05.11.2013! 1! Humangenetische Grundlagen der
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05.11.2013! Humangenetische Grundlagen der Pathophysiologie! • Grundlagen: vom Gen zur Krankheit! • Molekulargenetische Methoden in der Diagnostik! • Therapeutische rekombinante Proteine! Genom des Menschen! Nukleäres Genom:! 3,1 x 109 = 3,1 Gb (31000 Mb)! Ca 26.000 Gene! Nicht Proteinkodierende DNA >> kodierende DNA: 1.1% ! repetitive Sequenzen (420 Mb)" singuläre Sequenzen (ca 1700 Mb)" HuGO: seit 2004 ist menschliches Genom sequenziert. " Mitochondriales Genom:! 16,6 kb, zirkulär (Doppelstrang),! ca. 10/Mitochondrium, ca 1000-10.000/Zelle! 37 Gene, 13 Gene für Enzyme der Atmungskette! (ergänzt durch 60 kernkodierte Gene)" 24 mitoch. t-RNAs! Verbung: maternal (Mitochondrien der Oozyte)" 1! 05.11.2013! ca. 26.000! Transkription Translation Genstruktur und Transkription! Grundstruktur eines eukaryontischen Gens! ATG" Stop" Protein-kodierender Bereich! Herausschneiden (Spleißen) der Introns und ! Zusammenfügen der Exons führt zu einem reifen Transkript:! 2! 05.11.2013! Definition: Genetische Erkrankung! Eine Erkrankung ist genetisch bedingt, wenn sie gänzlich! oder überwiegend durch eine bestimmte Störung im genetischen! Programm aller oder bestimmter Zellen verursacht wird. ! Monogene Erkrankung:! Phänotyp! • Genotyp: heterozygot! erkrankt! dominante Mutation! • Genotyp: homozygot! erkrankt! rezessive Mutation! Vererbung von Merkmalen ! Anaylse des Auftretens von Erkrankungen in Stammbäumen 3 Haupttypen von mendelschen Erbgängen • autosomal dominant • autosomal rezessiv • X-Chromosomal gekoppelt, rezessisv. 3! 05.11.2013! Vererbung von Merkmalen (nach Mendel) I! Genetische Erkrankungen (monogenetisch)! mit autosomal dominantem Erbgang! • Jedes erkrankte Individuum hat einen erkrankten Elternteil " (falls es sich nicht um eine neue Mutation handelt)." • Ein erkranktes Individuum hat durchschnittlich 50% erkrankte Nachkommen" (Problem: bei kleiner Kinderzahl, oft nicht zu erkennen)" • Vertikale Transmission an die nächste Generation, über mehrere Generationen" • Gesunde Kinder eines erkrankten Elternteils haben" selbst keine erkrankten Kinder." • Männliche und weibliche Individuen sind gleich häufig betroffen" Vererbung von Merkmalen (nach Mendel) II! Genetische Erkrankungen (monogenetisch)! mit autosomal rezessivem Erbgang! • Beide Eltern sind gesund, nur Geschwister sind betroffen" • Im Durchschnitt sind 25% der Kinder erkrankt, 75% gesund" • Keine vertikale Transmission (Kinder nicht betroffen)" • Männliche und weibliche Individuen sind gleich häufig betroffen" 4! 05.11.2013! Vererbung von Merkmalen (nach Mendel) III! Genetische Erkrankungen (monogenetisch)! mit X-chromosomal rezessivem Erbgang! • Erkrankung tritt nur bei Männern auf (bei Frauen XX Kompensation)." • Söhne einer heterozygoten Mutter (Carrier, Xx) haben ein " 50% Erkrankungsrisiko." • keine Transmission von Vater auf den Sohn" • alle Töchter eines erkrankten Vaters sind Carrier." • gesunde Söhne einer heterozygoten Mutter können die " Erkrankung nicht weitergeben" Kategorien genetischer Erkrankungen und! ihre medizinische Bedeutung! • monogen (weitgehend den Mendelschen Erbgängen folgend)! • multigen/mutifaktoriell (z. B. Augenfarbe, Haarfarbe, Intelligenz)! • chromosomal (Chromosomen-Anomalie)! • mitochondrial! • Erkrankung aufgrund nichterblicher somatischer Mutationen! (aus Siegenthaler, Lehrbuch klinische Pathophysiologie)" 5! 05.11.2013! Bedeutung der Analyse genetischer Faktoren:! Krankheiten werden vorhersehbar! präventive oder therapeutische Maßnahmen. ! Problem: belastendes Wissen, wenn keine Therapie vorhanden. ! Falls erbliche Formen einer Erkrankung neben sporadischen existieren" Aufklärung der Pathogenesemechanismen durch Identifizierung ! der mutierten Gene bei erblichen Formen der Erkrankung! (bei Alzheimer: Mutationen in APP, PS; bei Krebs: z.B. Retinoblastom, p53 etc)." Entwicklung neuer Medikamente und Therapien! 6! 05.11.2013! Arten von Mutationen! Klassifikation auf Grund molekularer, ! struktureller Veränderungen! Klassifikation nach funktioneller, klinischer Auswirkung! (Genotyp/Phänotyp Beziehungen)! Klassifikation auf Grund struktureller Veränderungen I! normaler Karyotyp: 2 x 23 = 46 Autosomen, XX oder 46,XY! Chromsomenanomalien:! numerische z.B.:! • Monosomien ! • Trisomien! Beispiele! XO! Trisomie 21! XXY! Turner Syndrom! Down Syndrom! Klinefelter Syndrom! Fehlverteilung der Chromosomen in der meiotischen Teilung während Oogenese oder Spermatogenese (Nondisjunction) strukturelle z.B.:! • Translokationen! t (9, 22) ! Philadelphia-! Chromosom! chronische ! myeloische Leukämie! • große Deletionen! • große Insertionen! • Inversion! • Ringchromosom! 7! 05.11.2013! Klassifikation auf Grund struktureller Veränderungen I! normaler Karyotyp: (2 x 23 ) 46, XX oder 46, XY! Chromsomenanomalien:! Beispiele! numerische z.B.:! • Monosomien ! • Trisomien! XO! Trisomie 21! XXY! Turner Syndrom! Down Syndrom! Klinefelter Syndrom! Fehlverteilung der Chromosomen in der meiotischen Teilung während Oogenese oder Spermatogenese (Nondisjunction) strukturelle z.B.:! t (9, 22) ! Philadelphia-! Chromosom! • Translokationen! (balanziert, nichtbalanziert)! chronische ! myeloische Leukämie! (Bcr/Abl Fusionsprotein,! konst. aktive Tyrosinkinase)! • große Deletionen! • große Insertionen! • Inversion! • Ringchromosom! UM 23! Chromsomenanomalien:! Analyse mittels cytogenetischer Verfahren! Klassische Cytogenetik:! Bandenmuster von Metaphasechromosomen werden mit! Farbstoffen dargestellt (z.B. Giemsa, Quinacrin)! Banden Chromatinregionen unterschiedlicher Packungsdichte! Floureszenz in situ Hybridisierung FISH :! Lokalisation einzelner Gene! Gen-spezifische Sonden! mehrere, chromosomen- ! spezifische Sonden! Giemsa! „chromosome painting“! (nicht-balanzierte Translokation" von Chrom. 8 auf 4, jetzt gut erkennbar)" 8! 05.11.2013! Klassifikation von Punktmutationen I! Klassfikation nach funktioneller Auswirkung:! • nichtpathogene SNPs (single nucleotide polymorphism)" • pathogene Punktmutationen! Einzelbasensubstitution in kodierenden Bereichen! • synonyme („stille“) Mutation: Nukleotidaustausch ohne Aminosäureaustausch! • Missense Mutation: Nukleotidaustausch führt zu Aminosäureaustausch! • konservativ (gleicher Charakter der AS: AlaninIsoleucin)" • nicht konservative (basisch sauer)" • Nonsense Mutation: Nukleotidaustausch führt zu Stop-Codon! • a) Translation stoppt, verkürztes Polypeptid" • b) nonsense mediated decay, Abbau von mRNAs mit prämaturen Stop Codons" NMC Nonsense mediated decay: ! Qualitätskontrolle für Transkripte mit stop codon in internen Exons ! Quelle: Strachan, 4th edition 2011 " 9! 05.11.2013! Warum führt nicht jede Mutation in kodierendem Bereich zu AS-Austausch? ! Aminosäurecodons und ihre Häufigkeit! „wobble“ Position! Klassifikation von Punktmutationen II! Einzelbaseninsertion oder -deletion in kodierenden Bereichen! • Verschiebung des Leserahmens (= Rasterschub, „frame shift“)! andere Aminosäure-Sequenz, häufig auch stop-codons" Auch Mutationen in nicht kodierenden,! regulatorischen Regionen (z. B. Promotor, Splicesites) können pathogen sein!! • gestörteTranskriptionsrate (Proteinmenge )! • veränderte mRNA Stabilität,! • abberantes Spleißen etc.! 10! 05.11.2013! Dynamische Mutationen I! Erkrankungen assoziiert mit Expansion von Trinucleotid Repeats! (VNTR: variable number of tandem repeats)! innerhalb eines Gens: z. B. Chorea Huntington (erblicher Veitstanz, neurodeg.)! (CAG)n Polyglutamin repeats! Proteine aggregieren! in nicht-codierenden Regionen: z. B fragiles X-Syndrom , ! • genetische Instabilität des X-Chromosoms! ! ! ! geistige Retardierung! (C-Methylierung! Promotorinaktivierung! Transkription)! • erst ab bestimmter Repeatlänge pathogen! • Schweregrad der Erkrankung korreliert mit Repeatlänge! • Repeatlänge kann von Generation zu Generation zunehmen! Dynamische Mutationen I! Erkrankungen assoziiert mit Expansion von Trinucleotid Repeats! (VNTR: variable number of tandem repeats)" innerhalb eines Gens: Polyglutaminexpansion.! Prototyp: Chorea Huntington (erblicher Veitstanz, neurodeg.)! (CAG)n Polyglutamin repeats! Proteine aggregieren! • erst ab bestimmter Repeatlänge pathogen! • Schweregrad der Erkrankung korreliert mit Repeatlänge, je länger desto schlimmer ! • Antizipation: Repeatlänge kann von Generation zu Generation" zunehmen, erstes Auftreten der Erkrankung (age of onset) somit immer früher " 11! 05.11.2013! Dynamische Mutationen I! Erkrankungen assoziiert mit Expansion von Trinucleotid Repeats! (VNTR: variable number of tandem repeats)" in nicht-codierenden Regionen: z. B fragiles X-Syndrom, CGG repeat im 5-UTR von FMR1! • ! !genetische Instabilität des X-Chromosoms" ! ! ! ! geistige Retardierung, Autismus! C-Methylierung des Promotors,! Transkription,! zu geringe FMR-1 Menge ist pathogen" FMR-1 = fragile X mental retardation protein" Funktion: mRNA bindendes Protein,! Reguliert subzelluläre Lokalisation und Translation verschiedner mRNAs" Besonders wichtig in Neuronen:" Lokale Translation von mRNAs an Synpasen! Lokale Biosynthese von Proteinen, die für Lernen und Gedächtnis benötigt werden! ,! 12! 05.11.2013! Klassifikation von Mutationen nach funktioneller Auswirkung! A: „loss of function“:! Funktionsverlust oder reduzierte Funktion eines Proteins! B: „gain of function“! neue, abnorme Funktion eines Genprodukts! Klassifikation von Mutationen nach funktioneller Auswirkung! zu A: „loss of function“:! 1) vollst. Funktionsverlust: beide Genkopien (Allele) dysfunktionell! z.B. Funktionsverlust beider Genkopien eines Tumorsupressorgens! (z. B. bei APC, Rb, p53 führt zu frühem Krebs).! 2) Haploinsuffizienz: nur ein intaktes Allel! nur 50% der normalen Proteinmenge! diese geringe Expression ist funktionell nicht ausreichend.! Beispiel: Waardenburg Syndrom I, Pax3 (splotch mouse)! Entwicklungsstörung mit Hörverlust und Pigmentierungsstörugen: z.B. 2 verschiedenfarbige Augen (blau und grün), einzelne weisse Haarsträhnen, vorzeitiges generelles Ergrauen. (Molekulare Ursache: Mangel an Transkriptionsfaktor Pax3, kontrolliert während der Embryonalentw. Pigmentierung und Hörentwicklung) 13! 05.11.2013! zu A: „loss of function“:! 3) dominant negatives (= transdominantes) Allel! mutiertes Genprodukt interferiert mit Funktion des normalen Allels! in heterozygotem Individuum.! Transdominante Mutationen können bei Oligomeren oder ! Multiproteinkomplexen auftreten:! • z. B. dimere oder multimere Transkriptionsfaktoren: ! basic-HLH-Zip Familie! bilden Dimere, insbesondere Heterodimere" Fehlt an nur einem der Monomere die basische Helix" inaktiviert dies die gesamte DNA-Bindedomäne" funktionell inaktiver Transkriptionsfaktor" • Ionenkanäle und Rezeptoren aus mehreren Untereinheiten (e.g. Connexin 26)! • Mutationen im Typ I Kollagen Osteogenesis imperfecta (OI)! Mutationen im Typ I Kollagen Osteogenesis imperfecta OI! 25% des Gesamtproteins sind Kollagen, wichtigstes Protein des Bindegewebes." Typ I Kollagen: rechtsgängige Triple Helix aus α-Ketten:! 2 x COL1A1 , 1 xCOL1A2! Gly-X-Y)n Repeats bilden linksgängige α-Kette (dies ist keine α Helix!!!)! G! G! G! • reich an Prolin und und Hydroxyprolin" • Gly an jeder dritten Position (Innenseite der Triplehelix)" 14! 05.11.2013! Mutationen im Typ I Kollagen Osteogenesis imperfecta OI! Osteogenesis imperfecta OI: „brittle bone disease“, Brüchigkeit der Knochen! Typ I Kollagen: Triple Helix aus α-Ketten:! 2 x COL1A1 , 1 x COL1A2! Nullmutation (kein COL1A1Protein) transdominant! Mutationen im Typ I Kollagen Osteogenesis imperfecta OI! Typ I Kollagen: Triple Helix aus α-Ketten:! 2 x COL1A1 , 1 xCOL1A2! WT! Dominant negativ! = transdominant! Schwere OI! MIlde Form der OI! Haploinsuffizienz! transdominant! 15! 05.11.2013! „loss of function“ kann diverse molekulare Ursachen haben! Strachan and Read! Textbook: Human Molecular Genetics! Klassifikation von Mutationen nach funktioneller Auswirkung! zu B: „gain of function“! • in Erbkrankheiten relativ selten: Trisomie 21, " • erbliche Formen der Alzheimererkrankung: " Mutationen im APP-, oder Presenilin PS1, PS2 Gen" • sehr häufig bei Krebs (somatische Mutationen)! • Überexpression (rein quantitativer Effekt, wildtyp-Protein überexprimiert) ! Proliferationsfaktoren bei Krebs (e.g. Myc), " Alzheimerpathologie (3 Genkopien APP!) und geistige Behinderung bei Trisomie 21 ! • chimäre Proteine (bei Translokationen, z. B. Philadelphia Chrom.:" Bcr/Abl Fusionsprotein, konst. aktive Tyrosinkinase)" • konstitutiv aktive Proteine: e. g. oncogene Ras-Mutationen! • Proteine die Aggregate bilden können:! Prionprotein bei erblicher Creutzfeld Jakob Krankheit," Huntington Disease (Huntingtonin Aggregate, Polyglutamin-Aggregate)" Alzheimer: β Amyloid Aggregation bei erhöhter β Amyloid-Menge oder " veränderter βAmyloid-Sequenz. (qualitative und quantitative Effekte)" 16! 05.11.2013! Hämoglobin! • α,β-Globine: am besten untersuchte Gene, über 500 Mutationen (so gut wie alle Arten)" • weltweit häufigste genetische Erkrankung: Hämoglobinopathien! • prosthetische Gruppe: Häm! (mit Porphyrinring)! Proteinanteil: Heterotetramer! 2 α-Globinketten, ! 2 β-Globinketten ! 1 prosthetische Gruppe pro α und β Kette! Hämoglobinopathien I! Drei Hauptgruppen:! Thalassemien: quantitative Störung der Globinketten (α, β) Produktion:! αο, βο : keinerlei Genprodukt; α+, β+ : reduzierte Proteinmenge (e.g. Mutationen im Promotor)! • Ungleichgewicht in der Menge von α und β Ketten:! gestörte Stöchiometrie der Bildung des Hämoglobintetramers! Abnorme Hämoglobine (mit Aminosäureaustausch)" Qualitativ, funktionelle Störung: z. B HbS Sichelzellanämie, HbM Methämoglobin" Persistenz fetaler Hämoglobine im adulten Organismus" Quelle: Löffler, Petrides" 17! 05.11.2013! Hämoglobinopathien II! β-Globingencluster! 1 adulte funktionelle β-Kette. δ-Gen: nur 2% der funkt. Aktivität 2 fetale γ-Gene, 1 embryonales ε-Gen. 1 Pseudogen (exprimiert kein Protein) β-Globingen! α-Globingencluster! 2 adulte α-Gene: α1, α2 1 embryonale Variante ξ (zeta) 2 Pseudogene α1-Globingen! Adultes HbA: 2 α-Ketten und 2 β-Ketten Abb. 11.22 Löffler, Petrides (7. Auflage)" Thalassemien! • autosomal dominant vererbt,! • Mittelmeergebiete besonders häufig" betroffen" • Verlust oder reduzierte Menge an! α-Ketten oder β-Kette ! • null-Mutation: αο, βο " • reduzierte Menge: α+, β+ " • nicht nur kodierende Regionen können" mutiert sein, sonder auch regulatorische" Bereiche!!" • Klinik: schwere Anämien,! reaktiver, massiver Induktion der" Erythropoese, vergrößerte Milz.! Quelle: Löffler, Petrides" (7. Auflage)" 18! 05.11.2013! Abnorme Hämoglobine:! normale Menge an Hämoglobin, aber veränderte physikochemische Eigenschaften" z. B. Sichezellanämie HbS: nur bei Homozygotie klinisch auffällig, " Heterozygote normal Malariaresistenz, daher häufig in Afrika, " Sichelzelle! Glutamat! Punktmutation in Codon 6! Valin! Abb. 11.20/23 Löffler, Petrides" (7. Auflage)" HbS hydrophober AS Austausch in der β-Kette: Glutamat zu Valin " HbS aggregiert nur in nicht-oxygenierter Form, bei niedrigem pO2 und saurem ph" Sichelzellen im peripheren Sauerstoff-armen Blutgefäßsystem." A) Sichelzellen werden in der Milz schneller abgebaut, führt zu Anämie.! B) veränderte Fließeigenschaften des Blutes,! durch Adhäsion der Sichelzell-Erythrozyten an Gefäßwand! schmerzhafter Gefäßverschluss, Durchblutungsstörungen, Infarktneigung, red. Lebenserw." aber: Heterozygotie ist ass. mit Malariaresistenz, daher sehr häufig in Endemiegebieten!" Sichelzellen werden in der Milz schneller abgebaut, daher Elimination des Erregers" Hydrophobe WW" 19! 05.11.2013! Molekulargenetische Methoden in der Diagnostik Restriktion von DNA! Typ II Restriktionsenzyme:! bakterielle Endonucleasen, die Phosphodiesterbindungen der DNA" an spezifischen, palindromen Erkennungssequenzen (4-8 bp lang) spalten." • erzeugt 5´oder 3´überhängende Enden (e.g. BamHI, SacI) oder" • stumpfe (blunt) Enden (e. g. SmaI)" Anwendung:! SmaI" • Erstellen von Restriktionskarten: Position der Restriktionsstellen entlang eines DNA-Abschnitts" • Rekombinante DNA-Techniken: Verknüpfung von DNA-Fragmenten mit komplementären Enden Klonieren" 20! 05.11.2013! Southernblot Analyse! Fluoreszenzfarbstoff! UV-Licht:" Leuchtende Banden" Detektion: X-ray Film! Hybridisierung:! Sonde bindet mit! hoher Spezifität an ! komplementäre ! Sequenz! DNA-Sonde: z.B 32P markiert! RFLP Analyse! Restriktionsfragmentlängen Polymorphismus! Ziel: z. B. Detektion von Mutationen, die mit Erbkrankheiten einhergehen" Sichelzell-Anämie! Punktmuation im β-Globingen:! im mutierten β HbS Allel fehlt eine MstII-Stelle! 21! 05.11.2013! Anwendung von Restriktionsenzymen:! Klonieren in Bakterien, Rekombinante Techniken! Vorgehensweise! Typischer ! Plasmid-Vektor pUC18! Enzyme:! Ligasen! DNA-Insert! Resistenzgen:! Ampicillin-R.! Insertionsmarker:! LacΖ; β-Galactosidase-Gen! intakt: blaue Kolonien auf XGal ! zerstört: weisse Kolonien! ori: Replikations-! Ursprung! Northernblot Analyse! Gesamt RNA enthält mRNAs! verschiedener Göße! 2. Hybridisierung mit ! genspezifischer Sonde! Ribosomale rRNA! mRNAs nur als ! Hintergrundsschmier sichtbar!! (da einzelne mRNAs nicht abundant " genug um diskrete Banden zu" erzeugen)" 1. Transfer auf Filter! Informationsgewinn:! • qualitativ: mRNA Größe ! • quantitativ: Bandenintensität proportional Transkriptmenge! (Expressionsniveau eines Gens)! 22! 05.11.2013! PCR: polymerase chain reaction! Amplifikation spezifischer DNA-Abschnitte! Zyklus 1:! Denaturierung! 95˚C! Primer Binden! („Anneaing“)! 55˚C! Elongation! 72˚C! Zyklus 2:! • Amplifikation verläuft exponentiell 2n! • nach 25 Cyclen ca 106 fache Amplifikation! extrem sensitiv !!! mRNA als PCR Template: Prinzip der RT-PCR ! Reverse Transkriptase gekoppelte PCR" • RT-PCR: Amplifikation von cDNA-Fragmenten! • RT -Reaktion: Rev. Transkriptase schreibt mRNA! in eine complentäre DNA-Kopie um (= cDNA)! • quantitative RT-PCR:! Quantifizierung spezifischer mRNAs! (Quantitative Analyse der Genexpression, ! z. B. eines Tumormarkers)! • hochsensitive Alternative zum Northernblot! wenn nur geringe Gewebemengen verfügbar! (e.g. Tumorbiopsie)! • schnell (1-3h), moderne Standardmethode! 23! 05.11.2013! PCR Anwendungsbeispiele in der Diagnostik! • Identifikation und Quantifizierung von infektiösen Organismen" z.B. HIV- Test, Virustiterbestimmung während Therapie" • Gynäkologie: Test auf HPV-Risikovarianten im Portio-Abstrich" • Test von Blutkonserven auf HIV, Hepatitis B und C Virus" • Detektion von Mutationen (Erbkrankheiten, Tumorklassifizierung): " Allel-spezifische Primer (binden an wt Sequenz nicht, da nicht vollst. komplementär)" • Pränatale Diagnostik PID" • Vaterschaftstests (Amplifikation von Mikrosateliten DNA)" 9-11 Small tandem repeats: (2-7 bp)x-fach werden per Multiplex-PCR analysiert" • Forensik (Amplifikation von Mikrosateliten DNA) "" Analyse differentiell exprimierter Gene über Micro-Arrays! Array: distinkte cDNAs oder Oligonukleotide (z.B. 30.000) werden auf Glas oder Membran" "rasterartig (arrayed) immobilisiert (Gen-Chip)" Sonde: komplexe Mischung an mRNAs (RT-Reaktion: komplexe cDNAs), markiert" Vorteil: Analyse der Expression tausender Gene gleichzeitig Transcriptomics!! Anwendung: z. B. Klassifikation von Tumoren Aussagen zu Prognose, optimierte Therapien! Variante: Array mit immobilisierten Oligonukleotiden, jeweils spezifisch für bestimmte Mutationen! Hochdurchsatzverfahren für Diagnostik von Gendefekten! 24! 05.11.2013! Westernblot Analyse! Proteinproben:! z.B. rekombinante Virusproteine! 1. Transfer auf Filter (i. a. Elektroblot)! 2. Inkubation mit spez. Antikörper! 3. Detektion mit Sekundärantikörper! z. B. HRP, AP" Enzym! Y! Y! Substrat! farbiges Produkt" oder Chemoluminiszenzsignal" (Detektion: X-ray film) " Y! Y! HRP: horse radish peroxidase" AP: alkalische Phosphatase" Primärantikörper erkennt Protein" Sekundärantikörper erkennt Fc des Primärantikörpers" e.g. rabbit anti-mouse antibody" Westernblot Analyse! Informationsgehalt:! qualitativ: wird ein bestimmtes Protein gemacht? " Hat die detektierte Bande die erwartete Größe?" quantitativ: wieviel wird von einem Protein gemacht?" (Expressionsstärke auf Proteinniveau)" Umgekehrt: Enthält ein Serum einen Antikörper der ein bestimmtes Antigen! auf dem Blot erkennt?...! Ist ein Patient seropositiv für einen bestimmten Virus/Bakterielle Infektion?" 25! 05.11.2013! ELISA und Sandwich-ELISA! enzyme linked immuno sorbent assay! ELISA: Nachweis von Antikörpern (z. B. gegen HIV)! Vorteil: ! • automatisierbar! • Hochdurchsatzverfahren! 1: Mikrotiterplatte mit Antigen beschichtet (z. B. rekombinantes Virushüllprotein)! 2: Antikörper aus Patientenserum bindet! 3: Enyzm-gekoppelter Sekundärantikörper (blauer Stern) gegen Fc-Region des 1.Ak! 4: Farbreaktion und Nachweis! Sandwich-ELISA: Nachweis von löslichen Antigenen! ( z. B. Cytokine, IL 2)! 1: Mikrotiterplatte mit Antikörper beschichtet (Überschuss!)! 2: zu titrierendes Antigen bindet! 3: Enyzm-gekoppelter Antikörper gegen weiteres Epitop des Antigens ! 4: Nachweisreaktion! 26! 05.11.2013! Molekulare Diagnostik ! von Erbkrankheiten! „Klassische“ Diagnostik von Erbkrankheiten! • Test der Enzymaktivität ! • Messung von Stoffwechselmetaboliten ! z. B. Phenylketonurie (1 in 10.000 Geburten), führt zu schwerer geistiger Behinderung! Ursache: Defekt der Tyrosinbiosynthese, bedingt durch" fehlende, bzw. reduzierte Aktivität der Phenylalaninhydroxylase" ca. 30-fach erhöhte Konz. an Phenylalanin und seinen Metaboliten (u.a. Phenylpyruvat)" PAH! Diagnose: Guthrietest (seit 1960, Routinetest an Neugeborenen)," heute: Phenylalanin Nachweis per HPLC aus dem Blut" Wachstum von B. subtilis! Mit Blut getränktes Filterpapier (dunkellila)! wird auf Agarplatte gebracht.! normal! 0.12! 0.48! 1.2! Phe [mmol/l]! PKU! Thienylamin-gehemmter! B. Subtilis (rosa) wächst nur in! Gegenwart von Phe!! Therapie: Phenyalanin-arme aber Tyrosin-reiche Diät, Therapiebeginn vor der 8. Woche 27! 05.11.2013! Diagnostik mutierter Allele! Deletionen, Insertionen, Inversionen: Southern oder PCR! Erkrankungen assoziiert mit Expansion von Trinucleotid Repeats! (VNTR: variable number of tandem repeats)! • Diagnostik mittels PCR (flankierend zu Repeat)! PCR! Größe des Fragments Repeatlänge! z. B. 150 bp! Diagnostik von Punktmutationen! (Auswahl)" 1) RFLP! 2) PCR-basierende Verfahren: an genomischer DNA oder cDNA (z. B bei Tumorbiopsien)! • PCR-Produkt + Restriktionsverdau (z. B. Sichelzellallel mit MstII Polymorphismus)! • PCR-Produkt + Sequenzierung! • PCR mit allelspezifischen Primern:! 3‘OH! ungepaartes 3‘OH verhindert Polymerase-Reaktion:! x! mut! kein PCR Produkt!! 3) Array basierte Verfahren! Zukunft: Next Generation Sequencing... 1000,- Dollar Genom! 28! 05.11.2013! Therapeutische rekombinante Proteine und Gentherapie 29! 05.11.2013! Gentechnisch produzierte Arzneimittel! Marktanteil" bereits ca. 10-15 % des Gesamtumsatzes aller Pharmazeutika," Umsatz (2007): ca 40 Mrd in USA, ca 3.4 Mrd in Deutschland " Erwartungen: wichtiger Wachstumsmarkt der Zukunft" Beispiel: EPO > 12 Milliarden $ pro Jahr" Zugelassene Wirkstoffe in Deutschland (2007): 177 " Vorteile rekombinanter Proteine als Arzneimittel: " • keine aufwendige biochemische Anreicherung," • keine biologischen Kontaminationen (z. B. Prionkontaminationen bei GH aus Hypophysen," Virale HIV/Hepatitis-Kontaminationen bei Blutprodukten, z. B. bei Gerinnungsfaktoren)" • hohe Spezifität erzielbar, z. B. bei rekombinanten Antikörpern" • optimierbar (funktionelle Eigenschaften, Bioverfügbarkeit, Abbaurate etc.)" biologische „designer drugs“, “rational drug design“" mögliche Nachteile: " • (eingeschr.) immunologische Verträglichkeit (nicht humanidentisches Glycosilierungsmuster?)" • Reinheitsgrad/Kontaminationen (e.g. Abwesenheit bakterieller Proteine, Toxine z. B. LPS?)" • Kosten!!!" Klassen gentechnisch erzeugter Arzneimittel! • Enzyme! tPA (tissue plasminogen activator), antithrombotisch, Herzinfarkt" Glucocerebrosidase " (Morbus Gaucher, lysosomale Speicherkrankheit )" • Hormone/Wachstums- faktoren! Insulin, Therapie von Typ I Diabetes" hGH (human growth hormone), Therapie des Zwergwuchses bei Hypophysenunterfunktion" EPO (Erythropoetin, Biosynthese in der Niere)" Indikation: Anämien, z. B. bei Nierenunterfunktion, " Dialysepatienten, oder nach Chemotherapie bei Krebs)" • Cytokine! IFN-α/β (Hepatitis B, C),)IFN-γ) Interleukin-2) • Blutgerinnungsfaktoren! Hämophilie A ( Faktor VIII), B (IX)" • Rekombinante Impfstoffe! Hepatitis B" • Therapeutische Antikörper! v.a. in Krebstherapie (Herceptin) und zur Immunsuppression" Wachstumsmarkt der Zukunft!!" 30! 05.11.2013! Quelle: Tab 6, Lehrbuch Pharmazeutische Biologie 2" Wagner, et al. " Quelle: Tab 6, Lehrbuch Pharmazeutische Biologie 2, Wagner, et al. 2007" 31! 05.11.2013! Heterologe Genexpression in Bakterien! Vorteile:! • schnelles Wachstum in billigen Medien (Fermenter)" • hohe Proteinausbeute" Nachteile:" • Bakterien besitzen kein ER und keinen Golgi: keine N- bzw. O-Glykosylierung!!!! " häufig essentiell für die biologische" Funktion/Halbwertszeit z. B von EPO" Core-Zucker werden über Dolicholphosphat am ER auf wachsende Polypeptidkette kotranslational übertragen (Quelle: Alberts) Proteinfaltung im Cytoplasma von Bakterien:" reduzierende Umgebung, Disulfidbrücken werden meist falsch geknüpft" Proteine fallen als unlösliche „inclusion bodies“ an" Denaturierung und in vitro Renaturierung unter oxidierenden " Bedingungen (meist nicht quantitativ)" Rekombinantes Human-Insulin! N! preproinsulin! • Insulin muß proteolytisch gespalten werden " um aktiv zu sein." • Insulin A und B Ketten sind durch S-S Brücken" kovalent verbunden (intra- und intermolekular). " proinsulin! insulin! Genentech und Eli Lily:" Insulin A und B Ketten werden " (als Fusionsproteine) getrennt exprimiert" und durch chemische Oxidation verbunden" A! B! Vertiefung: siehe VL Wink" 32! 05.11.2013! Heterologe Genexpression in Hefe! S. cerevisiae (Bäckerhefe): einfachste Eukaryontenzelle ! • gute Proteinausbeuten, Sekretion ins Medium möglich" • kostengünstige Medien (industrielle Fermenter)" • Proteinglykosylierung möglich, aber häufig hyperglykosyliert, nicht humanidentisch" „high mannose“ Typ sehr immunogen (ideal für rekombinante Impfstoffe), " als in vivo Arzneimittel ungeeignet." Pichia pastoris! • Hyperglykosilierung kein Problem" • sehr gute Ausbeuten bei sekretierten Proteinen" Komplexe Oligosaccharide:" N-Acetylglucosamine," Galactose" Sialylsäure" Heterologe Expression in Säugerzellen! Entweder:! • Transiente Expression nach Transfektion mit episomalem Vektor! Oder:! • Permanente Expression durch stabile Integration des Zielgens in das Genom der Säugerzelle („Stabile Linien“)! Vorteile:! • human-ähnliche oder identische Glykosylierung:! - Glykosilierungsmuster ist speziesabhängig: CHO (chinese hamster ovary)-Zellen, und " BHK (baby hamster kidney) Zellen sind Hamsterzelllinien. " - bei Verwendung humaner Linien kann humanidentische Glykosilierung erzielt werden." (EPO Präparate: Nachweis von recEPO im Urin durch isoelektrische Fokusierung" beruht auf nicht humanidentischer Glykosilierung von Epoetin α, β, ω;" aber bei Verwendung humaner HT1080 Zellen zur Expression ist EPO humanidentisch)" • korrekte Proteaseprozessierung und Sekretion! Nachteile:! • teure Medien (Serum als Wachstumsfaktor!)! • langsames Zellwachstum (Generationszeit ca. 24h)! • industrieller „scale up“ aufwendig und langsam.! 33! 05.11.2013! Biomanufacturing! Dove, Nature Biotech, Aug. 2002, 20: 777-779! Genetische Manipulation des Mausgenoms UM 49! Gentargeting Transgene Mäuse P1 1 1 chrom. DNA Transgen 3 neo 2 tk 3 Vektor genom. Lokus P2 Homologe Rekombination n P1 1 neo 3 rekomb. Lokus P2 PCR-product Mikroinjektion von DNA in Oozyten • Integration (mehrerer Kopien) in nicht selektierbaren, zufälligen Lokus • Expression beeinflußt durch flankierende Sequenzen Mikroinjektion von ES-Zellen in Blastozysten • Einführen beliebiger Mutationen an jeden gewünschten Genlokus: Genunterbrechung, Deletionen, Punktmutationen, chrom. Umlagerungen "Designermäuse" Anwendungen: Anwendungen: • Überexpression • Knockoutmäuse ("loss of function" Phänotyp) • Expression unter Kontrolle gewebespezifischer Promotoren • Einführung genetischer Modifikationen unter Erhalt des Expressionsmusters • Expression von mutierten Proteinen ("gain of function" Phänotyp) • Krankheitsmodelle • Krankheitsmodelle 34! 05.11.2013! Generierung transgener Tiere! Oocyten-Injektion! • Injektion in den männlichen Vorkern ! befruchteter Eizellen! • Zufällige Integration in mehreren! Kopien ins Genom! • Integrationsort nicht selektierbar! Implantation in Leihmutter! Zucht: Etablierung einer Transgenen Mauslinie! Herstellung von "Knock-out" Mäusen! Gen wir durch Homolge! Rekombination in ES-zellen! punktgenau mutiert:! z.B. Genunterbrechung! durch Einführen eines ! Antibiotika Resistenzgens! Knockout-Maus! „loss of function“! 35! 05.11.2013! Transgene Tiere " Anwendungsbeispiele " Medizin" Grundlagenforschung" • Studium des Immunsystems " • Krebspathogenese " • Analyse von Erbkrankheiten " • Tiermodelle für Krankheiten " •S " truktur/"" Funktionsbeziehungen " • "Entwicklungsbiologie " • Analyse " " komplexer " zellulärer"Systeme" Neue Therapien" Biotechnologie Genomprojekt • Funktionsanalyse neuer oder unzureichend charakterisierter Proteine • Erzeugung von Nutztieren mit neuen Eigenschaften z. B. BSE-resistente Rinder • Produktion von Pharmazeutika in der Milch chrom. DNA Transgen n • Promotoren für Milchdrüsenexpression:! Lactalbumin, WAP (whey acidic protein)! Literatur zur Vorlesung! Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter:" Molekularbiologie der Zelle, Wiley VCH, (5th edition), 2009" Kap. 8.1, 8.2, 8.3, 8.5" Strachan and Read: Human Molecular Genetics," Garland Science, 2004, 3rd edition; 2011 4th edition" chapter 4.1, 4.2, 16 (gene therapy chapt 16)" (3rd edition, gibt es neu in deutscher Übersetzung)" Wagner, Vollmar, Bechthold:! Pharmazeutische Biologie 2! Völlige Neuauflage 2007 und 2011" Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft" Kap. 6 (nichtpflanzliche hochmolekulare Arzneistoffe)" Kap 7 (Grundlagen der Gentechnologie)" Dingermann, Winckler, Zündorf: Gentechnik Biotechnik! Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft" 2. Auflage 2011" 36!
