Anti-TG - Content James

ORGENTEC Diagnostika GmbH
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Anti-TG
ORG 502
96 Tests
Immunometrischer
Enzymimmunoassay zum
quantitativen Nachweis von
Autoantikörpern gegen
Thyreoglobulin (TG)
Gebrauchsanweisung
INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis........................................................................................................ 2
Einleitung .................................................................................................................... 3
Methodik ..................................................................................................................... 4
Lieferumfang des Tests .............................................................................................. 5
Technische Daten ....................................................................................................... 5
Erforderliche Laborgeräte ........................................................................................... 5
Vorbereitung der Reagenzien ..................................................................................... 6
Probenentnahme und Probenvorbereitung ................................................................. 6
Technische Hinweise .................................................................................................. 6
Assaydurchführung ..................................................................................................... 7
Auswertung der Ergebnisse ........................................................................................ 8
Normalwerte................................................................................................................ 8
Spezifität ..................................................................................................................... 8
Sensitivität................................................................................................................... 8
Kalibrierung................................................................................................................. 8
Linearität ..................................................................................................................... 8
Reproduzierbarkeit...................................................................................................... 9
Literatur....................................................................................................................... 9
Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen......................................................................... 10
Kurzanleitung ............................................................................................................ 11
2
EINLEITUNG
Einige Schilddrüsenerkrankungen sind wahrscheinlich aufgrund genetischer Prädisposition für eine
autoimmune Beteiligung mit dem Auftreten von differenzierten Autoantikörpern assoziiert. Diese
Autoantikörper richten sich gegen membranständige oder extrazelluläre Antigene der
Schilddrüsenzelle. Die wichtigsten Autoantigene sind neben dem TSH-Rezeptor das
Thyreoglobulin und die Schilddrüsenperoxidase TPO:
Thyreoglobulin ist ein wasserlösliches Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa
660.000 Dalton. Mit 75 % Anteil stellt es die Hauptproteinkomponente im Schilddrüsenkolloid.
Die Tyrosinreste des Thyreoglobulin-Moleküles werden zur oxidativen Jodierung bereitgestellt
und bilden somit die Voraussetzung für die Synthese der Schilddrüsenhormone T3 und T4.
Innerhalb der Zelle wird Thyreoglobulin durch die Mikrosomen transportiert.
Das mikrosomale Antigen der Schilddrüse ist ein integrales Membranprotein der Mikrosomen
und als das Enzym Schilddrüsen-Peroxidase (TPO) charakterisiert. Sein Molekulargewicht
beträgt ca. 110.000 Dalton.
Autoantikörper werden sowohl bei entzündlichen Erkrankungen als auch bei thyreoidalen
Autoimmunprozessen beobachtet. Verschiedene Leitsymptome für Schilddrüsenerkrankungen, wie
z. B. Struma, Schilddrüsenschmerz, Hyperthyreose sowie Hypothyreose, können von
immunogenen Prozessen, also der Beteiligung von Autoantikörpern, begleitet sein. Dies
unterstreicht die Relevanz der Autoantikörperbestimmung bei der Diagnostik von
Schilddrüsenerkrankungen.
Wichtigste Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse sind:
Hashimoto Thyreoiditis
Primäres Myxödem
Morbus Basedow Hyperthyreose (häufig begleitet von endokriner Ophtalmopathie)
und andere asymptomatische, beispielsweise postpartale, Thyreoiditen.
Das oftmals gleichzeitige Auftreten von Autoantikörpern gegen Thyreoglobulin und TPO scheint
auf dem funktionellen Zusammenhang beider Antigene zu beruhen. Bei der oxidativen Jodierung
der Aminosäurereste des Tyrosins am Thyreoglobulin als Ausgangsstruktur zur Bildung der
Schilddrüsenhormone T3 und T4 ist die Schilddrüsen-Peroxidase wahrscheinlich aktiv beteiligt.
TSH reguliert durch Stimulation die Synthese und Freisetzung der Schilddrüsenhormone unter
räumlichem Zusammenwirken aller dieser Proteine in oder auf der Zellmembran. Daher ist auch
das oftmals gleichzeitige Auftreten aller beschriebenen Antikörper plausibel.
Die fortdauernde Inhibierung der Peroxidase-Aktivität durch spezifische Autoantikörper ( anti-TPO)
führt zu einer verminderten Synthese der Schilddrüsenhormone und damit zur Hypothyreose.
Besonders am Ende einer Schwangerschaft kann der Nachweis von Schilddrüsen-Autoantikörpern
wertvolle Hinweise auf eine spätere postpartale Hypothyreose geben (Hashimoto's post partum
depression). Bei der Hashimoto Thyreoiditis findet man häufig sehr stark erhöhte AutoantikörperKonzentrationen, wobei die gegen Thyreoglobulin gerichteten Autoantikörper meist stärker erhöht
sind als die anti-TPO Antikörper.
Die Verteilung der dargestellten Autoantikörper bei Schilddrüsen-Autoimmunerkrankungen ist in
der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
Krankheisbild (vereinfacht)
Hashimoto Thyreoiditis
Morbus Basedow (immunogen)
Endokrine Orbitopathie
Dissiminierte Autonomie (nicht immunogen)
Regionale Autonomie (autonomes Adenom)
TM(TPO)
xxx
xx
xx
x
x
AntiTG
xxx
x
x
(x)
(x)
TSHRezeptor
x
xxx
xx
-
3
Im Wesentlichen ergeben sich für die Bestimmung der Autoantikörper gegen Antigene der
Schilddrüse folgende Indikationen:
Morbus Basedow (immunogen)
Hashimoto Thyreoiditis
Endokrine Orbitopathie
Hyper- bzw. Hypothyreose ungeklärter Genese
Schilddrüsenautomien
Postpartale Thyreoiditen
METHODIK
Der vorliegende Test ist ein indirekter Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von
Autoantikörpern gegen Thyreoglobulin (TG).
Die Kavitäten der Mikrotiterplatte sind mit humanem Thyreoglobulin beschichtet.
Auf einer Mikrotiterplatte können 96 Bestimmungen durchgeführt werden. Jede Mikrotiterplatte
setzt sich aus 12 einzelnen Streifen mit jeweils 8 Kavitäten zusammen. Bei Bedarf können die
Streifen in einzelne Kavitäten zerteilt werden. Die drei Reaktionsschritte stellen sich wie folgt dar:
1. Reaktionsschritt
Die Antikörper in den Standards, Kontrollen und in den Patientenproben werden an das
immobilisierte Antigen in den Kavitäten gebunden.
2. Reaktionsschritt
Das zugegebene Enzymkonjugat (anti-human-IgG Meerrettich-Peroxidase) erkennt spezifisch die
gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe.
3. Reaktionsschritt
Die gebundene Peroxidase setzt ein zugegebenes Substrat (TMB) in ein gefärbtes Produkt um.
Auswertung
Die optische Dichte der Proben wird in einem ELISA-Photometer bei 450 nm gemessen. Die
Farbentwicklung ist direkt proportional zur gesuchten Autoantikörper-Konzentration.
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LIEFERUMFANG DES TESTS
Mikrotiterplatte mit 96 abbrechbaren Kavitäten, die beschichtet sind ....... 1
mit hochgereinigtem humanem Thyreoglobulin
Probenpuffer, Konzentrat, (gelb) .............................................................. 1 Fläschchen, 20 ml
Waschpuffer, Konzentrat .......................................................................... 1 Fläschchen, 20 ml
Konjugat................................................................................................... 1 Fläschchen, 15 ml
anti-human IgG, Peroxidase konjugiert, gebrauchsfertig (rosa),
TMB Substratlösung, 3,3`, 5,5`-Tetramethylbenzidin, gebrauchsfertig ..... 1 Fläschchen, 15 ml
Stopplösung, 1M HCl, gebrauchsfertig ..................................................... 1 Fläschchen, 15 ml
Kontrollen, gebrauchsfertig ...................................................................... je 1 Fläschchen, 1,5 ml
- Kontrolle 1
Positivkontrolle
- Kontrolle 2
Negativkontrolle
Standards A bis F, gebrauchsfertig mit den Konzentrationen: .................. je 1 Fläschchen, 1,5 ml
Anti-TG: 0 - 100 - 300 - 1000 - 3000 - 9000 IU/ml
Arbeitsanleitung/Qualitätskontroll-Zertifikat
TECHNISCHE DATEN
Untersuchungsmaterial
Serum oder Plasma
Erforderliche Probenmenge 10 µl Probe für eine 1 : 101 Probenvorverdünnung
100 µl verdünnte Probe pro Einzelbestimmung
Gesamt-Inkubationszeit
60 Min. bei Raumtemperatur (20 - 28 °C)
Meßbereich:
0 - 9000 IU/ml
Meßwellenlänge
450 nm
Empfindlichkeit:
10 IU/ml
Lagerung
bei 2 - 8 °C im Kühlschrank
ERFORDERLICHE LABORGERÄTE
Geräte/Reagenzienvorbereitung
- Plattenphotometer mit einem optischen Filter der Meßwellenlänge 450 nm
(ggf. Referenzwellenlänge von 620 nm)
- Wirbelmischer (Vortex)
- Mikropipetten mit Einmalspitzen für 10 µl, 100 µl und 1000 µl, evtl. Multipette
- destilliertes Wasser
- Meßzylinder für 100 ml und 1000 ml
- Gefäß zur Aufbewahrung der Waschlösung
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VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
Alle Komponenten dieses Testbesteckes liegen bis auf den Probenpuffer und den Waschpuffer
gebrauchsfertig vor. Die Lösungen sind nach dem Öffnen der Fläschchen und bei Lagerung im
Kühlschrank bei 2 - 8 °C bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar.
Waschlösung
Jede Flasche des Waschpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von
destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml (1 Liter) zu verdünnen. Die verdünnte
Waschlösung ist bei einer Lagerung bei 2 - 8 °C mindestens 30 Tage haltbar.
Probenpuffer
Jede Flasche des Probenpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von
destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml zu verdünnen. Der verdünnte Probenpuffer
ist bei einer Lagerung bei 2 - 8 °C mindestens 30 Tage haltbar.
Mikrotiterplatte
Es werden je nach Probenaufkommen die nötige Anzahl von Streifen oder Einzelkavitäten in den
Rahmen der Mikrotiterplatte eingesetzt. Es sollte unbedingt darauf geachtet werden, daß die
verpackte Mikrotiterplatte bereits Raumtemperatur angenommen hat, ehe die Folienverpackung
geöffnet wird. Die nicht benötigten Streifen bzw. Kavitäten werden in dem wiederverschließbaren
Beutel bei 2 - 8 °C aufbewahrt.
Achtung:
Werden bei einem Assayansatz nicht alle Streifen bzw. Kavitäten benötigt, muß der Rahmen der
Mikrotiterplatte aufbewahrt werden. Nach Beendigung eines Testansatzes sollten die verbrauchten
Kavitäten verworfen und der Rahmen der Mikrotiterplatte in den Kit zurück gelegt werden.
PROBENENTNAHME UND PROBENVORBEREITUNG
Die Bestimmung der TG-Antikörper wird im Serum oder Plasma durchgeführt. Die Serum- bzw.
Plasmaproben werden vor der Messung 1 : 101 mit Probenpuffer verdünnt.
10 µl Probe plus 1000 µl Probenpuffer
Serum- und Plasmaproben können gekühlt bei 2 - 8 °C bis zu 5 Tage aufbewahrt werden. Ist eine
längere Lagerung beabsichtigt, sollten die Proben aliquotiert und bei -20 °C tiefgefroren werden.
Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Seren und Plasmen mit erhöhten
Bilirubinwerten, hämolytische oder lipämische Proben stören die Bestimmung nicht.
TECHNISCHE HINWEISE
Zur laufenden Kontrolle der Richtigkeit wird empfohlen, jeden Ansatz anhand von Kontrollseren zu
überprüfen.
6
ASSAYDURCHFÜHRUNG
Vor Testbeginn müssen alle Reagenzien sowie die Patientenseren Raumtemperatur angenommen
haben.
1.
Eine ausreichende Anzahl von Kavitäten bzw. Mikrotiterplatten-Module zum Ansatz von
Standards, Kontrollen und Patientenproben vorbereiten. Doppelbestimmungen werden
empfohlen.
2.
Jeweils 100 µl Standards, Kontrollen und vorverdünnte Patientenproben entsprechend
der Plattenbelegung in die Mikrotiterplatte pipettieren.
Vorschlag für ein Pipettierschema:
A
B
C
D
E
F
G
H
1
SA
SA
SB
SB
SC
SC
SD
SD
2
SE
SE
SF
SF
K1
K1
K2
K2
3
P1
P1
P2
P2
P3
P3
P4
P4
4
P5
P5
P..
P..
5
6
SA - SF:
P1, P2...
K1:
K2:
Standards A bis F
Pantientenprobe 1, 2 ...
Positivkontrolle
Negativkontrolle
1. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur (20 - 28 °C)
3.
4.
Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen.
Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus
den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der
Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden.
Jeweils 100 µl Enzymkonjugatlösung in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettieren.
2. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20 - 28 °C)
5.
6.
Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen.
Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus
den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der
Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden.
Jeweils 100 µl TMB Substratlösung in die Kavitäten pipettieren.
3. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20 - 28 °C)
7.
8.
100 µl Stopplösung in jede Kavität pipettieren und die Platte ca. 5 Minuten stehen lassen.
Messung der optischen Dichte aller Proben im Plattenphotometer innerhalb von 30 Minuten
bei einer Wellenlänge von 450 nm.
Bitte beachten Sie:
Alle angegebenen Inkubationszeiten müssen eingehalten werden. Alle Pipettierschritte sind bei
allen Inkubationen in einheitlicher Reihenfolge und einheitlichem Zeittakt durchzuführen.
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AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE
Eine Standardkurve erhält man durch Auftragen der gemessenen optischen Dichte gegen die
vorgegebene Standardkonzentration.
NORMALWERTE
Im Rahmen einer umfangreichen Normbereichsstudie wurde anhand von Blutspender-Seren mit
dem Anti-TG ELISA die folgenden Werte ermittelt:
normal
< 100 IU/ml
grenzwertig
100 - 150 IU/ml
erhöht
> 150 IU/ml
SPEZIFITÄT
Die Mikrotiterplatte ist mit hochgereinigtem Thyreoglobulin, isoliert aus humanem
Schilddrüsengewebe, beschichtet. Der Anti-TG Assay erfaßt spezifisch die gegen das humane
Thyreoglobulin-Molekül gerichteten Autoantikörper der IgG-Klasse.
SENSITIVITÄT
Die untere Nachweisgrenze beträgt 10 IU/ml.
KALIBRIERUNG
Das quantitative Meßsystem Anti-TG ist gegen die WHO Referenzpräparation 65/93 für
Thyreoglobulin-Antikörper kalibriert. Dabei entspricht die Referenzpräparation 1000 IU/ml.
LINEARITÄT
Für die Verdünnungsexperimente wurden Seren/ Plasmen mit hohen Antikörperkonzentrationen in
steigenden Verdünnungsstufen (Verdünnung im Probenpuffer) im Assay eingesetzt. Die
Ergebnisse sind über den gesamten Meßbereich linear.
8
REPRODUZIERBARKEIT
In der untenstehenden Tabelle sind die Variationskoeffizienten (VK %), die für die Intra- und die
Inter-Assay-Varianzen des Anti-TG Kits ermittelt wurden, aufgeführt. Zur Ermittlung der IntraAssay-Varianzen wurden drei Seren mit unterschiedlichen Konzentrationen jeweils 24-fach auf
einer Platte gemessen.
Für die Bestimmung der Inter-Assay-Varianzen wurden drei Proben mit unterschiedlichen
Konzentrationen auf fünf Platten jeweils sechsfach gemessen.
Probe
Nr.
1
2
3
Intra-Assay
Mittelwert
Variationskoeffizient (%)
(IU/ml)
746
2,6
1398
2,4
4674
5,0
Probe
Nr.
1
2
3
Inter-Assay
Mittelwert
Variationskoeffizient (%)
(IU/ml)
765
5,7
1500
2,3
5565
4,0
LITERATUR
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Dtsch. Med. Wschr. 1984; 109: 1574 - 1581.
HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN
Alle Reagenzien dieser Testpackung dürfen ausschließlich zur in vitro-Diagnostik verwendet
werden.
Die Einhaltung des vorgeschriebenen Protokolls zur Durchführung des Tests ist unbedingt
erforderlich. Die Richtlinien zur Durchführung der Qualitätskontrolle in medizinischen Laboratorien
sind zu beachten (Mitführen von Kontrollen, Poolseren).
Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke sollten nicht ausgetauscht
werden. Die auf der Verpackung und den Etiketten der einzelnen Komponenten angegebenen
Verfallsdaten sind zu beachten.
Der Testkit enthält Reagenzien, die aus humanen Serum- oder Plasmabestandteilen hergestellt
sind. Die Ausgangsreagenzien wurden mit Immunoassaymethoden auf Antikörper gegen HIV 1,
HIV 2, HCV und auf das Hepatitis B Oberflächenantigen untersucht. Alle getesteten Parameter
wurden für negativ befunden.
Für den Umgang mit Kitreagenzien, Kontroll- und Serumproben sind die Vorschriften zur
Unfallverhütung für den Gesundheitsdienst beim Umgang mit potentiell infektiösem Material
einzuhalten.
Das Untersuchungsmaterial ist stets als potentiell infektiös einzustufen. Unter den gleichen
Sicherheitsvorkehrungen sind ebenso Kitreagenzien und Kontrollproben zu handhaben.
Die Reagenzien dieses Testbestecks enthalten zum Schutz gegen bakterielles Wachstum
Konservierungsmittel; daher ist die Berührung mit der Haut und/oder Schleimhäuten zu vermeiden.
Das Substrat TMB (3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin) ist toxisch bei Verschlucken und bei Berührung
mit der Haut. Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser und Seife abwaschen.
Vermeiden Sie den Kontakt der Peroxidlösung mit leicht oxidierbaren Materialien. Extreme
Temperaturschwankungen können zum spontanen Zerfall des Peroxids führen.
Ein Kontakt mit der Salzsäure enthaltenden Stopp-Lösung ist zu vermeiden. Bei Hautkontakt
unverzüglich und kräftig mit Wasser abwaschen. Alle Geräte sofort nach Gebrauch gründlich
reinigen.
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KURZANLEITUNG
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