu Infekten
führt 43;92;114. Zur Beurteilung des Infekts wurden allerdings nur subjektive Kriterien der
Sportler herangezogen. Auch wenn sich damit eine tatsächlich stattgefundene Infektion nicht
beweisen läßt, zeigen die Ergebnisse, daß moderat ausgeübter Ausdauersport mit weniger
Krankheitsgefühl in Verbindung zu bringen ist. Sport in Maßen führt zu einer besseren
Gesundheit und damit zu erhöhter Lebensqualität.
Neben dem überwiegenden Benefit durch Veränderungen im Immunsystem sprechen
zahlreiche andere Argumente für regelmäßige Aktivität als Präventivmaßnahme oder
54
therapiebegleitende
essentiellem
Behandlung
Bluthochdruck
zu
bestimmter
Krankheiten.
erkranken 58,
Vermindertes
verbesserte
Risiko,
Insulinsensitivität
an
und
Glukosetoleranz bei Diabetikern 62 und erhöhte Knochenmasse zur Prävention der
Osteoporose 90 seien nur drei der zahlreichen Beispiele hierfür. In besonderen Situationen
hingegen, wie z.B. bei schon bestehenden viralen Infektionen, kann das "offene Fenster" der
Abwehrkräfte nach körperlicher Tätigkeit die Gefahr einer Krankheitsmanifestation an
inneren Organen, insbesondere des Myokards, mit sich bringen 29;124.
55
5 Zusammenfassung
In dieser Studie wurden die Auswirkungen von Ausdauertraining auf submaximalen
Belastungsstufen auf Lymphozyten des peripheren Blutes untersucht. In zahlreichen Studien
konnte nachgewiesen werden, daß die durch Belastung induzierten Veränderungen
immunologischer
Parameter
eng
mit
hormonellen
und
metabolischen
Anpassungsmechanismen verknüpft sind. Körperliche Tätigkeit führt sowohl zu einer
Aktivierung des symphatischen Nervensystems als auch zu einer Mobilisierung von
Leukozyten ins zirkulierende Blut. In der Erholungsphase dominieren erhöhte Kortisolwerte,
die eng mit der in dieser Arbeit beschriebenen Lymphopenie korrelieren. NK-Zellen und
CD8+
CTL
sind
maßgeblich
an
den
Verschiebungen
innerhalb
der
Lymphozytensubpopulationen beteiligt.
Perforin und GrB sind zwei wichtige Proteine in Ablauf zytotoxischer Mechanismen von NKZellen und CTL. Ausdauersportler in Ruhe weisen im Vergleich zu nicht Sport treibenden
Personen einen höheren Anteil an Zellen mit intrazellulären Gehalt dieser Stoffe auf. Dies ist
vor allem auf den erhöhten Anteil Perforin+ CTL zurückzuführen. Des weiteren ist die
Population der nahezu 100% Perforin+ CD8-Zellen mit für NK-Zellen charakteristischen
Oberflächenmerkmalen bei trainierten Personen deutlich erhöht, verändert sich aber durch die
Belastung kaum. Im Gegensatz dazu besitzen Sportler und Nichtsportler einen gleich großen
Anteil Perforin+ CD3+/CD16/56+ Zellen, der sich duch die Belastung stark vermindert. Es
kann vermutet werden, daß regelmäßiges moderates Training zu einem aktivierten Status des
nicht adaptiven Immunsystems führt.
Eine Stunde nach der Belastung wurde eine Verminderung der Anteils Perforin+ und GrB+
Zellen gefunden. Wiederum waren NK-Zellen und CTL die ausschlaggebenden Populationen.
In einer 24 stündigen Erholungsphase bildeten sich alle festgestellten Veränderungen fast
vollständig zurück. Die genauen Mechanismen dieser Vorgänge sind bisher nicht bekannt.
Inwieweit aus der Verminderung der zytotoxischen Zellen und deren Perforingehalt nach
körperlicher Belasung auch eine temporäre Immunsuppression resultiert, läßt sich nur schwer
nachweisen. Bis auf eine erhöhte Inzidenz der Symptome für Infektionen der oberen
Luftwege bei Extrembelastungen konnte keine Verbindung zwischen belastungsinduzierten
Veränderungen und klinischer Symptomatik hergestellt werden. Bei bestehenden Infektionen
hingegen birgt körperliche Beanspruchung die Gefahr der Krankheitsmanifestation an inneren
Organen, insbesondere des Myokards. Im Hinblick auf die vielen positiven Aspekte eines
regelmäßigen
moderaten
Ausdauertrainings
sind
die
kurzzeitigen
immunologische Parameter für Gesunde jedoch klinisch nicht relevant.
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69
7 Danksagung
Herrn PD Dr. med. J. Ch. Virchow jr. danke ich recht herzlich für die Aufnahme in seine
Arbeitsgruppe, die stetige Betreuung und das schnelle Korrekturlesen meiner Arbeit.
Herrn Dr. rer. nat. Werner Luttmann danke ich für die Überlassung des spannenden Themas,
seinem Interesse am Fortgang der Arbeit sowie seinem unermüdlichen Engagement.
Bei Herrn Prof. Dr. A. Berg möchte ich mich für die Zweitbegutachtung meiner Arbeit
bedanken.
Den Mitarbeitern des Sportinstituts möchte ich für den reibungslosen Ablauf der
Blutabnahmen und die gute Zusammenarbeit danken.
Bei den sportlichen Probanden und den "Unsportlichen" aus Klinik und Labor entschuldige
ich mich für die zahlreichen unangenehmen Blutabnahmen und sage nochmals vielen Dank.
Frau Sieglinde Bock danke ich für die ausführliche Einführung in die Labortätigkeit und für
die vielen interessanten Gespräche weit über den Laborhorizont hinaus.
Ganz herzlich möchte ich mich auch bei Herrn Dr. Richard Staats bedanken, der durch
kritisches Korrekturlesen, selbstlose Mitarbeit und regelmäßig notwendige, moralische
Unterstützung sehr zum Erfolg dieser Arbeit beigetragen hat.
Für die große Hilfe bei den umfangreichen Versuchen und die stets gute Zusammenarbeit
bedanke ich mich recht herzlich bei allen Mitarbeitern des Labors, insbesondere bei Britta
Bade, Madelon Hoßfeld und Daniela Purlis, Christian Stratz und Steffen Abd-el-Ghani sowie
Alex und Steffen, mit all denen ich auch außerhalb des Labors jede Menge Spaß hatte.
Mein besonderer Dank gilt meinem Freund und Wohnheim-Nachbarn Marco Idzko fürs
ausführliche Korrekturlesen und die kompetente Beratung sowie für die konsequente
psychologische Betreuung.
Mein allergrößtes Dankeschön schenke ich meiner lieben Naschi,
die für mich stets die Sonne aufgehen läßt.
70
8 Puplikationen
R Staats, S. Sorichter, D. Uhl, D. Grathwohl, H. Northoff, W. Luttmann, A. Berg, J.C.
Virchow. Influence of exhaustive exercise on the perforin and granzyme-B-expression in
peripheral blood lymhocyte subpopulations.
71
9 Lebenslauf
Dieter Uhl
geboren am 11. Februar 1970 in Haslach im Kinzigtal
1976 - 1980
Grundschule Hofstetten
1980 - 1989
Gymnasium Hausach
Mai 1989
Abitur
1989 - 1990
Zivildienst beim DRK/Kreisverband Wolfach
1990 - 1995
Rettungsassistent beim DRK/KV Wolfach
seit Oktober 1995
Studium der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg
September 1997
Ärztliche Vorprüfung
März 1998
Famulatur im KKH Emmendingen, Chirurgie
September 1998
1. Staatsexamen
Seit Oktober 1998
Beginn der experimentellen Promotionsarbeit im Labor von PD
Dr. J. Ch. Virchow jr. der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
September 1999
Famulatur im Dora-Nginza-Hospital, Port Elizabeth, Südafrika,
Geburtshilfe und Pädiatrie
August 2000
Famulatur im Loretto-Krankenhaus Freiburg, Anästhesie
April 2001
2. Staatsexamen
Mai 2001 – April 2002
Praktisches Jahr, Kreiskrankenhaus Donaueschingen,
Lehrkrankenhaus der Uni Freiburg, Wahlfach Anästhesie
Mai 2002
3. Staatsexamen
Seit Juni 2002
Arzt im Praktikum, Uni Mannheim, Anästhesie